In vitro mutagenezis és Irányított evolúció
“The White House Office of Science and Technology Policy and the U.S. Patent and Trademark Office (USPTO) have announced the winners of the 2015 recipients of the Patents for Humanity Award, among them the Golden Rice Project.” “Golden rice is a variety of rice (Oryza sativa) produced through genetic engineering to biosynthesize betacarotene, a precursor of vitamin A, in the edible parts of rice. The research was conducted with the goal of producing a fortified food to be grown and consumed in areas with a shortage of dietary vitamin A,[2] a deficiency which is estimated to kill 670,000 children under the age of 5 each year.”
www.mdpi.com
Mutagenezis Mutáció: az eredeti DNS szekvencia megváltoztatása Mutagenezis céljai: 1. Gén(szakasz) szerepének meghatározása (fenotípus elemzés) 2. Géntermék (ált. fehérje) funkciójának megváltoztatása 3. Nem kódoló génszakaszok (pl. regulációs elemek) funkciójának vizsgálata, megváltoztatása In vitro mutagenezis típusai: 1. Random mutagenezis: random pozíciók változtatása és az érdekes fenotípusok és azokhoz tartozó genotípusok azonosítása 2. Helyspecifikus (site directed) mutagenezis: mutációk ésszerű tervezése ismert térszerkezet és/vagy szekvenciaösszehasonlítások alapján De novo szintézis: teljes gén szintézis (akár mutációval)
Random mutagenezis mutátor sejtvonalak
Deléciók DNS hibajavító útvonalakon hibafelhalmozódás pl. XL1-Red (endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac mutD5 mutS mutT Tn10 (Tetr))
kérdéses gén mutD5 mutS mutT plazmid
mutS: mismatch hibajavító mutD: pol III 3’-5’ exonukláz mutT: oxidatív stressz hibajavító Előny: - 5000x magasabb mutációs ráta (vs. wt) - nem szükséges egyéb technika (emésztés, PCR, ligálás, stb.) Hátrány: - 1 mut/2000 bp/ciklus - genóm és plazmid váz is mutálódik - ismételt DNS izolálási és transzformálási lépesek szükségesek
XL1-Red
n generáció
X X
mutD5 mutS mutT
X
X
XL1-Red
Random mutagenezis hibára hajlamos ‘error-prone’ PCR
B
templát
restrikciós enzim hasítóhelyek
A dNTP arányok
[Mg2+]
+[Mn2+]
mut
[Taq] NINCS 3’-5’ exo ‘proof-reading’
mut
hatékonyság/ DNS tisztítás mutáns sereg DNS emésztés méret-limt! ligálás mut
mut
mut
mut
expresszió
mut mut
Mutáns konstrukciók
ciklusszám (60)
Klónok fenotípus szerint szelekciója és azonosítása szekvenálással
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Mutációk bevitele észszerűen kiválasztott pozíciókba Észszerű tervezés kiindulópontjai: 1. Ismert szerkezet: funkcionálisan fontos(nak) tartott aminosavak kiválasztása 2. Rokon fehérjék szekvenciaanalízise: konzervált aminosavak cseréje
rokonokon belül különböző aminosavak cseréje
CLUSTAL 2.0.12 multiple sequence alignment
sequence1 sequence3 sequence2 sequence4
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR---E MASLAALLPLLALLVLCRLDPAQAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKSRREVEE MAPWMHLLTVLALLALWGPNSVQAYSSQHLCGSNLVEALYMTCGRSG-FYRPHDRRELED MAVWLQAGALLVLLVVSSVSTNPG-TPQHLCGSHLVDALYLVCGPTGFFYNP-KRDVEPL ** .:*.**.: .. . ******:**:***:.** * ** * *
sequence1 sequence3 sequence2 sequence4
AEVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN-LQVGQAELGGGPGAGGLQPSALELALQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN-LQVEQAELG--LEAGGLQPSALEMILQKRGIVDQCCNNICTFNQLQNYCNVP LGFLPPKSAQETEVADFAFKDHAELIRKRGIVEQCCHKPCSIFELQNYCN-. : . ...: ::*****:*** . *:: :*:****
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Mutálandó pozíciók azonosítása (PubMed, Uniprot, Expasy, JustBio, stb.) www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Mutálandó pozíciók azonosítása (PubMed, Uniprot, Expasy, JustBio, stb.) http://www.justbio.com/
1. Szerkezettel összevetni (ha van) 2. Meghatározni a cserélendő aminosavat
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Mutálandó pozíciók azonosítása (PubMed, Uniprot, Expasy, JustBio, stb.) www.ncbi.nlm.nih.gov/
1 - GCATTCTGAGGCATTCTCTAACAGGTTCTCGACCCTCCGCCATGGCCCCGTGGATGCATC - 60 1 M A P W M H L - 7 61 - TCCTCACCGTGCTGGCCCTGCTGGCCCTCTGGGGACCCAACTCTGTTCAGGCCTATTCCA - 120 8 L T V L A L L A L W G P N S V Q A Y S S - 27 121 - GCCAGCACCTGTGCGGCTCCAACCTAGTGGAGGCACTGTACATGACATGTGGACGGAGTG - 180 28 Q H L C G S N L V E A L Y M T C G R S G - 47 181 - GCTTCTATAGACCCCACGACCGCCGAGAGCTGGAGGACCTCCAGGTGGAGCAGGCAGAAC - 240 48 F Y R P H D R R E L E D L Q V E Q A E L - 67 241 - TGGGTCTGGAGGCAGGCGGCCTGCAGCCTTCGGCCCTGGAGATGATTCTGCAGAAGCGCG - 300 68 G L E A G G L Q P S A L E M I L Q K R G - 87 301 - GCATTGTGGATCAGTGCTGTAATAACATTTGCACATTTAACCAGCTGCAGAACTACTGCA - 360 88 I V D Q C C N N I C T F N Q L Q N Y C N - 107 361 - ATGTCCCTTAGACACCTGCCTTGGGCCTGGCCTGCTGCTCTGCCCTGGCAACCAATAAAC - 420 108 V P * T P A L G L A C C S A L A T N K P - 127 421 - CCCTTGAATGAG - 432 128 L E * X
- 147
1. Meghatározni a változtatandó aminosav kódját 2. Mutagenezis módszert választani a mutáció beviteléhez
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis PCR alapú mutagenezis megváltoztatott kóddal mutáció helye 5’ AGAGAAGCCGAGCTGAGCGGATCCTCACACGACTGTGAT……………………………CTGCAACCAAGCGGGTCTTACCCCCGGTCCTCCG 3’ 3’ TCTCTTCGGCTCGACTCGCCTAGGAGTGTGCTGACACTA……………………………GACGTTGGTTCGCCCAGAATGGGGGCCAGGAGGC 5’
GAATTCATG TGAGCGGATCCTCACACGACTGTGAT……………………………CTGCAACCAAGCGGGTCTTACCCCCTAGGGATCC 3’ GGTTCGCCCAGAATGGGGGATCCCTAGGGTAC 5’ 5’ 3’
5’
a mutáns pozicióba a megváltoztatott nukleotidot rendeljük
3’ 5’
ACTGGAATTCATGTGAGCGGATCCTTACACG 3’ ACTCGCCTAGGAGTGTGCTGACACTA……………………………GACGTTGGTTCGCCCAGAATGGGGG
‘upstream’ oligo: 5’ ACTGGAATTCATGTGAGCGGATCCTTACACG 3’ ‘downstream’ oligo: 5’ CATGGGATCCCTAGGGGGTAAGACCCGCTTGG 3’
a szekvencia közepén lévő kód megváltoztatása így nehézkes lehet a hasítóhelyek korlátozott száma miatt
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis PCR alapú mutagenezis megváltoztatott kóddal templát
Bmut restrikciós enzim hasítóhelyek
A PCR (A+B) mut
DNS tisztítás DNS emésztés ligálás mut
-
Mutáns konstrukció
a szekvencia közepén lévő kód megváltoztatása így nehézkes lehet a hasítóhelyek korlátozott száma miatt
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis PCR alapú deléció (domén trunkáció) templát
PCR
Primer1
Primer2
termék
Primer2
Primer1
termék Primer1
Primer2
termék
expresszió
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Megaprimer módszer templát
A
restrikciós enzim hasítóhelyek
Bmut
1. PCR (A+B) Az 1. PCR tisztított terméke a 2. PCR primere (megaprimer) C
templát
megaprimer 2. PCR (megaprimer + C)
Mutáció
Az eredeti hasítóhelyekre klónozható
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Megaprimer módszer - domén csere templát 1
A
B
prot 1
prot 2
templát 2
1. PCR (A+B)
templát 2
C
megaprimer 2. PCR (megaprimer + C) domén cserélt fehérje
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Primer meghosszabítás módszer
B A
D
B A
C 1. PCR (A+B, C+D)
D C
1. PCR (A+B, C+D) D
A
D
A 2. PCR (A+D)
2. PCR (A+D)
Deléció
Inszerció eu.idtdna.com alapján
eu.idtdna.com alapján
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Kunkel módszer
Fágmid (wt inszert) transzformálása dut- ungsejtvonalba (pl. CJ236)
Az dut- ung- sejtvonalban a T-k esetlegesen U-ra cserélődnek (emelkedett U szint, nincs hibajavítás)
dut- ung-
DUT: dUTPáz dut-: emelkedett dUTP szint UNG: uracil-N-glikoziláz ung-: nincs uracil eltávolítás a DNS-ből
m13 fág ssDNS izolásása G A
A
mutáns oligonukleotid anellálása az ssDNS-hez szálkiegészítés polimerázzal (dNTP, nincs dUTP) Mutáns konstrukció transzformálása ung+ sejtvonalba (pl. JM101)
Mutációt tartalmazó m13 fág ssDNS izolálható (kb. 80-90% mutáns) http://2011.igem.org alapján
ung+
ung+ sejtvonalban: 1. az Uracil tartalmú szál lebomlik 2. a mutációt tartalmazó szálhoz, mint templáthoz szintetizálódik az új szál
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis S-adenosyl-L-methionine (SAM) - metil donor
Quikhange módszer wikipedia.org
PCR
http://www.intechopen.com/books/ the-mechanisms-of-dna-replication
(SAM)
Dpn I hasítóhely
www.agilent.com
Primerek: 25-45 bp, Tm ≥ 78oC Tm = 81.5 + 0.41(%GC)-(675/N)-%mismatch (mismatch) Tm = 81.5 + 0.41(%GC)-(675/N) (inszerció, deléció) ’N’ nukleotidok száma a mutáns pozíciók nélkül
*Pfu Fusion: - 1 hiba/2.5 millió bp - Akár 19 kb termék - Hiba% 3x kisebb, mint PfuTurbo és 20x kisebb, mint Taq (Fusion: Pfu+DNS kötő domén fúziója)
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Kiterjesztett genetikai kód
aa-tRNS szintáz
STOP kódok/kodonok használata mutagenezisre:
NTA kötőhely
mutáns antikodon
aatRNS
C U A G A U
3’
5’
STOP kodon
Cél: nem természetes aminosavak (NTA) bevitele a fehérjébe (unnatural amino acids UAA) Mód: - mutáns aa-tRNS szintáz - mutáns tRNS antikodon - NTA a tápoldatban - Speciális E.coli törzs használata (mutált amber (UAG) kód: C321.ΔA)
Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Kiterjesztett genetikai kód https://biology.mit.edu/people/uttam_rajbhandary alapján
NEM TERMÉSZETES AMINOSAV MUTAGENEZIS
nem természetes aminosav tartalmú célfehérje
Fluoreszcens Fotoaktiválható Keresztkötő Spektroszkópiai próba Nanogold-jelölt Nehézfém tartalmú In vitro és in vivo alkalmazás
Irányított evolúciós technikák EVOLÚCIÓ NON-DIRECTED
information2share.files.wordpress.com/2011/07/the-evolution-of-man-and-woman.jpg
Irányított evolúciós technikák EVOLÚCIÓ A
variánstömeg
B
szaporodás öröklődés
A
A
A
B
B
A
A
A
B
B
C
változatosság szelekció
A
D
E
B
C
C
C
Irányított evolúciós technikák IRÁNYÍTOTT EVOLÚCIÓ A
B
C
D
E
F
változatosság (akár 1013 könyvtár)
szelekció A
B
C
D
E
F
szelekció A
B
azonosítás
C
A fehérjénk mely részét és milyen mértékben mutáljuk?
Irányított evolúciós technikák Egy 60 aminosav hosszúságú peptid összes variációja= 2060 = 1078 Egy 62 minosavas peptid összes variációja= 2062 = 5x1080 http://book.bionumbers.org/how-big-is-the-average-protein/
375 aminosavas fehérje= 20375 = 10488
260 aminosavas fehérje= 20260 = 10338
Irányított evolúciós technikák Egy 60 aminosav hosszúságú peptid összes variációja= 2060 = 1078 Egy 62 minosavas peptid összes variációja= 2062 = 5x1080 Atomok szama az univerzumban= 1078 - 1080
375 aminosavas fehérje= 20375 = 10488
Irányított evolúciós technikák
Variánsok (mutáns könyvtár) kialakítása: Random mutagenzis alapú - ‘error-prone’ PCR (ld. fent) - ‘szexuális’ vagy rekombinációs PCR Helyspecifikus mutagenezis alapú - telítési mutagenezis - ‘spiked’ oligo mutagenezis - ‘tailored’ oligo mutagenezis
Irányított evolúciós technikák Rekombinációs PCR természetes variánsok, ‘error-prone’ PCR termékek
DNáz I aspecifikusan emésztett termékek
PCR (minták keverésével; primerek nélkül) az emésztési termékek, mint primerek szerepelnek a kiindulási változatok rekombináns termékei: kombinatórikus könyvtár enzimek biotechnológiai fejlesztésére is használható
Irányított evolúciós technikák DNS oligonukleotid szintézis
http://www.vialattea.net/
Irányított evolúciós technikák Telítési mutagenezis: 6-7 pozícióban mind a 20 aa. kódolása … … … … NNS NNK A T G C
A T G G C C
A T G C
A T T G G C
32 féle kodon keverékét eredményezi: - mind a 20 aa. - 1 STOP (vs. 3 STOP - NNN) - egyenletesebb aa. eloszlás (mint NNN) - max. 6-7 pozíció (207= 109, ami a display technikák felső limitje)
Spiked oligo: csak 1-1 pozícióban tartalmaz nem wt nukleotidot Tailored oligo: csak 1-1 pozícióban és nem mind a 20 aa. kódja
Irányított evolúciós technikák Variánsok (mutáns könyvtár) bemutatása: Riboszóma bemutatás Fág bemutatás Sejtes (bakt., élesztő) bemutatás Bemutatási ‘display’ technikák jellemzői
2. szelekció fenotípus alapján (kötés erősség, fluoreszcencia, stb.)
1. bemutató rendszer természetes alkotójához fuzionált mutáns variánsok
Irányított evolúciós technikák Riboszóma bemutatás Reverz transzkripció + PCR
Transzkripció (T7 pol)
DNS
DNS könyvtár mRNS
mRNS könyvtár
mRNS
rögzített célmolekula
Transzláció
mRNS izolálás kérdéses fehérje linker peptid mRNS
Szelekció
riboszóma
nincs STOP, nem disszociál
(affinitás)
Fehérje-Riboszóma-mRNS komplex
Irányított evolúciós technikák m13 fág bemutatás m13 bakteriofág
bemutatásra használt fehérjék
P3
P6
P8
P7
P9
méret (aa) méret (kDa) db/virion
http://openi.nlm.nih.gov/ alapján
valencia: hány db bemutatott fehérje/ peptid van egy víruson aviditás: a több 1000 gyenge kötés eredményezhet “erős” affinitású fenotípust
Irányított evolúciós technikák m13 fág bemutatás A táplevesben az összes variánst bemutató fágklón megjelenik
emésztett fágmid (pBluescript)
mutáns variánsok (ld.fent)
+
-
+
+
fág burokfehérje (P3, P6, P8) + linker peptid
kérdéses fehérje
+
+ +
ligálás +
-
+
+
transzformálás
+ +
mutáns DNS könyvtár
fágtermelés
-
+
+
+
+
Irányított evolúciós technikák m13 fág bemutatás kérdéses fehérje
rögzített kötőpartner
fág burokfehérje (P3, P6, P8)
+
+
+
+
szelekció
+
+
Y PGA F TVIC mutáns azonosítás fág/DNS izolálás szekvenálás
szelekciós ciklusok (affinitás, aviditás,valencia)
+
+ fágtermelés
kötő fágok izolálása és transzformálása
Irányított evolúciós technikák Sejtes bemutatás gén -expr.
Sejtfelszínen megjelenik a fuzionált fehérjénk (akár több 10,000/sejt)
kérdéses fehérje
inkubálás fluorescencen jelölt partnerrel jelölt partnerfehérje
másik partnerfehérje másféle jellel
Irányított evolúciós technikák Sejtes bemutatás
Fluoreszcencia alapú szortírozás (FACS)
1. Van-e fluoreszcencia?
Irányított evolúciós technikák Sejtes bemutatás
Fluoreszcencia alapú szortírozás (FACS)
2. Jelintenzitás alapján (arányos a kötés erősségével)
Irányított evolúciós technikák Sejtes bemutatás
Fluoreszcencia alapú szortírozás (FACS)
3. Keresztreakciók kimutatása (pl. ellenanyagok esetén)
Irányított evolúciós technikák Sejtes bemutatás + nanocsepp szortírozás enzimaktivitás alapján Agresti et al 2010 PNAS alapján
bemutatott enzim
sejt+szubsztrát
≤ 1 sejt/csepp élesztő mutáns könyvtár
sejt
szubsztrát
termék
Irányított evolúciós technikák nanocsepp szortírozás
Kintses et al 2010 Chem Biol
Kintses et al 2010 Chem Biol
csepp gyártás
Agresti et al 2010 PNAS
Kintses et al 2010 Chem Biol Kintses et al 2010 Chem Biol
Irányított evolúciós technikák nanocsepp szortírozás
Kintses et al 2010 Chem Biol
Irányított evolúciós technikák nanocsepp szortírozás
Agresti et al 2010 PNAS
