Buněčná a molekulární biologie praktikum LS, část II
2.3. SEPARACE PROTEINŮ POMOCÍ SDS-PAGE ELEKTROFORÉZY A CHEMILUMINISCENČNÍ DETEKCE PROTEINŮ A) Příprava gelů 1)
Vzít sklo s přilepenými “spacery” a kratší sklo a vyčistit je pomocí etanolu a gázy. Podle obr. 1-4 návodu na sestavení ELFO aparatury (oddíl Přípravy gelu) sestavit skla a připravit je k nalití gelu.
2)
Nalít do prostoru mezi skly pomocí střičky malé množství etanolu pro kontrolu těsnosti aparatury. Jestliže nedochází k úniku etanolu, etanol vylít do umyvadla a zbytek etanolu odsát čtverečkem buničiny. Po ověření těsnosti aparatury jsou skla připravena k nalití gelu.
3)
Do zkumavky s předmíchanou směsí na 10% gel přidat 2.5 l TEMEDu a 25 l 10% APS a promíchat jemným převracením zkumavky. Nevortexovat! Přidáním APS a TEMEDu je započata polymerizace gelu, je třeba proto pracovat rychle, neboť jinak gel ztuhne už ve zkumavce.
4)
Nalít tento roztok do prostoru mezi skly až do úrovně určené vedoucími praktika za použití pipety s modrou špičkou. Vyvarovat se vzniku bublin při nalévání gelu.
5)
Na gel pomocí střičky opatrně nalít vrstvu etanolu. Etanol zabraňuje kontaktu polymerizujícího gelu s kyslíkem, který polymerizaci inhibuje. Etanol dále pomůže odstranit bubliny na povrchu gelu, pomocí něho se také vytvoří vodorovný povrch gelu.
6)
Gel nechat polymerizovat asi 30-45 minut. Rychlost polymerizace lze sledovat na zbytku gelu ve zkumavce. Ve chvíli, kdy je tento zbytek kompletně zpolymerizovaný, je možno přikročit k nalévání druhého gelu.
7)
Po kompletní polymerizaci 10% gelu odstranit etanol vylitím do výlevky a zbytek etanolu odsát opatrně čtverečkem buničiny.
8)
Vzít zkumavku s předmíchanou směsí na 4% zaostřovací gel. Přidat 2 l TEMEDu a 10 l 10% APS a promíchat jemným převracením zkumavky.
9)
Nalít na zpolymerizovaný gel 4% zaostřovací gel (až po okraj kratšího skla) pomocí pipety s modrou špičkou.
10)
Vložit hřeben do prostoru mezi skly. Vyvarovat se vzniku bublin. Případné bubliny negativně ovlivňují elektrickou vodivost gelu a tím i separaci proteinů v gelu.
Buněčná a molekulární biologie praktikum LS, část II
11)
Nechat zaostřovací gel polymerizovat asi 30 minut. Kompletní polymerizaci lze předpokládat ve chvíli, kdy je i zbytek gelu ve zkumavce ztuhlý. Použití dvou různých gelů s různým pH a různým procentuálním zastoupením akrylamidu/bis-akrylamidu umožní proteinům naneseným ve vzorku dosáhnout rozhraní gelů ve stejnou dobu, takže pohyb proteinů ve spodním (separačním) gelu je závislý pouze na velikosti jednotlivých proteinů a nezávislý na způsobu nanesení vzorků či jiných proměnných.
12)
Takto vytvořený gel ponechat ve stojanu, bude použit následující skupinou. Pro vlastní elektroforézu použít gel připravený předchozí skupinou.
B) Příprava vzorků 1)
Do nových popsaných 1,5 ml zkumavek napipetovat 30 l vzorkového pufru.
2)
K vzorkovému pufru přidat stejné množství lyzátu vyrobeného v předchozím týdnu.
3)
Vzorky proteinů naředěné ve vzorkovém pufru zamíchat vortexováním a zahřát na 95°C po dobu cca 5 minut ve vyhřívaném termobloku. Teplo denaturuje proteiny ve vzorkovém pufru, který obsahuje sodium dodecyl sulfát (SDS) a 2-mercaptoethanol, látku redukující disulfidické můstky. Výsledně získávají proteiny vláknitý tvar a stejný náboj na jednotku délky proteinu. Proteiny se během SDS-PAGE separují pouze podle své molekulové hmotnosti. Toho můžeme využít pro odhad molekulové hmotnosti separovaných proteinů tím, že porovnáme jejich mobilitu s mobilitou proteinu/proteinů o známé molekulové hmotnosti.
C) Nanášení vzorků na gel 1)
Vypočítat množství lyzátu, které obsahuje 30 g proteinu. Poté vypočítat množství lyzátu ředěného vzorkovým pufrem, které obsahuje 30 g proteinu. Potřebný objem lyzátu vypočítat z koncentrace vzorku, která byla stanovena pomocí metody Bradfordové. Vzorek byl ředěn vzorkovým pufrem 1:1.
2)
Podle obrázků 1-5 z návodu na sestavení elektroforetické aparatury (část Složení elektroforézové jednotky) a instrukcí vedoucích praktik připravit ELFO jednotku pro nanesení vzorků a běh elektroforézy.
3)
Po složení celé jednotky elektroforézy naplnit vnitřní nádržku pufrem pro běh gelu Running buffer) tak, aby pufr přesahoval vnitřní kratší sklo. Pufr nalít také do vnější nádržky elektroforézové jednotky do úrovně cca 3 mm nad koncem kratšího skla. Pokud bude hladina pufru níže než kratší sklo, nebude systémem procházet elektrický proud, a tudíž nebude probíhat separace proteinů.
2
Buněčná a molekulární biologie praktikum LS, část II
4)
Nanést vzorky do jednotlivých jamek gelu v tomto pořadí: směs markerů molekulových hmotností, déle vzorek čistého aktin a myosinu v množství určeném vedoucím praktika, dále vlastní vzorky v množství odpovídajícím 30 g proteinu. SDS PAGE Markery molekulových hmotností používáme pro poměrně přesný odhad molekulové hmotnosti separovaných proteinů. Molekulové hmotnosti jednotlivých proteinů v markeru námi použitém jsou 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 a 250 kDa. Markery molekulových hmotností nám zároveň umožní sledovat průběh separace proteinů, protože jsou barevné a tudíž viditelné v gelu během separace. Vzorky aktinu a myosinu nám umožní identifikovat aktin a myosin v našich vzorcích.
D) Gelová elektroforéza 1)
Po nanesení vzorků uzavřít elektroforézovou jednotku víkem. Na zdroji elektrického proudu nastavit konstantní napětí 200 V a nechat proteiny separovat přibližně 35 minut (je důležité průběžně sledovat pohyb čela vzorků na gelu). Bromfenolová modř obsažená ve vzorkovém pufru je ze všech složek nanesených na gel nejrychlejší. Ve chvíli, kdy dosáhne spodního okraje gelu, je nutné separaci proteinů zastavit, jinak hrozí únik proteinů z gelu do pufru.
2)
Po doběhnutí elektroforézy vypnout zdroj a odpojit el. kabely. Vyjmout vnitřní část elektroforézové jednotky a z ní oba gely se skly.
E) Barvení proteinů a identifikace aktinu a myosinu 1)
Pomocí nehtů rozevřít skla a opatrně vyjmout gel.
2)
Gel ponořit do nádobky s roztokem Coomassie blue. Barvit gel přibližně 5-10 minut za občasného kývání. Coomassie Blue je barvivo vázající se nespecificky na proteiny a umožňující tak jejich vizualizaci.
3)
Vložit obarvený gel do odbarvovacího roztoku. Slít odbarvovací roztok a pokračovat v odbarvování horkou vodou. Postupným odbarvováním pozadí gelu se zviditelňují jednotlivé proužky proteinů.
4)
Podle markerů molekulové hmotnosti a vzorku čistého aktinu a myosinu identifikovat aktin a myosin ve vlastních vzorcích. Porovnat obsah aktinu a myosinu v různých typech tkání. Aktin i myosin jsou evolučně velmi konzervované proteiny, jejich velikost i struktura jsou velmi podobné mezi jednotlivými druhy organismů. Aktin má molekulovou hmotnost cca 43 kDa, myosin je tvořen těžkým řetězcem o velikosti 210 kDa a několika lehkými řetězci o velikosti 15-20 kDa.
3
Buněčná a molekulární biologie praktikum LS, část II
POUŽITÉ ROZTOKY: 10% separační gel: 2,05 ml 1,65 ml 1,25 ml 50 ul 25 ul 2,5 ul
destilované vody 30% roztoku akrylamid/bisakrylamid 1,5 M Tris-HCl, pH=8,8 10% SDS 10% amonium persulfát TEMED
30% roztok akrylamid/bisakrylamid, 1,5 M Tris-HCl, pH=8,8, TEMED skladovat při 4°C, 10% SDS skladovat při pokojové teplotě, 10% amonium persulfát v alikvótech při -20°C 4% zaostřovací gel: 1,22 ml 266 ul 0,5 ml 20 ul 10 ul 2 ul
destilované vody 30% roztoku akrylamid/bisakrylamid 0,5 M Tris-HCl, pH=6,8 10% SDS 10% amonium persulfát TEMED
30% roztok akrylamid/bisakrylamid, 0,5 M Tris-HCl, pH=6,8, TEMED skladovat při 4°C, 10% SDS skladovat při pokojové teplotě, 10% amonium persulfát v alikvótech při -20°C Sample Buffer (vzorkový pufr): 3,55 ml 1,25 ml 2,5 ml 2 ml 0,2 ml 0,5 ml
destilované vody 0,5 M Tris-HCl, pH=6,8 glycerol 10% SDS 0,5% bromfenolová modř 2-merkaptoetanol
Skladovat při 4°C. 5x Running Buffer (pufr pro běh gelu): 9g 43,5 g 3g
Tris base glycin SDS
Doplnit do 600 ml destilovanou vodou. Upravit pH na 8,3, skladovat při 4°C. Pro běh elektroforézy naředit 200 ml 5x zásobního roztoku 800 ml destilované vody.
4
Buněčná a molekulární biologie praktikum LS, část II
Coomassie Blue Stain (barvicí roztok): 0,25 g 90 ml 90 ml 20 ml
Coomassie Blue metanol destilovaná voda kyselina octová
Dobře zamíchat a přefiltrovat, skladovat při 4°C. Coomassie Blue Destain (odbarvovací roztok): 450 ml 450 ml 100 ml
metanol destilovaná voda kyselina octová
Skladovat při 4°C.
5
