Handleiding Uitvoeren gevoeligheidstesten melkmonsters
UBROCARE
Voorwoord
Het op de juiste manier inzetten van diergeneesmiddelen, waaronder de onderbouwing voor het toepassen van antibiotica, is van groot belang. Als partner in uiergezondheid ondersteunen wij veehouders en dierenartsen met het nemen van melkmonsters, voor bacteriologisch onderzoek en gevoeligheidstesten. Deze handleiding is bedoeld voor dierenartsenpraktijken, die zelf melkmonsters onderzoeken. De handleiding gaat niet in op het uitvoeren van bacteriologisch onderzoek en de kiem identificatie. Het beschrijft de uitvoering van disk diffusie gevoeligheidstesten en de interpretatie ervan. Hopelijk draagt deze handleiding bij aan kwalitatief goede gevoeligheidstesten en plezier in de uitvoering. Met vriendelijke groet, Monique Driesse
Van links naar rechts: Edzard van Delden, Elzo Kannekens, Arjon Velthoen, Ferry ten Brinke, Wim Hondelink, Mylène Handgraaf, Harmannus Harkema en Monique Driesse
UBROCARE
2
Methode en richtlijnen
Disk diffusie
Tips:
Mueller Hinton agar, (paper)disk, confluente groei
• Bewaar de paperdisks, inclusief die in dispensers, in afgesloten containers (beschermd tegen licht) met een droogmiddel.
Richtlijnen 1) EUCAST 2) CLSI
• Sla de voorraad disks op bij -20°C, tenzij anders aangegeven door de leverancier. Als dit niet mogelijk is, sla de disks dan op beneden 8°C. • Bewaar de werkvoorraad disks beneden 8°C. • Om condensvorming te voorkomen, laat de disks op kamertemperatuur komen voor het openen van de containers. • Gooi disks na het verstrijken van de expiratie datum weg via de juiste afvalroute.
3
UBROCARE
Instructie Volgens EUCAST/ CLSI methode Bereiding van het inoculum • Neem minimaal 3 - 5 identieke kolonies van de (bloed) agar plaat met een steriele entnaald of swab en suspendeer in 4 - 5 ml 0.9% NaCl. • De dichtheid van de kolonie suspensie (inoculum) moet gelijk zijn aan 0,5 McFarland. • Het wordt aanbevolen om een density meter te gebruiken voor de juiste dichtheid van het inoculum. Als alternatief kan een 0,5 McFarland standaard gebruikt worden voor visuele standaardisering. Schud de standaard goed voor gebruik en bekijk het inoculum en de standaard tegen een witte achtergrond met horizontale zwarte lijnen. • Aanpassing van de dichtheid kan door meer bacteriën toe te voegen of door meer zoutoplossing toe te voegen. Het aanbrengen van het inoculum • Gebruik het inoculum bij voorkeur binnen 15 minuten na bereiding.
UBROCARE
• Dit inoculum met een steriele swab op een Mueller Hinton (MH) agar enten. Druk de swab tegen de zijkant van de buis, om overtollige vloeistof te verwijderen. Dit is belangrijk om overbeënting te voorkomen, met name bij Enterobacteriaceae. Bestrijk de gehele MH plaat en herhaal deze procedure 2 x, roteer de plaat elke keer 60°, om een gelijkmatige verdeling te krijgen. Het aanbrengen van de disks • Breng de disks aan binnen 15 minuten na het aanbrengen van het inoculum (anders gaan de bacteriën al groeien voordat de disks zijn opgebracht, waardoor de remmingszones kunnen afwijken). • Voor Streptococcen adviseert EUCAST MH-F agar (Mueller Hinton agar met 5% paardenbloed en 20 mg/L beta-NAD) en CLSI adviseert hiervoor MH agar met 5% schapenbloed. Breakpoints van betreffende bronnen zijn tot stand gekomen en gestandaardiseerd met betreffende platen. • De paper disks op de beënte MH leggen en licht aandrukken. Geadviseerd wordt om niet meer dan 6 disks op een (standaard) plaat van 90 mm te gebruiken (anders kunnen de zones niet goed gemeten worden).
4
Incubatie van de platen
Beoordeling van de platen
• De plaat omdraaien en binnen 15 minuten na het aanbrengen van de disks in een stoof zetten. Het stapelen van platen kan de verspreiding van warmte in een stoof beïnvloeden.
• Beoordeel de groei op de platen. Een juist inoculum resulteert in een confluente, gelijkmatige groei met ronde inhibitie zones. Als individuele kolonies zichtbaar zijn is het inoculum te licht en moet de test opnieuw ingezet worden.
• Incubeer de platen gedurende 16 - 20 uur op 35 ± 2 C°, voor het aflezen van de gevoeligheid. Voor staphylococcen en enterococcen de plaat na 24 uur beoordelen (CLSI). • Zet indien mogelijk Enterobacteriaceae en staphylococcen bij gewone lucht in de stoof en streptococccen bij 4 - 6% CO2 in de stoof (CO2 verrijkt).
Opmeten van zones en interpretatie • De diameter van de remmingszones (inclusief de diameter van de disk) opmeten in mm. • De zones vertalen naar “gevoelig”, “intermediair” of “resistent” (ongevoelig), volgens de criteria.
5
UBROCARE
Criteria en interpretatie + 23.75 µ g
Criteria voor disk diffusie (melkmonsters)
Remmingszone
Eucast
g Pirlimycin
Trimetho p
e 2 µg
rim + sulf
amethoxa
zole 1. 25
etine 10 i. u. + 100 µ
Oxacillin
Penicillin
e + framyc
e 1 µg (clo xacilline)
ramyceti
ne)
Fabrikant
Clsi
Eucast
Sau
Staph
Staph
Strep
10
9
14
16
16
9
12 13
17
11
10
15
17
17
10
13 14
18
12
11
16
18
18
11
14 15
13
12
17
19
19
12
15 16
Strep
Staph + Strep
Sau
Cns
Staph
Strep
Staph + Staph + Staph + Strep Strep Strep
16
22
14
16
18
21
16
13
17
23
15
17
19
22
17
14
17
14
18
24
16
18
20
23
18
15
18
15
19
25
17
19
21
24
19
16
19
16
19
13
Clsi
Voorst. Sau
Staph
16
Neomycin
enicilline Fabr.
e 10 µg (f
+ strepto
Clsi
Nafcilline +p
Eucast
ine 30 µg
Eucast
Kanamyc
µg (tylosi
ine 2 µg (l
ne)
ine) incomyc
en) 30 µg (M Cefoxitin Eucast
Staph
16
Staph + Strep
Staph
Strep
20 26* 18
20
22
25
20
17
20
17
20
14
13
18
20
20
13
16 17
21
27
19
21
23
26
21
18
21
18
21
15
14
19
21
21
14
17 18
22
28
20
22
24
27
22
19
22
19
22
16
15
20
22
22
15
18 19
Voor toelichting, zie pagina 8
UBROCARE
ec-A scre
e + kanam ycine 15 Fabr.
Erythrom ycine 15
Clsi
Clindamyc
Criteria volgens Kiemen
Cefalexin
Disk antibioticum en lading
enicilline
Voorstel (preliminaire) criteria
(Benzyl)p
Gevoelig
ne + clav
Intermediair
Amoxicilli
Resistent
1 unit
ulaanzuu
+ 30 µ g
r 20 + 10
µg
mycine 3 5
µg
Gram positief panel - Staphylococcen en streptococcen
5 µg
Criteria voor disk diffusie (melkmonsters)
Criteria volgens
Eucast
Eucast
Eucast
Specifieke kiemen
Remmingszone
Fabrikant
Voorstel
Fabrikant
amethoxa rim + sulf Trimetho p
etine 10 i. u. + 100 µg e + framyc Penicillin
ne) ramyceti e 10 µg (f Neomycin
enicilline
+ strepto Clsi
Nafcilline +p
Kanamyc
ine 30 µg
L/AmpC)
e + kanam ycine 15
e 5 µg (ESB Eucast
E. coli
Eucast
E. coli
13
10
10
16
16
13
16
8
13
11
14
11
11
17
17
14
17
9
14
12
15
12
12
18
18
15
18
10
15
13
16
13
13
19
19
16
19
11
16
14
17
14
14
20
20
17
20
12
17
15
18
15
15
21
21
18
21
13
18
16
19
16
16
22
22
19
22
14
19
17
Voor toelichting, zie pagina 8
UBROCARE
Fabrikant
Cefoxatim
Disk antibioticum en lading
Cefalexin
Amoxicilli
Voorstel (preliminaire) criteria
e 30 µ g
Gevoelig
Cefalexin
ne + clav
Intermediair
Ampicillin
Resistent
e 10 µg
ulaanzuu
+ 30 µ g
r 20 + 10
µg
mycine 3 5
µg
zole 1. 25 + 23.7
Gram negatief panel - Enterobacteriaceae
Toelichting op beide tabellen
*Remmingszone beoordelen tegen het licht gehouden (doorvallend licht): ≥ 26 met scherpe rand -> resistent tegen penicilline, amox/ampicilline. ≥ 26 met vage, wazige rand -> penicilline gevoelig.
Criteria zijn remmingszones in mm. • Remmingszones aangegeven in groen of groter aanmerken als gevoelig. • Remmingszones aangegeven in oranje aanmerken als intermediair. • Remmingszones aangegeven in rood of kleiner aanmerken als resistent.
Note: Criteria kunnen veranderen, zie EUCAST website of meest recente CLSI document.
8
UBROCARE
Specifieke instructies
• D e aanwezigheid van stoffen met antagonistische werking in het medium (agar) kan resulteren in vage groei tot aan de disk bij sulfonamide en trimethoprim zones. Geadviseerd wordt om deze groei te negeren en af te lezen op 80% groei inhibitie. • B ij het testen van Enterobacteriaceae en ampicilline, wordt geadviseerd om groei die eruitziet als een dunne laag, die een binnenste zone vormt, te negeren. • B ij hemolytische streptococcen op MH-F medium, lees de inhibitie van groei af en niet de inhibitie van hemolyse.
Voor het testen op induceerbare lincosamide (lees clindamycine) resistentie is het nodig dat een erythromycine disk naast de clindamycine disk wordt geplaatst (D-test). Bij een onderlinge afstand van 26 mm kan de inductie nog steeds goed worden aangetoond. De aanwezigheid van induceerbare lincosamide resistentie is te herkennen als een deuk in de remmingszone van de clindamycine (aan de kant van de erythromycine disk). De kiem wordt dan afgeven als resistent tegen alle lincosamides (clindamycine, lincomycine en pirlimycine).
• O m induceerbare resistentie te kunnen vinden, wordt geadviseerd om te testen met clindamycine en erythromycine, dit kan niet met pirlimycine. Sommige typen van lincosamide resistentie worden geïnduceerd door de aanwezigheid van een macrolide (zoals erythromycine).
9
UBROCARE
Kwaliteitscontroles Kwaliteitscontroles Voor het beoordelen van de routine uitvoering van de disk diffusie methode en de interpretatie van de resultaten, wordt geadviseerd om wekelijks kwaliteitscontroles uit te voeren met controle stammen. Gebruik de controle stammen ATCC 29213 Staphylococcus aureus, ATCC 25922 Escherichia coli en ATCC 49619 Streptococcus pneumoniae (volgens CLSI, EUCAST of fabrikant).
Referenties CLSI Approved Standard – third Edition M31-A3. CVI criteria disk diffusie 26-4-2013. EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing - Version 3.0 (April 2013). EUCAST Reading Guide EUCAST disk diffusion method for antimicrobial susceptibility testing Version 3.0 April 2013.
Fiebelkorn 2003 Practical disk diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. Pillar 2009 Evaluating the in vitro susceptibility of bovine mastitis pathogens to a combination of kanamycin and cefalexin: recommendations for a disk diffusion test. Pillar 2013 Development of a disk diffusion test for evaluating susceptibility of mastitis field isolates to Ubrostar®.
EUCAST breakpoint table v 3.1 2013-02-11. Silley 2012 Susceptibility of coagulase-negative staphylococci to a kanamycin and cefalexin combination.
UBROCARE
10
Dankwoord
Deze handleiding is mede tot stand gekomen dankzij de goede suggesties en adviezen van Marielle Melchior.
Deze handleiding 2013 is onderdeel van UbroCare® en is aangeboden door: Boehringer Ingelheim Partner in uiergezondheid
Voor meer informatie kunt u contact opnemen met: Boehringer Ingelheim bv Postbus 8037, 1802 KA Alkmaar
[email protected] Telefoon: +31 (0)72 566 24 11 Fax: +31 (0)72 564 32 13
11
UBROCARE
