cahiers bio-wetenschappen en maatschappij
GIST C.P. VAN DER BEEK EN P. OSSEWEIJER T. BOEKHOUT J.T. PRONK W.A. SCHEFFERS A.J.J. VAN OOYEN R.J. PLANTA J.M. THEVELEIN
Cahiers Bio-Wetenschappen en Maatschappij 20e jaargang, nr. 3, januari 2000
Dit Cahier kwam mede tot stand door een financiële bijdrage van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO).
Abonnementen en bestellingen: Stichting Bio-Wetenschappen en Maatschappij Postbus 2046, 3440 DA Woerden Tel. 0348 - 689 318 De cahiers verschijnen viermaal per jaar. Van de reeds verschenen cahiers zijn de meeste uitgaven nog verkrijgbaar. Zie hiervoor de inlegkaarten in dit cahier of vraag de catalogus aan op bovenstaand adres.
De redactie van dit nummer berust bij: prof.dr. J. Joosse (voorzitter), mw.drs. E.J. Birfelder (eindredactie), mw.drs. G.T. Hartman (research/publiciteit), dr. W.H. Mager, prof.dr. A.H. Stouthamer. Het bestuur van de stichting bestaat uit: prof.dr. D.W. van Bekkum (voorzitter), prof.dr. H.M. Dupuis, prof.dr. H. Galjaard prof.dr. J.P.M. Geraedts, prof.dr. J. Joosse, prof.dr. J.A. Knottnerus prof.dr. W.J. Rietveld, prof.dr. D. de Wied, prof.dr. P.R. Wiepkema (penningmeester). Erevoorzitter is Z.K.H. Prins Claus. Directrice is mw.drs. E.J. Birfelder.
Illustraties: J.T. Pronk (pag. 5, 7, 19, 20, 21, 22) M. Veenhuis, Eukaryote Microbiologie, RU Groningen (pag. 8, 14, 18, 25, 32, 53, 54, 55, 56) T. Boekhout (pag. 10, 12, 13, 15, 16, 17) Fotodienst Rijksmuseum van Oudheden, Leiden (pag. 26) W.A. Scheffers (pag. 27) W.H. Mager, Laboratorium biochemie en moleculaire biologie, Vrije Universiteit Amsterdam (pag. 34) R.J. Planta (pag. 40, 44) J. Thevelein (pag. 46, 48, 49, 50, 51).
Foto's omslag: • Bakkersgistkolonie onder de scanningelektronenmicroscoop (M. Veenhuis). • Verzameling gisten en schimmels op een agarvoedingsbodem (T. Boekhout).
Lay-out en druk: Drukkerij Groen BV, Leiden ISBN 90-73196-26-4
© Stichting Bio-Wetenschappen en Maatschappij
GIST INHOUD 1
2
DE VEELZIJDIGHEID VAN GIST C.P. van der Beek en P. Osseweijer
3
Extra kaders: De ontdekking van gisten als levende organismen Gist-onderzoek in Nederland
4 6
DE SOORTENRIJKDOM VAN GISTEN T. Boekhout
11
Extra kaders: Taxonomie: van brief tot cd-rom Regeling van de levenscyclus
14 16
STOFWISSELING VAN GISTEN J.T. Pronk
19
Extra kaders: De Neuberg-fermentatie Ethanol en kooldioxide: You can't have one without the other Groeien op methanol
22 24 25
4
GIST ALS PRODUCENT VAN ALCOHOL EN KOOLDIOXIDE W.A. Scheffers
27
5
GISTEN ALS PRODUCENTEN VAN EIWITTEN A.J.J. van Ooyen
33
Extra kader: Concurrerende expressiesystemen
38
HET GENOOM VAN GIST ONTRAFELD R.J. Planta
41
Extra kader: Compact genoom
42
GIST ALS ONDERZOEKSMODEL J.M. Thevelein
47
Extra kaders: Gist en andere modelsystemen De MAP kinase signaalweg Homologe genen bij andere organismen Hansenula Polymorpha
48 50 52 55
3
6
7
1
2
Op de achtergrond de tapinstallatie (stender) waarmee uit de gracht water wordt gehaald dat via een goot de brouwerij instroomt. Bron: Johannes en Caspaares Luiken, Het menselijk bedrijf. Vertoond in 100 verbeeldingen: Ambachten, Konsten, Hanteeringen en Bedrijven; met versen. Amsterdam, 1694.
1
De veelzijdigheid van gist
C.P. VAN DER BEEK EN P. OSSEWEIJER
C.P. van der Beek heeft planteziektenkunde gestudeerd en is op een moleculair biologisch onderwerp gepromoveerd aan de Wageningen Universiteit. Van 1980 tot medio 1996 heeft hij bij Gist-brocades (tegenwoordig DSM) in Delft gewerkt. In 1997 heeft hij een op milieuanalyse en -management gerichte MBA opleiding gevolgd bij het Centrum voor Schone Technologie en Milieubeleid aan de Technische Universiteit Twente waarna hij onder de naam ECONCERN voor zichzelf is begonnen als free-lance adviseur en projectleider op de terreinen milieu en biotechnologie. Zijn nevenactiviteiten omvatten het lidmaatschap van diverse nationale en internationale commissies en werkgroepen die zich bezig houden met de maatschappelijke aspecten van de biotechnologie. P. Osseweijer heeft biologie gestudeerd aan de Universiteit Utrecht. Van 1984 tot 1991 was zij werkzaam bij de Katholieke Universiteit Nijmegen, waar zij onder meer betrokken was bij het opzetten van een biotechnologische en een medisch biologische studierichting binnen de Subfaculteit Biologie. Sinds 1991 werkt zij bij de Technische Universiteit Delft. In september 1999 is zij benoemd tot secretaris van de afdeling Biotechnologie en de onderzoekschool BSDL en heeft ze de leiding van het Project Bureau Biotechnologie. Zij verzorgt regelmatig onderwijs op het gebied van ethiek en publieke perceptie van biotechnologie. Nevenactiviteiten: o.a. het secretariaat voor de EFB (European Federation of Biotechnology) Section on Biochemical Engineering Science en bestuurslid van de Nederlandse Vereniging voor Biotechnologie en de Stichting Biotechnologie Nederland.
Gisten zijn eencellige micro-organismen met een grootte van gemiddeld 0,005 tot 0,02 millimeter die niet met het blote oog zichtbaar zijn. Ondanks hun geringe afmetingen spelen gisten al duizenden jaren een belangrijke rol in het leven van de mens. De oudst bekende vorm van “gistgebruik” is de omzetting van granen in bier. De ontdekking van de biergisting is waarschijnlijk op verscheidene plaatsen gedaan, nadat de eerste boeren granen begonnen te verbouwen. Reeds in het Egypte van de farao’s was bier een bestanddeel van het dagelijks voedsel. Archeologisch onderzoek heeft gedetailleerde beschrijvingen opgeleverd van de manier waarop het graan werd voorbewerkt en vergist. Hier is creatief op ingespeeld door een Britse brouwerij, die enige jaren geleden op grond van die beschrijvingen ‘ToetAnkh-Amon bier’ op de markt heeft gebracht. Ook in middeleeuws Europa waren gisten in tel. Uit historisch onderzoek is bekend dat de bierconsumptie in Europa in de jaren 1300-1650 een absolute piek bereikte. De gemiddelde bierconsumptie per hoofd van de bevolking bedroeg in deze periode liefst zo’n 400 liter per jaar (de huidige consumptie in Nederland ligt 4 tot 5 maal lager). Vooral in de steden werd bier gezien als geschikte vervanger van vervuild drinkwater, dat veel ziekten veroorzaakte. Het economisch belang van de bierproductie in de late middeleeuwen was dan ook groot. Bier werd geproduceerd door talloze, in sommige steden meer dan honderd, kleine brouwerijen. Grachtwater was een essentiële grondstof voor de bierbrouwerijen (zie hiernaast). Behalve voor productie van bier en wijn wordt gist ook al vele eeuwen ingezet voor het laten rijzen van brooddeeg. Aanvankelijk werd hiervoor de gist gebruikt die overbleef na de biergisting. De toegenomen vraag naar bakkersgist en veranderingen in het bierbrouwproces zorgden er echter voor dat aan het einde van de negentiende eeuw 3
DE ONTDEKKING VAN GISTEN ALS LEVENDE ORGANISMEN Gedurende duizenden jaren hebben mensen zonder het te weten gisten gebruikt. De ontdekking van gisten wordt wel toegeschreven aan Antonie van Leeuwenhoek, de Delftse uitvinder van de microscoop, waarmee hij aan het einde van de 17e eeuw allerlei preparaten bekeek. Zijn microscopen maakten echter geen gedetailleerde bestudering van gisten mogelijk. De waarneming van regelmatig gevormde, onbewegelijke bolletjes in gistend bier en wijn leidde dus aanvankelijk niet tot de overtuiging dat hierin levende organismen aan het werk waren. Pas in de eerste helft van de 19e eeuw opperde de Franse onderzoeker Cagniard-Latour, die door de verbeterde microscoop veel meer kon zien, dat bier- en wijngisten kleine organismen (micro-organismen) zijn die zich vermenigvuldigen door dochtercellen af te scheiden via knopvorming. Zijn Duitse collega Schwann legde het verband tussen de vorming van alcohol en kooldioxide in alcoholische dranken en de aanwezigheid van gistcellen. Tevens liet hij zien dat men de spontane gisting die optreedt in druivensap, kan voorkomen door dit sap te verhitten of door er gifstoffen aan toe te voegen. Schwann noemde de gist Zuckerpilz (suikerschimmel, in het Latijn Saccharomyces). Later heeft men deze belangrijke gistsoort, die een rol speelt bij de bereiding van brood, wijn en bier, Saccharomyces cerevisiae genoemd (cerevisia betekent bier in het Latijn). De pioniers van het gistonderzoek hadden helaas hun tijd niet mee. In de eerste helft van de negentiende eeuw was namelijk de organische chemie sterk in opkomst, waardoor het niet in de mode was om organismen in staat te achten tot het uitvoeren van chemische reacties. Veel onderzoekers gaven er dan ook de voorkeur aan om gistcellen te beschouwen als niet-levende materie die de alcoholproductie stimuleert. De vooraanstaande Duitse chemicus Justus von Liebig maakte de waarnemingen van gistcellen onder de microscoop zelfs belachelijk in een schertspublicatie. In een wetenschappelijk tijdschrift beschreef hij microscopische “waarnemingen” van, onder andere de anus en de geslachtsdelen van gistcellen. Er was één van de grootste wetenschappers van de 19e eeuw voor nodig om het pleit definitief te beslechten in het voordeel van degenen die gisten zagen als levende microorganismen: Louis Pasteur (1822-1895). Deze Franse wetenschapper is waarschijnlijk het meest bekend vanwege zijn beslissende bijdragen aan de medische microbiologie en het naar hem genoemde pasteuri4
satie-proces van levensmiddelen. Minder bekend is Pasteur’s onderzoek aan gisten. Toch heeft hij het tientallen jaren durende debat beslecht over de vraag of de alcoholische gisting in wijn en bier een chemisch proces was zonder of met de inbreng van levende organismen. Door nauwkeurige metingen liet Pasteur zien dat er tijdens het wijngistingsproces een toename optrad van het gewicht van de gisten en dat deze groei gekoppeld was aan een toename van de hoeveelheid door gist geproduceerde kooldioxide en stikstof. De voorstanders van de gedachte dat wijngisting een chemisch proces was, namen aan dat de vorming van alcohol en kooldioxide het resultaat was van de inwerking van zuurstof uit de lucht. Pasteur toonde echter aan dat gisten ook in de volledige afwezigheid van zuurstof (onder zogenaamd anaërobe condities) in staat waren om een alcoholische gisting uit te voeren. Nadat door het onderzoek van Pasteur en anderen was vastgesteld dat gistcellen verantwoordelijk zijn voor de omzetting van suikers in alcohol en kooldioxide, was de volgende belangrijke vraag hoe deze omzetting tot stand komt. Het onderzoek naar deze vraag leidde tot de ontdekking dat sommige chemische omzettingen ook konden worden bevorderd (gekatalyseerd) door extracten van gistcellen. Al in 1860 toonde de Franse onderzoeker Berthelot aan dat na toevoeging van pure alcohol aan fijngemalen gistcellen “iets” neersloeg dat in staat was om sacharose (riet- of bietsuiker) te splitsen in de twee kleinere suikers fructose en glucose. Spoedig hierna werd aangetoond dat extracten van gisten, waarin zich geen intacte gistcellen meer bevonden, in staat waren om allerlei andere chemische omzettingen te katalyseren. De hiervoor verantwoordelijke factoren werden enzymen genoemd, wat in het Grieks “in gist ” betekent. Inmiddels is bekend dat enzymen eiwitten zijn die, vaak met een hoge mate van specialisatie, chemische reacties katalyseren. In de eerste helft van de twintigste eeuw zijn gistcellen veelvuldig gebruikt als modelsysteem voor het ophelderen van de complexe stofwisselingsroutes die een rol spelen bij het koolstof- en energiemetabolisme van cellen. Dit onderzoek resulteerde in 1938 in de volledige opheldering van de route waarlangs gisten suikers omzetten in ethanol en kooldioxide, de zogenaamde glycolyse. Deze route, die ook verantwoordelijk is voor de suikerstofwisseling in veel andere organismen, wordt naar haar ontdekkers ook wel de Embden-Meyerhof route genoemd (zie pagina 21).
J.T. Pronk
Krijttekeningen van "regelmatig gevormde, onbeweeglijke bolletjes" door Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723)
speciale processen werden ontwikkeld om bakkersgist te kweken. Om dit mogelijk te maken, moesten echter eerst belangrijke ontdekkingen gedaan worden (zie hiernaast). Gist speelt nog steeds een belangrijke rol in het leven van alledag. Alleen al voor de bereiding van “ons dagelijks brood” worden jaarlijks enkele miljoenen tonnen gist gebruikt. In totaal zijn er nu zo’n 700 soorten gist beschreven (zie hoofdstuk 2), maar daarvan worden tot nu toe slechts enkele soorten gebruikt. Gist en voeding Favoriet is nog steeds bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae). Als deze gist, die in rusttoestand aan het brooddeeg wordt toegevoegd, “ontwaakt”, gaan de gistcellen kooldioxide produceren (zie hoofdstuk 3). Hierdoor ontstaan belletjes in het deeg, die het gebakken brood een luchtige structuur geven. Vroeger werden door de bakker geperste blokken verse gist gebruikt. Tegenwoordig kan een bakker gedroogde gist kopen die langer houdbaar is. Voor grootgebruikers zijn er gistsuspensies die in tankauto’s vanaf de gistfabriek naar de industriële bakkerijen worden vervoerd. Gistfabrikanten leveren niet één giststam, maar verschillende, afhankelijk van de toepassing. Net zoals er door mensen heel veel verschillende hondenrassen zijn gefokt, zijn er ook heel veel verschillende bakkersgiststammen ontwikkeld. Deze stammen zijn in de loop der jaren in speciale mutatie- en kruisingsprogramma’s geselecteerd om een zo goed mogelijk resultaat te
geven onder de omstandigheden waaronder zij worden gebruikt. Een stam die voor de productie van gedroogde gist wordt gebruikt, bevat bijvoorbeeld meer trehalose dan verse gist; deze stof bevordert de houdbaarheid en zorgt ervoor dat de gistcellen intact blijven, wanneer deze weer in een vochtige omgeving komen en water op gaan nemen. Er zijn ook speciale stammen voor deeg dat veel suiker bevat (zoals voor donuts) of dat in bevroren toestand bewaard moet kunnen worden. Ook heeft men de hoeveelheid kooldioxide die door gist geproduceerd wordt (de rijskracht) steeds verder weten te verbeteren, waardoor er minder gist dan vroeger nodig is voor hetzelfde resultaat. Als consument merk je van dit alles niet zoveel, maar bakkers kunnen tegenwoordig kiezen uit een groot assortiment aan giststammen. Gist wordt ook gegeten. Als vitaminesupplement zijn er gisttabletten en als broodbeleg is er gistpasta (marmite) te koop. Gist in de vorm van gistextract wordt als hartige smaakstof toegevoegd aan veel voedingsmiddelen, vooral aan soepen en sauzen (let maar eens op de etiketten). De meeste gistextracten worden gemaakt van speciaal daarvoor gekweekte bakkersgiststammen. Daarnaast maakt men gistextract van biergist die overblijft na het brouwproces; dit gistextract heeft een kaassmaak en wordt veel gebruikt als laagje om allerlei zoutjes. Een andere belangrijke gistsoort is Kluyveromyces lactis. Deze gist maakt het enzym lactase. Mensen, die zelf geen lactase kunnen maken, worden ziek als ze melk drinken, 5
GIST-ONDERZOEK IN NEDERLAND
Gedurende het afgelopen centennium hebben Nederlandse onderzoekers belangrijke bijdragen geleverd aan onze huidige kennis over gisten. In de eerste helft van de eeuw waren het vooral de hoogleraren Beijerinck en Kluyver, en hun medewerkers die in het Laboratorium voor Microbiologie aan de Technische Universiteit in Delft, met name taxonomisch, fysiologisch en biochemisch onderzoek verrichtten. Later is het onderzoek aan gisten meer over ons land verspreid geraakt, en thans wordt gistonderzoek verricht aan de meeste universiteiten en aan enkele onderzoeksinstituten. De reden hiervan is dat bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) een uitstekend modelorganisme bleek te zijn voor fysiologisch, biochemisch en moleculair genetisch onderzoek van de eukaryote cel en in belangrijke mate heeft bijgedragen aan onze huidige inzichten over het functioneren van cellen van hogere organismen. Deze populariteit van bakkersgist als onderzoeksobject heeft zelfs zulke vormen aangenomen dat vele onderzoekers bij het begrip gist meteen aan dit organisme denken. Zij vergeten daarbij dat bakkersgist slechts één is van de vele honderden soorten gisten die bekend zijn. Overigens wordt in ons land ook onderzoek gedaan aan enkele van de andere gisten. NWO, voorheen ZWO, heeft de afgelopen vijftig jaar een belangrijke bijdrage geleverd aan de financiering van gist-onderzoek in ons land. Na de organisatieverandering bij NWO in 1998 is het gebied Aard- en Levenswetenschappen (ALW) belast met de zorg voor onderzoek in de levenswetenschappen; zij financieert het huidige onderzoek aan gisten veelal in projectvorm. Het op toepassing gerichte onderzoek wordt door het gebied behartigd in opdracht van de Stichting Technische Wetenschappen van NWO. De laatste jaren is ook veel gist-onderzoek in ons land gefinancieerd door de Europese Commissie. Het betreft hierbij met name enkele grote internationale pro-
gramma’s zoals het gist-genoom programma en het zogenaamde Cell Factory programma. Het eerste programma had als doel het ophelderen van de volgorde van het complete genoom van bakkersgist en is in 1996 succesvol afgesloten. Daarmee was deze gist het eerste eukaryote organisme waarvan de complete genetische informatie bekend geworden is, voorwaar een geweldige doorbraak. Maar ook het andere programma heeft veel nieuwe inzichten opgeleverd voor de toepassing van gisten in nieuwe biotechnologische processen. De uitdaging voor de toekomst van het gist-onderzoek is zonder twijfel het vaststellen van de relatie tussen genen en hun functie in de intacte cel. In de causale keten van gen naar functie liggen een aantal stappen die als volgt kunnen worden gekarakteriseerd: Eerst wordt het gen vertaald naar een transcript dat boodschapper RNA wordt genoemd en dat de instructie bevat voor de vertaling naar een product, een eiwit. Dit eiwit wordt soms gemodificeerd en dient vervolgens de juiste lokatie in de cel te bereiken door interacties aan te gaan met andere eiwitten of membranen. Tenslotte dient de metabole logistiek van de cel zodanig op orde te worden gebracht en gereguleerd dat het geheel van de stofwisseling van kleine moleculen, macromoleculen en cellulaire structuren op een dynamische wijze bijdraagt aan de reproductie en overleving van de cel, Van de bijna 5800 genen die in het bakkersgist genoom zijn aangetroffen kennen we thans van iets meer dan de helft de functie waarvoor het betreffende gen codeert. Dat betekent dat we nog een lange weg te gaan hebben waarin ten behoeve van de opheldering van de functie van genen een belangrijke bijdrage geleverd moet worden door de bio-informatica. Het lijdt weinig twijfel dat gisten belangrijke modelsystemen zullen blijven voor toekomstig onderzoek.
Prof.dr. W. Harder, voorzitter ALW-NWO 6
Kluyver
omdat ze de suiker lactose in melk niet kunnen verteren. Door lactase toe te voegen aan melk wordt lactose door dit enzym afgebroken tot de enkelvoudige suikers glucose en galactose. Melk die op deze manier lactose-vrij is gemaakt, is wel wat zoeter. Dat komt, omdat de zoetkracht van met name glucose groter is dan die van lactose. Vroeger zorgde de van nature op planten voorkomende gist voor de start van de ‘alcoholvergisting’. Tegenwoordig worden speciaal geselecteerde giststammen gebruikt (zie hoofdstuk 4). Voor de productie van de talloze biersoorten worden evenzo vele verschillende biergiststammen gebruikt die door de brouwers zorgvuldig in stand gehouden worden om de karakteristieke smaak en geur te kunnen blijven garanderen. Bij de productie van wijn moet men tegenwoordig ook gist toevoegen. Door het veelvuldig gebruik van schimmeldodende middelen is de hoeveelheid gist, die van nature op druiven voorkomt, vaak niet voldoende om op een ‘natuurlijke’ wijze wijn te kunnen maken. Voor wijn wordt een andere giststam gebruikt dan voor champagne of cognac. Veevoer en cosmetica Na de bereiding van alcoholische dranken houdt men vaak bier- of wijngist over. Dit komt, omdat gist nog doorgroeit
tijdens het vergistingsproces en - behalve bij sommige biersoorten - geen deel uitmaakt van het eindproduct. Meestal wordt de overgebleven gist dan tot veevoer verwerkt. Een andere gistsoort wordt speciaal gekweekt voor gebruik in diervoer. Zalmen en garnalen worden tegenwoordig op grote schaal gekweekt. Om de gekweekte vis net zo roze te krijgen als hun soortgenoten in het wild moet er voldoende van de kleurstof astaxantine in hun voedsel zitten. Door de vistelers werd aanvankelijk alleen chemisch gesynthetiseerd astaxantine aan het visvoer toegevoegd. Nu wordt steeds vaker de gistsoort Phaffia rhodozyma door het visvoer gemengd. Deze gist produceert deze kleurstof van nature, maar niet zo veel als nodig is. Door middel van speciale selectieprogramma’s heeft men inmiddels stammen ter beschikking, die deze kleurstof in grote hoeveelheden en dus goedkoop kunnen maken. Ook flamingo’s in dierentuinen krijgen tegenwoordig deze bijzondere gist door hun voer heen gemengd om ze mooi roze te houden. Een ander voorbeeld is de productie van vetachtige stoffen ( ceramiden). Onze opperhuid bevat hoornachtige cellen die zijn ingebed in een vettige substantie die deze cellen bij elkaar houdt, zoals cement tussen bakstenen. Ongeveer 40 procent hiervan bestaat uit ceramiden. Deze stoffen spelen een rol bij de bescherming van onze huid tegen uitdroging. Daarom voegen cosmeticaproducenten uit gist afkomstige ceramiden toe aan hun huidcrèmes. Genetische modificatie Sinds de jaren zeventig is het in toenemende mate mogelijk om gericht veranderingen aan te brengen in het erfelijk materiaal (DNA) van micro-organismen, planten en dieren; zelfs bij mensen is men daarmee bezig in het onderzoek naar de mogelijkheden van gentherapie voor het behandelen van erfelijke aandoeningen. Ook kan men stukken DNA, die coderen voor een eiwit (genen) van het ene organisme naar het andere organisme overbrengen. Naast bacteriën behoort gist tot de eerste organismen waarvoor dit soort technieken ontwikkeld zijn. Hieronder zullen enkele (mogelijke) toepassingen besproken worden om te laten zien hoe ons dagelijks leven beïnvloed wordt en wellicht zal gaan worden door deze technologie: • bakkersgist De nieuwe technologie biedt onderzoekers die zich bezig houden met de verbetering van bakkersgiststammen de mogelijkheid om sneller en gerichter gewenste veranderingen aan te brengen in de genen van gist. Veel van de 7
GIST ALS PROTOTYPE VAN EEN EUKARYOTE CEL Een gistcel bevat alle karakteristieken van een eukaryote cel: DNA bevindt zich in de kern en bepaalde processen worden uitgevoerd in speciale compartimenten (organellen). Gedurende de evolutie zijn de mechanismen die betrokken zijn bij celprocessen zoals bijvoorbeeld de vorming van de verschillende celorganellen (zie ook pagina 55) nauwelijks veranderd. Dit betekent dat de eiwitten, die daarbij een rol spelen, in verschillende eukaryote organismen erg veel op elkaar lijken. De uitkomsten van studies naar zo’n celproces in gisten kunnen daarom eenvoudig vertaald worden naar planten, dieren of mensen. Gisten zijn buitengewoon aantrekkelijk als modelorganismen voor studies vanwege een groot aantal experimentele voordelen. Ten eerste zijn ze gemakkelijk en snel te kweken (verdubbelingstijd 1-2 uur). Ten tweede kunnen de biochemische en fysiologische eigenschappen van gistcellen worden gevarieerd door veranderingen aan te brengen in de kweekomstandigheden, bijvoorbeeld door verschillende voedingsstoffen te gebruiken (zie hieronder). Tenslotte zijn de technieken om gisten genetisch te manipuleren zeer goed ontwikkeld, waardoor het mogelijk is de functie van één enkel gen in de vorming van een celorganel te bestuderen door bijvoorbeeld te kijken wat het effect is van het verwijderen van dit gen. Doorsnede door een cel van de gist Hansenula polymorpha die is gekweekt op glucose als voedingsbron. In de cel is slechts één klein peroxisoom (P) aanwezig, dat onder deze groei-omstandigheden geen - belangrijke - rol speelt in de stofwisseling van de cel. Mitochondrion (M); kern (N); vacuole (V). Als de gist H. polymorpha gekweekt wordt op methanol als voedingsbron, is de cel geheel gevuld met grote peroxisomen.
door hen bedachte verbeteringen bevinden zich nog in het onderzoeksstadium. In Groot-Brittannië is al een stam, die deeg sneller doet rijzen, voor verkoop goedgekeurd. Ondanks de goedkeuring is deze genetisch gemodificeerde gist nog niet op de Engelse markt gebracht. De broodfabrikanten stellen zich afwachtend op, omdat zij niet het risico willen lopen onderwerp te worden van een mediacampagne door actiegroepen tegen het gebruik van genetische modificatie bij voedingsmiddelen. • biergist Ook bij biergist kan men door genetische modificatie product- en procesverbeteringen eenvoudiger en sneller realiseren. Voorbeeld: de belangrijkste snelheidsbeperkende stap tijdens de productie van licht bier (pils) is het 8
zogenaamde lageren, waarbij het bier gedurende acht tot twaalf weken gekoeld moet worden om de smaakbedervende stof diacetyl door een gistenzym te laten afbreken. Dat duurt zolang, omdat biergist van nature weinig van dit enzym bevat. Diverse bierproducenten laten nu een genetisch gemodificeerde biergiststam met meer enzym ontwikkelen. Hierdoor kan het lageringsproces naar verwachting drastisch worden bekort, waardoor niet alleen de kosten van opslag lager worden, maar vooral veel bespaard wordt op energie voor koeling (kostenverlagend en milieuvriendelijk). Eveneens in Groot-Brittannië is door de autoriteiten een genetisch gemodificeerde biergist goedgekeurd, die meer suikers in de wort kan verwerken. Ook deze gist is om de
eerder genoemde reden door de bierproducenten niet met open armen ontvangen. • wijngist Bij wijngist wordt ook veel onderzoek gedaan om de giststammen te verbeteren. Men zou bijvoorbeeld graag een gist willen hebben, die het scherp smakende appelzuur kan omzetten in het veel zachter smakende melkzuur. Nu doen wijnboeren dat door een behandeling met melkzuurbacteriën na de alcoholgisting. Nadeel is dat de melkzuurbacteriën door alcohol geremd worden en dat nogal eens infecties optreden met ongewenste microorganismen. In Frankrijk zijn inmiddels gisten zodanig veranderd, dat zij zelf appelzuur kunnen omzetten in melkzuur. Champagneproducenten zouden graag een gist willen hebben, die wat beter uitvlokt. Nu moeten zij grote moeite doen om de zeer langzaam uitzakkende gist te verwijderen, die tijdens de tweede gisting in de fles de ‘bubbels’ produceert. Ook zo’n champagnegist is inmiddels beschikbaar en wordt nu in het laboratorium getest. Ten slotte een voorbeeld van het verbeteren van de smaak. De smaak van een goede volle wijn wordt voornamelijk bepaald door de hoeveelheid glycerol. Malafide producenten voegen soms extra glycerol aan een te schrale wijn toe om hem voller van smaak te maken. Giststammen die wat meer glycerol produceren, verkleinen het bedrijfsrisico voor de wijnproducent. Ook hieraan wordt hard gewerkt.
om melk te laten stremmen. Chymosine werd en wordt nog altijd gehaald uit magen van geslachte kalveren. Sinds enkele jaren is er ook chymosine, die gemaakt wordt door de gist Kluyveromyces lactis. In Groot-Brittannië wordt kaas, die met chymosine van genetisch gemodificeerde gist geproduceerd is, op de markt gebracht als ‘vegetarische kaas’. Tot slot Behalve productie-organisme is gist ook modelorganisme voor onderzoek (zie hiernaast en hoofdstuk 7). Talloze processen in de cel zijn ontrafeld aan de hand van experimenten met bakkersgist, die men veel makkelijker en sneller kan kweken dan cellen van mens of dier. Het voorlopige hoogtepunt van dit onderzoek vormt het ontrafelen van de basenvolgorde van het totale DNA in de celkern (genoom) in 1996 (zie hoofdstuk 6). Van de ongeveer 6000 genen waren tot dan toe zo’n 2600 eerder geïdentificeerd. Sindsdien is men hard bezig uit te zoeken voor welke eiwitten die duizenden genen coderen en welke functie die eiwitten in de cel hebben. Omdat veel gistgenen overeenkomen met genen van de mens, hoopt men ook veel kennis op te doen over het functioneren van eiwitten in onze cellen en over hun rol bij ziekteprocessen.
WERKEN MET GIST OP SCHOOL Gist als producent van eiwitten Naast bacteriën zijn ook diverse gistsoorten ontwikkeld tot ‘fabriekjes’ waarin aan de hand van een aangeleverd ‘recept’ producten gemaakt kunnen worden (zie hoofdstuk 5). De producten zijn eiwitten, de recepten zijn de in de gist ingebrachte erfelijke informatie, d.w.z. het gen dat codeert voor het te produceren eiwit. Bakkersgiststammen worden tegenwoordig ook gebruikt voor de productie van het hormoon insuline. Naast insuline zijn er inmiddels allerlei farmaceutische eiwitten op de markt en nog veel meer in aantocht. Enkele daarvan worden door gisten gemaakt. Bovendien worden ook eiwitten met een andere toepassing al op commerciële schaal gemaakt. Een mooi voorbeeld daarvan is het enzym chymosine, dat gebruikt wordt
Literatuur: Frings, J., e.a., Biotechnologie in de praktijk; schoolproeven. Leiden: SMD, 1997. Schollar, J. & B. Watmore, Practical fermentation a guide for school and colleges. Reading: National Centre for Biotechnology Education, 1999. Website: www.eibe.org (European Initiative for Biotechnolgy Education), met allerlei lesmodulen, waarvan enkele in het Nederlands zijn vertaald, o.a. Brooddeeg maken.
9
NAAMGEVING: SEXUEEL OF ASEXUEEL? Omdat veel gisten (en schimmels) alleen in het asexuele stadium bekend zijn, worden er in de mycologie twee systemen van naamgeving gehanteerd: het ene is gebaseerd op het asexuele stadium, het andere op het sexuele stadium. Als een onderzoeker bij een asexuele gist cellen in het sexuele stadium ontdekt, dan moet deze gist ook een ‘sexuele’ naam krijgen; deze naam krijgt dan meestal de voorkeur boven de asexuele. De praktijk leert echter dat beide systemen door elkaar worden gebruikt, bijvoorbeeld als de asexuele naam veel genoemd is in de literatuur. Een voorbeeld hiervan is de ziekteverwekker Cryptococcus neoformans (de asexuele naam) met een sexueel stadium (Filobasi-diella neoformans is de sex-uele naam). In medische tijdschriften wordt echter nog steeds voornamelijk de (asexuele) naam Cryptococcus neoformans gebruikt. Een tweede voorbeeld is de industriële gist Candida utilis (asexuele naam) met het sexuele stadium Pichia jadinii (sexuele naam). Dit lijkt allemaal vrij ingewikkeld, maar de praktijk leert dat men toch goed met beide systemen kan omgaan.
Voorbeeld van een stamboom.
10
2
De soortenrijkdom van gisten
T. BOEKHOUT
T. Boekhout studeerde biologie aan de Universiteit Utrecht. Hij is werkzaam bij de gistafdeling van het Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), een instituut van de Koninklijke Nederlandse Academie van Wetenschappen, waar hij zich voornamelijk bezighoudt met onderzoek aan basidiomycete gisten. Naast de morfologie en fysiologie wordt in toenemende mate gebruik gemaakt van moleculaire kenmerken om gisten te classificeren en te identificeren.
Gisten leven op zeer uiteenlopende plekken (habitats). Belangrijke habitats zijn bodems, o.a. strooisellaag, humus, zand-, klei- en leembodems, maar ook bijvoorbeeld de permafrost; geliefd zijn daarnaast insectentunnels en uitwerpselen van insecten en onderdelen van planten zoals bloemen, nectar, fruit of sapstromen. Op bladeren leeft bijvoorbeeld een speciale groep van gisten, zg. honingdauwgisten. Geheel verschillende organismen, zoals bijvoorbeeld cacteeën en fruitvliegjes, hebben nauwe banden met bepaalde gisten. Er leven ook gisten in zeewater, onder andere soorten van de geslachten Rhodosporidium, Leucosporidium en Mrakia. Gisten kunnen zich onder uiteenlopende omstandigheden handhaven. Sommige soorten gedijen goed bij hogere temperaturen (de thermotolerante gisten), terwijl andere een duidelijke voorkeur hebben voor lagere temperaturen (psychrophiele gisten); bepaalde soorten groeien in een omgeving met een hoge osmotische waarde (osmotolerante gisten). Gisten leven ook op of in mensen en dieren. Hierbij kan men grofweg drie verschillende habitats onderscheiden: • lichaamsoppervlak zoals huid, nagels en haren (Candida, Trichosporon en Malassezia soorten); • slijmvliezen (Candida soorten zoals C. albicans); • dieper gelegen delen (o.a. in de hersenen de gist Cryptococcus neoformans ). Deze gisten zijn bekend geworden, omdat mensen er last van kregen. Malassezia soorten zijn bijvoorbeeld betrokken bij de vorming van roos. Overigens geldt dat ook veel ogenschijnlijk onschuldige gisten bij mensen met weinig of geen weerstand ziekteverwekkend kunnen zijn. Hoeveel gistsoorten er zijn, is niet bekend. Momenteel zijn ongeveer zevenhonderd gisten als soort erkend. Dit aantal zal zeker toenemen, omdat vooral in de tropen veel habitats nog nauwelijks zijn onderzocht; daarnaast blijken 11
12
veel gisten die momenteel verondersteld worden tot één soort te horen, na vergelijking van hun DNA toch aparte soorten te zijn (zie pagina 14). Veel gistsoorten staan bekend om hun economische betekenis. Allereerst natuurlijk door hun toepassing bij de bereiding van brood, bier en wijn. Daarnaast zijn er veel soorten die van belang zijn, omdat ze speciale stoffen maken. Voorbeelden daarvan zijn zuren zoals citroenzuur door Yarrowia lipopytica, vitamines zoals riboflavine door Ashbya gossypii, kleurstoffen (pigmenten) zoals astaxanthine door Phaffia rhodozyma , enzymen zoals invertase door Kluyveromyces marxianus en smaak- en geurstoffen, bijvoorbeeld door Candida utilis. Ook spelen gisten een rol bij de productie van farmaceutische eiwitten (zie hoofdstuk 5). Daarnaast zijn gistsoorten bekend vanwege hun slechte reputatie. Zij veroorzaken problemen (bederf) in de voedingsmiddelenindustrie, bijvoorbeeld Zygosaccharomyces bailii, Torulaspora delbrueckii, Schizosaccharomyces octosporus en Brettanomyces soorten. Andere soorten staan bekend als ziekteverwekker bij planten, zoals Ashbya gossypii op katoenplanten, of lijken betrokken te zijn bij het ontstaan van verruwing van appels, o.a. Rhodotorula en Cryptococcus soorten. Gisten, die zich keren tegen andere schimmels, kunnen daarentegen aangewend worden in de biologische bestrijding van plagen, bijvoorbeeld omdat zij de groei remmen van meeldauwschimmels, zoals de gistsoort Pseudozyma flocculosa doet, of omdat zij bederf van fruit tegengaan; een voorbeeld hiervan is de remming van de schimmel Penicillium door de gisten Pichia guilliermondii en Cryptococcus laurentii.
Wat zijn gisten? Gisten zijn eencellige micro-organismen. Anders dan bacteriën hebben gistcellen hun DNA in de celkern opgeborgen; dat hebben zij gemeen met planten, dieren en mensen, waardoor zij ingedeeld zijn bij de eukaryote organismen. Gistcellen kunnen zich in tweeën delen net zoals bacteriën; bovendien zijn gistcellen in staat een knop te vormen, die uitgroeit en zich afsplitst (budding ; zie de scanning-elektronenmicroscopische opname van een 'knoppende' bakkersgist op de pagina hiernaast. B: de plaats waar al eerder een knop is afgesnoerd). Deze manieren om zich te vermenigvuldigen noemt men vegetatieve groei of voortplanting. Gisten behoren tot de schimmels (fungi). Zij zijn ingedeeld bij de ascomyceten, waartoe o.a. de morielje en de truffel behoren, en de basidiomyceten, waartoe o.a. de champignon en de oesterzwam behoren. Bij de ascomyceten worden de cellen voor de sexuele voortplanting (ascosporen) inwendig gevormd in een zakvormige cel, de ascus. Bij de basidiomyceten ontstaan die sporen (basidiosporen) uitwendig, aan de buitenkant van een knotsvormige cel, het basidium. Hoewel deze beschrijving duidelijk lijkt, valt er in de praktijk het een en ander op af te dingen. Veel gisten vormen namelijk ook korte al dan niet vertakte ketens van aan elkaar vastzittende, meestal langwerpige gistcellen (pseudomycelium). Ook zijn veel gisten dimorf, dat wil zeggen dat ze naast ronde gistcellen ook draadvormige cellen (hyfen ) kunnen vormen. Dit dimorfisme speelt een belangrijke rol bij het ziekteverwekkend effect van allerlei gisten (zie foto hierboven:pseudohyfen van Candida albicans). Behalve vegetatief kunnen veel gisten zich ook nog 13
TAXONOMIE: VAN BRIEF TOT CD-ROM
Antonie van Leeuwenhoek is de eerste geweest die over gist schreef in zijn brief aan de Royal Society in Londen (1684); hij maakte melding van de aanwezigheid van “animalcula” in gefermenteerde mout. Pas veel later kwam er door de opkomst van de reincultuur en de betekenis van gisten voor de industrie een wetenschappelijke aandacht voor de diversiteit aan gistsoorten. In het begin van deze eeuw werden talloze mogelijke bronnen van gist onderzocht met de ontdekking van veel nieuwe soorten als resultaat. De meeste nieuwe gistsoorten bracht men aanvankelijk onder bij het geslacht Saccharomyces, maar al vrij snel werd duidelijk dat het om verschillende gisten ging. In 1901 beschreef Barker bijvoorbeeld het geslacht Zygosaccharomyces, in 1904 Hansen de geslachten Pichia en Saccharomycodes en Lindner het geslacht Torulaspora. Dat deden zij op grond van uiterlijke kenmerken. In 1921 introduceerde Guilliermond kenmerken voor de identificatie van de gisten, die berusten op hun eigenschappen bij de gisting (fermentatie). Deze methode wordt tot op de dag van vandaag nog gebruikt. Het aantal testen is in de loop van de tijd sterk uitgebreid en omvat nu ondermeer fermentatie- en assimilatieproeven, metingen van de behoeften aan vitamines en van de groei bij verschillende temperaturen. Kluyver en de eerste medewerksters van de gistafdeling van het Centraalbureau voor Schimmelcultures in Delft hebben een grote bijdrage geleverd aan de fysiologische karakterisatie van gisten; men sprak zelfs wel van “de Delftse school van gistenclassificatie”. Ook de Amerikaanse onderzoeker Wickerham droeg in belangrijke mate bij tot de standaardisatie van de identificatiemethode. Tot nu toe zijn er meer dan 2300 gistsoorten beschreven, waarvan er ‘slechts’ zo’n 700 worden erkend. De grafiek (hiernaast) laat zien, dat het aantal beschreven gistsoorten aanvankelijk exponentieel toenam (1830-1900), gevolgd door een periode van toename (1900-1940) en afname tijdens de Tweede Wereldoorlog; daarna is de toename minder stijl dan die tijdens de eerste helft van deze eeuw en uiteindelijk neemt het aantal beschreven soorten tijdens de jaren negentig duidelijk af. Zal de aandacht voor taxonomisch onderzoek verder afnemen? Recente ontwikkelingen in de moleculaire genetica vergemakkelijken het ontdekken van gistsoorten en dat kan de 14
taxonomie een nieuwe impuls geven. Een voorbeeld daarvan is de vergelijking van sequenties van het ribosomale DNA ten behoeve van de classificatie van gisten. Hieruit blijkt dat men veel nieuwe soorten ten onrechte op grond van fysiologische kenmerken als dezelfde soort heeft beschouwd. Het gevolg is wel dat men deze soorten vaak niet op grond van traditionele fysiologische kenmerken kan indelen. In de derde editie van “The yeasts, a taxonomic study” (1984) werd bijvoorbeeld de gist S. cerevisae als aparte soort genoemd, maar in de vierde editie uit 1998 worden in plaats daarvan vier soorten, waaronder S. cerevisiae, apart beschreven. Het is dan ook van belang om te beschikken over snelle en betrouwbare identificatiemethoden voor gisten. De verwachting is dat in de nabije toekomst DNA sequenties daarbij een belangrijke rol gaan spelen. Omdat het Centraalbureau voor Schimmelcultures al vanouds gisten identificeerde voor anderen, werkt dit bureau momenteel samen met een groot aantal buitenlandse partners en het Expertisecentrum voor Taxonomische Identificatie van de Universiteit van Amsterdam aan de ontwikkeling van een CD-ROM, die naast morfologische en fysiologische gegevens, lichtmicroscopische en electronmicroscopische foto’s, ook een grote database van ribosomale DNA sequenties zal bevatten.
sexueel voortplanten: in hun levenscyclus wisselen asexuele en sexuele stadia elkaar af. Bij veel basidiomycete gisten ontstaan na samensmelting van twee gistcellen hyfen met twee kernen. Het is dan ook niet eenvoudig om bij zo’n diversiteit aan verschijningsvormen ordening aan te brengen. Vanouds heeft men naar uiterlijke kenmerken gekeken (morfologie). De vorm van gistcellen loopt uiteen van bol, cylinder, nier, maan tot citroen. De knop kan ontstaan op één uiteinde van de cel (monopolaire knopvorming in o.a Malassezia), op beide uiteinden (bipolaire knopvorming in o.a. Hanseniaspora) of over het gehele celoppervlak (multipolaire knopvorming in bijvoorbeeld Saccharomyces). Vaak worden verscheidene knoppen achter elkaar op dezelfde plaats gevormd. Sommige gisten, zoals Schizosaccharomyces, delen zich door midden (splijting). Bij andere gisten en gistachtige schimmels vallen de hyfen uiteen in zogenaamde arthroconidiën (o.a. in Trichosporon en Geotrichum ). Bepaalde basidiomycete gisten maken sporen (ballistoconidiën), die worden weggeschoten. Het kenmerk van de sexuele stadia is de vorming van asci met ascosporen of basidia met basidiosporen. Bij asci kan de celwand al dan niet verdwijnen. Ascosporen zijn glad of ruw en verschillen in vorm van bol, ellips, hoed tot naald. De basidia zijn een- tot viercellig (zie de foto hierboven: een meercellig basidïum van Bulleromyces albus). In het sexuele stadium laat de ziekteverwekker Cryptococcus neoformans zelfs vier ketens van basidiosporen op de basidia zien. Tegenwoordig kan men gisten niet alleen indelen op grond van hun uiterlijke kenmerken, maar ook op grond van hun DNA. Het is opmerkelijk dat men gisten zowel bij de groep van de ascomyceten als die van de basidiomyceten heeft ingedeeld. De levensvorm ‘gist’ is dus polyphyletisch, d.w.z. is tijdens de evolutie verscheidene keren onafhankelijk van elkaar ontstaan. Of anders gezegd: niet alle gisten stammen in rechte lijn af van één gemeenschappe-
lijke voorouder. Vergelijking van het (ribosomaal) DNA van gisten heeft het inzicht in de evolutionaire verwantschap van gisten sterk vergroot. Een van de meest opvallende resultaten is dat de meeste ascomycete gisten een monophyletische zustergroep vormen naast de filamenteuze ascomyceten, zoals Penicillium en Aspergillus. De basidiomycete gisten blijken echter verspreid voor te komen over drie hoofdgroepen van de basidiomyceten: namelijk de trilzwammen (Tremellales) en hun verwanten, de roestschimmels (Uredinales) en hun verwanten, en de brandschimmels (Ustilaginales) en hun verwanten. De twee laatste groepen bestaan voor het grootste deel uit schimmels die bekend staan als ziekteverwekkers bij planten. Kennelijk zijn deze schimmels vanuit evolutionair oogpunt nauw verwant met bepaalde gisten. Vergelijkend DNA-onderzoek heeft ook aangetoond dat niet verwante organismen tijdens de evolutie sterk op elkaar kunnen gaan lijken. De brandschimmels bijvoorbeeld, die qua uiterlijk en ziekteverwekkend vermogen erg op elkaar lijken, blijken dan in twee evolutionair zeer verschillende groepen uiteen te vallen. Daarentegen zijn andere schimmels en gisten, die helemaal niet op elkaar lijken, op grond van hun DNA zeer nauw met elkaar verwant. Een voorbeeld daarvan is de basidiomycete gistsoort Malassezia, die men alleen kent als ziekteverwekker bij mens en dier en die een zeer opvallende morfologie (monopolaire knopvorming) heeft. Onlangs heeft DNA-onderzoek aangetoond, dat deze gisten tot de brandschimmels gerekend moeten worden, die een sterk dimorfe leefswijze hebben en als ziekteverwekker bij planten bekend staan. De wetenschappelijke uitdaging is nu om een verklaring te vinden voor deze onverwachte evolutionaire verwantschap. Complexe levenscycli Zowel de ascomyceten als de basidiomyceten kennen veel variaties in hun levenscycli (zie ook hiernaast). Gisten 15
REGELING VAN DE LEVENSCYCLUS Bij basidiomycete gisten wordt de levenscyclus gereguleerd door zogenaamde incompatibiliteitsfactoren. Bipolaire soorten hebben één regulerende factor met twee of meer allelen (Mat A, Mat a, enz.). Mat-A cellen vormen rhodotorucine-A, een peptide van 10 aminozuren, en mata cellen vormen het peptide rhodotorucine-a. Rhodotorucine-A stopt de celcyclus van een Mat-a cel in de G1-fase en brengt het plastischer worden van de celwand, de vorming van een conjugatiebuis en de uitscheiding van rhodotorucine-a op gang. Dit rhodotorucine-a stopt de celcyclus van de Mat-A cel in de G1-fase en zet het zachter worden van de celwand en de vorming van de conjugatiebuis in gang. Na versmelting van de conjugatiebuizen (plasmogamie; zie de twee versmeltende cellen tussen de asci en overige cellen van de bederfgist Zygosaccharomyces bailii op de foto hierboven), ontstaat een tweekernig mycelium (dikaryon). Na versmelting van de twee kernen (karyogamie) ontstaat een éénkernig, diploid stadium, dat meestal kort bestaat. Deze karyogamie vindt meestal plaats in gespecialiseerde cellen, de basidia, waarop na de meiose de haploïde basidiosporen worden gevormd. Tetrapolaire soorten hebben twee incompatibiliteitsfactoren met meestal verscheidene allelen (A1B1, A2B2, A3B3 enz.). De A-factor en de B-factor moeten verschillend zijn voor een geslaagde kruising. Het grote aantal allelen van de incompatibiliteitsfactoren bevordert in sterke mate uitkruising, waardoor men van een bepaalde soort diverse stammen in handen kan krijgen. 16
kunnen een homothallische of een heterothallische levenscyclus hebben. In een homothallische levenscyclus ontstaan de sexuele sporen zonder versmelting van twee cellen (conjugatie ). Bij heterothallische levenscycli vindt deze conjugatie wel plaats. De levenscyclus van de bakkersgist Saccharomyces cerevisiae bijvoorbeeld is een zogenaamde diplontische cyclus: in de ascus vindt versmelting plaats tussen twee haploïde ascosporen tot diploïde ascosporen, die na kieming uitgroeien tot een diploïde gist. Een alternatieve route is dat er in de vier haploïde ascosporen eerst een celdeling (mitose) plaats vindt, gevolgd door versmelting van beide dochterkernen. Hierdoor ontstaan dan vier diploïde ascosporen per ascus. Door de vier haploïde ascosporen uit de ascus te halen, krijgt men haploïde giststammen, die verschillen in “mating type”: MAT α en MAT a. De MAT a-cel vormt een peptide van tien aminozuren, de a-factor, maar bezit een receptor voor de α-factor van het andere celtype, terwijl dit bij de MAT α-cel omgekeerd is. Beide peptiden remmen de start van de celcyclus van het andere celtype. A- en α-cellen met respectievelijk aan hun receptor gebonden α- en a-factoren zijn in staat te conjugeren: de cellen worden langwerpiger en de celwanden elastischer, er vindt vorming van de conjugatiebuis plaats, gevolgd door migratie van de kernen naar het centrum van de conjugatiebuis; tenslotte versmelten de kernen (karyogamie), waardoor een diploide α/a cel ontstaat. Alleen deze α/a cellen zijn in staat tot de vorming van ascosporen. Na de meiose ontstaan aanvankelijk vier haploïde ascosporen, die twee aan twee versmelten, enz. Andere voorbeelden van levenscycli zijn de haplontische en de diplohaplontische cyclus. In een haplontische cyclus vindt er versmelting plaats van twee via mitose ontstane haploïde kernen, waarvan er meestal één naar de knop is verhuisd (moeder-knop conjugatie). Na een meiotische deling van de dan diploïde kern ontstaan er meestal vier
haploïde ascosporen. Deze cyclus komt onder meer voor bij de gist Debaryomyces hansenii. Een diplohaplontische cyclus komt voor bij de methylotrofe gist Hansenula polymorpha. Deze gist kan zowel vanuit een haploïde cel als een diploïde cel vegetatief groeien. Conjugatie van haploïde cellen leidt dan tot cellen met diploïde kernen die na meiose in een ascus met vier haploïde ascosporen resulteren. In de heterothallische gist Zygosaccharomyces rouxii ontstaat de ascus door versmelting van twee haploïde cellen. Typerend voor deze gist is de haltervorm van de ascus, namelijk twee cellen verbonden door een conjugatiebuis. De aanwezigheid van ascosporen, de korte generatietijd en de mogelijkheid om ascosporen uit een ascus apart van elkaar te laten groeien, leidden ertoe dat gisten, vooral de bakkersgist Saccharomyces cerevisiae, uitgebreid genetisch zijn bestudeerd. Deze kennis is toegepast om giststammen via kruisingen te veranderen, bijvoorbeeld door specifieke eigenschappen te versterken, zoals het vermogen tot alcoholvorming, of juist de vermeerdering van gistcellen te stimuleren (zie hoofdstuk 4). Later zijn de klassieke genetische methoden aangevuld met de recombinant DNA-technologie. Zoals eerder gezegd, heeft DNAonderzoek al enkele verrassingen opgeleverd over de verwantschap van gisten. Naar verwachting zal men de soortenrijkdom van gisten nog beter in kaart kunnen brengen door hun erfelijk materiaal te vergelijken.
Website: www.cbs.knaw.nl (Centraal Bureau voor Schimmelcultures).
De meeste gisten kunnen goed worden bewaard in vloeibare stikstof, in de vriezer bij -8 graden Celsius of in drooggevoren vorm (zie foto hierboven: droogvriezen van gisten). Sommige soorten stellen specifieke eisen aan hun voeding. Malassezia gisten bijvoorbeeld groeien alleen op media met veel vetten en Cyniclomyces guttulatus, de gist die in de ingewanden van konijnen voorkomt, groeit alleen op media met een lage pH (pH 4,5) en in aanwezigheid van een hoge concentratie kooldioxide (15 procent). Er bestaan instellingen die speciaal zijn toegerust om collecties van gisten en schimmels of van andere micro-organismen te bewaren. Sommige collecties, zoals die van het Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), bevatten voornamelijk in het wild voorkomende gisten, maar bijvoorbeeld ook patentstammen. Andere, zoals die van het Amerikaanse Yeast Genetic Stock Center bevatten voornamelijk mutanten. 17
18
3
Stofwisseling van gisten
J.T. PRONK
J.T. Pronk studeerde biologie aan de Rijksuniversiteit Leiden. Hij promoveerde in 1991 aan de Technische Universiteit Delft op onderzoek aan zuurminnende bacteriën en is thans persoonlijk hoogleraar Industriële Microbiologie op het Kluyverlaboratorium voor Biotechnologie van deze universiteit. Tevens is hij adviseur bij DSM-Delft en BIRD Engineering. Zijn onderzoek richt zich voornamelijk op industriële gisten. Hierbij wordt, naast het kweken onder nauwkeurig gedefinieerde condities, genetische modificatie ingezet om via gerichte veranderingen in de erfelijke eigenschappen inzicht te verwerven in koolstofen energiestofwisseling.
Net als andere levende cellen bestaan gisten na drogen voor meer dan 90 procent uit eiwitten, suikers, vetten en nucleïnezuren (RNA, DNA). Het koolstof in deze organische stoffen halen gisten niet, zoals planten, uit kooldioxide. In plaats daarvan hebben gistcellen, net als dierlijke cellen, organische voedingsstoffen nodig voor de aanmaak van koolstofbevattende celbestanddelen. Aan stikstof, fosfor, zwavel en diverse metalen komen gistcellen door anorganische zouten uit hun omgeving op te nemen. De omzetting van deze eenvoudige voedingsstoffen in de complexe eiwitten en de andere macromoleculen waaruit gistcellen bestaan, wordt assimilatie genoemd. Zowel de opname van voedingsstoffen uit de omgeving als de omzetting daarvan vereist een investering van vrije energie. Gistcellen ontlenen deze vrije energie, net als dierlijke cellen, aan de afbraak van voedingsstoffen. De vrije energie die hierbij beschikbaar komt, wordt vastgelegd in de universele energiedrager van levende cellen, het molecuul adenosine trifosfaat (ATP). Dit proces wordt dissimilatie genoemd. Afhankelijk van de omstandigheden waaronder een gistcel zich bevindt en de beschikbare voedingsstof kan de dissimilatie leiden tot vorming van kooldioxide en water (via de ademhaling) of tot vorming van kooldioxide en ethanol (via de alcoholische fermentatie of gisting). Alle tot nu toe bekende gistsoorten zijn in staat om tenminste één suiker, bijvoorbeeld glucose of fructose, te gebruiken als enige bron van koolstof en vrije energie. Suikers, hetzij in zuivere vorm, hetzij in ruwe vorm (bijvoorbeeld als molasse, een bijproduct van de suikerindustrie dat voor ongeveer vijftig procent uit suikers bestaat) zijn veruit de belangrijkste koolstof- en energiebron voor de industriële toepassingen van gisten. In dit hoofdstuk zal daarom de nadruk liggen op de basisprincipes van de suikerstofwisseling in gisten. 19
glucose maltose
ethanol glucose
glycolyse
NAD NADH
pyruvaat
aceetaldehyde fermentatie
ademhaling
H2O CO2
citroenzuur cyclus
NAD NADH
1/ O 2 2
Opname van suikers door gisten Gistcellen worden omgeven door een plasmamembraan en een celwand. Het plasmamembraan, dat bestaat uit een dubbellaag van verbindingen met vetzuurketens (lipiden), is in principe niet doorlaatbaar voor suikers. Het plasmamembraan bevat daarom diverse transporteiwitten die de opname van suikers door gistcellen mogelijk maken. Behalve met enkelvoudige suikers, zoals glucose en fructose, kunnen veel gisten zich voeden met verbindingen van twee enkelvoudige suikers (disachariden). Voorbeelden van belangrijke disachariden zijn: a. sacharose (riet- of bietsuiker), de belangrijkste suiker in molasse en de koolstof- en energiebron voor de industriële productie van bakkersgist en b. maltose (moutsuiker), de belangrijkste suiker in brooddeeg en in wort, de grondstof voor de bereiding van bier. Disachariden moeten, voordat ze door gistcellen als koolstof- en energiebron gebruikt kunnen worden, eerst worden gesplitst in enkelvoudige suikers. De enzymen die voor deze splitsing zorgen, kunnen zich zowel binnen als buiten de gistcel bevinden. In het eerste geval worden de disachariden via speciale transporteiwitten door het plasmamembraan heen getransporteerd om vervolgens in de 20
cel gesplitst te worden door een enzym. Dit gebeurt onder andere bij de omzetting van maltose door bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae). In het tweede geval wordt het enzym door de gistcel uitgescheiden om in zijn omgeving aanwezige disachariden te splitsen in enkelvoudige suikers; deze worden de gistcel binnen gebracht via eiwitten, die gespecialiseerd zijn in het transport van enkelvoudige suikers. Een voorbeeld van dit mechanisme is het gebruik van sacharose door bakkersgist. De opname van suikers is een belangrijke stap in de suikerstofwisseling van gisten, die worden gebruikt om alcohol en kooldioxide te produceren. Er is zelfs wel verondersteld dat suikeropname door gistcellen een snelheidsbepalende stap kan zijn bij het rijzen van brooddeeg of de bereiding van bier. De vraag daarbij is hoe (snel) transporteiwitten suikers uit de omgeving de cel in kunnen brengen. Om dat te weten te komen is men erin geslaagd lege membraanblaasjes te maken uit het plasmamembraan van gistcellen. Met zulke membraanblaasjes kunnen nauwkeurige metingen worden verricht, zonder dat deze metingen beïnvloed worden door storende reacties die zich in intacte gistcellen afspelen. Om de route van de suikers te volgen gebruikt men vaak radioactief gemerkte suikers. Op deze wijze kan men inzicht krijgen in de werkwijze en specialisatie van transporteiwitten van verschillende gistsoorten en diverse stammen van een soort. Glycolyse: de snelweg van de suikerstofwisseling Nadat enkelvoudige suikers, na eventuele splitsing van disachariden, door transporteiwitten in de gistcel zijn beland, kunnen ze dienen als bron van celbestanddelen en energie (ATP). Net als in cellen van de mens, begint de stofwisselingsroute van suikers met de glycolyse. In de glycolyse wordt een molecuul glucose of fructose (dat 6 koolstofatomen bevat) via een aantal stappen om-
Alcoholvorming via de Embden-Meyerhof route (glycolyse).
glucose ATP ADP
glucose-6-fosfaat fructose-6-fosfaat ATP ADP
fructose-1,6-difosfaat dihydroxyacetonfosfaat
gezet in twee moleculen pyrodruivenzuur (pyruvaat, met 3 koolstofatomen per molecuul). In de eerste reacties van de glycolyse moet vrije energie, in de vorm van 2 moleculen ATP per molecuul glucose, geïnvesteerd worden. Dit wordt echter ruimschoots gecompenseerd door het feit dat bij de latere reacties voor ieder gevormd molecuul pyruvaat ook 2 ATP gevormd worden. De netto opbrengst van de glycolyse bedraagt dus 2 ATP per molecuul glucose. Deze berekening gaat echter alleen op, wanneer voor de opname van glucose of fructose geen vrije energie vereist is. Sommige gisten bevatten transporteiwitten die voor het opnemen van suiker vrije energie nodig hebben. Hun energiebehoefte komt in de praktijk overeen met ongeveer 1 ATP per getransporteerd molecuul. In deze gevallen kan de opbrengst van transport en glycolyse dus lager liggen dan 2 ATP per molecuul glucose. Bij de omzetting van glucose in pyruvaat komen per molecuul pyruvaat ook twee elektronen vrij. Deze elektronen worden overgedragen op het molecuul nicotinamide dinucleotide (NAD), dat daardoor omgezet wordt in NADH (reductie). In gistcellen komen slechts zeer geringe hoeveelheden NAD voor. Om te voorkomen dat de glycolyse “vastloopt”, doordat alle beschikbare NAD omgezet is, moet de gistcel NADH weer voortdurend omzetten in NAD (reoxidatie). Gistcellen kunnen op twee manieren NAD terugwinnen: door alcoholische gisting en door ademhaling. Vanwege hun doorslaggevende belang voor de industriële toepassing van gisten worden beide processen hieronder nader toegelicht. Alcoholische gisting Wanneer NAD wordt teruggewonnen door alcoholische gisting, wordt de pyruvaat (3 koolstofatomen) die in de glycolyse gevormd wordt, eerst gesplitst in kooldioxide (1 koolstofatoom) en aceetaldehyde (2 koolstofatomen) met behulp van het enzym pyruvaatdecarboxylase. Aceetalde-
glyceraldehyde-3-fosfaat
ethanol NAD NADH
1,3-difosfoglyceraat ADP ATP
3-fosfoglyceraat 2-fosfoglyceraat fosfoenolpyruvaat
CO2
ADP ATP
aceetaldehyde
pyruvaat
hyde kan vervolgens gebruikt worden om NAD terug te winnen uit NADH. Dit gebeurt in een reactie waarin het enzym alcoholdehydrogenase de 2 elektronen van NADH gebruikt om aceetaldehyde om te zetten in ethanol. Het NAD dat hierbij ontstaat, is dus weer beschikbaar voor de glycolyse. Dit maakt een voortgaande productie van ATP mogelijk. Alcoholische gisting komt niet alleen voor in gistcellen. Ook andere organismen, waaronder bacteriën, planten en dieren maken onder bepaalde omstandigheden gebruik van alcoholische gisting om ATP te maken. In deze organismen treedt alcoholvorming vooral op wanneer ademhaling, de andere wijze om NAD terug te winnen, niet mogelijk is. Een sprekend voorbeeld is de productie van ethanol door karperachtige vissen om te kunnen overleven bij lage zuurstofconcentraties, bijvoorbeeld tijdens langdurige vorst, wanneer de zuurstofconcentratie in dichtgevroren oppervlaktewateren sterk daalt. Onze spiercellen kunnen 21
DE NEUBERG-FERMENTATIE
Glycerolproductie via de Neuberg-fermentatie. Aceetaldehyde wordt weggevangen met sulfiet, waardoor NAHD niet meer via alcoholvorming uit aceetaldehyde gereoxideerd kan worden. In plaats hiervan wordt glycerol via een andere weg gevormd uit dihydroxyacetonfosfaat.
De Duitse wetenschapper Neuberg leverde tussen 1910 en 1920 enkele belangrijke bijdragen aan de opheldering van de glycolyse in gistcellen. Hij was de eerste die vaststelde dat de stoffen glucose pyruvaat en aceetaldehyde tussenproducten zijn 2ATP van de alcoholproductie door gistcellen. Tijdens 2ADP zijn onderzoek aan alcoholische gisting vond Neuberg dat toevoeging van sulfiet aan gistcultures leidde tot de ophoping van de stof glycerol, ook wel glycerine genoemd. Gistcellen produceren van nature al glycerol. Dit is goed zichtbaar wanneer men dihydroxyacetonfosfaat glyceraldehyde-3-fosfaat wijn langs de wand van een glas laat glijden: de langzaam teruglopende vloeistoffilm is het gevolg van de aanwezigheid van glycerol. Na toevoeging NADH van sulfiet kunnen gistcellen zelfs zo’n 30 tot 35 2ATP procent van de suiker in glycerol omgezetten. NAD 2ADP Het onderzoek van Neuberg was niet alleen van wetenschappelijk belang. Tijdens de Eerste Wereldoorpyruvaat log ontstond in Duitsland een tekort aan glycerol als glycerol-3-fosfaat grondstof voor de productie van de springstof nitroglyceaceetaldehyde rine. Neuberg’s sulfietproces is in deze periode op grote Pi Na SO schaal ingezet voor de industriële productie van glycerol. 2 3 Aldus maakten gisten na millennia van vreedzame toepasglycerol sing bij de bereiding van bier, wijn en brood hun debuut in de CH CH O-SO Na 3 2 3 oorlogsindustrie. Van wetenschappelijk belang was dat door Neuberg voor het eerst bewezen werd, dat de stofwisseling van een micro-organisme aangepast kan worden ten behoeve van de industriële productie van een specifieke chemische verbinding (in het Engels “metabolic pathway engineering” genoemd). Deze tak van industriële microbiologie maakt aan het einde van de 20e eeuw een explosieve groei door. Dit is te danken aan de recombinant DNA-technologie, die het mogelijk maakt om zeer gericht veranderingen aan te brengen in de enzymen die bij de stofwisseling van gisten en andere micro-organismen werkzaam zijn.
22
eveneens een gisting uitvoeren. Hierbij wordt uit pyruvaat echter geen ethanol, maar melkzuur geproduceerd. Dit leidt tot “verzuring” van de spieren, wanneer bij hevige inspanning aan de ATP-behoefte van spiercellen niet langer kan worden voldaan via de ademhaling. Ademhaling Net als de cellen van mensen, dieren en planten bevatten gistcellen mitochondriën . Dit zijn door membranen omgeven compartimenten in een levende cel die een sleutelrol spelen in de ademhaling. Mitochondriën kunnen het NADH dat tijdens de glycolyse gevormd wordt, weer omzetten tot NAD. Hierbij wordt zuurstof gebruikt om de elektronen aan af te geven, zodat dit proces alleen in aanwezigheid van zuurstof kan optreden. Wanneer mitochondriën voor NAD zorgen, hoeft de gistcel pyruvaat niet meer om te zetten in ethanol. Dit maakt het voor de cel mogelijk om pyruvaat volledig te verbranden tot kooldioxide. Deze verbranding van pyruvaat in aanwezigheid van zuurstof vindt plaats in de mitochondriën via de reacties van de citroenzuurcyclus. De elektronen die hierbij vrijkomen worden, net als die uit de glycolyse, via NADH (en de verwante verbinding FADH) overgedragen op zuurstof. De volledige omzetting van suikers tot kooldioxide en water die bij de ademhaling in de mitochondriën optreedt, levert veel meer ATP op dan de alcoholische gisting. Dit komt doordat de mitochondriën in staat zijn bij het oxideren van NADH een elektrisch spanningsveld over hun membraan aan te leggen, waardoor een speciaal enzym in het membraan ATP kan maken. Zoals eerder vermeld, levert de alcoholische gisting per molecuul glucose 2 moleculen ATP op. Afhankelijk van de gistsoort kan een volledige verbranding van een molecuul glucose wel 16 tot 36 ATP moleculen opleveren. Het is daarom niet verrassend dat de hoeveelheid gistcellen bij
een bepaalde hoeveelheid glucose (biomassa-opbrengst ) veel groter is in ademhalende gistcultures dan in culturen die een alcoholische gisting uitvoeren. Een duidelijk voorbeeld hiervan is bakkersgist. De biomassa-opbrengst in cultures van de gistsoort S. cerevisiae die alleen ademhaling vertonen - en geen alcoholische gisting - bedraagt ongeveer een halve kilogram droge gistcellen per kilogram glucose. In afwezigheid van zuurstof is ademhaling niet mogelijk, maar wel alcoholische gisting waardoor de opbrengst daalt tot slechts eentiende kilogram droge gistcellen per kilogram glucose. De verdeling van suikers over alcoholische gisting en ademhaling is van cruciaal belang voor de industriële toepassingen van gisten. Wanneer het de bedoeling is om gistcellen te vermeerderen zoals in de bakkersgistproductie of bij het gebruik van genetisch gemodificeerde gisten voor de productie van farmaceutische eiwitten, moet alcoholische gisting zoveel mogelijk worden vermeden. Wanneer het echter om de productie van alcohol gaat, bijvoorbeeld bij het brouwen van bier of bij de productie van alcohol als alternatieve brandstof, moeten gistcellen zich niet vermeerderen, maar zoveel mogelijk suikers via de alcoholische gisting verwerken. Effect van zuurstof op de suikerstofwisseling De aan- of afwezigheid van zuurstof is dus een belangrijke factor bij de regeling van alcoholische gisting en ademhaling. Immers, als zuurstof niet in voldoende mate beschikbaar is, is ademhaling niet mogelijk en kunnen gisten alleen in hun behoefte aan energie voorzien door alcoholische fermentatie. De meeste van de ongeveer zevenhonderd bekende gistsoorten zijn zowel in staat tot ademhaling als tot alcoholische fermentatie. In principe zijn ze dus niet afhankelijk van de aanwezigheid van zuurstof voor het maken van ATP. Toch is er maar één gist bekend die snel kan groeien 23
ETHANOL EN KOOLDIOXIDE
De beide producten van de alcoholische gisting, ethanol en kooldioxide, spelen een belangrijke rol bij de “klassieke” toepassingen van gisten: het maken van alcoholische dranken en het rijzen van brooddeeg. Bij het rijzen van brooddeeg is het gas kooldioxide het belangrijkste gistingsproduct. Omdat de vorming van kooldioxide en ethanol onlosmakelijk met elkaar verbonden zijn, wordt in brooddeeg een behoorlijke hoeveelheid ethanol geproduceerd. Ondanks de term “brooddronken” beïnvloedt het eten van een boterham niet de rijvaardigheid: het in het deeg gevormde ethanol verdampt tijdens het bakken van het brood. Ook het omgekeerde gaat op: bij het vergisten van suikers tijdens de bereiding van alcoholische dranken ontstaan grote hoeveelheden kooldioxide. Bijvoorbeeld bij de productie van een liter wijn (12 procent alcohol op volumebasis) komt zo’n 50 liter kooldioxide vrij. De Nederlandse overheid streeft ernaar om, vanwege mogelijke effecten van kooldioxide op het klimaat, de kooldioxide-uitstoot te beperken. Toch wordt geen kooldioxideheffing op wijnen bierconsumptie overwogen. Men moet zich hierbij realiseren dat kooldioxide dat vrijkomt bij bier- en wijngistingen afkomstig is van plantaardig materiaal (gerst of druiven). Zolang de consumptie op peil blijft, wordt elk jaar het vrijgekomen kooldioxide weer door planten via de fotosynthese vastgelegd in een nieuwe oogst. Hetzelfde principe ligt ten grondslag aan de toepassing van bio-ethanol als alternatieve brandstof. Wanneer deze ethanol door gisten uit suikers van landbouwgewassen wordt geproduceerd, zal verbranding in bijvoorbeeld automotoren niet leiden tot een toename van de kooldioxideconcentratie in de atmosfeer.
YOU CAN’T HAVE ONE WITHOUT THE OTHER 24
(verdubbelingstijd van ongeveer twee uur) in de volledige afwezigheid van zuurstof. Deze uitzondering is de gistsoort S. cerevisiae. Het vermogen om zich in een volledig zuurstofloze omgeving te kunnen handhaven verklaart waarschijnlijk mede waarom stammen van deze gist ook in spontane wijnfermentaties de overhand krijgen; als andere gisten de zuurstof hebben opgebruikt, kan S. cerevisiae nog stevig doorgroeien. De meeste niet-Saccharomyces gisten hebben slechts spoortjes zuurstof nodig om snel te kunnen groeien, omdat hun behoefte aan ATP vrijwel volledig wordt gedekt door alcoholische fermentatie. Waarschijnlijk hebben deze gisten een minimale hoeveelheid zuurstof nodig als een soort “vitamine” voor de aanmaak van bepaalde bestanddelen van hun cellen. Gezien de hogere opbrengst aan ATP van de ademhaling lijkt de verwachting gerechtvaardigd, dat gisten in aanwezigheid van voldoende zuurstof geen alcoholische fermentatie zullen vertonen. Inderdaad zijn er veel gisten die alleen onder zuurstofbeperkende omstandigheden overgaan tot alcoholische gisting. Er zijn echter enkele belangrijke uitzonderingen op deze regel. Bepaalde gistsoorten, waaronder S. cerevisiae, maken ook in aanwezigheid van zuurstof ethanol. De gist S. cerevisiae doet dit bij hoge suikerconcentraties en bij hoge groeisnelheden. Blijkbaar kunnen de mitochondriën onder deze condities NADH en pyruvaat uit de glycolyse niet voldoende snel verademen en schakelt de gist gedeeltelijk over op alcoholische gisting om in zijn behoefte aan energie te voorzien. Dit fenomeen wordt wel het Crabtree-effect genoemd, naar een Engelse wetenschapper die in de jaren twintig onderzoek deed naar melkzuurfermentatie door tumorcellen van de mens. Het Crabtree-effect heeft een belangrijke rol gespeeld bij de ontwikkeling van de technologie voor het op industriële schaal kweken van gisten.
GROEIEN OP METHANOL
Uitdagingen in het onderzoek van de giststofwisseling Al meer dan een eeuw wordt de suikerstofwisseling van gisten bestudeerd, in het bijzonder die van de gistsoort S. cerevisiae. Deze gist blijft een interessant studieobject, zoals de volgende twee voorbeelden laten zien. In de jaren tachtig werden in sneltreinvaart de genen geïdentificeerd die coderen voor de enzymen van de glycolyse. Er bestond destijds de verwachting dat dit snel zou leiden tot genetisch gemodificeerde gisten met een verhoogde glycolyse-snelheid. Zo’n verandering zou onder andere gebruikt kunnen worden voor het maken van bakkersgist met een een verhoogde rijskracht in brooddeeg. Inmiddels zijn tientallen gisten genetisch gemodificeerd, waardoor de concentraties van (combinaties van) glycolytische enzymen sterk zijn verhoogd. Geen van deze stammen vertoonde echter de gewenste toename in glycolyse-snelheid. Hoewel deze experimenten uit toegepast oogpunt, mild gezegd, geen doorslaand succes waren, hebben ze het inzicht in de regeling van de stofwisseling in gistcellen en andere levende cellen sterk vergroot. Nu weet men dat de snelheid van een biologische omzetting vrijwel nooit verhoogd kan worden door het simpelweg veranderen van een enkel enzym in de betreffende stofwisselingsroute. Mede om deze reden wordt op het moment veel onderzoek verricht aan de complexe regelmechanismen die de glycolyse en andere stofwisselingsroutes in S. cerevisiae controleren. De vraag welke eigenschappen S. cerevisiae in staat stellen om in de volledige afwezigheid van zuurstof te groeien, is nog niet afdoende beantwoord. Deze vraag is niet alleen van wetenschappelijk belang. Er bestaat nog steeds veel belangstelling voor het gebruik van gisten voor de productie van “bio-ethanol” uit landbouwgewassen (zie verder pagina 31). Zo blijft er nog veel te ontdekken, vooral nu het genoom van S. cerevisiae ontrafeld is.
De verscheidenheid aan stofwisselingsrouten in gisten is minder groot dan in bacteriën. Toch kunnen sommige gisten behalve suikers ook andere organische verbindingen gebruiken. Een voorbeeld hiervan is het gebruik van methanol door de zogenaamde methylotrofe gisten, onder andere Hansenula polymorpha en Pichia pastoris. Methanol kan gemakkelijk geproduceerd worden uit aardgas. In de jaren ’60 en ’70 was de aardgasprijs laag en werd een groot tekort aan eiwit voor menselijke en dierlijke consumptie voorzien. Daardoor ging men intensief onderzoek doen aan de methanolstofwisseling in methylotrofe gisten. De eerste stap in de methanolstofwisseling bleek te bestaan uit de oxidatie van methanol tot formaldehyde (“spaanplaatgas”). Het hiervoor verantwoordelijke enzym, methanoloxidase, bleek in enorme hoeveelheden in gistcellen voor te komen. In cellen die men methanol als voedingsstof gaf, zaten zelfs kubusvormige kristallen van dit enzym. De noodzaak voor productie van eiwit uit methanol door gist is inmiddels achterhaald door een verhoogde eiwitproductie in de landbouw en de gestegen aardgasprijzen. De opgebouwde kennis over de productie van methanol-oxidase wordt echter op grote schaal toegepast voor het maken van bijvoorbeeld farmaceutische eiwitten door genetisch gemodificeerde methylotrofe gisten (zie ook pagina 36).
25
Model van een bierbrouwerij (grafgift, hout, 12e dynastie, ca. 1900 voor Christus, Egypte). Bier werd gemaakt door gebakken broden te verkruimelen en met water te vermengen tot een brei, waarin enzymen en gisten hun werk konden doen. (Foto: © Rijksmuseum van Oudheden, Leiden)
26
4
Gist als producent van alcohol en kooldioxide
W.A. SCHEFFERS
W. A. Scheffers studeerde scheikunde (hoofdvak microbiologie) aan de Technische Universiteit Delft. Van 1957 tot 1990 was hij werkzaam bij het laboratorium voor Microbiologie van die universiteit, sinds 1982 als universitair hoofddocent. Zijn onderwijs betrof, naast de algemene microbiologie, vooral de microbiologie van levensmiddelen, drink- en afvalwater. Van zijn ruim honderd publicaties hebben de meeste betrekking op de fysiologie van gisten. Een octrooi op de vergisting van houtsuiker staat mede op zijn naam. Hij vervulde diverse bestuursfuncties, zoals het secretariaat van de Nederlandse Biotechnologische Vereniging. Hij is nauw betrokken bij de organisatie van internationale symposia, onder andere het gistsymposium: “The Rising Power of Yeast in Science and Industry, augustus 2000”.
In het Egypte van de farao’s waren bier en brood zo belangrijk, dat men deze voedingsmiddelen aan de gestorvenen meegaf voor het leven na de dood. Sommigen kregen als grafgift een model mee van een bakkerij of brouwerij (zie de pagina hiernaast). Het vorige hoofdstuk liet zien dat zowel het rijzen van het brooddeeg als de alcoholische gisting bij de productie van bier en wijn berusten op de omzetting van suikers in ethanol en kooldioxide. Sinds men dit te weten kwam, probeert men deze omzettingsprocessen bij te sturen om nog betere producten tegen lagere kosten te verkrijgen. Kennis van de fysiologie van gisten speelt daarbij een grote rol, zoals de voorbeelden in dit hoofdstuk laten zien. Brood Eeuwenlang was de bereiding van voedsel een kwestie van ervaring. Ook het bakken van broden. Van een goed gerezen deeg hield men een portie apart om als ent te dienen voor een volgende ronde. Daarbij ontstond een mengelmoes van micro-organismen met vooral gisten en melkzuurbacteriën. De vorming van melkzuur gaf het brood een zurig karakter. Ook nu nog wordt op ruime schaal gebruik gemaakt van zo’n mengsel (zuurdesem) om bepaalde broodsoorten te bereiden. Door een ongecontroleerde ontwikkeling van de gisten kunnen echter minder gewenste resultaten optreden, zoals een te veel of te weinig rijzen van deeg. Toen men meer te weten kwam over micro-organismen en het kweken ervan, ging men gebruik maken van zg. “reinculturen”; door selectie van gisten kreeg men een constanter product. De industrieel bereide bakkersgist behoort tot de soort Saccharomyces cerevisiae. Deze gist wordt gekweekt in een apparaat (fermentor), dat een suikerhoudende vloeistof bevat waar lucht doorheen wordt geblazen. Door deze aerobe omstandigheden wordt een gunstig rendement aan energie en celgroei behaald, althans 27
Tekening van een bierbrouwerij (folder, papier, tweede helft van de 20e eeuw na Christus, Nederland).
28
zolang de suikers worden omgezet via de ademhaling. Voorwaarde is dan echter dat de suikerconcentratie zo laag blijft, dat het Crabtree effect niet optreedt (zie pagina 24). Want bij de aerobe gisting wordt een deel van de suikers omgezet in alcohol. Bij het kweken van gist is alcohol een ongewenst product, omdat er minder energie beschikbaar komt voor de aanmaak van nieuwe gistcellen. Om vermindering van de gistopbrengst te voorkomen wordt een zg. “fed-batch” kweekmethode toegepast, waarbij de suiker gedoseerd wordt toegevoerd; de suikertoevoer wordt aangepast aan de toename van de gistcellen. Omdat bij de ademhaling (omzetting van suiker in kooldioxide en water) ook flink wat warmte vrijkomt, moet de fermentor bovendien worden gekoeld. Voor een grootschalige vermeerdering van gist moeten diverse condities, zoals suikerconcentratie, luchtdoorvoer en koeling, goed op elkaar zijn afgestemd. De gist die is gegroeid onder aerobe omstandigheden, moet vervolgens in het deeg onder de daar intredende anaerobe omstandigheden een krachtig gistingsproces op gang brengen, waarna de vorming van kooldioxide het deeg snel doet rijzen. Dit stelt eisen aan het reguleringsvermogen van het organisme. Door voortdurende selectie en mutatie kreeg men een grote variatie aan stammen van de gist S. cerevisiae met gewenste eigenschappen. Een voorbeeld daarvan is de houdbaarheid van gistcellen in gedroogde vorm, zg. actieve droge gist. Na een speciaal droogproces kan deze gist zelfs geruime tijd worden opgeslagen om te zijner tijd pas na vochtopname in deeg weer tot snelle ontwikkeling en gisting te komen. Om de bakker zijn nachtrust te gunnen kan de industrie tegenwoordig bevroren deeg leveren waarin de gist is mee bevroren. Als de oven ‘s nachts door een schakelklok in werking treedt, moeten ook de gistcellen aan de slag, zodat ‘s morgens de inmiddels ontwaakte bakker zijn verse stokbrood kant en klaar aantreft. Hiervoor moest men stressbestendige giststammen ontwikkelen en de kweekmethode aanpassen. Bier Voor de bierbereiding gebruikt men gerst als voedingsbron voor gist. Een gistcel kan echter het zetmeel in gerst niet omzetten in alcohol. Daarom moet de gerst eerst ontkiemen, waarbij het enzym amylase zorgt voor de splitsing van zetmeel in suikers, zoals maltose en glucose,
die de gist wel kan omzetten. Na enige tijd wordt door verhitting van de gekiemde gerst de amylase geïnactiveerd en de gewenste mate van caramelvorming bereikt die aan de ontstane mout, en later aan het bier, een bruine kleur geeft. De mout wordt met water aangemaakt tot wort, die behalve suikers ook de nodige stikstofverbindingen en mineralen uit de mout bevat en waaraan hop als smaakbepaler is toegevoegd. Dit mengsel vormt de basis voor het brouwproces. Brouwerijen houden zorgvuldig hun bedrijfsgist (speciale stammen van de gistsoort S. cerevisiae) in ere om het gewenste karakteristieke bier te produceren. Tijdens de vergisting ontstaan namelijk niet alleen ethanol en kooldioxide (beide vanouds essentieel voor het bier), maar ook allerhande bijproducten die aan bier een al dan niet gewenste smaak verlenen. Diacetyl (2,3 butaandion) bijvoorbeeld, met het aroma van boter, heeft reeds in lage concentratie invloed op de smaak van het pas gebrouwen bier. Wanneer de gist tijdens de lagering echter lang genoeg in contact blijft met het bier, wordt deze smaakbederver door gistenzymen afgebroken tot minder waarneembare verbindingen, zoals bijvoorbeeld 2,3-butaandiol. Dimethylsulfide, in concentraties lager dan 0,1 milligram per liter, levert een bijdrage aan de karakteristieke smaak van sommige bieren. Als belangrijke aromacomponenten treden in bier ook esters op, zoals ethylacetaat en iso-amylacetaat. Een bijzonder geval is het geuzebier (lambiek) uit de omgeving van Brussel. Dit werd traditioneel niet gebrouwen met een reincultuur, maar verliep volgens een ‘wilde’ gisting. Daarbij daalden bacteriën en gisten uit de lucht in de wort, die behalve alcohol ook melkzuur en azijnzuur maken. Door enzymen in de gist Brettanomyces kunnen deze zuren aan ethanol worden gekoppeld, waarbij esters ontstaan zoals ethyllactaat en ethylacetaat. Het risico van zo’n wilde gisting is dat ook ongewenste bacteriën uit de lucht komen vallen, die zwavelwaterstof (rottingsgeur) of boterzuur (ranzige smaak) maken. Stoffen, die reeds in zeer kleine hoeveelheden de smaak van bier bederven. Als men gist in de kou zet, ontstaat “alcoholvrij” bier met minder dan 1 procent alcohol. Door de wort bij 1 graad Celsius te vergisten, krijgt men echter niet alleen weinig alcohol, maar ook weinig aromastoffen. Bovendien blijft in het bier de onaangename smaak merkbaar van methional, een verbinding uit de wort die tijdens de biergisting bij 29
normale temperatuur (8-14 graden Celsius) zou zijn afgebroken. Tenslotte moet een goede biergist het vermogen hebben om aan het eind van het brouwproces te flocculeren (de gistcellen hechten zich aan elkaar en bezinken samen, zodat men ze makkelijk van de vloeistof kan scheiden). De overtollig geworden gist, met hopsmaak, kan worden verwerkt in veevoer of in biergisttabletten. Bij de alcoholische gisting ontstaat per kilogram ethanol tevens 0,95 kilogram kooldioxide. Dit gas kan in een gesloten productiesysteem voor ongeveer 75 procent worden teruggewonnen om later bij het gepasteuriseerde bier in de fles te worden teruggeperst. Het kan ook worden gebruikt voor de productie van andere koolzuurhoudende dranken of als brandblusmiddel worden toegepast. Wijn en andere alcoholische dranken Rijpe vruchten zijn rijk aan suikers en vormen een natuurlijke bron voor een uitbundige groei van gisten. Dat daarbij alcohol ontstaat, kon mens en dier niet ontgaan. Bekend zijn de verhalen over dronkenschap van olifanten en apen na het eten van gegiste vruchten. Overal ter wereld hebben mensen de bedwelmende werking van vergiste vruchtensappen ontdekt. Met gebruik van de ter plaatse voorkomende vruchten hebben volkeren op traditionele wijze hun eigen wijn gemaakt voor feesten en religieuze plechtigheden. Bovendien waren de vergiste producten langer houdbaar, omdat hogere alcoholconcentraties een conserverende werking hebben. In de tweede helft van de negentiende eeuw, vooral door het werk van Pasteur, werd het micro-organisme gist als de producent van alcohol ontdekt. Sindsdien kon men naast ervaring een wetenschappelijke benadering toepassen. Aan de vergisting van druivenmost bleken verschillende gistsoorten een bijdrage te leveren. Daarbij vertonen sommige soorten een “killer”-vermogen: ze scheiden een eiwit uit dat de celmembraan van andere, gevoelige gisten aantast waardoor deze gisten worden verdrongen. De kwaliteit van de wijn kan sterk variëren, afhankelijk van de druivensoort, de bodemsamenstelling en de ligging van de wijngaard, het weer tijdens de rijpingsperiode van de druiven, en de gistflora. Door uit geslaagde fermentaties de voornaamste gist te isoleren en die te gebruiken als ent 30
voor volgende kuipen kan een betere en meer constante kwaliteit worden bereikt. Een verdere ontwikkeling leidt tot het fabrieksmatig, op grote schaal opkweken van de favoriete gist. Die kan vervolgens als “actieve droge gist” worden verpakt, vervoerd en opgeslagen. Nog meer dan bij bier wordt de kwaliteit van wijn in hoge mate bepaald door de aanwezigheid van kenmerkende aromastoffen en hun concentraties. Deels zijn die bepaald door de druif, de wijngaard en het weer. Daarnaast levert de giststofwisseling een complex van alcoholen, zuren, esters, aldehyden, terpenen, zwavelverbindingen en andere stoffen, die reeds in concentraties van enkele milligrammen per liter (of nog lager) hun bijdrage aan het geurige bouquet leveren, maar ook tot ongewenste smaakafwijkingen kunnen leiden. De vorming van zwavelwaterstof bijvoorbeeld is niet alleen afhankelijk van de gistsoort, maar ook van de samenstelling van de most. Gist kan ook helpen wijn te verbeteren. Na een koud, weinig zonnig seizoen zijn de druiven te zuur om er wijn van goede kwaliteit van te maken. Verbetering van de kwaliteit krijgt men door de gist Schizosaccharomyces pombe toe te voegen die appelzuur omzet in ethanol en kooldioxide. Ook melkzuurbacteriën die appelzuur omzetten in het minder zure melkzuur kunnen een bijdrage leveren aan de verbetering van de kwaliteit. Een aparte vermelding verdient de Spaanse sherry. Deze wijn wordt, na toevoeging van extra alcohol, in halfgevulde vaten opgeslagen waarbij zich op het vloeistofoppervlak een deklaag vormt van “flor”gisten. In contact met de lucht zetten deze een deel van de ethanol om in aceetaldehyde dat het karakteristieke aroma mede bepaalt. Afhankelijk van de beschikbare gewassen is wereldwijd een bonte verscheidenheid aan alcoholische dranken beschikbaar. Cider wordt uit appels bereid. In Japan wordt saké gemaakt door eerst rijstzetmeel af te breken met schimmelenzymen en vervolgens de suikers te vergisten. Daarbij wordt een krachtige vorming van ethylacetaat in de rijstwijn zeer gewaardeerd, terwijl ook appelzuur en barnsteenzuur een rol spelen. Veel alcoholische dranken worden verkregen door destillatie. Enkele bekende voorbeelden zijn cognac uit druivenwijn; slivowitsj uit pruimenwijn; whisky, wodka en jenever uit granen na splitsing van zetmeel en vergisting. Elke
Wereldproductie in 1998 • bier: 133.000.000.000 liter • wijn: 24.000.000.000 liter (waarvan Frankrijk en Italië samen de helft) • gedestilleerd: 180.000.000.000 liter • bio-ethanol (motorbrandstof): meer dan 10.000.000.000 liter • bakkersgist: 2.000.000.000 kilogram
drank heeft zijn eigen karakteristieke aroma op grond van een speciale, vaak geheime, bereidingswijze. Ook zuivel laat zich vergisten. Het zure alcoholische zuivelproduct kefir ontstaat door de gezamenlijke activiteit van gisten en melkzuurbacteriën in melk. De bacteriën vormen uit melksuiker een ‘suikernetwerk’ dat gisten en bacteriën samenpakt in bloemkoolachtige structuren die kunnen worden doorgeënt. De gisten maken enkele procenten alcohol en de bacteriën melkzuur, terwijl ze elkaar waarschijnlijk van dienst zijn door de uitwisseling van vitamines of andere voedselbestanddelen (symbiose). Andere toepassingen van alcohol Ethanol wordt niet alleen gebruikt in de vorm van alcoholische dranken. Er is vanouds een belangrijke toepassing als oplosmiddel, bijvoorbeeld in de parfumindustrie. Voor dergelijke toepassingen kan men met de huidige petrochemische processen ethanol op grote schaal uit aardolie maken. Voor consumptiedoeleinden mag men echter alleen gistingsalcohol gebruiken. Vervalsing is in beginsel op te sporen door bepaling van de verhouding van koolstofisotopen in een alcoholmonster: die verhouding is anders in de fossiele aardolie dan in de recent ontstane “groene” grondstoffen. Zo mag natuurazijn, in tegenstelling tot huishoudazijn voor schoonmaakdoeleinden, slechts met azijnbacteriën worden bereid uit alcohol die geproduceerd is door gisten. Vooral toen de olieprijzen hoog waren, ontstond veel belangstelling voor de toepassing van ethanol als motorbrandstof. Als groene grondstof voor de alcoholproductie kan men gebruik maken van mais-zetmeel, suikerriet of houtsuiker. Het voordeel van houtsuiker (xylose) is dat het geen eetbare grondstof is, maar een afvalstof van de productie van cellulose en papier. De daarbij vrijkomende stroom sulfietafvalloog geeft ernstige problemen bij lozing op rivieren en meren. De kosten van afvalwaterzuivering drukken zwaar op de productiekosten en een alternatief,
bijvoorbeeld vergisting, is dus welkom. De gist S. cerevisiae kan echter alleen een beperkt aantal suikers vergisten; xylose behoort daar niet toe. Slechts enkele andere gistsoorten zijn in staat de suiker xylose in ethanol om te zetten. Helaas worden deze gisten sterk geremd door azijnzuur, furfural en andere verbindingen in de afvalloog; ze halen hoogstens een alcoholconcentratie van omstreeks 3 procent, zodat de kosten van de destillatie voor de alcoholwinning onaanvaardbaar hoog worden. Hoewel intensief onderzoek enkele xylose-fermenterende gistsoorten heeft opgeleverd, kan geen van deze soorten in afwezigheid van zuurstof groeien. Vanwege de hoge kosten is toevoeging van kleine hoeveelheden zuurstof tijdens dit soort fermentatieprocessen niet haalbaar. Wanneer de genen bekend zijn die de gist S. cerevisiae in staat stellen zonder zuurstof te groeien, kunnen deze genen met behulp van de recombinant DNA-technologie worden overgebracht in xylose-fermenterende gisten. Nu is vooral in Brazilië en de Verenigde Staten op grote schaal bio-ethanol in gebruik als motorbrandstof. Over het voordeel van bio-ethanol boven fossiele brandstoffen lopen de meningen uiteen. De onzekerheid zit vooral in de energiekosten die zijn gemoeid met het kweken, oogsten, transporteren en verwerken van de groene grondstof. Naast het streven naar vermindering van het broeikaseffect kunnen nationale overwegingen een rol spelen, zoals onafhankelijkheid van olieleverende landen, de aanwezigheid van dollarreserves of werkverschaffing in de agrarische sector. Onbetwist is de grote betekenis van hernieuwbare energiebronnen voor de toekomst als de fossiele brandstoffen op raken. Gisten kunnen dan goed van pas komen.
Literatuur: De Keukeleire, D., Chemie onder de schuimkraag. Natuur en Techniek 1990; 58 , 3: 228 - 239. 31
32
5
Gisten als producenten van eiwitten
A.J.J. VAN OOYEN
Een vriesetch replica van een op methanol gekweekte gistcel (Hansenula polymorpha), waarin een afdruk van het breukvlak door de cel zichtbaar is. Duidelijk is de aanwezigheid van grote, kubusvormige peroxisomen (P). Mitochondrion (M); kern (N); vacuole (V).
A.J.J. van Ooyen studeerde planteziektenkunde aan de Landbouwuniversiteit Wageningen. In 1976 promoveerde hij aan de Rijksuniversiteit Groningen op een genetisch onderwerp, waarna hij vier jaar aan de universiteit van Zürich werkte. Na zijn terugkeer in Nederland trad hij in dienst van het Nederlands Kanker Instituut in Amsterdam. Sinds 1984 werkt hij bij Gist-brocades (nu DSM) in Delft, waar hij genetisch onderzoek doet. In 1992 werd hij benoemd tot bijzonder hoogleraar in de Genetische Technieken in de Levensmiddelentechnologie aan de Wageningen Universiteit.
Gist is vooral bekend als een hulpmiddel bij de bereiding van brood. Ik kan dit illustreren met een anekdote. Als je in de Verenigde Staten op het vliegveld het land binnen komt voor zaken (business), is een standaardvraag “What business are you in, sir?”. Vroeger zei ik altijd “Enzymes”. Dat leidde vaak tot moeilijke discussies over wat enzymen zijn en welke zaken je dan wel niet doet. Tegenwoordig zeg ik altijd “Yeast”. De douaneambtenaar kijkt dan even nadenkend en zegt: “The thing you put in bread, sir?”. Dan zeg ik “yes” en kan vervolgens meteen doorlopen. De voornaamste taak van gist in brood is het produceren van kooldioxide, waardoor de luchtigheid van het brood ontstaat. Dit zou ook op andere manieren kunnen, maar aangezien gist ook bijdraagt aan de smaak van brood, is dit organisme niet zo gemakkelijk te vervangen. De traditionele gisten zijn allemaal Saccharomyces soorten. Met de opkomst van de recombinant DNA-technologie is de aandacht evenwel steeds meer verschoven naar andere gistsoorten, omdat deze voor bepaalde toepassingen beter bleken te functioneren dan de Saccharomyces gisten. Die gisten worden ook wel niet-conventionele gisten genoemd. Een groot deel van dit hoofdstuk zal aan voorbeelden van deze gisten gewijd zijn en aan de vraag waarom ze tegenwoordig zo sterk in de belangstelling staan. Gist ondervindt daarbij ook concurrentie van andere kandidaten voor de eiwitproductie (expressiesystemen, zie pagina 38). De successen van bakkersgist Bakkersgist (S. cerevisiae) was de eerste gist die toegankelijk is gemaakt voor genetische modificatie. Deze doorbraak is al in 1978 gerealiseerd door de Engelse onderzoekster Jean Beggs. Kort daarna toonden onderzoekers van het Amerikaanse bedrijf Genentech aan dat deze gist ook daadwerkelijk eiwitten van andere organismen kon maken en zelfs uitscheiden. Eén van de eerste eiwitten 33
aantal stabiele genkopieën
sterkte van de promotor
transport stabiliteit
regelsignalen codongebruik
stabiliteit transportsignalen uitscheidingssignaal
Niveau’s van genexpressie waarop de (biotechnologische) productie van een eiwit geregeld kan worden; mogelijke aangrijpingspunten voor genetische modificatie in kleur.
34
was het Hepatitis B oppervlakte antigen. Dit eiwit is later gebruikt voor de ontwikkeling van een vaccin. Voor genetische modificatie is het een groot voordeel dat de gist S. cerevisiae over een eigen plasmide - cirkelvormig DNA buiten de celkern - beschikt, dat in een groot aantal kopieën (hoog kopiegetal) in de gistcel voorkomt. Dit betekent dat de op het plasmide aanwezige genen in veelvoud aanwezig zijn, wat leidt tot meer boodschapperRNA; dit op zijn beurt geeft optimale vooruitzichten voor een hoge eiwitsynthese. Genetische modificatie van genen op een plasmide lukt alleen als het geproduceerde eiwit niet nadelig is voor de gistcel. Een voorbeeld daarvan is de productie van het enzym lysozym van de mens. Dit werd pas mogelijk, nadat voor het gen dat codeert voor lysozym een schakelaar werd geplaatst om de vorming van RNA en daarmee de eiwitsynthese uit te stellen. Het lysozym van de mens is namelijk nadelig voor de celwandgroei, waardoor men zonder schakelaar geen goede transformanten (cellen die het vreemde gen hebben opgenomen) kreeg. Een ander eiwit van de mens dat de gist S. cerevisiae met succes ging maken is het hormoon insuline. Momenteel is het merendeel van de insuline op de markt afkomstig van genetisch gemodificeerde micro-organismen, zij het de bacterie E. coli of de gist S. cerevisiae. Een bijzonder probleem voor de productie van insuline is dat het eerst in de vorm van een “voorlopermolecuul” gemaakt wordt, dat vervolgens nog geassembleerd moet worden tot het actieve molecuul. Voordat de recombinant DNA-technieken ter beschikking kwamen, werd insuline geïsoleerd uit de pancreas van varkens, waarna het varkenseiwit via een chemische reactie omgezet werd in mens-insuline. Het recombinant DNA-product uit gist heeft dezelfde eigenschappen als dat mens-insuline uit varkens, omdat de aminozuurvolgorde van de twee eiwitten exact dezelfde is. Toepassing van recombinant DNA-technologie op zich is vaak niet voldoende om een grote opbrengst van het gewenste eiwit te krijgen. De mogelijkheden om de op-
brengst te verhogen liggen, zoals reeds opgemerkt, vooral in het gericht inbrengen van een zo groot mogelijk aantal kopieën van een bepaald gen. Hierdoor wordt een maximale vorming van boodschapper-RNA tot stand gebracht en zijn de mogelijkheden voor een hoge eiwitproductie optimaal. Indien deze ingrepen niet genoeg opleveren, kan men teruggrijpen op klassieke stamverbeteringstechnieken. Via mutagenese met behulp van straling of chemicaliën en/of kruisingen tussen giststammen, wordt het DNA van de gist net zo lang ongericht veranderd tot men mutanten vindt die een verhoogde eiwitopbrengst geven. Er zijn studies waarin nagegaan is wat er tijdens de klassieke verbetering van giststammen veranderd is. Verrassenderwijs, of misschien ook juist niet, zijn dit vaak veranderingen, die men ook via de recombinant DNAtechnologie tot stand kan brengen. Via deze technologie poogt men de veranderingen in het DNA gericht aan te brengen. Men kan dat dus alleen met succes doen, als bekend is waar de knelpunten voor de eiwitsynthese liggen. Via mutagenese voert men ongericht veranderingen uit en moeten zeer veel mutanten gescreend worden. Eén van de eerste onderzoeken betrof de synthese van het enzym chymosine in de gist S. cerevisiae. De aanmaak van dit enzym in deze gist was vrij hoog, maar het eiwit hoopte zich binnen de cel op in een inactieve vorm. Toen heeft men via mutagenese zogenaamde supersecreting mutanten, die het enzym veel beter uitscheiden, in handen gekregen. Uit analyse bleek dat deze mutanten grotere hoeveelheden maakten van een eiwit dat betrokken is bij de uitscheiding van chymosine. In andere gevallen heeft men toch de vorming van boodschapper-RNA via ongerichte mutaties verder verhoogd ondanks een groot aantal kopieën van het gen in de gistcel. Ook heeft men een andere strategie bedacht: verlaging van de activiteit van eiwitsplitsende enzymen (proteasen), omdat deze enzymen de net gemaakte aminozuurketens weer afbreken; dit kunnen zij overal in de syntheseroute van een eiwit doen. Ook deze aanpak kan ertoe leiden dat de gistcel meer eiwit uitscheidt.
Opkomst van de niet-conventionele gisten Bakkersgist kreeg al spoedig concurrentie van andere gisten voor de synthese van soortsvreemde (heterologe) eiwitten. Dit is minder voor de hand liggend dan het op het eerste gezicht lijkt. Voor elke gist afzonderlijk moet namelijk weer een aparte moleculair-biologische “gereedschapskist” ontwikkeld worden. Deze bestaat met name uit een efficiënte methode om vreemd DNA de cel in te krijgen en het gewenste eiwit te laten maken (transformatiesysteem) en een aanpak om de cel dat eiwit eventueel te laten uitscheiden. Hoewel de mogelijkheden steeds verder toenemen, kost het vaak verscheidene jaren werk om een goed lopend transformatiesysteem voor een nieuwe kandidaat-gist te ontwikkelen. De problemen die daarbij kunnen optreden en de manieren om deze problemen op te lossen zijn op een rij gezet aan de hand van ervaringen met de gist Phaffia rhodozyma. Ook de octrooierende instanties erkennen deze problematiek. Het is daarom nog steeds mogelijk om een octrooi te krijgen als men er als eerste in slaagt met de vereiste inventiviteit en vasthoudendheid een bepaalde gist te transformeren. Momenteel wordt er door sommige organisaties verzet aangetekend tegen dit “octrooi op leven”, maar zonder een goed werkend octrooisysteem zal er veel minder onderzoeksinspanning door bedrijven geleverd worden. Een in tijd beperkte bescherming van de eigen vinding, gecombineerd met de verplichting erover te publiceren levert bedrijven de mogelijkheid hun investeringen terug te verdienen. Dit geeft anderen de mogelijkheid op de vinding voort te bouwen en op hun beurt weer octrooien aan te vragen, indien zij een volgende uitvinding doen.
• Kluyveromyces lactis Een van de eerste gisten die S. cerevisiae concurrentie aandeed, was de melkgist Kluyveromyces lactis. Onderzoekers van Gist-brocades (tegenwoordig DSM) en het Amerikaanse bedrijf Chiron vonden dat deze melkgist veel beter in staat was het enzym chymosine te maken dan S. cerevisiae. Het is niet helemaal duidelijk waarom dit zo is. Waarschijnlijk heeft het iets met de uitscheiding van het 35
eiwit te maken. Men zou kunnen zeggen dat K. lactis als producent van heterologe eiwitten door chymosine op de kaart is gezet. Deze gist staat bovendien bekend als zeer veilig. Chymosine is een eiwitsplitsend enzym dat gebruikt wordt voor het laten stremmen van melk tot kaas. In de zestiger jaren is melkgist nog als voedingssupplement gebruikt voor kleine kinderen tijdens de hongersnood in de provincie Biafra in Nigeria. In Europa is er inmiddels een enthousiaste en toegewijde groep onderzoekers die zich over deze gist ontfermd heeft.
• Pichia pastoris en Hansenula polymorpha Behalve voor de gist K. lactis kreeg men ook vrij snel belangstelling voor andere niet conventionele gisten zoals Pichia pastoris. Deze gist trok de aandacht van onderzoekers, omdat de gistcel in staat is grote hoeveelheden enzym op te slaan. De moleculair-biologische gereedschapskist voor deze gist is ontwikkeld door het Amerikaanse oliebedrijf Philips Petroleum ten koste van grote investeringen; dit bedrijf heeft echter besloten er niet mee door te gaan en de ontwikkelde technologie te verkopen. In het verleden hebben overigens verscheidene oliemaatschappijen geflirt met de biotechnologie, maar zij zijn er weer van terug gekomen; waarschijnlijk, omdat de technische problemen groter bleken dan gedacht en de winsten op zich lieten wachten. Hansenula polymorpha (zie ook pagina 55) is een andere niet-conventionele gist die ontwikkeld is voor de productie van heterologe eiwitten. In Duitsland richt het bedrijf Rhein Biotech zich volledig op de exploitatie van deze gist. Dit bedrijf doet vooral contractonderzoek, maar heeft inmiddels ook enkele 'joint-ventures' met bedrijven in ontwikkelingslanden om deze gist farmaceutische eiwitten te laten produceren. Een opsomming van het aantal eiwitten dat deze twee gisten met succes maken, beslaat inmiddels vele pagina’s en de eiwitopbrengsten lopen op tot meer dan vijftien gram per liter, wat verrassend hoog is voor gisten. Het gaat meestal om farmaceutische eiwitten die men zonder de recombinant DNA-technologie niet of moeilijk kan maken dan wel isoleren. Vervolgens is er nog een lange weg te gaan tussen het maken van een kleine hoeveelheid eiwit voor klinische studies en het op de markt brengen van een farmaceutisch product. Slechts weinig kandidaten halen daarbij de eindstreep. • Yarrowia lipolytica Vanwege de verwantschap tussen schimmels en gisten, 36
heeft men de aanmaak van schimmelenzymen in verschillende gisten bestudeerd. In deze studie werden Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe en Yarrowia lipolytica met elkaar vergeleken. Van deze gisten bleek S. cerevisiae de slechtste en Y. lipolytica de beste prestaties te leveren. De verschillen waren spectaculair; van ongeveer 4,5 keer beter in het slechtste geval tot honderden keren in het meest gunstige geval. Het zou evenwel te ver voeren om nu te concluderen dat Y. lipolytica de beste gist is voor de productie van allerlei heterologe eiwitten. Misschien is deze gist juist het meest geschikt voor het maken van schimmelenzymen, terwijl andere gisten in aanmerking komen als het om eiwitten van de mens gaat. Dit voorbeeld laat zien dat het lonend is om bij de ontwikkeling van een bepaald eiwit tot een commercieel product eerst goed na te denken over de keuze van de eiwitproducent. Punten die door moleculair-biologen ook nog wel eens over het hoofd worden gezien zijn ten eerste de condities waarbij men gist kweekt, omdat deze een groot effect op de opbrengst van de eiwitsynthese kunnen hebben, en ten tweede de keuze van de giststam. Binnen één soort kunnen stammen sterk verschillen in de opbrengst van hetzelfde eiwit.
• Phaffia rhodozyma en Cryptococcus curvatus In het voorafgaande is vooral de aanmaak van eiwitten door gisten besproken. Natuurlijk kunnen gisten nog een veelheid aan andere producten maken. Eiwitten zijn echter verreweg het gemakkelijkst te produceren met de recombinant DNA-technologie. Het is relatief eenvoudig hun synthese in een ander organisme te laten plaatsvinden; je hoeft maar één gen over te brengen. Het overbrengen naar een ander organisme van hele syntheseroutes met alle bijbehorende enzymen - bijvoorbeeld voor de productie van antibiotica - leidt vaak tot een lage opbrengst. Bij zulke stoffen is het dus beter om uit te gaan van een organisme dat het gewenste product al van nature maakt. Met behulp van de recombinant DNA-technologie kan men dan de hoeveelheid ervan verhogen of kan men proberen verwante producten te maken. Een voorbeeld hiervan is de aanmaak van (roodachtige) kleurstoffen zoals beta-caroteen (oranje) en astaxanthine (roze) door de gist Phaffia rhodozyma. Deze kleurstoffen worden nu nog via chemische synthese gemaakt, maar biotechnologische productie zou een goed alternatief kunnen zijn. Met behulp van de recombinant DNA-technologie zou de productie van deze stoffen ver-
Vergelijking van de traditionele gist S. cerevisiae met enige niet-conventionele gisten, die voor de biotechnologie van belang zijn. De lijst is lang niet volledig.
GIST
PRODUCTEN
EIGENSCHAPPEN
Saccharomyces cerevisiae
Insuline
GRAS organisme veilig
Kluyveromyces lactis
Chymosine Humaan Serum Albumine Interleukine
GRAS organisme veilig
Pichia pastoris
Farmaceutische eiwitten
hoge intracellulaire productie goede secretie
Hansenula polymorpha
Farmaceutische eiwitten
als Pichia hoog kopiegetal integratie van vreemd DNA
Yarrowia lypolitica
Schimmelenzymen
Phaffia rhodozyma
Astaxanthine en andere carotenoiden
produceert extracellulaire proteasen lage groeitemperatuur
Cryptococcus curvatus
Lipiden en vetzuren
hoogd kunnen worden of zouden vergelijkbare carotenen gemaakt kunnen worden. Inmiddels is deze gist daartoe genetisch gewijzigd en heeft men enkele genen geïsoleerd die bij de synthese van carotenen een rol spelen. Daardoor zijn de basisinstrumenten in handen om de verdere ontwikkeling ter hand te nemen. Een ander voorbeeld is de gist Cryptococcus curvatus die behoort tot een groep gisten die goed is in het maken van lipiden, verbindingen met vetzuurketens. Het ligt voor de hand om zo’n gist geschikt te maken voor de synthese van waardevolle vetten of vetzuren. Ook voor de uitvoering van dit idee is de ontwikkeling van een gereedschapskist op maat weer een vereiste. De producten die door beide gisten gemaakt worden, worden gezien als gezondheidsbevorderend en passen in de huidige trend naar een meer bewust omgaan met voedsel als mogelijkheid om ziekten te voorkomen. Daardoor stijgt de kans dat een bedrijf in jarenlang onderzoek wil investeren. Tot slot Gisten zijn interessante producenten van farmaceutische
nog geen goede genetische “gereedschapskist” ontwikkeld
eiwitten of producten voor de levensmiddelenindustrie. Er is evenwel veel concurrentie van andere expressiesystemen, zoals dierlijke cellijnen voor farmaceutische eiwitten en schimmels of bacteriën voor extracellulaire enzymen. Binnen de groep van gisten zelf zijn de niet-conventionele gisten sterk in opkomst, omdat zij voor bepaalde producten betere opbrengsten geven dan S. cerevisiae (zie ook de tabel hierboven). Indien genetische gemodificatie van het micro-organisme nog niet de gewenste opbrengst geeft, kan men besluiten ook kennis uit de klassieke microbiologie toe te passen. De droom van elke moleculair-bioloog zal het evenwel blijven om alle gewenste veranderingen gericht te kunnen uitvoeren.
Literatuur: Wery, J., e.a., Genetics of Non-Saccharomyces industrial Yeast. In: Demain, A.L., e.a., Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. American Society for Microbiology, 1999.
37
CONCURRERENDE EXPRESSIESYSTEMEN
Voor het tot expressie brengen van genen die coderen voor eiwitten is momenteel al een keur van expressiesystemen beschikbaar. Deze doen hun werk het best als er onder gecontroleerde condities in grote fermentoren gekweekt wordt. In de tabel hiernaast staan enkele expressiesystemen vermeld met hun voor- en nadelen. Het overzicht is beperkt tot in fermentoren gekweekte systemen en laat transgene planten en dieren dus buiten beschouwing. Dit is voor de gedachtenvorming ook niet zo belangrijk, omdat ook zonder deze twee groepen er al genoeg concurrentie voor gist is. Voor farmaceutische eiwitten komen dierlijke cellen het dichtst in de buurt van de natuurlijke situatie. Dat wil zeggen dat men met dierlijke cellijnen de grootste kans heeft een actief eiwit te maken, dat bovendien door volgende aanpassingen, zoals het aanbrengen van suikergroepen op bepaalde aminozuren (glycosylering), de grootste overeenkomst heeft met het gewenste eiwit van de mens. Dierlijke cellen kweken is echter duur vanwege de apparatuur en kweekvloeistoffen. Microorganismen zijn dan vaak een voor de hand liggend goedkoop alternatief, met name als het om grotere hoeveelheden gaat zoals bijvoorbeeld voor de productie van insuline, groeihormoon of humaan serum albumine. Van de in de tabel genoemde micro-organismen kan de bacterie E. coli eiwitten niet goed uitscheiden en dit organisme heeft ook niet het vermogen om een eiwit te glycosyleren. Andere bacteriën, zoals de Bacillus soorten, en
38
filamenteuze schimmels zoals Aspergillus niger hebben wel het vermogen om veel eiwit uit te scheiden, maar tevens het nadeel dat ze veel proteasen maken, waardoor deze eiwitten ook weer snel afgebroken kunnen worden. Gist is dan vaak een goed compromis. Dit organisme heeft van nature niet zo’n goed uitscheidingsvermogen, maar geeft wel minder problemen met proteasen. Voor voedingseiwitten, meestal enzymen, komen dierlijke cellen en baculovirus systemen niet in aanmerking vanwege de kosten. Om mogelijke toxicologische problemen te voorkomen, geeft men voor voedingsproducten meestal de voorkeur aan zogenaamde GRAS organismen (GRAS: Generally Recognized As Safe). Dit is een term die door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) gebruikt wordt. Met een GRAS organisme wordt meestal bedoeld, dat bepaalde producten van deze organismen de GRAS-status van de FDA gekregen hebben. Het organisme heeft dan bij een volgende goedkeuringsprocedure een streepje voor, omdat veel over de veiligheid ervan bekend is. Een voorbeeld is bakkersgist dat al vele jaren bij de bereiding van brood gebruikt wordt en waarvan de veiligheid dus onomstreden is. Voor de productie van voedingsenzymen zal men meestal de voorkeur geven aan microorganismen die niet alleen een lange historie van veilig gebruik hebben, maar ook eiwitten goed kunnen uitscheiden, zoals de schimmel Aspergillus niger en de bacterie Bacillus subtilis.
ORGANISME
VOORDELEN
NADELEN
Escherichia coli
Klassiek modelsysteem voor genetische modificatie Snelle groei in vloeibare cultures Hoog expressieniveau van heterologe eiwitten
Potentieel ziekteverwekkend Potentiële bron pyrogenen Eiwitten niet uitgescheiden In grote hoeveelheden aangemaakte eiwitten hopen vaak op in een onoplosbare en inactieve vorm Geen glycosylering
Bacillus subtilis
GRAS organisme Goede uitscheiding Veel fermentatie-ervaring
Lage opbrengst heterologe eiwitten Hoog niveau van proteasen Geen glycosylering
Saccharomyces cerevisiae
GRAS organisme Genetica goed bekend Glycosylering Kan heterologe eiwitten uitscheiden Grote schaal fermentatie op eenvoudig en goedkoop medium (voeding)
Meestal lage expressie van heterologe eiwitten Vaak hyperglycosylering Uitscheiding in het medium soms moeizaam
Aspergillus niger
GRAS organisme Hoge uitscheiding homologe eiwitten Glycosylering Grootschalige fermentatie en opwerking bekend
Meestal lage niveaus van heterologe eiwitten Produceert proteasen
Baculovirus systeem
Secretie van heterologe eiwitten Glycosylering
Eindigt met celdood Lage niveaus van heterologe eiwitten Geen sialylering Moeilijk opschaalbaar Duur medium
Dierlijke cellen
Secretie van heterologe eiwitten Glycosylering
Lage niveaus heterologe eiwitten Moeilijk opschaalbaar Duur medium
Voor- en nadelen van veelgebruikte expressiesystemen. Naar: De Baetselier-Van Broekhoven, A ., Yeast as a source for therapeutic and diagnostic proteins. In: Dekker, M., Recombinant microbes for industrial and agricultural applications, 1994. GRAS: Generally Recognized As Safe.
39
40
6
Het genoom van gist ontrafeld
R.J. PLANTA
R.J. Planta studeerde scheikunde en natuurkunde aan de Rijksuniversiteit Groningen. Aan dezelfde universiteit promoveerde hij in 1962 op een biochemisch onderwerp. In 1963 werd hij gevraagd om een nieuwe Biochemische Afdeling aan de Vrije Universiteit Amsterdam op te zetten. Tot aan zijn emeritaat in 1997 bleef hij als hoofd van dit Biochemisch Laboratorium aan de Vrije Universiteit verbonden, eerst als lector Biochemie en sinds 1970 als hoogleraar Biochemie. Gedurende die periode van meer dan dertig jaar deed hij moleculair-biologisch onderzoek aan gist, met name gericht op de vorming van ribosomen in relatie tot de groeiomstandigheden. Thans is hij nog als buitengewoon hoogleraar verbonden aan de Universiteit van Stellenbosch, Zuid-Afrika.
Ruim vijftig jaar geleden werd de gist Saccharomyces cerevisiae, een eencellige eukaryoot, al beschouwd als het modelorganisme voor de bestudering van processen, die zich in een cel afspelen en die ook van fundamenteel belang zijn voor alle meercellige eukaryoten (inclusief de mens). Tot de populariteit van de gist S. cerevisiae als onderzoeksobject droegen verder bij het gemak waarmee men dit organisme kan kweken en genetisch manipuleren. Steeds meer biochemici, genetici en fysiologen kozen de gistcel als studieobject. Deze onderzoekers vormden geleidelijk een hechte internationale organisatie met een jaarlijks gistcongres, dat afwisselend in de Verenigde Staten en Europa wordt gehouden. Op het gistcongres in San Francisco (1987) lanceerde professor André Goffeau (Louvain-la-Neuve, België) het idee om de volledige structuur van het gistgenoom op te helderen. Op de 16 chromosomen van de gistcel had men nog maar duizend genen, van de naar schatting zes- à zevenduizend in totaal, door biochemische en genetische analyse geïdentificeerd. De beschikbaarheid van recent geconstrueerde bibliotheken van grote chromosoomfragmenten, die tezamen vrijwel het gehele gistgenoom omvatten, en de ontwikkeling van automatische apparatuur voor de analyse van de DNAstructuur (de sequentie-analyse) droegen bij aan de gedachte dat de bepaling van de volledige DNA-sequentie van gist haalbaar was. Europees initiatief Al spoedig bleek dat er een verschil in opvatting bestond tussen de Europese en de Amerikaanse onderzoekers ten aanzien van de te volgen strategie. De Amerikaanse onderzoekers gaven de voorkeur aan een centrale aanpak, waarbij één of twee megacentra de sequentie- analyse zouden uitvoeren, terwijl de Europese onderzoekers voorstander waren van een gedecentraliseerde opzet, waarbij een goed gecoördineerd netwerk van tientallen 41
COMPACT GENOOM
De in 1996 afgeronde sequentie-analyse van het genoom van gist openbaart het bestaan van 6275 ORFs (of genen). Daarvan worden - naar men vermoedt - 390 ORFs niet “vertaald” in eiwitten. Dus waarschijnlijk bevat het gistgenoom 5885 genen, waarbij dat wel gebeurt. Dit bevestigt de reeds voor chromosoom III waargenomen compacte genetische organisatie, nl. ongeveer 1 eiwit-coderend gen per 2000 baseparen (bp). Ter vergelijking: het genoom van de worm C. elegans bevat 1 potentieel eiwit-coderend gen per 6000 bp, en het genoom van de mens 1 gen per 30.000 (of meer) bp. Naast eiwit-coderende genen liggen op het gistgenoom ongeveer 140 eenheden coderend voor ribosomaal-RNA (bestanddelen van de cellulaire eiwitfabriekjes, de ribosomen) als een cluster op chromosoom XII. Verspreid over alle chromosomen zijn er nog: • 275 genen die coderen voor zg. transport-RNA’s (tRNA’s); deze RNA’s vervullen een rol bij de eiwitsynthese; • 40 genen, die coderen voor kleine, nucleaire RNA’s (snRNA’s); deze RNA’s zijn betrokken bij de accurate omzetting van RNA-kopieën van bepaalde genen in “vertaalbare” boodschapper RNA’s; • 52 transposons of Ty-elementen; dit zijn stukken DNA die door recombinatie kunnen “overspringen” naar een ander deel van het gistgenoom. Ruim 70 procent van het genoom van de gist Saccharomyces cerevisiae bevat genetische informatie. Deze hoge genetische dichtheid is onder meer het gevolg van het feit dat bij deze gist slechts in een klein aantal genen (vier procent) de coderende sequenties worden onderbroken door niet-coderende stukken DNA (introns), in tegenstelling tot de situatie bij andere eukaryoten, waar introns veelvuldig in genen voorkomen en heel lang kunnen zijn.
42
kleinere laboratoria die taak op zich zou nemen. Bij dit laatste werd gedacht aan laboratoria, waarin al jaren moleculair-biologisch onderzoek aan gist werd uitgevoerd. Daardoor hadden de onderzoekers een direct belang bij de te verkrijgen gegevens en de wetenschappelijke interpretatie daarvan. Uiteindelijk besloten de Europeanen het voortouw te nemen, en financiële steun voor het sequentie-project aan te vragen bij de Europese Unie. Met de verkregen steun begon een netwerk van 35 verschillende onderzoeksgroepen in Europa (waarvan drie in Nederland: de groepen van Grivell van de Universiteit van Amsterdam, Planta van de Vrije Universiteit in Amsterdam en Steensma van de Rijksuniversiteit Leiden) in 1989 met de sequentie- analyse van chromosoom III, één van de kleinere chromosomen (ca. 315.000 baseparen) van gist. In ongeveer 18 maanden werd dit karwei tot een goed einde gebracht. Het netwerksysteem bleek, tot verbazing van Amerikaanse onderzoekers, zeer goed te werken. Bovendien was het uitgevoerde werk van zeer hoge kwaliteit: de sequentieanalyse van een stuk DNA werd op beide strengen van het DNA uitgevoerd, terwijl iedere groep tevens verificatieanalyses moest uitvoeren van fragmenten van het DNA, waarvan een andere groep de sequentie eerder had bepaald. De geschatte fout in de uiteindelijke sequentie-bepaling is minder dan 0,03 procent, d.w.z. minder dan 3 fouten in 10.000 baseparen. Na analyse van de DNA-sequentie op de aanwezigheid van eiwit-coderende gebieden (de zogenaamde “Open Reading Frames”, afgekort ORFs) bleken op chromosoom III 182 genen te liggen, waarvan slechts 37 voordien waren geïdentificeerd. Dit verrassende resultaat onthulde dat een groot aantal genen nog nooit functioneel was gekarakteriseerd, en dat gist-chromosomen een hoge genetische dichtheid hebben (zie hiernaast). Aangemoedigd door dit succes, gepubliceerd in het gezaghebbende tijdschrift Nature (S.G. Oliver e.a., Nature 357 (1992), 38-46) ging het in omvang steeds groeiende Europese Consortium, met financiële steun van de Europese Unie, verder met de analyse van andere gistchromosomen (chromosoom II, VII, X, XI en XIV). Bovendien werd in toenemende mate gebruik gemaakt van de inmiddels betrouwbaar gebleken apparatuur, waarmee een belangrijk deel van de sequentie- analyse automatisch kon worden uitgevoerd. Dit verhoogde de snelheid waarmee nieuwe sequentiegegevens van de gistchromosomen beschikbaar kwamen. Alle gegevens werden doorgegeven aan en centraal opgeslagen
in de computers van het Martinsried Institut für Protein Sequenzen (MIPS) nabij München. Dit instituut, onderdeel van het Europese Consortium, verzorgde ook de assemblage, verificatie en analyse van de door verschillende laboratoria geleverde sequentie-gegevens. Het succes van de Europese onderzoekers bleef in de rest van de wereld uiteraard niet onopgemerkt, en in de loop van de tijd sloten laboratoria buiten Europa zich aan bij het Europese initiatief: één laboratorium uit Canada (chromosoom I) en één uit Japan (chromosoom VI), en twee grote instituten uit de Verenigde Staten (chromosomen VI, VIII en delen van de chromosomen IV, XII en XVI). De coördinatie van het geheel, en daarmee de taakverdeling, bleef in Europese handen. Door deze omvangrijke internationale samenwerking, de grootste in zijn soort in de geschiedenis van het moleculair-biologische onderzoek, werd sneller dan verwacht in april 1996 de sequentie-analyse van het volledige gistgenoom voltooid. Aan dit grote succes hebben meer dan zeshonderd onderzoekers bijgedragen, vertegenwoordigers van bijna honderd verschillende laboratoria in Europa, de Verenigde Staten, Canada en Japan. Meer dan 70 procent van de analyse van het gistgenoom (12,5 miljoen baseparen) werd in Europa uitgevoerd, te weten 55 procent door het Europese netwerk, en 17 procent door het gespecialiseerde Sanger Instituut in Cambridge (Groot-Brittannië), terwijl de rest werd gedaan in de Verenigde Staten (22 procent), Canada (4 procent) en Japan (2 procent). Ondanks de spreiding van het werk over een groot aantal laboratoria, werd - dankzij de goede organisatie - de analyse zeer efficiënt en met grote nauwkeurigheid uitgevoerd. Deze nauwkeurigheid werd voortdurend getest door delen van het gistgenoom telkens door twee verschillende laboratoria te laten analyseren, waarbij tenslotte fouten van minder dan 1 basepaar per 10.000 baseparen werden geconstateerd. De volledige analyse van het gistgenoom is een mijlpaal in de geschiedenis van de moleculaire biologie. Voor het eerst was de volledige genetische informatie van een eukaryotisch organisme beschikbaar; daardoor wordt een gedetailleerde analyse van het functioneren van een eukaryotische cel. Het gistgenoom kan daarmee dienen als een belangrijk referentiekader bij de genetische analyse van alle eukaryoten, inclusief de mens. Veel genen in gist kunnen namelijk worden beschouwd als universele “legosteentjes”. Genen die in gist bijvoorbeeld een rol spelen bij de omzetting van voedingsstoffen in cellulaire energie, doen dat in andere eukaryoten ook.
Verassende vondsten Een uitvoerige computerananalyse van het complete gistgenoom onthulde enkele opmerkelijke feiten. Door systematisch de sequentie van gistchromosomen met elkaar te vergelijken (in fragmenten van 25.000 baseparen) bleek dat in de loop van de evolutionaire ontwikkeling van S. cerevisiae 53 gebieden van het gistgenoom (verspreid voorkomend over alle chromosomen) zijn gedupliceerd. Niet meegerekend zijn de bekende herhalingen aan het uiteinde van een chromosoom: de telomeren. Dit houdt in dat ongeveer 30 procent van de genen is gedupliceerd. Deze evolutionaire strategie biedt grote voordelen. Door duplicatie van een bepaald gen is het mogelijk één kopie tijdens de evolutie geleidelijk te laten veranderen, zowel structureel als functioneel, zonder dat de mogelijk vitale functie van de andere kopie wordt verstoord. De door genduplicatie ontstane structureel verwante genen (paraloge genen) coderen voor eiwitten, die een vergelijkbare, maar onderling duidelijk onderscheidbare, functie hebben, zoals bijvoorbeeld de groep van membraangebonden transporteiwitten of de groep eiwitten die een actieve rol spelen bij het doorgeven van signalen vanuit de omgeving van de cel. Een eenvoudig voorbeeld van de functionele winst die door genduplicatie mogelijk wordt, is de aanwezigheid van drie verwante genen op het gistgenoom, die alle drie coderen voor het belangrijke enzym citraatsynthase. Echter, het eiwit van het ene gen komt in de peroxysomen terecht, terwijl het eiwit van het tweede gen in het mitochondrion als enzym werkzaam is. Wat het eiwit van het derde gen doet, is nog niet duidelijk. Wellicht het meest verrassend was het feit dat van de ongeveer 6000 genen, gevonden op het complete gistgenoom, slechts zo’n 2600 genen eerder waren geïdentificeerd (zie voorbeeld op pagina 44). Tot eenzelfde conclusie was men al gekomen voor de groep genen op chromosoom III. De functie van ongeveer 1000 pas ontdekte genen kan worden afgeleid uit hun structurele overeenkomsten met andere genen in gist of andere organismen. Echter, de toekenning van een biochemische functie op basis van homologie met andere genen verschaft nog geen duidelijkheid over hun feitelijke biologische rol. Verder experimenteel onderzoek is dus nodig om dat uit te zoeken. Dit geldt evenwel nog meer voor de resterende 2300 tot 2400 genen, waarvoor (nog) geen enkele aanwijzing bestaat ten aanzien van hun functie. De nieuwe, inspirerende wetenschappelijke uitdaging, die voortvloeit uit de volledige analyse van het gistgenoom is dan ook de opheldering van de functie van deze onbeken43
44
Genen op de kaart zetten is het begin. In kleur: de bekende genen; licht gekleurd: homologie met bekende genen in gist of andere eukaryoten. Voorbeeld: chromosoom 9.
Functionele indeling van de gist-eiwitten
%
Cellulaire organisatie en synthese cellulaire onderdelen Metabolisme (suikerstofwisseling) Celgroei, celdeling en DNA-synthese Genexpressie (transcriptie en eiwitsynthese) Intra- en extracellulair transport Eiwitadressering (route naar bepaalde celonderdelen) Handhaving en overleving (stress-respons, detoxificatie, etc) Energiemetabolisme Signaaltransductie Nog niet in te delen
25 14 11 12 8 6 4 3 2 15
de genen. Voor dit doel is in Europa, eveneens met financiële steun van de Europese Unie, een nieuw netwerk opgezet, genaamd EUROFAN (het Europese Functionele Analyse Netwerk). Soortgelijke activiteiten zijn nadien gestart in de Verenigde Staten, Japan en Canada. Voor de functionele analyse van de dankzij het gistproject ontdekte genen worden verschillende benaderingen toegepast. Eén daarvan is de verwijdering, stuk voor stuk, van genen uit het gistgenoom; daarvoor heeft men tegenwoordig eenvoudige en betrouwbare technieken beschikbaar. De verwijdering van een bepaald gen kan dan leiden tot celdood: dit gen is kennelijk onmisbaar voor groei en leven van de gistcel, al zegt dat nog niet veel over de functie ervan. Blijft de gistcel in leven dan kan een verandering van de groei van de gistcel onder bepaalde omstandigheden, wel concrete aanwijzingen opleveren. Een andere benadering is de analyse van de expressieniveaus van deze genen onder een groot aantal verschillende omstandigheden. Deze benadering levert veel informatie op, die echter alleen in combinatie met andere gegevens interpreteerbaar is. Een belangrijke aanwijzing voor de mogelijke functie van een biochemisch nog niet gedefinieerd eiwit is zijn locatie in de cel. Helaas is dit nog maar voor ongeveer een derde van alle eiwitten gedaan. Hoe onvolledig deze analyse ook is, toch is het opmerkelijk dat ongeveer 550 gelokaliseerde eiwitten zich in de celkern bevinden en daar hun biologische functie vervullen. Dit illustreert dat de gistcel veel genetische informatie besteedt aan een nauwkeurige replicatie en een goed geregelde expressie van zijn ongeveer 6000 genen. De verschillende benaderingen voor de functionele analyse van genen, uitgevoerd in internationaal verband, zullen
uiteindelijk moeten leiden tot een volledige kennis van de biologische functie van alle eiwitten in gist, ook wel aangeduid als “proteome”. Die kennis zal de betekenis van deze eukaryote cel als referentiekader voor de functionele analyse van cellen van andere eukaryoten, bijvoorbeeld menselijke cellen, alleen maar vergroten. Veel gistgenen hebben homologen in andere organismen (van worm tot mens), wat erop wijst dat deze genen in het eukaryotisch leven een welhaast universele rol spelen. Daardoor is de gist S. cerevisiae een belangrijk modelsysteem voor de functionele, genetische analyse van andere eukaryoten. Thans is reeds bekend dat meer dan de helft van de eiwitten, die door niet goed te functioneren bepaalde erfelijke ziekten bij de mens veroorzaken, een homoloog eiwit hebben in gist. Bekende voorbeelden zijn de transporteiwitten, die door een defect verantwoordelijk zijn voor de taaislijmziekte (cystische fibrose) en voor adrenoleukodystrofie bij de mens. Ofschoon de functionele analyse van de genen nog verre van voltooid is, is al wel duidelijk wat voor soorten eiwitten, en ruwweg hoeveel van elke soort, het leven van de eukaryote gistcel mogelijk maken (zie de tabel hierboven; Planta, berekende percentages per januari 1999). Het is duidelijk dat er nog veel inventief werk verricht moet worden voordat van alle 6000 eiwitten in de gistcel precies de functie bekend is. Eerst dan zullen we weten hoe een eukaryotische cel onder verschillende omstandigheden functioneert.
Literatuur: Aart, Q.J.M. van der, en H.Y. Steensma, Chromosoom III van gist. Natuur en Techniek 1993; 61, 3: 200 - 215. 45
Laboratoriumrobot voor automatische bepalingen.
46
7
Gist als onderzoeksmodel
J.M. THEVELEIN
J.M. Thevelein studeerde biologie (plantkunde- microbiologie- biochemie) aan de Katholieke Universiteit Leuven. Hij promoveerde in 1981 en verrichtte daarna gedurende twee jaar onderzoek aan Yale University (New Haven, Verenigde Staten). In 1983 werd hij vast navorser bij het Nationaal Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek en verbonden aan de K.U.Leuven. In 1986 startte hij zijn academische carrière als docent om tenslotte in 1996 aan de K.U.Leuven gewoon hoogleraar te worden. Zijn onderzoek concentreert zich op door voedingsstoffen geïnduceerde signaaltransductiewegen bij gistcellen en de eigenschappen die door deze signaalwegen worden gecontroleerd. Voor eigenschappen met belangrijke toegepaste implicaties, zoals stress-resistentie, wordt ook intensief onderzoek uitgevoerd in samenwerking met gistbiotechnologiebedrijven.
Waarom groeien bepaalde organismen in het wetenschappelijk onderzoek uit tot modellen die blijkbaar zo aantrekkelijk zijn dat duizenden onderzoekers al hun aandacht op zo’n organisme richten? Wanneer men de voornaamste modelorganismen langs loopt (zie pagina 48), dan zal men merken dat daar geen voor de hand liggende economische of medische redenen voor te vinden zijn. De meeste modelorganismen hebben op zich geen direct belang voor de mens. De enige uitzondering hierop vormt de gist Saccharomyces cerevisiae, die reeds duizenden jaren wordt gebruikt voor de productie van brood, bier, wijn en een enorme variatie aan andere alcoholische dranken. Dat deze gist is uitgegroeid tot het voornaamste onderzoeksmodel voor de studie van de eukaryotische cel is aan verschillende factoren te danken. De carrière van gist De sterke fermentatie-activiteit van gist oefende op de eerste biochemici een sterke aantrekkingskracht uit. In de gistcel konden zij de chemische reacties identificeren die voor de omzetting van suiker in alcohol en kooldioxide verantwoordelijk zijn. Deze studies leidden tot de opheldering van de glycolyse, de oudste en meest centrale weg in de stofwisseling, en de daarop aansluitende fermentatiereacties. Deze opheldering vormde de start van de carrière van gist als onderzoeksmodel. De volgende essentiële stimulans kwam van de genetica. Gist is - genetisch gezien - een zeer bijzonder organisme. Gistcellen kunnen zich evengoed vermenigvuldigen in haploïde als in diploïde vorm en de overgang van de haploïde vormen (met paringstype a en α) naar de diploïde vorm kan op zeer eenvoudige wijze door de onderzoeker teweeggebracht worden. De diploïde cellen kunnen ook zeer gemakkelijk tot de vorming van sporen (sporulatie) worden aangezet, waarbij de cellen meiose ondergaan en vier haploïde ascosporen vormen in één ascus. Deze 47
GIST EN ANDERE MODELSYSTEMEN Er zijn miljoenen soorten dieren, planten en microorganismen. Het spreekt vanzelf dat het wetenschappelijk onderzoek maar traag zou vorderen wanneer men alle biologische vraagstukken bij alle soorten tegelijkertijd zou willen oplossen. Alle biologische fenomenen bij één organisme ophelderen is niet mogelijk. Men kan bijvoorbeeld de werking van de bloedsomloop niet leren kennen door een bacterie te onderzoeken. Als gevolg daarvan heeft een zeer beperkt aantal organismen zich geleidelijk ontwikkeld tot modelsysteem voor de studie van biologische vraagstukken. Deze organismen hebben met elkaar gemeen dat ze gemakkelijk en goedkoop in grote aantallen gekweekt en onderhouden kunnen worden. Olifanten zijn dan ook nooit een modelsysteem geworden. Met modelorganismen kan men bovendien vlot genetische experimenten uitvoeren. Voor het ophelderen van universele basisprocessen in cellen, zoals de mechanismen van DNAreplicatie, transcriptie en eiwitsynthese heeft de bacterie Escherichia coli een essentiële rol gespeeld. Dit heeft geleid tot de bekende uitspraak: ‘Wat waar is voor E. coli, is ook waar voor een olifant’. Dit hoofdstuk laat zien dat de gist S. cerevisiae een cruciale rol speelt bij het ophelderen van basisprocessen in eukaryote cellen, zoals celcyclus, signaaloverdracht, secretieweg en de werking van de mitochondriën. Het spreekt vanzelf dat gist geen onderzoeksmodel kan zijn voor biologische functies die bij dit organisme niet aanwezig zijn, zoals bijvoorbeeld de werking van het zenuwstelsel of de ontwikkeling tot meercellig organisme. De nematode Caenorhabditis elegans blijkt bijzonder nuttig voor het ophelderen van basisprocessen die typisch zijn voor dierlijke cellen, zoals zenuwgeleiding, beweging en gedrag. De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft vanouds een belangrijke rol gespeeld in de genetica en is nu een zeer geliefd modelsysteem voor het ophelderen van de moleculaire basis van de ontwikkeling van één cel tot meercellig organisme. Dit laatste geldt ook voor de zebravis Brachydanio rerio. Voor alle levensprocessen die typisch zijn voor zoogdieren is de muis Mus musculus duidelijk het uitverkoren modelsysteem geworden. Voor planten staat de plant Arabidopsis thaliana model. 48
ascosporen blijven gewoonlijk samen in één ascus zitten, maar kunnen daar door de onderzoeker gemakkelijk één voor één uit worden geïsoleerd. Deze techniek wordt bij gist tetradenanalyse genoemd (zie de foto's). De vier producten van één enkele meiose kan men dus identificeren en als aparte organismen opkweken, wat zeer uitzonderlijk is bij eukaryote organismen. Meestal komt slechts één van de meioseproducten tot ontwikkeling (bijvoorbeeld eicellen van de mens) of worden de meioseproducten onmiddellijk door elkaar gemengd (bijvoorbeeld zaadcellen van de mens). De mogelijkheid om de vier producten van elke meiose te herkennen en apart op te kweken als haploïde organismen biedt onschatbare voordelen bij genetisch onderzoek. Het maakt het bijvoorbeeld heel eenvoudig om aan te tonen dat een eigenschap aan één enkele mutatie te wijten is; bovendien is het opstellen van genetische kaarten veel eenvoudiger. Als gevolg van deze voordelen heeft het genetisch onderzoek bij gist een zeer sterke ontwikkeling doorgemaakt, waardoor de gistcel een model werd voor de genetica van eukaryote cellen.Ook degenen die bezig waren met de toepassingen van gist hadden voor de gistgenetica grote belangstelling. Dit toegepaste genetisch onderzoek echter is altijd veel moeizamer verlopen. De stammen van de gist S. cerevisiae die bij de bierbrouwerij, wijnbereiding en bakkersgistproductie de beste resultaten geven, zijn geen
zuiver diploïde stammen, waardoor zij dikwijls een heel slechte sporulatie en/of een zeer slechte kieming van sporen vertonen. Na de successen van de genetische modificatie bij de bacterie Escherichia coli slaagden ook gistonderzoekers er in hun model genetisch te modificeren. Al vrij snel bleken gistcellen ook nu weer onvermoede mogelijkheden te bieden, waar, achteraf bezien, onderzoekers van andere eukaryote organismen alleen maar van konden dromen. Bij gist kon men genen - vrij eenvoudig - volledig vervangen door merkergenen en dus stammen krijgen die een bepaald eiwit misten. De mogelijkheid om gistcellen zowel in haploïde als in diploïde vorm te kweken, bleek ook hierbij een groot voordeel. Daardoor was het immers mogelijk om van genen waarvan de verwijdering (deletie) dodelijk was in haploïde cellen, slechts één van beide exemplaren uit te schakelen in diploïde cellen. Na sporulatie resulteerde dit dan steeds in twee dode en twee levensvatbare sporen. Bovendien kon men in een volgende fase de diploïde stam voorzien van een induceerbaar gen; na sporulatie kon men daardoor de sporen met de deletie (en het induceerbare gen) toch laten opgroeien. Bij gist kon men dus stammen selecteren, waarin het bewuste gen naar believen was aan- of uitgeschakeld. Zo kan men eerst voldoende cellen opkweken, vervolgens het gen
uitschakelen en dan de cellen met het uitgeschakelde gen bestuderen om erachter te komen wat de functie van het gen is (zie ook pagina 50). Deze zg. deletiestammen van gist komen overeen met de zogenaamde knock-out stammen van muizen. Dit zijn muizen waarvan een bepaald gen volledig is uitgeschakeld. Bij gist is men evenwel niet beperkt tot een enkele deletie per stam. Onlangs werden systemen ontwikkeld om deleties aan te brengen waarbij de merker steeds ‘gerecupereerd’ kan worden. Daardoor kan men in principe een onbeperkt aantal genen deleteren in dezelfde stam. Giststammen met vijf tot tien deleties van verschillende genen zijn reeds gemeengoed geworden. De sterke ontwikkeling van de gistgenetica en het grote belang van gist als producent in de biotechnologie vormden de aanzet voor de systematische ontrafeling van het hele gistgenoom (zie hoofdstuk 6). Dit was een nieuwe mijlpaal in het gistonderzoek en heeft de status van gist als modelorganisme voor onderzoek aan de eukaryote cel definitief bevestigd. Bij de ontdekking van een gen in andere organismen wordt dan ook bijna automatisch als eerste gevraagd of er van dit gen een homoloog gen bij gist voorkomt en zo ja, wat de functie van dit homologe gen bij gist is (zie pagina 52). Op die manier is gist een modelsysteem geworden voor zowat alle basisfuncties van de eukaryote cel. Dit kan overvloedig met voorbeelden geïllustreerd worden, enkele van de voornaamste voorbeelden worden hierna besproken. De eukaryotische celcyclus Eén van de klassieke domeinen waarin gist als uitstekend onderzoeksmodel heeft gefungeerd, is de studie van de celcyclus. Alle eukaryote cellen ondergaan tijdens hun vermenigvuldiging een specifieke opeenvolging van fasen. In een eerste fase (G1 fase) wordt door de cel al dan niet de beslissing genomen om met de voorbereiding van een volgende celdeling te starten. Om deze beslissing te nemen zal de cel zich baseren op informatie over zichzelf en over de omgeving. In het eerste geval wordt bijvoorbeeld nagegaan of de cel voldoende gegroeid is. De twee voornaamste omgevingsfactoren die gistcellen in deze fase onderzoeken zijn de aanwezigheid van voldoende voedingsstoffen en van feromonen, ook wel paringsfactoren genoemd. Indien aan alle voorwaarden voldaan is, zal de cel de volgende celdeling gaan uitvoeren en de beslissing is onherroepelijk. Dit betekent dat de volgende celdeling wordt afgewerkt ongeacht eventuele veranderingen in de omgevingscondities, zoals een plotseling gebrek aan 49
DE MAP KINASE SIGNAALWEG
Haploïde gistcellen van het a-type kunnen versmelten met cellen van het α-type en een diploïde (a/α) cel vormen. Daartoe zullen de a-cellen het a-feromoon (of a-factor) uitscheiden, terwijl de α-cellen het α-feromoon uitscheiden. Beide feromonen bestaan uit een tiental aminozuren. De a- en α-feromonen binden aan receptoren respectievelijk in de cellen van het a- en α-type. Door de binding van de feromonen aan de receptoren wordt een signaalweg geactiveerd die leidt tot remming van het Cdc28 proteïne kinase en het stilvallen van zowel de a-als de α-cellen aan het startpunt van de celcyclus. Vervolgens gaan de cellen over tot een specifieke differentiatie die hen in staat stelt tot versmelting van twee haploïde cellen tot één diploïde cel. Dit hele proces bij gist lijkt een zeer specifiek proces waarvan men op het eerste gezicht weinig zou kunnen uit leren over wat zich bij andere eukaryote organismen afspeelt. Toen men vele jaren geleden de signaalweg ophelderde die het signaal afkomstig van de geactiveerde feromoonreceptor doorgaf aan het Cdc28 proteïne kinase, was er maar weinig verband te ontdekken met andere signaalwegen bij eukaryoten. Nadien echter bleek een bepaald onderdeel van de signaalweg, de MAP kinase cascade, universeel als signaalmodule bij eukaryoten voor te komen. Hierbij gaat een proteïne kinase een tweede proteïne kinase activeren door fosforylatie, dat vervolgens op zijn beurt een derde proteïne kinase door fosforylatie activeert. De drie proteïne kinasen noemt men respectievelijk: MAP kinase, MAP kinase kinase en MAP kinase kinase kinase. De naam “MAP kinase” staat voor “Mitogen Activated Protein kinase”, omdat deze kinase immers ook een rol speelt bij de activatie van de celdeling bij zoogdiercellen door mitogene (mitosis-stimulerende) regulatorische stoffen. Ook bij gist wordt deze signaalmodule nog in verschillende andere signaaltransductiewegen gebruikt, onder meer bij de respons van de gistcellen op osmostress. Als men gistcellen in een medium brengt met hoge osmolariteit (bijvoorbeeld met een hoog gehalte aan zout of suiker, zie hiernaast), gaan de cellen heel snel glycerol oppotten om zich tegen uitdroging te beschermen. De stimulatie van de glycerolsynthese vindt plaats via een MAP kinase cascade. 50
De door de feromonen geactiveerde MAP kinase cascade bij gist was de eerste signaalweg die werd geïdentificeerd en sedertdien zijn zowel bij planten als bij dieren tal van MAP kinase homologen aangetroffen. Net zoals in zoveel andere onderzoeksdomeinen heeft ook dit onderzoek overvloedig aangetoond dat tijdens de evolutie dezelfde bouwstenen telkens opnieuw in een andere context werden gebruikt. Ook de MAP kinase cascade is hiervan een mooi voorbeeld.
Voorbeeld van de gevoeligheid van wild type (WT) en deletiestammen voor zout als stressor. Van links naar rechts is de cirkelvormige groei van de kolonie te zien in een serie verdunningen (1:10).
De celcyclus van de gist S. cerevisiae bestaat uit dezelfde vier fasen als die van andere eukaryoten: G1 fase, S fase (DNA-replicatie), G2 fase en mitose (kerndeling). In de G1 fase gaat de cel de omgevingscondities en andere factoren (o.a. celgrootte) na en beslist op basis daarvan of ze al dan niet met een nieuwe celdeling start. De twee voornaamste omgevingscondities die de overgang van de G1 fase naar de S fase beïnvloeden zijn de aanwezigheid van voedingsstoffen (haploïde en diploïde cellen) en van feromonen (haploïde cellen). Bij het ontbreken van een essentiële nutriënt of de aanwezigheid van een a of α feromoon, resp. bij a of α cellen, stoppen de cellen aan het startpunt van de celcyclus in de G1 fase. Bij het ontbreken van een essentiële nutriënt gaan de cellen over in de stationaire rustfase. Bij aanwezigheid van een feromoon zetten de cellen een differentiatieproces in gang dat hen voorbereidt op de versmelting met een cel van het andere paringstype. Het cAMP-kinase A systeem en het Cdc28 proteïne kinase spelen een essentiële rol respectievelijk bij het voedingsdetectiepunt en bij het feromoondetectiepunt. De synthese van de G1 cyclines is cruciaal bij het doorlopen van de G1 fase en essentieel voor de overgang naar de S fase.
voedingsstoffen. In de volgende fase van de celcyclus (S fase) wordt het DNA verdubbeld, waarna de cel alle voorbereidingen zal treffen om de kerndeling (mitose) en de daaropvolgende deling van het cytoplasma (cytokinese) uit te voeren. Bij cellen van de gist S. cerevisae gebeurt de vermenigvuldiging door knopvorming en kan de positie van de cel in de celcyclus gemakkelijk afgeleid worden van het uiterlijk: het al dan niet aanwezig zijn van de knop en de grootte van de knop. Dit maakte het mogelijk om zg. celcyclusmutanten te isoleren. Daartoe werden eerst vele honderden zogenaamde temperatuursensitieve mutanten geïsoleerd. Dit zijn mutanten die normaal groeien bij 23 graden Celsius (permissieve temperatuur), maar niet kunnen groeien bij 36 graden Celsius (restrictieve temperatuur). Vervolgens werden deze mutanten één voor één bekeken onder de microscoop om na te gaan hoe ze er uit zagen als ze stil vielen nadat de temperatuur van 23 graden Celsius naar 36 graden Celsius was verhoogd. Op die manier heeft men tussen de vele temperatuursensitieve mutanten enkele tientallen celcyclusmutanten geïdentificeerd; die cellen vertoonden namelijk allemaal dezelfde
uiterlijke kenmerken, nadat ze waren stilgevallen bij de restrictieve temperatuur: bijvoorbeeld alle cellen waren knoploos, alle cellen hadden een kleine knop, een grote knop of alle cellen waren dubbelcellen met een dochtercel zo groot als de moedercel. Elke mutant had blijkbaar een genetische verandering ondergaan, waardoor een bepaald eiwit niet meer functioneerde dat essentieel was voor de voortgang op een bepaald punt tijdens de celcyclus. Een belangrijk deel van het onderzoek heeft zich toen geconcentreerd op de cellen zonder knop, omdat die blijkbaar gemuteerd waren in het systeem dat verantwoordelijk is voor het nemen van de beslissing om al dan niet een volgende celdeling te ondergaan. De belangrijkste mutant die op deze manier werd geïdentificeerd was de Cdc28 mutant. Het Cdc28 proteïne kinase werd later ook bij andere eukaryoten aangetroffen en bleek de belangrijkste pacemaker te zijn van de eukaryotische celcyclus (zie hierboven). Activatie van dit enzym controleert de overgang van de G1 fase naar de S fase van de celcyclus en daarmee de DNA synthese. Deze overgang is bijzonder 51
HOMOLOGE GENEN BIJ ANDERE ORGANISMEN
Er bestaan verschillende technieken om homologe genen te isoleren bij andere organismen nadat men uit gist een bepaald gen gekloneerd heeft. Veel van deze technieken zijn gebaseerd op overeenkomsten in de volgorde van baseparen (DNA-sequentie). Belangrijker dan deze homologie is echter de functionele homologie. Oefent het gen uit het andere organisme ook dezelfde functie uit als dat bij gist? Dankzij het gemak waarmee men bij gist deletiestammen kan verkrijgen, is gist zeer snel een belangrijk instrument geworden voor het isoleren van genen met functionele homologen bij andere organismen. Daarvoor wordt in zo’n deletiestam een genenpakket van het andere organisme ingebracht via een vector die in gist vermenigvuldigd kan worden; daarna wordt geselecteerd op herstel van de functie. Voorbeeld: een functioneel homoloog van een gisttransporteiwit voor het aminozuur arginine kan worden geselecteerd door de stam op een medium met alleen arginine als stikstofbron te kweken. Alleen die gistcellen van de stam met het
52
gedeleteerde gistgen, die een functioneel transporteiwit uit het andere organisme tot expressie brengen, zullen dan op deze voedingsbodem kunnen groeien. Het enige wat men voor deze benadering nodig heeft, is een goed selectiesysteem. Voor alle essentiële genen is dit systeem vanzelf aanwezig: alleen gistcellen met functionele homologen blijven in leven (selectie op herstel van de groei). Dankzij deze benadering zijn reeds tal van functionele homologen van gistgenen uit andere organismen gekloneerd. Een bijzonder in het oog springend voorbeeld van dergelijke homologe genen bij andere organismen zijn genen die bij de mens verantwoordelijk zijn voor erfelijke ziekten. Er zijn al diverse gistgenen geïdentificeerd waarvan een homoloog gen bij de mens een erfelijke ziekte veroorzaakt (zie de tabel hieronder). De gistcel kan dan een zeer krachtig instrument zijn om het preciese werkingsmechanisme van het verwante eiwit bij de mens op te helderen.
Gist-gen
Functie van het eiwit
Mens-gen
Erfelijke ziekte
MSH2 MLH1 YCF1 CCC2 GUT1 SGS1 SGS1 PXA1
DNA herstel eiwit DNA herstel eiwit Metaalresistentie-eiwit Koper transporteiwit Glycerol kinase (enzym) Helicase (enzym) Helicase (enzym) Peroxisomale ABC transporteiwit
MSH2 MLH1 CFTR WND GK BLM WRN ALD
TEL1 GEF1 GEF1 YNL161W SOD1 YIL002C GDI1 IRA2
PI3 kinase (enzym) Spanningsgereguleerd chloride ionenkanaal Spanningsgereguleerd chloride ionenkanaal Hypothetisch eiwit Superoxide dismutase (enzym) Vermoedelijk IPP-5 fosfatase (enzym) GDP-dissociatie inhibitor Activator van G-eiwit GTPase activiteit
ATM CLCN5 CLC1 DM SOD1 OCRL CHM NF1
Colonkanker Colonkanker Cystische fibrose Ziekte van Wilson Glycerol kinase deficiëntie Syndroom van Bloom Werner’s syndroom Adrenoleukodystrofie (X- chromosoom gekoppeld) Ataxia telangiectasia Syndroom van Fanconi Ziekte van Thomsen Myotone dystrofie Amyotrofe laterale sclerose Syndroom van Lowe Choroideremie Neurofibromatose, type 1
belangrijk bij de controle van de eukaryotische celcyclus. Juist dit beslissingsmechanisme is bij kankercellen ontregeld. Kankercellen beslissen telkens opnieuw om toch te delen onder condities waarin ze dat eigenlijk niet mogen doen. Vandaar dat er vanuit het kankeronderzoek een zeer grote belangstelling bestaat voor de moleculaire basis van het beslissingsmechanisme dat aan de basis ligt van de overgang van de G1 fase naar de S fase. De mitochondriale ademhaling In vergelijking met de meeste andere eukaryote cellen hebben gistcellen de unieke eigenschap om zowel ademhaling als fermentatie te kunnen gebruiken voor hun groei. Wanneer gistcellen in contact komen met glucose of vergelijkbare snel-fermenteerbare suikers, zullen de voor de zuurstofademhaling verantwoordelijke genen bijna volledig uitgeschakeld zijn en worden alle suikers in ethanol en kooldioxide omgezet. Raakt de suiker opgebruikt, dan worden de genen voor de zuurstofademhaling weer aangezet en begint de gistcel alcohol om te zetten in kooldioxide. De zuurstofademhaling speelt zich af in de mitochondriën (Krebs-cyclus in de matrix en elektronentransportketen op de cristae). Ook de morfologische ontwikkeling van de mitochondriën hangt nauw samen met de aan- of afwezigheid van de zuurstofademhaling. In fermenterende gistcellen zijn de mitochondriën zeer zwak ontwikkeld. Het spreekt vanzelf dat zo’n manipuleerbaar systeem bijzonder geschikt is om de regulatie en ontwikkeling van de mitochondriale ademhaling te bestuderen. Dit is evenwel niet het enige voordeel. De meeste genen van de zuurstofademhaling maken deel uit van het genoom in de kern; de rest is gelocaliseerd op het mitochondriale DNA, dat ook codeert voor alle ribosomale en transfer RNA’s die in de mitochondriale eiwitsynthese worden gebruikt. Uit het onderzoek van de mitochondriën in gist bleek dat men zelfs dit hele mitochondriale DNA kan uitschakelen zonder de levensvatbaarheid van de gistcellen (voor groei op fermenteerbare suikers) aan te tasten. De gistcel is van bijzonder groot nut geweest voor het onderzoek naar de werkingsmechanismen van mitochondriën. Een belangrijk voorbeeld daarvan is de opname in de mitochondriën van eiwitten die door het genoom in de celkern gecodeerd worden en bijgevolg gesynthetiseerd worden door de ribosomen in het cytoplasma. Dit mechanisme is voor de mitochondriale ontwikkeling en activiteit van zeer groot belang, omdat het grootste gedeelte van alle mitochondriale eiwitten vanuit de kern gecodeerd wordt. Het onderzoek bij gistcellen is hier ook
Overzicht bakkersgist, doorsnede door de cel. Met name de mitochondriën (M) en de vacuole (V) zijn goed zichtbaar; (P) peroxosoom.
de trendsetter geweest. Aangetoond werd dat de in het cytoplasma gesynthetiseerde eiwitten eerst moeten worden ontvouwen door speciale eiwitten, voordat zij met een specifiek label (signaalsequentie) binden aan receptorcomplexen die de dubbele membraan van de mitochondriën overspannen op contactplaatsen tussen de buitenste en de binnenste membraan. De eiwitten worden vervolgens in ontrolde vorm door het transportkanaal geloodst, waarna zij binnen de mitochondriën weer in de juiste ruimtelijke vorm worden gevouwen. Een groot deel van de bij dit proces betrokken eiwitten is eerst bij gist geïdentificeerd en nadien is aangetoond dat homologe eiwitten dezelfde functie uitoefenen bij andere eukaryoten. Bovendien is opgehelderd hoe van verschillende signaalsequenties gebruik wordt gemaakt om de verschillende mitochondriale eiwitten naar het juiste mitochondriale compartiment te sturen. 53
Accumulatie van het enzym invertase in de secretieroute van bakkersgist. Het eiwit is zichtbaar gemaakt d.m.v. immunocytochemie, waarbij goudbolletjes, gekoppeld aan een specifiek antiserum tegen invertase de locatie van de invertase-moleculen aangeven; (N) kern.
De secretieweg Alle eukaryote cellen bezitten twee systemen voor de eiwitsynthese: een systeem dat werkt met vrije ribosomen en een systeem dat werkt met ribosomen die tijdelijk aan de membranen van het endoplasmatisch reticulum (E.R.) worden gebonden. Dit laatste systeem vormt het startpunt van de zogenaamde secretieweg van de cel, alhoewel slechts een deel van de aan het E.R. gesynthetiseerde eiwitten effectief uitgescheiden wordt. Ook de eiwitten voor het E.R. zelf, het Golgi-apparaat, de lysosomen en de plasmamembraan worden door de ribosomen aan het E.R. gesynthetiseerd en via de secretieweg naar hun bestemming gevoerd. De gist S. cerevisiae heeft ook voor het ontrafelen van deze ‘intracellulaire verkeersweg voor eiwitten’ model gestaan. Omdat de activiteit van de secretieweg essentieel is voor de levensvatbaarheid van een gistcel, werd in dit onderzoek ook gewerkt met een collectie van temperatuursensitieve mutanten. De mutanten die bij de restrictieve temperatuur stoornissen hadden in de secretieweg van de cel, werden geïdentificeerd door op intacte cellen de activiteit te meten van het enzym invertase. Dit enzym wordt in normale gistcellen (wild type) via de secretieweg van de cel vervoerd naar de pericellulaire ruimte, de ruimte tussen de plasmamembraan en de celwand. Omdat de celwand doorlaatbaar is voor kleine moleculen en de plasmamembraan niet, kan de activiteit van het enzym alleen waargenomen worden als dit effectief uitgescheiden is naar de ruimte tussen plasmamembraan en celwand. Als alle temperatuursensitieve mutanten in de secretieweg waren geïdentificeerd, ging men vervolgens na op welke plaats in de secretieweg het betrokken eiwit werkzaam is. Daartoe onderzocht men in welk intracellulair compartiment het enzym zich ophoopte: in het E.R., in het Golgi-apparaat of tijdens het transport tussen deze compartimenten. Als men eenmaal het blok54
keringspunt in de secretieweg voor de verschillende mutanten had bepaald, kon vervolgens via het construeren van dubbelmutanten de precieze volgorde van de gemuteerde eiwitten in de secretieweg worden bepaald. Op deze manier zijn bij gist eiwitten geïdentificeerd die een essentiële rol spelen, bijvoorbeeld bij de tocht van eiwitten door de membraan van het E.R. of bij het coördineren van de verschillende transportsystemen die tussen de compartimenten voor het vervoer van eiwitten naar hun bestemming zorgen. Nadien werd aangetoond dat homologen van deze gisteiwitten ook bij andere eukaryote cellen in de secretieweg werkzaam zijn. De volledige opheldering van het gistgenoom heeft ook een belangrijke stimulans gegeven om (althans voor gist) zicht te krijgen op het volledige arsenaal aan eiwitten die bij de celcyclus, mitochrondiale ademhaling, secretieweg en andere functies van de cel betrokken zijn.
HANSENULA POLYMORPHA Modelorganisme in studies naar peroxisomen Aan de universiteit van Groningen wordt de gist Hansenula polymorpha gebruikt als modelorganisme in het peroxisoom onderzoek. Peroxisomen zijn zeer eenvoudige celorganellen die bestaan uit een eiwit bevattende matrix omsloten door een enkele membraan. De eiwitten in dit organel zijn enzymen die een rol spelen in zeer uiteenlopende stofwisselingsprocessen. Een voorbeeld hiervan is de rol van peroxisomale enzymen, en dus peroxisomen, tijdens de groei van H. polymorpha op methanol (zie foto’s hiernaast). De eerste stap in de methanolstofwisseling (de oxidatie van methanol tot formaldehyde en waterstofperoxide) wordt gekatalyseerd door het enzym methanoloxidase. Waterstofperoxide wordt vervolgens afgebroken door het enzym catalase. Doordat beide enzymen zich in het peroxisoom bevinden, wordt het geproduceerde waterstofperoxide ter plekke meteen weer onschadelijk gemaakt, waardoor het geen schade kan toebrengen aan andere onderdelen van de cel. De rol van peroxisomen beperkt zich niet tot het metabolisme van methanol in een bijzondere gistsoort. Integendeel, er zijn vele, zeer uiteenlopende functies van peroxisomen bekend. In een ander micro-organisme, de schimmel Penicillium chrysogenum, worden bijvoorbeeld de laatste stappen van de synthese van het antibioticum penicilline gekatalyseerd door peroxisomale enzymen. Bij planten zijn peroxisomen essentieel voor het ontkiemingsproces in oliehoudende zaden. Tijdens de ontkieming van de zaden bevatten de peroxisomen speciale enzymen die de olie erin afbreken tot kleinere moleculen die worden gebruikt als voedsel voor de ontwikkeling van het kiemplantje. Bij zoogdieren, dus ook bij mensen, zijn peroxisomen o.a. betrokken bij de afbraak van zeer lange vetzuurmoleculen en bij de synthese van cholesterol. Het belang van deze organellen voor de mens werd duidelijk toen zo’n vijfentwintig jaar geleden bekend werd dat het niet of slecht functioneren van peroxisomen leidt tot ernstige ziektebeelden, die voornamelijk worden veroorzaakt door
Detail van een doorsnede door een peroxisoom in een op methanol gekweekte gistcel waarin te zien is dat de matrix van het organel een kristal bevat dat opgebouwd is uit afzonderlijke moleculen van het enzym methanoloxidase (cryocoupe).
Immunolabeling experiment waarmee met behulp van antistoffen waaraan goudbolletjes zijn gekoppeld (zwarte stipjes op de elektronenmicroscopische foto) het enzym methanoloxidase in de peroxisomale matrix is gelokaliseerd. Afkortingen: P (peroxisoom), M (mitochondrion) en N (kern).
55
ophoping van zeer lange vetzuurmoleculen in het lichaam van de patiënt. Er bestaat een heel scala aan erfelijke peroxisomale afwijkingen die variëren van het ontbreken van één of meer peroxisomale enzymen tot de afwezigheid van het gehele organel, inclusief alle daarin voorkomende enzymen. In het laatste geval, het zogenaamde Zellweger syndroom, leidt dit meestal binnen enkele maanden na de geboorte tot de dood.
Doorsnede door een op methanol gekweekt wild type H. polymorpha waarin duidelijk zichtbaar is dat het krystallijne enzym methanoloxidase wordt omgeven door de peroxisomale membraan.
Gisten echter hebben de unieke eigenschap dat ze zonder peroxisomen in leven gehouden kunnen worden. Ze kunnen niet meer op voedingsstoffen groeien die door peroxisomale enzymen worden omgezet, zoals methanol in het geval van de gist H. polymorpha. Door peroxisoomloze gistmutanten (z.g. pex mutanten) te isoleren is het mogelijk de genen die betrokken zijn bij de vorming van peroxisomen (PEX genen) te identificeren. Door de genetische informatie in de verschillende PEX genen van gist te vergelijken met de op dit moment beschikbare informatie over genen van de mens - dankzij de resultaten van het mondiale humane genoom project - zijn inmiddels enkele PEX genen van de mens geïdentificeerd. Op deze manier heeft het onderzoek aan gistperoxisomen een belangrijke bijdrage geleverd aan het achterhalen van de oorzaak van bepaalde ernstige erfelijke ziekten. Deze informatie is ook van belang voor de diagnostiek van deze erfelijke ziekten, de ontwikkeling van nieuwe medicijnen en, eventueel in de toekomst, ook voor gentherapie.
M. Veenhuis en I.J. van der Klei Eukaryote Microbiologie Rijksuniversiteit Groningen
Doorsnede door een peroxisoomloze pex mutant van H. polymorpha. Het enzym methanoloxidase wordt in deze mutant nog steeds gemaakt, echter door een mutatie in een gen dat belangrijk is voor de vorming van de peroxisomale membraan, ontbreekt deze membraan volledig. Het peroxisomale eiwit bevindt zich daardoor los in het cytosol, waar het een groot kristal heeft gevormd, en tevens in de kern waar een kleiner eiwitkristal zichtbaar is.
56
Informatieservice Bio-Wetenschappen en Maatschappij
De stichting Bio-Wetenschappen en Maatschappij stelt zich ten doel informatie te verschaffen over de ontwikkelingen in de biowetenschappen en over de maatschappelijke aspecten daarvan. Hiertoe beschikt zij over een documentatiesysteem waarin onderwerpen als biotechnologie, chronische ziekten, milieuvervuiling, ouder worden, reageerbuisbevruchting, gentherapie, klonen en erfelijkheid zijn opgenomen. De documentatie omvat tijdschriften, boeken, krantenknipsels en dergelijke. Iedereen kan van de documentatie gebruik maken voor een scriptie, spreekbeurt, lezing, artikel, enzovoort. Men kan zelf informatie verzamelen of deze telefonisch dan wel schriftelijk aanvragen. De informatieverstrekking is in principe gratis; alleen bij hoge kopieer- en portokosten wordt een vergoeding gevraagd.
Als u zelf iets in ons documentatiesysteem wilt opzoeken, bent u van harte welkom, maandag t/m vrijdag van 10 tot 17 uur. Ons adres: Postbus 2046, 3440 DA Woerden Telefoon 0348 - 689 318
STICHTING BIO-WETENSCHAPPEN EN MAATSCHAPPIJ Nooit tevoren waren er zoveel onderzoekers wereldwijd bezig met de verwerving van kennis op tal van gebieden van de biologie van de mens. Groots opgezette onderzoeksprogramma’s als het ‘Human Genome Project’ en het ‘Decennium of the brain’ laten zien dat de verwachtingen hoog gespannen zijn. Onderzoekers beschikken tegenwoordig over geavanceerde technieken, waarmee zij processen die zich in ons lichaam afspelen tot in detail kunnen ontrafelen en waarmee moleculen en cellen in beeld gebracht kunnen worden. Beeldtechnieken maken het tevens mogelijk dat men een kijkje in het lichaam neemt. Een ontoegankelijk gebied als de hersenen kan nu life bestudeerd worden, omdat men de activiteit van hersencellen zichtbaar maakt. Al die technieken leveren een stortvloed van gegevens op, die men bovendien geautomatiseerd kan verwerken en opslaan. Waar deze enorme toename van kennis toe zal leiden, is niet te voorzien. Maar de ingrijpende maatschappelijke gevolgen, in het bijzonder voor de gezondheidszorg, tekenen zich al duidelijk af. In 1969 werd door mensen die voorzagen dat ontwikkelingen in de biowetenschappen het dagelijks leven diepgaand zouden kunnen beïnvloeden, de stichting Bio-Wetenschappen en Maatschappij opgericht. Het leek hen niet verantwoord dat alleen een beperkt aantal mensen geïnformeerd was over de te verwachten ontwikkelingen, bijvoorbeeld op het gebied van genetisch onderzoek, hersenonderzoek, reageerbuisbevruchting of transplantaties. De stichting Bio-Wetenschappen en Maatschappij heeft als doelstelling:”in brede kring het inzicht te bevorderen in de aktuele en toekomstige ontwikkeling en toepassing der biowetenschappen, in het bijzonder met het oog op de betekenis en gevolgen voor mens en maatschappij” (statuten, art.2). De stichting is onafhankelijk. Zij wil een bijdrage leveren aan de meningsvorming door toegankelijke informatie beschikbaar te stellen voor een breed publiek. De vraag is wat wij gaan doen met de mogelijkheden die de nieuwe wetenschappelijke inzichten en technieken ons kunnen bieden.
