UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie
ÚČINKY VYBRANÝCH CHINAZOLINOVÝCH DERIVÁTŮ SLEDOVANÉ IN VITRO NA IZOLOVANÉ TRACHEE POTKANA
Diplomová práce
Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Jana Pourová, Ph.D.
Hradec Králové 2012
Lenka Zarzycká
„Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Tato práce nebyla použita k získání jiného či stejného titulu“.
Děkuji své vedoucí diplomové práce PharmDr. Janě Pourové, Ph.D. za odborné vedení, ochotu a vstřícnou pomoc s vypracováním této diplomové práce.
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka:
Lenka Zarzycká
Školitel:
PharmDr. Jana Pourová, Ph.D.
Název diplomové práce:
Účinky vybraných chinazolinových derivátů sledované in vitro na izolované trachee potkana
Adhatoda vasica (syn. Justicia adhatoda) se v lidovém léčitelství užívá především k terapii astmatu. Její hlavní účinnou látkou je izochinolinový alkaloid vasicin. Cílem této práce bylo stanovit bronchodilatační účinky nových derivátů izochinolinu, a to 4-(3-(piperidin-1-yl)propyloxy)chinazolin-1-oxid (VN-024) a 2-(3-(piperidin-1-yl) propylsulfanyl)chinoxalin hydrochlorid (VN-034). Ke zjištění bronchodilatačního efektu zkoumaných látek jsme použili metodiku izolované trachey potkana. Průdušnici jsme nejprve kontrahovali karbacholem (10-5 M) a postupně relaxovali kumulativním přidáváním testované látky. Na konci experimentu byla maximální relaxace trachey navozena theofylinem (10-2 M). V programu GraphPad jsme z křivek testovaných látek vypočítali hodnoty EC50 a získané výsledky jsme srovnali s dilatačním efektem theofylinu. Obě zkoumané látky vykázaly při srovnání hodnot EC50 několikanásobně vyšší bronchodilatační účinky než theofylin.
Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology & Toxicology Student:
Lenka Zarzycká
Supervisor:
PharmDr. Jana Pourová, Ph.D.
Title of diploma thesis:
In vitro effects of some quinazoline derivatives on isolated rat trachea
Adhatoda vasica (syn. Justicia adhatoda) is especially used for treatment asthma in a folk medicine. Its main effective substance is an isoquinoline alkaloid vasicine. The aim of this study was to determine the bronchodilator effects of the new izoquinoline derivatives, 4-(3-(piperidine-1-yl)propyloxy)quinazoline-1-oxide (VN-024) and 2-(3 (piperidine-1-yl)propylsulphanyl)quinoxaline hydrochloride (VN-034). To determine bronchodilator effect of research substances we used the methodology of isolated rat trachea. At first, we contracted rat trachea by carbachol and gradually relax by the cumulative addition of test substance. At the end of the experiment, the maximum tracheal relaxation was induced by theophylline (10-2 M). At program GraphPad we calculated EC50 from the curves values of tested compounds and obtained results were compared with the dilatation effect of theophylline. Both tested substances in compare EC50 values showed much higher bronchodilator effect than theophylline.
Obsah
1
Seznam zkratek ...................................................................................................... 1
2
Úvod ....................................................................................................................... 2
3
Teoretická část ....................................................................................................... 3 3.1
Astma bronchiale............................................................................................ 3
3.1.1
Charakteristika ........................................................................................ 3
3.1.2
Epidemiologie.......................................................................................... 3
3.1.3
Etiopatogeneze ....................................................................................... 3
3.1.4
Klasifikace ................................................................................................ 4
3.1.5
Farmakoterapie ....................................................................................... 6
3.2
Chronická obstrukční plicní nemoc .............................................................. 11
3.2.1
Charakteristika ...................................................................................... 11
3.2.2
Epidemiologie........................................................................................ 11
3.2.3
Etiopatogeneze ..................................................................................... 11
3.2.4
Klasifikace .............................................................................................. 12
3.2.5
Farmakoterapie ..................................................................................... 12
3.2.6
Nefarmakologická terapie ..................................................................... 15
3.3
Deriváty chinazolinu a chinoxalinu ............................................................... 17
3.3.1
Adhatoda vasica .................................................................................... 17
3.3.2
Účinky derivátů chinazolinů a chinoxalinů na respirační systém ......... 19
4
Cíle práce ............................................................................................................. 22
5
Experimentální část ............................................................................................. 23 5.1
Použitý materiál a zvířata ............................................................................. 23
5.1.1
Chemikálie ............................................................................................. 23
5.1.2
Testované látky ..................................................................................... 23
5.1.3
Použité přístrojové vybavení ................................................................. 24
5.1.4
Zvířata.................................................................................................... 24
5.2
Metodika....................................................................................................... 24
5.2.1
Přípravná fáze........................................................................................ 24
5.2.2
Vlastní pokus ......................................................................................... 26
5.2.3
Vyhodnocení a statistická analýza ........................................................ 26
6
Výsledky ............................................................................................................... 27
7
Diskuze ................................................................................................................. 30
8
Závěr .................................................................................................................... 31
9
Literatura ............................................................................................................. 32
1
1 Seznam zkratek
CHOPN
chronická obstrukční plicní nemoc
SABA
krátkodobě účinná β2-sympatomimetika
IKS
inhalačně působící kortikosteroidy
LABA
inhalační β2-sympatomimetika s dlouhodobým účinkem
DDOT
dlouhodobá domácí oxygenoterapie
2
2 Úvod Astma bronchiale a chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN) jsou závažná onemocnění respiračního systému. Pro obě je charakteristická obstrukce dýchacích cest, která je v případě CHOPN ireverzibilní. Tato onemocnění nejsou plně léčitelná a jejich prevalence v rozvojových i rozvinutých zemích neustále vzrůstá. Pokud nejsou dostatečně léčena, dochází rychle k jejich zhoršení a ke vzniku nevratných změn v dýchacím systému. Astma se stává nejčastějším chronickým onemocněním dětského věku, CHOPN je nyní druhou nejrozšířenější neinfekční nemocí na světě. To má nejen ekonomické a sociální dopady na nemocné jedince, ale i na celou společnost. V současné době je k dispozici mnoho terapeutických možností, farmakologických i nefarmakologických. Avšak mortalita obstrukčních nemocí stále stoupá, proto je nutné pokračovat v hledání a výzkumu nových účinných látek. Jednou z možností je zaměřit se na rostliny užívané v lidovém léčitelství, izolovat účinnou látku drogy a pokusit se o syntézu jejich účinnějších derivátů.
3
3 Teoretická část
3.1 Astma bronchiale
3.1.1 Charakteristika Astma bronchiale je chronické zánětlivé onemocnění dolních cest dýchacích. Hlavním patologickým znakem je zánět dýchacích cest, někdy spojený se strukturálními změnami (GINA 2010). Zánět doprovází zvýšená reaktivita dýchacích cest na různé stimuly (bronchiální hyperreaktivita). Výsledkem je variabilní bronchiální obstrukce – jejími příznaky jsou pískoty, dušnost, kašel a pocit tíhy na hrudi. Symptomy se nejčastěji projevují v noci nebo brzkých ranních hodinách. Hlavními buňkami, které se tohoto zánětu zúčastní, jsou Th2 lymfocyty, eozinofilní granulocyty a žírné buňky, méně se uplatňují neutrofilní a bazofilní granulocyty (Kašák et al. 2001). Astma nelze zcela vyléčit, ale vhodně zvolenou terapií lze nad ním dosáhnout kontrolu a dlouhodobě ji udržet.
3.1.2 Epidemiologie Astma je celosvětově rozšířenou nemocí, odhaduje se, že jí trpí asi 300 milionů osob (GINA 2010). Výskyt astmatu a alergií vůči nejrůznějším látkám stále vzrůstá, a to především v mladší dětské populaci ve věku 6-7let. V současné době je astma nejčastějším chronickým onemocněním dětského věku (Marek 2010). Celková prevalence se v ČR odhaduje na více než 5 %, v dětské populaci již přesáhla 10 % (Kašák et al. 2001).
3.1.3 Etiopatogeneze Nejzávažnějším faktorem pro rozvoj astmatu je geneticky determinovaná atopie, jež je definována jako tvorba abnormálního množství IgE protilátek, která je odpovědí na
4
obecné alergeny zevního prostředí (Marek 2010). Dispozice k astmatu je dědičná, jedná se o polygenní autozomálně recesivní přenos (geny na 11. a 5. chromozomu). Pokud mají oba rodiče týž projev alergie, je riziko výskytu alergického onemocnění až 70% (Pohl 2001). Fenotypickým znakem je chronický eozinofilní zánět v dýchacích cestách s poškozením epitelu a rozvojem časných strukturálních změn a s patofyziologickými projevy bronchiální hyperreaktivity, na které má svůj podíl i dysfunkce hladkých svalů průdušek (Kašák et al. 2001). Vnější faktory u predisponovaných osob zvyšují vnímavost ke vzniku astmatu a jsou příčinou perzistujících příznaků a záchvatů. Mezi zevní faktory, které mají za následek rozvoj astmatu, patří především alergeny, respirační infekce, kuřáctví, tělesná námaha, iritační látky (SO2, NO2, různé chemikálie) či farmaka (nesteroidní antiflogistika). Psychické a endokrinní vlivy rovněž působí na rozvoj nemoci. Dalším faktorem je obezita, i když není zcela jasné, jakým mechanismem astma podporuje. Rizikovým faktorem je rovněž mužské pohlaví, u chlapců do 14 let je prevalence astmatu téměř dvakrát tak velká než u stejně starých dívek (GINA 2010).
3.1.4 Klasifikace Rozlišují se celkem čtyři stupně závažnosti astmatu (Tab. 1). Podle stupně se pak stanovuje léčba pacienta.
5
Tab.1 Rozdělení astmatu podle stupně, frekvenci příznaků, průběhu exacerbací a doporučené léčby (převzato z Marek 2010, Krčmová a Novosad 2010)
Stupeň
Denní
Noční
Exacerbace
Léčba
astmatu
příznaky
příznaky
Stupeň intermitentní
<1× týdně
≤2× měsíčně
krátké
SABA podle potřeby
Stupeň lehké perzistující
>1× týdně
>2× měsíčně
vliv na denní aktivity a spánek
nízké dávky IKS nebo antileukotrieny, theofyliny
Stupeň
denně
>1× týdně
narušení běžné denní činnosti a spánku
nízká až střední dávka IKS plus LABA nebo další extra léčba
denně
často
omezení vysoká dávka IKS fyzických aktivit plus LABA a/nebo další extra léčba
<1× týdně
středně těžké perzistující Stupeň těžké perzistující
SABA
rychle působící inhalační β2-agonisté
IKS
inhalačně působící kortikosteroidy
LABA
inhalační β2-agonisté s dlouhodobým účinkem
6
3.1.5 Farmakoterapie Astma je nevyléčitelné onemocnění, avšak pokud je terapie vhodně zvolena a pacient ji dodržuje, lze nemoc dobře kontrolovat. Mezi obecně stanovené cíle terapie astmatu patří:
Dosažení kontroly příznaků onemocnění a spouštěcích faktorů
Prevence akutního zhoršení
Prevence možného úmrtí na akutní projevy a prevence zhoršení onemocnění
Prevence nežádoucích účinků léčiv (Lincová et al. 2007)
Terapie astmatu je dlouhodobá a málokdy vyžaduje užití pouze jedné látky. Monoterapie úlevovým bronchodilatačním léčivem je možná pouze u pacientů s intermitentním astmatem, u ostatních je navíc indikována pravidelná protizánětlivá léčba. Rozlišujeme dvojí terapii astmatu – úlevovou a preventivní. Léčiva lze podat několika různými způsoby, preferována je inhalační forma před perorálním či injekčním podání. Výhodou je aplikace léčiva přímo do místa působení, což má za následek dosažení účinných koncentrací v místě astmatického zánětu, minimalizaci nežádoucích systémových účinků a podstatně rychlejší nástup účinku.
Rychle působící bronchodilatancia Rychle působící bronchodilatancia dělíme na krátkodobě a dlouhodobě účinná terapeutika. Užívají se v případech, kdy je nutné odstranit akutní potíže nemocného, především dojde-li k bronchokonstrikci. Někdy se označují jako úlevová antiastmatika.
Inhalační
β2-agonisté
s rychlým
nástupem
účinku
(krátkodobě
účinná
β2
sympatomimetika) Krátkodobě účinná β2-sympatomimetika (SABA) se aplikují podle potřeby. U pacientů s interminentním astmatem vystačí SABA jako monoterapie, u těžších forem se užívají v kombinaci dalšími léčivy. Relaxují hladké svaly průdušek, podporují mukociliární clearence a snižují vaskulární permeabilitu. Na zánětlivé změny
7
v průduškách nemají žádný vliv (Kottová et al. 2008). Jejich účinek je rychlý, trvá 4 až 6 hodin, maximum nastává během 30 minut (Lincová et al. 2007). Z této skupiny se užívá fenoterol, salbutamol, terbutalin a hexoprenalin.
Systémové kortikosteroidy Jako úlevová antiastmatika se mohou kortikosteroidy podávat perorálně či parenterálně. Mají pomalý nástup účinku (za 4 až 6 hodin), přesto jsou důležitými léčivy v terapii těžké exacerbace astmatu. Působí preventivně proti progresi exacerbace, snižují potřebu urgentní návštěvy ambulancí a hospitalizace, působí preventivně proti časnému relapsu po ukončení akutní léčby a snižují nemocnost (Marek 2010). Jejich nevýhodou jsou závažné nežádoucí účinky. Pokud jsou užívány dlouhodobě, může se objevit osteoporóza, arteriální hypertenze, diabetes, obezita, suprese osy hypotalamus – hypofýza - nadledviny, katarakty, glaukom, ztenčení kůže a svalová slabost (GINA 2010). V současné terapii se používá methylprednisolon, prednison a triamcinolon.
Inhalační anticholinergika s krátkodobým účinkem Anticholinergní látky blokují muskarinové receptory, čímž omezují účinky acetylcholinu, který se podílí na spazmu bronchiálního svalstva. U astma bronchiale mají inhalační anticholinergika menší bronchodilatační účinek než inhalační β2-agonisté a všeobecně pomalejší nástup účinku – maxima je dosaženo až za 30-60 minut a doba trvání účinku je 6-8 hodin (Marek 2010). Užívají se především jako alternativa bronchodilatační léčby u nemocných, pro které není vhodná terapie β2-mimetiky s rychlým nástupem účinku (starší pacienti a osoby, u kterých β2-mimetika vyvolávají třes či tachykardii). Jako nežádoucí účinek se může vyskytnout sucho v ústech a hořká chuť. Do této skupiny se řadí ipratropium, tiotropium či oxitropium.
Theofyliny s krátkodobým účinkem Theofyliny inhibují fosfodiesterasu, což má za následek dilataci bronchů. Mechanismus účinků však není příliš jasný, předpokládá se také vliv na adenosinové receptory. Ve srovnání s inhalačními krátkodobými β2-mimetiky jsou méně účinné a mají výrazně pomalejší nástup účinku (Pauk a Zatloukal 2002a). Theofyliny jsou
8
používány především jako aditivní bronchodilatancia u pacientů se středně těžkým či těžkým astmatem, u kterých se podáváním samotných inhalačních kortikosteroidů nedosahuje požadovaného efektu (Marek 2010, GINA 2010). Mají četné nežádoucí účinky, které však mohou být redukovány pečlivou volbou dávky léčiva a monitorováním pacienta. Z nežádoucích účinků se může objevit nauzea, zvracení, bolest hlavy, neklid, porucha spánku, srdeční arytmie či diuréza.
Preventivní antiastmatika Preventivní antiastmatika jsou léčiva, která je nutné užívat pravidelně a dlouhodobě. Mají preventivní účinek a jejich cílem je udržet astma pod kontrolou. Někdy jsou označována i jako protizánětlivá.
Inhalační kortikosteroidy Inhalační kortikosteroidy jsou v současné době nejúčinnějšími látkami kontrolující astmatický zánět. Zlepšují plicní funkce a kvalitu života, snižují bronchiální hyperreaktivitu, redukují příznaky, frekvenci a tíži exacerbací (Marek 2010). V souvislosti s patogenezí astmatu je jedním z nejdůležitějších účinků kortikosteroidů snížení tvorby cytokinů, které aktivují eozinofily a odpovídají za zvýšenou produkci IgE a expresi IgE receptorů (Lincová et al. 2007). Jsou indikovány u všech forem perzistujícího astmatu. Pro jejich použití se musí dodržet několik zásad. Léčbu je nutné zahájit co nejdříve, pokud možno inhalačně. Terapie se zahajuje vyššími dávkami, které se postupně po stabilizaci snižují na nejmenší ještě účinné, nejdříve však po třech měsících podávání (Fendrich et al. 2002). Nežádoucí systémové účinky jsou při odpovídajícím dávkování minimální. Může se vyskytnout otofaryngeální kandidóza, chrapot či kašel s bronchospasmem, lze je však omezit pravidelným vyplachováním úst po inhalaci. V současné době se používá beclomethason, budesonid, ceclesonid, fluticason, často ve fixní kombinaci s inhalačním β2-agonistou s dlouhodobým účinkem (LABA).
9
Systémové kortikosteroidy Podání kortikosteroidů perorální cestou se uplatňuje u těžkých astmatických stavů, kdy inhalační kortikosteroidy a další léčiva nestačí ke zvládnutí onemocnění. Na rozdíl od inhalačních mají výrazné nežádoucí účinky, dlouhodobá terapie je tedy nežádoucí. Preferovány jsou prednison, prednisolon nebo methylprednisolon pro jejich minimální mineralokortikosteroidní účinky, relativně krátký poločas účinku a omezený účinek na příčně pruhovaný sval (Marek 2010).
β2-mimetika s dlouhodobým účinkem β2-mimetika s dlouhodobým účinkem podobně jako ostatní β2-agonisté relaxují hladké svalstvo dýchacích cest, zlepšují mukociliární clearence, snižují vaskulární permeabilitu a mohou modulovat uvolnění mediátorů z mastocytů a bazofilů (Marek 2010). Jejich účinek trvá kolem 12 hodin, nabízejí tedy dlouhodobou ochranu před bronchokonstrikcí. Řadí se mezi ně formoterol, salmeterol (inhalační formy) a procaterol, bambuterol, clenbuterol (perorální formy). Formoterol má rychlý nástup účinku, je možné ho použít i k odstranění akutního záchvatu.
Antileukotrieny Leukotrieny jsou mediátory, které se uplatňují při některých zánětlivých a alergických
reakcích
a
jsou
zodpovědné
za
řadu
astmatických
příznaků
(bronchokonstrikce, zvýšená vaskulární permeabilita, zvýšená sekrece a hypertrofie hladké svaloviny). Pro omezení jejich účinků se uplatňují antileukotrieny, které mohou účinkovat dvěma způsoby: inhibicí 5-lipoxygenazy a tím i tvorby leukotrienů nebo antagonistickým působením na leukotrienových receptorech. Při dlouhodobém podávání mají účinek bronchodilatační, bronchoprotektivní a protizánětlivý (Pauk a Zatloukal 2002). Užívají se při léčbě lehkého perzistentního astmatu a u pacientů s aspirinovým astmatem, jestliže na tuto léčbu reagují. Pokud jsou užívány společně s glukokortikoidy, výrazně snižují jejich dávky potřebné pro kontrolu astmatu (GINA 2010). V současné době se v terapii uplatňuje montelukast, zafirlukast, pranlukast (antagonisté receptoru) a zileuton (inhibitor 5-lipoxygenazy).
10
Kromony Kromony stabilizují membránu mastocytů a inhibují tak vyplavení histaminu, leukotrienů a dalších mediátorů zánětu (Kottová et al. 2008). Snižují exacerbace astmatu, ale jejich vliv na ostatní projevy není účinnější než placebo. Jednorázová aplikace těchto látek zeslabuje bronchospasmus vyvolaný námahou či chladným vzduchem. U malé části pacientů se jako nežádoucí účinek vyskytuje kašel, dráždění krku či bronchokonstrikce při užití nedokromilu, kromoglykát sodný může způsobit nechutenství, bolest hlavy či nauzeu (GINA 2010).
Antihistaminika 2. generace H1- antagonisté jsou indikovány při současném výskytu astmatu a alergické rýmy. Nežádoucím účinkem některých antihistaminik 2. generace je sedace. Řadí se mezi ně levocetirizin, desloratadin a rupatadin (Kottová et al. 2008).
Biologická léčba Omalizumab je monoklonální protilátka odvozená z rekombinantní DNA, která se selektivně váže na lidský imunoglobulin E – je tedy antiIgE protilátkou. Omalizumab je indikován pro léčbu těžkého perzistujícího alergického astmatu, které není možné zvládnout
inhalačními
kortikosteroidy společně
s
inhalačními
β2-agonisty s
dlouhodobým účinkem (Krčmová 2006). Snižuje počet exacerbací, zlepšuje kvalitu života a kontrolu komorbidit – alergické rýmy a dermatitidy, vliv na zlepšení plicních funkcí však nebyl prokázán (Sedlák a Koblížek 2010).
11
3.2 Chronická obstrukční plicní nemoc
3.2.1 Charakteristika Chronická obstrukční plicní nemoc je považována za onemocnění, kterému lze předcházet. Má významné mimoplicní účinky, jež mohou přispívat k jeho závažnosti u jednotlivých nemocných. Jeho plicní složka je charakterizována bronchiální obstrukcí, která není plně reverzibilní. Bronchiální obstrukce obvykle progreduje a je spojena s abnormální zánětlivou odpovědí plic na škodlivé částice a plyny (GOLD 2010). Zánět postihuje velké i malé bronchy a plicní parenchym. Zánětlivé změny zahrnují metaplazii pohárkových buněk, zmnožení a hypertrofii hlenových žláz, hypervaskularizaci a hypertrofii hladké svaloviny a změny v extracelulární matrix společně s hromaděním zánětlivých buněk (Musil 2009). Mezi symptomy CHOPN patří chronický kašel, pískoty při dýchání a námahová dušnost.
3.2.2 Epidemiologie Úmrtnost na CHOPN stále stoupá, v současné době je podle Světové zdravotnické organizace čtvrtou nejčastější příčinou úmrtí a odhaduje se, že v roce 2020 se posune na místo třetí. Prevalence v České republice je v současnosti 7-10 % .
3.2.3 Etiopatogeneze CHOPN obvykle vzniká jako následek chronické bronchitidy vyvolané nejčastěji iritanty (cigaretový kouř, vzdušné polutanty) nebo infekcí. Opakované záněty vedou ke zvýšení velikosti a počtu mukózních žlázek a gobletových buněk v respiračním epitelu, sekrece hlenu je nadměrná, rozvíjí se obstrukce dýchacích cest (Fendrich et al. 2002). Mezi genetické rizikové faktory patří vrozená deficience α1-antitrypsinu, hlavního cirkulujícího inhibitoru serinových proteáz. Tato deficience vede u kuřáků i nekuřáků k předčasnému a urychlenému rozvoji panlobulárního emfyzému (GOLD 2010).
12
3.2.4 Klasifikace CHOPN dělíme podle závažnosti do čtyř stádií (Tab. 2), podle kterých se stanovuje terapie.
Tab. 2 Rozdělení chronické obstrukční plicní nemoci podle stádií, klinické charakteristiky a doporučené léčby (převzato z Marek 2010) Stadium
Klinická charakteristika
Léčba
I - lehké
Kašel, expektorace, pacient si ještě nemusí uvědomovat abnormální funkci plic
Vyhnutím se rizikových faktorů, bronchodilatancia s krátkodobým účinkem podle potřeby
II - středně těžké
Příznaky progredují, objevuje se klinická dušnost
Jako I. stadium, navíc jedno nebo více bronchodilatancií s dlouhodobým účinkem a rehabilitace
III - těžké
Typické je zhoršení dušnosti, která limituje pacienta v aktivitách, opakované exacerbace
Jako II. stadium, navíc inhalační kortikosteroidy
IV - velmi těžké
Kvalita života zjevně zhoršena, exacerbace mohou být život ohrožující
Jako III. stadium, navíc dlouhodobá domácí oxygenoterapie a zvážení chirurgické léčby
3.2.5 Farmakoterapie Farmakoterapie u CHOPN slouží k prevenci a kontrole symptomů, snižuje frekvence a závažnost exacerbací, zlepšuje zdravotní stav a fyzickou kondici (GOLD 2010). Jejím cílem je zabránění progresi nemoci. Terapie závisí na vážnosti onemocnění, obecně se léčiva postupně přidávají s rostoucím stadiem. Kromě farmakologické léčby jsou nutné
13
i různé nefarmakologické metody. Pro maximální účinek léčby je nutné přestat kouřit a vyhýbat se možným rizikovým faktorům ze zevního prostředí.
Bronchodilatační terapie Bronchodilatancia jsou základem terapie stabilizované i exacerbované CHOPN. Jsou preferovány inhalační formy, působí v místě podání a navíc mají rychlejší nástup účinku než perorální podání. U terapie CHOPN se osvědčila anticholinergika, zatímco u astmatiků se více preferují pro svou účinnost β2-agonisté (Dindoš 2005).
Krátkodobě účinná β2-sympatomimetika β2-mimetika se využívají již v I. stadiu nemoci především ke zmírnění a prevenci příznaků dle potřeby pacienta i pro pravidelné užívání. Zvyšují hlavně odolnost vůči tělesné zátěži, i když významně nezlepšují plicní funkce (Musil 2009).
Inhalační β2-agonisté s dlouhodobým účinkem LABA mají bronchodilatační a protizánětlivý efekt, zlepšují FEV1, výkonnost a zdravotní stav pacienta, redukují frekvenci exacerbací a projevy choroby (Turčáni 2008). Působí 12 hodin a více. Jsou indikovány v případech, kdy je nutno podávat pravidelně bronchodilatancia, tedy od II. stadia CHOPN.
Inhalační anticholinergika s krátkodobým účinkem Nejvýznamnějším účinkem anticholinergik je blokáda M3 receptorů, která má za následek zmírnění bronchokonstrikce a zmenšení produkce hlenu v submukózních žlázkách (Kašák 2006). Jejich bronchodilatační účinek trvá déle než účinek SABA. V současné době se používá ipratropium bromid, který blokuje i M2 receptory, což je méně výhodné.
Anticholinergika s dlouhodobým účinkem Dlouhodobě působícím anticholinergikem je tiotropium bromid, jehož účinek trvá více než 24 hodin. Redukuje počet exacerbací a hospitalizací, zlepšuje zdravotní stav pacienta a toleranci fyzické zátěže, zvyšuje kvalitu života. Má také efekt i na zánětlivé
14
buňky (neutrofily, makrofágy a T-lymfocyty), blokuje produkci acetylcholinu uvolňovaného v místě zánětu makrofágy a epiteliálními buňkami (Turčáni 2008). Dnes je lékem první volby u stabilizované CHOPN, jako jediný dokáže zastavit progresi obstrukce díky hyperinflaci plic.
Theofyliny Theofyliny jsou díky vážným nežádoucím účinkům léčivy druhé řady. Vzhledem k jejich úzké terapeutické šíři se doporučuje podávat pouze přípravky s pomalu se uvolňující účinnou látkou. Kombinace theofylinu s kortikoidy potlačuje uvolňování zánětlivých cytokinů z makrofágů a epiteliálních buněk, i když samostatně podávané léky takový efekt nemají. Předpokládá se, že minimální protizánětlivý efekt theofylinu je přidáním kortikoidů potencován (Turčáni 2008).
Jiná farmakoterapie
Inhalační kortikosteroidy Pravidelné podávání inhalačních kortikosteroidů je indikováno pro léčbu nemocných s těžkou až velmi těžkou CHOPN (stadium III a IV). Bylo prokázáno, že jejich užívání snižuje výskyt exacerbací a zlepšuje se tak zdravotní stav u symptomatických pacientů. Jejich fixní kombinace s LABA je mnohem efektivnější než samostatné podání obou látek (GOLD 2010). Užívání kortikosteroidů ovšem není v tomto případě tak jednoznačné jako v terapii astmatu, zlepšení nastává jen u části pacientů s CHOPN, rizika nežádoucích účinků přitom zůstávají stejná. Proto je tato léčba určena pouze pro pacienty, kteří na ni dobře reagují.
α1-antitrypsin U pacientů s vrozeným deficitem α1-antitrypsinu je indikována substituční terapie. Bohužel je však tato léčba velmi drahá a ve většině zemí nedostupná (GOLD 2010).
Vakcinace Všem pacientům s CHOPN je doporučena každoroční vakcinace proti chřipce, u starších pacientů je účinnější. Přínosné je i očkování pneumokokovou vakcínou
15
(doporučeno u pacientů starších 65 let), která má účinnost 5 let, dostatečné údaje podporující její širší použití u CHOPN však chybějí (Pauk a Zatloukal 2002b).
3.2.6 Nefarmakologická terapie
Rehabilitace Plicní rehabilitace zahrnuje komplexní rehabilitační program, jehož součástí je zlepšení fyzické kondice, edukace pacienta a zajištění poradenství ohledně životního stylu (odvykání kouření, redukce hmotnosti). Hlavním cílem této metody je zvýšení kvality života nemocného, zvýšení tolerance pro fyzickou zátěž, snížení dušnosti a umožnit nemocnému bezproblémové zapojení do každodenních aktivit.
Dlouhodobá domácí oxygenoterapie (DDOT) DDOT se využívá při nemocech spojených s chronickou respirační insuficiencí, u kterých se vyskytuje hypoxie. Je tedy i součástí terapie velmi těžkého stadia CHOPN. Pokud je tato metoda přidaná k plicní rehabilitaci, zvyšuje při cvičení toleranci zátěže a redukuje dušnost (Turčáni 2008). Ačkoliv dlouhodobé podávání (více než 15 hodin denně) je pro pacienta z hlediska motoriky, čilosti a přežití prospěšné, údaje ohledně kvality života a emocionálním stavu jsou sporné.
Neinvazivní plicní ventilace Neinvazivní plicní ventilace je indikována u pacientů trpících nejtěžším stádiem CHOPN, pro které je dýchání náročné a respirační svaly jej již nezvládají. Rovněž se využívá jako součást plicní rehabilitace.
Chirurgie Chirurgická léčba je vymezena jen pro některé indikace. Zahrnuje celkem tři postupy: bulektomie, volumredukční operace a transplantaci plic.
16
Při bulektomii se vyjme emfyzematózní bula, která stlačuje zdravou tkáň a odstraní se tak nefunkční plicní parenchym. Pokud je zákrok úspěšný, dochází ke zlepšení plicních funkcí a dušnosti (Turčáni 2008). Volumredukční operace je chirurgický postup, při kterém je resekována část plíce, aby se zmenšila hyperinflace. Snížení hyperinflace umožní respiračním svalům zvýšit svoji účinnost (Musil 2009). Transplantace plic je určena pacientům v posledním stadiu nemoci, jejichž očekávaná délka života je 12 – 18 měsíců (Turčáni 2008). Tato metoda však závisí na dárcích orgánů, kterých není mnoho, a samotná transplantace je často provázena komplikacemi.
Odvykání kouření Zanechání kouření je základním předpokladem pro maximální efekt léčby. Pro pacienty ve všech stadiích CHOPN platí, že pokud přestanou kouřit, dojde k významnému zpomalení poklesu dechových funkcí, což se příznivě odrazí na jejich klinických obtížích (Fendrich et al. 2002). Odvykání kouření lze podpořit farmakoterapií, v současnosti se užívají nikotinové náhražky, bupropion a vareniklin. Důležitější je však odhodlání pacienta a změna životního stylu.
17
3.3 Deriváty chinazolinu a chinoxalinu
3.3.1 Adhatoda vasica
Charakteristika Adhatoda vasica (syn. Justicia adhatoda, Obr. 1) je léčivá rostlina pocházející z jihovýchodní Asie. Tento keř je velmi ceněnou rostlinou v ajúrvédské medicíně a v lidovém léčitelství se užívá k terapii rýmy, kašle, astmatu a tuberkulózy ( Ignacimuthu a Shanmugam 2010). K léčebným účelům se využívají především listy, které se jako droga označují Vasaka. Adhatoda obsahuje mnoho látek, z nichž nejvýznamnějšími
jsou
chinazolinové
alkaloidy (vasicin,
vasicinon,
vasicinol,
Obr. 1 Adhatoda vasica
adhatodin, adhatonin, adhavasinon, anisotin
(Převzato z BioLib [Internet]. ©
a peganin). Kromě nich jsou v rostlině
1999-2011 [cit. 2012-04-01].
přítomny betainy, steroidy, alkany silice a
Dostupné z: http://www.biolib.cz )
vitamin C (Claeson et al. 2000, Avicenna 2012).
Účinky adhatody Byly zkoumány methanolické, ethanolické a vodné extrakty adhatody. Methanolický extrakt vykazuje po inhalaci či intragastrickém podání antialergické a antiastmatické účinky na tracheu morčete. Po perorálním podání ethanolického roztoku z listu potkanům a králíkům se projevil hypoglykemický efekt a jejich vodný extrakt se ukázal jako účinný proti mikrobiální flóře izolované u pacientů trpících gingivitidou (Claeson et al. 2000).
18
Adhatoda má rovněž antioxidační a protizánětlivé účinky, hepatoprotektivní, antitusické a bronchodilatační. Také působí antibakteriálně, jako anticestodikum, anthelminthikum a proti prvokům rodu Leischmania (Rachana et al. 2011). Co se týče antitusických účinků adhatody, byla zjištěna účinnost perorálně podaného extraktu adhatody na kašel indukovaný iritanty, která byla srovnatelná s kodeinem. Intravenózní podání extraktu tlumí mechanicky vyvolaný kašel. Proti kašli vyvolanému elektrickou stimulací nervu vagu a trachey je extrakt z adhatody rovněž účinný (Dhuley 1999).
Vasicin a vasicinon Farmakologicky nejvíce studovanou chemickou sloučeninou adhatody je alkaloid vasicin (Obr. 2), který se nachází v listech, květech i kořenech rostliny. Kromě adhatody byl izolován i v dalších rostlinách, např. Sida cordifolia či Galega battiscombei
(Rachana et al. 2011). Vasicin je tricyklický derivát chinazolinu, který vykazuje bronchodilatační aktivitu in vivo a in vitro. Jeho oxidační produkt vasicinon, který adhatoda rovněž obsahuje, naopak má in vivo bronchokonstrikční účinky. Pokud jsou však spolu oba alkaloidy kombinovány, výsledný efekt je bronchodilatační (Claeson et al. 2000). Vliv vasicinu na respirační systém je jen jeden z mnoha jeho účinků. Vyvolává také rytmické kontrakce myometria, přičemž jeho uterotonický efekt je srovnatelný s oxytocinem (Claeson et al. 2000). Má trombopoetické účinky a vykazuje středně silnou hypotenzní aktivitu (Patočka 2011). Rovněž působí antioxidačně, jako antitusikum a abortivum (Rachana et al. 2011).
Obr. 2 Vasicin (převzato z: Wikipedia: The Free Encyclopedia [Internet]. 2001 [cit. 2012-04-04]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/)
19
Vasicin
se
díky
svým
účinkům
stal
předlohou
pro
syntézu
nových
bronchodilatačních látek. Za jeho nejznámější deriváty jsou považovány bromhexin a jeho metabolit ambroxol, jenž se pro své mukolytické a sekretomotorické účinky využívá jako expektorans, i když v obou případech je již chemická struktura značně modifikována.
3.3.2 Účinky derivátů chinazolinů a chinoxalinů na respirační systém
Antialergické účinky Derivát chinazolinu 10-(2,3-dimethyl pentanamido)-4-oxo-4H-pyrimido [1,2-C] chinazolin-3-karboxylát sodný (označovaný jako FR50948) byl zkoumán na antialergickou aktivitu. Tato látka má inhibiční účinek na I. a III. typ alergické reakce, ale II. a IV. typ neovlivňuje. Efekt FR50948 podaného intravenózně potkanovi proti IgE vyvolané reakci byl mnohem vyšší než účinek kromoglykátu sodného a srovnatelný s lodoxamidem. Také působí inhibičně na reakci vyvolanou IgG, avšak inhibice je méně než 50 % při podání maximálních dávek. Rovněž inhibuje v závislosti na dávce anafylaktickou bronchokonstrikci a vyplavování histaminu ze žírných buněk (Hiroi et al. 1988). Deriváty 4-fenyl-1,2,4-triazolo[4,3-a]chinazolin-5(4H)-onu substituované v poloze 1 byly testovány in vivo na morčatech jako antihistaminika působící na H1 receptorech. Výsledky ukázaly protektivní vliv těchto látek vůči histaminem vyvolanému bronchospasmu (Alagarsamy et al. 2005). 2,3-dimethoxy-6,6-dimethyl-5,6-dihydrobenzo[7,8]indolizino[2,3-b]chinoxalin (označován také jako YM-90709) byl intravenózně podáván myším a potkanům. Tato látka jako antagonista inteurleukin-5 receptorů vykázala inhibici eozinofilní infiltrace v dýchacích cestách zvířat. Účinek nastal díky potlačení diferenciace a aktivace eozinofilů (Morokata et al. 2005).
20
Bronchodilatační účinky Chinazolin a chinoxalin působí relaxačně na kontrakci izolované trachey prasete, která byla vyvolána histaminem. K dosažení požadovaných účinků stačí nízké dávky, proto tyto látky mají vysoký potenciál pro vývoj nových antiastmatických léčiv (Lee a Lee 2011). 2,4-diethoxy-6,7,8,9,10,12-hexahydroazepino[2,1-b]chinazolin-12-on
vykazuje
bronchodilatační účinek na tracheu morčete kontrahovanou acetylcholinem, histaminem i antigenem (ovalbumin). Ve všech případech EC50 této látky bylo nižší než u theofylinu a účinek přetrvával i po předchozím podávání propranololu. Výzkumy také prokázaly ochranné působení této látky vůči anafylaxi, ve srovnání s theofylinem vykazuje vyšší účinnost proti IgG a IgG indukované systémové anafylaxi, přičemž ochrana proti IgG byla výraznější ve srovnání s IgE. Látka rovněž působí ochranně proti histaminem indukovanému bronchospasmu na tracheu morčete, tento účinek je srovnatelný s účinkem salbutamolu (Zabeer et al. 2006). 6, 7, 8, 9, 10, 12-hexahydro-azepino-[2, 1-b] quinazolin-12-on (označován také jako RLX) byl rovněž připraven jako potenciální bronchodilatační látka modifikací vasicinu. RLX inhibuje antigenem navozenou degranulaci žírných buněk, vyplavování histaminu, vychytávání vápníku a snižuje aktivitu cAMP fosfodiesterásy a lipoxygenásy. Výsledky naznačují, že jeho účinek je srovnatelný s kromoglykátem sodným a aminofylinem a navíc účinkuje dlouhodobě (Rachana et al. 2011). Také
deriváty
6-alkyl/aryl-1,2,4-triazino[4,3-c]chinazolinů
byly
pro
své
potencionální bronchodilatační účinky testovány in vivo na trachee morčete. Bylo zkoumáno celkem 16 sloučenin a všechny vykazovaly protektivní aktivitu vůči histaminem indukovanému bronchospasmu, která u mnohých z nich byla ekvivalentní s referenční látkou – aminofylinem (Kombu et al. 2008). Deriváty imidazo[1,2-a]chinazolinů byly vyvinuty jako látky inhibující fosfodiestázu 4 (PDE4). Jejich inhibiční aktivita byla analyzována na PDE4 extrahované z lidské alveolární epiteliální buněčné linie (Deleuze-Masquéfa et al. 2004).
21
Antitusické účinky Během roku 1980 se ve Francii a dalších evropských zemích užíval Chlorochalon
(Obr. 3) jako antitusikum ať už samostatně nebo v kombinaci s dalšími látkami (Vijaychand et al. 2011). Obr. 3 Chlorochalon (převzato z Vijaychand et al. 2011) Antitusický efekt byl zkoumán u derivátů azepino[2,1-b]chinazolinů.(Obr. 4) Sloučenina C-3 vykazuje antitusický efekt na tracheu morčete v dávkách 10 a 20 mg/kg, což je srovnatelné s kodeinem (10mg/kg). Látka C-1 také působí antitusicky, ale její efekt není tak výrazný jako u C-3. C-3 je oproti ostatním zkoumaným látkám substituována dvěma bromy, tato substituce má tedy za následek nejúčinnější antitusický efekt. Naproti tomu redukce vazby C=N u látky C-2 vedla k velké ztrátě
účinku (Nepali et al. 2011). Obr. 4 Deriváty azepino[2,1-b]chinazolinů (převzato z Nepali et al. 2011)
22
4 Cíle práce Cílem této práce bylo:
Stanovit relaxační účinky látek VN–024 a VN–034 na trachee potkana v podmínkách in vitro
Srovnat relaxační účinky zkoumaných látek s theofylinem
Určit, zda jsou testované látky vhodné pro další zkoumání
23
5 Experimentální část 5.1 Použitý materiál a zvířata
5.1.1 Chemikálie Chlorid sodný – Penta, Chrudim, Česká republika Chlorid draselný – Lachema, Brno, Česká republika Hydrogenuhličitan sodný p.a. – Penta, Chrudim, Česká republika Dihydrogenfosforečnan draselný – RNDr. Jan Kulich, Hradec Králové Síran hořečnatý heptahydrát p.a. – Lachema, Brno, Česká republika D- glukóza p.a. – Penta - Chrudim, Česká republika Chlorid vápenatý bezvodý p.a. – Lachema, Brno, Česká republika Karbamoylcholin chlorid 99% - Sigma-Aldrich, Steinheim, Německo Theofylin Sigma-Aldrich, Steinheim, Německo Destilovaná voda – Farmaceutická fakulta, Hradec Králové
5.1.2 Testované látky 4-(3-(piperidin-1-yl)propyloxy)chinazolin-1-oxid (VN-024) 2-(3-(piperidin-1-yl)propylsulfanyl)chinoxalin hydrochlorid (VN-034) Obě látky byly získány na Katedře organické chemie Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy.
24
5.1.3 Použité přístrojové vybavení Aparatura na izolované orgány: Multi chamber tissue bath system, ISO-08-TSZ4, SEN_03_FSG1 Force/Displacement transducer (Experimetria Ltd., Budapešť, Maďarsko) Vyhodnocovací software (S.P.E.I., Advanced KYmograph, SOFT-03-KYMO, Experimetria Ltd,. Budapešť, Maďarsko Laboratorní váhy (Kern & Sohn GmbH, Balingen, Německo) Počítač Plynová bomba s pneumoxidem Termostat U1 (Prüfgeräte-Werk Medingen GmbH, Dresden, Německo Laboratorní sklo, pomůcky k navažování, nůžky, pinzety, pean, ligatury
5.1.4 Zvířata Pokusy byly prováděny na samcích potkana kmene Wistar o průměrné hmotnosti 300g. Zvířata byla umístěna ve viváriu Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové za standardních laboratorních podmínek a měla volný přístup k pitné vodě a standardní peletizované potravě. Pokusy byly prováděny po desetidenní aklimatizaci a v souladu se zákonem č. 246/1992 Sb. O ochraně zvířat proti týrání a se souhlasem etické komise Farmaceutické fakulty Univerzity Karlovy v Hradci Králové.
5.2 Metodika
5.2.1 Přípravná fáze
Příprava Krebs – Henseleitova roztoku Na pokus bylo potřeba připravit vždy 1 litr Krebs – Henseleitova roztoku. Pro jeho přípravu jsme ve vodě postupně rozpustili navážené suroviny (Tab. 3). Chlorid vápenatý
25
jsme do roztoku přidali až jako poslední a rozpuštěný v destilované vodě, důvodem je slabá rozpustnost vápenatých solí, které by se mohly vysrážet. Tab. 3 Složení Krebs –Henseleitova roztoku (g/l) Látka
NaCl
KCl
NaHCO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O Glukóza CaCl2
6,8
0,35
2,1
Koncentrace g/l
0,14
0,29
2,0
0,28
Izolace trachey a příprava preparátu Potkana jsme úderem do hlavy rychle omráčili, poté přestřihli krční tepnu a zvíře usmrtili vykrvením. V oblasti krku jsme vedli skalpelem podélný řez, tupou preparací jsme uvolnili tracheu od štítné chrupavky po bifurkaci a z obou stran ji odstřihli. Poté jsme ji položili na sklíčko se živným roztokem a očistili od zbývající tkáně. Rozdělili jsme ji na čtyři stejně velké prstence, každý jsme v chrupavkovité části podélně rozstřihli. Ke každému preparátu jsme upevnili dvě protilehlé ligatury tak, aby hladká svalovina zůstala uprostřed neporušena. Poté jsme preparát přemístili do Schullerovy nádobky na izolovaný orgán, kterou jsme předem naplnili živným Krebs-Henseleitovým roztokem vyhřívaným na 37 °C a okysličovaným pneumoxidem (směs 95 % O2 a 5 % CO2). Tkáně jsme pomocí ligatur upevnili jednou stranou k pevně fixované fritě s pneumoxidem a druhou k izotonickému převodníku spojeného s registračním zařízením (počítač). Toto uspořádání umožňovalo sledovat kontrakci a relaxaci hladkého svalu trachey.
Závěrečná příprava Tracheu jsme ve Schullerově nádobce po dobu 40 minut nechali stabilizovat, během této doby jsme po každých deseti minutách vyměňovali Krebs-Henseleitův roztok. Tkáň byla prvních dvacet minut zatížena na 2,5 g, po jejich uplynutí jsme zatížení snížili na pracovní napětí 1g. Po ukončení stabilizace jsme objem ve Schullerově nádobce upravili na 5 ml, čímž byl preparát připraven k pokusu.
26
Před testováním zkoumané látky jsme si ověřili reaktivitu preparátu. Tracheu jsme pomocí karbacholu kontrahovali (výsledná koncentrace v lázni 10-5 M). Jakmile jsme dosáhli maximální odpovědi, preparát jsme opakovaně vypláchli živným roztokem a nechali relaxovat do stabilizace.
5.2.2 Vlastní pokus Preparát jsme pomocí karbacholu (10-5 M) kontrahovali. Poté jsme do lázně kumulativně přidávali roztok zkoumané látky ve zvyšující se koncentraci a sledovali, zda navodí relaxaci trachey. Každá další koncentrace byla přidána až po stabilizaci odpovědi. Tento postup jsme opakovali, dokud nedošlo k navození maximálního účinku. Na závěr jsme přidali do Schullerovy nádobky theofylin (10-2 M). Jím navozenou relaxaci jsme považovali za maximální.
5.2.3 Vyhodnocení a statistická analýza Získané výsledky jsme vyhodnotili v programu GraphPad Prism5. Sestrojili jsme graf, na jehož osu x jsme umístili log koncentrace testované látky a na osu y procentuální relaxaci trachey (průměr ± sem). Za 100% relaxaci byla považována relaxace navozená theofylinem (10-2 M). Nelineární regresí jsme body proložili křivku a odečetli z ní hodnotu ED50, která vyvolá polovinu maximální možné odpovědi. K hodnotě EC50 jsme spočítali konfidenční interval 95 %. Obdobně byla určena maximální odpověď Emax a příslušný konfidenční interval 95 %.
27
6 Výsledky Tab. 4 Výsledky měření Význam EC50 Látka
n
ný rozdíl
CI95% pro EC50
proti theofylin
(mol/l)
Významn Emax CI95% pro Emax (%)
u? theofylin
24
0,002090
-
(0,001815 - 0,002405)
VN-024
8
8
proti theofylinu ?
100,4
-
(95,64 - 105,2)
4,532×10-5
103,0
Ne
(4,155×10 - 4,942×10 ) p≤0,001
(100,1 - 106,0)
p= 0,4076
3,259×10-6
99,98
Ne
(95,42 - 104,5)
p= 0,8948
-5
VN-034
ý rozdíl
-6
Ano -5
Ano -6
(2,796×10 - 3,798×10 ) p≤0,001
28
Obr. 5 In vitro relaxace trachey potkana kontrahované karbacholem (10-5 M) navozená pomocí kumulativního přidávání testované látky VN-024
100
90
80
70
theofylin
relaxace (%)
VN-024 60
***
50
40
30
20
10 *** p0,001 pro EC50
0 -8
-7
-6
-5
-4
log c (mol/l)
-3
-2
-1
0
29
Obr. 6 In vitro relaxace trachey potkana kontrahované karbacholem (10-5 M) navozená pomocí kumulativního přidávání testované látky VN-034
100
90
80
70
theofylin
relaxace (%)
VN-034 60
***
50
40
30
20
10
*** p0,001 pro EC50
0 -8
-7
-6
-5
-4
log c (mol/l)
-3
-2
-1
0
30
7 Diskuze Astma bronchiale a chronická obstrukční plicní nemoc jsou vážná onemocnění, která nelze zcela vyléčit. Jejich společným znakem je bronchokonstrikce, která značně snižuje kvalitu života nemocných osob. Na trhu je dostupné velké množství různých účinných látek, přesto je nutné zkoumat nová potenciální a pokud možno účinnější bronchodilatancia. Cílem diplomové práce bylo in vitro ověřit účinky na respirační systém u dvou derivátů chinazolinu, látek odvozených od vasicinu, a srovnat je s účinkem theofylinu. V experimentální části diplomové práce byly připraveny preparáty z trachey potkana, které jsme kontrahovali karbacholem (10-5M) a poté kumulativně přidávali roztok zkoumané látky ve zvyšující se koncentraci. Pro navození maximální relaxace jsme na závěr každého pokusu přidali theofylin. Výsledky těchto měření jsou shrnuty v Tab. 4 a v Obr. 5 (látka VN-024) a 6 (látka VN-034). Křivky vždy zachycují průběh relaxace trachey (%) v závislosti na log c zkoumané látky (mol/l) a srovnávají je s účinkem theofylinu (kontrolní známá látka užívaná v terapii astmatu a CHOPN). Výsledky ukázaly, že obě testované látky mají předpokládaný relaxační účinek na tracheu potkana kontrahovanou karbacholem. Obě látky byly schopny navodit úplnou relaxaci podobně jako theofylin (hodnoty Emax určené z naměřených křivek byly 103,0 % (CI95%=100,1–106,0) pro VN-024 a 99,98 % (CI95%= 95,4–104,5) pro VN-034). Naproti tomu účinnost obou látek byla signifikantně vyšší nežli u theofylinu (p ≤ 0,001). Hodnota EC50 pro theofylin byla 2,09×10-3 (CI95%=1,82×10-3–2,41×10-3), pro látku VN-024 to bylo 4,53×10-5 (CI95%=4,16×10-54,94×10-5) a pro látku VN-034 dokonce 3,26×10-6 (CI95%=2,80×10-6–3,80×10-6). To znamená, že v daném uspořádání pokusu byla látka VN-024 46krát účinnější a látka VN-034 dokonce 641krát účinnější nežli theofylin. Z tohoto zjištění vyplývá obrovský potenciál obou testovaných látek, především látky VN-034, pro další zkoumání.
31
8 Závěr V použitém uspořádání pokusu jsme zjistili: 1) Obě testované látky dokáží relaxovat tracheu potkana kontrahovanou karbacholem. 2) Látka VN-024 měla hodnotu EC50 4,53×10-5 mol/l, což je zhruba o 46krát méně než u theofylinu. Emax je u obou látek srovnatelná. 3) Látka VN-034 měla hodnotu EC50 3,26×10-6 mol/l, což je zhruba o 641krát méně než u theofylinu. Emax je u obou látek srovnatelná. 4) Látka VN-034 je oproti VN-024 skoro 14krát účinnější a proto i vhodnější pro další testování.
32
9 Literatura
1) From the Global Strategy for Asthma Management and Prevention, Global Initiative for Asthma (GINA) 2010. Available from: http://www.ginasthma.org/. 2) Kašák V., Špičák V., Pohůnek P. Asthma bronchiale. Interní medicína pro praxi 2001; (10): 442-5. Dostupné také z WWW: http://www.solen.cz/pdfs/int/2001/10/02.pdf 3) Marek J. et al. Farmakoterapie vnitřních nemocí. 4th ed. Prague: Grada Publishing, 2010:777. 4) Pohl J. Astma bronchiale. Pediatrie pro praxi 2001;(5):234-7. Dostupné také z WWW: http://www.solen.cz/pdfs/ped/2001/05/08.pdf 5) Krčmová I., Novosad J. Bronchiální astma - praktické aspekty. Interní medicína pro praxi 2010;12(4):196-9. Dostupné také z WWW: http://www.solen.cz/pdfs/int/2010/04/06.pdf 6) Lincová D. et al. Základní a aplikovaná farmakologie. 2nd ed. Prague: Galén, 2007:672. 7) Kottová M., Vopršálová M., Pourová J. Farmakoterapie asthma bronchiale. Praktické lékárenství 2008;4(3):116-22 Dostupné také z WWW: http://www.solen.cz/pdfs/lek/2008/03/04.pdf 8) Pauk N., Zatloukal P. Současná farmakoterapie asthma bronchiale u dospělých. Remedia 2002;12(3):186-92. 9) Fendrich Z. et al. Farmakologie pro farmaceuty I. Prague: Karolinum, 2002:207 10) Krčmová I. Omalizumab – terapeutická perspektiva v léčbě těžkého bronchiálního astmatu. Remedia 2006;15(4):438-42. 11) Sedlák V., Koblížek V. Budoucí léčba astma bronchiale. Klinická farmakologie a farmacie 2010;24(2):71-4. Dostupné také z WWW: http://www.solen.cz/pdfs/far/2010/02/03.pdf 12) From the Global Strategy for the Diagnosis, Management and Prevention of COPD, Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) 2010. Available from: http://www.goldcopd.org/.
33
13) Musil J. Chronická obstrukční plicní nemoc - choroba stále aktuální. Interní medicína pro praxi 2009;11(7,8):319-23. Dostupné také z WWW: http://www.solen.cz/pdfs/int/2009/07/03.pdf 14) Dindoš J. Nejnovější pokroky v léčbě CHOPN. Interní medicína pro praxi 2005;(6):291-5. Dostupné také z WWW: http://www.solen.cz/pdfs/int/2005/06/04.pdf 15) Turčáni P. Chronická obstrukční plicní nemoc dnes. Interní medicína pro praxi 2008;10(11):502-7. Dostupné také z WWW: http://www.solen.cz/pdfs/int/2008/11/04.pdf 16) Kašák V. Farmakoterapie stabilizované chronické obstrukční plicní nemoci v České republice. Klinická farmakologie a farmacie 2006;20(2):90-6. Dostupné také z WWW: http://www.solen.cz/pdfs/far/2006/02/08.pdf 17) Pauk N., Zatloukal P. Současná léčba chronické obstrukční plicní nemoci. Remedia 2002;12(4): 253-262. 18) Ignacimuthu S., Shanmugam N. Antimycobacterial activity of two natural alkaloids, vasicine acetate and 2-acetyl benzylamine, isolated from Indian shrub Adhatoda vasica Ness. leaves. Journal of Biosciences 2010;35(4):565-70 Dostupné také z WWW: http://www.ias.ac.in/jbiosci/dec2010/565.pdf 19) Claeson U. P., Malmfors T., Wikman G., Bruhn J.G. Adhatoda vasica: a critical review
of
ethnopharmacological
Ethnopharmacology
2000;
and
toxicological
data.
Journal
Dostupné
také
z
72(1-2):1-20.
of
WWW:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0378874100002257 20) Adhatoda vasica. Avicenna [Internet]. [cit. 2012-01-08]. Dostupné z: http://www.avicenna.cz/item/adhatoda-vasica 21) Rachana, Sujata B., Mamta P., Kumar Manoj K.P., Sonam S. Review & Future Perspectives of Using Vasicine, and Related Compounds. Indo-Global Journal of Pharmaceutical Sciences 2011; 1(1): 85-98. Dostupné také z WWW: http://iglobaljournal.com/wp-content/uploads/2011/02/RACHANA-ET-AL9.pdf 22) Dhuley J. N. Antitussive effect of Adhatoda vasica extract on mechanical or chemical stimulation-induced coughing in animals. Journal of
34
Ethnopharmacology 1999; 67(3):361-5. Dostupné také z WWW: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0378874199000744 23) Patočka J. Vasicin, alkaloid Adhatoda vasica. Toxicology [Internet]. 13. 11. 2010 [cit. 2011-11-22]. Dostupné také z WWW: http://www.toxicology.cz/modules.php?name=News&file=article&sid=369 24) Hiroi J. et al. Effects of FR50948, a New Orally Active Antiallergic Agent, in Experimental Allergic Models. The Japanese Journal of Pharmacology 1988, 46:337-48. Dostupné také z WWW: http://www.journalarchive.jst.go.jp/jnlpdf.php?cdjournal=jphs1951&cdvol=46& noissue=4&startpage=337&lang=en&from=jnlabstract 25) Alagarsamy V., Giridhar R., Yadav M.R. Synthesis and pharmacological investigation of novel 1-substituted-4-phenyl-1,2,4-triazolo[4,3-a]quinazolin5(4H)-ones as a new class of H1-antihistaminic agents. Bioorganic 2005;15(7):1877-80. Dostupné také z WWW: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0960894X05001848 26) Morokata T., Suzuki K., Ida K., Yamada T. Effect of a novel interleukin-5 receptor antagonist, YM-90709, on antigen-induced eosinophil infiltration into the airway of BDF1 mice. Immunology Letters 2005; 98(1):161-5. Dostupné také z WWW: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0165247804003062 27) Lee Ch., Lee H. Relaxant Effect of Quinoline Derivatives on Histamine-induced Contraction of the Isolated Guinea Pig Trachea. The Korean Society for Applied Biological Chemistry 2011;54(1):118-23. Dostupné také z WWW: http://www.ksabc.or.kr/admin/contribute/journal/kpaper/2011_54_1_118123.pdf 28) Zabeer A. et al. Synthesis and bronchodilator activity of new quinazolin derivative. European Journal of Medicinal Chemistry 2006;41(3):429-34. Dostupné také z WWW: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0223523405003168 29) Kombu R. S., Mailavaram R. P., Devalapally H., Chinnappa P. M., Devarakonda R. K., Akkinepally R. R. R.. Synthesis and Bronchodilator Studies of Some Novel 6-Alkyl/Aryl-1,2,4-Triazino[4,3-c]Quinazolines. The Open Medicinal Chemistry Journal 2008;2(1):101-11. Dostupné také z WWW:
35
http://benthamscience.com/open/openaccess.php?tomcj/articles/V002/101TOM CJ.htm 30) Deleuze-Masquéfa C. et al. Design and synthesis of novel imidazo[1,2a]quinoxalines as PDE4 inhibitors. Bioorganic 2004;5:1129-39. Dostupné také z WWW: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0968089603008186 31) Vijaychand A., Manjula S.N., Bharath E. N. a Divya B. Medicinal and biological significance of quinazoline: A highly important scaffold for drug discovery: A review. International Journal of Pharma and Bio Sciences 2011;2(1): 780-809. Dostupné také z WWW: http://ijpbs.net/volume2/issue1/pharma/_83.pdf 32) Nepali K. et al. Antitussive effects of azepino[2,1-b]quinazolones. Medicinal Chemistry
Research
2011.
Dostupné
také
http://www.springerlink.com/index/10.1007/s00044-011-9641-1
z
WWW:
