GLIOMÁK KEZELÉSE CITOKINEKET TERMELŐ TUMORSEJT VAKCINÁCIÓVAL ÉS GYÓGYSZERÉRZÉKENYÍTŐ GÉNTERÁPIÁVAL EGÉR TUMOR MODELLEN DR. DÉSAKNAI SZILVIA
SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA BUDAPEST, 2002
GLIOMÁK KEZELÉSE CITOKINEKET TERMELŐ TUMORSEJT VAKCINÁCIÓVAL ÉS GYÓGYSZER-ÉRZÉKENYÍTŐ GÉNTERÁPIÁVAL EGÉR TUMOR MODELLEN
DR. DÉSAKNAI SZILVIA
Programvezető: Prof. Dr. Falus András Témavezető: Dr. Sáfrány Géza
Bírálók:
Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Kopper László
Dr. Kalabay László
Dr. Sármay Gabriella
Dr. Pivarcsi Andor
Dr. Duda Ernő
Bíráló bizottság: Prof. Dr. Varga Gábor Prof. Dr. Tímár József Dr. Prohászka Zoltán
Készült a „A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika” c. Ph.D. program keretében Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Budapest 2002
TARTALOMJEGYZÉK
TARTALOMJEGYZÉK .................................................................................................. 1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE........................................................................................... 3 ÖSSZEFOGLALÓ ........................................................................................................... 4 SUMMARY ..................................................................................................................... 5 1 BEVEZETÉS ............................................................................................................. 6 2 IRODALMI HÁTTÉR............................................................................................... 8 2.1 A génterápia története, fajtái ............................................................................... 8 2.2 Génterápiában alkalmazott vektorok................................................................... 9 2.3 Daganatok genetikai, immunológiai háttere...................................................... 15 2.4 Központi idegrendszeri daganatok sajátosságai................................................ 17 2.5 Daganatok kezelése génterápiával .................................................................... 18 2.6 Génterápia citokineket kódoló génekkel ........................................................... 19 2.6.1 A citokin kutatás története, citokinek általános jellemzése, fajtáik............ 19 2.6.2 Génterápia citokineket kódoló daganatsejt vakcinákkal ............................ 21 2.7 Génterápia gyógyszer-érzékenyítő génekkel .................................................... 24 2.7.1 Gyógyszer-érzékenyítő génterápia mechanizmusa .................................... 24 2.7.2 Génterápia timidin-kinázzal ....................................................................... 25 2.7.3 Génterápia uracil-foszforibozil-transzferázzal ........................................... 26 2.7.4 Génterápia citozin-deaminázzal ................................................................. 26 2.7.5 „Bystander” hatás ....................................................................................... 27 2.7.6 Gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinációja sugárterápiával ............. 27 3 CÉLKITŰZÉSEK.................................................................................................... 28 4 MÓDSZEREK ......................................................................................................... 31 4.1 Sejtvonalak ........................................................................................................ 31 4.2 Adenovírus vektorok ......................................................................................... 31 4.2.1 Adenovírusok fajtái, előállításuk................................................................ 31 4.2.2 Adenovírusok felszaporítása szuszpenziós kultúrában, vírustiter meghatározása.......................................................................................................... 32 4.2.3 Adenovírusokkal történő fertőzés hatékonyságának vizsgálata ................. 33 4.3 Kísérletek citokineket termelő daganatsejt vakcinákkal ................................... 33 4.3.1 Agytumoros egerek kezelése citokineket termelő daganatsejt vakcinákkal és/vagy lokális besugárzással................................................................................... 33 4.3.2 Immunrendszeri aktiváció mechanizmusa.................................................. 34 4.3.2.1 Citotoxikus T-limfociták aktivációja ................................................... 34 4.3.2.2 Immunhisztokémiai vizsgálatok .......................................................... 34 4.3.2.3 CD4+ és/vagy CD8+ sejtek deplécióját követő vakcináció GM-CSF-et termelő Gl261 sejtekkel........................................................................................ 34 4.3.3 Statisztikai analízis ..................................................................................... 35 4.4 Kísérletek gyógyszer-érzékenyítő génterápiával .............................................. 35 4.4.1 In vitro 5-fluoruracil, ganciklovir kezelés és besugárzás hatása gyógyszerérzékenyítő géneket tartalmazó Gl261 sejtekre ....................................................... 35
1
4.4.2 Gyógyszer-érzékenyítő géneket tartalmazó agy-, ill. szubkután tumorok kezelése 5-fluorouracillal, ganciklovirral, valamint lokális irradiációval ............... 35 4.4.3 Gyógyszer-érzékenyítő géneket tartalmazó agytumorok kezelése 5fluorouracil és ganciklovir terápia, valamint citokin termelő daganatsejt vakcináció kombinálásával ........................................................................................................ 36 4.4.4 Daganatok utólagos kezelése gyógyszer-érzékenyítő génterápiával és besugárzással ........................................................................................................... 37 4.5 Statisztikai analízis............................................................................................ 37 5 EREDMÉNYEK...................................................................................................... 38 5.1 Kezelés citokineket termelő daganatsejt vakcinákkal....................................... 38 5.1.1 A fertőzés hatékonyságának vizsgálata és a citokin termelés mérése ........ 38 5.1.2 Agytumorok kezelése citokineket termelő daganatsejt vakcinákkal.......... 40 5.1.3 T-limfociták aktivációjának vizsgálata....................................................... 44 5.1.3.1 Citotoxikus T-limfociták aktivációjának tanulmányozása................... 44 5.1.3.2 Immunhisztokémiai vizsgálatok .......................................................... 45 5.1.3.3 CD4+ és/vagy CD8+ sejtek deplécióját követő vakcináció GM-CSF-et termelő Gl261 sejtekkel........................................................................................ 47 5.1.4 Citokin termelő daganatsejt vakcináció és lokális sugárterápia kombinálása 47 5.2 Kezelés gyógyszer-érzékenyítő génterápiával .................................................. 50 5.2.1 In vitro kísérletek........................................................................................ 50 5.2.2 5-fluorouracil/ganciklovir kezelés hatása kísérletes daganat modellen ..... 52 5.2.3 „Bystander hatás” vizsgálata ...................................................................... 54 5.2.4 Gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinációja GM-CSF-et termelő daganatsejt vakcinációval ........................................................................................ 55 5.2.5 Gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinációja lokális tumor besugárzással ........................................................................................................... 55 5.2.6 Daganat kezelés gyógyszer-érzékenyítő gének utólagos bejuttatásával és lokális besugárzással................................................................................................ 57 6 MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK........................................................ 58 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ........................................................................................ 64 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE .................................................................................................................... 65 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN NEMZETKÖZI FOLYÓIRATOKBAN MEGJELENT KONGRESSZUSI ABSZTRAKTOK JEGYZÉKE............................... 65 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN TARTOTT ELŐADÁSOK ÉS BEMUTATOTT POSZTEREK JEGYZÉKE ............................................................................................ 66 IRODALOMJEGYZÉK ................................................................................................. 70
2
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
Adex-CAUPTK
uracil-foszforibozil-transzferáz és timidin-kináz enzimet kódoló adenovírus vektor
CD
citozin-dezamináz
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
FUMP
fluorouridin-monofoszfát
FdUMP
fluorodezoxiuridin-monofoszfát
GC
ganciklovir
Gl261
glioma 261
GM-CSF
granulocita-monocita kolónia stimuláló faktor
IL
interleukin
INF
interferon
LAK
limfokin-aktivált killer sejt
LIF
leukémia inhibitor faktor
LT
limfotoxin
PBS
foszfát-puffer oldat
TIL
T-limfocitás infiltrátum
TK
timidin-kináz
TNF
tumor nekrózis faktor
UPRT
uracil-foszforibozil-transzferáz
5-FC
5-fluorocitozin
5-FU
5-fluorouracil
3
ÖSSZEFOGLALÓ Szerző: Dr. Désaknai Szilvia Programvezető: Prof. Dr. Falus András Témavezető: Dr. Sáfrány Géza „Humán molekuláris genetika és géndiagnosztika” c. program Semmelweis Egyetem Doktori Iskola
Budapest, 2002
Munkánk során a génterápiás eljárások hatékonyságát tanulmányoztuk a malignus agydaganatok jelentős részét kitevő, rendkívül rossz prognózisú gliomák kezelésében. Részben a citokineket termelő daganatsejt vakcinák, részben a gyógyszer-érzékenyítő génterápia hatását elemeztük in vitro körülmények közt és egér tumor modellen. A terápiás géneket adenovírus vektorok segítségével juttattuk a sejtekbe. Mindkét módszert lokális besugárzással is kombináltuk. Elsőként a citokin termelő tumorsejt vakcinák hatását vizsgáltuk. Eredményeink szerint a citokin szint lineárisan változik a vírus/sejt arány növelésével, így könnyen módosítható a tumorsejtek által termelt citokinek koncentrációja. Kimutattuk a citokin szint és a terápiás hatás szoros összefüggését, ami arra utal, hogy az optimális citokin koncentráció beállítása döntő fontosságú az eljárásnál. IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF alkalmazásával 20-40%-os túlélést sikerült elérni. Az immunrendszeri aktiváció hátterében CD4+ limfociták, GM-CSF esetében ezenkívül CD8+ limfociták szerepét igazoltuk. Lokális besugárzással kombinálva a túlélés 80-100%-ra nőtt. Kísérleteink második felében a gyógyszer-érzékenyítő génterápia hatását tanulmányoztuk a timidin-kináz/ganciklovir és az uracil-foszforibozil-transzferáz/5fluorouracil rendszerek kombinálásával. Eredményeink alapján a két génterápiás rendszer együttes alkalmazása szinergista hatású volt: A kombinált 5-fluorouracil, ganciklovir kezelés sokkal nagyobb mértékben növelte az agydaganatos állatok túlélését (60-80%), mint az 5-fluorouracil (10-20%), vagy a ganciklovir (40-50%) önmagában. A lokális besugárzással történő kombináció pedig tovább javította a terápia tumorellenes hatását (90-100%-os túlélés). Vizsgálatainkkal tehát kimutattuk, hogy a citokin termelő daganatsejt vakcináció és a gyógyszer-érzékenyítő génterápia kísérletes egér tumor modellen eredményesen, nagy hatékonysággal működik, különösen lokális besugárzással kombinálva. A jövőben a génterápia a hagyományos tumorellenes módszerekkel kombinálva új utat nyithat a malignus daganatok kezelésében.
4
SUMMARY Author: Dr. Szilvia Désaknai
Scientific coordinators: Prof. Dr. András Falus, Dr. Géza Sáfrány
Ph.D. program: „The bases of human molecular genetic and gene diagnosis” Semmelweis University, School of Ph.D. Studies Budapest, 2002
The aim of our study was to investigate the effect of gene therapeutic methods in the treatment of gliomas, which constitute a considerable part of malignant intracranial tumors. The therapeutic effect of cytokine producing cancer cell vaccines and gene directed enzyme pro-drug therapy was studied under in vitro circumstances and in a mouse tumor model. Adenovirus vectors were used to transduce the tumor cells with the therapeutic genes. Both methods were combined with local irradiation. First, the effect of cytokine producing cancer cell vaccines was investigated. According to our findings the cytokine level produced by the vaccines is linearly related to the number of viral particles per cell, thus it is easy to alter the cytokine level secreted by the gene-modified cancer cells. Our data suggested that the anticancer effect strongly depended on the concentration of cytokines, which indicated that the determination of the optimal cytokine level was essential. Vaccines producing IL-2, IL-4, IL-12, GMCSF cured 20-40% of the mice. CD4+ lymphocytes were involved in the antitumor response of the vaccines, GM-CSF induced CD8+ infiltration of the tumors, as well. Combining the cytokine vaccination with local tumor irradiation increased the survival up to 80-100%. Next, the effect of gene directed enzyme pro-drug therapy was studied by combining the thymidine kinase/ganciclovir and the uracil phosphoribosyltransferase/5fluorouracil systems. Our data indicated the synergistic effect of the two different drug sensitising system: The combined treatment with both 5-fluorouracil and ganciclovir enhanced the survival of brain tumor bearing mice more efficiently (60-80%), than the single agent treatment either with 5-fluorouracil (10-20%) or with ganciclovir (40-50%) alone. Combination with irradiation increased further the anticancer effect: 90-100% of the animals survived. Our results suggest that the cytokine producing cancer cell vaccines and gene directed enzyme pro-drug therapy are very effective in experimental brain tumor model, especially applied with local irradiation. Gene therapy combined with existing anticancer modalities might open a new potential on the treatment of malignant tumors.
5
1 BEVEZETÉS
A malignus agydaganatok, köztük a gliomák prognózisa a hagyományos kezelési módszerek mellett rendkívül rossz. A gliomák az intrakraniális tumorok mintegy 3540%-át teszik ki. Bár ritkán metasztatizálnak, rendkívül agresszívan növekednek. A hagyományos kezelés a sebészi eltávolítást követő kemo-, ill. sugárterápiából áll. A kezelés ellenére a betegek többsége egy éven belül meghal, az ötéves túlélés pedig mindössze 5-6%. A sebészi és kemoterápiás kezelés korlátai miatt nagy jelentősége van új terápiás eljárások kidolgozásának. Az utóbbi években számos génterápiás próbálkozás történt a daganatos betegségek, köztük az agytumorok kezelésére. Ennek során a beteg tumorsejtjeit, ill. egyéb autológ sejtjeit genetikailag módosítják. Az eljárásnak a gén beviteli módszertől, a módosított sejtektől, valamint a bejuttatott génektől függően számos vállfaja létezik. A terápiás géneket beadhatják közvetlenül a tumorba, de bevihetik a betegből eltávolított, sejtkultúrában növesztett sejtekbe is, melyeket később visszaoltanak a betegbe. Génbevitelre alkalmasak a beteg műtéti úton eltávolított tumorsejtjei, vagy más autológ sejtek (pl. limfociták, fibroblasztok). Alkalmaznak ezenkívül allogén sejtvonalakat is. Ilyenkor a sejtvonal HLA antigenitásának meg kell egyeznie a beteg HLA típusával. A gének bejuttatása különböző vektorokkal történhet: pl. liposzóma, plazmid, adeno-, retrovírus. A génterápiának számos módozata ismert: pl. immunterápia citokinekkel vagy B7 kostimulátor molekulákkal, gyógyszer-érzékenyítő génterápia, antiszensz stratégia, génterápia tumor szuppresszor génekkel stb. Jelen munkánk során kétfajta génterápiás módszert vizsgáltunk a gliomák kezelésében: részben a citokineket termelő daganatsejt vakcinák, részben pedig a gyógyszer-érzékenyítő génterápia hatását tanulmányoztuk. Kísérleteinket in vitro körülmények közt, valamint egérmodellen végeztük, vektorként adenovírusokat alkalmaztunk.
6
A citokinek az immunrendszer tumorellenes aktivációját idézik elő, hatásukat feltehetőleg az antigénprezentáló sejtek stimulálásával fejtik ki. A vakcinációs módszer lényege, hogy a beteg műtéti úton eltávolított daganatsejtjeiből sejtkultúrát állítanak elő, az in vitro növő sejteket genetikailag módosítják citokineket kódoló génekkel, majd besugarazzák a további sejtosztódás leállítása céljából és e sejtekkel szubkután vakcinálják a beteget. A vakcináció hatására aktiválódik az immunrendszer, amely elpusztíthatja mind a műtét után visszamaradt daganatsejteket, mind a metasztázisokat. A malignus tumorok hagyományos kezelésének alapját a sebészi-, a sugár- és a kemoterápia képezi. A kemoterápiás kezelés eredményességét gyakran csökkenti a daganatsejtek citosztatikumok iránti rezisztenciája. A génterápia gyógyszer-érzékenyítő génekkel ígéretes új módszert kínál a daganatsejtek kemoterápeutikumok iránti rezisztenciájának legyőzésére és a nem kívánt mellékhatások csökkentésére. Az eljárás során a tumorsejtekbe olyan enzimeket kódoló géneket juttatnak be, amelyek érzékenyítik azokat egyes citosztatikumokra, vagy antivirális szerekre. Ezt követően a megfelelő gyógyszerekkel végzett kezelés a tumorsejtek szelektív pusztulásához vezet. A daganatok kezelésekor célszerű az új génterápiás eljárásokat a régi, már bevált módszerekkel, így pl. lokális besugárzással kombinálni. A besugárzás hatására megkisebbedett tumor ellen az immunrendszer nagyobb hatásfokkal tudja felvenni a küzdelmet, másrészt a besugárzott tumorsejtek nekrotizálnak, e sejtekből pedig nagy mennyiségben szabadulnak fel immunogén molekulák, melyek fokozzák az immunrendszer aktivációját. A gyógyszer-érzékenyítő génterápiánál alkalmazott 5fluorouracil pedig sugárérzékenyítő hatással is rendelkezik. Kísérleteink során mindkét génterápiás eljárást lokális besugárzással kombináltuk.
7
2 IRODALMI HÁTTÉR
2.1
A génterápia története, fajtái Amint az 1970-es évektől egyre többet sikerült felderíteni a gének működéséről és
számos öröklődő betegség hátterében álló gént azonosítottak, megkezdődtek a génterápiás kísérletek. Az első génterápiát 1990-ben, egy letális géndefektusban, adenozin-dezamináz hiányban szenvedő betegnél végezték.1 Az eredmények biztatóak voltak, ami serkentette újabb klinikai kipróbálások létrejöttét. Azóta számos humán génterápiás vizsgálatot végeztek részben öröklődő genetikai betegségek (pl. cisztikus fibrózis,2 hemofília3); részben daganatok kezelésére.4,5,6 Elvileg a kívánt gént be lehetne juttatni célzottan a hibás gén helyére, jelenleg azonban a gyakorlatban az irányított génbevitel még nem megoldható in vivo körülmények közt. Általában ez nem is szükséges, elegendő a gént bevinni a megfelelő sejtbe, ahol kompenzálni tudja a hiányzó vagy hibás működésű gént, illetve új tulajdonságokat hozhat létre. A gének két fő úton: ex vivo, ill. in vivo juttathatók a betegekbe.7,8 Az első, általánosan elterjedt módszer során a betegből eltávolítják a megfelelő sejteket, laboratóriumi körülmények közt genetikailag módosítják azokat, majd visszaoltják a szervezetbe. Az in vivo eljárás alkalmával a terápiás gént tartalmazó vektort közvetlenül a betegbe injektálják. A gén bevitele a sejtekbe többféle vírus, ill. nem vírus alapú vektor segítségével történhet (ld. 2. 2.). A génterápiát csoportosíthatjuk a célsejtek szerint is: módosíthatók maguk a tumorsejtek, illetve a szervezet egyéb sejtjei is. Elvileg öröklődő genetikai betegségeknél alkalmazható lenne a csírasejtek génterápiája, mivel így az abból keletkező valamennyi szomatikus sejt a megfelelő géneket hordozná, ez azonban számos technikai nehézséget és etikai problémát vet fel.
8
2.2
Génterápiában alkalmazott vektorok A génterápia sikerében kulcsszerepe van olyan „génszállító eszközök”-nek, azaz
vektoroknak,
melyek
biztonságosan,
hatékonyan
alkalmazhatók.
A
vektorok
összefoglaló tulajdonságait a következő táblázat mutatja (1. táblázat).7,9,10
Előny Adenovírus
Hátrány
-nem okoz komoly humán -átmeneti génexpresszió betegséget
-immunrendszer aktivációja
-nincs inszerciós mutagenezis -magas titerben állítható elő -nagyméretű
idegen
gén
juttatható be Retrovírus
-tartós génexpresszió
-inszerciós mutagenezis -csak osztódó sejteket fertőz -alacsonyabb titerben állítható elő
Adeno-asszociált vírus
-nem okoz humán betegséget -kis méretű DNS fér bele
Liposzóma,
-nem okoz betegséget
-vírusoknál kevésbé hatékony géntranszfer
Plazmid
1. táblázat Génterápia során alkalmazott vektorok tulajdonságai.
I. Vírus alapú vektorok Hatékony szállítóeszközök a vírusok, mivel az evolúció során sejtekbe való bejutásra és ott génjeik expressziójára specializálódtak. Az adenovírusok számos előnyös tulajdonsággal rendelkeznek más vektorokkal szemben:7,10 mind a szaporodó, mind a nyugalmi fázisban levő sejteket képesek
9
megfertőzni; nagy titerben állíthatók elő; valamint genomjuk nem épül be a sejt DNSébe, ezáltal nem alakulhat ki inszerciós mutagenezis. Fontos, hogy embernél nem onkogén hatásúak. Fő hátrányukat viszont a szervezet vírus ellen irányuló immunreakciója adja, mely korlátozza a génexpresszió időtartamát, valamint a vektor ismételt bejuttatását Az adenovírusokat 50 különböző szerotípusba, valamint A-tól G-ig terjedően alcsoportokba sorolhatjuk.11 Közülük az A és B újszülött állatokban onkogén potenciállal rendelkezik, a génterápiában alkalmazott, C alcsoportba tartozó ezzel szemben nem okoz tumorokat. A C alcsoport csak enyhe légúti betegséget hozhat létre embereknél.
1. ábra Adenovírusok felépítése
A vírus az adenovírus receptorokon keresztül fertőzi meg a sejteket, az endoszómába kerül, majd annak lízise során kiszabadul a citoplazmába. Ezt követően a maghártyán keresztül a sejtmagba jut, ahol a vírus genom episzómális marad. A genom 36 kb nagyságú, lineáris, dupla szálú DNS molekulákból áll (1. ábra). Mindkét végén rövid, fordított, terminális ismétlődések (ITR) helyezkednek el, melyek a vírus replikációjához szükségesek. Az 5’ ITR szekvenciát követően helyezkedik el az enkapszidációs szignál, mely a genom becsomagolásához nélkülözhetetlen. A genom korai (E1-E4) és késői (L1-L5) régiókból áll. A korai gének általában a vírus replikációját segítik elő, a későiek pedig struktúr fehérjéket kódolnak. Az E1 szakaszt celluláris transzkripciós faktorok írják át és a régió által kódolt proteinek részt vesznek a többi korai gén aktiválásában. Az E1b régióról kimutatták, hogy onkogén potenciállal rendelkezik.12 Az E2a szakasz egy DNS-hez kötődő proteint, az E2b pedig a DNS
10
polimerázt kódolja. Az E4 géntermékek befolyásolják a virális és celluláris proteinek expresszióját, a vírus DNS replikációját. Feltehetőleg az E4 régió az E1b-hez hasonlóan onkogén tulajdonságú.13 A génterápiánál alkalmazott adenovírusok genomját genetikailag módosítják: egyes, a replikációhoz szükséges géneket eltávolítanak annak érdekében, hogy a vírus a célsejtekben ne tudjon szaporodni. Az adenovírusok többségénél az eltávolított E1 régió helyére juttatják be az idegen gént. Egyes esetekben az E3 szakaszt is kivágják, ezáltal több hely nyerhető a genomban. Az E1, ill. E3 régiót nem tartalmazó adenovírusokat első generációs vektornak nevezik. Ezekbe mintegy 8 kb nagyságú exogén DNS vihető be.14 Az adenovírus vektorokat általában a hasított vírus genom és a terápiás gént hordozó plazmid homológ rekombinációval állítják elő.10,15 Az idegen gént tartalmazó transzkripciós egységet plazmidba helyezik. A plazmid tartalmazza a bal oldali ITR régiót, enkapszidációs szignált (ψ), valamint a transzgén expressziós kazettát. Az expressziós kazetta a génből, promoterből és poliadenilációs szignálból áll. A promoter megfelelő megválasztása növelheti a génexpressziót. Erős promoter például az adenovírus késői promotere, a Rous szarkóma vírus és a citomegalovírus promotere, valamint a hibrid citomegalovírus enhanszer − ß aktin promoter. Szövetspecifikus promoterek segítségével pedig célzott expresszió érhető el. Az eredeti adenovírusból restrikciós enzimatikus hasítással eltávolítják a genom bal oldali részét (az 5’ ITR régiót és a ψ-t). A plazmidot és a hasított vírus genomot megfelelő sejtvonalba juttatják, ahol a homológ rekombináció történik. Másik lehetséges módszer az adenovírus vektorok előállítására a plazmid szekvenciák direkt klónozása az adenovírus genomba a restrikciós helyeken keresztül. E módszer alkalmazását korlátozza az egyedi restrikciós helyek kis száma a nagyméretű genomban. Mivel az adenovírus vektorokból hiányoznak egyes, a replikációhoz szükséges gének, felszaporításuk csak olyan speciális sejtvonalakban lehetséges, mely tartalmazza azokat. Legáltalánosabban használt a besugárzással összetört adenovírus DNS-el transzformált humán embrionális vese sejtekből álló 293-as sejtvonal.16 A felszaporítás során a vektor magas titerben termelődik, akár 1011 plakk-képző egységet is kaphatunk milliliterenként.
Ez
nagyságrendekkel
több,
11
mint
amennyi
retrovírus,
vagy
adenoasszociált vírus esetében nyerhető. Problémát jelenthet azonban a replikáció kompetens adenovírusok esetleges keletkezése a vektor és 293-as sejtek E1 régiója közti rekombinációval. Ennek csökkentésére az E1 régión kívül gyakran az E2A és E4 régióban is deléciót hoznak létre, ezáltal csökken a szekvencia homológia a vektor és a 293-as sejtek genomja közt.17 A magas fertőzési és expressziós arány ellenére a génexpresszió időtartama korlátozott. A legtöbb esetben rövidebb, mint egy hónap, bár beszámoltak több hónapig tartó expresszióról is. Ez részben a vektor direkt toxicitásával, részben a szervezet immunreakciójával áll összefüggésben. Citotoxikus T-limfociták infiltrálják, majd elpusztítják a transzformált sejteket. Az immunreakció csökkenthető további vírusgének deléciójával. Így a harmadik generációs vektorok esetében mind az E1, E2a és E3 régiókat eltávolítják. Előállítottak már E1 és E4 deléciót tartalmazó adenovírusokat is.17 Végül beszámoltak olyan vektorokról, melyek csak a csomagoló szekvenciát és a transzgén expressziós kazettát tartalmazták.18 A vírus ismételt alkalmazásánál problémát jelent a szervezet humorális immunválasza
a
vírus
kapszid
proteinek
ellen.
A
reakció
dózisfüggő
és
immunszupresszív szerekkel gátolható. Az adeno-asszociált vírusok nagy előnye, hogy emberben nem ismert általuk kiváltott betegség. Genomjuk azonban kisméretű, ezáltal korlátozott a bevihető gén mérete.10 Gyakran használt génterápiás eszközök a retrovírusok, melyeket az 1980-as évek óta alkalmaznak.7,10 Előnyt jelent a tartós génexpresszió, legnagyobb veszélyük viszont az esetleges karcinogén hatás. Véletlenszerűen épülnek be a genomba, a beépülés helyétől függően megzavarhatják a gének működését, ezáltal inszerciós mutagenezis révén daganatot okozhatnak. Szintén hátrányt jelent, hogy csak az osztódó sejteket képesek megfertőzni, ugyanis a maghártya feloldódása előfeltétele a sikeres transzfekciónak. A retrovírusok genomja két egyszálú RNS-ből áll, mely dupla szálú DNS-sé íródik át a fertőzött sejtben reverz-transzkriptáz enzim segítségével, majd beépül a gazdasejt DNS-ébe. Az integráció véletlenszerűen történik, bár az aktívan átíródó régiók némi előnyt élveznek. Amennyiben a vírus egy protoonkogénbe, vagy annak környezetébe épül be, fennáll tumorok kialakulásának lehetősége. Az integrálódott vírus
12
DNS, (az ún. provírus) a celluláris génekhez hasonlóan íródik át. A provírus a genom stabil részét képezi a sejt teljes élettartalma alatt és tovább adódik az osztódással keletkezett utódsejteknek. Ezen tulajdonságuk miatt a retrovírusok ideális vektort jelentenek a hosszú időtartamú génexpresszió számára.
2. ábra Retrovírusok felépítése
Az integrálódott vírus transzkripcióját az 5’ long terminal repeat (LTR) területén elhelyezkedő promoter és az enhanszer elemek irányítják, a terminációért pedig a 3’ LTR felelős (2. ábra). A retrovírusok három fő gént tartalmaznak: a gag gén a „core” proteinek kialakításáért felelős, a pol gén a reverz-transzkriptázt, az envelope pedig az „envelope” fehérjéket kódolja.10 A keletkezett primer transzkriptum adja az információt részben az új virionok genomjának számára, másrészt a gag és pol fehérjék szintéziséhez. Egy másik, hasítással keletkezett transzkriptum pedig az envelope proteinek felépítésében vesz részt. A virionok genomjának becsomagolásához a gag régió kezdetén található ún. enkapszidációs szignál (ψ) szükséges. Vektorként elsősorban az egér leukémia vírust használják. A struktúr gének helyére építik be a kívánt gént, így a vírus önálló replikációra képtelen. A felszaporításhoz ún. csomagoló sejtvonalra van szükség, mely tartalmazza a vektorból hiányzó struktúr géneket, így biztosítja a szükséges szerkezeti fehérjéket, ugyanakkor a ψ régió hiányában nem képes a saját virális RNS-ét becsomagolni. A vektor genomjának és a csomagoló sejtvonal fehérjéinek összekapcsolódásával keletkeznek az új vírusok. A felszaporítás során azonban nem érhető el olyan magas titer, mint az adenovírusoknál. A keletkezett vírusok a gazdasejtbe juttatva integrálódnak a DNS-be, de replikációra képtelenek a struktúrgének hiánya miatt. A vírus felszaporítása során azonban ritkán mégis keletkezhetnek replikáció kompetens retrovírusok, amennyiben a
13
vektor és a csomagoló sejtvonal genomja közt homológ rekombináció jön létre. Ennek minimálisra csökkentése érdekében továbbfejlesztették a rendszert és különböző megoldások születtek. Ezek közé tartozik például két különböző csomagoló sejtvonal használata, melyekből az egyik a gag és pol, másik az envelope fehérjéket kódolja. Ezáltal csökken a rekombináció valószínűsége.19 A vírusok megfelelő sejtekbe juttatása elérhető az envelope proteinek genetikai módosításával (infekciós targeting), a gének célsejtben történő kifejeződése (expressziós targeting) pedig specifikus promoterek segítségével valósítható meg. A lentivírusok a retrovírusok alosztályába tartoznak. Jelentős előnyük, hogy a retrovírusoktól eltérően osztódó sejteket is képesek megfertőzni. Hatékony pomoterük révén nagyfokú génexpresszió érhető el. Egyik fő hátrányukat képezi, hogy csak alacsony titerben állíthatók elő. A herpeszvírusok közül leggyakrabban a herpesz szimplex vírus 1-es típusát alkalmazzák vektorként, mely az emberben általában enyhe lefolyású betegséget okoz. A szemen, bőrön, nyálkahártyákon bejutva, az idegvégződéseken keresztül a neuronokba kerül, amelyekben replikálódva a sejtek pusztulását okozhatja, vagy látens állapotba kerülve hosszú ideig perzisztálhat a neuronokban. Ilyenkor episzómálisan helyezkedik el a sejtmagban. A genom dupla szálú DNS molekulából áll, mely ún. UL és US szakaszokra osztható. Mindkét szegmentumot ismétlődő szekvenciák fogják közre. A vírus litikus ciklusa az egyes gének szigorúan szabályozott, meghatározott sorrendben történő kaszkádszerű aktivációjával megy végbe. A látens állapotba kerülés mechanizmusa nem ismert egészében. A vírust neurotropizmusa és a sejtekben való perzisztálása különösen alkalmassá teszi a központi idegrendszer génterápiájára. Megfelelő genetikai módosításokkal csökkenthető citotoxicitása, valamint elérhető mind konstitutív, hosszú időtartamú; mind szabályozható, tranziens génexpresszió.20 Bizonyos mutációkkal előállíthatók ún. feltételesen
replikálódó
vírusok
is,
melyek
elsősorban
a
daganatsejtekben
szaporodnak.21 II. Nem vírus alapú génbevitel A génbeviteli módszerek másik csoportját a nem vírus alapú eljárások képezik. Legnagyobb előnyüket biztonságos alkalmazásuk jelenti: nem okozhatnak daganatot és
14
nem váltanak ki immunreakciót sem. In vitro körülmények közt általában hatékonyan működnek, in vivo azonban a vírusoknál lényegesen kisebb a transzformáció hatásfoka. In vitro alkalmazható a kálcium-foszfát precipitáció és az elektroporáció. A kálcium-foszfát precipitáció során a vegyület DNS-el alkotott csapadékát a sejtek endocitózissal felveszik. A DNS egy része a sejtmagba is bejut, ott azonban nukleázok hatására általában gyorsan lebomlik. Esetenként azonban egyes DNS molekulák beépülhetnek a kromoszómákba is. Az elektroporáció lényege, hogy a sejteket rövid időre erős mágneses térbe helyezik, melynek hatására pórusok képződnek a sejtmembránban. Ezáltal a membrán átjárhatósága megnő és DNS molekulák is átjuthatnak a pórusokon. Az in vivo transzformáció során a DNS bejuttatható közvetlenül plazmid formájában22, valamint liposzómák23 segítségével, illetve receptor mediált úton. Az utóbbi során a DNS-hez specifikus ligandot kapcsolnak, melyet a megfelelő sejtfelszíni receptorok felismernek, így célzott génbevitel érhető el. Új terápiás lehetőséget képez az őssejtek vektorként történő alkalmazása. Fontos felfedezés, hogy e sejtek úgy tűnik képesek felismerni a károsodott területeket és bevándorolni annak területére. Így pl. kísérletes agytumoroknál a daganattól távolra, az agy másik részére injektált őssejtek kimutathatók voltak a tumorban. A terápiás gének így a későbbiekben feltehetően célzottan a megfelelő helyre juttathatók majd. Jelenleg az őssejtes kísérletek még kezdeti stádiumban vannak, de már most rendkívül ígéretesnek tűnnek.24 Az egyes vektorok alkalmazásánál mérlegelni kell azok előnyeit és hátrányait. Például, amennyiben egy örökletes genetikai betegségnél azt szeretnénk elérni, hogy a bevitt gén terméke egész életen át jelen legyen, célszerű retrovírust használni. Abban az esetben, ha csak időleges génexpresszióra (pl. daganatok kezelésénél) van szükségünk, adenovírusok, liposzómák, vagy csupasz DNS a megfelelőbb választás. 2.3
Daganatok genetikai, immunológiai háttere Daganatos betegségekre jellemző a sejtkeletkezés és pusztulás szabályozási
zavara, aminek hátterében genetikai hibák állnak. A daganatok tehát genetikai
15
betegségeknek tekinthetők.7,8 A géndefektusok lehetnek veleszületettek, vagy szerzettek.
Öröklődő
daganatoknál
már
a
csírasejtekben
jelen
vannak
(pl.
retinoblasztoma), így valamennyi szomatikus sejtben megtalálhatók, ezzel szemben exogén hatásra keletkezett tumorok esetében csak a daganatsejtekben mutathatók ki. A génhibák a proliferációt elősegítő és/vagy a sejtpusztulást gátló onkogének, illetve a proliferációt gátló és/vagy a sejtpusztulást serkentő tumor szuppresszor géneknél, következhetnek be. Általában a daganatok progressziója során a géndefektusok halmozódása figyelhető meg. Az előnyös mutációval rendelkező tumorsejtek kiválogatódnak (klonális szelekció). A génállomány instabillá válása miatt egyre könnyebben jelennek meg újabb hibák, az onkogén és szuppresszor régiókon kívül egyéb gének is gyakran érintettek. A számos genetikai változás révén új tulajdonságokra tesznek szert a sejtek, melyek elősegítik növekedésüket, terjedésüket, a gazdaszervezet elleni védekezést. Bár a daganatok kialakulásában alapvetők a proliferáció és az apoptózis szabályozásában résztvevő gének hibái, ezeken kívül számos egyéb genetikai működési zavar is létrejöhet: •
Több daganatnál kimutatható a DNS-repair zavara (pl.: herediter nem-polipózus vastagbélrák). A repair hibája következtében megnő a mutációk kialakulásának esélye.
•
A normál sejtekkel szemben a tumorsejtek többségénél észlelhető telomeráz aktivitás. Az enzim a mitózisok során folyamatosan rövidülő kromoszómákhoz szintetizál ismétlődő szekvenciákat, ezáltal biztosítja a tumorsejtek túlélését.
•
Gyakran a daganatsejtek nem a vártnak megfelelően reagálnak a kemoterápiás kezelésre. Ennek hátterében olyan genetikai változások állnak, melyek képesek megvédeni a tumorsejtet számos citosztatikumtól. A multidrug rezisztencia gén terméke, az ATP-kötő transzportfehérjékhez tartozó P-glikoprotein képes bizonyos szereket kipumpálni a daganatsejtekből és ezáltal csökkenteni intracelluláris koncentrációjukat.
•
Fontos szerep tulajdonítható a daganatok stromájának is. A stromának nem csupán passzív támasztó funkciója van, hanem képes növekedési faktorokat megkötni, tárolni, a sejtek felé jeleket továbbítani, aktiválni, inaktiválni. A tumor befolyásolja a stroma tulajdonságait is. Erre utal, hogy a primer tumornál és az áttétnél is azonos a stroma felépítése az anatómiai helytől függetlenül. A daganatsejt a környezetében
16
levő normál sejteket olyan faktorok termelődésére készteti, melyek saját növekedését, terjedését segítik elő. A tumorok szervezet elleni védekezésében döntő szerepe van azoknak a mechanizmusoknak, melyek révén az immunrendszer daganatellenes válaszreakcióját képes semlegesíteni. E mechanizmusok a következők lehetnek:25,26 •
A tumorantigének leválnak a tumorsejtek felszínéről, ami által csökken a sejt immunogenitása. A levált szolubilis antigének reagálnak az ellenanyagokkal és az
effektor
immunsejtekkel,
így
elirányítják
az
immunreakciókat
a
tumorsejtektől. •
Egyes esetekben a tumor ellen termelődő ellenanyagok paradox módon a daganat növekedését idézik elő, mivel az antigénekhez kötődve elfedik azokat.
•
Gyakran csökkent az MHC molekulák expressziója, amit különböző mutációk okozhatnak, melyek az MHC molekulák szintézisét, vagy transzportját befolyásolják. A citotoxikus T-limfociták az MHC-hez kapcsolt antigéneket ismerik fel, MHC hiányában így elmarad a tumorsejtek felismerése.
•
Sok esetben csökkent a B7 kostimulátor molekulák expressziója.
•
Egyes tumorok az immunrendszer működését gátló citokineket, pl. IL-10-et, TGF-ß-át termelnek.
•
Leírták Fas ligand megjelenését is a tumorsejtek felszínén, ami apoptózist indukálhat a tumort infiltráló limfocitáknál.
2.4
Központi idegrendszeri daganatok sajátosságai A
központi
idegrendszer
megkülönböztetett
szerepet
foglal
el
az
immunrendszerben. Ebben fontos szerepet játszik egy speciális endoteliális szerkezet, a vér-agy gát, mely meggátolja bizonyos makromolekulák, vírusok és sejtek agyba történő bejutását. Jellemző sajátosság még a nyirokkeringés hiánya, valamint az MHC molekulák csökkent expressziója. Mindezek ellenére azonban bizonyított, hogy a T limfociták képesek átjutni a vér-agy gáton.27 Az intrakraniális daganatok mintegy 35-40%-át alkotó gliomáknál több genetikai változást írtak le.5 Ezek közül gyakoriak a p53 gén mutációi, valamint az EGFR gén amplifikációja. Az EGFR fokozott expresszióját a gliomák 40%-ánál írták le. A
17
tumorsejtek által termelt növekedési faktorok, valamint citokinek elősegítik a tumor növekedését és gátolják a szervezet immunrendszerének aktivációját. Számos esetben megfigyelték a PDGF, IGF, VEGF, TNF-α, IFN-ß, TGF-ß fokozott termelődését glioma sejtekben. 2.5
Daganatok kezelése génterápiával Sajnálatos módon a hagyományos eljárásokkal (sebészi eltávolítás, kemo-,
sugárterápia) a daganatos betegeknek csak kevesebb, mint fele gyógyítható7. E tény a kutatókat újabb eljárások kifejlesztésére ösztönözte. Mivel a daganatok tulajdonképpen genetikai betegségeknek tekinthetők (ld. 2. 3), kézenfekvő a génterápiás módszerek alkalmazása. A daganatok hátterében többféle genetikai változás állhat, ezért a génterápiás módszereknek is számos vállfaja létezik. Ezek közül gyakran alkalmazott eljárás az immunterápia. Ennek során olyan molekulákat juttatnak be az immunrendszer effektor sejtjeibe vagy a tumorsejtekbe, ill. egyéb sejtekbe (pl. fibroblasztok, antigénprezentáló sejtek), melyek képesek az immunrendszer tumorellenes aktivitását fokozni. Ilyen molekulák például a citokinek (ld. részletesen 2. 6) és a B7 kostimulátor molekula. Az antigénprezentáló sejtek felszínén található B7 molekulák jelenléte fokozza az MHC antigénekkel kombinációban megjelenő idegen epitópok elleni immunválaszt. Jelenlétük elengedhetetlen az immunrendszer aktiválásához, a T-sejtek CD28, ill. CTLA-4 molekuláihoz kapcsolódnak. A B7 gént tartalmazó tumor sejtekkel történő vakcináció során megnőtt a sejtek immunogenitása, javult a terápia hatékonysága.28 Szintén gyakran alkalmazott módszer a gyógyszer-érzékenyítő génekkel történő terápia (ld. 2. 7). Kísérletek történtek a tumor szuppresszor gének, elsősorban a p53 gén tumorsejtekbe juttatására. Kimutatták, hogy a gén képes volt megállítani a tumor növekedését és apoptózist indukált.29 A hibás génműködés gátlásán alapuló eljárás az antiszensz stratégia, mely a nukleinsavak komplementaritásán alapul.30,31 A génműködés gátlása két fő úton érhető el: megakadályozhatjuk a gén átíródását (anti-kód stratégia), vagy a már átíródott RNS-t gátoljuk (antiszensz stratégia). Megfelelően tervezett oligonukleotid hibridizál a gátolni kívánt DNS szakasszal, így triplex alakul ki, mely felfüggeszti az RNS-polimeráz
18
működését, valamint megakadályozza a szabályzó fehérjék DNS-hez kötődését. Másik lehetőség az oligonukleotid szakasz mRNS-hez kötődése, mely a fehérjévé történő átírást gátolja. A komplex aktiválhatja az endogén RNáz-H-t, mely az mRNS-t bontani képes. Fontos a specificitás kérdése: olyan nukleotid szekvenciát kell választani, mely a genomban csak egyszer fordul elő, ezenkívül rezisztensnek kell lennie nukleázokkal szemben, valamint előnyös, ha Rnáz-H aktiváló hatással rendelkezik. A feltételek teljesítéséhez többféle módosítást hajtanak végre az oligókon. Próbálkozások folynak tumorspecifikus ellenanyagok megfelelő vektorba építésével és azok tumorhoz szállításával is.32
2.6 2.6.1
Génterápia citokineket kódoló génekkel A citokin kutatás története, citokinek általános jellemzése, fajtáik A limfokin kutatás történetét általában 1966-ig vezetik vissza,33 mikor
felfedezték az antigén expozíciónak kitett limfociták MIF termelését, mely a makrofágok működését gátolja. Ezt követte a limfotoxin kimutatása aktivált limfocita kultúra felülúszójából 1968-ban. 1969-ben pedig megszületett a limfokin elnevezés azokra szolubilis faktorokra, melyeket specifikus antigénnel aktivált limfociták termelnek. Az 1970-es években fedezték fel a T-sejtek növekedésében és funkcióiban központi szerepet játszó IL-2-t. Az elsőként megismert monocita/makrofág eredetű citokin pedig 1975-ben a TNF volt. A kezdeti felfedezéseket sorra követte újabb citokinek megismerése. A folyamat napjainkban sem zárult le, folyamatosan bővül a citokinek listája. A citokinek kis molekulatömegű glikoproteidek (10-40 kDa), melyek az immunválasz szabályozásában vesznek részt.25,26 Korábban különbséget tettek limfociták és monociták által termelt faktorok közt és ennek megfelelően az előbbieket limfokineknek, az utóbbiakat monokineknek nevezték. Későbbiekben kiderült, hogy e faktorokat nemcsak az immunrendszer sejtjei képesek termelni, valamint egy faktor többféle eredetű is lehet. Ezért bevezették az általános citokin elnevezést. A citokinek a sejtek membránján elhelyezkedő citokin receptorokon keresztül fejtik ki hatásukat. Általában parakrin úton, a környező sejtek működését befolyásolják, de visszahathatnak az azt termelő sejtre (autokrin hatás) és ritkán távolabbi sejteket is
19
szabályozhatnak (endokrin hatás). Jellegzetes tulajdonságuk a pleiotrópia, ami azt jelenti, hogy egy adott citokin különböző sejteknél más-más hatást fejt ki. Ennek alapja a célsejtek, illetve a jelátviteli utak sokfélesége. Ugyanakkor több, különböző citokinnek is lehet azonos biológiai hatása (redundancia jelensége). A citokineket az immunreakciókban betöltött szerepük szerint 3 fő csoportra osztjuk: az elsőbe tartozók a természetes immunitásban és gyulladásban vesznek részt, a második csoport a limfociták aktivációját és differenciálódását szabályozza, a harmadik tagjai pedig az immunsejtek érésére hatnak.25,26 Az első csoportba, a természetes immunitásban és gyulladásban résztvevők közé sorolhatók az akut fázis reakcióban szereplő citokinek (TNFα, IL-1, IL-6). E citokineket elsősorban a makrofágok termelik nagy mennyiségben, pleiotróp hatással rendelkeznek: fokozzák a makrofágok tumorsejt-ölő aktivitását, aktiválják a neutrofil granulocitákat, stimulálják a T-sejtek citokin termelődését, B-sejtek proliferációját, ellenanyag
termelését,
elősegítik
a
fibroblasztok,
endotélsejtek,
epitélsejtek
proliferációját, citokin termelését, a mellékveséből glükokortikoidokat, a májból akutfázis proteineket, az agyból prosztaglandinokat szabadítanak fel. Szintén a természetes immunválaszban vesznek részt az interferonok, melyek közül az α és a ß a vírussal fertőzött leukocitákból és fibroblasztokból szabadul fel, a γ-t pedig a NK-sejtek és a T-sejtek termelik. Az INFγ pleiotróp hatású, fontos szerepet játszik a mononukleáris sejtek aktiválódásában, elősegíti a citotoxikus effektor sejtek kialakulását, fokozza a NK-sejtek citotoxikus aktivitását, a B-sejtek differenciálódását, ellenanyag termelését. Számos sejten növeli az MHC antigének expresszióját. Az IL-10 több immunfunkciót gátol, így a TH1 sejtek aktiválódását, valamint a makrofágok citotoxikus aktiválódását. Fontos viszont a B-sejtek éréséhez, ellenanyag termeléséhez. Az IL-12 részt vesz a NK-sejtek és a citotoxikus effektor sejtek aktiválásában. Serkenti a T-limfociták TH1 sejtekké alakulását, proliferációját, valamint INFγ termelésüket. A természetes immunválaszt szabályozzák a kemokinek is. E kis molekulatömegű, szerkezetileg rokon molekulákat szinte valamennyi sejtféleség képes termelni. Részt vesznek a sejtek adhéziójának fokozásában, kemotaxis indukálásában és az effektor leukociták aktiválásában. A második csoportba, a limfociták aktivációját és differenciálódását szabályzó citokinek közé sorolható az IL-2, mely a T-sejtek fő autokrin növekedési faktora.
20
Elősegíti a naív T-sejtek, a TH1 sejtek, a CD8+ effektor T-sejtek és a NK-sejtek aktiválását, citotoxikus funkcióit. Szerepe van a B-limfociták proliferációjában, differenciálódásában. Az IL-4 sokféle, különböző sejttípusra hat: gátolja a makrofágok aktivitását, elősegíti a TH2 sejtek kialakulását, proliferációját, B-sejteken indukálja az MHC
és
kostimulátor
molekulák
megjelenését,
serkenti
proliferációjukat,
differenciálódásukat, részt vesz a hízósejtek érésében, endotélsejteken indukálja egyes adhéziós molekulák megjelenését. A TGF-ß az immunrendszer működését általában negatív módon befolyásolja: gátolja a T-sejtek proliferációját és citokin termelését, a Bsejtek proliferációját és ellenanyag-termelését, a NK-sejtek és monociták citotoxikus funkcióit. A harmadik csoportba, az immunsejtek érésére ható citokinek közé tartozik a GM-CSF, az IL-3, melyek a granulociták, makrofágok érését segítik elő, az IL-5, mely az eozinofil granulociták érésében, aktivációjában veszt részt. A SCF a csontvelői őssejtek érésére hat, az IL-7 a B-limfociták csontvelői érését és a timociták fejlődését stimulálja. Az eddig említetteken kívül még számos egyéb citokin ismert, számuk napjainkban is folyamatosan bővül.
2.6.2
Génterápia citokineket kódoló daganatsejt vakcinákkal Egyes klinikai megfigyelések daganatok spontán regressziójáról számolnak be,
ami az immunrendszer tumorellenes aktivitására utal. Sajnálatos módon azonban ez általában nem képes a tumor legyőzésére. Az utóbbi évtizedekben az immunológiai kutatások rávilágítottak a citokinek központi szerepére a daganatellenes válaszban. Szisztémás használatukat azonban súlyos mellékhatásaik, valamint gyors eliminációjuk gátolják.34 E megfigyelések vezettek az alternatív, génterápiás eljárásokhoz, melynek során citokineket kódoló géneket juttatnak a tumor vagy egyéb sejtekbe, majd a genetikailag módosított sejtekkel vakcinálják a beteget. A daganatsejteket felismerő T-sejtek gyakran nem, vagy csak kis mennyiségben szekretálnak
citokineket,
ami
nélkül
az
effektor
T-sejtek
proliferációja
és
differenciálódása kismértékű. A citokinek bejuttatása a T-sejtek környezetébe tehát elősegíti azok effektor sejtekké alakulását. Citokinekkel történő immunizálás
21
alkalmával valóban kimutatták CD8+ és TH1 sejtek jelenlétét a tumorsejtek körül.33,35,36,37 Citokinek hatására kialakul egyrészt egy lokális gyulladásos infiltrátum a tumor környezetében, de sok esetben létrejön egy szisztémás, T-sejt közvetítette tumorellenes immunreakció is, ami az eredeti tumortól távol eső helyeken is hatékony daganat elleni választ tesz lehetővé. A citokinek tumorellenes hatásában talán legfontosabb tényező, hogy a tumorantigének prezentációjának hatásfokát növelik.33,38,39 A
különböző
citokinek
különböző
effektorsejtek
révén,
mechanizmussal hatnak (2. táblázat).7
Citokin
Fő effektor sejtek
Egyéb lehetséges effektor sejtek
G-CSF
Neutrofil
makrofág, eozinofil, CD8+
GM-CSF
CD4+, CD8+
IFN-γ
CD8+
INF-α
CD8+, NK
TNF-α
CD4+, CD8+
makrofág
IL-1
Nincs adat
nincs adat
IL-2
CD8+
NK, neutrofil, eozinofil, makrofág
IL-4
Eozinofil
makrofág, CD8+
IL-6
CD4+, CD8+
NK, makrofág
IL-7
CD4+, CD8+, makrofág
IL-12
CD4+, CD8+, NK
IL-18
NK
NK
CD4+, CD8+
2. táblázat Citokinek effektor sejtjei.
22
különböző
Számos citokin vált ki T-sejt közvetítette immunválaszt: GM-CSF, IL-2, IL-6, IL-7, 1L-12, IL-18. Az eozinofil granulociták az IL-4 fő effektor sejtjei, de részt vesznek az IL-2 által kiváltott immunválaszban is. Neutrofil granulocitáknak van szerepe a G-CSF, makrofágoknak a GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-7 esetében. Fontos kiemelni az IL-4-nél, hogy jelentősen növeli a dendritikus sejtek beáramlását a tumorba, ami magyarázhatja ezen citokin különösen hatékony daganatellenes hatását. Egyes citokinek (IFN-γ, INF-α, IL-1, IL-4) fokozzák az endotél sejteken az adhéziós molekulák expresszióját, mely elősegíti a gyulladásos sejtek szövetekbe áramlását az ereken keresztül. A citokinekkel végzett génterápia során a citokin géneket bejuttathatják magukba a tumorsejtekbe, valamint limfocitákba, fibroblasztokba, endotél- és antigénprezentáló sejtekbe. A tumorsejtek genetikai módosítása citokinekkel4,35,36 két úton történhet: autológ sejtek esetében eltávolítják a beteg tumorát, majd a daganatsejteket in vitro körülmények közt citokint kódoló génekkel módosítják és vakcinálják velük a beteget. Végezhető az immunizálás standard, allogén sejtvonalba bejuttatott citokin gének segítségével is. Ilyenkor fontos követelmény, hogy az allogén sejtek a beteg tumorsejtjeivel közös antigéneket tartalmazzanak. A két módszer közül a második egyszerűbben megvalósítható, viszont az autológ daganatsejtekkel történő vakcináció nagyobb eséllyel aktiválja a beteg immunrendszerét. Mindkét esetben a vakcinációhoz használt tumorsejteket a betegre oltás előtt besugarazzák, annak érdekében, hogy osztódásképtelenné váljanak és ne alakuljon ki belőlük tumor. A limfociták genetikai módosítása is gyakran alkalmazott technika.40 Előnyt jelent, hogy megfelelő stimulus hatására proliferálnak, valamint vándorolnak a szervezetben. Számos tumor esetében kimutatható T-limfocitákból álló infiltrátum (TIL), ami az immunrendszer lokális daganatellenes aktivitására utal, ezért kedvező prognosztikai jelnek tekintik. Több kutatócsoport eredményesen alkalmazott citokin génekkel transzformált TIL-t vakcinációhoz.41 Mások endotélsejtekbe42 juttatják be a citokin géneket. Az endotélsejtek citokineket és növekedési faktorokat képesek termelni. E sejtek több szempontból is alkalmasak génbevitelre: egyrészt in vivo körülmények közt képesek proliferációra,
23
másrészt
a
tumorok
növekedéséhez
alapvetően
fontos
angiogenezis
helyén
expresszálják a terápiás fehérjéket. Fibroblasztok43,44 is felhasználhatók citokin termelésre. Gyakran a beteg autológ tumorsejtjeiből nem könnyű sejtkultúrát létrehozni. Ilyenkor egyszerűbb megoldást kínál az autológ fibroblasztok alkalmazása. Terápiás
célra
megfelelők
az
antigénprezentáló
sejtek
is,45
melyek
nélkülözhetetlenek a tumor reaktív T-sejtek indukálásához. A leghatékonyabb antigénprezentáló sejtek a dendritikus sejtek, melyek jelen vannak minden szövetben. Számos citokin termelésére képesek (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IFN-α, TNF-α, GM-CSF). A kutatások során fény derült a citokinek központi szerepére az tumorantigének
antigénprezentáló
sejtek
általi
bemutatásában.
Feltehetőleg
a
dendritikus sejtek éretlen állapotban találhatók a szövetekben és a citokinek általi stimuláció révén válnak hatékony antigénprezentáló sejtté. Nem egyszerű feladat elegendő mennyiségű dendritikus sejtet izolálni, mivel a vérben található mononukleáris sejteknek mindössze 0,05-0,3%-át teszik ki. Napjainkra azonban sikerült hatékony eljárásokat kifejleszteni: dendritikus sejtek előállíthatók hemopoetikus progenitor sejtekből GM-CSF, TNF, SCF tartalmú médium hozzáadásával, vagy a perifériás vérben található sejtek GM-CSF-el és IL-4-el történő kezelésével. 2.7 2.7.1
Génterápia gyógyszer-érzékenyítő génekkel Gyógyszer-érzékenyítő génterápia mechanizmusa A kemoterápiás kezelés eredményességét gyakran csökkenti a daganatsejtek
citosztatikumok iránti rezisztenciája.46 A kemoterápiás szerek dózisának növelése ugyan fokozza a tumorellenes hatást, ennek azonban gátat szab a gyógyszerek egészséges szövetekre gyakorolt toxikus hatása. Amennyiben génterápiás módszerekkel növelni tudjuk a tumorsejtek érzékenységét a megfelelő gyógyszerrel szemben, kisebb dózisnál jelentkezik a terápiás hatás, ezáltal a daganatellenes hatás fokozható, az egészséges szöveteket érő toxicitás pedig csökken. A génterápia gyógyszer-érzékenyítő génekkel ígéretes új módszert kínál a daganatsejtek kemoterápeutikumok iránti rezisztenciájának legyőzésére és a nem kívánt mellékhatások csökkentésére. Az eljárás során a tumorsejtekbe olyan enzimeket kódoló géneket juttatnak be, amelyek érzékenyítik azokat egyes citosztatikumokra, vagy antivirális szerekre.7 Ezt követően a módosított
24
daganatsejtekben termelődő enzimek metabolizálják a megfelelő, szisztémásan beadott gyógyszereket. Így lokálisan, a daganatban magasabb aktív metabolit koncentráció érhető el, mint az egészséges szövetekben, ami a tumorsejtek szelektív pusztulásához vezet és egyúttal a szisztémás toxicitás is csökkenthető. A gyógyszer-érzékenyítő génterápiának számos módozata ismert. Az ún. „öngyilkos génterápia” során alkalmazott „öngyilkos gének” olyan enzimeket kódolnak, melyek normál körülmények közt nincsenek jelen az eukarióta sejtekben és képesek egyébként nem toxikus szereket toxikussá alakítani. Ezekkel a génekkel transzformált tumorsejtek elpusztulnak a többi sejtre nem toxikus szerrel végzett kezelés hatására. E csoportba sorolható a herpesz szimplex vírus eredetű timidin-kináz (TK) gén. Bejuttatásával a daganatsejtek érzékennyé tehetők a herpesz szimplex fertőzésben használt, a vírusmentes sejtekre egyébként nem toxikus ganciklovir (GC) iránt (ld. 2.7.2). Szintén az öngyilkos gének közé tartozik a bakteriális vagy élesztőből származó citozin-deamináz enzimet (CD) kódoló gén. Az enzim az önmagában nem toxikus 5fluorocitozinból toxikus 5-fluoruracil-t (5-FU) állít elő (ld. 2.7.4). Gyógyszer-érzékenyítő hatású az E. coli eredetű uracil-foszforibozil-transzferáz (UPRT) enzim is, mely serkenti az egyik leggyakrabban használt kemoterápiás szer, az 5-FU metabolizmusát (ld. 2.7.3).
2.7.2
Génterápia timidin-kinázzal A leggyakrabban alkalmazott „öngyilkos génterápián” alapuló gyógyszer-
érzékenyítő eljárás során a daganatsejteket a herpesz szimplex vírus eredetű TK génnel transzformálják. A TK enzim az antivirális szerként alkalmazott ganciklovir metabolizmusához szükséges. A vegyületet a TK ganciklovir-foszfáttá, majd a celluláris kinázok ganciklovir-trifoszfáttá alakítják (3. ábra). Ez beépül a DNS-be, ezáltal gátolja annak szintézisét.6,47,48,49 Mivel az eukarióta sejtek nem tartalmaznak TK-t, a ganciklovir csak a gén bevitele után vált ki citotoxikus hatást. Amennyiben a TK gént szelektíven a tumorsejtekbe visszük be, ganciklovir kezelés hatására csak a transzformált sejtek pusztulnak el, az egészéges sejtek nem károsodnak.
25
2.7.3
Génterápia uracil-foszforibozil-transzferázzal Az UPRT 5-fluorouracilra (5-FU) érzékenyít, mivel annak metabolizmusát segíti
elő. Az 5-FU az egyik leggyakrabban alkalmazott kemoterápiás szer. Toxicitásáért metabolitjai felelősek. A vegyület az emberi szervezetben először fluorouridinné alakul az uridin-foszforiláz segítségével, majd az uridin-kináz fluorouracil-monofoszfáttá (FUMP) konvertálja. Az E. coliban található UPRT enzim az 5-FU-t közvetlenül, egyetlen lépésben alakítja fluorouracil-monofoszfáttá az emlősöknél leírt két lépésben szemben, ami jóval nagyobb hatékonyságot jelent (3. ábra).46,50 Az FUMP toxicitását kifejtheti az RNS-be beépülve, vagy a dezoxiribóz-nukleotid-reduktáz hatására fluorodezoxi-uridin-monofoszfáttá (FdUMP) alakulva beépülhet a DNS-be, ami akadályozza a replikációt. A FdUMP ezenkívül a DNS szintézishez szükséges timidilát-szintetáz enzimet is gátolja.46,47,50
UPRT
5-Fluorouracil
ribonukleotid-difoszfát-reduktáz
FUMP
FdUMP
FdUMP: gátolja a timidilát-szintetáz enzimet, beépül a DNS-be
TK
Ganciklovir
celluláris kinázok
Ganciklovir-foszfát
Ganciklovir trifoszfát
Ganciklovir trifoszfát: beépül a DNS-be, gátolja a DNS szintézist
3. ábra UPRT és TK szerepe az 5-fluorouracil és ganciklovir metabolizmusában
2.7.4
Génterápia citozin-deaminázzal Az 5-fluorocitozin/CD rendszert is gyakran alkalmazzák a gyógyszer-
érzékenyítő génterápia során. Az önmagában nem toxikus 5-fluorocitozinból a bakteriális vagy élesztőből származó citozin-deamináz hatására toxikus 5-fluorouracil keletkezik.5,47
26
2.7.5
„Bystander” hatás A tumorok kezelésekor technikai akadályai vannak, hogy minden daganatsejtbe
bejuttassuk a terápiás géneket. A gyógyszer-érzékenyítő génterápia során fontos szerepe van az ún. „bystander hatás”-nak. Ez azt jelenti, hogy a tumor elpusztításához nem szükséges valamennyi sejtet genetikailag transzformálni, elég csupán a sejtek meghatározott hányadát. Ilyenkor a fertőzött sejtek környezetében elhelyezkedő, érzékenyítő géneket nem tartalmazó sejtek is elpusztulnak. A jelenség magyarázatára többféle elmélet született:51,52 a TK-al módosított sejtekből átjuthatnak a ganciklovir toxikus metabolitjai a környező sejtekbe, részben a „gap junction”-ökön keresztül, részben apoptotikus vezikulák formájában. Az UPRT/5-FU rendszer esetében az 5-FU közvetlenül a sejthártyán is képes átdiffundálni a szomszédos sejtekbe. E mechanizmusok in vitro körülmények közt is működnek, azonban in vivo feltehetőleg az immunrendszer aktivációja is rész vesz a „bystander” hatásban.53 Erre utal, hogy in vivo az „öngyilkos génterápiával” kezelt tumorsejtek jóval hamarabb pusztulnak el, mint in vitro körülmények közt. In vivo az apoptózissal elpusztuló sejtekből proinflammatorikus citokinek szabadulnak fel: 24 órával a kezelés után már kimutatható TNF, IL-1, IL-6 jelenléte. E citokinek gyulladásos sejteket vonzanak a daganat területére. A tumort infiltráló immunsejtek további citokineket szekretálnak, aminek következtében diffúz immunválasz jön létre az egész daganat ellen, függetlenül attól, hogy a sejtek expresszálnak-e érzékenyítő géneket.
2.7.6
Gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinációja sugárterápiával Az új terápiás eljárásokat, mint a génterápiát célszerű kombinálni már bevált, jól
működő tumorellenes eljárásokkal. Mivel az 5-FU sugárérzékenyítő tulajdonsággal is rendelkezik, kézenfekvő a kombináció sugárterápiával. A vegyület radioszenzitizáló hatásának mechanizmusa nem teljesen ismert, feltehetőleg az 5-FU megakadályozza a sugárhatásra keletkezett kettős DNS lánctörések javítását.54,55,56
27
3 CÉLKITŰZÉSEK
I. Kezelés citokineket kódoló tumorsejt vakcinákkal •
adenovírusokkal történő génbevitel hatékonyságának ellenőrzése
Adenovírusokat viszonylag kevesen alkalmaztak a citokineket termelő vakcinák előállítása során. Vizsgálni kívántuk, hogy-e vektorokkal megfelelő hatékonyságú fertőzés érhető-el, valamint a vírus/sejt arány változtatása hogyan befolyásolja a citokin koncentrációt. •
citokin termelő daganatsejt vakcináció hatásának vizsgálata egér modellen
Következő célkitűzésünk a különböző citokineket (IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, GMCSF, LIF, LT, TNF-α) termelő vakcinák, illetve kombinációjuk (IL-4+GMCSF) tumorellenes hatásának tanulmányozása volt kísérletes egér tumor modellen. Mivel a megfelelő
immunválasz
kiváltásában
lényeges
szerepe
lehet
a
citokinek
koncentrációjának, vizsgáltuk a citokin szint és a terápiás hatás összefüggését. •
citokin
termelő
daganatsejt
vakcinák
immunrendszert
aktiváló
hatásának
tanulmányozása Elemezni kívántuk a citokinek immunrendszert aktiváló hatásának mechanizmusát is. Mivel az irodalomban nem egységesek az adatok a CD4+ és CD8+ sejtek szerepével kapcsolatban
a
citokinek
által
indukált
daganatellenes
válaszreakcióban,
immunhisztokémiai reakciót végeztünk a vakcinált agydaganatos állatok agyát infiltráló CD4+ és/vagy CD8+ limfociták kimutatatására, valamint megfigyeltük, hogyan befolyásolja az egerek túlélését a vakcináció előtti anti-CD4+ és anti-CD8+ ellenanyagokkal történő kezelés.
28
•
citokineket termelő daganatsejt vakcináció kombinálása lokális sugárterápiával
A kísérlet során az állatok egy része 6 Gy lokális tumor besugárzásban részesült. Összehasonlítottuk a kombináltan kezelt és a csak vakcinált állatok túlélését.
II. Kezelés gyógyszer-érzékenyítő génterápiával •
gyógyszer-érzékenyítő génterápia vizsgálata in vitro körülmények közt
Egyes kutatócsoportok két különböző gyógyszer-érzékenyítő rendszer kombinációjának szinergista hatásáról számoltak be. Mi a timidin-kináz (TK)/ ganciklovir (GC) és az uracil-foszforibozil-transzferáz (UPRT)/ 5-fluorouracil (5-FU) kettős rendszert kívántuk összehasonlítani egyetlen rendszer hatásával. Ezt a kombinációt eddig még nem alkalmazták. A génterápiához olyan adenovírus vektor állt rendelkezésünkre, mely mindkét gyógyszer-érzékenyítő gént egyszerre kódolja. Sejtkultúrában növő glioma sejtek egy részét adenovírussal fertőztük. Ganciklovir és/vagy 5-FU kezelés után összehasonlítottuk az érzékenyítő géneket tartalmazó, ill. nem tartalmazó sejtek túlélését. •
gyógyszer-érzékenyítő génterápia tanulmányozása kísérletes egér tumor modellen
Szintén két rendszerből álló kombinált génterápiát alkalmaztunk. Kísérleteink első részében olyan tumorsejteket oltottunk az állatokra, melyekbe már előzetesen bejuttattuk a gyógyszer-érzékenyítő géneket. A génterápia során nem szükséges, hogy minden tumorsejt hordozza az érzékenyítő géneket, az ezeket nem tartalmazó tumorsejtek is elpusztulhatnak a toxikus metabolitok diffúziója következtében (ún. „bystander hatás”). Ennek vizsgálatára érzékenyítő géneket tartalmazó és nem tartalmazó tumorsejtek meghatározott arányú keverékével oltottuk az állatokat. Kísérleteink másik részében gyógyszer-érzékenyítő géneket nem tartalmazó tumorsejtek oltásával létrehozott daganatokat kezeltünk gyógyszer-érzékenyítő géneket hordozó adenovírusok közvetlen tumorba injektálásával. Nyomon követtük a túlélési időket.
29
•
gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinálása lokális sugárterápiával
Az állatok egy része 4 Gy lokális feji besugárzásban részesült. Összehasonlítottuk a besugárzott, a gyógyszer-érzékenyítő génterápiával és a kombináltan kezelt állatok túlélését. •
gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinálása citokineket termelő daganatsejt vakcinációval egér modellen
Végül vizsgálni kívántuk két különböző génterápiás rendszer: a citokineket termelő daganatsejt vakcinák és a gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinációjának hatását. Összehasonlítottuk a vakcinációval, a gyógyszer-érzékenyítő génterápiával és a kettő kombinációjával kezelt állatok túlélését.
30
4 MÓDSZEREK
4.1
Sejtvonalak A tumorok létrehozásához Glioma 261 (Gl261) egér glioma sejteket
alkalmaztunk. A daganatot eredetileg kémiai karcinogének intracerebrális injektálásával indukálták C57Bl/6 egereken és kis tumor darabok intrakraniális, ill., szubkután transzplantációjával tartották fent.57 Intézetünkben a daganatból permanens sejtvonalat sikerült előállítani. A sejteket Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) médiumban, 10% borjúsavó jelenlétében tenyésztettük. A GK1.5 és 53-6.72 monoklonális, anti-CD4+ és anti-CD8+ ellenanyagokat termelő hibridoma sejtvonalakat az ATCC-től vásároltuk. 4.2 4.2.1
Adenovírus vektorok Adenovírusok fajtái, előállításuk Az adenovírusokat japán együttműködő partnerünktől kaptuk. Egy részük
citokineket
kódoló
AdexCAmIL-7,
géneket
(AdexCAmIL-2,
AdexCAmIL-12p35,
AdexCAmIL-4,
AdexCAmIL-12p40,
AdexCAmIL-6,
AdexCAmGM-CSF,
AdexCAmLT, AdexCAmLIF, AdexCAmTNFα) tartalmaz.40 Az IL-12 gén két alegységét (p35, p40) külön vektor hordozza. A másik típusú adenovírus vektor (Adex-CAUPTK) gyógyszer-érzékenyítő géneket tartalmaz. Ez esetben egyetlen vektorba juttatták be az uracil-foszforiboziltranszferáz (UPRT) és a timidin-kináz (TK) enzimeket kódoló géneket.46,50,58 A vírusok előállítása során az 5-ös típusú adenovírus E1A, E1B és E3 régióját eltávolították és ún. klónozó kazettával helyettesítették, mely UPRT és TK géneket hordozott. A génexpressziót mesterséges promoter vezérli, mely csirke β-aktin promoterét és citomegalovírus fő korai enhanszerét tartalmazza (4. ábra).40
31
poly(A)
cDNS
promoter
E1A+E1B
E3
4. ábra Kísérleteink során alkalmazott adenovírus vektor felpítése. Az E1A, E1B és E3 régiót eltávolították és ún. klónozó kazettával helyettesítették, mely a terápiás géneket hordozza. A génexpressziót mesterséges promoter vezérli, mely csirke β-aktin promoterét és citomegalovírus fő korai enhanszerét tartalmazza
4.2.2
Adenovírusok
felszaporítása
szuszpenziós
kultúrában,
vírustiter
meghatározása Az általunk használt adenovírusok önálló replikációra képtelenek, mivel hiányzik belőlük az ehhez szükséges E1a-E1b régió. Így felszaporításuk csak olyan sejtvonalban lehetséges, mely tartalmazza a hiányzó géneket. Legáltalánosabban használt a besugárzással összetört adenovírus DNS-el transzformált humán embrionális vese sejtekből álló 293-as sejtvonal. 16,40 Az eljárás során Joklik médiumot tartalmazó szuszpenziós kultúrában növő 293as sejteket fertőztünk a felszaporítani kívánt adenovírus vektorral a transzfekcióhoz optimális 3-5x105/ml sejtszám elérésekor. Negyvennyolc óra múlva ellenőriztük a fertőzés hatékonyságát: a vírus citopátiás hatására utal, ha a sejtek nem képesek 1-2 órán belül kitapadni szövettenyésztő flaskában. A vírusoldat centrifugálása (3000 rpm, 8 min) után az üledéket 5-7 ml pH: 8-as TrisHCl-ben felszuszpendáltuk, majd lefagyasztottuk -70˚C-ra. Ezt követően 37˚C-os vízfürdőben felengedtük, centrifugáltuk (3000 rpm, 8 min), a felülúszóhoz 10% glicerint adtunk és -70˚C-on tároltuk. A vírusoldat titerét „plaque assay”-vel határoztuk meg. A módszer lényege: Petri csészében növesztett 293-as sejteket a meghatározni kívánt vírusoldat különböző
32
hígításaival fertőzünk. 5-10 nap múlva az agaróz táptalajon a vírus citopátiás hatása következtében szabad szemmel látható sejtmentes területek, plakkok alakulnak ki. Ezek megszámolásával, a hígítás ismeretében határozható meg a vírus titere, a PFU („plaque forming unit”) érték, mely az 1 ml oldatban levő plakk-képző egységek számát adja meg.
4.2.3 Adenovírusokkal történő fertőzés hatékonyságának vizsgálata 24 lyukú sejtkultúra edénybe lyukanként 2x104 Gl261 sejtet oltottunk ki. A sejteket béta-galaktozidáz enzimet kódoló rekombináns adenovírussal fertőztük különböző vírus/sejt arányokban. A sejteket X-Gal pufferben festettük meg. A leolvasott kék/fehér sejtek számaránya mutatta a fertőzés hatásfokát.40 4.3
Kísérletek citokineket termelő daganatsejt vakcinákkal
4.3.1 Agytumoros egerek kezelése citokineket termelő daganatsejt vakcinákkal és/vagy lokális besugárzással Az agytumorok létrehozása során ketamin-xilazin keverékkel anesztetizált 8-12 hetes C57Bl/6 egerekre 1-2x104 Gl261 sejtet oltottunk a „fissura petrosquamosa”-n keresztül a jobb agyféltekébe, a felszíntől 4 mm mélyre, Hamilton injekciós tű segítségével. Logaritmikus fázisban levő sejteket használtunk. A sejteket foszfát-puffer oldatban (PBS) gyűjtöttük be és 25 µl/állat térfogatban oltottuk az egerekre. Abban az esetben, mikor a vakcinációt sugárterápiával is kombináltuk, nagyobb sejtszámot alkalmaztunk (1x105 sejt/állat). A vakcinációt 3 nappal a daganat transzplantáció után végeztük. A citokin termelő vakcinák előállításához sejtkultúrában növesztett Gl261 sejteket különböző vírus/sejt arányban citokinekkel fertőztünk. A citokinek szintjét ELISA kit segítségével határoztuk meg a sejtkultúra felülúszójából 48 órával a fertőzést követően, a sejteket pedig 20 Gy
60
Co-γ besugárzással (Gammatron-3 sugárforrás, dózis teljesítmény:
0,4781 Gy/min, Siemens) kezeltük a további sejtosztódás leállítása céljából. Ezt követően tripszin kezeléssel begyűjtöttük a sejteket, PBS oldatban szuszpendáltuk, majd az agytumoros állatokat szubkután vakcináltuk (106 sejt/állat, 0,2 ml térfogatban).
33
Nyomon követtük az állatok túlélését. A súlyosan beteg állatokat elöltük és felboncoltuk A kísérletet lokális sugárterápiával is kombináltuk. Az anesztetizált állatok 6 Gy lokális feji röntgen besugárzásban részesültek (THX-250 sugárforrás, dózisteljesítmény: 1,003 Gy/min, Medicor). Az egerek testének többi részét ólom cső védte. A besugárzás 3 nappal a tumor oltás után történt, egy órával a vakcináció előtt.
4.3.2
Immunrendszeri aktiváció mechanizmusa
4.3.2.1 Citotoxikus T-limfociták aktivációja Egészséges egereket vakcináltunk besugarazott Gl261 sejtekkel, vagy IL-4-et, ill. GM-CSF-et termelő Gl261 sejtekkel. A vakcinációt követően különböző időpontokban (3 nap, 1 hét, 2 hét) a leölt állatok lépéből limfocitákat izoláltunk. A limfocitákat besugárzott Gl261 sejtek és IL-2 jelenlétében tenyésztettük 5 napig, majd 51
Cr-al jelölt Gl261 vagy B16 melanoma sejtekkel kevertük különböző effektor és
célsejt arányban. A limfocita aktivitást a sejtkultúra felülúszójából mért radioaktivitás alapján határoztuk meg.59 4.3.2.2 Immunhisztokémiai vizsgálatok Agytumoros egereket vakcináltunk IL-2-t, IL-4-t, IL-12-t és GM-CSF-et termelő Gl261 sejtekkel. 10 nap múlva az elölt állatok agyát eltávolítottuk, és 4%-os formaldehidben fixáltuk. Parafinba ágyazás után 8 µm vastagságú metszetek készültek, majd immunhisztokémiai reakciót60 végeztünk poliklonális CD4+ és CD8+ ellenes antitestek segítségével. A primer antitesteket 1: 100 arányban hígítottuk és deaminobenzidinnel tettük láthatóvá a reakciót. Pozitív kontrollként normál egér nyirokcsomó szolgált. A negatív kontrolloknál nem használtunk antitesteket. 4.3.2.3 CD4+ és/vagy CD8+ sejtek deplécióját követő vakcináció GM-CSF-et termelő Gl261 sejtekkel Egér GK1.5 és 53-6.72 hibridoma sejtek által termelt anti-CD4+-et és antiCD8+-at használtunk vizsgálatainkhoz. Az antitesteket DE52 ioncserélő kromatográfia segítségével tisztítottuk.61 A kísérlet során az állatokat anti-CD4+ és/vagy anti-CD8+ ellenanyagokkal kezeltük, majd agytumorokat hoztunk létre és az egereket a daganat
34
indukció után 3 nap múlva GM-CSF-et termelő Gl261 sejtekkel vakcináltuk. Vizsgáltuk a túlélési időket.
4.3.3
Statisztikai analízis Az eredmények kiértékelését számítógépes program (BMDP4F Statistical
Software, Inc., Los Angeles, CA, USA) segítségével Mantel-Cox analízissel végeztük. A P<0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak.
4.4
Kísérletek gyógyszer-érzékenyítő génterápiával
4.4.1
In vitro 5-fluoruracil, ganciklovir kezelés és besugárzás hatása gyógyszerérzékenyítő géneket tartalmazó Gl261 sejtekre Gl261 sejteket oltottunk Petri csészékbe (2x105 sejt/Petri). 24 óra múlva a
sejteket az UPRT és TK géneket tartalmazó Adex-CAUPTK vírussal (ld. 4.2.1) fertőztük két különböző (10 és 100) vírus/sejt arányban. Majd 5 napon keresztül 5-FUal
és/vagy
ganciklovirral
kezeltük
a
sejteket
különböző
(0,001-10
µM)
koncentrációkban. A gyógyszer-érzékenyítő génterápia és az ionizáló sugárzás kombinációjának vizsgálatára a sejtek egy része 2 Gy
60
Co-γ (Gammatron-3
sugárforrás, dózisteljesítmény: 0,4781 Gy/min, Siemens) besugárzásban részesült az első 5-FU/ganciklovir kezelés előtt 1 órával. A fertőzés után 5 nappal a sejteket tripszin kezeléssel begyűjtöttük, majd megszámoltuk.
4.4.2
Gyógyszer-érzékenyítő géneket tartalmazó agy-, ill. szubkután tumorok kezelése 5-fluorouracillal, ganciklovirral, valamint lokális irradiációval C57Bl/6 egerekre szubkután, ill. agytumorokat transzplantáltunk. A szubkután
tumorok létrehozásához 0,5-1x106 Gl261 sejtet oltottunk az állatok jobb alsó végtagjára 200 µl PBS oldatban. Agytumorok indukálásához a „fissura petrosquamosa”-n keresztül oltottunk be 1,5-2x104 tumorsejtet a ketamin-xylazin keverékkel anesztetizált állatok jobb agyféltekéjébe, 4 mm mélyre, Hamilton injekciós tű segítségével, 25 µl PBS oldatban.
35
Mind a szubkután, mind az agytumoroknál a daganat transzplantáció vagy vad típusú Gl261 sejtekkel, vagy Adex-CAUPTK-val fertőzött Gl261 sejtekkel történt. A genetikailag módosított tumorsejtek előállításához a Gl261 sejteket a kioltást követő 24 óra múlva Adex-CAUPTK-val fertőztük 100 vírus/sejt arányban. Negyvennyolc órával később 0,25% tripszin kezeléssel begyűjtöttük a sejteket és PBS oldatban szuszpendálva oltottuk az állatokra. A daganatok létrehozását követő 3. naptól kezdve az állatokat 5 napig 5-FU (10 mg/kg) és ganciklovir (5 mg/kg) intraperitoneális injekcióival kezeltük, majd két nap szünet után további 5 napig. Nyomon követtük a szubkután tumorok méretének alakulását, illetve az agydaganatos egerek túlélését. A szubkután tumorok átmérőit kétnaponta mértük tolómérővel, majd az átmérők alapján kiszámítottuk a daganat térfogatát (hosszúság x szélesség x π/6). A tüneteket mutató agytumoros egereket, valamint 100 nappal a tumor oltás után a gyógyult állatokat is elöltük és felboncoltuk. A gyógyszer-érzékenyítő génterápiánál észlelhető „bystander hatás” vizsgálatára az agydaganatokat Adex-CAUPTK-val fertőzött, ill. nem fertőzött Gl261 sejtek 1:4 és 1:9 arányú keverékével hoztuk létre. Kísérleteinket lokális besugárzással is kombináltuk. Ebben az esetben az agytumorokat mintegy ötször magasabb sejtszámmal hoztuk létre (1x105 sejt/állat). Az anesztetizált állatok feje 4 Gy-el lett besugarazva (THX-250 terápiás röntgen sugárforrás, dózisteljesítmény: 1,003 Gy/min, Medicor,). A test többi részét ólom cső védte. Az irradiáció 3 nappal a daganat transzplantáció után és 1 órával az első 5FU/ganciklovir kezelést követően történt.
4.4.3
Gyógyszer-érzékenyítő
géneket
tartalmazó
agytumorok
kezelése
5-
fluorouracil és ganciklovir terápia, valamint citokin termelő daganatsejt vakcináció kombinálásával Vakcinációval
történő
kombináció
esetében
a
GM-CSF-et
termelő
tumorsejtekkel 3 nappal a tumor oltás után vakcináltuk az állatokat (ld. 4.3.1) és 5-FUal, ganciklovirral kezeltük az előzőkben leírtak alapján
36
4.4.4
Daganatok utólagos kezelése gyógyszer-érzékenyítő génterápiával és besugárzással Szubkután tumorokat hoztunk létre érzékenyítő géneket nem tartalmazó Gl261
sejtek (5x105 sejt/állat) jobb hátsó végtagba történő oltásával, 0,2 ml PBS oldatban. A daganat transzplantációt követő 3. naptól az egereket intraperitoneálisan 5-FU-al (10 mg/kg), és ganciklovirral (5 mg/kg) kezeltük 5 napig, majd 2 nap szünet után újabb 5 napig. Mindkét 5 napos periódus első napján, 1 órával az 5-FU/ganciklovir kezelés előtt a tumor inokuláció helyére Adex-CAUPTK-t injektáltunk (1x109 vírus partikulum 100 µl PBS oldatban). Az állatok egy részénél a tumor oltás helye 2 Gy röntgensugárzásban is részesült egy órával az 1. és a 6. 5-FU/ganciklovir kezelés után. A test többi részét ólomcső védte. A tumorok növekedését 2 naponta mértük. 4.5
Statisztikai analízis Az eredmények kiértékelését számítógépes program (BMDP4F Statistical
Software, Inc., Los Angeles, CA, USA) segítségével Mantel-Cox analízissel végeztük. A P<0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak.
37
5 EREDMÉNYEK
5.1 5.1.1
Kezelés citokineket termelő daganatsejt vakcinákkal A fertőzés hatékonyságának vizsgálata és a citokin termelés mérése Az adenovírusokkal történő vírus fertőzés hatékonyságának vizsgálatára lacZ
gént kódoló adenovírus vektort (Adex-lacZ) juttattunk Gl261 sejtekbe különböző vírus/sejt arányban, majd megmértük a lacZ+ sejtek arányát. 10 vírus/sejt aránynál a sejtek 50-70%-a fertőződött meg, 100 vírus/sejt értéknél pedig valamennyi sejt tartalmazta a vírust (5. ábra). Adenovírus vektorokkal tehát nagy hatékonyságú génbevitel érhető el.
5. ábra Gl261 sejtek fertőzése különböző vírus/sejt arányban béta-galaktozidáz enzimet kódoló rekombináns adenovírus vektorral.
38
A citokin szint méréséhez Gl261 sejteket fertőztünk citokineket (IL-2, IL-4, IL12, GM-CSF) kódoló adenovírus vektorokkal különböző vírus/sejt arányban és ELISA reakcióval meghatároztuk a citokinek expresszióját a sejttenyészet médiumában. A citokin szint lineárisan növekedett egészen 500 vírus/sejt arányig (6. ábra). Mivel a korábban leírtak szerint 100 vírus/sejt értéknél valamennyi sejt megfertőződött, a lineáris növekedés arra utal, hogy ezen érték felett egy sejtbe több vírus is jutott. Az IL12 többi citokinnél alacsonyabb koncentrációjának magyarázata, hogy a molekula két alegységét külön vektor tartalmazta, az IL-12-t expresszáló sejtek előállításához mindkét vektorral egyszerre fertőztük a sejteket. Az IL-12 molekulák kialakulásához tehát mindkét alegység expressziójára és hatékony érési folyamatára volt szükség ugyanabban a sejtben. A citokinek koncentrációjának lineáris emelkedése lehetővé teszi, hogy a vírus/sejt arány változtatásával könnyen módosítsuk a citokin termelő daganatsejt vakcinák citokin koncentrációját és meghatározzuk a terápiás hatás eléréséhez optimális értéket.
6. ábra Genetikailag módosított Gl261 sejtek által termelt citokinek szintje. In vitro növő Gl261 sejteket különböző vírus/sejt arányban fertőztünk különböző citokineket kódoló adenovírus vektorokkal. A citokin koncentrációt a fertőzést követően 24 óra múlva ELISA reakcióval mértük.
39
5.1.2
Agytumorok kezelése citokineket termelő daganatsejt vakcinákkal Egereken agytumorokat hoztunk létre 1-2x104 Gl261 sejt intrakraniális oltásával.
Három nappal később az állatokat citokineket különböző arányban termelő Gl261 sejtekkel vakcináltuk. A daganatsejt vakcinák előállítása során sejtkultúrában növő Gl261 sejtekbe különböző vírus/sejt arányban juttattunk be citokineket (IL-2, IL-4, IL6, IL-7, IL-12, GM-CSF, LIF, LT, TNF-α) kódoló adenovírus vektorokat. Két nappal később a további sejtosztódás leállítása érdekében besugaraztuk a sejteket (20 Gy 60Coγ), majd begyűjtés után szubkután vakcináltuk velük az állatokat. Eredményeink szerint a terápiás hatás szorosan összefüggött a citokin típusával és szintjével. Az IL-6-ot, IL-7-et, LIF-t, LT-t, TNF-α-t termelő vakcinák nem voltak képesek növelni az állatok túlélését (adatok nincsenek feltüntetve). Ezzel szemben az IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF az egerek egy részét meggyógyította. Ezekben az esetekben a túlélést jelentősen befolyásolta a citokin koncentráció. A GM-CSF-et expresszáló vakcinánál a legmagasabb túlélést (30-40%) 10 vírus/sejt aránynál kaptuk (7. ábra). Ekkor a citokin koncentráció 10 ng GM-CSF/106 sejt/24 h volt (6. ábra). Magasabb citokin szintnél (50, 100 vírus/sejt arány) lényegesen kisebb hatékonyságot észleltünk (7. ábra). Az IL-4 vakcina leghatékonyabb 100 vírus/sejt aránynál volt, ekkor az egerek mintegy 5-10%-a élte túl a tumort (8. ábra). 50 ng IL-4/106 sejt/24 h citokin koncentrációt mértünk. Alacsonyabb vírus/sejt aránynál nem jelentkezett terápiás hatás. Mind IL-2, mind IL-12 esetében magasabb, 200 vírus/sejt arány bizonyult hatékonynak. Ekkor az állatok 20-40%-a gyógyult meg (9. ábra). Mivel a citokin koncentrációnak döntő jelentősége van a terápiás hatás szempontjából, a következőkben a citokin szint időbeli változását tanulmányoztuk vakcinált állatok plazmájában. In vitro növő Gl261 sejteket 300 vírus/sejt arányban fertőztünk GM-CSF-et kódoló adenovírus vektorral, majd 48 óra múlva besugaraztuk a sejteket (20 Gy
60
Co-γ). Ezt követően a sejteket különböző arányban kevertük
besugarazott, GM-CSF-et nem termelő sejtekkel és agydaganatos egereket vakcináltunk 1x106 sejttel. A vakcinált állatoktól közvetlenül az oltás előtt és az oltás után 24, 48, 72 és 96 órával vért vettünk. ELISA reakcióval megmértük a citokinek koncentrációját az állatok vérplazmájában (10. ábra). A GM-CSF koncentráció a 24 óra után érte el maximumát, majd fokozatosan csökkent. A vakcinációt követő 96 óra múlva, pedig a kontroll állatoknál mérttel megegyező szintet észleltünk. A genetikailag módosított
40
daganatsejtek tehát a besugárzás után mintegy 5 napig képesek a citokinek termelésére. Látható, hogy a citokin termelő sejtek különböző arányú keverése citokineket nem termelő sejtekkel módot ad a plazma citokin szintjének változtatására (10. ábra).
7. ábra Agytumoros egerek túlélése GM-CSF-et termelő tumorsejt vakcina hatására. A vakcina elkészítéséhez in vitro növő Gl261 sejteket különböző vírus/sejt arányban fertőztünk GM-CSF-et kódoló adenovírus vektorral. P<0,008 a 10 vírus sejt arányú vakcina esetében a Gl261 vakcinához képest
41
8. ábra Agytumoros egerek túlélése IL-4-et termelő tumorsejt vakcina hatására. A vakcina elkészítéséhez in vitro növő Gl261 sejteket különböző vírus/sejt arányban fertőztünk IL-4-et kódoló adenovírus vektorral. P<0,02 a 100 vírus/sejt arányú vakcina esetében a Gl261 vakcinához képest
9 ábra Agytumoros egerek túlélése IL-2-t és IL-12-t termelő tumorsejt vakcinák hatására. A vakcina elkészítéséhez in vitro növő Gl261 sejteket 200 vírus/sejt arányban fertőztünk IL-2-t és IL12-t kódoló adenovírus vektorral. P<0,002 és <0,02 az IL-12-t és IL-2-t termelő vakcina esetében a Gl261 vakcinához képest.
42
10. ábra GM-CSF plazmakoncentráció citokin termelő, besugarazott Gl261 sejtekkel történő vakcináció után.
43
Vizsgáltuk a citokinek kombinációjával történő vakcináció terápiás hatását is. A vakcina előállítása során Gl261 sejteket mind GM-CSF-et, mind IL-4-et kódoló adenovírus vektorral fertőztünk. A kombináltan kezelt állatok túlélése lényegében hasonló volt a csak GM-CSF-el kezeltekéhez, nem észleltünk fokozott tumorellenes hatást (11. ábra).
11. ábra Agytumoros egerek túlélése GM-CSF-et, IL-4-et és mindkét citokint termelő tumorsejt vakcinák hatására. P<0,001, <0,016, <0,0008 a GM-CSF-et, az IL-4-et és a mindkét citokint szekretáló vakcináknál a Gl261 vakcinához képest.
5.1.3
T-limfociták aktivációjának vizsgálata
5.1.3.1 Citotoxikus T-limfociták aktivációjának tanulmányozása Egészséges egereket vakcináltunk IL-4-et vagy GM-CSF-et termelő Gl261 sejtekkel. A vakcinációt követő különböző időpontokban leöltük az állatokat és a lépből limfocitákat preparáltunk, majd mértük a citotoxikus T-limfociták aktivációját. Az első héten nem észleltünk immunválaszt, majd az aktivitás folyamatosan növekedett és 3 hét múlva tetőzött. GM-CSF esetében lényegesen nagyobb aktivitást tapasztaltunk, mint IL4-nél (12. ábra).
44
12. ábra Citotoxikus T-limfociták aktivációjának vizsgálata citokin termelő daganatsejt vakcináció után
5.1.3.2 Immunhisztokémiai vizsgálatok Agytumoros egereket vakcináltunk IL-2-t, IL-4-t, IL-12-t, GM-CSF-t termelő Gl261 sejtekkel. A kontrollokat besugárzott Gl261 sejtekkel kezeltük. A daganatok transzplantációját követő 10. napon a leölt állatok agyát eltávolítottuk és immunhisztokémiai vizsgálatot végeztünk a tumort infiltráló CD4+ és CD8+ limfocita populációk jelenlétének kimutatására. Az IL-2-vel, IL-4-el, IL-12-vel, GM-CSF-el vakcinált állatoknál az agydaganat kifejezett CD4+ limfocitás infiltrációját észleltük. A GM-CSF ezenkívül mérsékelt CD8+ infiltrációt is indukált (13. ábra). Más vakcináknál CD8+ infiltráció nem volt kimutatható. A kontroll állatok agytumorában sem CD4+, sem CD8+ limfociták nem voltak jelen.
45
13. ábra Agytumorok immunhisztokémiai vizsgálata GM-CSF vakcináció után. Agytumoros egereket Gl261 sejtekekkel (A, C kép) vagy GM-CSF-et termelő Gl261 sejtekkel (B, D kép) vakcináltunk. 10 nappal a vakcináció után vizsgáltuk a CD4+ (A, B) kép és a CD8+ (C, D kép) limfociták jelenlétét. N: normál agyszövet, T: tumoros agyszövet. A nyilak a tumort infiltráló CD4+ és CD8+ limfocitákat mutatják.
46
5.1.3.3 CD4+ és/vagy CD8+ sejtek deplécióját követő vakcináció GM-CSF-et termelő Gl261 sejtekkel A CD4+ és CD8+ limfociták szerepét tovább tanulmányoztuk a citokinek által indukált daganatellenes immunválaszban. Egereket anti-CD4+ és/vagy anti-CD8+ ellenanyagokkal kezeltünk. Ezt követően agytumorokat hoztunk létre Gl261 sejtek intrakraniális oltásával, majd 3 nap múlva GM-CSF-et termelő daganatsejtekkel vakcináltuk az állatokat. Mind a CD4+, mind a CD8+ sejtek funkciójának kiesése meggátolta a vakcina tumorellenes hatásának létrejöttét (14. ábra).
14. ábra CD4+ és CD8+ limfociták deplécióját követő vakcináció GM-CSF-et termelő tumorsejt vakcinával. P<0,006 a GM-CSF vakcinánál a Gl261 vakcinához képest.
5.1.4
Citokin termelő daganatsejt vakcináció és lokális sugárterápia kombinálása Mint
korábban
említettük,
egyes
citokinekkel
történő
vakcináció
az
agydaganatos állatok 20-40%-át gyógyította meg (ld. 5.1.2). Vizsgálni kívántuk, hogy a vakcináció kombinálása lokális sugárterápiával képes-e tovább növelni a túlélést.
47
Agytumorokat hoztunk létre 1-2x104 Gl261 sejt intrakraniális oltásával, majd 3 nappal később az állatok fejét 6 Gy-el besugaraztuk. 1 órával a besugárzás után az egereket IL4-et vagy IL-12-t termelő Gl261 sejtekkel vakcináltuk. A kombinált kezelés hatására az állatok mintegy 80%-a élte túl a tumort (15. ábra).
15. ábra Lokális tumor besugárzás és citokin termelő tumorsejt vakcináció kombinációjának hatása agytumoros egerek túlélésére. P<0,01 és <0,02 az IL-12 –t és IL-4-t termelő vakcina esetében a Gl261 vakcinához képest. P<0,0001 és <0,0001 a besugárzással kombinált IL-12 és IL-4 vakcina esetében a besugárzással kombinált Gl261 vakcinához képest.
Annak érdekében, hogy megállapítsuk a módszer korlátait, a következő kísérlet alkalmával a daganatokat mintegy tízszer nagyobb sejtszámmal (1x105) hoztuk létre, mint a korábbiakban. Három nappal később az állatok fejét besugaraztuk az előzőekben leírtak szerint. A besugárzás után 1 óra múlva az egereket GM-CSF-el vakcináltuk 200 vírus/sejt arányban. Az optimális 10 vírus/sejt aránytól eltérően azért alkalmaztunk 200 vírus/sejt arányt, mivel tanulmányozni kívántuk, hogy a besugárzással történő kombináció abban az esetben is képes-e javítani a túléléseket, ha a citokin koncentráció nem optimális. Besugárzás nélkül a vakcinációnak egyáltalán nem volt terápiás hatása (16. ábra). A citokin szint csökkentése érdekében az állatok egy részét GM-CSF-et
48
termelő és nem termelő sejtek 1:3 arányú keverékével vakcináltuk. Ez esetben a túlélés mérsékelten megnőtt, de az állatok nem gyógyultak meg. A besugárzás önmagában kis mértékben megnövelte az élettartamot, de egy állat sem élte túl a tumort. Ezzel szemben a vakcináció és a lokális besugárzás kombinációja jelentősen növelte a túlélést, az egerek 80%-a meggyógyult. Amennyiben pedig a citokin szint valamivel alacsonyabb volt (1:3 arányú keverék), a túlélés 100%-ra nőtt (16. ábra).
16. ábra Lokális tumor besugárzás és citokin termelő tumorsejt vakcináció kombinációjának hatása agytumoros egerek túlélésére. P<0,002 a besugárzással kombinált GM-CSF vakcináció esetében és <0,0001 a besugárzással kombinált GM-CSF-et 1:3 arányban termelő és nem termelő sejtek keverékével végzett vakcinációnál a besugárzással kombinált Gl261 vakcinához képest.
49
5.2 5.2.1
Kezelés gyógyszer-érzékenyítő génterápiával In vitro kísérletek Elsőként a Gl261 sejtek in vitro 5-FU és ganciklovir érzékenységét
tanulmányoztuk, valamint vizsgáltuk ennek változását Adex-CAUPTK fertőzés hatására. Ez a vektor mind az UPRT, mind a TK géneket tartalmazza és a sejteket 5-FUra, ill. ganciklovirra érzékenyíti. A fertőzés 10 vagy 100 vírus/sejt arányban történt. Tíz vírus/sejt aránynál a sejtek 60-70%-a tartalmazta a vírust, míg 100 vírus/sejt értéknél valamennyi sejt megfertőződött (ld. 5.1.1). Mind a fertőzött, mind a nem fertőzött tumorsejteket 5-FU-al és/vagy ganciklovirral kezeltük különböző (0,001-10 µM) koncentrációkban, majd meghatároztuk a sejtszámokat. A ganciklovir önmagában nem volt toxikus a vírust nem tartalmazó sejtekre, mivel az eukarióta sejtek nem tudják metabolizálni. A sejtek Adex-CAUPTK-val (100 vírus/sejt) történő fertőzése után viszont már jelentős citotoxicitást észleltünk (17. ábra). Az 5-FU önmagában is csökkentette a sejtszámot, mivel az eukarióta sejtek képesek metabolizálni. Citotoxikus hatása azonban lényegesen fokozódott az UPRT gént kódoló vírus jelenlétében. A nem fertőzött Gl261 sejtek kombinált kezelése 5-FUal és ganciklovirral hasonló hatású volt, mint az 5-FU kezelés önmagában. Ezzel szemben az érzékenyítő géneket tartalmazó sejtek kombinált kezelésekor lényegesen nagyobb citotoxikus hatást tapasztaltunk, mint az 5-FU vagy ganciklovir monoterápia esetében. Tíz vírus/sejt arányban történő transzfekció esetében hasonló, bár kisebb fokú sejtpusztulás jelentkezett (18. ábra). Végül vizsgáltuk a gyógyszer-érzékenyítő génterápia és az ionizáló sugárzás kombinációját. Mind a fertőzött, mind a nem fertőzött sejteket 5-FU-al és ganciklovirral, valamint 2 Gy γ-sugárzással kezeltük. A besugárzás önmagában a sejtek 45%-át pusztította el (adatok nincsenek feltüntetve). Gógyszer-érzékenyítő gének hiányában alacsony koncentrációknál az 5-FU és ganciklovir kezelés nem fokozta lényegesen a besugárzás citototoxikus hatását. Ezzel szemben a kombinált kezelésnek drámai hatása volt a fertőzött sejtek túlélésére: 0,01 µM-os gyógyszer koncentrációnál valamennyi sejt elpusztult (17. ábra).
50
17. ábra UPRT és TK géneket tartalmazó adenovírus vektorral 100 vírus/sejt arányban fertőzött Gl261 sejtek érzékenysége 5-FU-ra, ganciklovirra és ionizáló sugárzásra.
18. ábra UPRT és TK géneket tartalmazó adenovírus vektorral 10 vírus/sejt arányban fertőzött Gl261 sejtek érzékenysége 5-FU-ra, ganciklovirra és ionizáló sugárzásra.
51
5.2.2
5-fluorouracil/ganciklovir kezelés hatása kísérletes daganat modellen A gyógyszer-érzékenyítő génterápia hatását szubkután és intrakraniális tumor
modellen is vizsgáltuk. Szubkután, ill. intrakraniális daganatokat hoztunk létre gyógyszer-érzékenyítő géneket tartalmazó Gl261 sejtek oltásával. A TK és az UPRT gének bejuttatásához Gl261 sejteket fertőztünk Adex-CAUPTK-val 100 vírus/sejt arányban, 2 nappal a tumor transzplantáció előtt. A kontroll állatokat nem fertőzött Gl261 sejtekkel oltottuk. A kontroll egereknél nem volt lényeges különbség a szubkután daganatok növekedésében: hasonló ütemben nőttek a kezeletlen és az 5-FU-al és/vagy ganciklovirral kezelt állatok tumorai is (19. ábra). Ezzel szemben az érzékenyítő géneket tartalmazó 5-FU-al, ganciklovirral valamint mindkét gyógyszerrel kezelt állatok tumor növekedése lényegesen lassabb volt. Hasonló eredményeket figyeltünk meg az agydaganatos egereknél is. Valamennyi kontroll állat elpusztult 3-4 héttel a tumor transzplantáció után (eredmények nincsenek feltüntetve). Szintén elpusztult az összes kezeletlen, gyógyszerérzékenyítő gént tartalmazó állat is (20. ábra). Ugyanakkor az 5-FU-al kezelt, érzékenyítő-géneket tartalmazó állatok 10-20%-a, a ganciklovirral kezeltek 40-50%-a meggyógyult. Leghatékonyabbnak a kombinált kezelés bizonyult, amikor a túlélés elérte a 60-80%-ot, megerősítve az in vitro kísérletek eredményeit, miszerint legnagyobb citotoxikus hatással a két gyógyszer kombinációja rendelkezik.
52
19. ábra Gyógyszer-érzékenyítő géneket tartalmazó szubkután tumorok növekedése 5-FU és/vagy ganciklovir kezelés után.
20. ábra Gyógyszer-érzékenyítő géneket tartalmazó agytumoros egerek túlélése 5-FU és/vagy ganciklovir kezelés után. P<0,0857 és <0,0306 az 5-FU és ganciklovir kezeléseknél a kezeletlen kontrollhoz képest. P<0,0058 a kombinált kezelésnél a kontrollhoz képest.
53
5.2.3
„Bystander hatás” vizsgálata Az előző daganat modelleknél valamennyi Gl261 sejt tartalmazta a gyógyszer-
érzékenyítő géneket. Ez az optimális állapot azonban sajnos a klinikumban nem valósítható meg. Ezért a továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy a tumorsejtek hány százalékának kell a terápiás géneket tartalmaznia a megfelelő daganatellenes hatáshoz. Agytumorokat indukáltuk Adex-CAUPTK-val fertőzött, ill. nem fertőzött tumorsejtek különböző arányú (1:4 és 1:9) keverékével. Az állatokat mind 5-FU-al, mind ganciklovirral kezeltük és nyomon követtük túlélésüket. Valamennyi kezeletlen állat elpusztult (21. ábra). Abban az esetben, mikor az összes tumorsejt tartalmazta az érzékenyítő géneket, az állatok 60-80%-a élte túl az agydaganatot. Ha a tumorokat érzékenyítő géneket tartalmazó és nem tartalmazó sejtek 1:4 arányú keverékével hoztuk létre, 40-50%-os gyógyulást tapasztaltunk, 1:9-es aránynál pedig a túlélés még mindig elérte a 30-40%-ot.
21. ábra A kettős gyógyszer-érzékenyítő génterápia bystander hatása. Az agytumorokat AdexCAUPTK-val fertőzött ill., nem fertőzött Gl261 sejtek különböző arányú keverékének (1:4, 1:9) intrakraniális oltásával hoztuk létre. Az állatokat mind 5-FU-val, mind ganciklovirral kezeltük. P<0,0036 a csak fertőzött sejtekkel oltott csoportnál, valamint P<0,02342 és <0,02147 az 1:4, ill. 1:9 arányban fertőzött, ill. nem fertőzött sejtekkel oltott csoportnál a kontrollhoz képest.
54
5.2.4
Gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinációja GM-CSF-et termelő daganatsejt vakcinációval A következőkben vizsgáltuk, hogy a gyógyszer-érzékenyítő génterápia
eredményesen kombinálható-e citokineket termelő daganatsejt vakcinációval. Egereken agytumorokat indukáltunk gyógyszer-érzékenyítő géneket tartalmazó Gl261 sejtek oltásával. Az állatokat 5-FU+ganciklovirral, vagy GM-CSF-et termelő daganatsejt vakcinával, illetve mindkettővel kezeltük. A gyógyszer-érzékenyítő génterápia és a vakcináció hasonló hatásúak voltak, önmagukban az egerek 40-50%-át gyógyították meg. A két terápia kombinációja azonban nem javította tovább a túlélést (22. ábra).
22. ábra A gyógyszer-érzékenyítő génterápia és a citokin termelő tumorsejt vakcinák kombinációjának tumorellenes hatása. P<0,1046 és <0,0089 a GM-CSF és az 5-FU+ganciklovir kezelések esetében, valamint <0,0523 a kombinált terápiánál a kontrollhoz képest.
5.2.5
Gyógyszer-érzékenyítő
génterápia
kombinációja
lokális
tumor
besugárzással Következőkben tanulmányoztuk, hogy a gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinálása egy hagyományos tumorellenes kezeléssel, a radioterápiával képes-e tovább javítani a gliomás egerek túlélését. Mivel alacsony oltási sejtszám esetén a besugárzásnak önmagában alkalmazva is jelentős daganat növekedés gátló hatása van,
55
az agytumorokat mintegy ötször magasabb sejtszámmal hoztuk létre, mint a korábbi kísérletekben (105 sejt/állat). Ennél a magas sejtszámnál az 5-FU/ganciklovir kezelés önmagában nem volt hatékony, valamennyi nem besugárzott állat elpusztult a kezeléstől függetlenül (23. ábra). A lokális tumor irradiáció önmagában 20-30%-os túlélést okozott. A besugárzás és
a
gyógyszer-érzékenyítő
génterápia
kombinációja
ugyanakkor
valamennyi
agydaganatos egeret meggyógyította. Tanulmányoztuk a kombinált kezelés hatását abban az esetben is, mikor a tumorsejteknek csak egy része hordozta az érzékenyítő géneket. Az egerekre 1:4, ill. 1:9 arányban oltottuk gyógyszer-érzékenyítő géneket tartalmazó, ill. nem tartalmazó Gl261 sejtek keverékét. A kombinált kezelés akkor is hatékony volt, ha a sejteknek csak egy része tartalmazta az érzékenyítő géneket: amennyiben a daganatsejtek 20%-át fertőztük, az állatok 60-70%-a meggyógyult, 10%-os aránynál pedig a túlélés még mindig 40-50 volt (23. ábra).
23. ábra 6. A kettős gyógyszer-érzékenyítő génterápia és a lokális irradiáció hatása agytumoros egerek túlélésére. Az agytumorokat Adex-CAUPTK-val fertőzött, vagy fertőzött és nem fertőzött sejtek keverékével (1:4, 1:9 arány) hoztuk létre. P<0.0012; <0,0109 és <0,0609 a csak fertőzött
56
sejtekkel oltott csoport, valamint a fertőzött és nem fertőzött sejtek az 1:4 vagy 1:9 arányú keverékével oltott csoport esetében a kontrollhoz képest.
5.2.6
Daganat kezelés gyógyszer-érzékenyítő gének utólagos bejuttatásával és lokális besugárzással Végül a gyógyszer-érzékenyítő génterápia hatását vizsgáltuk már kialakult
tumoroknál. Míg a korábbi kísérleteknél a daganatokat már eleve gyógyszer-érzékenyítő géneket tartalmazó tumorsejtek oltásával hoztuk létre, most nem fertőzött Gl261 sejtek szubkután transzformációjával indukáltuk. A tumor transzplantáció utáni 3. és 10. napon a tumor oltás helyére Adex-CAUPTK-t (1x109 vírus/állat) injektáltunk és az állatokat 5-FU+ganciklovirral és/vagy lokális röntgen besugárzással kezeltük. Az AdexCAUPTK-val injektált és az 5-FU+ganciklovirral kezelt daganatok kis mértékben lassabban növekedtek, mint a csak 5-FU+ganciklovirral kezeltek (24. ábra). A lokális tumor besugárzás önmagában és 5-FU+ganciklovirral kombinálva is lényeges növekedési gátlást okozott, a daganatok sokkal később jelentek meg, mint a nem besugárzottaknál. A leghatékonyabb kezelés azonban a vírusok injektálását követő 5FU/ganciklovir kezelés és a besugárzás kombinációja volt.
24. ábra Gyógyszer-érzékenyítő géneket nem tartalmazó Gl261 sejtek szubkután oltásával létrehozott tumorok kezelése Adex-CAUPTK utólagos tumorba injektálásával.
57
6 MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
A gliomák a legagresszívabb malignus daganatok közé tartoznak, prognózisuk a hagyományos kezelési módszerek ellenére rendkívül rossz. A túlélési arány javításához új terápiás eljárásokra van szükség. Ezek közé sorolható az immunrendszer aktiválása a tumorsejtek genetikai módosításával, valamint a gyógyszer-érzékenyítő génterápia. Kísérleteink első részében a citokin termelő daganatsejt vakcinák terápiás hatását tanulmányoztuk.
Az
4,62,63
retrovírusokkal,
egyes
kutatócsoportok 64
liposzómákkal,
a
citokineket
kódoló
65
66
vakcinavírussal,
plazmiddal
géneket
jutatták be a
tumorsejtekbe. Érdekes módon adenovírusokat viszonylag kevesen alkalmaztak.35,67 Kísérleteink megmutatták, hogy e vektorok egyik legfontosabb előnye a nagy hatékonyságú génbevitel: 10 vírus/sejt aránynál a sejtek 50-70%-a fertőződött meg, 100 vírus/sejt értéknél pedig már valamennyi sejt tartalmazta a vírust. Szintén kedvező tulajdonságuk, hogy magas vírus/sejt aránynál a fertőzött sejtekbe egyszerre több vírus partikulum is bejuthat. Eredményeink szerint a citokin szint lineárisan emelkedett a vírus/sejt arány növelésével a vizsgált tartományban. Ebből következően az adenovírus vektorokkal végzett génbevitel során könnyen változtatható a genetikailag módosított daganatsejtek által termelt citokinek koncentrációja. Számos citokint alkalmaztunk a tumorsejtek ex vivo módszer szerinti génterápiájára (IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, GM-CSF, LIF, LT, TNF-α). Közülük csak az IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF voltak képesek növelni a túlélési időket, illetve meggyógyítani az állatokat. Ezt alátámasztják az irodalmi adatok is, melyek az IL-2-t,37,43,44 IL-4-t,4,35,37,41 IL-12-t,62,68 GM-CSF-t35,36,37,69,70 termelő daganatsejt vakcinák eredményességéről számolnak be. Kísérleteink azt is megvilágították, hogy a terápiás hatás nemcsak a citokinek típusával áll szoros összefüggésben, hanem azok koncentrációjának is döntő szerepe van. Az optimális koncentráció citokinenként különböző volt: 10, 30, 50, 60 ng/106 sejt/24h, GM-CSF, IL-12, IL-4 és IL-2 esetében. Az IL-2-t, IL-4-et és IL-12-t termelő vakcináknál a tumorellenes hatás magasabb koncentrációknál megnőtt. Ezzel ellentétben a GM-CSF-et szekretáló vakcináknál a terápiás hatás csökkent a
58
koncentráció növelésével. Meglepő módon 200 vírus/sejt arányú fertőzésnél (80 ng GM-CSF/106 sejt/24 h) ez a vakcina teljesen hatástalan volt. Ebben az esetben, ha a GM-CSF-et szekretáló daganatsejteket 1:3 arányban kevertük azt nem termelő sejtekkel és ezáltal csökkentettük a citokin koncentrációt, ismét észleltünk kisfokú tumor növekedés gátlást. A citokin koncentráció és terápiás hatás közti szoros összefüggés háttere nem egyértelműen tisztázott az irodalomban. Ismert azonban, hogy az egyes citokinek számos immunfolyamatot képesek befolyásolni és a különböző célsejteknél eltérő koncentrációra van szükség. Valószínűleg csak a megfelelő célsejt aktiválása eredményez hosszan tartó daganatellenes immunválaszt. Elképzelhető, hogy az optimális szint felett egyes citokinek már gátolnak bizonyos folyamatokat. Eredményeink magyarázhatják a különböző kutatócsoportok ellentmondásos adatait az egyes citokinek állatmodelleken észlelt hatékonyságáról, valamint a klinikai kipróbálások csak igen mérsékelt sikereit. Beszámoltak a kombinált, egyidejűleg több citokinnel történő vakcináció fokozott hatásáról is. Wakimoto és mtsai35 GM-CSF-et és IL-4-et termelő vakcinával kezeltek intrakraniálisan oltott B16 melanomákat és lényegesen nagyobb daganatnövekedés gátlást tapasztaltak, mint monoterápiánál. A kombináció eredményességében szerepet játszhat, hogy mindkét citokin részt vesz az antigén-prezentáló sejtek aktivációjában. A GM-CSF feltehetőleg elősegíti e sejtek érését, ami az antigén-specifikus CD4+ és CD8+ limfociták aktivációjához vezet. Az IL-4 pedig tovább serkentheti a GM-CSF által elindított antigén-bemutatási folyamatot. Egér Gl261 modellen azonban nem sikerült igazolnunk a kombináció kedvező hatását, GM-CSF és IL-4 együttes alkalmazásakor hasonló eredményt észleltünk, mint a GM-CSF, ill. IL-4 monoterápiánál. Nem zárható azonban ki, hogy amennyiben a citokin koncentráció a szuboptimális tartományba esik, előnyös hatása lehet a kettős citokin szekréciónak. Mivel az irodalomban nem egységesek az adatok a CD4+ és CD8+ limfociták szerepét
illetően
a
citokin
termelő
vakcinák
által
indukált
tumorellenes
immunválaszban, a következőkben az immunrendszeri aktiváció mechanizmusát vizsgáltuk. Több szerző szerint mind a CD4+, mind a CD8+ limfociták lényegesek a daganatellenes hatáshoz.35,36,37 Mások ugyanakkor elsősorban a CD4+,41,71 vagy a CD8+62,69 limfocitáknak tulajdonítanak központi szerepet. Eredményeink szerint GM-
59
CSF esetében mindkét limfocita populáció fontos a daganat eradikációjához: mind az anti-CD4+, mind az anti-CD8+ ellenanyagokkal végzett előkezelés meggátolta a GMCSF daganatellenes hatását. Ezenkívül a GM-CSF-el vakcinált agytumoros egereknél a daganat kifejezett CD4+ és mérsékelt CD8+ limfocitás infiltrációját észleltük az immunhisztokémiai vizsgálat során. IL-2, IL-4, IL-12 vakcináció után 10 nappal azonban csak CD4+ limfocitás beszűrődés jelentkezett. Elképzelhető, hogy más időpontban ezeknél a citokineknél is megjelennek a CD8+ limfociták. Egyik fontos eredményünk, hogy kísérletes agytumoroknál a citokineket termelő daganatsejtekkel végzett vakcináció rendkívül hatékonyan kombinálható lokális besugárzással. Egyes kutatók szintén a kombináció kedvező hatásáról számoltak be.72,73,74 Kísérleteinknél a citokin termelő vakcinák az agytumoros egerek mintegy 3040%-át gyógyították meg. A lokális besugárzás önmagában csak mérsékelten nyújtotta meg az élettartamot. A két módszer kombinációja ugyanakkor 80-100%-ra növelte a túlélést. A szinergista hatás egyik magyarázata, hogy a besugárzás által megkisebbedett daganatot az immunrendszer könnyebben tudja eliminálni. Másik lehetőség szerint a besugárzást követően a tumorsejtek egy része nekrotizál. A nekrotizált sejtekből felszabaduló immunogén molekulák pedig tovább serkentik az immunrendszer daganatellenes aktivációját. Kísérleteink alapján tehát lényeges felismerés, hogy a szekretált citokin szint döntően befolyásolta a vakcinák tumorellenes hatását. Egyik legfontosabb eredményünk pedig a citokineket termelő daganatsejtekkel végzett vakcináció és a lokális besugárzás hatékony kombinációja. Kutatásaink
második
részében
a
gyógyszer-érzékenyítő
génterápiával
foglalkoztunk. Az eddigiekben leggyakrabban a GC/TK rendszert alkalmazták, mely kísérletes állat agytumor modellen eredményes volt,6,47,48,49 azonban a klinikumban nem bizonyult hatékonynak.75,76,77 Ezt magyarázhatja a daganatok transzdukciójának alacsony hatásfoka, gyógyszer rezisztencia kialakulása, valamint a „bystander hatás” nem kielégítő volta. Az utóbbi két probléma feltehetőleg leküzdhető két különböző gyógyszer-érzékenyítő rendszer együttes alkalmazásával.
60
Jelen munkánkban a GC/TK és az 5-FU/UPRT rendszerek kombinációjának terápiás hatását tanulmányoztuk in vitro körülmények közt, valamint egér tumor modellen. Ezt a kombinációt a korábbiakban még nem alkalmazták. Vizsgálatainkkal sikerült igazolni a GC/TK és az 5-FU/UPRT két rendszerből álló gyógyszer-érzékenyítő génterápia fokozott daganatellenes hatását. In vitro körülmények közt lényegesen nagyobb citotoxicitás jelentkezett a mindkét gyógyszerrel történő kezelés hatására, mint monoterápiánál. Hasonlóan, az in vivo kísérleteknél a kombinált 5-FU, GC kezelés sokkal hatékonyabban növelte az agydaganatos állatok túlélését (6080%), mint az 5-FU (10-20%), vagy a GC (40-50%) önmagában. Adataink összhangban állnak a korábbi beszámolókkal, amelyek szerint a GC/TK és az 5-FC/CD rendszerek kombinációja fokozott tumorellenes hatást mutatott patkány 9L48 és C6 gliomák78 kezelésekor. Aghi és mtsai48 vizsgálatai szerint az összetevők szinergista hatásúak voltak, ami a gyógyszerek és metabolitjaik interakciójával magyarázható. Feltehetőleg az 5-FU növeli a GC TK által történő foszforilációját. Ugyanakkor Moriuchi és mtsai79 a monoterápiát előnyösebbnek találták TK és CD esetében, mint a kombinált rendszer alkalmazását. Közleményük szerint a FdUMP TK általi foszforilációja csökkentheti az 5-FC/CD rendszer aktivációját, ill. a GC CD hatására bekövetkező deaminációja pedig a GC/TK rendszerét. Bár adataink világosan mutatják a kettős gyógyszer-érzékenyítő génterápia kedvező hatását, további vizsgálatok indokoltak a lehetséges interakciók felderítésére. A terápiás gének közvetlen tumorba oltása során technikai akadályai vannak, hogy minden daganatsejtbe bejuttassuk azokat. A vírussal fertőzött sejtek aránya meghatározza a génbevitel hatékonyságát. A nem fertőzött sejtek is károsodhatnak azonban az ún. „bystander hatás” következtében. Ez azt jelenti, hogy az érzékenyítő géneket tartalmazó sejtek környezetében elhelyezkedő, érzékenyítő géneket nem tartalmazó tumorsejtek is elpusztulhatnak a megfelelő gyógyszerrel történő kezelés hatására a toxikus metabolitok „gap junction”-ökön vagy sejthártyán keresztül történő diffúziója következtében.51,52 Ennek vizsgálatára a daganatokat vírus vektorral fertőzött, ill. vad típusú Gl261 sejtek különböző arányú keverékével hoztuk létre. Eredményeink szerint a két rendszerből álló gyógyszer-érzékenyítő génterápiánál nagymértékű „bystander hatás” jelentkezett: az agytumoros állatok 30-40%-a akkor is meggyógyult, ha a daganatsejteknek csak 10%-a tartalmazott érzékenyítő géneket. Feltehetőleg in vivo
61
körülmények közt az immunrendszer is részt vesz a ”bystander hatásban”: az immunrendszer aktiválódik a gyógyszer-érzékenyítő enzimek ellen, ami diffúz immunválaszhoz vezet az egész tumor ellen, függetlenül attól, hogy a sejtek expresszálnak-e terápiás géneket.53 A kettős gyógyszer-érzékenyítő génterápia hatékonysága tovább növelhető, amennyiben az aktivált immunrendszer elpusztítja a vírussal nem fertőzött daganatsejteket. Munkánk első részében kísérleteinkkel igazoltuk, hogy a citokint termelő tumorsejt vakcinák jelentősen növelték az immunrendszer daganatellenes aktivációját. Ezen alapulva a gyógyszer-érzékenyítő génterápiát GM-CSF-et termelő tumorsejt vakcinával kombináltuk. Bár önmagában mindkét eljárás hatékony volt, a kombinációnál nem észleltünk fokozott terápiás hatást. Ez ellentétben áll Chen és mtsai80 eredményével, akik kimutatták, hogy kísérletes kolon karcinoma modellnél a GC/TK rendszer hatását nagymértékben fokozta az IL-2/GM-CSF vakcináció. A különbség egy lehetséges magyarázata, hogy míg Chen és mtsai rendszere csak az eukarióta sejtekre önmagában nem toxikus GC-t tartalmazott, addig mi 5-FU-t is alkalmaztunk, mely gátolhatta az immunrendszer aktivációját. A klinikumban az új módszereket célszerű kombinálni a már létező, bevált tumorellenes terápiákkal. Gyakran alkalmazott kezelés a lokális sugárterápia, mely csökkenti a daganat volumenét, így a kisebb méretű reziduális tumorok hatékonyabban kezelhetők génterápiával. Mivel az 5-FU sugárérzékenyítő hatással is rendelkezik, kézenfekvő a két módszer kombinálása. Talán legjelentősebb eredményünk, hogy a gyógyszer-érzékenyítő génterápia különösen hatékonyan működik lokális besugárzással együtt alkalmazva. In vitro, az érzékenyítő géneket tartalmazó daganatsejtek 5-FU és GC kezelése besugárzással kombinálva három nagyságrenddel fokozta a citotoxicitást. Az agytumoros egereknél a kombinált kezelés szintén nagymértékben növelte a túlélést, valamennyi állat meggyógyult. Eredményeink összhangban állnak az irodalmi adatokkal, miszerint az 5-FC/CD rendszer sugárérzékenyítő hatással rendelkezik fejnyak rákoknál,81 kolorektális daganatoknál82,83 és gliomáknál.84 Kimutattuk, hogy a besugárzással történő kombináció képes fokozni a „bystander hatást” is. Az agytumoros állatok túlélése akkor is megnőtt a kombinált kezelés hatására, ha a daganatsejtek csak 10%-a tartalmazott érzékenyítő géneket. Ezenkívül a genetikailag előzetesen nem módosított, vad típusú tumorsejtekkel indukált, utólag érzékenyítő géneket tartalmazó
62
vektorral közvetlenül oltott daganatok progresszióját is csökkentette a lokális besugárzással történő kombináció. A két rendszerből álló gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinációja ionizáló sugárzással tehát rendkívül hatékonynak bizonyult a kísérletes agytumorok kezelésében. A kritikus pontot a daganatsejtek vírus vektorral történő megfelelő fertőzése jelenti, ami a jövőben feltehetően megoldható replikáció kompetens85 vagy feltételesen replikálódó vírusok21 alkalmazásával. Kutatásaink gyakorlati vonatkozásokat is felvetnek. Mivel számos malignus daganat prognózisa a hagyományos kezelés ellenére rendkívül rossz, nagy jelentősége van új terápiás eljárások kidolgozásának. Munkánk során két génterápiás módszer hatékonyságát tanulmányoztuk in vitro körülménynek közt és egér modellen. Az állatkísérletekből nyert adatok és következtetések nélkülözhetetlenek a génterápia humán alkalmazása előtt. A citokin termelő vakcinák esetében lényeges eredmény, hogy a szekretált citokin szint döntően befolyásolta a vakcinák tumorellenes hatását. Ez magyarázhatja egyúttal az eddigi klinikai kipróbálások mérsékelt eredményeit. Ebből következően a jövőben zajló klinikai kipróbálásoknál célszerű lenne a figyelmet az optimális citokin koncentrációra irányítani. Lehetséges, hogy a szintet a betegek egyedi szükségletei szerint kell majd beállítani. A gyógyszer-érzékenyítő génterápiánál kimutattuk, hogy két különböző rendszer kombinációja lényegesen nagyobb daganatellenes hatással rendelkezik, mint a monoterápia, amit szintén lényeges szem előtt tartani a daganatos betegek kezelésekor. Legfontosabb eredményünk pedig, hogy mindkét génterápiás eljárás kombinálása lokális sugárterápiával nagymértékben fokozza a génterápia hatékonyságát. Munkánk alapján tehát a génterápiás eljárások, mint a citokin termelő daganatsejt vakcináció és a gyógyszer-érzékenyítő génterápia a már bevált hagyományos módszerekkel kombinálva új utat nyithatnak a malignus tumorok kezelésében.
63
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönetet szeretnék mondani mindazoknak, akik lehetővé tették számomra, hogy a dolgozat alapját képező kutatásokat elvégezhessem. Elsősorban témavezetőmnek Dr. Sáfrány Gézának, az Országos Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Intézet Sugárbiológiai Főosztály-, valamint a Molekuláris és Tumorbiológiai Osztály Vezetőjének szeretném köszönetemet kifejezni mindazért a segítségért, hasznos tanácsért és útmutatásért, amelyeket az ott eltöltött évek alatt tőle kaptam. Szintén hálával tartozom programvezetőmnek, Prof. Dr. Falus Andrásnak, aki Ph.D. tanulmányaim során végig nyomon követte tevékenységemet, és rendkívül segítőkész volt. Szeretnék köszönetet mondani Prof. Dr. Szende Bélának és az I. sz. Kórbonctani és Kísérleti Rákkutató Intézet munkatársainak, akik az immunhisztokémiai reakciókat végezték. Köszönettel tartozom Prof. Dr. Köteles Györgynek, az Országos "Frédéric Joliot-Curie" Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Kutató Intézet Igazgató-főorvosának, aki lehetőséget nyújtott az intézetben kísérleteim elvégzésére. Végezetül szeretném megköszönni valamennyi munkatársamnak, akikkel az elmúlt években együtt dolgoztam, hogy türelmükkel és hozzáértésükkel munkámban segítségemre voltak.
64
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
1. Desaknai Sz, Lumniczky K, Hidvégi EJ, Hamada H, Safrany G. Brain tumor treatment with IL-2 and IL-12 producing autologous cancer cell vaccines. Adv Exp Med Biol 2001; 495: 369-372 2. Desaknai Sz, Lumniczky K, Esik O, Hamada H, Safrany G. Local tumour irradiation enhances the anti-tumour effect of a double.suicide gene therapy system in a murine glioma model. J Gene Med 2002; 4: (megjelenés alatt) 3. Lumniczky K, Desaknai Sz, Mangel L, Szende B, Hamada H, Hidvégi EJ, Safrany G. Local tumor irradiation augments the anti-tumor effect of cytokine producing autologous cancer cell vaccines in a murine glioma model. Canc Gene Ther 2002; 9: 44-52.
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN NEMZETKÖZI FOLYÓIRATOKBAN MEGJELENT KONGRESSZUSI ABSZTRAKTOK JEGYZÉKE
1. Lumniczky, K., Désaknai, S., Hídvégi, E.J. Szende, B. Hamada, H. and Sáfrány, G. Combined Treatment of brain tumors with cytokine expressing autologous cancer cell vaccines and radiotherapy. Immunology Letters 2000; 73: 278. 2. Désaknai, S., and Sáfrány, G. Treatment of brain tumors with drug senzitizing genes. Immunology Letters, 2000; 73: 555.
65
3. Sáfrány, G. Lumniczky, K. Désaknai, S., Hídvégi, E.J. Hamada, H. Combined Treatment of brain tumors with cancer cell vaccines, radiotherapy and gene directed enzyme prodrug therapy. 2000; J. Gene Med 2: 107. 4. Safrany, G., Desaknai Sz., Lumniczky K. and Hamada, H. Combined treatment of brain tumours with gene-directed enzyme prodrug therapy and ionising radiation. Int. J. Mol. Med. 2002; 10: 429. 5. Lumniczky K., Désaknai Sz., Hamada, H. and Sáfrány G. Combined treatment of murine glioma with autologous cancer cell vacines and radiotherapy. Int. J. Mol. Med. 2002; 10: 429.
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN TARTOTT ELŐADÁSOK ÉS BEMUTATOTT POSZTEREK JEGYZÉKE 1. Lumniczky, K., Désaknai, S., and Sáfrány, G. Citokineket és B7 kostimulátor molekulákat termelő gliomasejtek immunaktiváló hatása. 5. Meeting of the Molecular Biological Division of the Hungarian Biochemical Society, May 811., 2000., Sopron, Hungary 2. Désaknai, S., and Sáfrány, G. Gliomák kezelése gyógyszerérzékenyítő gének bevitelével. 5. Meeting of the Molecular Biological Division of the Hungarian Biochemical Society, May 8-11., 2000., Sopron, Hungary 3. Lumniczky, K., Désaknai, S., Hídvégi, E.J. Szende, B. Hamada, H. and Sáfrány, G. (2000) Combined Treatment of brain tumors with cytokine expressing autologous cancer cell vaccines and radiotherapy. Immunology Letters (abstract)
66
73. 278., 14th European Immunology Meeting, Poznan, Poland, 23-27. September 4. Désaknai, S., and Sáfrány, G. (2000) Treatment of brain tumors with drug senzitizing genes. Immunology Letters (abstract) 73. 555., 14th European Immunology Meeting, Poznan, Poland, 23-27. September 5. Sáfrány, G. Lumniczky, K. Désaknai, S., Hídvégi, E.J. Hamada, H. (2000) Combined Treatment of brain tumors with cancer cell vaccines, radiotherapy and gene directed enzyme prodrug therapy. J. Gene Ther. (abstract) 2. 107., 8th Meeting of the European Society of Gene Therapy, Stockholm, Sweden, October 7-10, 2000. 6. Désaknai Sz., Sáfrány G.: Agydaganatok kezelése gyógyszerérzékenyítő gének bevitelével. 6. Meeting of the Molecular Biological Division of the Hungarian Biochemical Society, May 14-17., 2001., Sárospatak, Hungary, 7. Lumniczky K., Désaknai Sz., Szende B., Hamada H., Hídvégi E., és Sáfrány G. Citokin termelõ, autológ daganatsejtekkel végzett vakcináció és sugárterápia kombinált hatása agydaganatok kezelésére. Immunfarmakológiai Konferencia, 2001. június 19-20. Debrecen 8. Katalin Lumniczky, Szilvia Desaknai, Bela Szende, Hirofumi Hamada, Egon J. Hidvegi, and Geza Safrany. Local tumor irradiation augments the anti-tumor effect of cytokine producing autologous cancer cell vaccines in a murine glioma model. The 31st Meeting of the European Society for Radiation Research, September 01-05., 2001, Dresden, Germany 9. Desaknai S., Hamada H. and Safrany G. Combined treatment of brain tumors with gene directed enzyme prodrug therapy and ionizing radiation. Int. Symp. on New Treatments for brain Tumors: Gene Therapy and Neural Stem Cells. October 17-20, 2001, Parma, Italy
67
10. Safrany G, Lumniczky K, Desaknai S, Szende B, Hidvegi E, and Hamada H,. The combined therapeutic effect of cytokine producing autologous cancer cell vaccines and local tumor irradiation in a murine glioma model. Int. Symp. on New Treatments for brain Tumors: Gene Therapy and Neural Stem Cells. October 17-20, 2001, Parma, Italy 11. Katalin Lumniczky, Szilvia Desaknai, Bela Szende, Hirofumi Hamada, Egon J. Hidvegi, and Geza Safrany. Local tumor irradiation augments the anti-tumor effect of cytokine producing autologous cancer cell vaccines in a murine glioma model. Eur. J. Cancer 37. S226. 2001. European Cancer Conference 11., October 21-25., 2001., Lisbon, Portugal 12. Désaknai Sz., Sáfrány G. Agydaganatok kezelése gyógyszerérzékenyítõ génekkel Magyar Onkológusok Társasága XXIII. Kongresszusa, Budapest, 2001. November 22-24. 13. Lumniczky K., Désaknai Sz., Sáfrány G., Egér glioma immunogenitásának mesterséges fokozása Magyar Onkológusok Társasága XXIII. Kongresszusa, Budapest, 2001. November 22-24. 14. Safrany, G., Desaknai Sz. and Hamada, H. Combined treatment of brain tumours with gene-directed enzyme prodrug therapy and ionising radiation. 3rd International Symposium on genetic anticancer agents. Feb. 28- March 02., 2002., Amsterdam, The Netherlands. 15. Lumniczky K., Désaknai Sz., Hídvégi, EJ., Hamada, H. and Sáfrány G. The combined therapeutic effect of cytokine producing autologous cancer cell vacines and local tumor irradiation in a murine glioma model. 3rd International Symposium on genetic anticancer agents. Feb. 28- March 02., 2002., Amsterdam, The Netherlands.
68
16. Désaknai Szilvia, Lumniczky Katalin, Hamada Hirofumi, Sáfrány Géza. Daganatok kemoterápiás érzékenyítése 5-FU- és Ganciclovir “pro-drug” génterápiával. MTA Nukletidkémiai Munkabizottság és Magyar Kemoterápiás Társaság Kongresszusa, 2002. június 6. Szeged 17. Desaknai S., Hamada H. and Safrany G. Local irradiation enhances the antitumor effect of gene-directed enzyme prodrug therapy. 32nd Annual Meeting of the ESRB. September 04-07. 2002. Liege, Belgium 18. Safrany, G., Desaknai Sz., Lumniczky K. and Hamada, H. Combined treatment of brain tumours with gene-directed enzyme prodrug therapy and ionising radiation. The 7th World Congress on Advances in Oncology, 10-12 October, Hersonissos, Greece 19. Lumniczky K., Désaknai Sz., Hamada, H. and Sáfrány G. Combined treatment of murine glioma with autologous cancer cell vacines and radiotherapy. The 7th World Congress on Advances in Oncology, 10-12 October, Hersonissos, Greece
69
IRODALOMJEGYZÉK
1
Miller A. Human gene therapy comes of age. Nature 1992; 357: 455-460
2
Crystal RG, McElvaney NG, Rosenfeld MA. Administration of an adenovirus
containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis. Nature Genet 1994; 8: 42-51 3
Lu DR, Zhou JM, Zheng B, et al. Stage I clinical trial of gene therapy for hemophilia
B. Sci China B 1993; 36: 1342-1351 4
Okada H, Giezeman-Smits KM, Tahara H, et al. Effective cytokine gene therapy
against an intracranial glioma using a retrovirally transduced IL-4 plus HSVtk tumor vaccine. Gene Ther 1999; 6: 219-226. 5
Sasaki M., Plate K. H. Gene therapy of malignant glioma: Recent advances in
experimental and clinical studies. Annals of Oncology 1998; 9: 1155-1166 6
Takamiya Y, Short MP, Ezzedine ZD, et al. Gene therapy of malignant brain tumors: a
rat glioma line bearing the herpes simplex virus type-1 thymidine kinase gene and wild type retrovirus kills other tumor cells. J Neurosci Res 1992; 33: 493-503 7
Lattime EC, Gerson SL, eds. Gene Therapy of Cancer Academic Press, San Diego,
1998 8
Kopper L, Marcsek M, Kovalszky I, szerk. Molekuláris Medicina Medicina
Könyvkiadó, Budapest, 1997 9
Friedmann T. Overcoming the obstacles for gene therapy. Scientific American 1997; 6:
80-86 10
Meager A, ed. Gene Therapy Technologies, Application and Regulations. John
Wiley&Sons LTD, Chichester 1999 11
Wadell G. Molecular epidemiology of human adenoviruses. Curr Top Microbiol
Immunol 1984; 110: 191-220 12
Van der Eb, AJ, Mulder C, Graham FL, Houweling A. Transformation with specific
fragments of adenovirus DNAs. Isolation of specific fragments with transforming activity of adenovirus 2 and 5 DNA. Gene 1977; 2: 115-132 13
Moore M, Horikoshi N, Shenk T. Oncogenic potential of the adenovirus E4orf6
protein. Procl Natl Acad Sci USA 1996; 93: 11295-1131
70
14
Bett AJ, Haddara W, Prevec L, Graham FL. An efficient and flexible system for
construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3. Procl Natl Acad Sci USA 1994; 91: 8802-8806 15
Berkner KL. Development of adenovirus vectors for the expression of heterologous
genes. Biotechniques 1988; 6: 616-629 16
Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn N. Characteristics of a human cell line
transformed by DNS from human adenovirus type 5. J Gen Virol 1977; 36: 59-74 17
ArmamentoD, Sookdeo CC, Hehir KM, et al. Caracterization of an adenovirus vector
containing an E4 deletion. Hum Gene Ther 1995; 6: 1343-1353 18
Clemens PR, Kochanek S, Sunada Y, et al. In vivo muscle gene transfer of full-length
dystrophin with an adenoviral vector that lacks all viral genes. Gene Ther 1996; 3: 965972 19
Markowitz D, Goff S, Bank A. A safe packaging line for gene transfer: separating
viral genes on two different plasmids. J Virol 1988; 62: 1120-1124 20
Fink D, DeLuca N, Goins W, Glorioso J. Gene transfer to neurons using herpes
simplex virus-based vectors. Annu Rev Neurosci 1996; 19: 265-287 21
Ichikawa T, Chiocca EA. Comparative analyses of transgene delivery and expression
in tumors inoculated with a replication-conditional or –defective viral vector. Cancer Res 2001; 61: 5336-5339 22
Nishitani MA, Sakai T, Kanayama HO, Himeno K, Kagawa S. Cytokine gene therapy
for cancer with naked DNA. Mol Urol 2000; 4: 47-50 23
Feigner PL, Tsai YI, Sukhu L, et al. Improved cationic formulations for in vivo gene
therapy. Ann N Y Acad Sci 1995; 772: 126-139 24
Aboody KS, Brown A, Rainov NG, Bower KA, Liu S, et al. From the cover: neural
stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97:12846-51 25
Falus A. Az Immunológia élettani és molekuláris alapjai. Budapest, Semmelweis
Kiadó, 2001 26
Gergely J., Erdei A, szerk. Immunbiológia Medicina Könyvkiadó, Budapest, 2000
27
Inoue M, Plautz GE, Shu S. Treatment of intracranial tumors by systemic transfer of
superantigen-activated tumor-draining lymph node T cells. Cancer Res 1996; 56: 47024708
71
28
Emtage P.C., Wan Y., Bramson J.L., Graham F.L., Gauldie J. J. Immunol 1998; 160:
2531-2538 29
Fujiwara T, Kataoka M, Tanaka N. Adenovirus-mediated p53 gene therapy for human
cancer. Mol Urol 2000 ;4: 51-54 30
Carter G, Lemoine NR. Antisens technology for cancer therapy; does it make sense?
Br J Cancer 1993; 67: 869-876 31
Kopper L, Kovalszky I. Antiszenzek a daganatok kezelésében. Orvosképzés 1994; 69:
441-452 32
Coll JL, Wagner E, Combaret V, et al. In vitro targeting and specific transfection of
human neuroblastoma cells by chCE7 antibody-mediated gene transfer. Gene Ther 1997; 4: 156-161 33
Forni G, Foa R, Santoni A, Frati L, eds. Cytokine-induced tumor immunogenecity
Academic Press, San Diego, CA, USA, 1994 34
Lotze MT, Matory YL, Rayner AA, et al. Clinical effects and toxicity of interleukin-2
in patients with cancer. Cancer 1986; 58: 2764-2772 35
Wakimoto H, Abe J, Tsunoda R, et al. Intensified antitumor immunity by a cancer
vaccine that produces granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4. Cancer Res 1996; 56: 1823-1833 36
Herrlinger U, Kramm C, Jonston, et al. Vaccination for experimental gliomas using
GM-CSF-transduced glioma cells. Cancer gene therapy 1997; 6:345-352 37
Tseng S, Hwang L, Lin S. Induction of antitumor immunity by intracerebrally
implanted rat C6 glioma cells genetically engineered to secrete cytokines. Journal of immunotherapy 1997; 20: 334-342 38
Dranoff G, Jaffee E, Lazenby A, et al. Vaccination with irradiated tumor cells
engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 3539-3543 39
Allione A, Consalvo M, Nanni P, et al. Immunizing and curative potential of
replicating and nonreplicating murine mammary adenocarcinoma cells engineered with interleukin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, tumor necrosis factor alpha, granuloctemacrophage colony-stimulaing factor, and gamma-interferon gene or admixed with conventional adjuvants. Cancer Res 1994; 54: 6022-6026
72
40
Nakamura Y, Wakimoto H, Abe J, et al. Adoptive immunotherapy with murine
tumor-specific T lymphocytes engineered to secrete interleukin-2. Cancer Res 1994; 54: 5757-5760 41
Giezeman-Smits KM, Okada H, Brissette-Storkus CS, Villa LA, Attanucci J, et al.
Cytokine gene therapy of gliomas: induction of reactive CD4+ T cells by interleukin-4transfected 9L gliosarcoma is essential for protective immunity. Cancer Res 2000; 60: 2449-2457 42
Johnston P, Nam M, Hossain MA. Delivery of human fibroblast growth factor-1 gene
to brain by modified rat brain endothelial cells. J Neurochem 1996; 67: 1643-7652 43
Glick RP, Lichtor T, de Zoeten E, et al. Prolongation of survival of mice with glioma
treated with semiallogeneic fibroblasts secreting interleukin-2. J Neurosurg 1999; 45: 867-874. 44
Fakhrai H, Daniel L, Shawler L, et al. Cytokine gene therapy with interleukin-2-
transduced fibroblasts: Effects of IL-2 dose on anti-tumor immunity. Human gene therapy 1995; 6: 591-601 45
Zitvogel L, Couderc B, Mayordomo B, et al. IL-12 engineered dendritic cells serve as
effective tumor vaccine adjuvants in vivo. Ann N Y Acad Sci 1996; 795: 284-293 46
Inaba M, Sawaa H, Hamada H. Circumvention of 5-fluorouracil resistance in human
stomach cancer cells by uracil phosphoribosyltransferase gene transduction. Cancer Res 1999; 90: 349-354 47
Aghi M, Hochberg F, Breakfield X. Prodrug activation enzymes in cancer gene
therapy. J Gene Med 2000; 2:148-164 48
Aghi K, Kramm CM, Chao T, et al. Synergistic anticancer effects of
ganciclovir/thymidine kinase and 5-flourocytosine/cytosine deaminase gene therapies. J Natl Cancer Inst 1988; 90: 370-380 49
Maron A, Gustin T, Le Roux A, et al. Gene therapy of rat C6 glioma using
adenovirus mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Long term follow-up by magnetic resonance imaging. Gene Ther 1996; 3: 315-322 50
Kanai F, Kawamaki T, Hamada H, et al. Adenovirus mediated transduction of
escherichia coli uracil phosphoribosyltransferase gene sensitises cancer cells to low concentrations of 5-fluorouracil. Cancer Res 1998; 58:1946-1951
73
51
Huber BE, Austin EA, Richards CA, et al. Metabolism of 5-fluorocytosine to 5-
fluorouracil in human colorectal tumor cells transduced with the cytosine deaminase gene; significant antitumor effects when only a small percentage of tumor cells express cytosine deaminase. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91: 8302-8306 52
Denning C, Pitts JD. Bystander effects of different enzyme-prodrug systems for
cancer gene therapy depend on different pathways for intercellular transfer of toxic metabolites, a factor that will govern clinical choice of appropriate regimes. Hum Gene Ther 1997; 8: 1825-1835 53
Freeman SM, Abboud CN, Whatenby KA, et al. The „bystander effect”: tumor
regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified. Cancer Res 1993; 53: 5274-5283 54
Hughes LL, Luengas J, Rich TA, et al. Radio sensitisation of cultured human colon
adenocarcinoma cells by 5-fluorouracil: Effects on cell survival, DNA repair, and cell recovery. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1992; 23: 983-991 55
Buchholz DJ, Lepek KJ, Rich TA, et al. 5-flurouracil-radiation interactions in human
colon adenocarcinoma cells. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1995; 32: 1053-1058 56
Lawrence TS, Davis MA, Maybaum J. Dependence of 5-fluorouracil-mediated radio
sensitisation on DNA directed effects. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1994; 29: 519-523 57
Shapiro WR, Ausman JI, Rall DP. Studies on the chemotherapy of experimental brain
tumors:
evaluation
of
1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea,
cyclophosphamide,
mithramycin and methotrexate. Cancer Res 1970; 30: 2401-2413 58
Miyake S, Makimura M, Kanegae Y, et al. Efficient generation of recombinant
adenoviruses using adenovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing full-length virus genome. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93: 1320-1324 59
Nakayama E, Shiku H, Takahasi T, et al. Definition of a unique cell surface antigen
of mouse leukemia RL1 by cell mediated cytotoxicity. Procl Natl Acad Sci USA 1979; 76: 3486-3490 60
Saito S, Bannerji R, Ganbacher B, et al. Immunotherapy of bladder cancer with
cytokine gene-modified tumor vaccines. Cancer Res 1994; 54: 3516-3520 61
Coligen JE, Kruisbeek AM, Marguiles DH, et al, eds. Current protocols in
immunology. John Wiley&Sons, Inc. USA, 1996; 2.6.1.-2.8.1.
74
62
Saleh M, Wiegmans A, Malone Q, et al. Effect of in situ retroviral interleukin-4
transfer on established intracranial tumors. J Natl Cancer Inst 1999; 91: 438-445 63
Tahara H, Zitvogel L, Storkus W, et al. Effective eradication of established murine
tumors with interleukin-12 gene therapy using a polycystronic retroviral vector. J immunol 1995; 154: 6466-6474 64
Kageshita T, Mizuno M, Ono T, Matsumoto K, Saida T, Yoshida J. Growth inhibition
of human malignant melanoma transfected with the human interferon-beta gene by means of cationic liposomes. Melanoma Res 2001; 11: 337-342 65
ChenB, Timiryasova TM, Haghighat P, et al. Low-dose vaccina virus-mediated
antitumor gene therapy f gliomas. J Immumother 2001; 24: 46-57 66
Tamura T, Nishi T, Goto T, Takeshima H, Dev SB, et al. Intratumoral delivery of
interleukin 12 expression plasmids with in vivo electroporation is effective for colon and renal cancer. Hum Gene Ther 2001; 12: 1265-1276 67
Donson AM, Foreman NK, Adenovirus mediated gene therapy in a glioblastoma
vaccine model; specific antitumor immunity and abrogation of immunosuppression. J Neurooncol 1998; 40: 205-214. 68
DiMeco F, Rhines LD, Hanes J, et al. Paracrine delivery of IL-12 against intracranial
9L gliosarcoma in rats. J Neurosurg 2000; 92: 419-427 69
Sampson JH, Archer GE, Ashley DM, et al. Subcutaneous vaccination with
irradiated, cytokine-producing tumor cells stimulates CD8+ cell mediated immunity against tumors located in the immunologically privileged central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 10399-10404 70
Herrlinger U, Jacobs A, Quinones A, et al. Helper virus-free herpes simplex virus
type 1 amplicon vectors for granulocyte-macrophage colony-stimulating factorenhanced vaccination therapy for experimental glioma. Hum Gene Ther 2000; 11: 14291438. 71
Hock H, Dorsch M, Diamantstein M, Blankenstein T. Interleukin-7 induces CD4+ T-
cell dependent tumor rejection. J Exp Med 1991; 174: 1291-1298 72
Li J, Andres ML, Fodor I, et al. Evaluation of pGL1-TNF-alpha therapy in
combination with irradiation. Oncol Res 1998; 10: 379-387
75
73
Gridley DS, Li J, Kajioka EH, Andres ML, Moyers MF, Slater JM Combination of
pGL1-TNF-alpha gene and radiation (proton and gamma-ray) therapy against brain tumor. Anticancer Res 2000; 20:4195-203 74
Lam S, Hillman G, Younes E, et al. Effect of local tumor irradiation and interleukin-2
therapy in different murine tumors. J Immunother 1995; 18: 28-34 75
Trask TW, Trask RP, Aguilar-Cordova E, et al. Phase I study of adenoviral delivery
of the HSV-tk gene and ganciclovir administration in patients with current malignant brain tumors. Mol Ther 2000; 2: 195-203. 76
Shand N, Weber F, Mariani L, et al. A phase 1-2 clinical trial of gene therapy for
recurrent glioblastoma multiforme by tumor transduction with the herpes simplex thymidine kinase gene followed by ganciclovir. GLI328 European-Canadian Study Group. Hum Gene Ther 1999; 10: 2325-2335. 77
Klatzmann D, Valery CA, Bensimon G, et al. A phase I/II study of herpes simplex
virus type 1 thymidine kinase "suicide" gene therapy for recurrent glioblastoma. Study Group on Gene Therapy for Glioblastoma. Hum Gene Ther 1998; 9: 2595-2604 78
Chang JW, Lee H, Kim E, et al. Combined antitumor effects of an adenoviral
cytosine deaminase/thymidine kinase fusion gene in rat C6 glioma. Neurosurgery 2000; 47: 931-938 79
Moriuchi S, Wolfe D, Tamura M, et al. Double suicide gene therapy using a
replication defective herpes simplex virus vector reveals reciprocal interference in a malignant glioma model. Gene Ther 2002; 9: 584-591 80
Chen S, Kosai K, Xu B, et al. Combination suicide and cytokine gene therapy for
hepatic metastases of colon carcinoma: Sustained antitumor immunity prolongs animal survival. Cancer Res 1996; 56: 3758-3762 81
Hamstra DA, Rice DJ, Pu A, et al. Combined radiation and enzyme/prodrug treatment
for head and neck cancer in an orthotopic animal model. Radiat Res 1999; 152: 499-507 82
Kievit E, Nyati MK, Ng E. Yeast cytosine deaminase improves radio sensitisation
and bystander effect by 5-fluorocytosine of human colorectal xenografts. Cancer Res 2000; 60: 6649-6655 83
Gabel M, Kim JH, Kolozsvary A, et al. Selective in vivo radiosensitization by 5-
fluorocytosine of human colorectal carcinoma cells transduced with the E. coli cytosine deaminase (CD) gene. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1998; 41: 883-887.
76
84
Kim JH, Kolozsvary A, Rogulski K, et al. Selective radiosensitization of 9L glioma in
the brain transduced with double suicide fusion gene. Cancer J Sci Am 1998; 4: 364369. 85
Nanda D, Vogels R, Havenga M, et al. Treatment of malignant gliomas with a
replicating adenoviral vector expressing herpes simplex virus-thymidine kinase. Cancer Res 2001; 61: 8743-8750
77
