ŘÍZENÍ KULTIVACE ŘAS VE FOTOBIOREAKTORU

Ústav inženýrství ochrany životního prostředí, FT, UTB ve Zlíně

[T9TO2]

ŘÍZENÍ KULTIVACE ŘAS VE FOTOBIOREAKTORU

Zpracoval: Ing. Roman Slavík, Ph.D.

verze 2015/1

-1-

Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons: Uveďte autora-Neužívejte dílo komerčně 3.0 Česká republika


[T9TO2]

1. TEORETICKÁ ČÁST Průmyslové biotechnologie se díky neustále se stupňujícím nárokům na těžbu fosilních paliv nabízejí jako alternativa. Využitím těchto technologií by bylo možno v budoucnu podpořit, zjednodušit a případně i nahradit látky vyráběné z fosilních paliv. Při zavedení nových typů biotechnologií jde zejména o ekonomické a environmentální přínosy (nižší zatěžování životního prostředí zplodinami, přátelská produkce existujících a nových produktů, zlepšená ekonomie jejich produkce, redukce závislosti na neobnovitelných zdrojích energie a paliv, snížení hazardních stavů a bezpečnost výrob, zvýšení kvality života a zdraví společnosti, redukce vzniku potencionálních polutantů, management odpadů). V biotechnologicky významných procesech je potřeba nastavit a udržet vhodné podmínky v technologickém zařízení, které se co nejvíce blíží optimálním podmínkám potřebným pro kultivaci různých typů mikroorganismů. Zařízení, která jsou za tímto účelem využívána, se obecně označují jako bioreaktory (příklad je zobrazen na obr. 1) a jsou základním prvkem biotechnologických výrobních systémů. Bioreaktor (fermentor) je uzavřená, obvykle kovová válcovitá nádoba. Pro dosažení požadovaných podmínek je opatřena zařízením pro přívod výchozích látek, složek kultivačního média, vzduchu (pro aerobní kultivaci), produkčních mikroorganismů a také pro odčerpání meziproduktů a odpadních látek aseptickým způsobem. Dalším nezbytným vybavením fermentoru jsou míchadla, ventily, čidla a regulátory umožňující udržování technologicky požadované teploty, pH, případně čidla pro kontrolu obsahu jednotlivých složek. [1] Podle typu technologie můžeme bioreaktory rozdělit bioreaktory na [1]: a) fermentory pro aerobní fermentaci, b) fermentory pro anaerobní fermentaci, c) kultivační nádoby (chemostaty, cytostaty) používané k velkokapacitní kultivaci živočišných a rostlinných buněk d) enzymové reaktory používané v enzymových technologiích Podle způsobu provozu lze bioreaktory rozdělit na [1]: a) statické neboli vsádkové (batch) – používaně pro mikrobní kultivace menších objemů b) přítokovaný bioreaktor (fed-batch) c) kontinuální – pro enzymové výroby, popř. pro vysoce produkční aerobní kultivace Pro dosažení co nejvyšší účinnosti biotechnologických procesů jsou v současnosti stále vyvíjeny nové typy reaktorů. V moderních technologických systémech je v procesu zařazena již z velké části automatizaci celého provozu, a je prosazována snaha o dosažení co nejnižší spotřeby energie.

1.1. Statická kultivace Při množení mikroorganismů za statických podmínek kultivace rostou mikroorganismy v prostředí, jehož vlastnosti a složení se mění v závislosti na životní činnosti bakteriálních buněk. Množení nemá


-2-


[T9TO2]

trvale vzestupnou tendenci, ale probíhá v charakteristických fázích vzestupu a poklesu. Všechny buňky, včetně metabolických produktů, zůstávají po celou dobu kultivace v uzavřeném prostředí (uzavřený systém). Faktory, limitující růst jsou podmíněny změnami prostředí, vyvolanými samotnými bakteriemi. Mezi ně patří především vyčerpání živin a nahromadění produktů metabolismu.

Obr. 1. Schematické zobrazení sestavy bioreaktoru [2].

Jednotlivé fáze množení v závislosti na době kultivace lze graficky vyjádřit růstovou křivkou bakterií: po počáteční stagnaci (lagová fáze) se množství buněk zvyšuje (fáze zrychleného růstu a fáze exponenciální - logaritmická) a po vyvrcholení (fáze zpomaleného růstu a fáze stacionární) začíná opět klesat (fáze zrychleného odumírání); přírůstek ani úbytek počtu buněk není rovnoměrný (viz předmět Základy mikrobiologie). Fáze exponenciální je charakteristická intenzivním množením buněk, jejich počet narůstá geometrickou řadou. Rychlost dělení je konstantní, intenzívní dělení je provázeno aktivním metabolismem buněk, rychlým využíváním substrátu a tvorbou metabolických produktů. Proces ještě není limitován nedostatkem některé živiny, úbytek buněk odumíráním v poměru k přírůstku nových jedinců je minimální. Mezi faktory, ovlivňující délku této fáze, patří vedle druhových vlastností pěstované kultury především povaha prostředí a teplota kultivace.


-3-


[T9TO2]

Růst bakterií v logaritmické fázi je obvykle charakterizován pomocí tzv. růstových konstant. Matematicky lze růst vyjádřit rovnicí /1/: dX

μ * X

/ 1/

dt

kde  je rychlostní konstanta, tzv. specifická růstová rychlost (h-1), X je koncentrace mikroorganismů. Z rovnice plyne, že rychlost růstu a množení bakterií je v kterémkoliv okamžiku úměrné množství mikroorganismů. Integrací obdržíme rovnice /2/, případně /3/:

ln X 0  ln X   * t

/ 2/

X  X 0 * e * t

/ 3/

Pomocí  lze vypočítat generační dobu T, neboli dobu zdvojení biomasy T = ln2 / .

1.2. Kontinuální (průtoková) kultivace Využívá se k potlačení změn prostředí jako limitujícího faktoru, při níž se mezi mikroorganismy a prostředím vytváří stav dynamické rovnováhy. Princip této metody je vcelku jednoduchý (obr. 2.)

Obr. 2. Schéma zařízení pro kontinuální kultivaci.

Do kultivační nádoby s kulturou bakterií je plynule přiváděno čerstvé prostředí. Protože objem kultivátoru se nemění, musí z něho po přítoku čerstvého prostředí stejné množství prostředí, které ŘÍZENÍ KULTIVACE ŘAS VE FOTOBIOREAKTORU

-4-


[T9TO2]

bylo mezitím bakteriemi částečně využito, odtéci. Zároveň s tím je z kultivátoru odplavována část bakteriálních buněk. Jestliže je rychlost průtoku prostředí totožná s rychlostí přírůstku nových buněk a tím i s rychlostí úbytku buněk vyplavením, zůstává počet bakterií v kultivační nádobě konstantní. Stálý přítok čerstvého prostředí a odtok metabolických produktů zajišťuje tak růst bakterií v prakticky stejných podmínkách, tj. ve fyziologicky ustáleném stavu. Nemění se tedy ani vlastnosti kultury, pokud neuvažujeme změny, které prodělávají buňky v době mezi dělením. Systém bakterie prostředí je možno považovat v tomto případě za otevřený, neboť v uvedeném stavu dynamické rovnováhy lze udržovat bakterie neomezeně dlouho (obr. 3.)

Obr. 3. Závislost přírůstku biomasy na intervalu mezi opakovaným přítokem čerstvého prostředí při průtokové kultivaci (X0, X - v 1 hodinových intervalech, X0´, X ´ - v 15 minutových intervalech).

Rychlost množení bakterií pěstovaných metodou průtokové kultivace může být regulována v podstatě dvěma způsoby: Chemostat Toto zařízení umožňuje regulovat rychlost přítoku prostředí, v němž se esenciální substrát nachází v suboptimální koncentraci, kdežto ostatní živiny jsou zde v nadbytku. Změnou rychlosti průtoku se mění koncentrace základní živiny v kultivátoru a tím i rychlost množení buněk. Je to umožněno tím, že při zrychlení průtoku se v důsledku zvýšení koncentrace substrátu mohou bakterie množit rychleji než v případě, kdy je přítok čerstvého prostředí zpomalen, a je tudíž snížena i hladina příslušného substrátu. Rychlost průtoku nesmí však přesáhnout rychlost dělení bakterií.


-5-


[T9TO2]

Turbidostat Jako regulační činitel zde vystupuje rychlost množení buněk, jejímž prostřednictvím je řízena rychlost přítoku čerstvého plnohodnotného prostředí do kultivátoru. Děje se to tak, že se při dosažení předem stanovené horní hranice hustoty buněk v kultivátoru, kontrolované např. fotobuňkou, zvýší rychlost průtoku a tím i úbytek buněk jejich vyplavením. Pokles hustoty na určitou spodní hranici přivodí zároveň zastavení nebo zpomalení průtoku, a tím i nárůst populace na původní hustotu, což vede k opakování celého procesu.

1.3. Matematické stanovení rychlosti množení bakterií při průtokové kultivaci Růstovou konstantu µ charakterizující rychlost množení při průtokové kultivaci popisuje rovnice /1/. Za stavu dynamické rovnováhy platí, že každé zvýšení množství biomasy musí být okamžitě vyrovnáno jejím úbytkem, tj. vyplavením; časový přírůstek biomasy musí být prakticky nulový.

dX  * X  D * X  0 dt

/ 4/

kde D představuje tzv. zřeďovací rychlost, která je dána rychlostí průtoku prostředí F na jednotku objemu V

D

F V

/5/

Úpravou tohoto vztahu dostaneme

D

/6/

Závislost specifické růstové rychlosti na rychlosti zřeďovací Z matematického odvození vyplývá, že se specifická růstová rychlost µ musí rovnat při kontinuální kultivaci rychlosti zřeďovací D. Že je tomu skutečně tak, lze dokázat touto úvahou: Předpokládejme, že zřeďovací rychlost D převýší specifickou růstovou rychlost µ. Původní vztah pro přírůstek biomasy nabude pak tvaru

dX  * X  D * X  0 dt


/7/

-6-


[T9TO2]

Hodnota přírůstku dX/dt se tak stane negativní a množství biomasy, tj. buněk v systému, bude postupně klesat. Současně se snižováním počtu buněk bude se zvyšovat koncentrace substrátu. Pod podmínkou, že µ menší než µm, se v závislosti na rostoucí koncentraci substrátu tento rozdíl bude vyrovnávat podle známého Monodova vztahu

  m

S K s S

/8/

tzn. µ se zvýší. Dojde tak k ustavení nové rovnováhy. Překročí-li však hodnota D hodnotu µm, dojde postupně k vyplavení všech buněk z kultivátoru. Jestliže specifická růstová rychlost bude převyšovat zřeďovací rychlost, budou bakterie dokonale využívat substrát a úměrně s tím zvyšovat počet buněk. Snížení koncentrace substrátu při jeho dokonalejším využití vyvolává však na druhé straně jeho nedostatek, a tím i snížení specifické růstové rychlosti. Proto se v systému vytvoří nový ustálený stav, v němž se hodnoty obou veličin vyrovnají, čili µ = D. Tuto charakteristickou vlastnost kontinuálního procesu, spočívající ve vyrovnání hodnot µ a D až do rozmezí µm, označujeme jako samoregulační schopnost uvažovaného systému. Vztahy mezi nejdůležitějšími parametry kontinuální kultivace ilustruje obr. 4.

Obr. 4. Vztahy mezi růstovou rychlostí bakterií (osa A, [g.l-1h-1] ), jejich generační dobou (osa B, [h]), hustotou bakteriální suspenze (osa C, [g.l-1] ) a koncentrací substrátu (osa C, [g.l-1] ) na zřeďovací rychlosti D [h-1] při průtokové kultivaci v chemostatu. Dm představuje zřeďovací rychlost při maximální produkci bakterií, Dc zřeďovací rychlost, při které již dochází k vymývání bakterií.

Metody průtokové kultivace mají dalekosáhlý význam zejména z hlediska fyziologického. Tím, že poskytují bakteriím plynulé zásobování živinami a současně odstraňují využité prostředí, včetně škodlivých metabolitů, navozují pro životní úkony bakteriálních buněk dynamické podmínky. Tyto ŘÍZENÍ KULTIVACE ŘAS VE FOTOBIOREAKTORU

-7-


[T9TO2]

podmínky odpovídají způsobu života bakterií nesporně lépe než podmínky statické kultivace, neboť buňky jsou zde udržovány v trvale aktivním fyziologickém stavu. V dynamických podmínkách proudícího prostředí mají proto bakterie možnost plně rozvinout procesy růstu a látkové výměny, poněvadž jejich růst zde není limitován nepříznivě působícími změnami prostředí, jak je tomu při statické kultivaci.

1.4. Heterotrofní kultivace řas rodu Chlorella Jednobuněčné řasy a sinice neboli ve volné překladu mikrořasy (z ang. „microalgae“) představují pro biotechnologii velký potenciál. Vděčí tomu zejména velkou rozmanitostí produkujících metabolitů danou jejich ohromnou biodiverzitou. Většina biotechnologických aplikací jednobuněčných řas je zaměřena na autotrofní růst. Avšak některé jednobuněčné řasy jsou schopné i heterotrofního růstu, tj. získávat uhlík a energii z organických molekul. Heterotrofní kultivace jednobuněčných řas nabízí relativně nízké vstupní náklady a již prověřenou kultivaci v klasických fermentorech. Takto vedená kultivace se hodí jak pro vysoce hodnotné produkty (HVP - high value products) (EPA, DHA, astaxanthin, lutein), tak pro masovou produkci biomasy pro krmivářské a energetické účely. V dnešní době má velký potenciál heterotrofní kultivace jednobuněčných řas na odpadním surovém glycerolu pocházející z výroby bionafty, která je EU a USA dotačně podporována. Tím se glycerol stal velice levnou komoditou. Nejvhodnějšími kandidáty jsou Chlorella vulgaris, Chlorella protothecoides a Schizochytrium limacinum. Tyto řasy dokážou využít glycerol jako zdroj uhlíku a energie a zároveň akumulovat značné množství lipidové frakce ve své sušině. Tato lipidová frakce může být např. znovu využitá v procesu esterifikace k výrobě bionafty. Umělá produkce mikrořas by měla co nejvíce napodobovat přirozené podmínky, aby bylo dosaženo optimálního růstu. Za přirozených podmínek mikrořasy přes den absorbují solární záření, asimilují oxid uhličitý ze vzduchu a nutrienty z vody za současné produkce kyslíku a biomasy. Využití přirozených podmínek má zřejmé výhody v tom, že je možné využít solární záření, které je neomezeným zdrojem energie. Umělé osvětlování má naopak výhodu v nepřetržitém osvětlení, avšak velké náklady na umělé osvětlování zabraňují jeho využití v plném měřítku. Pro řádný růst mikrořas je nutné zajistit: -

zdroj uhlíku (ve formě CO2 z atmosféry nebo spalinových plynů, případně ve formě uhlovodíků); nutrienty (dusík, fosfor a draslík); mikronutrienty (železo, vápník, křemík, mangan, měď, zinek a další); fotosynteticky aktivní záření (tzn. záření o vlnové délce 400 až 700 nm); vodu a vhodné růstové podmínky.

Mikrořasy mohou být produkovány heterotroficky nebo mixotroficky, avšak v současnosti je nejběžnějším produkce autotrofní, protože je to jediný způsob produkce, který je technicky a ekonomicky přijatelný. Systémy pro produkci mikrořas jsou dvojího typu: (1) otevřené nádrže, a (2) uzavřené fotobioreaktory. Otevřené nádrže jsou nejstarším systémem pro produkci mikrořas. Tyto nádrže tvoří


-8-


[T9TO2]

mělká (20 až 50 cm hluboká) uzavřená smyčka s kolesovým kolem pro míchání, recirkulaci a předcházení sedimentace. Otevřené nádrže jsou levnější pro velkoprodukci, mají nižší energetické nároky a nevyžadují tolik obsluhy a údržby. Naopak koncentrace biomasy je v otevřených reaktorech poměrně nízká. Uzavřené reaktory byly navrhovány tak, aby byly vyřešeny problémy spojené s otevřenými nádržemi – např. snížení rizika kontaminace v případě, že jsou mikrořasy využívány k produkci léčiv. Uzavřené reaktory jsou tvořeny uzavřeným potrubím, nebo plochými deskami tvořící uzavřený okruh. Cena sklízení biomasy může být u uzavřených fotobioreaktorů podstatně nižší než u otevřených nádrží díky tomu, že koncentrace biomasy jsou vyšší (tzn. zpracovávají se menší objemy vody). Naopak pořizovací cena uzavřených fotobioreaktorů je vyšší ve srovnání s otevřenými nádržemi. Limitujícím faktorem pro růst řas je mnohdy dostupnost slunečního záření. Nejvíce záření dopadá na oblasti kolem rovníku a směrem od něho intenzita záření klesá. V některých geografických pásmech je intenzita dále ovlivněna ročním obdobím. Tyto poznatky je nutné vzít v úvahu při projektování elektrárny ve vybrané lokalitě. Kromě světla je také třeba vzít v úvahu dostupnost zdroje sladkovodní nebo mořské vody v závislosti na druhu řasy. Z hlediska energetické bilance je stále velmi problematická vysoká spotřeba energie pro čerpání a míchání suspenze řas v reaktorech a sklízení (zahušťování) řas. Tubulární i deskové reaktory jsou sice vysoce efektivní pro tvorbu i relativně koncentrovaných suspenzí, ale jsou z energetického hlediska velice náročné (nehledě na jejich vysoké konstrukční náklady). Oproti tomu šetrnější a levnější reaktory typu „raceway“ dosahují podstatně nižších objemových (a tedy i plošných) výtěžků biomasy, což významně prodražuje sklízení (sedimentace, odstřeďování, filtrace). Některé druhy mikrořas jsou schopné heterotrofického růstu, tzn. bez přísunu světla s využitím organického uhlíku jako zdroje energie. Autotrofní růst má totiž mnohé nevýhody: pomalý růst v kulturách s vysokou koncentrace biomasy díky nedostatečnému prosvětlení nebo fotoinhibici při přímém slunečním záření a vysoké ceny na sklízení biomasy díky poměrně nízkým koncentracím biomasy. Heterotrofní růst přináší několik výhod ve srovnání s autotrofním růstem: odstranění nutnosti dodávky fotosynteticky aktivního záření, lepší kontrola růstových podmínek a nižší náklady na sklízení biomasy díky vyšším koncentracím biomasy. Řasy rodu Chlorella se vyznačují rychlým růstem, relativní snadností pěstování a velmi kvalitním chemickým složením. Až 60 % tvoří bílkoviny, obsahující ve vyváženém poměru všechny esenciální aminokyseliny. Sacharidy, nejčastěji škrob, tvoří asi 20 % suché hmoty řas a lipidy (tuky) 15 %. Kromě 3–5 % chlorofylu, zeleného barviva s vysokým obsahem hořčíku, obsahuje Chlorella až 1 % karotenoidů. Důležitou složkou řasové buňky jsou biologicky vázané a tedy i dobře příjemcem využitelné minerální látky a stopové prvky. Chlorella také obsahuje významně více vitamínů a dalších látek (např. nenasycené mastné kyseliny - omega 3 a 6, karotenoidy, vitaminy, růstové faktory, chlorofyl, atd.) než jiné rostliny. Některé z produktů kultivace řas se již dnes využívají v potravinářském a kosmetickém průmyslu, v zemědělství i v medicíně. Značný obsah bílkovin je předurčuje k využití jako krmiva nebo doplňku stravy. V neposlední řadě jsou jednobuněčné řasy zkoumány pro využití v palivářském průmyslu jako zdroj mastných kyselin pro výrobu bionafty.


-9-


[T9TO2]

2. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 2.1 -

Zadání Proveďte heterotrofní kultivaci mikrořas rodu Chlorella Sledujte kontinuálně průběh kultivace pomocí čidel a řiďte podmínky kultivace Prostudujte vliv zvoleného organického substrátu na výtěžnost řasové biomasy Určete množství akumulovaného železa v řasové biomase během kultivace Výsledky zpracujte tabelárně i graficky.

2.2 Pracovní postup 2.2.1 Příprava základního média pro kultivaci násady Do 1L uzavíratelné láhve se nejprve nadávkuje 100 mL destilované vody a pak: o o o o o o o o

1,5 g NaNO3 1,8 mL fosforečnanového pufru 3,3 mL roztoku MgSO4x7H2O 1,3 mL roztoku CaCl2 2 mL roztoku stopových prvků 2 mL roztoku kyseliny citronové o koncentraci 6 g/L 1 mL roztoku Na2EDTA o koncentraci 1 g/L 1 mL roztoku Na2CO3 o koncentraci 20 g/L

Destilovanou vodou se doplní objem láhve na 1L a adjustuje se pH na hodnotu 7,1 pomocí koncentrovaného roztoku HCl nebo NaOH. Láhev se následně uzavře a sterilizuje po dobu 20 minut v tlakovém hrnci při teplotě 120 °C. Po ochlazení láhve na laboratorní teplotu je kultivační médium připraveno k použití.

2.2.2

Roztoky pro heterotrofní kultivaci

Organické médium Dle zadání vyučujícího připravte 1 dm3 organického substrátu o koncentraci 60 g/L, který bude sterilizován po dobu 20 minut při 110 °C. Do zásobníku 1 (viz obr. 6) se dávkuje 50 mL organického média na 1L doplňované vody.

Minerální médium Pro přípravu minerálního média se použije roztok komerčně dostupného hnojiva pro rostliny s obsahem prvků N-P-K v poměru alespoň 15-3-4 a obsahem Fe-EDTA minimálně 0,2 %. Do zásobníku 2 (viz obr. 6) se dávkuje 10 mL hnojiva na 1L doplňované vody.


-10-


[T9TO2]

Obr. 5. Zapojení fotobioreaktoru pro kultivaci řasové násady. 1- vzduchovací motorek; 2 - reaktor s kotvovým magnetickým míchadlem; 3 - LED osvětlení; magnetické míchadlo.

2.2.3

Kultivace řasové násady Do 2L sterilní nádoby reaktoru (obr. 5.) se nadávkuje 1 L připraveného kultivačního média a přidá se 50 mL řasového inokula. Nádoba reaktoru se uzavře víkem, v němž je připojen vývod pro vzduchovací motorek a uchyceno magnetické kotvové míchadlo. Na plášť nádoby se připojí LED osvětlení a spustí se vzduchovací motorek. V pravidelných časových intervalech (minimálně dvakrát za den) se odebírají vzorky pro určení optické hustoty na UV/VIS spektrofotometru a pro stanovení sušiny. Kultivace násady se provádí po dobu 72 hodin.

2.2.4

Velkoobjemová heterotrofní kultivace řas Nejprve se sestaví aparatura (obr. 6.) pro heterotrofní kultivaci a vyučující překontroluje správnost zapojení. Pak se do nádoby bioreaktoru (5) nalije 1 L kultivační násady, přidá se 15L pitné vody a spustí se vzduchovací kompresor (3). Do zásobníků (1) a (2) se na počátku experimentu nalije minimálně 1 L pitné vody a následně se spustí peristaltické čerpadlo (4). Vyučující zadá hodnotu průtoku na vstupu do modelu, která by měla činit alespoň 250 mL/h. Do zásobníků (1) a (2) se připraví takové množství roztoků, aby zásoba vystačila alespoň na 30 hodin provozu bioreaktoru. Biomasa vyprodukovaná v


-11-


[T9TO2]

bioreaktoru je samospádem odváděna do zásobníku (8). Sledování procesu kultivace je prováděno sadou čidel (6) umístěných v průtočných celách, která jsou propojena s počítačem (7), kde jsou naměřená data z procesu kultivace ukládána. Adjustace parametrů kultivace je prováděna přídavkem vhodných chemických činidel přes víko bioreaktoru, přes které se obdobně odebírají i vzorky z bioreaktoru pro stanovení optické hustoty, čistoty, sušiny a obsahu železa v kultivované biomase.

Obr. 6. Sestava bioreaktoru pro heterotrofní laboratorní kultivaci. 1 - zásobník s organickým médiem; 2 - zásobník s minerálním médiem; 3 - kompresor; 4 - peristaltické čerpadlo; 5 - bioreaktor se vzduchovacím elementem; 6 - průtočné cely se sadou čidel pro sledování kultivace; 7 - počítač s měřícím softwarem Magic XBC; 8 - zásobník pro jímání řasové biomasy.

Kultivace řas v bioreaktoru se provádí po dobu 96 hodin, přičemž každý den je nutno provádět kontrolu chodu laboratorního reaktoru. Při každodenní kontrole (mimo neděli a svátky) se odebírají vzorky ze vstupu do bioreaktoru, vzorky biomasy z reaktoru a zásobníku (8). U odebraných vzorků z reaktoru (5) a zásobníku (8) se stanoví sušina, provede se měření optické hustoty a kontrola kultury pod optickým mikroskopem. Dále se sleduje průtok na vstupu do modelu, spotřeba roztoků v zásobnících (1) a (2), množství jímané biomasy v zásobníku (8) a zapisují se čidly (6) sledované veličiny. Provádí se rovněž kontrola těsnosti hadic a kontrola chodu peristaltického čerpadla. Všechny odebrané vzorky je nutno před dalšími stanoveními zamrazit. Zásobník (8) na jímání biomasy se po provedení odběru vzorků vyprázdní a vypláchne pitnou vodou. Do zásobníků (1) a (2) se doplní potřebné množství roztoků, aby byl zajištěn provoz minimálně do další kontroly. Na konci experimentu se všechny odebrané vzorky rozmrazí a provedou se stanovení CHSK a obsahu železa ve všech odebraných vzorcích vhodnou analytickou metodou.


-12-


[T9TO2]

2.3 Pokyny pro vypracování protokolu - Základní doporučení pro sepsání protokolu jsou uvedena v „Pomocníku pro psaní protokolů“, který lze najít na adrese: http://uiozp.ft.utb.cz/studmat/200721223234/Manu%C3%A1l.pdf - Naměřené a vypočtené hodnoty přehledně zpracujte do tabulek a grafů, které musí být patřičně okomentovány v diskusní části protokolu. U údajů uváděných v tabulkách musí být uveden příklad výpočtu jednoho řádku tabulky. Ve vzorcích použitých při výpočtech uvádět popis veličin i jednotky, v nichž se do vzorce dosazuje. - Podmínky provozu a výsledky měření a analýz průběžně zapisujte do sumární tabulky (jednotlivé skupiny chronologicky), která je u úlohy k dispozici. Zapisujte vše, včetně případných nedostatků, výpadků provozu i třeba atypických výsledků (byť se vám nelíbí). - Vaši část výsledků zpracujte analogicky v laboratorním protokolu. Stanovte stupeň využití substrátu, výtěžnost biomasy, specifickou růstovou rychlost. - V závěru protokolu pak proveďte sumarizaci a zhodnoťte výsledky.

3. OBECNÁ PRAVIDLA §1:

Pozdní příchody do laboratoří nebudou tolerovány. Do laboratorních cvičení student přichází řádně vybaven (pracovní návod, laboratorní deník, psací potřeby, laboratorní plášť, kalkulačka, chemické tabulky) a musí být obeznámen s danou úlohou, kterou má provádět.

§2:

Jestliže studentovy znalosti při vstupním přezkoušení budou shledány jako nedostatečné, a nebude vypracována domácí příprava, bude z laboratoře vyloučen a úlohu musí nahradit v jiném termínu.

§3:

Odchod od laboratorní úlohy je třeba vždy nahlásit vyučujícímu. V případě, že student chce úlohu ukončit, musí laboratorní stůl uklidit a předat laborantce nebo vedoucímu cvičení.

§4:

Protokoly musí být odevzdány vždy následující týden. Jestliže student protokol neodevzdá, bude mu s každým následujícím týdnem přidělen vždy jeden výpočtový příklad, který bude nedílnou součástí protokolu.

§5:

V případě prokázání opisování protokolů, tento nebude uznán jak zdrojové skupině, tak skupině plagiátorské. Obě skupiny budou muset úlohu opakovat a protokoly znovu vypracovat.

POUŽITÁ LITERATURA 1. 2.

Kaštánek, F., Bioinženýrství2001, Praha: Academia. 334. Vodrážka, Z., Biotechnologie1991, Praha: VŠCHT.


-13-


[T9TO2]

Příloha 1: Sledování technologických veličin aktivačního procesu programem XBC Magic

Nejprve spusťte program Magic XBC, kliknutím na ikonu.

V úvodním dialogovém okně vyberte uživatele: STUDENT a klikněte OK. Po zobrazení dialogového okna s měřenými veličinami vyberte z hlavní nabídky položky: Datalogger > Záznam dat Data lze ukládat jak lokálně na disk počítače, tak je posílat online na vybraný databázový server. Pro ukládání do databáze zvolte položku „Připojení k databázi“. Pro ukládání naměřených údajů do databáze je potřeba znát adresu serveru a přístupové údaje. Tyto informace získáte od vedoucího cvičení. V případě poruchy je třeba spojení s databází opět nastavit. ŘÍZENÍ KULTIVACE ŘAS VE FOTOBIOREAKTORU

-14-


[T9TO2]

Údaje uložené v počítači lze prohlížet jak v tabulkové formě, tak i v grafické formě. V prvním kroku je třeba vybrat soubor s naměřenými daty zvolením položek menu: Datalogger > Prohlížení dat > Ze souboru > Výběr souboru. V druhém kroku pak z menu vyberete zobrazení ve formě tabulky nebo grafu.

Při zobrazení dat v grafické podobě, lze ještě upravovat popis jednotlivých os kliknutím na tlačítko „Nastavení“. Graf lze vytisknout nebo překopírovat do schránky a následně vložit do programů Word nebo Malování.

Průběh měřených veličin během pokusů lze sledovat i on-line přes webové rozhraní na adrese: http://reaktor.remediace.cz, jak je zobrazeno na obr. 7. Výběr zobrazených veličin lze provádět buď kliknutím na příslušný senzor na obrázku reaktoru, nebo výběrem z menu. Zobrazený graf lze libovolně přibližovat i oddalovat výběrem dvou bodů z časové osy.


-15-


[T9TO2]

Obr. 7. Příklad zobrazení průběhu koncentrace kyslíku pomocí webového rozhraní.


-16-


[T9TO2]

Příloha 2.: Stanovení CHSK – dichromanová metoda ve zkumavkách (dle modifikované normy ČSN ISO 15705) Stanovení CHSK dichromanovou metodou lze provádět dvěma způsoby. První způsob je založen na reakci dichromanu draselného s organickými látkami v kyselém prostředí, přičemž reakce probíhá v otevřeném systému, který je zahříván pod zpětným chladičem. Nezreagovaný dichroman je nakonec titrován síranem amonno-železnatým na indikátor ferroin (rovnice 1 a 2). K2Cr2O7 + 14H+ + 6e-  2Cr3+ + 2K+ + 7H2O

/1/

K2Cr2O7 + 6Fe2+ + 14H+  2Cr3+ + 6Fe3+ + 2K+ + 7H2O

/2/

Druhý způsob je založen na měření absorbance vzniklého trojmocného chromu při vlnové délce 600 nm, který vznikl reakcí dichromanu s organickou látkou (rovnice 1) v uzavřené reakční nádobě. Touto metodou lze stanovit CHSK až do hodnoty 1000 mg/l.

Použité chemikálie 1. Demineralizovaná voda - Voda prostá organických nečistot a látek, které mohou podléhat oxidaci.

2. Oxidační roztok - Roztok se připraví tak, že do 500ml odměrné baňky se nalije přibližně 350 ml demineralizované vody a přidají se následující chemikálie: 5,1080g K2Cr2O7, 83,5 ml konc. H2SO4, 16,65 g HgSO4. Po dokonalém rozpuštění látek se roztok doplní na 500 ml demineralizovanou vodou.

3. Katalyzační roztok - Do 1 litru konc. H2SO4 se nasype 10,0 g Ag2SO4 a láhev se nechá alespoň dva dny stát. Výsledný roztok by měl být čirý.

4. Hydrogenftalan draselný (KHF; C8H5O4K – Mr = 204,22 g/mol) - Zásobní roztok standardu o koncentraci CHSK = 1000 mg/l se připraví následovně. V 500ml odměrné baňce se rozpustí 0,4255 g KHF a baňka se doplní demineralizovanou vodou.

Použité zařízení -

Zařízení pro mineralizaci – ohřívací box (umožňující udržet teplotu 150 °C) Zkumavky pro mineralizaci z kyselinovzdorného skla (odolné vůči tlaku do 600 kPa) Pipety o objemech 1 ml, 2 ml a 3ml


-17-

Ústav inženýrství ochrany životního prostředí, FT, UTB ve Zlíně -

[T9TO2]

Fotometr schopný měřit při 600 nm Kádinky, váženka, lžička, ochranný štít

Pracovní postup - !!! POZOR !!! 0. Pokud vedoucí cvičení neurčí jinak, je možno použít kalibrační křivku v návodu pro stanovení CHSK z předmětu Technologie vod. 1. Při zahřívání reakční směsi v uzavřených zkumavkách nastává přetlak, z tohoto důvodu se zkumavky nesmějí otvírat, dokud nevychladnou! Zkumavky, které vykazují vady na skle nebo jsou poškrábané, se nesmějí používat pro stanovení, aby nedošlo k jejich explozi! 2. Po proběhnutí mineralizace se obsah zkumavky nesmí míchat před fotometrickým stanovením CHSK. 3. Výsledek stanovení mohou významně ovlivnit nečistoty nebo rýhy na stěnách zkumavek, proto se doporučuje změřit hodnotu absorbance pro každý vzorek minimálně třikrát. 4. Vždy se musí provádět i slepé stanovení s destilovanou vodou.

I.

Příprava kalibračních standardů, slepého pokusu a úprava nativních vzorků

Do čistých 10ml odměrných baněk se napipetují takové objemy zásobního roztoku KHF, aby se jeho koncentrace v kalibračních roztocích pohybovala v rozmezí 0 – 500 mg/l. Vypočtené objemy pipetovaného roztoku standardu KHF i zvolené koncentrace kalibračních roztoků musí zkontrolovat vyučující před dalším pokračováním v úloze. Po provedení mineralizace a vychládnutí zkumavek se provede měření jejich absorbance a sestrojí se kalibrační křivka závislosti absorbance na CHSK.

II.

Provedení mineralizace

1. Otevřete mineralizační zkumavky 2. Pod úhlem 45° dávkujte pipetou do zkumavky postupně následující roztoky (!!! POZOR !!! Celkový objem roztoků dávkovaných do zkumavek nesmí přesáhnout 6 ml):


-18-


[T9TO2]

1 ml oxidačního činidla 2 ml vzorku vody 3 ml roztoku katalyzátoru (!!! POZOR !!! NEPOTŘÍSNIT ZÁVIT ZKUMAVKY !!!) 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

III.

Zkumavky uzavřete a uzávěry těsně zašroubujte. Zkumavky opláchněte demineralizovanou vodou. Zkumavky utřete do sucha čistou papírovou utěrkou. Uchopte zkumavku za uzávěr a nad výlevkou ji několikrát obraťte. Mezitím zapněte mineralizační box a vložte do něj zkumavky (vyhřívání na 150 °C trvá přibližně 15 min.) Zkumavky zahřívejte v mineralizačním boxu po dobu 2 hodin. Po uplynutí požadované doby ještě horké zkumavky vyjměte z boxu a několikrát je obraťte. Pak ji umístěte do stojanu a nechte vychladnout na laboratorní teplotu. Otřete stěny zkumavky papírovým hadříkem. Vložte zkumavky do fotometru a proveďte měření absorbance při vlnové délce 600 nm. Vzorky měřte vždy proti destilované vodě.

Fotometrické stanovení CHSK

11. Zapněte fotometr. 12. Zadejte číslo programu – „0“ a potvrďte „ENTER“. Nastavte vlnovou délku „600 nm“ na malém displeji. 13. Do kyvetového prostoru vložte zkumavku s destilovanou vodou a kyvetový prostor zakryjte stínítkem. 14. Stiskněte „ZERO“ a na displeji se zobrazí „Zeroing“ 15. Do kyvetového prostoru vložte zkumavku se vzorkem a opět kyvetový prostor zakryjte stínítkem. 16. Nyní stiskněte „READ“, na displeji se zobrazí „Reading“ a naměřená hodnota absorbance, kterou si zapíšete do laboratorního deníku. Z naměřených hodnot sestrojíte grafickou závislost absorbance na hodnotách CHSK, kterou ukážete vyučujícímu.

IV.

Vyhodnocení stanovení CHSK

U vzorků odpadních vod se hodnota CHSK odečte z kalibrační křivky, přičemž pro určení přesné koncentrace je třeba zohlednit i ředění vzorku.


-19-


[T9TO2]

Příloha 3.: Stanovení železa ve vzorcích vod pomocí AAS Rozsah užití metody je možno rozšířit směrem k nižším koncentracím zakoncentrováním vzorku vody (okyselené) opatrným odpařením na menší objem. V případě vysokých koncentrací lze vzorek ředit. Používané laboratorní sklo musí být před použitím pečlivě vylouženo v ředěné kyselině dusičné a vypláchnuto destilovanou vodou. V případě vysokých obsahů povrchově aktivních látek může docházet ke zkreslení výsledků vlivem interference zmlžování. V takovémto případě přidejte ke standardům i ke vzorkům 0,2 ml na 100 ml přípravku TRITON X 100 z produkce firmy MERCK. Doporučuje se používat pravidelnou analýzu vnitřního standardu a sestavování regulačního diagramu.

Odběr a úprava vzorku: 1. Odběr vzorku Pro odběr vzorků se musí používat nádoby z polyetylenu nebo borosilikátového skla, které byly předem vylouženy v ředěné kyselině dusičné a následně pečlivě vypláchnuty destilovanou vodou.

2. Úprava a konzervace vzorku a) Stanovení celkového obsahu Fe Bezprostředně po odběru musí být vzorek konzervován kyselinou dusičnou na pH 1-2 (obvykle stačí 2 ml kyseliny na 1 l vzorku). Čistota použité kyseliny musí být minimálně p. a. b) Stanovení rozpuštěného obsahu Fe Co nejdříve po odběru se vzorek zfiltruje přes membránový filtr (velikost pórů 0,45 um) a bezprostředně poté se zakonzervuje kyselinou dusičnou na pH 1-2 (obvykle stačí 2 ml kyseliny na 1 l vzorku). Čistota použité kyseliny musí být minimálně p.a. Membránové filtry se musí před použitím důkladně vyloužit v ředěné kyselině dusičné a opláchnout destilovanou vodou. c) Slepý pokus (Sample Blank) Spolu se vzorky se připravuje slepý pokus, který musí obsahovat stejný přídavek konzervačního činidla, tedy kyseliny dusičné. Pozor: musí být použita kyselina z jedné láhve!!!

3. Příprava standardů Pro přípravu standardů použijte komerční standard s garantovaným obsahem 1 g/l Fe. Připravte si zásobní roztok o koncentraci 10 mg/l (s obsahem 1 ml HNO3 na 100 ml roztoku).


-20-


[T9TO2]

Standardy s obsahem 5, 2, 1, 0,5, 0,25 a 0,1 mg/l připravíte napipetováním 50, 20, 10, 5, 2,5 a 1 ml zásobního roztoku 10 mg/l do 100 ml odměrných baněk, přidáte 1 ml HNO 3 p.p. a doplníte destilovanou vodou po značky. Spolu se standardy se připravuje slepý pokus stejným postupem, pouze bez pipetování komerčního standardu. Životnost standardů: Takto připravené standardy mají životnost minimálně 1 týden. Zásobní roztok 10 mg/l má životnost minimálně 1měsíc.

Tab. 1. Parametry měření na přístroji GBC Avanta METHOD PROPERTIES

INSTRUMENT PARAMETERS

SYSTEM TYPE

Flame

SAMPLE INTRODUCTION

Manual

OVERRANGE SAMPLES

-

LAMP CURRENT [mA]

7

WAVELENGTH [nm] SLIT WIDTH [nm] SLIT HEIGHT BACKGROUND CORRECTION MEASUREMENT MODE

MEASUREMENT READ TIME [s] PARAMETERS TIME CONSTANT REPLICATES

CALIBRATION PARAMETERS

QUALITY PARAMETERS

FLAME CONTROL PARAMETERS

CALIBRATION MODE CONC. UNITS CONC. DECIMAL PLACES CALIBRATION FAILURE ON CALIBRATION FAILURE LIMIT CALIBRATION FAILURE ACTION ZERO BEFORE CALIBRATION ZERO BETWEEN SAMPLES MEAS. SAMPLE BLANK AFTER CAL. AUTO SAVE METHOD AFTER CAL. CHECK SAMPLE CONC. [mg/l] ACCEPTABLE RANGE CHECK SAMPLE FAIL ACTION CHECK SAMPLE FLAG FLAME TYPE FUEL FLOW [l/min] AIR FLOW [l/min] BURNER ANGLE [°] WORKHEAD HEIGHT [mm]


248,3 0,2 Normal On Integration 3 0,5 3 Conc Least Squares mg/l 3 R Value 0,95 Stop Yes No No Yes 0.2 80 – 120 % Stop * Air – Acetylen 1,6 10 0 11,2 -21-


[T9TO2]

4. Postup analýzy V sekvenci vzorků “Voda” zvolte start kalibrací. Po kalibraci zvolte pro každou sérií vzorků příslušný slepý pokus (Sample Blank) a zadejte názvy vzorků. V sekvenci je zadána automatická rekalibrace po každých deseti vzorcích. V případě většího počtu vzorků počítejte s tím, že přístroj Vás po každých deseti vzorcích vyzve k vložení rekalibračního standardu 5 mg/l Fe. V oddílu analýza si zvolte jméno metody „pitné vody Fe plamen.mth“ a zadejte název souboru kam chcete uložit výsledky. Po zadání těchto parametrů provedete automatické zapálení plamene stisknutím žlutého tlačítka na spektrometru nebo stlačením ikony ze software. Po 3 minutách nutné stabilizace systému při stanovení Fe klikněte na ikonu Start a spektrometr Vás bude automaticky vyzývat k vložení příslušného roztoku. Po ukončení analýzy před vypnutím přístroje proveďte promytí vzorkovacího systému spektrometru destilovanou vodou (10 minut). Promytí systému je nutné modifikovat v případě kritických vzorků.


-22-


[T9TO2]

Příloha 4.: Voltametrické stanovení železa

Elektrolyt: pyrofosfát sodný (Na4P2O7 x 10 H2O) pH = 10,3 AE : Pt; RE : Ag/AgCl/KCl 3M Nastavení parametrů stanovení v programu NOVA: DPPOL (-20 mV), DME ; Ustart = -50 mV; Uend = -1300 mV; Ep [Fe(II)] = -320 mV; Ep [Fe(III)] = -850 mV

Příprava standardu: Vhodným ředěním standardního roztoku chloridu železitého se připrav pracovní roztok pro vyhodnocování výsledku měření metodou standardních přídavků.

Postup stanovení: Do polarografické nádobky se odpipetuje přesně 3 ml mineralizátu zkoušeného vzorku a přidá se 10 ml roztoku elektrolytu. Totéž se provede s mineralizátem referenčního materiálu a slepého vzorku. Podle návodu nastavíme parametry měření v programu NOVA a provedeme měření. Záznam voltametrické křivky se provádí nejméně dvakrát vedle sebe. Potom se k mineralizátu přidá vhodným dávkovačem 100 µL roztoku standardu železa. Po promíchání se opět zaznamená voltametrická křivka. Totéž se opakuje s dalšími přídavky stejného množství roztoku standardu železa o stejné koncentraci.

Při vyhodnocení se měří výška píku stanovovaného prvku od upravené základní linie. Vzhledem k citlivosti použité voltametrické metody se musí ověřit hodnota "slepého vzorku", kdy se zjistí případná kontaminace vzorku v průběhu mineralizace a rozpouštění, jejich přítomnost v použitých chemikáliích, apod. Provádí se celý postup zkoušky bez zkušebního vzorku. Obsah železa ve "slepém vzorku" se opět vyhodnotí metodou přídavku standardu.


-23-

Ústav inženýrství ochrany životního prostředí, FT, UTB Příloha 6.: Vzor provozního záznamového listu pro laboratorní model fotobioreaktoru

Poděkování Úloha byla vytvořena za finanční podpory projektu FT 11B/2014.

-24-

ŘÍZENÍ KULTIVACE ŘAS VE FOTOBIOREAKTORU

Recommend Documents