Hemolýza erytrocytů ultrazvukem Optimalizace měřících postupů Stručné seznámení s tématem a rozbor dosavadně provedených meření. Vránová Kateřina 18.3.2011
Teoretický úvod Erytrocyty, známé spíše pod názvem červené krvinky, jsou buňky obsaženy ještě s dalšími látkami v krvi. V této práci se budu zaměřovat na koňskou a beraní krev, které jsem pod určitou intenzitou a dobou ozvučila pomocí terapeutického ultrazvuku. Díky účinkům ultrazvuku dochází k hemolýze erytrocytů, tzn. rozrušení cytoplazmatické membrány červených krvinek (zánik). Účinky ultrazvuku rozdělujeme: 1. Přímé: Tepelné – určitá část mechanické energie ultrazvukového záření se mění na teplo. Mechanické – vyvolaná mechanickými silami závislými na vysoké frekvenci ultrazvuku. Kavitační – jakmile překročí tlakové kmity kavitační práh, dochází ke vzniku kavitačních bublin. Tyto bubliny kmitají radiálně, tzn. že kavitační bublina se zvětšuje a zmenšuje a může dojít i ke kolapsu bubliny, kdy mateřská bublina zanikne a vznikne spoustu jiných malých bublin. V prostředí, ve kterém ke kavitaci dochází, může docházet k poškození. V měřeních, která jsem prováděla díky kavitačním účinkům zanikaly červené krvinky. 2. Nepřímé Chemické – při kolapsu kavitační bubliny dochází k tzv. Disociaci – rozštěpení vodní páry na OH radiály a H atomy. Definice ultrazvuku zni: ,, Ultrazvuk je mechanické (akustické) vlnění s frekvenci větší než 20 kHz''. Známe 2 typy aplikací ultrazvuku: Diagnostický - používá se především pro lékařské účely. Jeho frekvence je 3-10 MHz. Ultrazvukové vlny procházejí tělem a odrážejí se od jednotlivých orgánů resp. od přechodů mezi tkáněmi s různou akustickou impedancí. Podle toho jak velká frekvence je zvolena, podle toho se mění hloubka zobrazení. Čím větší frekvence, tím více se snižuje hloubka zobrazení. Terapeutický – využívá se především v lékařství k léčebným procedurám. Jeho frekvence se pohybuje nejvýše do 3 MHz a intenzita, která je také velmi důležitá se pohybuje v rozmezí mezi 0,1-3W/cm2. Zdrojem vlnění jsou mechanické, magnetostrikční nebo piezoelektrické měniče. Piezoelektrický měnič je použit i ve zdroji, s nímž jsem pracovala a u něhož je využit magnetický jev – dochází k přeměně elektrické energie na mechanickou, která rozkmitá okolní prostředí. Frekvence: Nízké: f = 100-1000 kHz, použití: např. čističky Vysoké: f = nad 1 MHz, použití: ultrazvukové vyšetřování v lékařství
Postup měření, zpracování a zhodnocení výsledků Použité materiály: 2% koňská či beraní krev (poskytnuta pracovišti VFU Brno), fyziologický roztok, pipety, zkumavky, Bürkerova komůrka, mikroskop, digitální fotoaparát, počítač, a terapeutický ultrazvuk Postup měření: Přenesení určitého množství krve do zkumavky. Ve většině měřeních jsem pracovala s objemem 1,8 ml. Odebrání 0,1 ml této krve do jiné zkumavky a smíchání s 0,9 ml fyziologického roztoku pro přehlednější počítání červených krvinek na Bürkerových čtverečcích. Nanesení této suspenze na Bürkerovu komůrku, pozorování a následné počítání erytrocytů pod mikroskopem na Bürkerových čtverečcích. Ozvučení krve pod určitou intenzitou a dobou a nové počítání erytrocytů (již nemusí být ředěná fyziologickým roztokem, jestliže je dostatečně ''zhemolyzovaná'') Zpracování a vyhodnocení výsledků. Výsledky z měření I. Prováděna opakovaná měření, nejprve s koňskou krví, v nedávné době vyměněna na beraní, jelikož u koňské krve docházelo k velkým změnám ve vlastnostech - dlouhodobě nereprodukovatelné výsledky
Výsledky z měření II. Měření stupně hemolýzy v závislosti na čase (beraní krve) - nejvíce zaniklých erytrocytů již při prvním ozvučování, kde stupeň hemolýzy dosahoval zhruba 82%, úplná hemolýza po 3 minutách (intenzita 0,1W/cm2) Porovnání výsledků hemolýzy koňské krve v závislosti na čase, z něhož je patrný vliv stárnutí krve: Měření stupně hemolýzy v závislosti na intenzitě (beraní krev) - křivka v grafu je velmi podobná jako u závislosti na čase, červené krvinky byly zničeny při intenzitě 1 W/cm2 za dobu 1 min. Zkoumání, zda se výrazně změní výsledky, jestliže krev ve zkumavce se nebude vyměňovat a při odebírání části vzorku se pozmění její objem. Výsledek se však výrazně nezmění. Chyby měření: Náhodné (stochastické) - neovlivnitelné, změna teploty, rychlá sedimentace, nedokonalé měření přístroje Soustavné - vzniklé nedbalosti, neúplností či nepřesností
