Exprese a variabilita genů ovlivňující růst a vývoj svalové tkáně u prasat

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Exprese a variabilita genů ovlivňující růst a vývoj svalové tkáně u prasat Disertační práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D.

Ing. Michaela Nesvadbová Brno 2012

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma „Exprese a variabilita genů ovlivňující růst a vývoj svalové tkáně u prasat“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

dne ……………………………………………… podpis doktoranda ………………………………

„Je otázka, co je pro vědce významnější, zda znalost faktů či fantazie.“ Albert Einstein

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych touto cestou poděkovala svému vedoucímu disertační práce prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za cenné rady, odborné vedení a konstruktivní připomínky nezbytné pro vznik této práce. Zvláštní poděkování patří také Mgr. Kristíně Civáňové, Ph.D., Mgr. Zuzaně Vykoukalové, Ph.D., Ing. Janě Zrůstové, Ph.D a Ing. Karlu Bílkovi, Ph.D., kteří mi poskytli své zkušenosti a všestrannou pomoc. Mé poděkování patří i celému kolektivu ústavu za vytvořené pracovní prostředí, které je velmi cennou zkušeností do dalšího profesního života. V neposlední řadě bych chtěla také směrovat svá poděkování všem svým blízkým, za jejich trpělivost a podporu hmotnou i duševní po celou dobu studia.

ABSTRAKT Předložená disertační práce na téma „Exprese a variabilita genů ovlivňující růst a vývoj svalové tkáně u prasat“ se v první části zabývá komparativní analýzou genových transkriptů v kosterní svalovině musculus longissimus dorsi a biceps femoris. Exprese genů byla studována mezi dvěma divergentními typy prasat, české bílé ušlechtilé plemeno a divoké prase, v období jejich intenzivního růstu. Pro tento účel byly použity komerčně dostupné čipy GeneChip Porcine Genome Array (Affymetrix), které umožňují kompletní analýzu transkriptomu prasete domácího. Tato studie umožnila nalézt 537 transkriptů mající nejméně trojnásobně rozdílnou expresi mezi zkoumanými druhy a konkrétní geny, které mohou ovlivňovat vznik, vývoj a růst kosterní svalové tkáně prasat. Pro následnou real-time PCR analýzu byly nejprve analyzovány referenční geny HPRT1, NACA, OAZ1, RPL32, RPS18, TAF4B a TBP a byla vyhodnocena jejich vhodnost pro normalizaci výsledků genové exprese. Jako nejstabilnější a nejvhodnější geny pro naši analýzu byly vybrány HPRT1, OAZ1 a RPS18. Na základě výsledků expresní microarray analýzy a pro validaci těchto výsledků byly následně vybrány geny ANKRD1, C1QTNF3, C5orf13, CNN3, ENHO, GDF8, POSTN, TNNT2, YWHAQ, MYH8, IGF2, MLC1SA a HLA-DRB4, jejichž genové exprese byla kvantifikována pomocí real-time PCR metody. Výsledky této analýzy potvrdily, že exprese sledovaných genů byla významně vyšší ve sledovaných tkáních českého bílého ušlechtilého prasete než u divokého prasete (P < 0,05). Důkladnější analýze byl podroben gen C5orf13 (chromosome 5 open reading frame 13). Byla studována sekvence mRNA i DNA a nalezené polymorfizmy byly testovány ve vztahu k užitkovým vlastnostem masné produkce prasat. Provedené asociační studie mezi nalezenými polymorfizmy v genu C5orf13 ukázaly, že tento gen může významně ovlivňovat růst kosterní svalové tkáně prasat. Zjištěné výsledky byly publikovány ve vědeckých časopisech. Klíčová slova: prase, kosterní svalovina, gen, genová exprese, genový polymorfismus, genové transkripty.

ABSTRACT This PhD thesis with the theme "Expression and variability of genes affecting growth and development of muscle tissue in pigs"is, in the first part, concerned with the comparative analysis of gene transcripts in skeletal muscles – musculus longissimus dorsi and biceps femoris. Gene expression was studied between two divergent types of pigs, Czech Large White Pig and wild boar, in the period of intensive growth. For this purpose, the commercially available GeneChip Porcine Genome Array (Affymetrix), which enables comprehensive coverage of the pig transcriptome, was used. This study allowed finding of 537 transcripts that have at least three-fold difference in expression between the investigated pig species and specific genes that may affect the formation, development and growth of skeletal muscle tissue of pigs. Reference genes HPRT1, NACA, OAZ1, RPL32, RPS18, TAF4B and TBP were subjected to subsequent real-time PCR analysis and their suitability for normalization of gene expression results was evaluated. Our results show that the most stable and the most suitable genes for further analysis were HPRT1, OAZ1 a RPS18. Subsequently, based on the results of microarray analysis and for validation of these results genes ANKRD1, C1QTNF3, C5orf13, CNN3, ENHO, GDF8, POSTN, TNNT2, YWHAQ, MYH8, IGF2, MLC1SA and HLA-DRB4 have been selected and their gene expression was quantified using real-time PCR method. The results of this analysis confirmed that the gene expression of studied genes was significantly higher in observed tissues of Czech Large White Pig (P < 0.05). C5orf13 gene (chromosome 5 open reading frame 13) has been subjected to genetic analysis. The mRNA and DNA sequence was determined and we found the polymorphisms that were tested in relation to the properties of meat production of pigs. Performed association studies between polymorphisms in the C5orf13 gene revealed that this gene may significantly affect the growth of skeletal muscle tissue of pigs. The results were published in scientific journals. Key words: pig, skeletal muscle, gene, gene expression, gene polymorphisms; gene transcripts.

OBSAH 1 ÚVOD ..................................................................................................................................................... 8 2 CÍL PRÁCE ........................................................................................................................................... 9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED..................................................................................................................... 10 3.1 CHARAKTERISTIKA, VÝVOJ A FUNKCE SVALOVÉ TKÁNĚ ........................................................... 10 3.1.1 Maso........................................................................................................................................................ 10 3.1.2 Kosterní svalová tkáň .............................................................................................................................. 11 3.1.3 Vznik a vývoj kosterní svaloviny ............................................................................................................ 13 3.1.3.1 Myogenní regulační faktory ............................................................................................................ 15 3.1.3.2 Molekulární regulace myogeneze v somitech ................................................................................. 16 3.1.3.3 Molekulární regulace vývoje svaloviny končetin............................................................................ 17 3.1.3.4 Molekulární regulace vývoje svaloviny hlavy a krku...................................................................... 18 3.1.3.5 Postnatální vývoj a regenerace svalové tkáně ................................................................................. 19 3.1.3.6 Růstové faktory ovlivňující růst a vývoj svalové tkáně................................................................... 21 3.1.3.7 Role microRNA ve vzniku a vývoji kosterní svaloviny .................................................................. 24

3.2 DIVOKÉ DRUHY PRASAT VERSUS MODERNÍ PLEMENA PRASAT .................................................. 26 3.2.1 Divoká prasata a jejich domestikace........................................................................................................ 26 3.2.2 České bílé ušlechtilé plemeno prasat....................................................................................................... 28

3.3 GENOVÁ EXPRESE A JEJÍ ANALÝZA............................................................................................. 30 3.3.1 Exprese genetické informace................................................................................................................... 30 3.3.2 Genomika prasat...................................................................................................................................... 31 3.3.3 Metody analýzy genové exprese.............................................................................................................. 32 3.3.3.1 Real-time PCR ................................................................................................................................ 33 3.3.3.2 Microarray technologie ................................................................................................................... 42

3.4 PŘEHLED STUDOVANÝCH GENŮ .................................................................................................. 55 3.4.1 Referenční geny....................................................................................................................................... 55 3.4.2 Analyzované geny ................................................................................................................................... 57

4 MATERIÁL A METODIKA .............................................................................................................. 63 4.1 VÝBĚR VHODNÝCH REFERENČNÍCH GENŮ PRO STUDIUM GENOVÉ EXPRESE VE SVALOVÉ TKÁNI PRASETE POMOCÍ METODY REAL-TIME PCR............................................................................. 63

4.1.1 Analyzované vzorky................................................................................................................................ 63 4.1.2 Izolace RNA, reverzní transkripce .......................................................................................................... 63 4.1.3 Real-time PCR......................................................................................................................................... 63

4.2 KOMPARATIVNÍ ANALÝZA GENOVÝCH TRANSKRIPTŮ V KOSTERNÍ SVALOVÉ TKÁNI PRASETE DOMÁCÍHO A DIVOKÉHO ............................................................................................................. 66

4.2.1 Analyzované vzorky................................................................................................................................. 66 4.2.2 Izolace RNA............................................................................................................................................ 66 4.2.3 Microarray analýza.................................................................................................................................. 67 4.2.4 Reverzní transkripce a kvantitativní real-time PCR ................................................................................ 68

4.3 ANALÝZA GENU C5ORF13 ........................................................................................................... 71 4.3.1 Analyzované vzorky................................................................................................................................ 71 4.3.2 PCR reakce.............................................................................................................................................. 71 4.3.3 Sekvenování ............................................................................................................................................ 72 4.3.4 Testování nalezených polymorfizmů a asociační analýza ....................................................................... 72

5 VÝSLEDKY A DISKUZE .................................................................................................................. 74 5.1 VÝBĚR VHODNÝCH REFERENČNÍCH GENŮ PRO STUDIUM GENOVÉ EXPRESE VE SVALOVÉ TKÁNI PRASETE POMOCÍ METODY REAL-TIME PCR............................................................................. 74

5.1.1 Kandidátní referenční geny a jejich real-time PCR analýza .................................................................... 74 5.1.2 Výběr nejstabilnějších referenčních genů................................................................................................ 76

5.2 KOMPARATIVNÍ ANALÝZA GENOVÝCH TRANSKRIPTŮ V KOSTERNÍ SVALOVÉ TKÁNI PRASETE DOMÁCÍHO A DIVOKÉHO ............................................................................................................. 79

5.2.1. Microarray analýza................................................................................................................................. 79 5.2.2.1 Identifikace diferenciálně exprimovaných genů.............................................................................. 79 5.2.2.2 Genová ontologie a anotace diferenciálně exprimovaných genů..................................................... 80 5.2.2.3 Geny souvisejících s vývojem, růstem a regenerací kosterní svalové tkáně.................................... 83 5.2.2.4 Signální dráhy genů......................................................................................................................... 83 5.2.2. Validace výsledků microarray analýzy pomocí metody real-time PCR ................................................. 93

5.3 ANALÝZA GENU C5ORF13 ......................................................................................................... 100 5.3.1. Analýza exprese genu v kosterní svalové tkáni prasat.......................................................................... 100 5.3.2. Identifikace polymorfizmů a asociační analýza.................................................................................... 102

6 ZÁVĚR ............................................................................................................................................... 109 7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY............................................................................................ 112 8 SEZNAM OBRÁZKŮ ....................................................................................................................... 136 9 SEZNAM TABULEK........................................................................................................................ 138 PŘÍLOHY............................................................................................................................................... 140 SEZNAM PŘÍLOH................................................................................................................................ 141

1 ÚVOD Hlavním cílem chovu hospodářských zvířat je produkce potravin pro lidskou spotřebu. Proto je i výzkum a vývoj v této oblasti zemědělství zaměřen především na porozumění biologických mechanizmů souvisejících s produkčními vlastnostmi hospodářských zvířat. Pro udržení konkurenceschopnosti chovatelů je důležité minimalizovat výrobní náklady a současně zvyšovat efektivitu produkce bez zhoršení kvality produktů. Prase domácí (Sus scrofa f. domestica) patří mezi nejdůležitější hospodářská zvířata chované zejména pro jejich maso, tuk a kůži. Mimo to, díky své fyziologické podobnosti s člověkem, je prase také důležitý modelový organismus, který nachází využití především v humánní medicíně. Genetika masné užitkovosti prasat je předmětem zájmu výzkumníků na celém světě. Selekci a hybridizaci prasat, vedoucí ke zlepšení ekonomiky produkce, však limituje nedostatek znalostí o genech a jejich vzájemných interakcích. Molekulární biologie a genetika dokáže překonat tyto limity. Množství informací, které jsou aktuálně dostupné o genomu mnoha druhů hospodářských zvířat, včetně prasete, se v posledních letech dramaticky zvyšuje. Velkou měrou tomu napomáhá i současný rychlý vývoj genomických metod, které nám umožňují nalézt odpovědi na otázku jaká je funkce a regulace genů a součástí jaké genetické sítě tyto geny jsou. Předložená práce se zabývá analýzou exprese genů pomocí microarray a kvantitativní real-time PCR metody. Využití čipových technologií umožňuje analyzovat několik tisíců genů současně v jediném experimentu. Počet identifikovaných genů se tak rapidně zvyšuje a v současné době je studium regulační funkce genů předmětem výzkumu v celosvětovém měřítku. V druhé fázi byl výzkum zaměřen na vybraný gen C5orf13 (chromosome 5 open reading frame 13), který byl podroben detailnější analýze včetně nalezení polymorfních míst a asociační analýzy. Jelikož výzkum v oblasti užitkových vlastností hospodářských zvířat je v této době nasměrován na studium kandidátních genů a následné využití získaných poznatků v selekci zvířat, i tato práce se snaží přispět k poznání genů majících vliv na masnou užitkovost prasat a její výsledky mohou být využity pro efektivnější produkci vepřového masa.

8

2 CÍL PRÁCE Hlavním cílem této disertační práce je rozšířit naše poznatky o růstu kosterní svalové tkáně a masné užitkovosti prasat z pohledu molekulární biologie a genetiky. Tohoto cíle bude dosaženo pomocí analýzy exprese genů v kosterní svalové tkáni bílého ušlechtilého a divokého prasete v období jejich intenzivního růstu a následné identifikace genů ovlivňujících růst svalové tkáně a masnou užitkovost prasat. Vybrané diferenciálně exprimované geny, které mají nebo mohou mít vztah ke sledovaným vlastnostem, budou identifikovány na základě metody expresních microarray. Exprese sledovaných genů bude ověřena metodou kvantitativní real-time PCR, čemuž bude předcházet nalezení vhodných referenčních genů pro sledovanou tkáň a dané laboratorní podmínky. Na základě výsledků expresní analýzy bude vybrán konkrétní gen, který bude dále podroben další detailnější analýze. Cílem bude studium sekvence RNA i DNA, analýza transkriptů, nalezení polymorfních míst, vyhodnocení potenciálního vlivu na znaky masné užitkovosti plemene české bílé ušlechtilé prostřednictvím asociační analýzy a optimalizace laboratorní metodiky pro testování.

9

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Charakteristika, vývoj a funkce svalové tkáně 3.1.1 Maso Maso je oblíbená složka lidské potravy představující hlavní zdroj kvalitních bílkovin, bohatý zdroj nenasycených mastných kyselin, vitamínů, minerálů a železa. Pod pojmem maso rozumíme všechny části těl živočichů, které se hodí k výživě lidí. V užším slova smyslu je to kosterní svalovina zvířat, a to buď samotná svalová tkáň nebo svalová tkáň a s ní související tkáně (vmezeřený tuk, cévy, nervy, vazivové a jiné části). Hlavní složkou masa je příčně pruhovaná svalovina, tuková tkáň a vazivo. Svalovina hospodářských zvířat obsahuje přibližně 70 – 75 % vody, 18 – 22 % bílkovin, 1 – 3 % tuku a 1 – 1,5 % minerálních látek (Kadlec, 2002).Složení některých částí vepřového masa je uvedeno v Tab. 1. Tab. 1: Složení vepřového masa (přepracováno dle Steinhauser, 1995). Voda

Bílkoviny

Tuky

Minerálie

Federovo

Podíl tuku

%

%

%

%

číslo*

a bílkovin

Bůček

34

7,1

56

0,5

4,8

7,09

Kýta

53

15,2

31

0,8

3,5

2,04

Pečeně

58

16,4

25

0,9

3,5

1,52

Plec

49

13,5

37

0,7

3,6

2,74

*Federovo číslo je poměr obsahu vody a bílkovin.

Spotřeba vepřového masa v Evropské unii v posledních letech stagnuje, ale i přesto tento druh masa patří mezi spotřebiteli k velmi oblíbeným. Ve srovnání s ostatními státy Evropské unie jsou Češi průměrní spotřebitelé masa. Roční spotřeba masa se u nás pohybuje okolo 80 kilogramů na osobu a z toho množství připadá celá polovina na maso vepřové (Sekaninová, 2011). Současný trh vyžaduje zejména prasata masného typu s vysokým podílem libové svaloviny. Šlechtění a chov prasat je proto zaměřen na produkci zvířat s maximálním podílem svaloviny a s minimálním podílem tukové tkáně s ohledem na znaky kvality masa. Ve šlechtitelských programech se tedy u otcovských linií prasat sleduje především přírůstek, zmasilost, výška hřbetního tuku, příjem krmiva a jeho konverze, utváře10

ní jatečního těla (kýta, kotleta), výtěžnost masitých částí těla, kvalita masa (pH, odkap, barva, obsah intramuskulárního tuku), utváření končetin a tělesný rámec (Rytina, 2010).

3.1.2 Kosterní svalová tkáň U savců rozlišujeme z funkčního a morfologického hlediska tři typy svalové tkáně: hladkou, srdeční a kosterní. Hladká svalová tkáň (orgánová) tvoří nejčastěji stěny dutých orgánů nebo cév. Svalovina srdeční je, jak je z jejího názvu patrné, příčně pruhovaná svalovina srdeční stěny. Z hlediska lidské výživy a zpracování masa je nejvýznamnější kosterní svalovina (příčně pruhovaná). Základní morfologickou a funkční jednotkou kosterní svaloviny (Obr. 1) je svalové vlákno vznikající splynutím velkého počtu buněk. Povrch svalového vlákna tvoří buněčná membrána, sarkolema, pod níž jsou uložena oválná buněčná jádra. Jednotlivé organely svalové buňky se nachází v cytoplaz-mě svalového vlákna (sarkoplasmě). Sarkoplasma

mimo

to

obsahuje podélně uložená vlákna (myofibrily), kterých může být v jediném svalovém vlákně až tisíc. Myofibrily jsou složeny z vlákének, které označujeme jako myofilamenta, na jejichž stavbě se podílejí molekuly aktinu, myosinu,

tropomyosinu

a troponinu rozdělující myofibrilu a umožňující její kontrakci

Obr. 1: Struktura kosterního svalu (přepracováno dle Will-

(Steinhauser, 1995).

mer et al., 2005).

11

Přestože svalová vlákna mají řadu společných znaků umožňujících jejich obecný popis, sval je heterogenní soubor vláken, které se liší v mikroskopických, histochemických a fyziologických vlastnostech. Obecně rozlišujeme čtyři typy vláken kosterního svalu: pomalá červená vlákna (typ I, SO – slow oxidative), rychlá bílá vlákna (typ IIa, FOG – fast oxidative glycolytic), rychlá červená vlákna (typ IIb, FG – fast glycolytic) a vlákna přechodná (typ III). Pomalá červená vlákna jsou tenká vlákna, která obsahují méně myofibril, ale mají vysoký obsah mitochondrií, krevních kapilár a myoglobinu, který jim dodává červenou barvu. Tyto vlákna jsou vhodná pro stavbu svalů zajišťujících spíše statické a polohové funkce a pomalý pohyb. Málo se unaví a jsou důležitá pro vytrvalostní činnost svalů. Rychlá bílá vlákna jsou silnější vlákna obsahující více myofibril, méně mitochondrií a střední množství kapilár. Vlákna tohoto typu jsou velmi odolná proti únavě a zajišťují rychlý pohyb, který je prováděn velkou silou. Velký objem, málo kapilár, nízký obsah myoglobinu a vysoký obsah glykogenu mají rychlá červená vlákna. Tyto vlákna jsou málo odolná proti únavě, ale jejich předností je rychlý stah prováděný maximální silou. Posledním typem jsou vlákna přechodná, představující vývojově nediferencovanou skupinu vláken, která je pravděpodobně zdrojem předchozích tří typů vláken (Dylevský, 2007). Charakteristika typu vláken kosterního svalu se provádí na základě stanovení aktivity svalových enzymů, a to myozinové ATPázy (aktivita enzymu je přímo úměrná rychlosti svalové kontrakce specifických vláken), sukcinyldehydrogenázy (SDH) (enzym indikující vysoké úrovně oxidativního metabolismu) a α-glycerolfosfát dehydrogenázy (αGPDH) (charakterizuje glykolytický nebo anaerobní metabolismus buňky). Svalová vlákna lze rozlišit také dle zastoupení různých izoforem kontraktilních proteinů, konkrétně tzv. těžkých myozinových řetězců (MHC – myosin heavy chains). Takto lze rozlišit čtyři typy svalových vláken: typ 1, 2A, 2B a 2X (Hossner, 2005). Souhrnnou charakteristiku a rozdělení typů vláken kosterní svaloviny udává Tab. 2. Velikost a počet svalových vláken jsou důležité faktory ovlivňující růstový potenciál, masnou užitkovost zvířat a kvalitu masa po porážce. Prase, ačkoliv není největší savec, má svalová vlákna největší (Rehfeldt et al., 2004). Přestože svalová vlákna lze obecně rozdělit podle jejich kontraktilních a metabolických charakteristik, ve skutečnosti se ve většině svalů nacházejí všechny typy svalových vláken (viz review Lee

12

et al., 2010). Svalovina prasat obsahuje vlákna různých typů typického vzoru. Ostrůvky pomalých vláken jsou obklopeny rychlými vlákny typu 2A a 2X a na okrajích rychlými vlákny 2B (Lefaucheur et al., 2002). Vysoký poměr vláken typu 2B ve svalové tkáni prasat může snižovat masnou kvalitu, jelikož koreluje s přítomností recesivní alely genu pro halotan a s nižšími hodnotami pH masa postmortem (Depreux et al., 2002). Tab. 2: Typy vláken kosterního svalu (přepracováno dle Hossner, 2005). Svalové vlákno

MHC typ

ATPáza

SDH

GPDH

1

+

++++

+

Typ IIa ( FOG)

2A

++++

++++

++++

Typ IIb (FG)

2B

++++

+

++++

Typ III (FG)

2X

++++

+

++++

Typ I (SO)

Zvířata s vyšším množstvím svalových vláken střední velikosti produkují maso vyšší kvality i kvantity. O tom, kolik svalových vláken bude v těle vytvořeno, je rozhodnuto většinou během myogeneze. Z toho vyplývá, že počet svalových vláken je determinován především genetickými faktory a faktory prostředí, které jsou schopné ovlivnit prenatální myogenezi. Dosažení optimální rovnováhy v dostatečném množství a velikosti svalových vláken a eliminace vláken abnormální struktury je důležitý krok v produkci masa vysoké kvality a kvantity. Poznání environmentálních a genetických vlivů ovlivňujících prenatální a postnatální růst kosterního svalu je důležité pro vývoj strategií a praktických přístupů v živočišné výrobě, které jsou založeny na selekci nebo environmentální modulaci prenatální myogeneze a postnatálního svalového růstu (Rehfeldt et al., 2004).

3.1.3 Vznik a vývoj kosterní svaloviny Proces, při němž se z embryonálních základů diferencuje svalová tkáň se nazývá myogeneze (Obr. 2). Tento proces je regulován dostupností živin a je pod kontrolou různých genů, růstových faktorů, hormonů a dalších proteinů, které mohou ovlivnit myogenezi na úrovni transkripce a translace (Rehfeldt et al., 2010). Svalová tkáň vzniká ze středního zárodečného listu – mezodermu, který se diferencuje v raném embryonálním období. Základem většiny kosterních svalů obratlovců jsou somity (prvosegmenty) vznikající z paraxiálního mezodermu nacházejícího se kolem 13

hřbetní struny (notochord) a neurální trubice. Během embryonálního vývoje se somity diferencují na dva úseky, dorzální dermomyotom tvořící základ škáry kůže a svalových progenitorových buněk a ventrální sklerotom, který je základem osové kostry. Dermomyotom je dále rozdělen na epaxiální a hypaxiální část, která se dále diferencuje na myotomy. Epaxiální myotom tvoří základ pro vznik svaloviny trupu, hypaxiální myotom je nezbytný pro tvorbu svalů končetin, bránice a stěny tělní (viz review Yokoyama & Asahara, 2011).

Obr. 2: Schematické znázornění vzniku kosterní svaloviny (přepracováno dle Kollias & McDermott, 2008).

V první fázi myogeneze se z myotomů diferencují myoblasty, které se řadí za sebou do sloupců. V místě dotyku myoblastů dochází k zániku jejich buněčných membrán a vznikají syncyciálně uspřádané myotuby, které se během vývoje a diferenciace svalu prodlužují. Některé buňky myotomů však zůstávají nediferencované až do dospělosti (tzv. satelitní buňky). Satelitní buňky jsou uloženy na povrchu myotuby a společně jsou kryty buněčnou membránou. Tyto buňky si zachovávají schopnost buněčného dělení a diferenciace a slouží například jako rezervní materiál při regeneraci svalového vlákna nebo se účastní procesu růstu svalových vláken během postnatálního vývoje. V další fázi vývoje svalů dochází k diferenciaci jednotlivých typů myofibril, další diferenciaci myoblastů a ke vzniku příčně pruhovaného svalového vlákna (Černý, 2005). U plodu prasete je utváření primárních svalových vláken ukončeno mezi 35. a 65. dnem, sekundárních vláken mezi 54. a 90. dnem březosti (Lefaucheur et al.,1995).

14

3.1.3.1 Myogenní regulační faktory Díky rozsáhlým výzkumům v posledních desetiletích, které využívají především modelových organismů molekulární biologie jako je myš (mus musculus), kur domácí (gallus gallus) nebo zebřička (danio renio), byla identifikována řada genů a regulačních drah, které kontrolují a jsou zapojeny v procesu vzniku a vývoje svalové tkáně obratlovců. Aktivace buněk embrya podílejících se na myogenezi je řízena sériemi komplexních transkripčních regulačních drah, jejichž výsledkem je exprese skupiny tzv. myogenních regulačních faktorů (MRF) zahrnující myogenní faktor 5 (MYF5), myoblastický diferenciační faktor (MYOD, MYODI), herkulin (MYF6, MRF4) a myogenin (MYOG) (viz review Bryson-Richardson & Currie, 2008). Výsledkem působení MRF je aktivace signální dráhy navozující diferenciaci buněk a vznik svalové tkáně. MYF5 a MYOD hrají klíčovou roli především v raném stupni diferenciace svalových buněk, MRF4 a MYOG v utváření svalových vláken a pozdějších stádiích diferenciace (Obr. 3) (Brameld et al., 2010).

Obr. 3: Úloha myogenních regulačních faktorů (MRF) v myogenezi (přepracováno dle Hettmer & Wagers, 2010). Gen MYF5 je nejprve přechodně exprimován v paraxiálním mezodermu před zahájením procesu myogeneze, poté v okrajích dermomyotomu, kde inicializuje migraci a diferenciaci buněk. Správná činnost genu je důležitá pro vývoj svaloviny trupu., jelikož výsledkem knockoutu genu je výrazně opožděný vývoj této svalové tkáně, přičemž vývoj svalové tkáně končetin je nedotčen. Expresi genu MYF5 následuje exprese genu MRF4. Tento gen hraje klíčovou roli v primární fázi myogeneze a vzniku myotub, a přestože není nezbytně nutný pro diferenciaci svaloviny a jeho inaktivace nezpůsobuje svalové defekty, funguje jako determinant a diferenciační faktor. Při inaktivaci genů

15

MYF5 a MYOD může MRF4 samostatně řídit svalový vývoj. Avšak genový knockout MYF4 a MYF5 způsobuje opožděné utváření myotomů a expresi genu MYOD. MYOD současně s genem MEF2 (myocyte enhancer factor 2) řídí transkripci genů souvisejících s myogenezí svalové tkáně. Exprese genu je pod kontrolou genů PAX3 (paired box 3), MRF4, MYF5, SIX1 (SIX homeobox 1) a SIX4 (SIX homeobox 4). Jeho inaktivace je kritická v období dospělosti v procesu regenerace svalu, ale i v období embryonálním. Embrya vykazují normální vývoj epaxiální svaloviny, na druhou stranu vývoj svalů končetin je zastaven. Gen MYOD zahajuje diferenciaci myoblastů aktivací exprese genu MYOG, který je nepostradatelný pro fúzi myoblastů a jejich formování v myotuby. Inaktivace MYOG vede k úmrtí narozeného jedince, oblast svaloviny končetin obsahuje jen jednojaderné buňky a pouze výjimečně myofibrily (viz review Bismuth & Relaix, 2010).

3.1.3.2 Molekulární regulace myogeneze v somitech Signální dráhy exprese specifických transkripčních faktorů v epaxiálních a hypaxiálních somitech, končetinách, hlavě, krku nebo dospělém jedinci mají několik odlišných rysů (Obr. 4).

Obr. 4: Regulačních dráhy kontrolující vznik a vývoje specifické svalové tkáně obratlovců. V šedém rámečku jsou znázorněny klíčové MRF nepostradatelné pro aktivaci myogeneze dané tkáně. Pozitivní regulátory jsou označeny červeně, inhibitory modře, černé šipky zobrazují vzájemné genetické interakce (přepracováno dle Mok & Sweetman, 2011).

Vznik epaxiálního myotomu, tvořící základ svaloviny trupu, kontroluje gen Sonic hedgehog (SHH). Proteiny Sonic Hedgehog, které produkuje chorda a ploténka neurální trubice, ovlivňují buňky dorsomediálního okraje dermomyotomu, podporují v těchto 16

buňkách genovou expresi a iniciují aktivaci signálních drah navozujících myogenezi (viz review Bryson-Richardson & Currie, 2008). Na rozdíl od toho, hypaxiální dermomyotom, který je základem pro svalovou tkáň končetin, bránice a stěny tělní, je pod vlivem signálů z dorzálního ektodermu (WNT dráha) a laterální ploténky mezodermu (BMP4 dráha) (viz review Yokoyama & Asahara, 2011). Také funkce genu PAX3, jehož expresi zajišťují svalové progenitorové buňky, je v epaxiální a hypaxiální somitech odlišná. Spontánní mutace genu Pax3 u myší (tzv. Splotch myši) je příčinou nevytvoření hypaxiální somitové domény a následkem toho i svaloviny končetin a některých svalů těla, zatímco svaly odvozené z epaxiální části jsou méně ovlivněné. Progenitorové svalové buňky exprimují mimo genu PAX3 také gen PAX7 (paired box 7). Tento gen však není tak důležitý pro svalový vývoj v embryonálním období, jako v období postnatálním. Přesto inaktivace PAX3 i PAX7 má za následek neschopnost svalových progenitorových buněk vstoupit do procesu myogeneze a proto je kritická pro vznik svalové tkáně. Kromě toho tyto geny také kontrolují expresi MRF jako je MYF5 a MYOD a zároveň přispívají k proliferaci a přežití myoblastů před jejich diferenciací (viz review Mok & Sweetman, 2011). Nejvýznamnější regulátor exprese PAX3 v dermomyotomu je genetická síť SIX-EYADACH. Geny SIX1 a SIX4 kontrolují hypaxiální expresi PAX3 a nepřítomnost jejich proteinů způsobuje absenci svalů končetin, které vznikají z migrujících hypaxiálních buněk. Potlačení exprese SIX1 a EYA2 (eyes absent homolog 2) je dostatečná k tomu, aby byla zahájena exprese MRF v somitech. SIX geny také kontrolují expresi MRF v myotomech (viz review Bismuth & Relaix, 2010). SIX1 a SIX4 regulují expresi genu MRF4 a inaktivace těchto genů způsobuje u embryí také opožděnou a nižší hladinu exprese genů MYOD a MYOG, zatímco exprese genu MYF5 zůstává beze změny (viz review Bryson-Richardson & Currie, 2008).

3.1.3.3 Molekulární regulace vývoje svaloviny končetin Přestože svaly končetin se vyvíjí ze somitů stejně jako svaly trupu, jsou vývojové stezky v několika rysech odlišné (Obr. 4). Svaly končetin vznikají z myogenních prekurzorových buněk hypaxiálního dermomyotomu, které migrují ze somitů ke končetinovým pupenům. Klíčovou roli v migraci buněk z dermomyotomu a vzniku svaloviny

17

končetin hraje HGF (hepatocyte growth factor) a jeho receptor c-Met (hepatocyte growth factor receptor) (viz review Mok & Sweetman, 2011). V migrujících buňkách je exprimován gen PAX3, který zajišťuje proliferující stav migrujících buněk, udržuje aktivní expresi receptoru c-Met, brání apoptóze buněk hypaxiálního somitu a expresi MRF. S genem PAX3 je současně exprimován také gen LBX1 (ladybird homeobox 1) kontrolující nalezení správné cesty a vstup migrujících buněk do končetinového pupenu. Jeho inaktivace způsobuje absenci dorzální svaloviny předních končetin a veškerých svalů končetiny zadní. Jak již bylo řečeno, pro specifikaci hypaxiální svaloviny a migraci myogenních prekurzorových buněk somitů ke končetinám jsou nezbytné také geny SIX1, SIX4, EYA1 a EYA2. Další z genů, který je exprimován migrujícími svalovými buňkami je CXCR4 (chemokine (C-X-C motif) receptor 4) podílející se na řízení migrace buněk, dosažení jejich cíle a zabezpečující jejich přežití. Ligand tohoto genu SDF1 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12) je exprimován v mezenchymu končetinového pupenu, který slouží jako cílové místo těchto migrujících buněk (viz review Yokoyama & Asahara, 2011). Za účasti transkripčních faktorů MEOX2 (mesenchyme homeobox 2) a PITX2 (paired-like homeodomain 2) migrující buňky tvoří dva úseky tkáně, dorzální a ventrální, které se po dosažení svého cílového místa následně diferencují ve svalovou tkáň přední a zadní končetiny a exprimují svalově specifické geny (jako první je exprimován MYF5, po několika hodinách také MYOD a MYOG). Mutace v genu MOEX2 vede ke ztrátě specifického souboru svalů končetin. Také role MRF v svalovině končetin a trupu jsou odlišné, jak již bylo uvedeno výše (viz review Bismuth & Relaix, 2010).

3.1.3.4 Molekulární regulace vývoje svaloviny hlavy a krku Genetické regulační sítě vývoje svaloviny hlavy a krku (Obr. 4) jsou odlišné nejen od sítí, které řídí vznik svaloviny těla, ale také mezi různými skupinami těchto svalů. Svaly jazyka jsou odvozeny ze somitů (okcipitální somity), zatímco svaly čelisti a oka vznikají z mezodermu, který somity nevytváří (nesegmentovaný paraxiální mezoderm). Pro svaly pocházející z mezodermu nevytvářejícího somity je typická nepřítomnost produktů genů PAX3 a PAX7. Namísto toho jsou exprimovány transkripční faktory jako je PITX2, TBX1 (T-box 1) (viz review Mok & Sweetman, 2011), MYOR (musculin)

18

a TCF21 (capsulin). Exprese genu PITX2 a TBX1 předchází expresi MRF. Následkem inaktivace genu PITX2 nedochází k vývoji svalů vznikajících z prvního žaberního oblouku včetně periokulárních svalů a svalů čelisti. Transkripční faktor TBX1 je rovnocenný ekvivalent genu PAX3 a je zodpovědný za zahájení myogeneze svalů hlavy a krku. Disfunkce tohoto genu způsobuje smrt jedince po narození, defekty v kraniofaciálních a kardiovaskulárních strukturách a poškození svaloviny hlavy a krku. Geny MYOR a TCF21 mají významnou funkci ve specifikaci budoucích žvýkacích svalů. Následkem jejich inaktivace nedochází v prvním žaberním oblouku k expresi MRF a k vývoji svalů, jelikož myogenní buňky podléhají apoptóze (viz review Bismuth & Relaix, 2010).

3.1.3.5 Postnatální vývoj a regenerace svalové tkáně Postnatální období je spojeno s růstem délky a objemu svalových vláken. Kapacitu postnatálního svalového růstu určuje počet svalových vláken, které jsou vytvořeny v průběhu prenatální myogeneze. Tempo růstu je limitováno fyziologickými a genetickými faktory. Platí, že čím je větší počet svalových vláken, tím je pomalejší postnatální tempo růstu svalového vlákna a menší objem vlákna na konci intenzivní doby růstu a naopak. Důvodem toho je rovnoměrná distribuce energie z výživy, která je rozdělena mezi všechna vlákna. Nicméně toto pravidlo není obecně platné vždy, protože některá zvířata rostou rychle, přestože mají vysoký počet svalových vláken (Rehfeldt et al., 2004). Postnatálního růstu svalových vláken se účastní satelitní buňky, které jsou zdrojem nových jader začleňujících se do již vytvořeného svalového vlákna. K připojování buněk dochází na koncích svalového vlákna, a tak dochází k jeho prodlužování. Tento proces je závislí především na faktorech jako je inervace, kontraktilní aktivita, růstové faktory, hormony a výživa. Počet svalových vláken savců a ptáků zůstává po narození většinou nezměněný. Přesto dochází u prasat krátce po narození k vytvoření svalových vláken velmi malého průměru, které vysvětluje navýšení celkového počtu svalových vláken v období od narození do věku 5 týdnů (Rehfeldt et al., 2000). V průběhu rané postnatální růstové fáze svalové tkáně může její množství zdvojnásobit během několika málo dnů. U myši, prasete nebo kapra se první měsíc po narození zdvojnásobí množství svalové tkáně každých 4 až 5 dnů (Goldspink, 2004). 19

Obr. 5: Schematické znázornění molekulární regulace satelitních buněk v průběhu regenerace kosterní svalové tkáně. Při poškození vlákna (A) doposud mitoticky klidné satelitní buňky vstoupí do buněčného cyklu a vznikají tak proliferující myogenní buňky (B). Následně dochází k diferenciaci (C) a fúzi myoblastů s poškozenými myobifrilami (D), které se podobají původnímu svalovému vláknu (E). Některé satelitní buňky se stávají opět klidné a jsou připraveny pro další regeneraci svalového vlákna (F). Procesu se účastní řada růstových faktorů, které fungují jako pozitivní (zeleně označené) nebo negativní (červeně označené)regulátory (Chargé & Rudnicki, 2004).

Geny odpovědné za vznik a vývoj svaloviny v embryonálním období hrají také svou roli v dospělosti, kdy se podílí na řízení a aktivaci satelitních buněk během postnatálního růstu nebo zranění (Obr. 5). Vzájemná souhra genů PAX3 a PAX7 je důležitá především během raného postnatálního růstu a má vliv na regenerační schopnosti svalové tkáně (viz review Yokoyama & Asahara, 2011). V dospělém těle jsou satelitní buňky mitoticky klidné. Tyto buňky exprimují produkty genů PAX7 a c-Met, jehož ligand HGF aktivuje činnost satelitních buněk. Při poškození svalové tkáně migrují satelitní buňky do oblasti zranění, fúzují mezi sebou a nahrazují poškozená svalová vlákna Mutace genu PAX7 u dospělých jedinců je zodpovědná za výrazné snížení počtu satelitních buněk nebo jejich apoptózu krátce po narození jedince (viz review Bryson-Richardson & Currie, 2008). Také gen MYF5 hraje důležitou roli v regeneraci svalové tkáně, absence produktů toho genu způsobuje zvýšené množství hypertrofických vláken, zpoždění diferenciace a zhoršenou schopnost svalové regenerace. Neméně důležitý je pro regeneraci a diferenciaci satelitních buněk, růst myoblastů, ale i růst jedince i gen MYOD (viz review Yokoyama & Asahara, 2011).

20

3.1.3.6 Růstové faktory ovlivňující růst a vývoj svalové tkáně Inzulinu podobné růstové faktory (IGF) Inzulinu podobné růstové faktory (IGF) hrají klíčovou roli ve vývoji, diferenciaci a přežití buněk kosterní svaloviny. Jsou produkovány různými buňkami včetně myoblastů, satelitních buněk, myofibrilami a fibroblasty. V kosterní svalovině IGF stimulují absorpci glukózy, aminokyselin, syntézu bílkovin a potlačují proteolýzu. Navíc ovlivňují svalové prekurzorové buňky a jsou to jediné extracelulární růstové faktory, které jsou schopny indukovat konečnou diferenciaci myoblastů a satelitních buněk. U embryí prasat se exprese genů IGF1 a IGF2 zvyšuje v průběhu pozdější fáze utváření primárních svalových vláken (44. až 59. den březosti). V průběhu utváření sekundárních myofibril (od 75. dne březosti) je exprese IGF1 stále vysoká, zatímco se exprese IGF2 snižuje. IGF tedy mají důležité regulační úlohy ve všech fázích myogeneze a jejich efekty na myogenezi závisí na stupni vývoje myoblastů. V brzké fázi vývoje, IGF stimulují proliferaci. Trvalá stimulace buněk vede k buněčné diferenciaci, která je charakteristická aktivací exprese MYOG, MYF5 a MYOD. Navíc efekt IGF je závislý na jejich koncentracích. Nízké koncentrace stimulují diferenciaci, zatímco vyšší koncentrace inhibují diferenciaci myoblastů. Inzulinu podobné růstové faktory hrají také důležitou roli v období růstu zralého kosterního svalu, kde indukují proliferaci satelitních buněk, diferenciaci a fúzi myotub. Aplikace IGF pokusným zvířatům indukuje růst svalové hmoty, na druhou stranu knockout genu IGF1 u myší způsobuje podobný fenotyp jako při knockoutu myogeninu, kdy dochází k celkové poruše vývoje kosterní svaloviny (Hossner, 2005). Myostatin (MSTN, GDF 8) Myostatin je růstový faktor, který je členem rodiny TGF-β. Tento gen je exprimován nejen v buňkách kosterní svaloviny v průběhu embryonálního vývoje, ale i u dospělého jedince. MSTN je negativní regulátor svalového růstu (McPherron et al., 1997). Tento gen funguje jako supresor prekurzorů proliferace svalových buněk (MYOD a MYOG) v průběhu embryonálního vývoje a následkem toho dochází k vytvoření omezeného množství myoblastů tvořících svalová vlákna (Lee, 2004). Knockout genu způsobuje stimulaci buněčného dělení satelitních buněk, hypertrofii kosterní svaloviny a až třínásobné zvětšení svalové hmoty (McPherron et al., 1997, McCroskery et al., 2003). Mutace v genu MSTN způsobující nárůst svalové hmoty se vyskytuje u řady zvířat, ale 21

i člověka. Fibroblastové růstové faktory (FGF) Rodina fibroblastových růstových faktorů zahrnuje více než 20 proteinů, které regulují široký okruh vývojových procesů včetně diferenciace a dorsalisace mezodermu, buněčný růst a migrace, utváření orgánů a růst kostí (Eswarakumar et al., 2005). Fibroblastové růstové faktory hrají významnou roli v průběhu primární myogeneze – stimulují proliferaci a inhibují diferenciaci buněk kosterní svaloviny a primárních myoblastů (Olwin et al., 2002). V proliferujících myogenních buňkách FGF potlačuje expresi MYOD, MYOG i IGF2. Pokud je efekt FGF blokován mutací v myoblastových receptorech, myoblasty se diferencují předčasně do myofibril, dochází k 30% úbytku hmotnosti svalové hmoty končetin a 50% redukci počtu svalových vláken. FGF je tedy nepostradatelný v myogenezi svalových vláken, inhibuje diferenciaci svalové tkáně a umožňuje tak vznik adekvátního množství myoblastů pro tvorbu normální svaloviny (Hossner, 2005).

Obr. 6: Regulace myogeneze kosterní svaloviny růstovými faktory (přepracováno dle Hossner, 2005).

22

Transformační růstový faktor beta (TGF-β) Transformační růstový faktor beta funguje jako regulátor proliferace, migrace, přežití, diferenciace a extracelulární syntézy matrixu v endoteliálních buňkách a hladkosvalových buňkách cév, stejně jako v zachování cévní homeostáze. TGF-β navozuje angiogenezi a zabezpečuje tak cévní zásobení potřebné pro růst a vývoj svalové tkáně (Bertolino et al., 2005). Mimo to je tento gen, stejně jako FGF, výrazný inhibitor svalové diferenciace. Je produkován řadou buněk včetně myoblastů a regenerující se svalovou tkání. Gen TGF-β je exprimován ve velkém množství v končetinovém pupenu, kde je produkován v ektodermu a ovlivňuje okolní mezenchymální buňky. Tento gen inhibuje diferenciaci fetálních, ale ne embryonálních myoblastů (Yanagisawa et al., 2001), expresi MYOD a MYOG v myogenních buňkách (Brennan et al., 1991), předchází předčasné diferenciaci migrujících myoblastů a umožňuje tak řádný vývoj budoucí svalové tkáně ve vyvíjející se končetině embrya (Olson et al., 1986). Kostní morfogenetické proteiny (BMP) Kostní morfogenetické proteiny jsou členy genové rodiny TGF-β a mají výrazné efekty v průběhu diferenciace kosterní svaloviny. Tyto proteiny produkují buňky ektodermu, laterální ploténky mezodermu a neurální trubice embrya, inhibují diferenciaci buněk dermomyotomu ve sval a předchází tak předčasné diferenciaci myoblastů v somitech (Reshef et al., 1998). Pro diferenciaci svalových progenitorových buněk je velmi důležitá sekrece BMP inhibitorů jako je Noggin a Gremlin (Tzahor et al., 2003). Nedávná studia také ukázala, že BMP4 zvyšuje počet fetálních svalových progenitoro-

vých buněk a svalových vláken v končetinách a reguluje počet prekurzorových buněk ve fetálním svalu. Ve svalovině dospělých jedinců se BMP podílí na regeneraci svalových vláken (Wang et al., 2010).

Růstový faktor hepatocytů (HGF) Růstový faktor hepatocytů (HGF) indukuje počáteční přeměnu epiteliálních buněk v somitech na buňky mezenchymální a ovlivňuje tak počátky myogeneze. Společně s transkripčními faktory LBX1 a PAX3 řídí delaminaci myoblastů z dermomyotomu a jejich migraci k místům utváření svaloviny. Inaktivace genu HGF nebo jeho receptoru (c-Met) způsobuje selhání migrace hypaxiálních myoblastů a následně nedochází k vytvoření kosterní svaloviny končetin a bránice při současném neovlivnění svaloviny

23

epaxiální. Mimo to je HGF také zapojen v hypertrofii a regeneraci svalové tkáně dospělých jedinců (Hossner, 2005). Ovlivnění jednotlivých fází myogeneze růstovými faktory znázorňuje Obr. 6.

3.1.3.7 Role microRNA ve vzniku a vývoji kosterní svaloviny V posledních letech se stále více do popředí dostává studium tzv. mikroRNA (miRNA), která má významnou roli také v biologii kosterní svaloviny. Přestože je studium a analýza jednotlivých miRNA započato nedávno, má významný dopad na pochopení řady biologických procesů včetně myogeneze. V současnosti se zvyšuje také počet studií, které se věnují analýze a identifikaci miRNA u prasat. Molekuly miRNA jsou negativní regulátory genové exprese, které jsou komplementární k cílové mRNA (obvykle k regionu 3' UTR). Cílová mRNA je následně degradována nebo je inhibována translace této mRNA v protein (Obr.7). Molekuly miRNA ovlivňují proces buněčné diferenciace svalové tkáně, vývoj embryonální svaloviny, regeneraci svalů a také některá svalová onemocnění (Mok & Sweetman, 2011). V průběhu vzniku a vývoje somitů jsou exprimovány minimálně tři miRNA (miR-1, miR-206 and miR-133), jejichž expresi indukují MRF (Carvajal & Rigby, 2010). Molekuly miR-1 a miR-206 negativně regulují produkci proteinu folistatinu a utropinu, které udržují myoblasty v nediferencovaném stavu, zatímco miR-133 pravděpodobně řídí proliferaci myoblastů. Také satelitní buňky exprimují miR-1 a miR-206 a tímto způsobem regulují proliferaci a diferenciaci buněk, které kontrolují geny PAX3 a PAX7 (Mok & Sweetman, 2011). Expresi genu PAX3 reguluje miR-27 a udržuje tak rovnováhu mezi proliferací a diferenciací satelitních buněk a podílí se na regeneraci zraněného svalu. I mechanizmus svalového stahu je ovlivněn složitou sítí, kterou významně ovlivňuje miRNA. Geny MYH6, MYH7 a MYH7b kódují miRNA, které řídí expresi myozinu, ovlivňují typ svalového vlákna a výkon svalu (Carvajal & Rigby, 2010). Za zmínku stojí i další miRNA, které regulují vývoj svalové tkáně, jako je například miR-24 ovlivňující gen TGF-β, miR-181 regulující HOXA11 (homeobox A11), miR-214 řídící epigenetický stav svalových buněk a miR-221 společně s miR-222 kontrolující regulátory diferenciace kosterní svaloviny (Mok & Sweetman, 2011).

24

Obr 7: Biogeneze a funkce miRNA. Primární transkript miRNA (pri-miRNA) vznikající z jaderné DNA je štěpen enzymem Drosha a je exportován ven z jádra. V cytoplazmě je dále upraven enzymem Dicer za vzniku zralé molekuly miRNA, která ve vazbě s multiproteinovým komplexem RISC inhibuje translaci cílové mRNA nebo navodí degradaci této mRNA (přepracováno dle Cuellar & McManus, 2005).

25

3.2 Divoké druhy prasat versus moderní plemena prasat 3.2.1 Divoká prasata a jejich domestikace Prase domácí (Sus scrofa f. domestica) je jedno z prvních domestikovaných zvířat. Domestikace prasete byla zahájena přibližně před

9000

lety.

Studium

mitochondriální

a genomové DNA odhalilo, že domestikace evropských a čínských plemen z divokých druhů prasat probíhala nezávisle na sobě (Giuffra et al., 2000). Na základě morfologických a genetických analýz se předpokládalo, že ke zdomácnění prvních divokých prasat došlo především v oblastech Blízkého a Dálného východu. Genetická analýza mitochondriální DNA divokých a domestikovaných druhů prasat však naznačuje, že existuje více domestikačních center (nejméně sedm) a že předchůdcem evropských domestikovaných plemen prasat, spíše než divoké prase blízkého východu, je evropské prase divoké

Obr. 8: Prase divoké (Mikulka, 2007).

(Larson et al., 2005). Avšak nedávné studium původu prasat založené na kombinované analýze polymorfizmů mitochondriální DNA, mikrosatelitů a Y chromozomu ukázalo, že divoká prasata z oblasti Blízkého východu a Evropy jsou si geneticky blízká, a proto je velmi obtížné říci, jakou měrou přispěly tyto druhy ke vzniku moderních evropských plemen prasat (Ramírez et al., 2009). Počet chromozómů je u všech druhů prasat diploidní, ale současně i velmi různorodý. Většina divokých prasat Střední Evropy a Asie, stejně jako domestikovaná plemena prasat, má 38 chromozomů. Divoká prasata západní Evropy mají chromozomů 36. Tato redukce je způsobena fúzí centromer chromozomů 15 a 17 (tzv. Robertsonská translokace) (Fang et al., 2006). Kříženci prasete domácího (2n = 38) a divokého (2n = 36) jsou morfologicky podobní divokému praseti a mají 37 chromozomů (Grossi et al., 2006). Fúze chromozomů 13 a 16 a chromozomů 15 a 17 je typická pro karyotyp štětkouna afrického, který obsahuje 34 chromozomů (Melander & Hansen-Melander, 1980; Musilova et al., 2010). Stejný počet chromozomů, tedy 34, má také prase bradavičnaté, 26

na rozdíl od karyotypu prasete pralesního, který obsahuje 32 chromozomů (Melander & Hansen-Melander, 1980).

Obr. 9: Diverzita a fylogenetické vztahy mezi druhy prasat (Chen et al., 2007).

Domestikované druhy zvířat se díky šlechtění a selekci samozřejmě liší od svých původních předků v řadě vlastností, včetně vlastností užitkových. U divoce žijících druhů je důležité, aby jejich stavba těla umožnila únik před predátorem nebo lov kořisti (Goldspink, 2004). Se zvyšující se úrovní domestikace a selekce prasat ze zvyšuje tempo růstu, obsah libové svaloviny, objem svalových vláken a podíl bílých svalových vláken. Současně se snižuje podíl svalových vláken červených (Lefaucheur, 2010). Vlákna svalu longissimu dorsi prasete domácího jsou složena především z vláken typu 2B, na rozdíl od svalů divokých prasat, která obsahují především vlákna typu 1 a 2A. Nejobjemnější svalová vlákna u divokých prasat byla typu 1, zatímco u domestikovaných plemen jsou tato vlákna nejmenší (Weiler, 1995).

27

3.2.2 České bílé ušlechtilé plemeno prasat Plemeno bílé ušlechtilé (Obr.10) je hlavní a nejrozšířenější plemeno chované v České republice. Vzniklo pomocí převodného křížení domácích prasat především s plemeny velké bílé anglické (Large White) a německé bílé ušlechtilé. Zušlechťování plemene se provádí pomocí selekce, ale i imigrací genů plemene velkého bílého anglického a bílého ušlechtilého plemene z Holandska, Německa, Francie a Švédska (Čechová et al., 2006).

Obr. 10: České bílé ušlechtilé plemeno prasat (Sambraus, 2006). České bílé ušlechtilé plemeno se vyznačuje bílým zbarvením, hlava je v profilu mírně prohnutá, uši jsou kratší a vzpřímené. Tělesný rámec je střední až větší, kostra kompaktní, stavba těla harmonická. Hmotnost samců v dospělosti dosahuje 300 – 320 kg, prasnic 220 – 250 kg. Toto plemeno je masného užitkového typu a vyznačuje se vynikající plodností a mléčností, nadprůměrnou výkrmností a průměrnou jatečnou hodnotou. Plemeno dále vyniká svou konstituční pevností, adaptací na podmínky velkovýrobních technologií a odolnosti vůči stresovým faktorům (Čechová et al., 2006). Mateřská linie bílých ušlechtilých prasat se vyznačuje velmi dobrými reprodukčním vlastnostmi, vynikající růstovou schopností, konverzí živin, masnou užitkovostí a dobrou kvalitou masa. Tyto prasata mají větší až velký tělesný rámec, lehčí hlavu, vzpřímené ucho, pevnou kostru a konstituci s vysokým stupněm odolnosti vůči stresům. Zbarvení kůže i štětin je bílé. Otcovská linie bílého ušlechtilého prasete se příliš neliší od mateřské linie, u této linie je však vyžadováno vyjádření masného užitkového typu s mediální rýhou na hřbetě

28

a kýtě. Tělesný rámec je střední až větší a kostra je o něco mohutnější než u linie mateřské. Otcovská linie se vyznačuje také výbornou růstovou schopností a konverzí živin (Pražák & Stibal, 2010). Tab. 3: Vlastní užitkovost českého bílého ušlechtilého plemene prasat v roce 2009 – polní test (přepracováno dle Stibal & Jelínková, 2010). Kanečci

Prasničky

Testováno (ks)

2365

8187

Průměrný denní přírůstek od narození do konce testu (g)

670

642

Podíl libového masa (%)

63,7

62,7

Průměrná výška špeku (cm)

0,73

0,74

Průměrný denní přírůstek v unifikovaném testu (g)

1057

1021

Průměrný denní přírůstek od narození do začátku testu (g)

386

383

29

3.3 Genová exprese a její analýza 3.3.1 Exprese genetické informace Podobu, strukturu a vývoj živých organismů řídí informace a nástroje, které jsou zodpovědné za veškeré biologické procesy uskutečňující se v organismu. Nositelkou této genetické informace všech organismů, s výjimkou některých nebuněčných, je deoxyribonukleová kyselina (DNA), která je součástí somatických buněk a je ve všech buňkách prakticky totožná. Rozdíl mezi jednotlivými typy buněk, jako jsou např. buňky svalu, mozku, nervů nebo jater, udává určitý soubor genů, které jsou v buňkách exprimovány. Stejně tak schopnost organismu odpovídat na podměty prostředí a přizpůsobit se jeho změnám, závisí na schopnosti regulace exprimovaných genů (pozitivní nebo negativní). Tato regulace, vytvářející rozdíly v genové expresi, je základem anatomické a fyziologické komplexity eukaryotických organismů. Genová exprese je tedy komplexní a regulovaný proces, kterým je genetická informace uložená ve formě DNA přeměněna v konkrétní buněčné struktury, přičemž tato DNA zůstává relativně nezměněna. Výsledné produkty procesu exprese genů jsou molekuly proteinů, ale i ribonukleové kyseliny (RNA). Exprese strukturních genů obecně zahrnuje transkripci, kdy je určitý úsek DNA (gen) přepsán v mediátorovou RNA (mRNA), která slouží jako matrice pro syntézu proteinů v procesu translace. Genová exprese eukaryot je podstatně složitější než u prokaryot, protože tato buňka je rozdělena na jednotlivé organely, které vykonávají odlišnou funkci. Stejně tak fáze genové exprese jsou fyzicky izolovány (transkripce probíhá v jádře, translace v cytoplazmě buňky), čímž je umožněna regulace exprese na různých místech. V současné době je známa řada mechanizmů, které organismy využívají k regulaci genové exprese (např. indukce exprese faktory prostředí, hormony, nebo chemikáliemi, RNA interference, remodelace chromatinu, metylace DNA, imprinting, amplifikace genů, aktivace nebo inaktivace chromozomů). Genová exprese a její regulace je dobře prostudována u bakterií a virů, na rozdíl od buněk eukaryotických, které stále ukrývají mnoho tajemství (Daryl & Granner, 2002; Snustad et al., 2009). V souvislosti s metodami analýzy genové exprese se zajímáme o míru genové exprese, tedy o počet kopií RNA transkriptů vytvořených během transkripce specifického genu ve sledovaném čase. Stanovení hladiny genové exprese vypovídá o transkripční aktivitě sledovaného genu (Dziuda, 2010). 30

3.3.2 Genomika prasat Genomika je termín, který použil jako první pravděpodobně Thomas Roderick v roce 1986 k označení podoboru genetiky zabývajícího se mapováním, sekvenováním a analýzou funkcí genomu a současně k pojmenování nového vědeckého časopisu Genomics určeného k publikování nových vědeckých poznatků v tomto oboru. Lze ji rozdělit na genomiku strukturní, studující strukturu genomu, na genomiku funkční, analyzující funkci genomu a genomiku komparativní, která studuje evoluci genomu. Protože v současné době již známe kompletní nukleotidové sekvence mnoha organismů, je strukturní genomika ve vysoce pokročilém stádiu. Znalosti strukturní genomiky nám otevřely další dveře pro bioinformatické analýzy a funkční studie genů (Snustad et al., 2009). Mapování genomu prasat bylo zahájeno na konci osmdesátých let minulého století, kdy vznikl projekt, který byl nazván PigMap (Pig Gene Mapping Project). Prvotní snahou tohoto projektu bylo nalezení genetických markerů a vytvoření vazbové a cytogenetické mapy. V roce 2003 bylo zahájeno sekvenování kompletního genomu prasete, které koordinuje organizace SGSC (Swine Genome Sequencing Consortium), jemuž předcházelo sestavení detailní vazbové a fyzické mapy chromozomů prasete pomocí metod jako je hybridizace somatických buněk, in situ hybridizace a radiační hybridní mapování (Groenen et al., 2011). V posledních letech zaznamenala genetika prasat významný pokrok díky vývoji moderních molekulárně - biologických technik a pokročilé bioinformatice. Byla vytvořena fyzická mapa s vyšším rozlišením díky začlenění mapy klonů a sekvencí BAC konců. Počet mapovaných QTL neustále narůstá (aktuální výsledky mapování QTL jsou dostupné prostřednictvím PigQTLdb). Roste také počet identifikovaných nekódujících RNA a jejich funkce jsou dále zkoumány. Publikované sekvence genomu prasete poskytují užitečné pomůcky pro komparativní genomiku, SNP a QTL analýzu (Fan et al., 2011). Další převrat v odhalování a charakterizaci genetické variability prasete domácího a jeho blízkých příbuzných způsobily sekvenační metody nové generace (tzv. NextGeneration Sequencing). Mimo to studium genové exprese výrazně pokročilo díky dostupným technikám jako jsou microarray (Moran, 2011). Genová exprese je klíčový determinant fenotypové variability a expresní lokusy kvantitativních znaků (eQTL), v souvislosti s chovem hospodářských zvířat, umožňují analyzovat geny a mutace ovlivňující ekonomicky důležité vlastnosti, vývojové vady

31

a onemocnění (Rothschild et al., 2007). Termín eQTL označuje statisticky významnou korelaci mezi genotypem a určitou úrovní genové exprese. Míra exprese genů je analyzována pomocí technologie microarray nebo masivního paralelního RNA sekvenování, genotypy asociačním, vazbovým nebo QTL mapováním (viz review Majewski & Pastinen, 2011). Na rozdíl od tradičního mapování QTL, které je omezené na několik kvantitativních vlastností, technologie DNA mikročipů umožňuje současně analyzovat expresní profil většiny genů genomu a mapovat jejich regiony v genomu prostřednictvím genetických markerů (viz review Gilad et al., 2008). Technologie masivního paralelního RNA sekvenování navíc umožňuje nejen přesné stanovení exprese, ale také může poskytnout informace o izoformách genů, jejich transkriptech a úrovních alelické exprese (viz review Majewski & Pastinen, 2011).

3.3.3 Metody analýzy genové exprese První průlom v identifikaci specifických genů byl zaznamenán s publikací metody Southernova přenosu (Southern blot) Edwinem Southernem v roce 1975. Tento postup byl v roce 1977 upraven pro molekuly RNA a nazván přenos northernový (Northern blot). Obě metody jsou založeny na hybridizaci radioaktivně značených sond s fragmenty DNA nebo RNA, které jsou imobilizovány na membráně. Tyto metody přinesly první možnost identifikovat specifické geny nebo transkripty, nelze však stále ještě hovořit o technikách kvantifikace nukleových kyselin. Jisté zlepšení přinesla citlivější metoda test ochrany před účinkem Rnázy, která je založena na hybridizaci v roztoku a umožňuje identifikovat specifické fragmenty RNA ve směsi molekul izolovaných z daného biologického vzorku. V roce 1983 představil Kerry Mullis techniku polymerázové řetězové reakce (PCR). Je těžké uvažovat o jiné laboratorní technice, která by měla větší dopad na různé stránky biologického výzkumu než PCR. Kombinace metody PCR s reverzně transkripční (RT) reakcí umožňuje identifikovat specifické RNA transkripty, které se v buňce vyskytují i ve velmi nízkých hladinách. Kvantifikaci transkriptů neznámých vzorků umožnila kompetitivní RT-PCR. Objev real-time PCR a mikročipů (microarray), v devadesátých letech minulého století, znamenal další revoluci v molekulární biologii a diagnostice. V roce 1996 Applied

32

Biosystems uvedl poprvé na trh přístroj 7700 pro real-time PCR. Tato technika se stala nejpřesnější a nejcitlivější metodou pro detekci a kvantifikaci nukleových kyselin a překonala většinu hlavních nedostatků dříve užívaných metod. Využití přesnosti a citlivosti metody PCR v kombinaci s přímou detekcí produktu pomocí fluorescenčně značených primerů, sond nebo barviv, umožnilo eliminovat základní nevýhody použití gelů, membrán, radioaktivně značených sond a autoradiografie (Shipley, 2006). V současné době existuje velká škála metod molekulární biologie a genetiky, které umožňují kvantifikaci mRNA a analýzu genové exprese. Každá metoda má své výhody, ale i omezení určující její praktickou využitelnost v daném výzkumu. Podrobný popis jednotlivých metod přesahuje možnosti této práce, a proto se v následujícím textu zmíním jen o metodách, které byly v této práci prakticky využity pro analýzu exprese zkoumaných genů.

3.3.3.1 Real-time PCR Metoda real-time PCR (PCR v reálném čase) je založená na polymerázové řetězové reakci (PCR). Real-time PCR je metoda velmi citlivá, specifická, spolehlivá, dobře reprodukovatelná, umožňující kvantifikaci specifického úseku nukleových kyselin (Bustin, 2000). Princip metody je založen na detekci a kvantifikaci fluorescenčního signálu ve speciálním cykleru, který je schopen provádět současně amplifikaci i detekci fluorescence, a tak přímo zaznamenávat výsledky v průběhu reakce bez nutnosti detekovat následně produkty pomocí gelové elektroforézy (Šmarda et al., 2008). Tato metoda má široký okruh využití, jako je například analýza genové exprese, stanovení virové nálože, detekce geneticky modifikovaných organismů (GMO), genotypování SNP nebo alelická diskriminace (Qiaqen, 2010). Fluorescence, která je přímo úměrná množství PCR produktu přítomného v reakční směsi, je zaznamenávána v průběhu každého cyklu reakce. Vynesením naměřené fluorescence oproti pořadovému číslu příslušného cyklu, ve kterém byla daná intenzita fluorescence zaznamenána, vznikne tzv. amplifikační křivka (Obr. 11). Typickou amplifikační křivku lze rozdělit na 3 části: 1) skrytá (background) fáze, při které amplifikovaný produkt nedosahuje měřitelných hodnot, 2) exponenciální fáze, pro kterou je typický nárůst množství detekovaného PCR produktu a 3) fázi plató, kdy již nedochází

33

k nárůstu množství amplifikovaného produktu a fluorescenční signál je konstantní (Generi Biotech). Amplifikační křivka zobrazuje rozdíly v počátečním množství templátových molekul v analyzovaných vzorcích. Čím dříve dosáhne tato křivka určitou úroveň fluorescenčního prahového signálu (tzv. threshold), tím více templátových molekul bylo přítomno na počátku reakce v analyzovaných vzorcích (Kubista et al., 2006). Množství amplifikovaného PCR produktu je však přímo úměrné počátečnímu množství cílových molekul pouze v průběhu exponenciální fáze amplifikace. Pro kvantifikaci pomocí real-time PCR je proto klíčové, aby bylo množství produktu analyzovaného genu zaznamenáno právě v průběhu této fáze (Pfaffl, 2004). Číslo cyklu, kdy měřená fluorescence překročí zvolenou prahovou hodnotu se nazývá CT (threshold cycle) hodnota, která je nepostradatelná pro následnou kvantifikaci pomocí matematických modelů (Kubista et al., 2006).

Obr. 11: Typická amplifikační křivka vznikající při real-time PCR reakci (přepracováno dle Kubista et al., 2006).

Detekce PCR produktu Pro detekci PCR produktu v průběhu reakce existují různé detekční systémy založené na použití interkalačního barviva, fluorescenčně značených sond nebo fluorescenčně značených primerů (Šmarda et al., 2008). Nejjednodušší a cenově nejdostupnější systém využívá principu inkorporace fluorescenčního barviva do nově vznikajících PCR produktů. K tomuto účelu se nejčastěji využívá SYBR Green I barvivo (Shipley, 2006),

34

které fluoreskuje po vazbě k dvouřetězcové DNA (dsDNA) nezávisle na její sekvenci. Fluorescence intaktního barviva v reakční směsi je minimální, ale výrazně se zvýší se vzrůstajícím množství PCR produktu, tedy po vazbě barviva na dsDNA, kdy dochází k jeho konformačním změnám (Obr.12). Postupný nárůst množství produktu reakce korelující se zvyšováním fluorescenčního signálu, je monitorován během každého cyklu. Hlavní výhodou využití tohoto systému je relativně snadný design a optimalizace reakce. Využití SYBR Green I barviva pro real-time PCR vyžaduje navržení vhodného páru PCR primerů a experimentální optimalizaci efektivity a specifity reakce. Nevýhoda tohoto detekčního systému spočívá v tom, že SYBR Green I detekuje veškerou dsDNA v reakční směsi, tedy mimo specifického produktu také produkty nespecifické a primerdimer artefakty. Dochází tak k nárůstu intenzity fluorescenčního signálu a výsledná kvantifikace je nadhodnocena. Proto je nezbytné na závěr každé analýzy využívající SYBR Green I provést tzv. analýzu křivky tání, která umožňuje detekovat veškeré produkty vytvořené v průběhu reakce prostřednictvím stanovení jejich specifických teplot tání (Tm) (Roche, 2006). Nespecifické produkty mají totiž odlišnou (obvykle nižší) Tm než produkty specifické (Generi Biotech).

Obr 12.: Princip detekce PCR produktů v průběhu real-time PCR reakce pomocí SYBR Green I barviva (A), TaqMan (B) a FRET sond (C) (přepracováno dle Qiagen, 2010).

Princip detekce produktu využívající fluorescenčně značené oligonukleotidové sondy je založen na hybridizaci sondy s komplementární amplifikovanou sekvencí. Na tyto sondy jsou navázány molekuly fluoroforů emitující světlo určité vlnové délky. Takové

35

detekční systémy jsou vysoce specifické, protože k nárůstu fluorescence dochází pouze pokud je amplifikován specifický úsek DNA, který je detekován jak samotnou sondou, tak primery. Díky tomu nedochází k detekci nespecifických produktů, a proto není nutné provádět analýzu křivky tání (Roche, 2006). Mezi fluorescenčně značené sondy řadíme tzv. TaqMan sondy, FRET sondy a nebo molekulární majáky. TaqMan sondy jsou duálně značené oligonukleotidy, které obsahují fluorescenční značku na 5´konci (reporter) a nefluoreskující značku na 3´konci (quencher, zhášeč). Pokud je sonda v intaktním stavu, jsou oba fluorofory drženy v prostorové blízkosti a zhášeč pohlcuje fluorescenci emitovanou reportérem. Po vazbě sondy s cílovou sekvencí je sonda štěpena prostřednictvím 5´→3´exonukleázové aktivity Taq DNA polymerázy, dochází k prostorovému oddělení fluoroforů a emisi fluorescence, která je úměrná množství amplifikovaného PCR produktu (Obr.12) (Applied Biosystems1). Real-time PCR využívající tzv. přenos energie fluorescenční rezonancí (FRET) funguje na principu dvojice fluorescenčně značených sond, z nichž jedna je značena na 3´konci donorovým a druhá na 5´konci akceptorovým fluoroforem. Sondy jsou navrženy tak, aby hybridizovaly s cílovou sekvencí blízko sebe. Dojde tak k prostorovému přiblížení fluoroforů, přenosu energie mezi donorovým a akceptorovým fluoroforem a ke zvýšení fluorescence akceptorového fluoroforu, která je detekována (Obr. 12) (Qiagen, 2010). Podobně jako TaqMan sondy (obsahují reporter a zhášeč) jsou navrženy sondy, které se označují jako molekulární majáky (Obr. 13). Tyto sondy ale vytvářejí

v intaktním

stavu

strukturu sekundární vlásenky díky 4 – 6 komplementárním bázím na každém konci oligonukleotidu. Oba fluorofory jsou tak

v prostorové

blízkosti

Obr. 13: Molekulární majáková sonda (Monroy- Contreras & Vaca, 2011).

a nedochází k emisi fluorescence (Shipley, 2006). Smyčka sondy obsahuje sekvenci komplementární k cílové molekule a po jejich vzájemné hybridizaci dojde ke konformační změně sondy, ukončení zhášení a k detekci fluorescence (Tan et al., 2000).

36

Mezi technologie detekčních systémů využívající fluorescenčně značených primerů lze zařadit tzv. Scorpions, LUX nebo Sunrise primery (Obr. 14). Technologie Scorpions využívá specifickou sondu, která je navržena jako molekulární majáková sonda, ale mimo to je na její 3´konec napojen pomocí blokovacího úseku specifický primer. Sekvence primeru je navržena tak, aby byla komplementární k sekvenci cílové nukleové kyseliny. Po zahájení elongace řetězce od 3´konce specifického primeru dochází ke změně konformace sondy. Jelikož ve smyčce sondy je sekvence shodná s úsekem řetězce cílové nukleové kyseliny, může tato sekvence hybridizovat s úsekem nově syntetizovaného řetězce blízko za 3´koncem primeru sondy. Část sondy se proto překlápí, dochází k prostorovému oddělení fluoroforů a emisi fluorescence. Technologie Scorpions může být také tvořena dvojící komplementárních značených oligonukleotidů, z nichž jeden má na 5´konci navázán reporter a primer pro PCR, druhý na 3´konci zhášeč (Pavlík & Pavlíková, 2004).

Obr. 14.: Princip detekce PCR produktů v průběhu real-time PCR reakce pomocí Scorpions (A), LUX (B) a Sunrise primerů (C) (přepracováno dle Cepheid). Technologie LUX využívá pár primerů, z nichž pouze jeden je značen fluorescenčně. Zhášení primeru zajišťuje sekundární struktura vlásenky, kterou tento primer zaujímá v intaktním stavu. Po hybridizaci primeru se specifickou sekvencí dochází k prodloužení primeru a emisi fluorescence (Šmarda et al., 2008).

37

Detekční systém využívající Sunrise primery se podobá technologii Scorpions. Tyto duálně značené sondy mající tvar vlásenky obsahují na 3´konci reportér a PCR primer, na 5´konci zhášeč. Při integraci sondy do nově vzniklého PCR produktu dochází k prostorovému oddělení reportéru a zhášeče a emisi fluorescence (viz review Wong & Medrano, 2005).

Kvantifikační strategie real-time PCR Kvantitativní real-time PCR nabízí dvě hlavní kvantifikační strategie, absolutní nebo relativní. Absolutní kvantifikace mám umožňuje určit přesný počet kopií templátu ve vzorku, zatímco relativní kvantifikace umožňuje kvantifikovat a porovnat relativní změny genové exprese (Pfaffl, 2004). Princip absolutní kvantifikace je založen na použití standardů (např. RNA molekuly o známé koncentraci nebo počtu kopií). Při této analýze je tedy koncentrace sledovaných molekul vyjádřena jako absolutní hodnota (např. počet kopií, µg/µl atd.) (Roche, 2006). Při amplifikaci diluční série standardů o známé koncentraci získáme tzv. kalibrační přímku (Obr. 15). Mezi CT hodnotou analyzovaného vzorku a počátečním množstvím celkové RNA nebo DNA existuje lineární vztah, který znázorňuje kalibrační přímka, z níž je možné odečíst koncentraci neznámého vzorku (viz review Wong & Medrano, 2005). Kritickým bodem absolutní kvantifikace je především design, výroba, stanovení přesné koncentrace a stabilita standardů v průběhu jejich uskladnění. Jako standard pro generování kalibrační přímky může být použita např. rekombinantní plazmidová DNA, genomové DNA, RT-PCR produkt nebo komerčně syntetizované oligonukleotidy (Pfaffl, 2004).

Obr. 15.: Typická kalibrační přímka zobrazující princip stanovení koncentrace analyzovaného vzorku (přepracováno dle Qiaqen, 2010).

38

Relativní kvantifikace je metoda umožňující stanovení míry genové exprese zkoumaného genu, která nevyžaduje, na rozdíl od kvantifikace absolutní, žádné standardy známé koncentrace. Tato kvantifikační strategie zjišťuje změny množství mRNA zkoumaného genu ve vztahu ke genu referenčnímu. Referenčním genem je většinou tzv. housekeeping gen, ale teoreticky to může být jakýkoliv transkript známé sekvence (Pfaffl, 2004). Studovaný a referenční gen mohou být amplifikovány samostatně nebo ve stejné reakci (multiplexu). Genová exprese referenčního genu musí být stabilní ve všech studovaných vzorcích a nesmí být ovlivněna různými podmínkami experimentu nebo stavy buněk a tkáně (např. zdravá x nemocná) (Qiagen, 2010). Kvantifikaci genové exprese testovaného vzorku lze provést pomocí různých matematických modelů. Výpočty jsou založeny na porovnání CT nebo CP (crossing points) hodnot, které jsou dosaženy při stejné úrovni fluorescence nebo získány podle stanoveného matematického algoritmu (Pfaffl, 2004).

Efektivita amplifikace Důležitá součást matematické analýzy relativní kvantifikace je stanovení efektivity amplifikace reakce studovaných a referenčních genů. Většina PCR reakcí nemá ideální efektivitu (1 nebo 100 % – tzn. že v každém následujícím cyklu PCR reakce se množství amplifikovaného produktu zdvojnásobí) a analýza dat bez vhodného korekčního faktoru může zkreslovat data výsledná (viz review Wong & Medrano, 2005). Efektivity amplifikace sledovaných genů je možné stanovit pomocí amplifikace dekadicky ředěných vzorků s použitím referenční RNA nebo cDNA, kdy ze získaných CT hodnot jsou sestrojeny kalibrační přímky. PCR efektivita = [10(–1/slope)] – 1 (Rasmussen, 2001), když logaritmus počáteční koncentrace templátu (nezávislá proměnná) je vynesen na ose x a CT (závislá proměnná) na ose y. Rozdíly v efektivitě mezi analyzovanými vzorky vytvářejí kalibrační přímky s různými tzv. slope hodnotami (Bustin et al., 2009). Při optimální efektivitě reakce (100 %) je hodnota slope rovna -3,32, ale obecně jsou považovány za přijatelné efektivity v rozmezí 90 – 110 % (D’haene et al., 2010). Efektivita amplifikace je poměrně stabilní v rané exponenciální fázi reakce a postupně se snižuje, což metoda využívající k výpočtu kalibrační přímky nebere v úvahu (Liu & Saint, 2002). Existuje však také několik dalších přístupů určujících efektivitu ampli39

fikace, které jsou stanoveny přímo z hrubých dat zaznamenaných v průběhu PCR reakce. Gentle et al. (2001) navrhl jeden z prvních modelů, který stanový efektivitu amplifikace bez kalibračních přímek. Pro výpočet efektivity každého vzorku je použita analýza lineární regrese z logaritmu hrubých fluorescenčních dat zaznamenaných v průběhu exponenciální fáze. Podobně funguje také program LinRegPCR (Ramakers et al., 2003; Ruijter et al., 2009), který určí log-lineární část amplifikační křivky v každém vzorku výběrem dolní a horní hranice, vykoná lineární regresní analýzu pro výpočet efektivity z regresní přímky, která je nejvhodnější z vybrané log-lineární části a výsledkem jsou hodnoty v rozmezí 1,0 – 2,0 představující 0 – 100% efektivitu.

Metody analýzy relativní kvantifikace Nejčastěji užívaná metoda pro kvantifikaci genové exprese je komparativní CT (2–ΔΔCT) metoda, která je založena na přímém porovnání získaných CT hodnot. Odvození rovnic, včetně předpokladů, designu experimentu a validace testu bylo popsáno v „Applied Biosystems User Bulletin No. 2 (P/N 4303859)“ (Applied Biosystems2, 1997) a v publikaci Livak & Schmittgen (2001). Na začátku experimentu je nutné provést analýzu kalibračních přímek pro zkoumaný i referenční gen a určit tak efektivitu jejich amplifikace. Pokud jsou efektivity srovnatelné, množství cílového genu lze jednoduše vypočítat jako: Δ CT (testovaného vzorku) = CT vzorku studovaného genu – CT vzorku referenčního genu; Δ CT (kontrolního vzorku) = CT vzorku kontrolního genu – CT vzorku referenčního genu; ΔΔCT = ΔCT (testovaného vzorku) – ΔCT (kontrolního vzorku); 2 – ΔCT (testovaného vzorku) – ΔCT (kontrolního vzorku) resp. 2–ΔΔCT.

Metoda 2–ΔΔCT je založena na předpokladu, že efektivita reakcí amplifikace zkoumaného i referenčního genu je 100 %. Pokud se efektivita liší, tato metoda může vést k nepřesné kvantifikaci genové exprese. Nicméně existují i různé modifikace této metody, které počítají s korekcí efektivity (Qiagen, 2010). V současné době jsou i k dispozici různé softwary určené pro plně automatizovanou kvantifikaci genové exprese, např. DataAssist od firmy Applied Biosystems, jejichž princip je založen na komparativní CT (2–ΔΔCT) metodě. Při různé efektivitě referenčních a studovaných genů je možné použít tzv. metodu kalibračních přímek. Tato metoda je nejjednodušší a není založena na matematických

40

modelech. Kvantifikace každého zkoumaného vzorku je stanovena prostřednictvím kalibrační přímky vztažením k hodnotě exprese známého kontrolního vzorku. Jelikož tato metoda nepočítá s endogenní kontrolou (obvykle referenční gen), výsledky musí být následně normalizovány (viz review Wong & Medrano, 2005). Mezi další metody analýzy relativní kvantifikace patří např. Pfafflova metoda nebo Q-Gene. Pfafflova metoda je model s korekcí efektivity (kombinuje kvantifikaci a normalizaci do jediného výpočtu). Tato metoda je začleněna v softwarovém programu REST (Pfaffl et al., 2002). Q-Gene je komplexní softwarová aplikace zahrnující celý proces real-time PCR experimentu – od jeho řízení a plánování, vykonání až po vyhodnocení, analýzu dat a jejich grafické znázornění. Tento softwarový nástroj vypočítá průměrnou normalizovanou genovou expresi se směrodatnými odchylkami prostřednictvím dvou různých matematických modelů, které oba pracují s korekcí efektivity. Program zahrnuje také několik testů statistické významnosti pro celkové zhodnocení výsledků experimentu (Muller et al., 2002).

Referenční geny Referenční (housekeeping) geny jsou nejoptimálnější volba pro normalizaci výsledků analýzy genové exprese pomocí real-time PCR metody. Pro správně zvolený referenční gen je typická exprese konstantní úrovně nelišící se mezi analyzovanými vzorky a skupinami (Dorak, 2006). Zda je vhodné daný referenční gen(y) využít pro normalizaci real-time PCR dat, musí být experimentálně ověřeno pro jednotlivé tkáně nebo typy buněk před každým jednotlivým experimentem, jelikož úroveň exprese genu se může značně lišit v odlišných biologických vzorcích a v různých experimentálních podmínkách (Schmittgen & Zakrajsek, 2000). Správně zvolené referenční geny normalizují rozdíly v množství a kvalitě výchozího materiálu, stejně jako v reakční efektivitě a odchylkách vznikajících v průběhu izolace RNA a reverzní transkripce (Bustin & Nolan, 2004). Pro ověření vhodnosti využití referenčních genů existuje řada programů jako je geNorm, BestKeeper nebo NormFinder. geNorm umožňuje vybrat nejvhodnější referenční geny ze souboru testovaných kandidátních referenčních genů na základě geometrického průměru exprese kandidátních cDNA a určí minimální množství referenčních genů po-

41

žadovaných pro spolehlivou normalizaci experimentu. Tento program stanoví stability kandidátních referenčních genů na základě párové variace a míry stability genu (tzv. M hodnota), která je definována jako průměr párové variace mezi určitým genem a dalšími kontrolními geny. Kandidátní geny s nejnižší M hodnotou mají nízkou variaci, a proto stabilní expresi. Pro každý vzorek tento program určí také normalizační faktor. Podrobný princip metody popisuje publikace Vandesompele et al., 2002. Softwarová aplikace BestKeeper, jejichž princip popisuje Pfaffl et al. (2004), je velmi podobná geNormu. Hlavní rozdíly spočívají v tom, že BestKeeper používá jako vstupní data hodnoty CT hodnoty (namísto relativního množství) a odlišnou míru stability genové exprese. Základní princip identifikace stabilně exprimovaných genů je založen na párové korelaci a regresní analýze kandidátních genů a spočívá v tom, že správně zvolené referenční geny by měli mít korelující úrovně exprese. Andersen et al. (2004) vyvinuli aplikaci NormFinder, jejíž princip je založen na matematickém lineárním modelu se smíšenými efekty umožňující odhad souhrnné variace kandidátních referenčních genů i variace mezi skupinami vzorků. Program umožňuje přímo určit odhadovanou variaci exprese a dovoluje uživateli zhodnotit systematickou chybu při využívání zvoleného referenčního genu.

3.3.3.2 Microarray technologie Microarray (mikročipová) technologie je multiplexní technologie umožňující analyzovat molekuly DNA, RNA, proteiny, polysacharidy, lipidy, malé organické sloučeniny nebo dokonce celé buňky. Tato metoda velkou měrou přispěla ke změně pohledu molekulárních biologů na geny a je jednou z metod, která nás popohání do další éry poznání, to je ze strukturní k funkční analýze genomu (viz review Shiu & Borevitz, 2008). Čipové technologie nalezly v současné době široký okruh aplikace a využívají se např. k analýze počtu kopií DNA (tzv. DNA copy number), metylací, chromatinu, proteinů (Reimers, 2010), exprese celého genomu, jednonukleotidových polymorfizmů (SNP) a komparativní genomické hybridizaci (CGH) (Schrenzel et al., 2009). Mezi čipovými technologiemi získaly významné postavení expresní mikročipy, jejichž prostřednictvím můžeme sledovat aktivitu několika tisíců genů v dané tkáni

42

(tzv. gene expression profilling) (Merkerová et al., 2006). Princip DNA mikročipů spočívá v hybridizaci vzorku se specifickými sondami obsahující sekvenci určité části genu nebo jiných úseků DNA, které jsou imobilizovány na čipu (viz review Chon & Lancaster, 2011). Technologie mikročipů se v podstatě neliší od jiných metod, jejichž podstata spočívá v hybridizaci nukleových kyselin. Na rozdíl od microarray technologie však nejsou tyto techniky vhodné pro analýzu velkého počtu genů. Na povrchu mikročipu je navázáno až několik tisíců specifických sond, a tak je možné současně monitorovat široké spektrum genů (viz review Sellheyer & Belbin, 2004). Tato technologie umožňuje kvantifikovat množství sledovaných molekul a detekovat biologické interakce na molekulární nebo buněčné úrovni (viz review Shiu & Borevitz, 2008). Každý DNA microarray experiment se skládá z pěti samostatných kroků: 1) výroba čipu, 2) příprava vzorku, 3) hybridizace značeného vzorku nukleové kyseliny se sondami, které jsou imobilizovány na čipu, 4) detekce signálu a vizualizace dat, 5) zpracování dat a jejich analýza (viz review Sellheyer & Belbin, 2004).

Technologie výroby mikročipů Čipy se zhotovují z materiálů, které jsou vhodné pro imobilizaci sond a vlastní hybridizaci (Gojová & Kozák, 2006). První čipy představovaly DNA sondy, které byly imobilizovány na nylonových membránách. Nejčastěji se však pro výrobu čipů používá sklo, které má ve srovnání s nylonovými membránami několik výhod. Mimo fakt, že nylonové membrány mají menší hustotu nanesených spotů, čip ze skla je nepropustný a není pórovitý, což umožňuje účinnější hybridizaci nukleových kyselin zkoumaného vzorku se sondami. Sklo není ani materiál absorpční, proto pro hybridizaci postačí menší množství nukleových kyselin. Nízká autofluorescence skla neovlivňuje výsledná data a na jediném sklíčku lze jednoduše porovnat současně dva vzorky, které jsou označeny odlišnými fluorescenčními barvivy (viz review Sellheyer & Belbin, 2004). Povrch skleněného čipu je upraven pomocí hydrofobních polymerů (poly-L-lysin, aminosilan, epoxysilan apod.), které poskytují reakční skupiny jako jsou -HN2, -OH, =O pro vazbu sondy (Merkerová et al., 2006). Sondy, které jsou imobilizovány na povrchu čipu mohou být dvojího typu. Čipy obsahující jako sondy molekuly komplementární DNA (cDNA) jsou většinou zhotoveny ze skla. Oligonukleotidové sondy se využívají jak pro čipy na sklíčku, tak pro membrá43

nové filtry. Na jediném čtverečním centimetru čipu může být až 10 000 cDNA nebo 250 000 oligonukleotidových sond. DNA mikročipy jsou často produkovány laboratořemi akademických center, zatímco oligonukleotidové čipy jsou vyráběny komerčně (viz review Sellheyer & Belbin, 2004). DNA microarrays tvořící cDNA klony nebo jejich PCR produkty jsou roboticky spotovány (natištěny) na sklíčko. Vlastní proces spotování zahrnuje nanášení sond na sklíčko ve formě roztoku, přičemž jsou sondy nasávány do velmi tenkých jehel, přeneseny a natištěny na povrch čipu přístrojem zvaným spotter (Gojová & Kozák, 2006). Takovýto čip je vhodný pro aplikace vyžadující malý nebo střední počet sond, jako je genotypování, různé diagnostiky bakterií nebo analýza genové exprese (viz review Chon & Lancaster, 2011). Oligonukleotidové sondy jsou buď spotovány (na sklo nebo membránu) nebo častěji jsou syntetizovány in situ na skleněný povrch. In situ syntéza je založená na technice označené jako fotolitografie (viz review Sellheyer & Belbin, 2004). Tuto metodu, umožňující přímou syntézu sond na čip, vyvinula firma Affymetrix a je vhodná pro analýzy, které vyžadují střední až velký počet sond, jako je skríning genomu pro detekci jednonukleotidových polymorfismů (SNP) nebo expresní analýzy. Microarray platformy, které jsou založeny na in situ syntéze sond komerčně vyrábí také firma Agilent. Sondy mohou být delší (Agilent designuje sondy o délce 60 nukleotidů) nebo kratší (Affymetrix designuje sondy o délce 25 nukleotidů) v závislosti na jejich účelu použití. Delší sondy jsou specifičtější k cílovým genům, kratší sondy mohou být spotovány ve vyšší hustotě a jejich výroba je levnější. Kromě Affymetrixu a Agilentu má významné postavení na trhu také firma Illumina, které vyvinula novou technologii výroby mikročipů tzv. bead array. Jedná se o soubor mikroskopických kuliček, které jsou náhodně imobilizovány na čipu. Každá kulička obsahuje tisíce kopií specifické oligonukleotidové sondy a je nasycena různými koncentracemi fluorescenčního barviva. Výhodou této metody je husté pokrytí čipu korálky se specifickými sekvencemi v mnoha kopích, které umožňuje vysokou preciznost a přesnost analýzy (viz review Chon & Lancaster, 2011).

Příprava vzorků pro expresní mikročipy Základem úspěchu microarray experimentu je izolace velmi kvalitní, intaktní RNA. Pro microarray analýzu je potřeba obvykle 10 – 40 µg izolované RNA, což odpovídá přibližně 100 mm3 tkáně (Ramaswamy & Golub, 2002). K izolaci RNA je preferována 44

tkáň čerstvá, ale lze využít i například vzorky uložené v parafínu. Čistota vzorku je kritická především pro proces hybridizace, jelikož přítomné zbytky lipidů a sacharidů mohou způsobit nespecifickou vazbu fluorescenčně značených nukleových kyselin k povrchu čipu. Pokud je množství izolované mRNA nedostatečné, je nutné, před značením vzorku, provést jeho amplifikaci. Purifikovaná mRNA je reverzní transkripcí přepsána do komplementárního řetězce cDNA. Následně je vlákno mRNA odbouráno a nahrazeno druhým řetězcem cDNA a vzniká tak dvouřetězcová cDNA, která je amplifikována. Podle kódujícího řetězce cDNA je připraven značený řetězec cRNA mající sekvenci komplementární k původní mRNA (Obr. 16) (Merkerová et al., 2006). Vzorky určené k analýze musí být dále před nebo po hybridizaci na čipu vhodně označeny. Ke značení mohou být využity fluorofory nebo izotopy. Inkorporace radioaktivních značek je nejstarší a dnes již překonaná metoda a v současnosti je již jednoznačně převládající přístup fluorescenčního značení (Gojová & Kozák, 2006), které může být buď přímé, nepřímé anebo dendrimerní. Princip přímého fluorescenčního značení spočívá v zabudování fluorescenčně značených nukleotidů dUTP nebo dCTP namísto neznačených dTTP nebo dCTP do řetězce nukleové kyseliny v průběhu reakce reverzní transkripce. Nepřímé značení je proces dvoufázový. Do řetězce nukleové

Obr. 16: Princip amplifikace mRNA (Merkerová et al., 2006).

kyseliny je nejprve zabudován aminoallyl-deoxyuridin-trifosfát (aa dUTP), na který se v druhé fázi nepřímého značení naváží pomocí kovalentní vazby fluorescenční barviva. Hlavní výhoda přímého značení je jeho jednoduchost a menší časová náročnost, ale dCTP značené barvivem Cy5 jsou inkorporovány do molekuly nukleové kyseliny s nižší efektivitou než dCTP označené barvivem Cy3 (viz review Do & Choi, 2007). Na rozdíl od předchozích dvou způsobů značení, tzv. 3DNA dendrimerní technologie (Obr. 17) není založena na inkorporaci fluoroforů do cDNA a je zcela závislá na průběhu hybridizace nukleových kyselin. Nukleová kyse-

45

lina analyzovaného vzorku je označena v průběhu procesu reverzní transkripce dendrimerní komplexy, které obsahují stovky molekul fluoroforu. Vazba komplexů na molekuly cDNA je zajištěna pomocí hybridizace s oligonukleotidy obsahujícími specifickou sekvenci s Cy3 nebo Cy5 fluorofory, která je začleněna do cDNA prostřednictvím upraveného primeru v průběhu reverzní transkripce. Výsledkem jsou značené molekuly cDNA s relativně konstantním množstvím fluoroforů (Manduchi et al., 2002).

Obr. 17: Vazba dendrimerních komplexů k molekule nukleové kyseliny (přepracováno dle Genisphere, 2006).

Dle počtu snímaných barev lze microarray experimenty rozdělit na jednokanálové (single-channel) a dvoukanálové (two-channel). Při jednokanálovém experimentu je provedena analýza na mikročipu pouze jediného značeného vzorku. Této metodě dává přednost většina komerčních výrobců microarray (Affymetrix, Illumina, Agilent) a používá se převážně u čipů s oligonukleotidovými sondami, jejichž výroba je založena na fotolitografické technologii. Dvoukanálový experiment umožňující analýzu dvou odlišně fluorescenčně značených vzorků na jediném čipu využívá především cDNA sondy (viz review Stears et al., 2003). Duální značení vzorků umožňuje provést semikvantitativní analýzu genové exprese. Na jeden čip jsou hybridizovány dva odlišně fluorescenčně označené vzorky, díky čemuž je možné přímo porovnat kvantitativní rozdíly v expresi sledovaného genu mezi oběma vzorky (Merkerová et al., 2006). Například kontrolní vzorek (zdravá tkáň) je označen zeleným fluorescenčním barvivem (Cy3) a vzorek zkoumaný (nádorová tkáň) barvivem červeným (Cy5). Pokud je výsledný spot 46

červený, je určitý gen ve srovnání s kontrolou exprimován více, naopak zelené zbarvení značí sníženou hladinu exprese určitého genu zkoumaného vzorku. Pokud je exprese genu obou vzorků stejná, spot bude žlutý, zatímco při nulové aktivitě spot zůstává černý (Xiang & Chen, 2000). Po procesu značení cDNA následuje její hybridizace se sondami na mikročipu, která se provádí podle obvyklých protokolů doporučených výrobcem. Hybridizační roztok obsahuje solný roztok citrátu sodného (SSC), dodecylsíran sodný (SDS) jako detergent, nespecifickou DNA (např. DNA kvasinek, DNA ze spermií lososa nebo repetitivní sekvence), jako blokátor hovězí sérový albumin (BSA) nebo Denhardtovo činidlo a značenou cDNA vzorku. Proces hybridizace probíhá při teplotě 42 – 45 °C u čipů s cDNA nebo při 42 – 50 °C u čipů s oligonukleotidovými sondami (Trevino et al., 2007). Hybridizace je ukončena přibližně za 16 – 24 hodin. Po ní následuje odmytí nenavázaných nukleových kyselin a snímání čipu pomocí skeneru (viz review Sellheyer & Belbin, 2004).

Detekce signálu a vizualizace dat U mikročipů využívající fluorescenční značení je měřena intenzita fluorescence imobilizované zkoumané nukleové kyseliny laserem konfokálního mikroskopu a fluorescenční obraz je získán excitačními a emisními filtry specifickými pro použité vlnové délky (viz review Sellheyer & Belbin, 2004). Platí předpoklad, že intenzita detekovaného signálu (intenzita barvy spotu) odpovídá množství inkorporovaného barviva v každém spotu a je přímo úměrná koncentraci sledovaných molekul přítomných v analyzovaném vzorku (Trevino et al., 2007). Při duálním značení se užívají různé filtry pro každý vzorek a intenzita obou vzorků je vzájemně porovnána a vyjádřena jako poměrná hodnota. Fluorescenční signály jsou konvertovány do pseudobarev a analyzovány různými softwary, které jsou po odečtení fluorescence pozadí schopny určit celkovou intenzitu signálu (viz review Sellheyer & Belbin, 2004).

47

Zpracování dat a jejich analýza Nejsilnější stránka technologie mikročipů, tedy schopnost analyzovat v jediném experimentu tisíce genů, je současně i její stránkou nejslabší. Pro řadu výzkumníků je proto při analýze dat nezbytná pomoc statistiků a matematiků (Leung & Cavalieri, 2003). Popis analýzy microarray dat je zveřejněna v řadě publikací a jsou popisovány její stále nové inovační způsoby. K dispozici je také několik softwarů, které jsou schopny vykonat všechny kroky standardní analýzy dat mikročipů jako je Genespring, Nexus (Biodiscovery), GeneSifter (Geospiza), Expressionist (Genedata) a Partek Genomics Suite (Reimers, 2010). Analýza dat mikročipů zahrnuje několik kroků. Klíčem k získání množství kvalitních dat pro jejich analýzu je kvalitní design experimentu. Samotná analýza poté zahrnuje zpracování získaného obrazu, zhodnocení kvality surových dat a jejich filtrování, transformaci a normalizaci. V závěrečných krocích je nezbytné provedení statistického zpracování získaných dat a validaci výsledků (viz review Allison et al., 2006). Jak již bylo řečeno, výsledkem microarray experimentu je obraz, ve kterém každý spot odpovídá určitému genu a má přiřazenou určitou intenzitu fluorescence, která představuje relativní úroveň exprese určitého genu. První krok v analýze microarray dat je zpracování tohoto obrazu (Babu, 2004). Digitální obraz je zpracován speciálním softwarem (program pro analýzu obrazu) s předem uloženým designem sond na microarray sklíčku. Pomocí tzv. integrační funkce je provedena konverze charakteristik aktuálního spotu na číselnou hodnotu a výsledkem analýzy obrazu je specifický (dle výrobce mikročipu) textový soubor. Většina výrobců mikročipů a skenerů poskytuje vlastní software pro analýzu obrazu, dostupný je např. ScanArray, GenePix, TIGRSpotFinder/TM4 a GeneChip (Trevino et al., 2007). V následujícím kroku je důležité určit, jaká data je vhodné dále analyzovat. Proto je nezbytné zhodnotit kvalitu získaných surových dat a filtrovat nespolehlivé spoty. Za takovéto lze označit např. spoty překrývající se, kontaminované (prachem, nadbytkem barviva), se silným šumem pozadí, s netypickou velikostí a tvarem, saturované spoty, spoty tvaru koblihy (ve středu spotu nejsou hybridizovány sondy) nebo spoty, které se nenacházejí v očekávaných pozicích (Sauer et al., 2005). K filtrování jsou nejčastěji používané přístupy využívající statistické testy, SNR (signal to noise ratio) –

48

poměr signálu popředí se směrodatnou odchylkou signálu pozadí, variabilitu a průměr (Trevino et al., 2007). Součástí předzpracování filtrovaných dat je dále jejich převod na podobu, která je vhodná pro jejich další analýzu. Jako názorný příklad může být uvedeno množství specifické mRNA, které je u mikročipů kvantifikováno nepřímo prostřednictvím emise fluorescence. Proto je nezbytné transformovat nezpracovaná surová data intenzity fluorescence na takovou podobu, která odráží úroveň dané exprese. V běžné praxi se nezpracovaná microarray data před vlastní analýzou převádějí neboli transformují většinou logaritmickou transformací, která také významně zredukuje nesouměrnost rozdělení dat (Li et al., 2006). Zobrazení rozdělení dat je možné prostřednictvím histogramu (Obr. 18) nebo krabicových grafů (tzv. box plot). Díky transformaci je možné porovnat naprosto odlišné hodnoty jako jsou extrémně vysoké a nízké intenzity detekované fluorescence (Zhang, 2006). Nedílnou součástí předzpracování analyzovaných dat je také sumarizace. Tento proces je velmi důležitý, jelikož většina mikročipů je konstruována tak, že na sklíčku je několik spotů, které obsahují sondy určené ke detekci určitého transkriptu (genu). Účelem procesu sumarizace je proto shrnout tyto opakovaná měření do jediné reprezentativní hodnoty, k čemuž lze využít programy jako je např. MAS 4, MAS 5, MBEI, RMA, PDNN (Miles & Kerns, 2003).

Obr. 18: Histogram intenzit mikročipových dat před (A) a po (B) log transformaci. Jak je možné vidět na obrázku A, surová data jsou většinou kumulována v nízkých hodnotách intenzit

a

díky

přítomnosti

extrémně

vysokých

hodnot

je

není

možné

sledovat.

Po logaritmické transformaci jsou data rozprostřena rovnoměrně (přepracováno dle Zhang, 2006).

49

Ať už hovoříme o oligonukleotidových nebo cDNA čipech, oba typy mikročipových dat jsou ovlivněny nějakou náhodou nebo systematickými chybami, které vznikají v průběhu výroby mikročipu, přípravě biologického vzorku, hybridizaci a nebo kvantifikaci intenzit spotů. O odstranění takovýchto odchylek se pokouší normalizace, která má rozhodující vliv na analýzu mikročipového experimentu a jejímž cílem je generovat hodnoty, které mohou být porovnány mezi experimenty, zvláště pokud byly tyto experimenty vykonány v odlišných časech, místech, odlišnými reagenciemi, mikročipy nebo technikami. Strategie normalizace in situ syntetizovaných oligonukleotidových mikročipů jako jsou Affymetrix GeneChip je odlišná než u oligonukleotidových a cDNA mikročipů, které vznikají spotováním, jelikož tyto platformy mají odlišnou strukturu i schéma značení. U spotovaných oligonukleotidových nebo cDNA mikročipů se provádí tzv. normalizace v rámci jednoho sklíčka odstraňující odchylky uvnitř jednotlivého čipu. U GeneChip dat se provádí tzv. normalizace mezi sklíčky, která odstraňuje odchylky mezi různými mikročipy použitými v experimentu (Do & Choi, 2006). Většina metod normalizace dat mikročipů je založena na předpokladech, že 1) všechny (nebo většina) genů na čipu není odlišně exprimována, 2) existuje symetrie mezi geny s pozitivní a negativní regulací genové exprese a 3) rozdílná exprese signálu je nezávislá na průměrné úrovni genové exprese (Göhlmann & Talloen, 2009). Normalizace v rámci jednoho sklíčka zahrnuje prostorovou korekci, korekci vůči pozadí a korekci vůči různým fluorescenčním barvivům (Budinská et al., 2005). Prostorové odchylky jsou významný problém a původní zdroj těchto artefaktů může vzniknout v průběhu tištění sond na mikročip (tzv. print-tip efekt), hybridizace, odmytí čipu po hybridizaci nebo skenování obrazu. Analýza rozptylu (ANOVA) nebo MA graf umožňují detekovat tyto prostorové odchylky a pro jejich korekci se často užívá vyhlazovací metoda lowess nebo loess (Locally weighted linear regression) normalizace (viz review Qian et al., 2003). Normalizace pozadí zahrnuje odstranění nespecifických signálů z celkové intenzity spotů. Tradiční přístup korekce vůči pozadí předpokládá, že celková intenzita určitého spotu je výsledkem součtu intenzity specifického signálu i pozadí. Odečteme-li signál pozadí od celkového pozorovaného signálu, získáme intenzitu specifického signálu. Avšak pokud je intenzita pozadí větší než intenzita skutečného signálu, výsledkem jsou korigované intenzity s negativní hodnotou. V řadě dostupných publikacích odborné literatury je diskutováno, jak eliminovat tento problém, např. odfiltrováním spotů s nízkou intenzitou, odečtením průměrné intenzity všech prázdných spotů atd. (Ritchie et al., 2007).

50

Obr. 19: Nejčastěji užívané vizualizační nástroje microarray analýzy pro interpretaci výsledků z experimentu. A) Heat mapa umožňující rychlé zhodnocení skupin genů, které vykazují podobné úrovně exprese (obraz se skládá z malých buněk určité barvy představující relativní hodnoty exprese). Heat mapy mohou také odhalit např. prostorové odchylky nebo intenzitu pozadí. B) Krabicový box (box plot) se skládá z bloků s centrální osou a dvěma konci. Osa představuje střední hodnotu (madián) dat, zatímco konce prezentují vrchní a spodní kvaril (tj. krajní hodnotu ve vrchní nebo ve spodní čtvrtině statistické řady). C) MA graf je určeny pro detekci microarray odchylek, které jsou závislé na intenzitě (často jsou využívány v procesu normalizace dvoukanálových experimentů). D) Volcano graf se užívá pro zhodnocení hodnoty fold change (jednotka pro porovnání úrovně exprese genu mezi dvěma odlišnými experimentálními podmínkami) a statistickou významnost. Horní rohy grafu představují geny, které vykazují jak statistickou významnost, tak významný fold change. E) Histogram p-hodnot je běžná součást smíšených modelů a znázorňuje bloky, které v rozsahu 0 až 1 obsahují p-hodnotu testu diferenciální exprese pro každý gen (Allison et al., 2006).

Pro odhalení odchylek intenzity barviv může být využit bodový MA graf (M hodnoty jsou vyneseny na ose x, A hodnoty na ose y). M = Log2 (R / G) a A = Log2 (R × G) / 2, kde R a G reprezentují intenzity červeného a zeleného kanálu. Za předpokladu, že většina genů nebyla odlišně exprimována a v intenzitách barviva není rozdíl, většina M hodnot by měla být rozložena na ose y kolem nuly. Normalizace je nakonec provedena odhadem (posunováním) přímky shodných expresí (Trevino et al., 2007).

51

Normalizace mezi sklíčky je nezbytná u experimentů, kde byly analyzovány minimálně dva čipy. Cílem je transformovat data takovým způsobem, aby všechny čipy měly stejnou distribuci hodnot. U těchto experimentů se provádí nejčastěji kvantilová normalizace (Trevino et al., 2007). Kvantilová normalizace je algoritmus pro distribuce intenzit sond, které musí být stejné pro všechny mikročipy v experimentu (Obr. 20). Nejprve je kalkulována první průměrná distribuce a poté jsou k této předkalkulované průměrné hodnotě přizpůsobeny ostatní mikročipy. Nevýhodou tohoto přístupu je však to, že některé sety sond mají někdy přesně stejné hodnoty napříč všemi mikročipy. Existují i jiné normalizační metody (např. lineární transformace – linear scaling, stabilizace normalizace rozptylu – variance stabilization normalization, loess nebo invariantní normalizace – rank-invariant normalization) (Göhlmann & Talloen, 2009).

Obr. 20: Krabicové grafy microarray dat před a po kvantilové normalizaci (přepracováno dle Su et al., 2009).

Statistická analýza je poslední část microarray experimentu. Metod, které statisticky analyzují data z mikročipů, je velké množství a jsou neustále modifikovány a vylepšovány. Tyto metody lze rozdělit do tří skupin: shlukovací metody, metody identifikace rozdílně exprimovaných genů a klasifikační metody. Úkolem shlukovacích metod

52

je nalezení skupiny genů (shluků), které se chovají v průběhu experimentu podobně a nebo skupiny vzorků s podobným expresním profilem. Ke shlukování lze využít procedury jako je metoda k-průměrů, hierarchické metody, samoorganizující se mapy a nebo metody založené na matematickém modelu. Cílem metod identifikace rozdílně exprimovaných genů je nalezení určitých genů, jejichž exprese se liší mezi jednotlivými vzorky. Mezi takovéto metody řadíme metody násobného testování hypotéz založené na t-testu a jeho modifikacích nebo analýzu rozptylu. Do poslední skupiny patří klasifikační metody, které zařadí vzorek na základě jeho expresního profilu do některé z předem definovaných tříd (např. zdravý x nemocný). Pro klasifikaci se používá pouze část z proměnných (genů), které mají dostatečnou vypovídací schopnost pro námi studovaný cíl, tj. geny, které jsou aktivní a nechovají se u analyzovaných tříd (zdravá x nemocná) stejně. Z klasifikačních metod lze využít např. metodu lineární diskriminační analýzy a její modifikace, metodu k nejbližších sousedů (k-NN), klasifikační stromy a nebo algoritmy podpůrných vektorů (SVM) (Pavlík & Jarkovský, 2006).

GeneChip Porcine Genome Array Affymetrix GeneChip jsou mikročipy obsahující několik desítek tisíc setů sond, jejichž princip je založen na jednoduchém fluorescenčním značení (jednokanálový experiment). Každý set sond je soubor 11. – 20. párů sond o délce 25 nukleotidů, které podrobně analyzují určitou sekvenci nebo soubor sekvencí. Každý pár obsahuje sekvenci, která je zcela komplementární k sekvenci zkoumaného genu nazývající se perfect match (PM). Specifická kontrolní sonda neboli mismatch (MM) má jednu bázi zaměněnou a je určena k rozlišení nespecifické hybridizace (Obr. 21) (Do & Choi, 2006). Porcine Genome Array je čip poskytující kompletní pokrytí transkriptomu prasete domácího. Tento čip obsahuje 23 937 sond, které podrobně zkoumají přibližně 23 256 transkriptů z 20 201 genů prasete. Sekvence sond byly sestaveny podle veřejně dostupných publikovaných dat včetně UniGene GenBank mRNA a GenBank mitochondriální a rRNA sekvence prasete. Porcine Genome Array čip obsahuje oligonukleotidové sondy o délce 25 nukleotidů (Affymetrix, 2011).

53

Obr. 21: Princip Affymetrix GeneChip mikročipů (PM – perfect match; MM – mismatch) (přepracováno dle Do & Choi, 2006).

54

3.4 Přehled studovaných genů 3.4.1 Referenční geny HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) Gen HPRT1 se u prasete, stejně jako u placentárních savců a vačnatců, nachází na chromozomu X. Protein, který kóduje tento gen, patří do proteinové rodiny purin/pyrimidin fosforibosyltransferáz, mezi jejíž členy se řadí enzymy, které jsou zodpovědné

za

syntézu

nukleotidů

(Musick,

1981).

Enzym

hypoxanthin-guanin-

fosforibosyltransferáza je transferáza katalyzující přeměnu hypoxantinu na inozinmonofosfát a guaninu na guanozinmonofosfát prostřednictvím přenosu 5-fosforibosylové skupiny z

5-fosforybosil-1-pyrofosfátu. Enzym omezuje konverzi hypoxanthinu

na kyselinu močovou a hraje klíčovou roli v recyklační dráze purinových bází (tzv. salvage pathway) (Keebaugh et al., 2007).

RPS18 (ribosomal protein S18) RPS18 je gen kódující protein, který je součástí malé podjednotky ribozomů (40S) a proteinové rodiny ribozomu S13P. Protein S18 vykazuje vysokou homologii s ribozomálním proteinem E.coli rps13, který hraje důležitou roli v iniciaci a elongaci translace a pomáhá také regulovat její efektivitu. Eukaryotický S18 protein je substrátem pro CaMKII (Ca2+/kalmodulin-dependentní kináza II), která hraje roli v různých buněčných procesech jako je uvolňování neurotransmiteru, migrace cévních svalových buněk, jejich kontrakce a transkripci genů (Mishra-Gorur et al., 2002). Tento protein funguje také jako specifický vazebný protein cofilinu, který váže a depolymeruje aktinová filamenta (Kusui et al., 2004). Gen RPS18 se nachází u prasete na chromozomu 7.

NACA (nascent polypeptide-associated complex alpha subunit) Gen NACA byl u prasete mapován na chromozomu 5 a je členem genové rodiny, která se nazývá NAC-alpha. Protein kódující gen NACA reguluje transkripci jako koak-

55

tivátor (Yotov et al., 1998), funguje jako pozitivní regulátor v derivování červených krvinek (Lopez et al., 2005) a jako negativní regulátor v proliferaci, diferenciaci a cytotoxické aktivaci CD8 (+) T buněk (Al-Shanti & Aldahoodi, 2006). Proteinový produkt genu NACA společně s BTF3b tvoří heterodimer NAC (nascent polypeptide associated complex). Tento proteinový komplex se váže ke vznikajícímu polypeptidovému řetězci, který je uvolněn z ribozomu a chrání jej před nesprávnou vazbou s jinými cytozolickými faktory (Wiedmann et al., 1994).

TBP (TATA box binding protein) TATA vazebný protein náležící k rodině TBP, má důležitou roli v procesu genové exprese. Vytváří společně s proteiny, které se nazývají TATA vazebné proteiny (TAF), makromolekulární komplexy (TFIID, B-TFIID, SL1 a TFIIIB) nepostradatelné v procesu transkripce, jež je katalyzována eukaryotickými RNA polymerázami I, II nebo III (Hernandez, 1993; de Graaf et al., 2010). Typickým rysem peptidu, který kóduje gen TBP, je dlouhý řetězec glutaminů v jeho N-konci. Tento region moduluje DNA vazebnou aktivitu C konce peptidu a ovlivňuje rychlost utváření transkripčního komplexu a iniciaci transkripce (Entrez Gene, 2010). TBP má také specifickou funkci v aktivaci genů řídících buněčný cyklus a ovlivňuje imunotoleranci v mateřském organismu savců během gravidity (Davidson et al., 2004).

TAF4B (TAF4b RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 105kDa) TFIID je základní transkripční faktor interagující s promotorem, který obsahuje TATA-vazebný protein (TBP) a několik faktorů s ním asociovaných (TAF), mezi něž se řadí i TAF4B (Verrijzer & Tjian 1996). TAF4B společně s TAF4 a TAF12 vytváří komplex, který se váže k DNA a napomáhá asociaci TFIID s promotory genů (Gazit et al., 2009). Inkorporace TAF4B do TFIID usnadňuje interakci s TFIIA a různými aktivátory transkripce (Cler et al., 2009). TAF4B také reguluje expresi genů kontrolujících buněčnou proliferaci (Mengus et al., 2005) a hraje důležitou roli v plodnosti obou pohlaví. TAF4B je zapojen v regulaci specifikace a proliferace spermatogoniových

56

kmenových buněk, které jsou nezbytné pro normální průběh spermatogeneze v dospělém organismu (Falender et al., 2005). Stejně tak je nepostradatelný pro správný vývoj a funkci vaječníků a folikulogenezi (Freiman et al., 2001). Gen byl zmapován na 6. chromozomu prasete a je součástí genové rodiny TAF4.

RPL32 (ribosomal protein L32) Gen kódující ribozomální protein L32 (RPL32) byl nalezen u prasete na chromozomu 13 a kóduje proteiny patřící k L32E rodině ribosomálních proteinů, které jsou součástí velké podjednotky (60S) ribozómů (Dudov & Perry, 1984). Ribozomální proteiny hrají důležité role ve stabilizaci struktury rRNA a v syntéze proteinů (proces translace) (Maguire & Zimmermann, 2001). Expresi ribozomálního proteinu RPL32 řídí endogenní RPL32 promotor, který výrazně zvyšuje úrovně genové exprese buněk (Hoeksema et al., 2011).

OAZ1 (ornithine decarboxylase antizyme 1) Gen OAZ1 byl mapován na druhém chromozomu prasete a je členem tzv. rodiny ODC antizyme. Tento gen je zapojen v regulaci syntézy polyaminů a má hlavní roli v udržování jejich vnitrobuněčné homeostáze. Produkt genu OAZ1 inhibuje a urychluje degradaci ornitin dekarboxylázy. Ornitin dekarboxyláza je klíčovým enzymem biosyntézy polyaminů spermidinu a sperminu prostřednictvím dekarboxylace aminokyseliny ornitinu, v důsledku čehož vzniká konečný produkt putrescin. Polyaminy jsou nezbytné pro regulační procesy jako je růst, derivování a transformaci buněk (Li & Coffino, 1992). Gen OAZ1 pravděpodobně také funguje jako negativní regulátor transportu polyaminů (He et al., 1994).

3.4.2 Analyzované geny ANKRD1 (ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle)) Gen ANKRD1 společně s geny ANKRD2 (ankyrin repeat domain protein 2) a DARP (diabetes-related ankyrin repeat protein) jsou členy rodiny MARP (muscle ankyrin re-

57

peat protein). Produkty této genové rodiny jsou lokalizovány v jádrech a také v sarkomeře svalového vlákna. Jejich funkce spočívá v regulaci genové exprese a ovlivnění svalová kontrakce (Miller et al., 2003). Exprese genu ANKRD1 je indukována α- a β- adrenergní signalizací (Zolk et al., 2003) a transformačním růstovým faktorem beta (TGF-β) (Kanai et al., 2001). Tento gen je také exprimován v kosterní svalové tkáni a jeho úroveň exprese se zvyšuje po fyzické námaze (Chen et al., 2002). Je ve spojení s řadou onemocnění pohybového aparátu jako je Duchennova svalová dystrofie, vrozená svalová dystrofie (Nakada et al., 2003), míšní svalovou atrofií nebo amyotrofická laterální skleróza (Nakamura et al., 2003). Mimo to je ANKRD1 důležitý regulátor raného vývoje srdce a mutace tohoto genu jsou zodpovědné za některá srdeční onemocnění (Zolk et al., 2002). Gen se u prasete nachází na chromozomu číslo 14.

C1QTNF3 (C1q and tumor necrosis factor related protein 3) Gen C1QTNF3, nacházející se u prasete na chromozomu 16, kóduje nedávno objevený protein CORS-26 (collagenous repeat-containing sequence of 26 kDa protein) a náleží k C1q/TNF rodině. Předpokládá se, že tento protein je paralog adiponektinu. Je zapojen v regulaci buněk osteosarkomu a ve vývoji tkáně mezenchymu. Jako růstový faktor hraje důležitou roli v regulaci procesu chondrogeneze a vývoji chrupavky. Jelikož je CORS-26 specificky indukován v průběhu pozdní diferenciace adipocytů a stimuluje sekreci adiponektinu a resistinu, předpokládá se, že může být zapojen v procesu inzulínové rezistence, cukrovce typu 2 a metabolickém syndromu. Mimo to tento protein hraje klíčovou roli v angiogenezi, pozitivně reguluje proliferaci a migraci endoteliálních buněk a proliferaci hladkosvalových buněk (viz review Svestak et al., 2010).

C5orf13 (chromosome 5 open reading frame 13) Gen C5orf13 byl u prasete mapován na dlouhém raménku chromozomu číslo 2 (Shi et al., 2001). Současné výzkumy ukazují, že tento gen má široký rozsah efektů na endokrinní faktory a jejich receptory, na transkripční faktory a možné role v transformaci nebo morfogenezi nervových, svalových a fibroblastových buněk (Taylor et al. 2000). Gen je zapojen v aktivaci myogeneze hladké svalové tkáně a diferenciaci myofibroblas-

58

tů (Pan et al. 2002). Také se podílí na regulaci akumulace lipidových kapének, podporuje expresi několika genů, které jsou asociovány se syntézou lipidů a zvyšuje úroveň vnitrobuněčného cholesterolu, triglyceridů a vnitrobuněčných lipidových kapének (Leung et al. 2008). Mimo to výzkumy ukazují, že tento gen může být zapojen v diferenciaci kosterní svalové tkáně (da Costa et al., 2004).

CNN3 (calponin 3, acidic) Kalponin je známý jako protein exprimovaný v hladké svalové tkáni a nesvalových buňkách. Byl původně identifikován jako regulační protein, který váže aktin, myozin, na Ca2+ závislé proteiny a tropomyozin, a tak je zapojen v procesu kontrakce hladké svalové tkáně (El-Mezgueldi, 1996). U obratlovců byly nalezeny tři izoformy kalponinu, které jsou produkty tří homologických genů: CNN1, CNN2 a CNN3. Produkty genu CNN3 byly nalezeny v hladké svalové a nervové tkáni (viz review Wu & Jin, 2008). Výzkumy ukazují že, kalponin 3 se podílí například na fúzi buněk (Shibukawa et al., 2010), záporné regulaci signální dráhy kostních morfogenetických proteinů (BMP) (Haag & Aigner, 2007) a kontrole migraci fibroblastů (Appel et al., 2010). Gen CNN3 byl u prasete mapován na chromozomu 4.

ENHO (energy homeostasis associated) Tento gen byl zmapován na 10. chromozomu prasete a kóduje nedávno identifikovaný protein adropin, který hraje důležitou roli v energetické homeostazi a inzulínové rezistenci. Adropin reguluje expresi lipogenních genů v játrech a tukové tkáni a také receptor aktivovaný peroxisomovým proliferátorem gama (PPARγ) (Kumar et al., 2008; Lovren et al., 2010). PPARγ je člen skupiny steroidních a thyreoidálních nukleárních receptorů. Reguluju genovou transkripci, podporuje buněčnou diferenciaci a především reguluje diferenciaci adipocytů a ukládání tukových zásob (Michalik et al., 2006).

GDF8 (myostatin) Tento gen byl u prasete mapován na chromozomu číslo 15. Stručný popis jeho funkce obsahuje kapitola 3.1.3.6. 59

POSTN (periostin, osteoblast specific factor) Gen POSTN, kódující protein periostin, byl nalezen u prasete na chromozomu 11. Periostin je protein různorodých funkcí, který je nezbytný hlavně v průběhu postnatálního vývoje. Je exprimován v řadě tkání a především v tkáních pojivových obsahujících kolagen, kde jeho funkce spočívá v kontrole syntézy extracelulárního matrixu (viz review Hamilton et al., 2008). Jeho expresi indukuje kostní morfogenetický protein 2 (BMP2) (Inai et al., 2008) a také transformační růstový faktor beta 1 (TGFβ1) (Horiuchi et al., 1999). Periostin je zapojen v procesu vývoje, hojení, i v řadě onemocnění. Výzkumy ukazují, že knockout genu u myší způsobuje embryonální i postnatální úmrtnost, vážnou růstovou retardaci, nepřítomnost trabekulárních kostí, defekty zubní skloviny, peridontální onemocnění a defekty chrupavek a srdečních chlopní (viz review Hamilton et al., 2008).

TNNT2 (cardiac troponin T) Troponin je svalový protein, který tvoří komplex s tropomyozinem a skládá se ze tří podjednotek.

Jednou

z těchto

podjednotek

je

troponin

T,

který

společně

s tropomyozinem zajišťuje kontrakci svalu (Gomes et al., 2004). Troponiny T jsou exprimovány tkáňově specificky a kódují izoformy, které jsou přítomny v srdečních, pomalých nebo rychlých vláknech svalové tkáně (Townsend et al., 1995). Mutace nalezené v genu TNNT2 jsou spojeny s onemocněním srdce (kardiomyopatií) (Abid et al., 2011). Gen TNNT2 byl mapován na desátém chromozomu prasete.

YWHAQ (tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, theta polypeptide) Produkt genu YWHAQ je součástí 14-3-3 proteinové rodiny, která se podílí na regulaci metabolismu, signální transdukci, regulaci buněčného cyklu a apoptóze (Malaspina et al., 2000). Tyto proteiny způsobují konformační změny v cílovém proteinu prostřednictvím změny jeho stability, katalytické aktivity, buněčné lokalizace nebo citlivosti k vnitrobuněčném proteázám, kinázám a fosfatázám (Morrison, 2009; Tzivion et al., 2006). Protein kódovaný genem YWHAQ je jedním z hlavních substrátů protein-tyrozin kinázy, která reguluje antigenně specifický receptor B-lymfocytů (Yamanashi 60

et al., 1993). Gen je spojován také s několika nemocemi jako je amyotrofická laterální skleróza nebo chronická lymfocytární leukemie (Malaspina et al., 2000; Scielzo et al., 2005). U prasete byl gen zmapován na chromozomu 3.

IGF2 (insulin-like growth factor 2 (somatomedin A)) Tento gen byl u prasete mapován na jeho druhém chromozomu. Stručný popis funkce genu IGF2 obsahuje kapitola 3.1.3.6.

MYH8 (myosin, heavy chain 8, skeletal muscle) Myozin je společně s aktinem základní bílkovinou svalového vlákna odpovědnou za kontrakci svalů. Molekula myozinu je hexamer, který je tvořen dvěma šroubovicemi a skládá se z jednoho páru těžkých a dvou párů lehkých řetězců. Vlastnosti myozinové molekuly určuje typ těžkého myozinového řetězce (Murray, 2002). Funkce genu MYH8 je téměř neznámá, mimo skutečnost, že MYH8 je společně s MYH1, 2 a 3 jednou z izoforem myozinu, která je specifiky exprimována během embryonálního vývoje, zatímco exprese dalších známých izoforem myozinu je potlačena (Shyy et al., 2010). Mutace nalezená v tomto genu způsobuje onemocnění zvané Dutch-Kennedyův syndrom, pro něž jsou typické deformace a anomálie pohybového ústrojí (Veugelers et al., 2004).

MLC1SA (myosin, light chain 6B, alkali, smooth muscle and non-muscle) Gen MLC1SA kóduje jeden ze dvou myozinových lehkých řetězců (lehký alkalický řetězec), který je exprimován v počátečních fázi myogeneze pomalými vlákny kosterní svaloviny, hladkosvalovou a nesvalovou tkání (Hailstones & Gunning, 1990). Gen se nachází na 5. chromozomu prasete. Izoformy myozinových lehkých řetězců (MLC1), mezi které patří i MLC1SA, ovlivňují kontrakci svalových vláken (Reiser & Bicer, 2006). MLC1SA společně s MLC1SB jsou pod kontrolou thyroidních hormonů, které ovlivňují změny v expresi myozinových izoforem v závislosti na stáří jedince, hrají klíčovou roli ve vývoji kosterní svaloviny a mají rozhodující vliv na expresi proteinů kontraktilního a sarkoplazmatického retikula (Biral et al., 1999).

61

HLA-DRB4 (major histocompatibility complex, class II, DR beta 4) HLA-DRB4 patří do třídy molekul heterodimerů, které jsou složeny z alfa (DRA) a beta (DRB) řetězců. Tyto molekuly hrají klíčovou roli v imunitním systému a mají důležitou úlohu při zajišťování imunologické homeostázy organismu: HLA molekuly se nacházejí na povrchu imunitních buněk a zajišťují předkládání antigenu T lymfocytům, což je důležitý předpoklad jeho rozpoznání a následné účinné imunitní odpovědi. HLA komplex představuje geny, které kódují HLA molekuly (glykosylované polypeptidy). Ty jsou exprimovány na membráně buněk imunitního systému i jiných buněčných typů (Petřek, 2002).

62

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Výběr vhodných referenčních genů pro studium genové exprese ve svalové tkáni prasete pomocí metody real-time PCR 4.1.1 Analyzované vzorky K analýze referenčních genů pro studium genové exprese pomocí real-time PCR metody byly použity následující vzorky z kosterní svalové tkáně prasat odlišného stáří: 1. plod – zadní končetina; české bílé ušlechtilé plemeno prasat; 42. den březosti; 2. sele – musculus longissimus lumborum etthoracis; komerční hybrid; stáří 1 – 18 dnů; 3. dospělé prase – musculus longissimus lumborum etthoracis; komerční hybrid; stáří přibližně 200 dnů. Z každé věkové kategorie bylo vybráno a následně analyzováno celkem 9 vzorků. Odebrané vzorky tkáně byly ihned po odběru uloženy v roztoku RNAlater Solution (Ambion) a uchovány při -20 °C.

4.1.2 Izolace RNA, reverzní transkripce Vzorky tkání určené k analýze byly nejprve homogenizovány v přístroji FastPrep FP 120 (ThermoSavant) a celková RNA byla izolována užitím TRI Reagentu (SigmaAldrich). Integrita a kvalita izolované RNA byla ověřena pomocí agarózové elektroforézy. Kontaminující DNA byla odstraněna za použití kitu DNA-free Kit (Ambion) a nepřítomnost molekul DNA byla ověřena pomocí kontrolní PCR. Primery (gen PLIN) a podmínky PCR reakce byly převzaty podle Vykoukalová et al. (2009). Celková koncentrace a čistota vzorků RNA byla stanovena spektrofotometrem NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Pro syntézu cDNA bylo použito 1 μg celkové RNA a byla provedena pomocí kitu Omniscript Reverse Transcriptase (Qiagen) a oligo (dT)20 primerů (Invitrogen) dle postupu, který doporučuje výrobce.

4.1.3 Real-time PCR Analyzované geny, jejich označení a sekvence primerů jsou uvedeny v Tab. 4

63

a Tab. 5. Primery pro analýzu genu HPRT1 byly převzaty ze studie Svobodová et al. (2008), pro gen TBP z publikace Nygard et al. (2007). Ostatní primery byly navrženy podle známých sekvencí genů prasete, které jsou dostupné v GenBank (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) pomocí programu OLIGO v4.0 (National Biosciences Inc.). Tab. 4: Symbol, název a číslo v databázi GenBank vybraných kandidátních referenčních genů. Symbol

Název

Číslo

hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1

NM_001032376

ribosomal protein S18

NM_213940

nascent-polypeptide-associated complex alpha polypeptide

AK237627

TBP

TATA box binding protein

DQ178129

TAF4B

TAF4b RNA polymerase II

EF133513

RPL32

ribosomal protein L32

NM_001001636

OAZ1

ornithine decarboxylase antizyme 1

NM_001122994

HPRT1 RPS18 NACA

Real-time PCR reakce byla provedena v termocykleru 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems). Reakční směs (konečný objem 20 μl) obsahovala 8,4 μl ultračisté vody (TopBio), 0,2 μl UracilN-glycosylase (UNG) (Applied Biosystems), 10 pmol přímého a zpětného primeru, 10 µl Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), a 1 µl vzorku cDNA nebo ultra čisté vody. Podmínky PCR reakce byly následující: počáteční UNG inkubace 2 min. při 50 °C byla následována úvodní denaturací 10 min. při 95 °C a 40 – 50 cykly sestávajícími se z denaturace 15 s. při 95 °C a annealingu/elongaci 1min. při 60 °C. Na závěr byla provedena křivka tání pro ověření specifity PCR produktů zvyšováním teploty z 60 na 95 °C v krocích po 0,2 °C po dobu 15 s. Pro stanovení efektivity PCR reakce byla provedena amplifikace diluční série vzorků každého analyzovaného genu a tkáně (10-ti násobné ředění) a ze získaných CT hodnot byly sestrojeny kalibrační přímky. Vzorky byly analyzovány v triplikátech a všechny 64

experimenty obsahovaly negativní kontrolu obsahující ultra čistou vodu namísto analyzované cDNA. Produkty PCR zkoumaných genů byly ověřeny elektroforeticky na 3% agarózovém gelu a následně sekvenováním užitím ABI PRISM 3100 – Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Vyhodnocení real-time PCR reakcí bylo prováděno softwarem 7500 Software v2.0.3 (Applied Biosystems). Stabilita genů a výběr vhodných referenčních genů pro real-time PCR byla vyhodnocena pomocí programu geNorm software program (Vandesompele et al., 2002). Tab. 5: Sekvence primerů pro real-time PCR analýzu vybraných referenčních genů. Gen HPRT1 RPS18

Sekvence přímého a zpětného primeru (5´→´3´) AAGGACCCCTCGAAGTGTTG

Produkt (bp) 122

CACAAACATGATTCAAGTCCCTG GGGTGTAGGACGGAGATATGCT

102

ATTACACGTTCCACCTCATCCTC NACA

AAGAGGAGAGTGAAGAGGAAGAGGT

106

GCTCGGACTGCCTTTGCTC TBP

AACAGTTCAGTAGTTATGAGCCAGA

153

AGATGTTCTCAAACGCTTCG TAF4B

GCAGCCAAGAGTCGTTCCA

178

CCTCACTTCCAGACCCAGATTC RPL32

AGCGGAACTGGCGGAAAC

210

TGTGAGCAATCTCAGCACAGTATG OAZ1

AGTTCCAGGGTCTCCATCAA

243

TTAATGTGTTTGGCATCTGTGA

65

4.2 Komparativní analýza genových transkriptů v kosterní svalové tkáni prasete domácího a divokého 4.2.1 Analyzované vzorky Pro komparativní analýzu transkriptů kosterní svalové tkáně byly vybrány dva typy svalů (m. longissimus dorsi a m. biceps femoris) tří jedinců českého bílého ušlechtilého plemene prasat a tří jedinců divokého prasete. Při odběru vzorků svalové tkáně byla poražená prasata v období intenzivního růstu. Bílá ušlechtilá prasata, pocházející ze šlechtitelského chovu Zemědělské společnosti Luže, a.s., byla poražena přibližně ve věku 3 měsíců a živé hmotnosti 45 – 50 kg. Stáří divokých prasat, pocházejících z honitby společnosti Agrowald s.r.o. Rožmberk nad Vltavou, bylo 8 – 9 měsíců a váha 15 – 20 kg. Vzorky byly odebrány ze svalu longissimus dorsi na úrovni posledního žebra a ze střední části svalu biceps femoris do 30 min po porážce. Odebraná tkáň byla okamžitě uložena v roztoku RNAlater Solution (Ambion) a uchována při -20 °C.

4.2.2 Izolace RNA K izolaci RNA ze svalové tkáně byl použit RNeasy Mini kit (Qiagen). Koncentrace a kvalita RNA byla analyzována pomocí bioanalyzačního přístroje automatické čipové elektroforézy Experion (Biorad). RQI (RNA quality indicator) všech vzorků RNA byl ≥ 8. Pokud nebylo dosaženo dostatečně vysoké koncentrace a absolutního výtěžku RNA při její izolaci určitého vzorku, byla provedena série izolací RNA, které byly zkoncentrovány pomocí RNeasy MinElute Cleanup kitu (Qiagen). Pro expresní analýzu bylo připraveno celkem 36 izolátů RNA: •

z m. longissimus dorsi – 3 vzorky z každého jedince divokého prasete (a1, a2, a3; b1, b2, b3; c1, c2, c3);

•

z m. biceps femoris – 3 vzorky z každého jedince divokého prasete (d1, d2, d3; e1, e2, e3; f1, f2, f3);

•

z m. longissimus dorsi – 3 vzorky z každého jedince ČBU prasete (g1, g2, g3; h1, h2, h3; i1, i2, i3);

•

z m. biceps femoris – 3 vzorky z každého jedince ČBU prasete (j1, j2, j3; k1, k2, k3; l1, l2, l3). 66

Z těchto vzorků byly poté vytvořeny pooly o koncentraci 140 ng/µl (koncentrace a kvalita RNA byla opět ověřena pomocí přístroje Experion (Biorad)): •

z m. longissimus dorsi divokého prase – pool 1: a1+b1+c1; pool 2: a2+b2+c2; pool 3: a3+b3+c3;

•

z m. biceps femoris divokého prase – pool 4: d1+e1+f1; pool 5: d2+e2+f2;

•

pool 6: d3+e3+f3;

•

z m. longissimus dorsi ČBU – pool 7: g1+h1+i1; pool 8: g2+h2+i2; pool 9: g3+h3+i3;

•

z m. biceps femoris ČBU – pool 10: j1+k1+l1; pool 11: j2+k2+l2; pool 12: j3+k3+l3.

Příprava vzorků pro microarray analýzu probíhala v laboratoři genomiky živočichů na Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AV ČR v Liběchově. 4.2.3 Microarray analýza Microarray hybridizace a níže popsaná prvotní analýza dat byla provedena v servisní laboratoři genomiky a bioinformatiky na Ústavu molekulární genetiky AV ČR v Praze. Pro microarray analýzu byly použity komerčně dostupné čipy GeneChip Porcine Genome Array (Affymetrix). Data, která byla získána při mikročipové analýze kosterní svalové tkáně bílého ušlechtilého a divokého prasete, byla dále analyzována v následujícím postupu: 1. odečtení signálu; 2. korekce pozadí metodou GCRMA (GC Robust Multi-array Average); 3. kvantilová normalizace mezi sklíčky; 4. identifikace diferenciálně exprimovaných genů pomocí metody ANOVA (analýza variance); 5. odstranění falešně pozitivních výsledků (korekce p-hodnot) pomocí metody FDR (false discovery rate) – korekce step-up a q-value. Získaná upravená data (23 937 prób) byla uložena v aplikaci Microsoft Excel. Další analýza byla provedena ve 4 kontrastech: 1. LW 1 * mbf3 vs. LW * mld4; 1

LW – české bílé ušlechtilé plemeno prasat WB – divoké prase 3 mbf – m. biceps femoris 4 mld – m. longissimus dorsi 2

67

2. WB2 * mbf vs. WB * mld; 3. LW * mbf vs. WB * mbf; 4. LW * mld vs. WB * mld.

4.2.4 Reverzní transkripce a kvantitativní real-time PCR Koncentrace a kvalita vzorků izolované RNA byla opět ověřena pomocí spektrofotometru NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Syntéza cDNA z 1 μg celkové RNA byla provedena pomocí kitu Omniscript Reverse Transcriptase (Qiagen) a oligo (dT)20 primerů (Invitrogen) dle standardních pokynů výrobce. Analyzované geny, včetně jejich označení a sekvencí primerů pro real-time PCR analýzu jsou uvedeny v Tab. 6 a Tab. 7. Primery byly navrženy v programu OLIGO v4.0 (National Biosciences Inc.) ze známých sekvencí, které jsou dostupné v GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)

nebo

Ensembl

Genome

Browser

(www.ensembl.org/). Tyto primery byly navrženy tak, aby se jejich Tm pohybovala okolo 60 °C, což bylo ověřeno pomocí nástroje Tm Calculator (http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/). Specifita primerů byla dále ověřena pomocí nástroje BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Real-time PCR reakce byla provedena v termocykleru 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems). Reakční směs (konečný objem 20 μl) obsahovala 8,4 μl ultračisté vody (TopBio), 0,2 μl UracilN-glycosylase (UNG) (Applied Biosystems), 10 pmol přímého a zpětného primeru, 10 µl Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), and 1 µl vzorku cDNA nebo ultra čisté vody. Podmínky PCR reakce byly následující: počáteční UNG inkubace 2 min. při 50 °C byla následována úvodní denaturací 10 min. při 95 °C a 40 – 50 cykly sestávajícími se z denaturace 15 s. při 95 °C a annealingu/elongaci 1min. při 60 °C. Na závěr byla provedena křivka tání pro ověření specifity amplifikovaných produktů zvyšováním teploty z 60 na 95 °C v krocích po 0,2 °C po dobu 15 s. Jako referenční byly vybrány geny HPRT1, RPS18 a OAZ1 (viz kap. 4.1.3). Pro zajištění reprodukovatelnosti výsledků byly reakce prováděny v triplikátech. Specifita amplikonů studovaných genů byla ověřena prostřednictvím gelové elektroforézy a sekvenováním pomocí ABI PRISM 3100 – Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Vyhodnocení real-time PCR reakcí bylo prováděno softwarem 7500 Software

68

v2.0.3 (Applied Biosystems). Získaná data (CT hodnoty) z analýzy genové exprese vybraných genů pomocí kvantitativní real-time PCR byly zhodnoceny pomocí programu REST 2009 Software (Qiagen). Tab. 6: Symbol, název a číslo v databázi GenBank nebo Ensembl vybraných analyzovaných genů pomocí kvantitativní real-time PCR. Symbol

Název

Číslo

ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle)

NM_213922.1

C1q and tumor necrosis factor related protein 3

NM_001145386.1

chromosome 5 open reading frame 13

EF416570.1

CNN3

calponin 3, acidic

AM490167

ENHO

energy homeostasis associated

NM_001164858.1

GDF8

myostatin

NM_214435.2

POSTN

periostin, osteoblast specific factor

AY880669

TNNT2

cardiac troponin T

CF360253

YWHAQ

tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-

AM503090

ANKRD1 C1QTNF3 C5orf13

monooxygenase activation protein, theta polypeptide IGF2

insulin-like growth factor 2 (somatomedin A)

NM_213883.1

MYH8

myosin, heavy chain 8, skeletal muscle

CN165669

MLC1SA

myosin, light chain 6B, alkali, smooth muscle and

ENSSSCT00000000419

non-muscle HLA-DRB4

major histocompatibility complex, class II, DR beta 4

69

ENSSSCT00000001613

Tab. 7: Sekvence primerů pro kvantitativní real-time PCR analýzu vybraných genů. Gen ANKRD1 C1QTNF3 C5orf13 CNN3

Sekvence přímého a zpětného primeru (5´→´3´) AAGAACTGTGCTGGGAAGACC

Produkt (bp) 119

CCTCTCGCATAGCAACTTTCTG CTATGGTGCTTTTGCTTGTATTGAT

258

CTCTCCCTCCCTCACCCTAC ACTCCACTCGGCAGCAATG

112

TGGTGTATGGGTATTGATGAGGTC AGATGGGCACCAACAAAGG

104

CGAGTTGTCCACGGGTTGT ENHO

CCTCATCGCCATCATCTGC

95

ACTCCCGCTCTGCCAACA GDF8

CTCCTCCACTCCGGGAACT

131

ACCATGCCTACAGAGTCTGATCTT POSTN

ATTCCTGATTCTGCCAAACAAG

147

AGAAAATGCGTTATTCACAGGC TNNT2

CCATCACCTTCCTCCTCTCG

98

CGTCTGAGCCTTCTGGATGTAG YWHAQ

ATCCAGAACTTGCCTGCACA

113

AAGCAACTGCATGATGAGGGT IGF2

CTCGTGCTGCTCGTCTTCTT

187

AGCAGCACTCTTCCACGATG MYH8

AGGACCTCACAAAGCAAGTGAC

148

GCTGAGTCCCAGGTCAACAA MLC1SA

CTGGGAGAGAGGATGACTGAAGA

113

CACATCCTGAGCGTCTGAGCTCTACAG HLA-DRB4

GGAGGGCACGGTCTGAATC GGAGGCCTGTTGGCTGAA

70

144

4.3 Analýza genu C5orf13 4.3.1 Analyzované vzorky K analýze sekvence cDNA a DNA (exonů a jejich lemující sekvencí) C5orf13 genu byly využity vzorky získané z kosterní svalové tkáně českého bílého ušlechtilého plemene a divokého prasete (celkem 12), jejichž obecný popis je obsažen v kapitole 4.2.1. 4.3.2 PCR reakce Primery pro PCR (Tab. 8) byly navrženy podle dostupné sekvence prasete C5orf13 genu (ENSSSCG00000014210) pomocí programu OLIGO v4.0 (National Biosciences Inc.). Reakční směs o celkovém objemu 25 µl obsahovala přibližně 50 ng cDNA nebo DNA (2 µl), 1 × 10 × LA PCR kompletní pufr (Top-Bio), 200 μM každého dNTP (Fermentas), 0,2 μM přímého a zpětného primeru a 1U LA DNA polymerázy (Top-Bio). PCR reakce byla zahájena denaturací při teplotě 95 °C po dobu 2 min. a poté následovalo 30 cyklů zahrnujících denaturaci při teplotě 95 °C po dobu 30 s., připojení primerů po dobu 40 s. při teplotě, která byla optimalizována pro každý použitý pár primerů (Tab. 8) a elongaci při teplotě 68 °C po dobu 1 min. V posledním cyklu byla syntéza řetězce při 68 °C prodloužena na 7 min. a poté byla reakční směs ochlazena na 4 °C. Tab. 8: Informace o primerech použitých k PCR amplifikaci vybraných úseků C5orf13 genu.

Název primeru

C5orf13_cDNA_F1

Sekvence primeru (5´→ 3´)

GGCTTTTGTCTGTTGCTTGG

Teplota

Velikost

připojení

PCR pro-

primerů

duktu

(°C)

(bp)

65

999

60

799

63

888

C5orf13_cDNA_R1 GAAAGCCACACTGAAGACACAA C5orf13_DNA_F2

ACCACTTTGCTTGCTAATGATAA

C5orf13_DNA_R2

TTTAGGATGTTCTTTTTCTTTTCTG

C5orf13_DNA_F3

GCCCAGCCATTAGAGAAACA

C5orf13_DNA_R3

ACTTACCACAAGGAAACAATGAGT

71

PCR produkty byly vizualizovány elektroforeticky na 2% agarózovém gelu. Poté byly přečištěny pomocí MinElute PCR Purification Kit (Qiagen).

4.3.3 Sekvenování Kvantifikace purifikovaných PCR produktů byly provedena pomocí spektrofotometru NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Pro sekvenační reakci byl použit BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems) a totožné primery jako byly využity při amplifikaci produktů pomocí PCR. Reakce probíhala za podmínek 96 ºC/ 1 min. (úvodní denaturace) následována 25-ti cykly zahrnujícími 96 ºC/10s. (denaturace), 50 ºC/5 s. (připojení primeru) a 60 ºC/4min. (elongace). Sekvenační směs byla následně přečištěna pomocí BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems) a analyzována v přístroji ABI PRISM 3100 – Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Získané sekvence byly vyhodnoceny pomocí programu Sequence Scanner Software v1.0 (Applied Biosystems) a porovnány s referenční sekvencí genu C5orf13 pomocí programu ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#).

4.3.4 Testování nalezených polymorfizmů a asociační analýza Nalezené polymorfizmy byly testovány na souboru 247 nepříbuzných prasnic plemene české bílé ušlechtilé, které pocházely ze tří odlišných chovů. Polymorfní místa byla analyzována prostřednictvím sekvenování (polymorfní místo 1-8) a metody PCR-RFLP (polymorfní místo 9). Primery a podmínky reakcí byly totožné jako byly využity při identifikaci polymorfních míst (kapitola 4.3.2 a 4.3.3). Restrikční analýza byla provedena v celkovém objemu 15 µl s využitím 2U DdeI restrikčního enzymu (BioLabs). Štěpení probíhalo přes noc v termostatu při teplotě 37 ºC. Testování odchylky od HardyWeinbergovy rovnováhy(HWE) bylo provedeno chí-kvadrát testem (R v2.13). Dostupné údaje o užitkových znacích sledovaných souborů prasat byly následující: 1. skupina 1 (98 zvířat; narozena v letech 1992 – 1997) a skupina 2 (52 zvířat; narozena v letech 1996 – 1997) – průměrný denní přírůstek (g) stanovený od narození do živé hmotnosti 90 kg a výška hřbetního tuku (cm) určená pomocí ultrazvukového měření přístrojem PIGLOG 105 (testování probíhalo metodou polní-

72

ho testu, užitkové znaky byly získávány u prasniček při živé váze 90 kg, případné odchylky se přepočítávaly pomocí regresní křivky); 2. skupina 3 (97 zvířat; narozena v letech 2003 – 2008) – výška hřbetního tuku (cm) a obsah libového masa (%) měřené ultrazvukovým přístrojem SonoMark SM-100 M na konci testu, průměrný denní přírůstek (g) určený od narození do živé hmotnosti 90 kg, průměrný denní přírůstek v testu (g) stanovený od začátku do konce testu a plemenná hodnota průměrného denního přírůstku od narození, obsahu libového masa, reprodukce a celková plemenná hodnota, které byly odhadnuty pomocí BLUP Animal modelu (testování probíhalo metodou polního testu a bylo započato ve 12 týdnech stáří zvířat a trvalo přibližně 57 dnů). Asociační analýza byla provedena pomocí zobecněného lineárního modelu (GLM procedura) v programu SAS (SAS for Windows 9.1.4) použitím následující rovnice s fixními efekty: yijklmnop = µ + Gi + Gj + Gk + Gl + YBm + Fn + Mo + eijklmnop, kde:

yijklmnop

= sledovaný znak,

µ

= odhadovaný průměr sledovaného znaku,

Gi

= pevný efekt i-tého genotypu SNP c.-169G>A,

Gj

= pevný efekt j-tého genotypu SNP c.-138G>A,

Gk

= pevný efekt k-tého genotypu SNP c.-93T>C,

Gl

= pevný efekt l-tého genotypu genu polymorfního místa c. 78+54T(6_7),

YBm B

= pevný efekt vlivu roku narození prasnice,

Fn and Mo = náhodný efekty otce a matky prasnice, eijklmnop

= náhodná chyba každého pozorování.

73

5 VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Výběr vhodných referenčních genů pro studium genové exprese ve svalové tkáni prasete pomocí metody real-time PCR 5.1.1 Kandidátní referenční geny a jejich real-time PCR analýza Klíčový faktor pro analýzu genové exprese pomocí kvantitativní real-time PCR metody je výběr vhodných referenčních genů. Tento výběr by měl být vykonán pro každý individuální experiment, jelikož exprese genů může být odlišná v závislosti na heterogenitě vzorků, tj. odlišném množství a kvalitě analyzované RNA, enzymatické efektivitě v průběhu extrakce RNA, syntézy cDNA a PCR reakce a v rozdílech v celkové transkripční aktivitě tkání nebo buněk (Vandesompele et al., 2002). V této studii byla stabilita genové exprese zkoumána u genů HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1), RPS18 (ribosomal protein S18), NACA (nascent-polypeptide-associated complex alpha polypeptide), TBP (TATA box binding protein), TAF4B (TAF4b RNA polymerase II), RPL32 (ribosomal protein L32) a OAZ1 (ornithine decarboxylase antizyme 1) v kosterní svalové tkáni plodů, selat a dospělých prasat pomocí kvantitativní real-time PCR a SYBR Green fluorescenčního barviva. Tyto geny byly vybrány na základě jejich předchozího využití pro normalizaci real-time PCR dat, dostupností a znalostí jejich sekvencí a jejich odlišných rolí v buňce (metabolismus nukleotidů – HPRT1, struktura ribozomů – RPS18 a RPL32, vazba DNA – NACA, iniciace transkripce – TBP, regulace a iniciace transkripce – TAF4B, biosyntéza polyaminů – OAZ1). Na rozdíl od

genů

RPS18,

RPL32,

OAZ1, NACA a TAF4B, jsou pouze geny HPRT1 a TBP běžně využívány jako referenční geny pro analýzu genové exprese tkání prasat. Navíc byla hodnocena stabilita exprese potenciálních referenčních genů v kosterní svalové tkáni různých věkových

Obr. 22: Ověření specifity PCR produktů pomocí

kategorií prasat (plod, sele,

gelové elektroforézy.

74

dospělý), jelikož doposud publikované práce se zaměřují pouze na určitou věkovou kategorii. Obecný popis a funkce genů je popsán v kapitole 3.4.1. Efektivita amplifikace PCR reakcí analyzovaných genů, lineární korelační koeficient (R2), průměrné CT hodnoty a směrodatná odchylka jsou uvedeny v Tab. 9. Specifita PCR produktů byla potvrzena agarózovou elektroforézou (Obr. 22), sekvenováním PCR produktů a analýzou křivky tání (Příloha 1). Tab. 9: Detailní výsledky real-time PCR analýzy. Gen

R2

Průměrná

Směrodatná

Efektivita

Věková

CT hodnota

odchylka

reakce (%)

kategorie

HPRT1

0,999

23,023

0,777

99,515

RPS18

0,999

16,820

0,454

92,403

NACA

1,000

13,464

0,575

89,571

TBP

0,998

24,950

0,761

91,829

TAF4B

0,988

29,452

0,949

107,126

RPL32

0,999

19,040

0,728

91,585

OAZ1

0,998

23,738

0,842

87,093

HPRT1

0,995

23,537

1,347

99,140

RPS18

0,999

17,310

1,192

88,742

NACA

0,999

16,973

0,758

88,141

TBP

0,984

26,709

1,756

102,699

TAF4B

0,995

28,001

1,523

108,312

RPL32

0,998

21,717

2,421

89,039

OAZ1

0,996

23,852

1,516

90,758

HPRT1

0,997

25,545

0,770

98,646

RPS18

0,999

18,843

0,666

89,621

NACA

0,999

18,779

0,303

102,941

TBP

0,993

27,916

0,809

98,985

TAF4B

0,996

28,425

0,948

107,789

RPL32

0,997

22,256

0,768

91,100

OAZ1

0,994

24,270

0,795

94,859

75

plod

sele

dospělé prase

5.1.2 Výběr nejstabilnějších referenčních genů Získané CT hodnoty byly konvertovány do souborů pro geNorm aplikaci. Tento program vyhodnotil stabilitu zkoumaných genů (Příloha 2) – geny s nejnižší hodnotou M mají nejstabilnější genovou expresi. Stabilita analyzovaných genů (od nejméně k nejvíce stabilním genům) byla: 1. plod: TAF4B, HPRT1, TBP, NACA, OAZ1, RPS18/RPL32; 2. sele: NACA, RPL32, OAZ1, TBP, RPS18, HPRT1/TAF4B; 3. dospělý: TAF4B, NACA, TBP, OAZ1, RPL32, HPRT1/RPS18. Tab. 10: Stabilita exprese analyzovaných referenčních genů vyhodnocená pomocí programu geNorm. Hodnota stability genové exprese (M) nejméně stabilní geny Plod Sele Dospělí

nejstabilnější geny

TAF4B

HPRT1

TBP

NACA

OAZ1

RPS18/RPL32

0,826

0,625

0,574

0,457

0,391

0,377

NACA

RPL32

OAZ1

TBP

RPS18

HPRT1/TAF4B

0,879

0,782

0,699

0,560

0,443

0,356

TAF4B

NACA

TBP

OAZ1

RPL32

HPRT1/RPS18

0,596

0,489

0,380

0,344

0,335

0,281

Zjištěná M hodnota zkoumaných genů byla nižší než 1,5 (Tab. 10), což ukazuje relativně dobrou a porovnatelnou stabilitu analyzovaných referenčních genů (dle manuálu geNorm softwaru nejsou geny s M hodnotou vyšší než 1,5 vhodné referenční geny pro danou analýzu). Jako nejstabilnější geny v kosterní svalové tkáni prasat různého stáří byly identifikovány geny ribozomálního původu RPL32 a RPS18. Tyto geny nebyly jako referenční doposud analyzovány v tkáních prasat, nicméně jsou běžně užívány jako vhodné referenční geny normalizaci dat kvantitativní real-time PCR (Spinsanti et al., 2006; Ahn et al., 2008; Smits et al., 2009). Jelikož geny, které kódují ribozomální RNA jsou většinou exprimovány ve všech typech buněk a jsou nezbytné pro vznik ribozomů, které jsou hlavní komponentou základních fyziologických procesů v buňkách, lze u těchto genů předpokládat, že mohou být vhodné referenční geny pro analýzy genové exprese. Tento fakt potvrzují i některé publikovaných studie jako de Jonge et al.

76

(2007) a Popovici et al. (2009), ale byly ohlášeny i rozdíly stability v závislosti na typu analyzované tkáně nebo experimentálních podmínkách (Thorrez et al., 2008). Geny HPRT1 a TBP mají významné postavení a jsou často využívány jako referenční geny pro normalizaci real-time PCR dat (Filby et al., 2007; Valente et al., 2009). U prasat již byla také studována stabilita těchto genů jinými autory. Naše výsledky ukázaly, že gen HPRT1 dosáhl nejvyšší expresní stability, na rozdíl od svalové tkáně plodů, ve svalové tkáni selete a dospělého prasete. Tyto výsledky jsou ve shodě s výsledky Nygard et al. (2007) a Svobodová et al. (2008). Gen TBP nebyl sice vyhodnocen jako nejstabilnější v námi analyzovaných tkáních, ale lze jej také označit jako vhodný referenční gen pro expresní analýzu ve svalové tkáni prasete ve shodě s publikacemi Erkens et al. (2006) a Nygard et al. (2007).

Determination of the optimal number of control genes for normalization 0,200 0,180 0,160 0,140 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000

0,181 0,139 0,117

0,120

0,109

plod

Řada1

V2/3

V3/4

V4/5

V5/6

V6/7

Pairwise Variations

Determination of the optimal number of control genes for normalization 0,170 0,165 0,160

0,167 0,156

0,158

0,155 0,150 0,145 0,140

0,149

sele

Řada1

0,142

0,135 0,130 0,125 V2/3

V3/4

V4/5

V5/6

V6/7

Pairwise Variations

Determination of the optimal number of control genes for normalization 0,120

0,112

0,114

0,111

0,100 0,074

0,080

0,078

dospělé prase Řada1

0,060 0,040 0,020 0,000 V2/3

V3/4

V4/5

V5/6

V6/7

Pairwise Variations

Obr. 23: Stanovení optimálního počtu referenčních genů pro normalizaci real-time PCR dat.

77

Geny TAF4B a NACA nebyly doposud v jiných studiích zkoumány jako geny referenční. TAF4B byl nejstabilněji exprimován ve svalové tkáni selat, ale nejméně stabilní ve svalovině plodů a dospělých prasat. Nicméně M hodnota pro tkáně těchto věkových kategorií prasat byla 0,95 a 0,6, což ukazuje na obecně dobrou stabilitu genu. Gen NACA byl na základě microarray analýzy označen jako vhodný referenční gen pro analýzu genů a jejich transkriptů souvisejících s rakovinou prsu pomocí kvantitativní real-time PCR (Popovici et al., 2009). Na rozdíl od svalové tkáně selat a dospělých prasat byla nejlepší stabilita exprese genu NACA zjištěna ve svalové tkáni plodu. Z námi zjištěných výsledků je ale patrné, že gen NACA je ze všech vybraných genů nejméně vhodný referenční gen pro expresní studie analyzovaných svalových tkání prasat odlišného věku. Program geNorm stanoví také optimální počet referenčních genů pro expresní experiment stanovením hodnoty párové variace V. Normalizace dat s jediným referenčním genem není přijatelná, pokud není podán jasný důkaz, který potvrzuje neměnnou expresi v daných experimentálních podmínkách (Bustin et al., 2009). Program geNorm navrhuje jako mezní hodnotu párové variace 0,15. Jak lze vidět na Obr. 23, V hodnota dvou nejstabilnějších genů je menší nebo rovna 0,15. Tato hodnota neklesla pokud více než 4 referenční geny byly zahrnuty u plodů a selat a více než 5 pro dospělé prasata. Tato data ukazují, že počet referenčních genů pro optimální normalizaci je 2 – 3 pro svalovinu plodů a selat, případně 3 – 4 pro svalovou tkáň dospělých prasata.

78

5.2 Komparativní analýza genových transkriptů v kosterní svalové tkáni prasete domácího a divokého 5.2.1. Microarray analýza 5.2.2.1 Identifikace diferenciálně exprimovaných genů Chov a šlechtění prasat je zaměřen na neustálé zlepšování tempa růstu, stavby těla, kvality masa po porážce a reprodukční vlastnosti. Z důvodu dalšího poznání a lepšího pochopení biologických procesů růstu svalů byla provedena analýza transkriptomu ve svalu m. longissimus dorsi a m. biceps femoris, která je zaměřena na porovnání expresních profilů genů mezi dvěma velmi kontrastními typy prasat (české bílé ušlechtilé a divoké prase) v období jejich intenzivního růstu. Bílého ušlechtilé plemeno je naším nejrozšířenějším plemenem, které se vyznačuje dobrou masnou užitkovostí a kvalitou masa a je domestikovanou formou divokého prasete. Pro tento účel byly použity mikročipy GeneChip Porcine Genome Array (Affymetrix), které obsahují sondy pro 20 201 genů prasete. Data získaná při microarray analýze kosterní svalové tkáně českého bílého ušlechtilého plemene a divokého prasete je nutné statisticky zpracovat a výsledky validovat. Pro užší výběr, které transkripty a geny budou dále statisticky zhodnoceny a anotovány, byly nejprve p-hodnoty našeho získaného seznamu upraveny pomocí metody FDR (false discovery rate), která kontroluje poměrné množství falešně pozitivních výsledků (Benjamini & Hochberg, 1995). Transkripty mající po FDR korekci korigovanou p-hodnou menší než 0,05 se obecně považují za signifikantní. Data byla dále korigována tak, že byly vybrány transkripty, které jsou změněny dvakrát nebo více než dvakrát (fold-change <= 2 nebo <= -2). Ze soboru 23 937 transkriptů odpovídalo tomuto kritériu 1 537 transkriptů . Další přísnější korekcí byly filtrovány transkripty mající nejméně trojnásobně rozdílnou expresi a tomu odpovídalo celkem 537 transkriptů. Z tohoto počtu byla genová exprese 407 transkriptů trojnásobně nebo více „up“ regulována ve svalu longissimus dorsi u bílého ušlechtilého plemene a 130 transkriptů u divokého prasete. U svalu biceps femoris byly výsledky velmi podobné. Celkem bylo trojnásobně nebo více „up“ regulováno 406 transkriptů analyzovaných u bílého ušlechtilého plemene a 131 transkriptů u divokého prasete.

79

5.2.2.2 Genová ontologie a anotace diferenciálně exprimovaných genů Moderní vysoce výkonné technologie genomiky, proteomiky a bioinformatiky (např. microarray technologie) generují jako své finální výstupy obsáhlé seznamy genů. Pro správnou interpretací těchto výsledků je proto důležitá analýza anotace genů. Systematické rozčlenění získaného seznamu genů a určení jejich biologické anotace (např. GO termínů nebo signálních drah) umožňuje v současné době řada aplikací, které využívají poznatky a vědomosti z veřejně dostupných databází (Huang et al., 20091). Pro objasnění vztahu mezi geny, který jsou diferenciálně exprimovány v kosterní svalové tkáni svalu longissimus dorsi a biceps femoris českého bílého ušlechtilého plemene a divokého prasete, jsme analyzovali soubor 537 odlišně exprimovaných transkriptů pomocí on-line dostupných aplikací: 1. agriGo (bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/); 2. DAVID (david.abcc.ncifcrf.gov/); 3. Genecodis (genecodis.dacya.ucm.es/analysis/); 4. GOEAST (omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/); 5. CoreMine Medical (www.coremine.com/). V současnosti je pro koncového uživatele velmi obtížné rozhodnutí, která z dostupných aplikací je pro analýzu nejvhodnější. Programů určených pro analýzu anotace genů bylo v roce 2008 k dispozici přibližně 68. Ty se od sebe odlišují jak v použitých algoritmech, tak v různých jiných rysech a neexistuje tzv. „zlatý standard“. Proto není neobvyklé, že uživatel pro získání uspokojivých výsledků zhodnotí získaná data pomocí více dostupných nástrojů (Huang et al., 20091). Program agriGO je založen na statistické metodě SEA (singular enrichment analysis) a doplněn nástroji PAGE (Parametric Analysis of Gene set Enrichment), BLAST4ID (převod ID do BLAST) a SEACOMPARE (Cross comparison of SEA). Rozšířené možnosti umožňují vybrat další statistické metody – hypergeometrický, Fisherův exaktní a chí-kvadrát test. Předností této aplikace je především to, že na rozdíl od jiných nástrojů, umožňuje interpretaci dat z microarray analýz 38 druhů hospodářských zvířat a zemědělských plodin (Du et al., 2010). Aplikace DAVID využívá pro analýzu anotace genů metodu SEA a MEA (modular enrichment analysis). Identifikaci signifikantních GO termínů provádí pomocí Fisherova exaktního testu, který je modifikován jako tzv. EASE skóre (Huang et al., 2007; Huang et al., 20092). Aplikace Genecodis je založena na statistické metodě MEA a doplněna metodou GSEA (gene set enrichment ana80

lysis).Využívá dvě statistické metody, a to hypergeometrický a chí-kvadrát test (Carmona-Saez et al., 2007; Nogales-Cadenas et al., 2009). GOEAST využívá pro identifikaci signifikantních GO termínů standardní hypergeometrický test a podporuje také Fisherův exaktní a chí-kvadrát test. GO termíny zobrazuje mimo jiné v grafickém formátu dle jejich vzájemných vztahů v hierarchické struktuře stromového grafu, což umožňuje lépe porozumět jejich vzájemným korelacím (Zheng & Wang, 2008). Poslední z využitých aplikací, CoreMine Medical, není určena k vyhodnocení dat získaných pomocí microarray technologie. Je to nástroj umožňující uživateli zobrazit dostupné informace o určitém genu. CoreMine Medical byl proto použit jako pomocný nástroj pro analýzu genů, které nebyly „zachyceny“ pomocí výše uvedených aplikací a u nichž byl zjištěn výrazný rozdíl v expresi v kosterní svalové tkáni u studovaných prasat. Před zahájením samotného rozčlenění našeho seznamu genů a určení jejich biologické anotace bylo nezbytné vyřešit zásadní nedostatek Affymetrix GeneChip Porcine Genome Array. Ten spočívá v tom, že jsou nedostatečně anotované. Proto bylo nezbytné provést manuální anotaci 537 analyzovaných transkriptů dle seznamu, který vytvořil Tsai et al. (2006). K identifikačním číslům (ID) analyzovaných prób GeneChip Porcine Genome Array byly doplněny informace o názvu genu, jeho produktu, chromozomu, na kterém se daný gen nachází, EnsEMBL ID, TIGR ID, GeneBank ID a ID odpovídající Human Affymetrix próby. Jak již bylo řečeno, z vybraných webových aplikací, které umožňují interpretaci výsledků z microarray analýzy, je pouze aplikace agriGo určena pro hospodářská zvířata včetně prasete. Platforma DAVID a GOEAST umožňuje také použít jako výchozí data ID Porcine Affymetrix prób, mají však nedostatečné informace o genech prasete (např. z 537 analyzovaných transkriptů aplikace DAVID nedokáže analyzovat 339, tj. 63 %). Genecodis neumožňuje vůbec anotovat geny podle ID Porcine Affymetrix prób prasete domácího. Jako výchozí data analýzy pomocí aplikace DAVID, GOEAST a Genecodis byla proto použita ID Human Affymetrix prób. Vybrané diferenciálně exprimované transkripty ze svalu longissimus dorsi a biceps femoris českého bílého ušlechtilého plemene a divokého prasete byly analyzovány pomocí výše uvedených webových aplikací, které rozčlenily tento seznam ID Affymetrix prób do GO termínů. Anotace získaných dat je většinou závislá na dostupné databázi GO termínů, jelikož ji využívá k popisu genů a jejich produktů v kontextu biologických procesů, molekulárních funkcí a buněčných komponent, kterých je daný gen součástí (Teufel et al., 2006). Ontologie genu (GO) je standardní popis jeho funkce, který

81

je běžně užíván jako hlavní zdroj pro anotaci pomocí většiny dostupných aplikací určených k validaci výsledků microarray analýz (Du et al., 2010). Množství generovaných GO termínů je odlišné v závislosti na použité webové aplikaci (Obr. 24). Z aplikací, kde byla jako výchozí data použita ID Afffymetrix Porcine prób, bylo z výrazným rozdílem nejvíce GO termínů (celkem 336) generováno programem agriGo. Tento počet lze přirovnat také k počtu GO termínů získaných pomocí aplikace DAVID (celkem 317) a GOEAST (celkem 358), kde byla ale jako výchozí data použita ID Afffymetrix Human prób. Aplikace DAVID a GOEAST při použití vstupních dat ID Afffymetrix Porcine prób generovali pouze 17 a 18 GO termínů.

400 350 300 AgriGo DAVID (Human ID) DAVID (Porcine ID) Genecodis GOEAST (Human ID) GOEAST (Porcine ID)

250 200 150 100 50 0 Biologický proces

Molekulární funkce

Buněčná komponenta

Celkem

Obr. 24: Počet GO termínů generovaných vybranými webovými aplikacemi pro anotaci dat z microarray experimentu. Seznam prvních osmi skupin GO termínů popisující biologický proces, kterého se účastní nejvíce námi anotovaných genů a počet genů v každé skupině je zobrazen v Příloha 3. Nejčastěji jsou zastoupeny GO názvy zahrnující biologické procesy jako je vývoj, buněčný proces, metabolické procesy, buněčná proliferace, regulace apoptózy a buněčné smrti. Seznam prvních osmi skupin GO termínů určujících molekulární funkce analyzovaných genů ukazuje Příloha 4. Z této tabulky je na první pohled patrné, že nejvíce analyzovaných transkriptů je zapojeno z hlediska jejich molekulární funkce ve vazbě např. aktinu, růstových faktorů, ATP, iontů vápníku a kovů, polysacharidů, kationtů, kofaktorů, proteinů, nukleotidů nebo receptorů. Poslední GO termíny popisující buněčné komponenty, jejichž jsou analyzované transkripty součástí, popisuje

82

Příloha 5. Nejčastěji je zastoupen extracelulární region a cytoplazma. Některé z vybraných aplikací nabízejí zobrazení výsledků analýzy v obrázkových formátech, např. ve sloupcových grafech nebo dle jejich vzájemných vztahů v hierarchické struktuře stromového grafu (Příloha 6 – 13). To napomáhá k lepší představě o výsledcích dané analýzy a umožňuje lépe porozumět vzájemným korelacím mezi GO termíny.

5.2.2.3 Geny souvisejících s vývojem, růstem a regenerací kosterní svalové tkáně Ze získaných GO termínů byly dále vybrány termíny související s kosterní svalovou tkání a ID prób (resp. genů), které jsou v těchto biologických procesech zapojeny (Příloha 14 – 18). Ze seznamu 537 diferenciálně exprimovaných genů bylo prostřednictvím programu agriGo nalezeno 33, DAVID (ID Affymetrix Human) 53, DAVID (ID Affymetrix Porcine) 7, Genecodis 29, GOEAST (ID Affymetrix Human) 50 a GOEAST (ID Affymetrix Porcine) 7 genů, jejichž funkce je spojena s vývojem, růstem nebo regenerací kosterní svalové tkáně. Jak je z tabulek patrné, aplikace označily řadu totožných genů. Avšak některé geny byly nalezeny pouze jedinou z použitých aplikací, konkrétně aplikace agriGo nalezla 16, DAVID (ID Affymetrix Human) 13, Genecodis 3, GOEAST (ID Affymetrix Human) 12 a GOEAST (ID Affymetrix Porcine) 1 unikátní gen. Tímto způsobem tak bylo celkem nalezeno 86 konkrétních genů, které mohou být vybrány pro další analýzy.

5.2.2.4 Signální dráhy genů Aplikace David a Genecodis mimo jiné nabízí také zobrazení signálních drah, které popisují genetické regulační sítě pomocí databáze KEGG PATHWAY. Signální dráha je komplexní síť zahrnující signální molekulu (ligand) a receptor. Vazba ligandu na receptor vyvolává konformační změnu v tomto receptoru, a většinou tak dojde k aktivaci kinázy, která může fosforylovat další proteiny. Dochází tak ke vzniku kaskády vzájemných interakcí proteinů, která v konečném důsledku aktivuje transkripční faktor aktivující nebo inhibující genovou expresi (Sadler, 2010). Prostřednictvím aplikace DAVID bylo identifikováno 144 drah a 52 drah pomocí aplikace Genecodis. Námi analyzované geny náleží do různých kategorií drah, které hrají klíčovou roli v růstu a vývoji kosterní svalové tkáně, jako jsou např. signální dráhy transdukce: TGF-ß signální dráha (TGF-ß signaling pathway), MAPK signální dráha 83

(MAPK signaling pathway), Wnt signální dráha (Wnt signaling pathway), kalciová signální dráha (Calcium signaling pathway) a mTOR signální dráha (mTOR signaling pathway); signální molekuly a jejich interakce: interakce ECM a receptoru (ECM-receptor interaction) nebo buněčná komunikace: fokální adheze (Focal adhesion).

TGF-ß signální dráha Aplikace KEGG Pathway (Příloha 19) detekovala, že z námi analyzovaných diferenciálně exprimovaných genů jsou v TGF-ß signální dráze zapojeny geny SMAD1 (SMAD family member 1), MYC (v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)), LTBP1 (latent transforming growth factor beta binding protein 1), THBS1 (thrombospondin 1), THBS2 (thrombospondin 2), TGFB2 (transforming growth factor, beta 2) a TGFB3 (transforming growth factor, beta 3). Jak je patrné z Tab. 11, tyto geny byly „up“ regulovány ve svalové tkáni longissimus dorsi i biceps femoris českého bílého ušlechtilého plemene prasat. Tab. 11: Rozdíl mezi expresí genů zapojených v TGF-ß signální dráze. ID próby

Gen

Rozdíl 1

Rozdíl 2

Ssc.10287.1.A1_at

TGFB2

3,71943

5,37884

Ssc.8072.1.A1_at

LTBP1

4,63052

3,93709

Ssc.11757.1.S1_at

SMAD1

3,84368

3,13815

Ssc.27593.1.S1_at

TGFB3

4,11743

3,68802

SscAffx.8.1.S1_s_at

MYC

6,07911

8,31647

Ssc.992.1.S1_at

THBS2

13,7441

14,0259

Ssc.924.2.A1_at

THBS1

4,38949

4,47778

Rozdíl 1: Rozdíl ve stehenní svalovině mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mbf vs. WB * mbf). Rozdíl 2: Rozdíl ve svalovině hřbetu mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mld vs. WB * mld).

Signální molekuly rodiny transformačního růstového faktoru beta (TGF-ß) řídí v mnoha organizmech řadu vývojových procesů jako je proliferace, diferenciace a růst. Tato rodina je složena z více než 50 strukturálně souvisejících ligandů, které lze rozdělit do tří hlavních skupin: transformační růstové faktory beta (TGF-ß), kostní morfogenetické proteiny (BMP) a activin (Kollias & McDermott, 2008). Účinek TGF-ß je zpro-

84

středkován pomocí vazby na transmembránový serin/threonin kinázový receptor (TßRI nebo TßRII). Receptor TßRII fosforyluje receptor TßRI a tím aktivuje jeho kinázovou doménu, která rozpozná a aktivuje vnitrobuněčné mediátory – proteiny rodiny SMAD, které mohou být rozděleny do 3 odlišných skupin. První skupina zahrnuje tzv. R-SMAD (SMAD 1, 2, 3, 5 a 8), které jsou přímo fosforylovány receptorem typu I. R-SMAD se hromadí v jádrech jako heterodimerické komplexy společně s druhou skupinou SMAD, tzv. co-SMAD (SMAD4). SMAD v asociaci s jedním z mnoha DNA vazebných partnerů a různých transkripčních koaktivátorů nebo korepresorů pozitivně nebo negativně regulují genovou expresi. Na rozdíl od toho, členové třetí skupiny SMAD proteinů (SMAD 6 a 7) inhibují efekty R-SMAD proteinů a fungují jako antagonisté TGF-ß signální stezky (viz review Attisano & Wrana, 2002). TGF-ß signalizace není omezená pouze na dráhy zprostředkované proteiny rodiny SMAD, ale může být aktivována např. prostřednictvím dráhy mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK). TGF-ß, MAPK a myostatin jsou signální molekuly, které hrají klíčovou roli v homeostazi kosterní svalové tkáně a v různých dědičných i získaných neuromuskulárních poruchách. V kosterní svalové tkáni mají členové TGF-ß rodiny významný vliv na vývoj svalů a postnatální růst svalové hmoty. Exprese těchto molekul je především spojena s procesy jako je růst, diferenciace, regenerace i odpověď na stres (viz review Burks & Cohn, 2011). MAPK signální dráha Z analyzovaných diferenciálně exprimovaných genů je, podle aplikace KEGG Pathway (Příloha 20), v MAPK signální dráze zapojeno celkem 14 genů: RAP1A (RAP1A, member of RAS oncogene family), CDC25B (cell division cycle 25 homolog B (S. pombe)), DUSP10 (dual specificity phosphatase 10), DUSP16 (dual specificity phosphatase 16), FGFR1 (fibroblast growth factor receptor 1), HSPA6 (heat shock 70kDa protein 7 (HSP70B)), MAP3K5 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5), MAP4K4 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4), NTRK2 (neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2), STMN1 ( stathmin 1), TGFB2 (transforming growth factor, beta 2), TGFB3 (transforming growth factor, beta 3), TNFRSF1A (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1A) a MYC (v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)). Všechny tyto geny byly „up“ regulovány jak ve sva-

85

lové tkáni longissimus dorsi, tak v biceps femoris českého bílého ušlechtilého plemene prasat (Tab. 12). Tab. 12: Rozdíl mezi expresí genů zapojených v MAPK signální dráze. ID próby

Gen

Rozdíl 1

Rozdíl 2

Ssc.18223.1.A1_at

RAP1A

6,14735

7,38633

Ssc.20406.1.S1_at

CDC25B

5,64875

9,30756

Ssc.28517.1.S1_at

DUSP10

8,21831

11,7702

Ssc.25400.1.S1_at

DUSP16

3,13623

3,62307

Ssc.24095.2.A1_at

FGFR1

3,79034

3,40376

Ssc.114.1.S1_at

HSPA6

51,4928

27,2865

Ssc.30506.1.A1_at

MAP3K5

4,74885

5,60317

Ssc.3574.1.A1_at

Q9NX89

3,2637

3,98269

Ssc.21223.2.A1_at

NTRK2

8,18955

4,54943

Ssc.7701.1.A1_at

STMN1

3,97588

3,26491

Ssc.92.1.S1_at

TGFB2

5,97735

6,27016

Ssc.27593.1.S1_at

TGFB3

4,11743

3,68802

Ssc.4674.1.S1_at

TNFRSF1A 3,37122

3,27107

SscAffx.8.1.S1_s_at

MYC

6,07911

8,31647

1

Rozdíl : Rozdíl ve stehenní svalovině mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mbf vs. WB * mbf). Rozdíl 2: Rozdíl ve svalovině hřbetu mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mld vs. WB * mld).

MAPK (mitogen-activated protein kinase) je signální dráha aktivující několik molekul, následkem čehož dochází k zesílení a přenosu signálu, který v konečném důsledku aktivuje několik regulačních molekul v cytoplazmě a jádře a iniciuje tak buněčné procesy jako je proliferace, diferenciace, migrace a vývoj (Seger & Krebs, 1995). Doposud bylo identifikováno několik systému MAPK signální dráhy: ERK1/2, JNK, p38 a ERK5 (viz review Nishimoto & Nishida, 2006). V průběhu diferenciace myogenních buněk je aktivována dráha p38 MAPK kinázy, která je nepostradatelná pro expresi svalově specifických genů. Tato dráha ovlivňuje činnost transkripčních faktorů náležících k rodinám MyoD a MEF2, podílí se na remodelaci chromatinu ve specifických regulačních oblastech a společně s MRF ovlivňuje expresi genů v průběhu procesu diferenciace (Keren et al., 2006). Nejlépe prostudovanou dráhou MAPK je ERK (extracellular signal-regulated kinase), která má významnou úlohu v signalizaci buněčné proliferace růs-

86

tovými faktory. Mimo to, MAPK společně s NF-κB jsou nejvýznamnější regulátory genové transkripce a metabolismu, které reagují na oxidační, energetický a mechanický stres v kosterní svalové tkáni. Tyto dvě dráhy udržují inzulínovou rezistenci a katabolismus bílkovin a jejich chronická aktivace je zapojena v různých patologických stavech jako je např. diabetes a kachexie (Kramer & Goodyear, 2007). Wnt signální dráha Wnt proteiny se účastní základních vývojových procesů, jako je specifikace osudu buňky, proliferace progenitorových buněk a kontrola asymetrického buněčného dělení (Staal et al., 2008). Existují minimálně 3 různé Wnt dráhy: kanonická dráha, dráha planárně buněčné polarity (PCP) a Wnt/Ca2+ dráha (viz review Komiya & Habas, 2008). Wnt signalizace hraje důležitou roli i v myogenezi. Kanonická signální dráha Wnt aktivuje transkripci MYF5 v somitech a v nekanonické Wnt dráze, signální dráze proteinkinázy C (PKC) a podporuje transkripční aktivitu PAX3, která umožňuje expresi genu MyoD a myogenezi. V postnatální fázi myogeneze je přesné načasování regulace Wnt a Notch signalizace potřebné pro účinnou regeneraci svalové tkáně. Tato stezka je pravděpodobně také zapojena v homeostazi svalové tkáně v průběhu stárnutí (viz review Buckingham & Montarras, 2008). Tab. 13: Rozdíl mezi expresí genů zapojených ve Wnt signální dráze. ID próby

Gen

Rozdíl 1

Rozdíl 2

Ssc.15749.1.S1_at

CCND2

5,14393

9,27549

Ssc.3232.1.S1_at

SFRP2

22,4855

72,5468

SscAffx.8.1.S1_s_at

MYC

6,07911

8,31647

Rozdíl 1: Rozdíl ve stehenní svalovině mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mbf vs. WB * mbf). Rozdíl 2: Rozdíl ve svalovině hřbetu mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mld vs. WB * mld).

Aplikace KEGG Pathway (Příloha 21) detekovala, že z námi analyzovaných diferenciálně exprimovaných genů jsou ve Wnt signální dráze zapojeny geny CCND2 (cyclin D2), SFRP2 secreted frizzled-related protein 2 a MYC (v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)). Tyto geny byly „up“ regulovány ve svalové tkáni longissimus dorsi i biceps femoris českého bílého ušlechtilého plemene prasat (Tab. 13).

87

Kalciová signální dráha Ca2+ ionty jsou velmi důležití vnitrobuněční poslové řídící různorodé buněčné procesy jako je genová transkripce, svalová kontrakce a buněčná proliferace. Jejich hlavní signální funkce je v buňce soustředěna v cytosolu, odkud se mohou rozptýlit do buněčných organel jako jsou mitochondrie a jádro (viz review Bootman & Lipp, 2001). Ionty Ca2+ zprostředkovávají buněčnou odpověď v různých typech buněk včetně osteoblastů, krevních destiček, buněk kosterní svalové tkáně, myocytů a neuronů (viz review Vicencio et al., 2011). Svalová vlákna savců využívají Ca2+ jako hlavní regulační a signální molekulu. Kontrakce a relaxace svalů je závislá na variabilní expresi proteinů, které jsou zapojeny v Ca2+ signalizaci a transportu. Ca2+ signální dráha zahrnuje: 1) ryanodinový receptor – vápníkový kanál v sarkoplazmatickém retikulu, 2) troponinový proteinový komplex zprostředkující vliv Ca2+ na myofibrily a umožňující kontrakci svalových vláken, 3) Ca2+ pumpu zodpovědnou za „vypumpování“ Ca2+ do sarkoplazmatického retikula a 4) calsequestrin – Ca2+ vážící a hromadící protein v sarkoplazmatickém retikulu. Ve svalové tkáni jsou však dále přítomny i další Ca2+ vážící se proteiny např. parvalbumin, calmodulin, S100 proteiny, annexiny, sorcin, lehké řetězce myozinu, beta-actinin, calcineurin a calpain, které hrají důležitou roli v kontrakci svalového vlákna nebo v jiných činnostech svalů jako je metabolismus proteinů, diferenciace a růst (Berchtold et al., 2000). Tab. 14: Rozdíl mezi expresí genů zapojených v kalciové signální dráze. ID próby

Gen

Rozdíl 1

Rozdíl 2

Ssc.27693.1.A1_a_at

ADCY3

7,31816

5,40349

Ssc.3295.1.S1_at

EDNRB

4,40686

4,81079

Ssc.1290.1.S1_at

MLCK

-5,13201

-9,46177

1

Rozdíl : Rozdíl ve stehenní svalovině mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mbf vs. WB * mbf). Rozdíl 2: Rozdíl ve svalovině hřbetu mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mld vs. WB * mld).

Dle aplikace KEGG Pathway (Příloha 22) jsou, z námi analyzovaných diferenciálně exprimovaných genů, v kalciové signální cestě zapojeny 3 geny – ADCY3 (adenylate cyclase 3), EDNRB (endothelin receptor type B) a MLCK (myosin light chain kinase). Geny ADCY3 a EDNRB byly „up“ regulovány ve svalové tkáni českého bílého ušlechtilého plemene, gen MLCK divokého prasete (Tab. 14).

88

Signální dráha interakcí ECM a receptoru Extracelulární matrix (ECM) je mezibuněčná hmota vytvářející prostředí, v němž buňky sídlí a poskytuje buňkám substrát, v němž mohou zakotvit, anebo migrovat. Toto prostředí se skládá z molekul, které buňky vylučují, jako je kolagen, proteoglykany (chondroitinsulfáty, kyselina hyaluronová aj.) a glykoproteinů (fibronektin a lamin) (Sadler, 2010). ECM významně ovlivňuje hlavní buněčné programy růstu, diferenciace, migrace, genové transkripce a apoptózy. O tom, jaký program buňka zvolí, je determinováno prostředím, které EMC obklopuje (viz review Boudreau & Jones, 1999). Tab. 15: Rozdíl mezi expresí genů zapojených signální dráze interakcí ECM a receptoru. ID próby

Gen

Rozdíl 1

Rozdíl 2

Ssc.16743.1.S1_at

FN1

4,0144

3,18633

Ssc.3467.1.S1_at

COL4A2

5,0937

3,71186

Ssc.4993.1.A1_at

COL5A1

6,52686

6,38817

Ssc.9778.1.S1_at

COL1A1

3,86425

4,60609

Ssc.21011.1.S1_at

COL1A2

8,93718

5,54445

Ssc.4345.1.S1_at

COL4A1

4,9451

3,71132

Ssc.5299.1.S1_at

LAMB1

3,4387

3,62842

Ssc.992.1.S1_at

THBS2

13,7441

14,0259

Ssc.4345.1.S1_at

COL5A3

4,9451

3,71132

Ssc.15556.1.S1_at

CD44

6,13167

5,4284

Ssc.23368.1.A1_at

COL4A5

7,73757

4,31709

Ssc.11302.1.S1_at

COL3A1

5,11245

3,57451

Ssc.16589.1.S1_at

COL6A3

4,29488

3,94551

Ssc.924.2.A1_at

THBS1

4,38949

4,47778

1

Rozdíl : Rozdíl ve stehenní svalovině mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mbf vs. WB * mbf) Rozdíl2: Rozdíl ve svalovině hřbetu mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mld vs. WB * mld)

Růst a vývoj kosterní svalové tkáně je proces, který je regulován vzájemnými interakcemi mezi svalovými buňkami a jejich extracelulárním prostředí. Komunikace mezi ECM a buňkami hraje rozhodující roli v regulaci proliferace a diferenciace svalů. V kosterní svalové tkáni je ECM hlavní složkou intramuskulární pojivové tkáně

89

a je nezbytnou součástí komunikační sítě buněk, která reguluje tvar buňky a její genovou expresi (viz review Velleman, 2012). Výzkumy také ukazují, že ECM hraje klíčovou roli v diferenciaci kosterní svalové tkáně prostřednictvím jeho interakce s receptory myoblastů (Menko & Boettiger, 1987; Osses & Brandan, 2002). Aplikace KEGG Pathway (Příloha 23) ukázala, že z námi analyzovaných diferenciálně exprimovaných genů jsou v signální dráze interakcí ECM a receptoru zapojeny geny FN1 (fibronectin 1), COL4A2 (collagen, type IV, alpha 2), COL5A1 (collagen, type V, alpha 1), COL1A1 (collagen, type I, alpha 1), COL1A2 (collagen, type I, alpha 2), COL4A1 (collagen, type IV, alpha 1), LAMB1 (laminin, beta 1), THBS2 (thrombospondin 2), COL5A3 (collagen, type V, alpha 3), CD44 (CD44 antigen), COL4A5 (collagen, type IV, alpha 5), COL3A1 (collagen, type III, alpha 1), COL6A3 (collagen, type VI, alpha 3) a THBS1 (thrombospondin 1). Jak je patrné z Tab. 15, tyto geny byly „up“ regulovány ve svalové tkáni longissimus dorsi i biceps femoris českého bílého ušlechtilého plemene prasat. Signální dráha mTOR Signální dráha mTOR (mTOR – mammalian target of rapamycin) je klíčový regulátor buněčného růstu a proliferace. Tato dráha může být aktivována pomocí různých živin, energetickým stavem organismu a nebo růstovými faktory. Reguluje mnoho procesů včetně mRNA translace, autofagie, biogeneze ribozomů a metabolismu živin (for a review, see Sarbassov et al., 2005). Tato signální dráha má rozhodující vliv na regulaci syntézy proteinů, růst a diferenciaci buněk kosterní svalové tkáně, osteoblastů a chondrocytů (Esser, 2008). Tab. 16: Rozdíl mezi expresí genů zapojených v mTOR signální dráze. ID próby

Gen

Rozdíl 1

Rozdíl 2

Ssc.12578.1.A1_at

IGF1

4,82111

6,97938

Ssc.9365.2.S1_a_at

IGF2

38,8951

55,1916

Rozdíl 1: Rozdíl ve stehenní svalovině mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mbf vs. WB * mbf) Rozdíl 2: Rozdíl ve svalovině hřbetu mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mld vs. WB * mld)

Dle aplikace KEGG Pathway (Příloha 24) bylo zjištěno, že z námi analyzovaných diferenciálně exprimovaných genů, jsou v signální dráze mTOR zapojeny 2 geny – 90

IGF1 (insulin-like growth factor 1) a IGF2 (insulin-like growth factor 2), které byly výrazně „up“ regulovány ve svalové tkáni českého bílého ušlechtilého plemene prasat (Tab.16). Signální dráha fokálních adhezí Z námi analyzovaných diferenciálně exprimovaných genů jsou v dráze fokálních adhezí zapojeny, dle aplikace KEGG Pathway (Příloha 25), geny PDGFD (platelet derived growth factor D), FN1 (fibronectin 1), COL4A2 (collagen, type IV, alpha 2), IGF1 (insulin-like growth factor 1 (somatomedin C)), COL5A1 (collagen, type V, alpha 1), COL1A1 (collagen, type I, alpha 1), COL1A2 (collagen, type I, alpha 2), COL4A1 (collagen, type IV, alpha 1), LAMB1 (laminin, beta 1), MLCK (myosin light chain kinase), THBS2 (thrombospondin 2), COL5A3 (collagen, type V, alpha 3), CCND2 (cyclin D2), COL4A5 (collagen, type IV, alpha 5), RAP1A (RAP1A, member of RAS oncogene family), COL3A1 (collagen, type III, alpha 1), COL6A3 (collagen, type VI, alpha 3) a THBS1 (thrombospondin 1). Jak je patrné z Tab. 17, všechny geny, mimo genu MLCK, který byl „up“ regulován ve svalovině divokého prasete, byly „up“ regulovány ve svalové tkáni longissimus dorsi i biceps femoris českého bílého ušlechtilého plemene prasat. Fokální adheze jsou oblasti plazmatické membrány sloužící jako místa kontaktu mezi buňkou a jejich extracelulární matrix a kontaktní body přenášející signály z prostředí (viz review Parsons et al., 2008). Vzájemné interakce buněk a extracelulární matrix ovlivňují a kontrolují důležité biologické procesy včetně buněčné mobility, proliferace, regulace genové exprese a přežití buněk. Některé složky fokálních adhezí poskytují strukturální spojení mezi membránovými receptory a aktinovým cytoskeletem, zatímco jiné jsou signální molekuly včetně různých kináz a fosfatáz, jejich substrátů a různých adaptérových proteinů. Základní receptory pro vazbu k extracelulární matrix jsou integriny, které fungují jako přenašeče signálů a prostřednictvím dějů signální transdukce jako je fosforylace tyrozinu, zvýšení pH buňky, syntéza PIP2 (phosphatidylinositol-4,5biphosphate) a aktivace MAPK signální dráhy dochází k aktivaci systému (viz review Petit & Thiery, 2000) a reorganizaci aktinového cytoskeletu, což je nezbytná podmínka pro změny tvaru buňky, její mobility a genové exprese. Podobné morfologické změny

91

a modifikace genové exprese jsou iniciovány vazbou růstových faktorů k jejich receptorům, což ukazuje významné překrývání signalizace zprostředkované adhezí a růstovými faktory (viz review Turner et al., 2000). Tab. 17.: Rozdíl mezi expresí genů zapojených signální dráze fokální adheze. ID próby

Gen

Rozdíl 1

Rozdíl 2

Ssc.10303.1.A1_at

PDGFD

7,63735

6,74334

Ssc.16743.1.S1_at

FN1

4,0144

3,18633

Ssc.3467.1.S1_at

COL4A2

5,0937

3,71186

Ssc.12578.1.A1_at

IGF1

4,82111

6,97938

Ssc.4993.1.A1_at

COL5A1

6,52686

6,38817

Ssc.9778.1.S1_at

COL1A1

3,86425

4,60609

Ssc.21011.1.S1_at

COL1A2

8,93718

5,54445

Ssc.5299.1.S1_at

LAMB1

3,4387

3,62842

Ssc.1290.1.S1_at

MLCK

-5,13201

-9,46177

Ssc.992.1.S1_at

THBS2

13,7441

14,0259

Ssc.12617.1.S1_at

COL5A3

5,5113

4,64678

Ssc.15749.1.S1_at

CCND2

5,14393

9,27549

Ssc.23368.1.A1_at

COL4A5

7,73757

4,31709

Ssc.18223.1.A1_at

RAP1A

6,1473

7,38633

Ssc.11302.1.S1_at

COL3A1

5,11245

3,57451

Ssc.16589.1.S1_at

COL6A3

4,29488

3,94551

Ssc.924.2.A1_at

THBS1

4,38949

4,47778

Ssc.4345.1.S1_at

COL4A1

4,9451

3,71132

1

Rozdíl : Rozdíl ve stehenní svalovině mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mbf vs. WB * mbf) Rozdíl 2: Rozdíl ve svalovině hřbetu mezi ČBU a divokým prasetem (LW * mld vs. WB * mld)

Mezi jednotlivými, námi detekovanými, signálními drahami byly zjištěny často přesahy, tzn. určitý gen je součástí několika různých drah. Nejvíce diferenciálně exprimovaných genů je zapojeno v signální dráze interakcí ECM a receptoru a dráze fokální adheze. Přestože analýza pomocí microarray technologie byla provedena na souboru tří jedinců českého bílého ušlechtilého plemene prasat a tří jedinců divokého prasete, poskytla nám důležité informace umožňující lépe porozumět řízení a regulaci genové ex-

92

prese genů, které jsou exprimovány ve svalu longissimus dorsi a biceps femoris. Systematické rozčlenění získaného seznamu genů a určení jejich biologické anotace nám umožnilo identifikovat konkrétní geny a signální dráhy, které mohou ovlivňovat vznik, vývoj a růst kosterní svalové tkáně prasat. Závěrem lze konstatovat, že mnohé z těchto genů si zaslouží podrobnější studium jejich funkce a úlohy v kosterní svalové tkáni a masné užitkovosti prasat.

5.2.2. Validace výsledků microarray analýzy pomocí metody real-time PCR Identifikace diferenciálně exprimovaných genů, které jsou asociovány s vznikem a růstem svalové tkáně, je velmi důležité z pohledu genetických a fyziologických studií zabývajícími se kvalitativními a kvantitativními vlastnostmi vepřového masa (Davoli & Braglia 2007). Microarray analýza umožnila identifikovat 537 transkriptů, které mají v kosterní svalové tkáni českého bílého ušlechtilého a divokého prasete nejméně trojnásobně rozdílnou expresi a 86 konkrétních genů, které mohou být vybrány pro další studium jejich vlivu na masnou užitkovostí prasat. Pro validaci těchto výsledků a další studium exprese genů, které je možné označit za významné z hlediska produkce masa, bylo vybráno 13 genů, které byly podrobněji studovány pomocí metody kvantitativní real-time PCR. Konkrétně se jedná o geny: ANKRD1 (ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle)), C1QTNF3 (C1q and tumor necrosis factor related protein 3), C5orf13 (chromosome 5 open reading frame 13), CNN3 (calponin 3, acidic), ENHO (energy homeostasis associated), GDF8 (myostatin), POSTN (periostin, osteoblast specific factor), TNNT2 (cardiac troponin T), YWHAQ (tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, theta polypeptide), IGF2 (insulin-like growth factor 2 (somatomedin A)), MYH8 (myosin, heavy chain 8, skeletal muscle), MLC1SA (myosin, light chain 6B, alkali, smooth muscle and non-muscle) a HLA-DRB4 (major histocompatibility complex, class II, DR beta 4). Obecný popis a funkce genů je popsán v kapitole 3.4.2. Na základě předchozí analýzy, byly jako referenční geny pro real-time PCR analýzu použity HPRT1, OAZ1 a RPS18. Podrobné výsledky real-time PCR analýzy (efektivita amplifikace PCR reakce, lineární korelační koeficient (R2) a průměrné CT hodnoty) studovaných genů jsou uvedeny v Příloha 26. Pro ověření specifity PCR produktů byla provedena agarózová elektroforéza, sekvenování PCR produktů a analýza křivky tání (Příloha 27). Data získaná

93

při kvantitativní real-time PCR byla nejprve vyhodnocena pomocí 7500 Software v2.0.3 (Applied Biosystems) a získaná CT hodnoty byly následně zhodnoceny pomocí programu pro analýzu genové exprese REST 2009 Software (Qiagen). Tento software využívá pro stanovení genové exprese matematický model, který bere v úvahu odlišné PCR efektivity studovaných i referenčních genů (Qiagen, 2009). Detailní výsledky této analýzy jsou zobrazeny v Tab. 18, na Obr. 25 a Obr. 26. Jak je z těchto grafických výsledků patrné, největší rozdíly mezi geny, které jsou exprimovány v kosterní svalové tkáni českého bílého ušlechtilého plemene a divokého prasete byly detekovány u genů GDF8, POSTN, TNNT2, IGF2 a MYH8 ve svalové tkáni longissimus dorsi a u genů POSTN, IGF2, HLA-DRB4 a MYH8 ve svalové tkáni biceps femoris. Analýza genové exprese studovaných genů pomocí real-time PCR ukázala, že všechny tyto geny mají průkazně (P(H1) < 0,05 nebo 0,01) odlišnou expresi v kosterní svalové tkáni m. longissimus dorsi a m. biceps femoris českého bílého ušlechtilého plemene prasat a divokého prasete a jsou „up“regulovány ve studované svalové tkáni českého bílého ušlechtilého plemene prasat. Tento výsledek je shodný s výsledkem microarray analýzy. U většiny studovaných genů výsledky kvantitativní real-time PCR analýzy korelují s microarray analýzou (Tab. 19) a mají podobnou úroveň genové exprese (Obr. 27), což ukazuje na dobrou spolehlivost microarray analýzy. Rozdíly mezi genovou expresí (fold-change) kvantifikovanou pomocí microarray a real-time PCR byly u genů: GDF8 (tkáň m. longissimus dorsi), POSTN (tkáň m. longissimus dorsi i m. biceps femoris), TNNT2 (tkáň m. longissimus dorsi), MYH8 (tkáň m. longissimus dorsi i m. biceps femoris) a HLA-DRB4 (tkáň m. biceps femoris). Tato rozdílná hladina genové exprese u některých genů může být pravděpodobně způsobena větší přesností kvantifikace pomocí real-time PCR metody ve srovnání s microarray analýzou, rozdíly mezi dynamickou řadou těchto technik a nedostatky ve specifitě primerů, které jsou navrženy tak, aby rozlišovali členy genových rodin na úrovni primárního skríningu čipu (Chen et al., 2009).

94

Tab. 18: Výsledky analýzy genové exprese studovaných genů pomocí programu REST 2009 Software. Gen

Exprese

St. chyba

95% C.I.1

P(H1)2

Výsledek

ANKRD1

10,627

6,308 – 16,805

5,023 – 21,970

0,049

UP

C1QTNF3

9,336

6,939 – 12,793

5,804 – 15,065

0,024

UP

C5orf13

14,501

11,716 – 17,208

10,628 – 17,385

0,036

UP

CNN3

3,106

2,213 – 4,291

1,758 – 4,501

0,000

UP

ENHO

13,554

9,067 – 17,045

8,837 – 17,378

0,000

UP

MLC1SA

6,143

4,791 – 9,021

3,267 – 9,499

0,000

UP

GDF8

23,43

15,453 – 35,579

11,617 – 36,575

0,000

UP

POSTN

22,53

17,699 – 31,236

14,880 – 34,733

0,000

UP

TNNT2

85,624

57,224 – 126,246

49,857 – 135,641

0,039

UP

YWHAQ

2,771

2,256 – 3,249

2,089 – 3,349

0,000

UP

HLA-DRB4

7,085

2,502 – 26,269

1,303 – 42,815

0,019

UP

IGF2

56,561

14,188 – 151,991

13,854 – 160,801

0,000

UP

MYH8

184,796

85,278 – 452,484

75,776 – 725,403

0,000

UP

HPRT1

0,994

RPS18

0,834

OAZ1

1,206

ANKRD1

12,166

3,631 – 26,057

3,084 – 103,956

0,028

UP

C1QTNF3

4,771

3,492 – 6,198

3,226 – 8,003

0,000

UP

C5orf13

11,641

8,428 – 20,472

7,075 – 21,972

0,011

UP

CNN3

4,354

2,729 – 6,387

2,623 – 9,943

0,049

UP

ENHO

17,032

12,753 – 20,362

12,254 – 21,967

0,030

UP

MLC1SA

11,949

6,072 – 21,910

4,446 – 37,796

0,000

UP

GDF8

12,993

8,423 – 21,277

6,019 – 27,727

0,033

UP

POSTN

57,608

39,071 – 93,441

34,237 – 99,309

0,000

UP

m. biceps

TNNT2

24,733

12,085 – 50,961

9,427 – 91,367

0,030

UP

femoris

YWHAQ

3,012

2,339 – 4,405

2,028 – 4,869

0,000

UP

HLA-DRB4

53,888

27,056 – 97,120

21,399 – 128,701

0,000

UP

IGF2

38,63

16,502 – 66,872

15,362 – 71,095

0,044

UP

MYH8

65,489

44,756 – 92,982

34,973 – 125,141

0,000

UP

HPRT1

1,219

RPS18

0,636

OAZ1

1,29

1

Vzorek

m. longissimus dorsi

95% C.I – 95% interval spolehlivosti (informuje o tom, v jakém rozmezí kolem zjištěného aritmetického

průměru se s 95% pravděpodobností nachází skutečná střední hodnota a v jakém rozsahu jsou zjištěné hodnoty považovány za signifikantní); 2

P(H1) – test hypotézy (informuje nás o statistické významnosti výsledku).

95

Obr. 25: Krabicový graf (tzv. graf vousatých krabiček) výsledků stanovení exprese studovaných genů pomocí programu REST 2009 ve svalu m. longissimus dorsi. Barevný box představuje 50 % všech pozorování, přerušovaná čára uprostřed boxu představuje střední hodnotu (medián) a „vousy“ představují 50% vnějších pozorování (ukazují hranice pro velmi nízké resp. velmi vysoké hodnoty) (Qiagen, 2009).

96

Obr. 26: Krabicový graf (tzv. graf vousatých krabiček) výsledků stanovení exprese studovaných genů pomocí programu REST 2009 ve svalu m. biceps femoris. Barevný box představuje 50 % všech pozorování, přerušovaná čára uprostřed boxu představuje střední hodnotu (medián) a „vousy“ představují 50% vnějších pozorování (ukazují hranice pro velmi nízké resp. velmi vysoké hodnoty) (Qiagen, 2009).

97

Tab. 19: Výsledky microarray analýzy genů, které byly validovány pomocí real-time PCR metody. Gen

Próba

Exprese

Exprese

(m. long. dorsi)

(m. bic. femoris)

Ssc.10429.1.S1_at

6,62336

10,0711

1,03E–05

Ssc.7678.1.A1_at

10,3989

18,7534

6,60E–07

C1QTNF3

Ssc.4231.1.A1_at

8,63345

5,35974

1,21E–07

C5orf13

Ssc.17287.1.A1_at

12,778

12,0268

1,58E–11

CNN3

Ssc.4848.1.S1_at

3,07632

3,01339

5,72E–07

ENHO

Ssc.5591.1.S1_at

14,2483

14,7966

3,49E–06

GDF8

Ssc.335.1.S2_at

11,4467

11,3115

1,33E–06

POSTN

Ssc.7266.1.A1_at

32,2009

70,9996

9,77E–07

TNNT2

Ssc.19141.1.S1_at

146,068

27,4275

5,14E–06

YWHAQ

Ssc.2456.1.S1_at

3,2062

3,15805

1,49E–05

MYH8

Ssc.27020.1.S1_at

300,906

32,7818

1,32E–06

Ssc.9365.2.S1_a_at

55,1916

38,8951

1,35E–08

Ssc.9365.3.S1_a_at

13,366

7,12482

0,00026

Ssc.9365.5.S1_a_at

21,1179

13,8256

5,57E–06

Ssc.26508.1.S1_at

6,68598

17,2556

2,29E–07

Ssc.16169.1.S1_x_at

9,4319

21,2099

4,54E–06

Ssc.210.7.S1_x_at

3,33479

4,26677

1,93E–05

ANKRD1

IGF2

MLC1SA HLA-DRB4

ANKRD1

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Q

M

C1QTNF3

Q

m. biceps femoris

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

M

m. longissimus dorsi

Q

M

4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

14 12 10 8 6 4 2 M

m. biceps femoris

M

m. longissimus dorsi

CNN3

16

Q

Q

m. biceps femoris

C5orf13

0

p-hodnota

Q

M

m. longissimus dorsi

Q

M

m. biceps femoris

98

Q

M

m. longissimus dorsi

ENHO

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Q

MLC1SA

M

Q

m. biceps femoris

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

M

m. longissimus dorsi

Q

M

GDF8

80 70

20

60

15

50 40

10

30 20

5

10

Q

M

Q

m. biceps femoris

0

M

m. longissimus dorsi

Q

M

M

m. longissimus dorsi

YWHAQ

160

3,3

140

3,2

120

3,1

100

3

80

2,9

60

2,8

40

2,7

20

2,6

Q

M

Q

m. biceps femoris

2,5

M

m. longissimus dorsi

Q

M

Q

m. biceps femoris

HLA-DRB4

M

m. longissimus dorsi

IGF2

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

10 0

Q

m. biceps femoris

TNNT2

0

M

m. longissimus dorsi

POSTN

25

0

Q

m. biceps femoris

10

Q

M

Q

m. biceps femoris

0

M

m. longissimus dorsi

Q

M

m. biceps femoris

Q

M

m. longissimus dorsi

MYH8

350 300 250 200 150 100 50 0

Q

M

m. biceps femoris

Q

M

m. longissimus dorsi

Obr. 27: Porovnání výsledků kvantitativní real-time PCR(Q) a microarray (M) analýzy genové exprese vybraných genů v kosterní svalové tkáni prasat.

99

5.3 Analýza genu C5orf13 5.3.1. Analýza exprese genu v kosterní svalové tkáni prasat Na základě výsledků expresní analýzy ve svalové tkáni m. longissimus dorsi a biceps femoris českého bílého ušlechtilého plemene prasat a divokého prasete a dostupných informacích byl vybrán gen chromosome 5 open reading frame 13 (C5orf13) pro další podrobnější analýzu, jejíž cílem bylo zjistit více informací o roli tohoto genu v kosterní svalové tkáni prasat. Jak již bylo řečeno, výsledky microarray a real-time PCR analýzy ukázaly, že tento gen je průkazně „up“regulován v obou typech testované kosterní svalové tkáně bílého ušlechtilého plemene (ve srovnání s kosterní svalovou tkání divokého prasete). Konkrétně, dle microarray studie, je exprese genu 12,78 násobně vyšší ve svalu m. longissimus dorsi (P < 0,01) a 12,03 násobně vyšší ve svalu m. biceps femoris (P < 0,01). Tyto výsledky byly následně potvrzeny metodou real-time PCR, kde byla zjištěna exprese genu 14,50 násobně vyšší ve svalu m. longissimus dorsi (P < 0,01) a 11,64 násobně vyšší ve svalu m. biceps femoris (P < 0,01). Rozdíly v expresi mezi jednotlivými testovanými vzorky ukazuje Obr.28. Podobně jako tyto zmíněné výsledky, také studie da Costa et al. (2004) ukázala, že tento gen byl výrazně exprimován v kosterní svalovině rostoucích prasat, která byla krmena nízkoproteinovou a nízkoenergetickou potravou. Na rozdíl od toho, gen C5orf13 byl relativně „down“regulován ve svalech selat, které trpí vrozeným syndromem slabosti končetin (congenital splay leg syndrome), který je charakteristický imobilitou selat ihned po narození. Hlavní příčinou tohoto syndromu jsou menší svalová vlákna (Ooi et al. 2006). V souladu s touto studií, výsledky mé studie ukázaly, že gen C5orf13 byl „down“ regulován v kosterní svalové tkáni divokých prasat, u nichž jsou svalová vlákna, ve srovnání s komerčními plemeny prasat, menší (Müller et al. 2002). Nedávné studie také ukazují, že tento gen snižuje („down“ reguluje) expresi genů TGFB1 a TGFB2 částečným blokováním TGF-ß autoindukce (Pan et al., 2002; Paliwal et al., 2004). Je obecně známo, že geny náležející k TGF-ß rodině mají silný vliv na vývoj kosterní svalové tkáně a že fungují jako negativní regulátory (Kollias & McDermott, 2008). Další studie, která byla publikovaná autory Lecker et al. (2004) ukázala, že snížená exprese tohoto genu je spojena se svalovou atrofií myší a krys. Tyto výsledky, včetně výsledků mé studie, tak indikují, že gen C5orf13 může hrát důležitou roli v myogenezi, diferenciaci a vývoji kosterní svalové tkáně. 100

RQ = 1,2665

m.biceps femoris RQ = 1

RQ = 0,765

RQ = 0,1276

1. GG 2. GA 3. TC 4. 67

1. GA 2. GG 3. TT 4. 77

1. AA 2. GG 3. TT 4. 66

RQ = 0,1518 RQ = 0,0471

1. GG 2. GG 3. TT 4. 77

1. GG 2. GG 3. TT 4. 77

1. GG 2. GG 3. TT 4. 77

m. longissimus dorsi

RQ = 1

RQ = 0,673

RQ = 0,9891

RQ = 0,0304

BU1

BU2

BU3

D1

RQ = 0,0503

RQ = 0,0505

D2

D3

Obr.28: Výsledky real-time PCR analýzy C5orf13 genu v kosterní svalové tkáni českého bílého ušlechtilého a divokého prasete (program DataAssist; Applied Biosystems). Rámeček RQ – zobrazuje fold change (jednotka pro porovnání úrovně exprese genu mezi vzorky); rámeček s genotypy – zobrazuje genotyp daného jedince v lokusu 1) c.-169G>A, 2) c.-138G>A, 3) c.-93T>C a 4) c.78+54T(6_7).

101

5.3.2. Identifikace polymorfizmů a asociační analýza Gen C5orf13 byl mapován na chromozomu číslo 2 (Shi et al., 2001). Na tomto chromozomu prasete již byly nalezeny lokusy kvantitativních znaků (QTL), které mají vliv na masnou produkci (Fontanesi et al. 2011). Kromě toho, jak již bylo zmíněno dříve, gen pravděpodobně ovlivňuje diferenciaci myofibroblastů a myogenezi svalové tkáně (Pan et al. 2002; da Costa et al. 2004). Za pomoci primerů C5orf13_cDNA_F1 a C5orf13_cDNA _R1 byla amplifikovaná sekvence mRNA studovaného genu. Genomická sekvence genu byla následně amplifikována pomocí primerů C5orf13_DNA_F2 a C5orf13_DNA_R2 (sekvence exonu 1 s jeho přiléhajícími sekvencemi) a primerů C5orf13_DNA_F3 a C5orf13_DNA_R3 (sekvence exonu 2 s jeho přiléhajícími sekvencemi). PCR produkty (Obr. 29) tří jedinců českého bílého ušlechtilého plemene prasat a tří jedinců divokého prasete byly následně sekvenovány a výsledné sekvence byly porovnány v programu ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/ Tools/clustalw/index.html#). Sekvenační analýza C5orf13 genu odhalila 9 polymorfních míst. Pět SNP bylo identifikováno 5´UTR oblasti (c.-169G>A, c.-138G>A, c.-93T>C, c.-91G>A, c.-62C>T), dvě delece a jedna substituce intronu číslo 1 (c.78+31T(8_9), c.78+54T(6_7), c.78+53CA>TG) a jedno SNP (c.129C>T) v exonu číslo 2.

Obr. 29: Gelová elektroforéza zobrazující polymorfizmus c.129C>T v genu C5orf13 po štěpení PCR produktu pomocí restrikčního enzymu DdeI. M100 – Gene GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder, 100 – 1000 bp (Fermentas); 2% agarózový gel.

Tyto polymorfizmy jsme následně testovali na souboru 247 nepříbuzných prasnic českého bílého ušlechtilého plemene, které pocházely ze tří odlišných chovů pomocí sekvenování (polymorfizmy: c.-169G>A, c.-138G>A, c.-93T>C, c.-91G>A, c.-62C>T, c.78+31T(8_9), c.78+54T(6_7), c.78+53CA>TG) a restrikčního štěpení (polymorfizmus: c.129C>T). PCR produkt o velikosti 888 bp obsahující SNP c.129C>T byl štěpen 102

enzymem DdeI. Alela C se štěpila na fragmenty 83, 151, 167 a 487 bp, zatímco alela T se štěpila na fragmenty 83, 151, 167, 193 a 294 bp (Obr. 30).

Obr. 30: Gelová elektroforéza zobrazující polymorfizmus c.129C>T v genu C5orf13 po štěpení PCR produktu pomocí restrikčního enzymu DdeI. M50 – Gene GeneRuler™ 50 bp DNA Ladder, 500 – 1000 bp (Fermentas); 3% agarózový gel.

Výsledky testování nalezených polymorfních míst na souboru 247 prasnic ukázaly, že polymorfní místa c.-169G>A, c.-91G>A, c.-62C>T, c.78+31T(8_9), c.78+53CA>TG a c.129C>T jsou v úplné genetické vazbě. Proto byly dále brány jako informativní pouze čtyři polymorfizmy, a to c.-169G>A, c.-138G>A, c.-93T>C a c.78+54T(6_7). Frekvence alel a genotypů je zobrazen v Tab. 20. Tab. 20: Frekvence alel a genotypů čtyř lokusů genu C5orf13 u tří různých chovů prasat českého bílého ušlechtilého plemene. Lokus c.-169G>A c.-138G>A c.-93T>C c.78+54T(6_7)

Alela

Chov 1

Chov 2

Chov 3

n = 98

n = 52

n = 97

A

0,10

0,17

0,04

G

0,90

0,83

0,96

G

0,70

0,93

0,83

A

0,24

0,07

0,17

T

0,93

0,95

0,87

C

0,07

0,05

0,13

6

0,15

0,24

0,17

7

0,85

0,76

0,83

103

Jak ukazují výsledky v Tab. 20, frekvence alel mezi třemi různými chovy bílých ušlechtilých prasat byly podobné. Dále bylo zjištěno, že frekvence alel, které mají zejména vliv na sledované znaky masné užitkovosti prasat, je často poměrně nízká. Důvod tohoto výsledku nám není znám. Může to být způsobeno např. selekcí, jelikož zjištěné alely mající pozitivní vliv na znaky masné užitkovosti prasat mohou negativně ovlivňovat jiné důležité produkční či reprodukční vlastnosti. Je všeobecně známo, že existuje celá řada faktorů, které ovlivňují užitkovost prasat, a které jsou ve vzájemné interakci. Výsledky asociační studie, jejíž cílem bylo zjistit, zda nalezené polymorfizmy ovlivňují vybrané užitkové vlastnosti u plemene české bílé ušlechtilé, jsou zobrazeny v Tab. 21 a Tab. 22. K výpočtu byl použit lineární model s pevnými efekty polymorfizmů, roku narození, náhodnými efekty otce a matky a náhodná chyba každého pozorování. Vysoce průkazný vliv na všechny sledované znaky masné užitkovosti tří testovaných chovů měl rok narození. Tab. 21: Asociační analýza nalezených polymorfizmů v genu C5orf13 a znaky masné užitkovosti v chovu číslo 1 a 2. Chov 1

HT

PDPn

Chov 2

HT

PDPn

c.-169G>A

c.-169G>A AA (n = 2)

0,93 ± 0,12

589,50 ± 30,80a

AA (n = 2)

1,21 ± 0,18

544,50 ± 18,14a,b

AG (n = 16)

0,99 ± 0,04

541,81 ± 10,89*

AG (n = 14)

1,02 ± 0,07

503,86 ± 6,86a

GG (n = 80)

1,02 ± 0,02

522,81 ± 4,87a,*

GG (n = 36)

1,05 ± 0,05

500,38 ± 4,77b

c.-138G>A

c.-138G>A

AA (n = 4)

1,03 ± 0,08

517,75 ± 22,42

AG (n = 7)

1,07 ± 0,10

492,50 ± 10,86

AG (n = 39)

1,02 ± 0,03

532,59 ± 6,05

GG (n = 45)

1,04 ± 0,04

505,10 ± 4,26

GG (n = 55)

1,00 ± 0,02

524,20 ± 7,18

c.-93T>C

c.-93T>C

TT (n = 85)

1,01 ± 0,02

529,39 ± 4,83

TT (n = 47)

1,05 ± 0,04

506,10 ± 4,08a

TC (n = 13)

1,04 ± 0,05

513,46 ± 12,34

TC (n = 5)

0,98 ± 0,11

482,00 ± 11,55a

66 (n = 2)

1,21 ± 0,18

544,50 ± 18,17a,b

c.78+54T(6_7)

c.78+54T(6_7) a,b

66 (n = 2)

0,93 ± 0,12

589,50 ± 31,21

67 (n = 31)

1,00 ± 0,03

526,83 ± 7,93a

67 (n = 21)

1,01 ± 0,06

500,90 ± 5,61a

77 (n = 65)

1,02 ± 0,02

525,56 ± 5,47b

77 (n = 29)

1,06 ± 0,05

502,09 ± 5,48b

HT – výška hřbetního tuku (cm), PDPn – průměrný denní přírůstek od narození (g). Genotypy označenými stejným horním indexem znázorňují statisticky průkazný rozdíl – rozdíl blížící se statistické průkaznosti – *P < 0,09.

104

a,b

P < 0,05;

Jak je z výsledkových tabulek patrné, ve všech testovaných chovech byly zjištěny především asociace mezi genotypy studovaných polymorfních míst genu C5orf13 a parametry průměrného denního přírůstku. Statisticky průkazná asociace byla nalezena mezi polymorfizmy, které jsou v genetické vazbě (zastoupeny lokusem c.-169G>A) a průměrným denním přírůstkem od narození v chovu 1, 2 i 3 (P < 0,05) a dále průměrným denním přírůstkem v testu (P < 0,01) a plemennou hodnotou průměrného denního přírůstku (P < 0,01) v chovu číslo 3. Výsledky ukázaly, že testované prasnice bílého ušlechtilého plemene, které jsou nositelkami genotypu AA nebo AG v lokusu c.-169G>A 1 mají průkazně vyšší průměrný denní přírůstek od narození, případně jeho další ukazatele (chov číslo 3). Genotypy ve sledovaném lokusu c.-169G>A

mají

v chovu číslo 3 statistický vliv blížící se průkaznosti také na obsah libového masa a celkovou plemennou hodnotou (P < 0,09). Asociační analýza dále ukázala, že genotypy v lokusu c.-138G>A nemají průkazný vliv na sledované znaky v chovu číslo 1 a 2, ale statistická průkaznost byla zjištěna mezi ukazateli, které hodnotí průměrný denní přírůstek v chovu číslo 3 – prasnice s genotypem GG mají, v porovnání se zvířaty s genotypem AG, průkazně vyšší průměrný denní přírůstek od narození (P < 0,05), vysoce průkazně vyšší průměrný denní přírůstek v testu (P < 0,01) a plemennou hodnotu průměrného denního přírůstku (P < 0,01). Výrazné rozdíly v hodnotách těchto ukazatelů hodnotící průměrný denní přírůstek platí i pro porovnání genotypů GG a AA, ale bez statické průkaznosti. Pokud se týká SNP c.-93T>C, bylo zjištěno, že toto SNP má kromě jiného také především vliv na průměrný denní přírůstek a jeho další ukazatele. Zvířata nesoucí genotyp TT v chovu číslo 2 vykazují statisticky průkazně vyšší průměrný denní přírůstek od narození (P < 0,05). Testované prasnice v chovu číslo 1 s genotypy TT měly taká, ve srovnání se zvířaty s genotypy TC, vyšší průměrný denní přírůstek od narození, ale bez statistické průkaznosti. V chovu číslo 3 byl odhalen statistický rozdíl blížící se průkaznosti mezi zmíněnými genotypy a průměrným denním přírůstkem od narození (P < 0,08). Mimo to, v tomto chovu byl dále zjištěn statisticky vysoce průkazný rozdíl u plemenné hodnoty průměrného denního přírůstku (P < 0,01), průkazný rozdíl u obsahu libového masa (P < 0,05), plemenné hodnoty obsahu libového masa (P < 0,05) a celkové

1

A současně také genotypu AA v lokusu c.-91G>A, TT v lokusu c.-62C>T, 88 v lokusu c.78+31T(8_9), TG v lokusu c.78+53CA>TG a TT v lokusu c.129C>T. Lokus c.-169G>A je s těmito lokusy v úplné vazbě.

105

Tab. 22: Asociační analýza nalezených polymorfizmů v genu C5orf13 a znaky masné užitkovosti v chovu číslo 3. Chov 3

HT

LM

PDPn

PDPt

PHpdp

PHlm

PHr

CPH

c.-169G>A AG (n = 8)

0,62 ± 0,03a

63,80 ± 0,30***

652,09 ± 19,08a

1099,17 ± 41,11A

39,75 ± 5,13A

1,44 ± 0,15

1,17 ± 0,32

1196,70 ± 61,05***

GG (n = 89)

0,82 ± 0,09a

61,88 ± 1,11***

610,91 ± 6,44a

993,54 ± 13,87A

22,82 ± 1,73A

1,31 ± 0,08

1,36 ± 0,10

913,57 ± 167,79***

0,64 ± 0,08a,*

63,22 ± 0,87

561,86 ± 37,78

920,61 ± 79,75

20,63± 6,82

1,34 ± 0,22

1,29 ± 0,25

1052,84 ± 137,70

1,31 ± 0,10

1,26 ± 0,17

1031,76 ± 95,35

24,00 ± 4,29

1,34 ± 0,08

1,24 ±0,17

1080,79 ± 92,34

c.-138G>A AA (n = 3)

*

AG (n = 27)

0,75 ± 0,05

a

GG (n = 67)

62,69 ± 0,59

569,71 ± 26,51

a a

932,62 ± 56,12

A

995,92 ± 53,99

A

A

18,73± 4,46

A

0,77 ± 0,05

62,62 ± 0,57

596,30 ± 25,46

TT (n = 71)

0,60 ± 0,03a

64,18 ± 0,35a

620,66 ± 15,45**

1014,01 ± 33,33

31,38 ± 3,51A

1,36 ± 0,08a

1,31 ± 0,11

1245,65 ± 66,62a

TC (n = 26)

0,84 ± 0,09a

61,50 ± 1,13a

531,26 ± 50,66**

885,42 ± 106,73

10,85 ± 7,69A

1,22 ± 0,10a

1,22 ± 0,32

864,61 ± 172,97a

67 (n = 33)

0,61 ± 0,03a

64,01 ± 0,37*

620,61± 16,53***

1012,31 ± 35,56

31,10 ± 3,64A

1,26 ± 0,09

1,31 ± 0,12

1235,03 ± 69,80a

77 (n = 64)

0,83 ± 0,09a

61,68 ± 1,14*

531,31 ± 51,00***

887,13 ± 107,43

11,13 ± 7,71A

1,36 ± 0,08

1,21 ± 0,33

875,23 ± 173,63a

c.-93T>C

c.78+54T(6_7)

HT – výška hřbetního tuku (cm), LM – obsah libového masa (%),PDPn – průměrný denní přírůstek (g) od narození, PDPt – průměrný denní přírůstek v testu (g), PHpdp – plemenná

hodnota

průměrného

denního

přírůstku,

PHlm

–

plemenná

hodnota

obsahu

libového

masa,

PHr

–

plemenná

hodnota

reprodukce

a CPH – celková plemenná hodnota. Genotypy označenými stejným horním indexem znázorňují statisticky průkazný rozdíl – ** P < 0,08; *** P < 0,09. .

106

a,b

P < 0,05 a A,B P < 0,01; rozdíl blížící se statistické průkaznosti – * P < 0,07;

plemenné hodnoty (P < 0,05). Zvířata v chovu číslo 3 mající genotypy TT vykazují také vyšší průměrný denní přírůstek v testu, ale bez statistické významnosti. U posledního testovaného lokusu c.78+54T(6_7) byla nalezena asociace mezi průměrným denním přírůstkem od narození, která je statisticky průkazná (P < 0,05) v chovu číslo 1 a 2 a blížící se průkaznosti (P < 0,09) v chovu číslo 3. V tomto chovu byl dále zjištěn statisticky průkazný rozdíl mezi tímto lokusem a plemennou hodnotou průměrného denního přírůstku (P < 0,01) a celkovou plemennou hodnotou (P < 0,05). Jak lze vidět v Tab. 22 zvířata v tomto chovu s genotypem 67 mají také vyšší průměrný denní přírůstek v testu, ale bez statistické významnosti. Dle studie Leung et al. (2008) se gen C5orf13 podílí také na regulaci syntézy a akumulaci lipidových kapének a podporuje expresi několika genů, které jsou asociovány se syntézou lipidů. V souladu s těmito výsledky, na rozdíl od chovu číslo 1 a 2, byly v chovu číslo 3 zjištěny také průkazné asociace mezi všemi testovanými polymorfními místy a výškou hřbetního tuku (P < 0,05) – prasnice s genotypem AG v lokusu c.-169G>A, AA v lokusu c.-138G>A, TT v lokusu c.-93T>C a 67 v lokusu c.78+54T(6_7) mají statisticky průkazně menší výšku hřbetního tuku. Přestože jedno polymorfní místo bylo nalezeno v kódující oblasti genu C5orf13 (SNP c.129C>T), toto SNP nemá vliv na kódování struktury proteinu a proto přímý účinek tohoto polymorfizmu není pravděpodobný. I když nalezené polymorfní místa nejsou pravděpodobně kauzální mutace, jsou již dnes známé mutace v intronech ovlivňující fenotypovou manifestaci genu – např. SNP v genu IGF2 u prasat (Van Leare et al., 2003). Kauzální mutace se také může nalézat v regulačních oblastech genu, jejichž sekvence však nejsou u prasat, ani u jiných eukaryotických organizmů, známé. Analýza těchto sekvencí regulačních oblastí genu je poměrně problematická, jelikož mohou být lokalizovány uvnitř samotného transkriptu, intronů, 5' nepřekládaných oblastí (promotor a okolní sekvence) nebo uvnitř zesilovače (enhancer) a tlumiče (silencer) transkripce, které mohou být umístěny několik desítek a nebo stovek párů kilobází od transkribované sekvence genu (Buckland, 2004). Ačkoliv výsledky expresní analýzy genu C5orf13, které by mohly naznačit, zda se kauzální mutace nachází v regulačních oblastech genu, vykazují určité rozdíly mezi testovanými jedinci českého bílého ušlechtilého a divokého prasete (Obr. 28), není možné vyvodit jednoznačné závěry, jelikož počet vzorků je pro analýzu alelově specifické genové expresi nedostatečný. Odlišná genová exprese mezi jedinci způsobená

107

nějakou změnou v sekvenci (polymorfizmy) v regulační oblasti je běžný mechanizmus fenotypové variability. Tento polymorfizmus (polymorfizmy) se však mohou nacházet jak v sekvenci genu samotného (tzv. cis efekt), tak v jiných genech, které regulují expresi cílových genů (tzv. trans efekt). Mimo to odlišná exprese genu může být zapříčiněna a regulována také faktory prostředí nebo epigenetickými efekty (Buckland, 2004). Závěrem lze konstatovat, že námi detekované polymorfizmy genu C5orf13 jsou prvními nalezenými a analyzovanými polymorfizmy u prasete a doposud nebyly žádné publikovány. Výsledky této studie naznačují, že nalezené polymorfní místa mohou být genetické markery, které jsou pravděpodobně ve vazbě s neznámou kauzální mutací ovlivňující především průměrný denní přírůstek prasat. Rychlost neboli tempo růstu definované jako průměrný denní přírůstek je jedním z hlavních selekčních kritérií u hospodářských zvířat. Nalezená polymorfní místa genu C5orf13 mají statisticky průkazný vliv na tento ekonomicky významný znak užitkovosti prasat ve všech třech testovaných chovech českého bílého ušlechtilého plemene prasat. Tato studie poskytuje důležité informace pro další výzkum tohoto genu a pro prohloubení znalostí o genech ovlivňující ekonomicky významné užitkové vlastnosti prasat. Snahou selekce a šlechtění hospodářských zvířat je produkce zvířat s rychle rostoucí svalovou hmotou vynikající kvality. Nicméně další zvyšování množství kosterní svalové tkáně vyžaduje znalosti molekulárních a buněčných dějů, které jsou zapojeny v regulaci růstu. Jelikož asociační analýza byla provedena na relativně malých souborech prasnic plemene české bílé ušlechtilé, je velmi těžké přesně odhadnout konečné využití nalezených polymorfizmů v MAS. Proto pro potvrzení mých výsledků je třeba, aby byly provedeny asociační studie i na dalších populacích a plemenech zvířat.

108

6 ZÁVĚR Předložená disertační práce se v úvodních kapitolách literárního přehledu zabývá popisem a shrnutím poznatků o důležitých aspektech vzniku, vývoje a funkci kosterní svalové tkáně z pohledu molekulární biologie a genetiky a metod, které umožňují kvantifikovat genovou expresi. Závěrečná část literárního přehledu je věnována stručnému popisu funkce dále studovaných genů. V části výsledkové se tato práce věnuje analýze transkriptomu pomocí mikročipové technologie v kosterní svalové tkáni musculus longissimus dorsi a biceps femoris mezi odlišnými typy prasat (české bílé ušlechtilé plemeno a divoké prasete) v období jejich intenzivního růstu. Expresní mikročipy představují moderní technologii, která nám umožňuje sledovat aktivitu tisíců genů v dané tkáni v rámci jediné analýzy. Taková analýza genové exprese a její srovnání mezi různými druhy prasat (případně mezi chovy) má velký potenciál pro objevení nových a doposud neznámých genů, které ovlivňují užitkovost zvířat. Naše analýza nám, společně s nástroji bioinformatiky, umožnila identifikovat 537 genů, které jsou více než trojnásobně odlišně exprimovány mezi analyzovány druhy prasat a určit jejich biologickou anotaci (GO termíny a signální dráhy). Dále nám umožnila nalézt 86 genů, jejichž funkce je spojena s vývojem, růstem nebo regenerací kosterní svalové tkáně a které mohou být vybrány pro další analýzy. Ze souboru těchto genů bylo následně vybráno 13 genů (ANKRD1, C1QTNF3, C5orf13, CNN3, ENHO, GDF8, POSTN, TNNT2, YWHAQ, MYH8, IGF2, MLC1SA a HLA-DRB4), jejichž exprese byla validována a stanovena pomocí metody kvantitativní real-time PCR. Jako referenční geny pro tuto analýzu byly použity geny HPRT1, OAZ1 a RPS18. Tyto geny byly vybrány na základě výsledků analýzy stability genové exprese, která byla zkoumána u 7 potenciálních referenčních genů (HPRT1, NACA, OAZ1, RPL32, RPS18, TAF4B a TBP) v kosterní svalové tkáni prasat různých věkových kategorií (plod, sele, dospělý). Jeden z nejdůležitějších cílů výzkumné činnosti v rámci užitkovosti hospodářských zvířat je porozumění genetickým základům a faktorům ovlivňující tvorbu svalové hmoty a kvalitu masa. V současnosti je ve šlechtitelských programech na tyto produkční znaky brán velký zřetel. Molekulární genetika je nástroj umožňující selekci a šlechtění zvířat na základě identifikace genových polymorfizmů a fyziologických rozdílů mezi zvířaty s různými genotypy. Závěrečná studie byla proto zaměřena na podrobnější analýzu genu chromosome 5 open reading frame 13 (C5orf13), který byl vybrán na základě 109

výsledků expresní analýzy a publikovaných informací. Přestože dostupné informace naznačují, že tento gen plní svou úlohu ve svalové tkáni, není příliš o jeho roli v kosterní svalové tkáni prasat známo. U tohoto genu byla studována sekvence mRNA i DNA a nalezené polymorfní místa (celkem 9, z nichž 6 je v úplné genetické vazbě) byla testována ve vztahu ke znakům masné užitkovosti českých bílých ušlechtilých prasat (247 prasnic pocházející ze 3 chovů). V testovaných chovech byly zjištěny především statisticky průkazné asociace mezi genotypy studovaných polymorfních míst a parametry průměrného denního přírůstku. Výsledky ukázaly, že všechny testované prasnice, které jsou nositelkami genotypu AA nebo AG v lokusu c.-169G>A (lokus zastupující polymorfizmy, které jsou v genetické vazbě) mají průkazně vyšší průměrný denní přírůstek od narození (P < 0,05) a případně jeho další ukazatele (tj. průměrný denní přírůstek v testu (P < 0,01) a plemennou hodnotu průměrného denního přírůstku (P < 0,01) v chovu číslo 3). Asociační analýza dále ukázala, že zvířata s genotypem GG v lokusu c.-138G>A mají, v porovnání se zvířaty s genotypem AG, průkazně vyšší průměrný denní přírůstek od narození (P < 0,05), vysoce průkazně vyšší průměrný denní přírůstek v testu (P < 0,01) a plemennou hodnotu průměrného denního přírůstku (P < 0,01) v chovu číslo 3. Prasnice, které jsou nositelkami genotypu 66 nebo 67 v lokusu c.78+54T(6_7) mají průkazně vyšší průměrný denní přírůstek od narození (P < 0,05) v chovu číslo 1 a 2, plemennou hodnotou průměrného denního přírůstku (P < 0,01) a celkovou plemennou hodnotou (P < 0,05) v chovu číslo 3. Navíc v chovu číslo 3 byly zjištěny také průkazné asociace mezi všemi testovanými polymorfními místy a výškou hřbetního tuku (P < 0,05) – prasnice s genotypem AG v lokusu c.-169G>A, AA v lokusu c.-138G>A, TT v lokusu c.-93T>C a 67 v lokusu c.78+54T(6_7) mají statisticky průkazně menší výšku hřbetního tuku. Jelikož se nám nepodařilo nalézt v kódující oblasti genu mutaci ovlivňující kódování struktury proteinu, naše studie ukazuje na možné spojení testovaných polymorfních míst s doposud neznámou kauzální mutací ovlivňující především průměrný denní přírůstek prasat. Snahou této práce je především přispět k poznání o genech, které ovlivňují masnou užitkovost prasat. Závěrem lze říci, že tato práce přinesla pozitivní výsledky, jelikož geny detekované pomocí mikročipové technologie představují prostor pro jejich další studium a podrobné analýzy. Navíc detekované polymorfizmy genu C5orf13 jsou prvními nalezenými a analyzovanými polymorfizmy u prasete. Tato studie tak poskytuje

110

důležité informace pro další výzkum tohoto genu a prohlubuje naše znalosti o genech ovlivňující ekonomicky významné užitkové vlastnosti prasat.

111

PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY Abid A., Akhtar N., Khaliq S., Mehdi S. Q., 2011: Genetic heterogeneity for autosomal dominant familial hypertrophic cardiomyopathy in a Pakistani family. J. Coll. Physicians Surg. Pak., 21 (4): 202–206. Affymetrix, 2011: Data Sheet, GeneChip® Porcine Genome Array [cit. 2011-08-15]. Dostupné na: http://media.affymetrix.com/support/technical/datasheets/porcine_datasheet.pdf. Ahn K., Huh J. W., Park S. J., Kim D. S., Ha H. S., Kim Y. J., Lee J. R., Chang K. T., Kim H. S., 2008: Selection of internal reference genes for SYBR green qRT-PCR studies of rhesus monkey (Macaca mulatta) tissues. BMC Mol. Biol., 9:78. Allison D. B., Cui X., Page G. P., Sabripour M., 2006: Microarray data analysis: from disarray to consolidation and consensus. Nat. Rev. Genet., 7 (1): 55–65. Al-Shanti N., Aldahoodi Z., 2006: Inhibition of alpha nascent polypeptide associated complex protein may induce proliferation, differentiation and enhance the cytotoxic activity of human CD8+ T cells. J. Clin. Immunol., 26 (5): 457–464. Andersen C. L., Jensen J. L., Ørntoft T. F., 2004: Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res., 64 (15): 5245–5250. Appel S., Allen P. G., Vetterkind S., Jin J. P., Morgan K. G., 2010: h3/Acidic calponin: an actin-binding protein that controls extracellular signal-regulated kinase 1/2 activity in nonmuscle cells. Mol. Biol. Cell, 21 (8): 1409–1422. Applied Biosystems1: Real-Time PCR Vs. Traditional PCR. Applied Biosystems [cit. 2011-05-10]. Dostupné na: http://www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/ rtpcr_vs_tradpcr.pdf. Applied Biosystems2, 1997: Applied Biosystems User Bulletin No. 2 (P/N 4303859) [cit. 2011-05-10]. Dostupné na: http://www.core-facility.uni-freiburg.de/lc480/lc480obj/ub2.

112

Attisano L., Wrana J. L., 2002: Signal transduction by the TGF-beta superfamily. Science, 296 (5573): 1646–1647. Babu M. M., 2004: An Introduction to Microarray Data Analysis, s. 225–249. In: Grant R. P. (ed.), Computational Genomics: Theory and Application. Horizon Bioscience, Norwitch, 350 s. Benjamini Y., Hochberg Y., 1995: Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J. Roy. Statist. Soc. Ser. B, 57 (1): 289–300. Berchtold M. W, Brinkmeier H., Müntener M., 2000: Calcium ion in skeletal muscle: its crucial role for muscle function, plasticity, and disease. Physiol. Rev., 80 (3): 1215– 1265. Bertolino P., Deckers M., Lebrin F., ten Dijke P., 2005: Transforming growth factorbeta signal transduction in angiogenesis and vascular disorders. Chest., 128 (Suppl. 6): 585–590. Biral D., Ballarin F., Toscano I., Salviati G., Yu F., Larsson L., Betto R., 1999: Genderand thyroid hormone-related transitions of essential myosin light chain isoform expression in rat soleus muscle during ageing. Acta Physiol. Scand., 167 (4): 317–323. Bismuth K., Relaix F., 2010: Genetic regulation of skeletal muscle development. Exp. Cell Res., 316 (18): 3081–3086. Bootman, M. D., Lipp, P., 2001: Calcium signalling and regulation of cell function. eLS. Boudreau N. J., Jones P. L., 1999: Extracellular matrix and integrin signalling: the shape of things to come. Biochem. J., 339 (Pt 3): 481–488. Brameld J. M., Greenwood P. L., Bell A. W., 2010: Biological Mechanisms of Fetal Development Relating to Postnatal Growth, Efficiency and Carcass Characteristics in Ruminants, s. 93–120. In: Greenwood P. L., Bell A. W., Vercoe P. E., Viljoen G. J., Managing the Prenatal Environment to Enhance Livestock Productivity. Springer, Dordrecht, 300 s.

113

Brennan T. J., Edmondson D. G., Li L., Olson E. N., 1991: Transforming growth factor beta represses the actions of myogenin through a mechanism independent of DNA binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 88 (9): 3822–3826. Bryson-Richardson R. J., Currie P. D., 2008: The genetics of vertebrate myogenesis. Nat. Rev. Genet., 9 (8): 632–646. Buckingham M., Montarras D., 2008: Skeletal muscle stem cells. Curr. Opin. Genet. Dev., 18 (4): 330–336. Buckland P. R., 2004: Allele-specific gene expression differences in humans. Hum. Mol. Genet., 13 (2): R255–260. Budinská E., Jarkovský J., Lidman P., Dušek P., 2005: Komplexní analýza údajů z genových expresních map: výzva onkologického výzkumu pro současnou analýzu dat, s. . 83–85. In: Žaloudík J, Vyzula R (eds): Edukační sborník. XXIX. Brněnské onkologické dny a XIX. Konference pro sestry a laboranty, 26.-28.5.2005. Masarykův onkologický ústav, Brno. Burks T. N., Cohn R. D., 2011: Role of TGF-β signaling in inherited and acquired myopathies. Skelet. Muscle; 1 (1): 19. Bustin S.A, 2000: Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J. Mol. Endocrinol., 25 (2): 169–193. Bustin S. A, Nolan T., 2004: Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. J. Biomol. Tech., 15 (3): 155–166. Bustin S. A., Benes V., Garson J. A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M. W., Shipley G. L., Vandesompele J., Wittwer C. T., 2009: The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem., 55 (4): 611–622. Carmona-Saez P., Chagoyen M., Tirado F., Carazo J. M., Pascual-Montano A., 2007: GENECODIS: a web-based tool for finding significant concurrent annotations in gene lists. Genome Biol., 8 (1): R3.

114

Carvajal J. J., Rigby P. W., 2010: Regulation of gene expression in vertebrate skeletal muscle. Exp. Cell Res., 316 (18): 3014–3018. Cepheid: Designing Real-Time Assays on the SmartCycler II System [cit. 2011-07-21]. Dostupné na: http://www.cepheid.com/media/files/smart-notes/SmartNote6.1.pdf. Chargé S. B., Rudnicki M. A., 2004: Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol. Rev., 84 (1): 209–238. Chen H-, Li C., Fang M., Zhu M., Li X., Zhou R., Li K., Zhao S., 2009: Understanding Haemophilus parasuis infection in porcine spleen through a transcriptomics approach. BMC Genomics, 10:64. Chen K., Baxter T., Muir W. M., Groenen M. A., Schook L. B., 2007: Genetic resources, genome mapping and evolutionary genomics of the pig (Sus scrofa). Int. J. Biol. Sci., 3 (3): 153–165. Chen Y. W., Nader G. A., Baar K. R., Fedele M. J., Hoffman E. P., Esser K. A., 2002: Response of rat muscle to acute resistance exercise defined by transcriptional and translational profiling. J. Physiol., 545 (Pt 1): 27–41. Chon H. S., Lancaster J. M., 2011: Microarray-based gene expression studies in ovarian cancer. Cancer Control, 18 (1): 8–15. Cler E., Papai G., Schultz P., Davidson I., 2009: Recent advances in understanding the structure and function of general transcription factor TFIID. Cell. Mol. Life Sci., 66 (13): 2123–2134. Cuellar T. L., McManus M. T., 2005: MicroRNAs and endocrine biology. J. Endocrinol., 187 (3): 327–332. Čechová M., Mikule V., Tvrdoň Z., 2006: Chov prasat, s. 144–166. In: Žižlavský J. (ed.), Chov hospodářských zvířat. Mendlova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 208 s. Černý H., 2005: Svalstvo z hlediska vývoje, stavby a funkce. [cit. 2011-03-08]. Dostupné na: http://boss.ped.muni.cz/vyuka/material/magi/chemie/Svaly.pdf.

115

da Costa N., McGillivray C., Bai Q., Wood J. D., Evans G., Chang K. C., 2004: Restriction of dietary energy and protein induces molecular changes in young porcine skeletal muscles. J. Nutr., 134 (9): 2191–2199. Daryl K., Granner M. D., 2002: Regulace genové exprese, s. 465–482. In: Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., Rodwell V.W., Harperova biochemie. H & H, Praha, 871 s. Davidson I., Martianov I., Viville S., 2004: TBP, a universal transcription factor? Med. Sci. (Paris), 20 (5): 575–579. Davoli R., Braglia S., 2007: Molecular approaches in pig breeding to improve meat quality. Brief . Funct. Genomic. Proteomic., 6 (4), 313–321. de Graaf P., Mousson F., Geverts B., Scheer E., Tora L., Houtsmuller A. B., Timmers H. T., 2010: Chromatin interaction of TATA-binding protein is dynamically regulated in human cells. J. Cell. Sci., 123 (Pt 15): 2663–22671. de Jonge H. J., Fehrmann R. S., de Bont E. S., Hofstra R. M., Gerbens F., Kamps W. A., de Vries E. G., van der Zee A. G., te Meerman G. J., ter Elst A., 2007: Evidence based selection of housekeeping genes. PLoS One, 2 (9): e898. Depreux F. F. S., Grant A. L., Gerrard D. E., 2002: Influence of halothane genotype and body-weight on myosin heavy chain composition in pig muscle as related to meat quality. Livest. Prod. Sci., 73 (2): 265–273. D'haene B., Vandesompele J., Hellemans J., 2010: Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR. Methods, 50 (4): 262–270. Do J. H, Choi D. K., 2006: Normalization of microarray data: single-labeled and duallabeled arrays. Mol. Cells, 22 (3): 254–261. Do J. H., Choi D. K., 2007: cDNA Labeling Strategies for Microarrays Using Fluorescent Dyes. Eng. Life Sci., 7 (1): 26–34. Dorak M. T. (ed), 2006: Real-time PCR. Taylor & Francis Group, New York, 333 s.

116

Du Z., Zhou X., Ling Y., Zhang Z., Su Z., 2010: agriGO: a GO analysis toolkit for the agricultural community. Nucleic Acids Res., 38 (Web Server issue):W 64–70. Dudov K. P, Perry R. P., 1984: The gene family encoding the mouse ribosomal protein L32 contains a uniquely expressed intron-containing gene and an unmutated processed gene. Cell, 37 (2): 457–468. Dylevský I., 2007: Obecná kineziologie. Grada Publishing a.s., Praha, 192 s. Dziuda D. M., 2010: Data Mining for Genomics and Proteomics: Analysis of Gene and Protein Expression Data. John Wiley & Sons, New Jersey, 336 s. El-Mezgueldi M., 1996: Calponin. Int. J. Biochem. Cell Biol., 28 (11): 1185–1189. Entrez Gene, 2010: TBP TATA box binding protein [cit. 2011-11-22]. Dostupné na: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6908. ¨ Erkens T., Van Poucke M., Vandesompele J., Goossens K., Van Zeveren A., Peelman L. J., 2006: Development of a new set of reference genes for normalization of real-time RT-PCR data of porcine backfat and longissimus dorsi muscle, and evaluation with PPARGC1A. BMC Biotechnol., 6: 41. Esser K., 2008: Regulation of mTOR signaling in skeletal muscle hypertrophy. J. Musculoskelet. Neuronal Interact., 8 (4): 338–339. Eswarakumar V. P., Lax I., Schlessinger J., 2005: Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev., 16 (2): 139–149. Falender A. E., Freiman R. N., Geles K. G., Lo K. C., Hwang K., Lamb D. J., Morris P. L., Tjian R., Richards J. S., 2005: Maintenance of spermatogenesis requires TAF4b, a gonad-specific subunit of TFIID. Genes Dev., 19 (7): 794–803. Fan B., Gorbach D. M., Rothschild M. F., 2011: The pig genome project has plenty to squeal about. Cytogenet. Genome Res., 134 (1): 9–18. Fang M., Berg F., Ducos A., Andersson L., 2006: Mitochondrial haplotypes of European wild boars with 2n = 36 are closely related to those of European domestic pigs with 2n = 38. Anim. Genet., 37 (5): 459–464. 117

Filby A. L., Tyler C. R., 2007: Appropriate 'housekeeping' genes for use in expression profiling the effects of environmental estrogens in fish. BMC Mol. Biol., 8: 10. Fontanesi L., Scotti E., Speroni C., Buttazzoni L., Russo V., 2011: A selective genotyping approach identifies single nucleotide polymorphisms in porcine chromosome 2 genes associated with production and carcass traits in Italian heavy pigs. Ital. J. Anim. Sci., 10 (2), 72–77. Freiman R. N., Albright S. R., Zheng S., Sha W. C., Hammer R. E., Tjian R., 2001: Requirement of tissue-selective TBP-associated factor TAFII105 in ovarian development. Science, 293 (5537): 2084–2087. Gazit K., Moshonov S., Elfakess R., Sharon M., Mengus G., Davidson I., Dikstein R., 2009: TAF4/4b x TAF12 displays a unique mode of DNA binding and is required for core promoter function of a subset of genes. J. Biol. Chem., 284 (39): 26286–26296. Generi Biotech: Základní principy kvantitativní real-time PCR (qPCR). Generi Biotech [cit. 2011-05-10]. Dostupné na: http://www.generi-biotech.com/real-time-pcr-sondykvantitativni-real-time-pcr/. Genisphere, 2006: 3DNA Nucleic Acid Microarray Kits [cit. 2011-06-17]. Dostupné na: http://www.genisphere.com/pdf/F_SBrochure-3-29-06.pdf. Gentle A., Anastasopoulos F., McBrien N.A., 2001: High-resolution semi-quantitative real-time PCR without the use of a standard curve. Biotechniques, 31 (3): 502–508. Gilad Y., Rifkin S. A. , Pritchard J. K., 2008: Revealing the architecture of gene regulation: the promise of eQTL studies. Trends Genet., 24 (8): 408–415. Göhlmann H., Talloen W., 2009: Gene Expression Studies Using Affymetrix Microarrays. Taylor & Francis Group, Boca Raton, 359 s. Gojová L., Kozák L., 2006: Možnosti využití DNA čipů v molekulární diagnostice dědičných onemocnění. Klin. Biochem. Metab., 14 (35): s. 89–95.

118

Goldspink G., 2004: Local and Systemic Regulation of Muscle Growth, s. 157–172. In: te Pas M. F. W., Everts M. E., Haagsman H. P., Muscle development of livestock animals: physiology, genetics, and meat quality. CABI Publishing, Wallingfrod, 428s. Gomes A. V., Barnes J. A., Harada K., Potter J. D., 2004: Role of troponin T in disease. Mol. Cell. Biochem., 263 (1-2): 115–129. Groenen M. A. M., Schook L. B., Archibald A.L., 2011: Pig Genomics, s. 179–200. In: Rothschild M. F., Ruvinsky A. (ed.), The Genetics of the Pig, 2nd Edition. CAB International, Wallingford, 507 s. Grossi S. F., Lui J. F., Garcia J. E., Meirelles F. V., 2006: Genetic diversity in wild (Sus scrofa scrofa) and domestic (Sus scrofa domestica) pigs and their hybrids based on polymorphism of a fragment of the D-loop region in the mitochondrial DNA. Genet. Mol. Res., 5 (4): 564–568. Haag J., Aigner T., 2007: Identification of calponin 3 as a novel Smad-binding modulator of BMP signaling expressed in cartilage. Exp. Cell Res., 313 (16): 3386–3394. Hailstones D. L., Gunning P. W., 1990: Characterization of human myosin light chains 1sa and 3nm: implications for isoform evolution and function. Mol. Cell. Biol., 10 (3): 1095–1104 Hamilton D. W., 2008: Functional role of periostin in development and wound repair: implications for connective tissue disease. J. Cell Commun. Signal., 2 (1-2): 9–17. He Y., Suzuki T., Kashiwagi K., Igarashi K., 1994: Antizyme delays the restoration by spermine of growth of polyamine-deficient cells through its negative regulation of polyamine transport. Biochem. Biophys. Res. Commun., 203 (1): 608–614. Hettmer S., Wagers A. J., 2010: Muscling in: Uncovering the origins of rhabdomyosarcoma. Nat. Med., 16 (2): 171–173. Hernandez N., 1993: TBP, a universal eukaryotic transcription factor? Genes Dev., 7 (7B): 1291–1308.

119

Hoeksema F., Hamer K., Siep M., Verhees J. A., Otte A. P., 2011: Placing the RPL32 Promoter Upstream of a Second Promoter Results in a Strongly Increased Number of Stably Transfected Mammalian Cell Lines That Display High Protein Expression Levels. Biotechnol. Res. Int., 2011: 492875. Horiuchi K., Amizuka N., Takeshita S., Takamatsu H., Katsuura M., Ozawa H., Toyama Y., Bonewald L. F., Kudo A., 1999: Identification and characterization of a novel protein, periostin, with restricted expression to periosteum and periodontal ligament and increased expression by transforming growth factor beta. J. Bone Miner. Res., 14 (7): 1239–1249. Hossner K. L., 2005: Hormonal regulation of farm animal growth. CAB International, Wallingford, 223 s. Huang da W., Sherman B. T., Tan Q., Kir cJ., Liu D., Bryant D., Guo Y., Stephens R., Baseler M. W., Lane H. C., Lempicki R. A., 2007: DAVID Bioinformatics Resources: expanded annotation database and novel algorithms to better extract biology from large gene lists. Nucleic Acids Res., (Web Server issue): W 169–175. Huang da W1., Sherman B. T., Lempicki R. A., 2009: Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res., 37 (1): 1–13. Huang da W.2, Sherman B. T, Lempicki R. A., 2009: Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc.,4 (1): 44–57. Inai K., Norris R. A., Hoffman S., Markwald R. R., Sugi Y., 2008: BMP-2 induces cell migration and periostin expression during atrioventricular valvulogenesis. Dev. Biol., 315 (2): 383–396. Kadlec P. (ed.), 2002: Technologie potravin I. VŠCHT, Praha, 300 s. Kanai H., Tanaka T., Aihara Y., Takeda S., Kawabata M., Miyazono K., Nagai R., Kurabayashi M., 2001: Transforming growth factor-beta/Smads signaling induces transcription of the cell type-restricted ankyrin repeat protein CARP gene through CAGA motif in vascular smooth muscle cells. Circ. Res., 88 (1): 30–36.

120

Keebaugh A. C, Sullivan R. T.; NISC Comparative Sequencing Program, Thomas J. W., 2007: Gene duplication and inactivation in the HPRT gene family. Genomics, 89 (1): 134–142. Keren A., Tamir Y., Bengal E., 2006: The p38 MAPK signaling pathway: a major regulator of skeletal muscle development. Mol. Cell. Endocrinol., 252 (1-2): 224–230. Kollias H. D, McDermott J. C., 2008: Transforming growth factor-beta and myostatin signaling in skeletal muscle. J. Appl. Physiol., 104 (3): 579–587. Komiya Y., Habas R., 2008: Wnt signal transduction pathways. Organogenesis, 4 (2): 68–75. Kramer H. F., Goodyear L. J., 2007: Exercise, MAPK, and NF-kappaB signaling in skeletal muscle. J. Appl. Physiol., 103 (1): 388–395. Kubista M., Andrade J. M., Bengtsson M., Forootan A., Jonák J., Lind K., Sindelka R., Sjöback R., Sjögreen B., Strömbom L., Ståhlberg A., Zoric N., 2006: The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med., 27 (2–3): 95–125. Kumar K. G., Trevaskis J. L., Lam D. D., Sutton G. M., Koza R. A., Chouljenko V. N., Kousoulas K. G., Rogers P. M., Kesterson R. A., Thearle M., Ferrante A. W. Jr., Mynatt R. L., Burris T. P., Dong J. Z., Halem H. A., Culler M. D., Heisler L. K., Stephens J. M., Butler A. A., 2008: Identification of adropin as a secreted factor linking dietary macronutrient intake with energy homeostasis and lipid metabolism. Cell Metab., 8 (6): 468–481. Kusui K., Sasaki H., Adachi R., Matsui S., Yamamoto K., Yamaguchi T., Kasahara T., Suzuki K., 2004: Ribosomal Protein S18 identified as a cofilin-binding protein by using phage display library. Mol. Cell. Biochem., 262 (1–2): 187–193. Larson G., Dobney K., Albarella U., Fang M., Matisoo-Smith E., Robins J., Lowden S., Finlayson H., Brand T., Willerslev E., Rowley-Conwy P., Andersson L., Cooper A., 2005: Worldwide phylogeography of wild boar reveals multiple centers of pig domestication. Science, 307 (5715): 1618–1621.

121

Lecker S.H., Jagoe R.T., Gilbert A., Gomes M., Baracos V., Bailey J., Price S.R., Mitch W.E., Goldberg A.L., 2004: Multiple types of skeletal muscle atrophy involve a common program of changes in gene expression. FASEB J., 18 (1), 39–51. Lee S. J., 2004: Regulation of muscle mass by myostatin. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 20: 61–86. Lee S. H., Joo S. T., Ryu Y. C., 2010: Skeletal muscle fiber type and myofibrillar proteins in relation to meat quality. Meat Sci., 86 (1): 166–170. Lefaucheur L., Edom F., Ecolan P., Butlerbrowne G. S., 1995: Pattern of muscle-fiber type formation in the pig. Dev. Dyn., 203 (1): 27–41. Lefaucheur L., Ecolan P., Plantard L., Gueguen N., 2002: New insights into muscle fiber types in the pig. J. Histochem. Cytochem., 50 (5): 719–730. Lefaucheur L., 2010: A second look into fibre typing – Relation to meat quality. Meat Sci., 84 (2): 257–270. Leung Y. F., Cavalieri D., 2003: Fundamentals of cDNA microarray data analysis. Trends Genet.,19 (11): 649–659. Leung J. K., Cases S., Vu T. H., 2008: P311 functions in an alternative pathway of lipid accumulation that is induced by retinoic acid. J. Cell. Sci., 121 (Pt 16): 2751–2758. Li W., Suh Y. J., Zhang J., 2006: Does logarithm transformation of microarray data affect ranking order of differentially expressed genes? Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc., Suppl: 6593–6596. Li X., Coffino P., 1992: Regulated degradation of ornithine decarboxylase requires interaction with the polyamine-inducible protein antizyme. Mol. Cell. Biol., 12 (8): 3556– 3562. Liu W., Saint D. A., 2002: Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics. Biochem. Biophys. Res. Commun., 294 (2): 347–353.

122

Livak K. J., Schmittgen T. D., 2001: Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 25 (4): 402–408. Lopez S., Stuhl L., Fichelson S., Dubart-Kupperschmitt A., St Arnaud R., Galindo J. R., Murati A., Berda N., Dubreuil P., Gomez S., 2005: NACA is a positive regulator of human erythroid-cell differentiation. J. Cell. Sci., 118 (Pt 8): 1595–1605. Lovren F., Pan Y., Quan A., Singh K. K., Shukla P. C., Gupta M., Al-Omran M., Teoh H. , Verma S., 2010: Adropin is a novel regulator of endothelial function. Circulation, 122 (11 Suppl): S185–192. Maguire B. A., Zimmermann R. A., 2001: The ribosome in focus. Cell, 104 (6): 813–816. Majewski J., Pastinen T., 2011: The study of eQTL variations by RNA-seq: from SNPs to phenotypes. Trends Genet., 27 (2): 72–79. Malaspina A., Kaushik N., de Belleroche J., 2000: A 14-3-3 mRNA is up-regulated in amyotrophic lateral sclerosis spinal cord. J. Neurochem., 75 (6): 2511–2520. Manduchi E., Scearce L. M., Brestelli J. E., Grant G. R., Kaestner K. H., Stoeckert C. J. Jr., 2002: Comparison of different labeling methods for two-channel high-density microarray experiments. Physiol. Genomics, 10 (3): 169–179. McCroskery S., Thomas M., Maxwell L., Sharma M., Kambadur R., 2003: Myostatin negatively regulates satellite cell activation and self-renewal. J. Cell Biol., 162 (6): 1135–1147. McPherron A. C., Lawler A. M., Lee S. J., 1997: Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature, 387 (6628): 83–90. Melander Y., Hansen-Melander E., 1980: Chromosome studies in African wild pigs (Suidae, Mammalia). Hereditas, 92 (2): 283–289.

123

Mengus G., Fadloun A., Kobi D., Thibault C., Perletti L., Michel I., Davidson I., 2005: TAF4 inactivation in embryonic fibroblasts activates TGF beta signalling and autocrine growth. EMBO J., 24 (15): 2753–2767. Menko A. S., Boettiger D., 1987: Occupation of the extracellular matrix receptor, integrin, is a control point for myogenic differentiation. Cell, 51 (1): 51–57. Merkerová M., Kráčmarová A., Bruchová H., Brdička R., 2006: Využití biočipových technologií v onkologii. Klinická onkologie, 19 (2): s. 333–337. Michalik L., Auwerx J., Berger J. P., Chatterjee V. K., Glass C. K., Gonzalez F. J., Grimaldi P. A., Kadowaki T., Lazar M. A., O'Rahilly S., Palmer C. N., Plutzky J., Reddy J. K., Spiegelman B. M., Staels B., Wahli W., 2006: International Union of Pharmacology. LXI. Peroxisome proliferator-activated receptors. Pharmacol. Rev., 58 (4): 726–741. Mikulka Š., 2007: Moji známí z divočiny - díl XVIII: "Prase divoké - černý rytíř". [cit. 2011-04-08]. Dostupné na: http://www.ordinaryangels.net/clanek.php?ID_Clanek=119. Miles M. F., Kerns R., 2003: Analysis and Interpretation of Microarray Data, s. 39–49. In: Williams R. W. (ed.), The Bioinformatics of Brains: From Genes and Proteins to Behaviors. DC: Society for Neuroscience, Washington, 92 s. Miller M. K., Bang M. L., Witt C. C., Labeit D., Trombitas C., Watanabe K., Granzier H., McElhinny A. S., Gregorio C. C., Labeit S., 2003: The muscle ankyrin repeat proteins: CARP, ankrd2/Arpp and DARP as a family of titin filament-based stress response molecules. J. Mol. Biol., 333 (5): 951–964. Mishra-Gorur K., Singer H. A., Castellot J. J. Jr., 2002: The S18 ribosomal protein is a putative substrate for Ca2+/calmodulin-activated protein kinase II. J. Biol. Chem., 277 (37): 33537–33540. Mok G. F., Sweetman D., 2011: Many routes to the same destination: lessons from skeletal muscle development. Reproduction, 141 (3): 301–312. Monroy-Contreras R., Vaca L., 2011: Molecular beacons: powerful tools for imaging RNA in living cells. J. Nucleic Acids, 2011: 741723. 124

Moran, 2011: Molecular Genetics, s. 73–100. In: Rothschild M. F., Ruvinsky A. (ed.), The Genetics of the Pig, 2nd Edition. CAB International, Wallingford, 507 s. Morrison D. K., 2009: The 14-3-3 proteins: integrators of diverse signaling cues that impact cell fate and cancer development. Trends Cell Biol., 19 (1): 16–23. Muller P. Y., Janovjak H., Miserez A. R., Dobbie Z., 2002: Processing of gene expression data generated by quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques, 32 (6): 1372– 1379. Müller E., Rutten M., Moser G., Reiner G., Bartenschlager H., Geldermann H., 2002: Fibre structure and metabolites in M. longissimus dorsi of Wild boar, Piétrain and Meishan pigs as well as their crossbred generations. J. Anim. Breed. Genet., 119 (2): 125– 137. Murray R. K., 2002: Sval, s. 698–716. In: Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., Rodwell V.W., Harperova biochemie. H & H, Praha, 871 s. Musick W. D. 1981: Structural features of the phosphoribosyltransferases and their relationship to the human deficiency disorders of purine and pyrimidine metabolism. CRC Crit. Rev. Biochem., 11 (1): 1–34. Musilova P., Kubickova S., Hornak M., Cernohorska H., Vahala J., Rubes J., 2010: Different fusion configurations of evolutionarily conserved segments in karyotypes of Potamochoerus porcus and Phacochoerus africanus. Cytogenet. Genome Res., 129 (4): 305–309. Nakada C., Tsukamoto Y., Oka A., Nonaka I., Takeda S., Sato K., Mori S., Ito H., Moriyama M., 2003: Cardiac-restricted ankyrin-repeated protein is differentially induced in duchenne and congenital muscular dystrophy. Lab. Invest., 83 (5): 711–719. Nakamura K., Nakada C., Takeuchi K., Osaki M., Shomori K., Kato S., Ohama E., Sato K., Fukayama M., Mori S., Ito H., Moriyama M., 2003: Altered expression of cardiac ankyrin repeat protein and its homologue, ankyrin repeat protein with PEST and proline-rich region, in atrophic muscles in amyotrophic lateral sclerosis. Pathobiology, 70 (4): 197–203.

125

Nishimoto S. , Nishida E., 2006: MAPK signalling: ERK5 versus ERK1/2. EMBO Rep., 7 (8): 782–786. Nogales-Cadenas R., Carmona-Saez P., Vazquez M., Vicente C., Yang X., Tirado F., Carazo J. M., Pascual-Montano A., 2009: GeneCodis: interpreting gene lists through enrichment analysis and integration of diverse biological information. Nucleic Acids Res., 37 (Web Server issue): W 317–322. Nygard A. B., Jørgensen C. B., Cirera S., Fredholm M., 2007: Selection of reference genes for gene expression studies in pig tissues using SYBR green qPCR. BMC Mol. Biol., 8: 67. Olson E. N., Sternberg E., Hu J. S., Spizz G., Wilcox C., 1986: Regulation of myogenic differentiation by type beta transforming growth factor. J. Cell Biol., 103 (5): 1799– 1805. Olwin B. B., Bren Mattison Y., Cornelison D. D. W., Fedorov Y. V., Flanagan-Steet H., Jones N. C., 2002: Role of cytokines in skeletal muscle growth and differentiation, s. 97–126. In: Sassoon D. A. (ed.), Stem cells and cell signalling in skeletal myogenesis. Elsevier , Amsterodam, 152 s. Ooi P.T., da Costa N., Edgar J., Chang K.C., 2006: Porcine congenital splayleg is characterised by muscle fibre atrophy associated with relative rise in MAFbx and fall in P311 expression. BMC Vet. Res., 25, 2:23. Osses N., Brandan E., 2002: ECM is required for skeletal muscle differentiation independently of muscle regulatory factor expression. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 282 (2): C383–394. Pan D., Zhe X., Jakkaraju S., Taylor G. A., Schuger L., 2002: P311 induces a TGFbeta1-independent, nonfibrogenic myofibroblast phenotype. J. Clin. Invest., 110 (9): 1349–1358. Pavlík E., Pavlíková A., 2004: Molekulárni biologické techniky pro mikrobiologickou diagnostiku - část 11. Labor Aktuell, 3: 10–13.

126

Pavlík T., Jarkovský J., 2006: Statistické metody v analýze dat z DNA mikročipů. Klinická onkologie, 19 (Suppl. 2): 365–368. Pfaffl M. W., Horgan G. W., Dempfle L., 2002: Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res., 30 (9): e36. Pfaffl M. W., 2004: Quantification strategies in real-time PCR, s. 87–112. In: Bustin S. A. (ed), A-Z of Quantitative PCR. International University Line, La Jolla, 910 s. Pfaffl M. W., Tichopad A., Prgomet C., Neuvians T. P., 2004: Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper--Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnol. Lett., 26 (6): 509–515. Pražák Č., Stibal J., 2010: Plemenné standardy a chovné cíle pro plemena prasat v plemenné knize. Svaz chovatelů prasat v Čechách a na Moravě [cit. 2011-03-05]. Dostupné na: www.schpcm.cz/slechteni/metodiky/02_plem_stan.pdf. Paliwal S., Shi J., Dhru U., Zhou Y., Schuger L., 2004: P311 binds to the latency associated protein and downregulates the expression of TGF-beta1 and TGF-beta2. Biochem. Biophys. Res. Commun., 315 (4): 1104–1109. Parsons J. T., Slack-Davis J., Tilghman R., Roberts W. G., 2008: Focal adhesion kinase: targeting adhesion signaling pathways for therapeutic intervention. Clin. Cancer Res., 14 (3): 627–632. Petit V., Thiery J. P., 2000: Focal adhesions: structure and dynamics. Biol. Cell, 92 (7): 477–494. Petřek, 2002: Hlavní histokompatibilní komplex člověka – základy teorie a praxe. [cit. 2011-11-22]. Dostupné na: http://www.medicina.cz/odborne/clanek.dss?s_id=4730. Popovici V., Goldstein D. R., Antonov J., Jaggi R., Delorenzi M., Wirapati P., 2009: Selecting control genes for RT-QPCR using public microarray data. BMC Bioinformatics, 10:42.

127

Qiagen, 2009: REST 2009 Software User Guide. Qaiaqen [cit. 2011-06-01]. Dostupné na: http://www.qiagen.com/Products/REST2009Software.aspx?r=8042#Tabs=t1. Qiagen, 2010: Critical Factors for Successful Real-Time PCR. Qaiaqen [cit. 2011-0513]. Dostupné na: http://www.qiagen.com/literature/render.aspx?id=23490. Qian J., Kluger Y., Yu H., Gerstein M., 2003: Identification and correction of spurious spatial correlations in microarray data. Biotechniques, 35 (1): 42–48. Ramakers C., Ruijter J. M., Deprez R. H., Moorman A. F., 2003: Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci. Lett., 339 (1): 62–66. Ramaswamy S., Golub T. R., 2002: DNA microarrays in clinical oncology. J. Clin. Oncol., 20 (7): 1932–1941. Ramírez O., Ojeda A., Tomàs A., Gallardo D., Huang L. S., Folch J. M., Clop A., Sánchez A., Badaoui B., Hanotte O., Galman-Omitogun O., Makuza S. M., Soto H., Cadillo J., Kelly L., Cho I. C., Yeghoyan S., Pérez-Enciso M., Amills M., 2009: Integrating Ychromosome, mitochondrial, and autosomal data to analyze the origin of pig breeds. Mol. Biol. Evol., 26 (9): 2061–2072. Rasmussen, R., 2001: Quantification on the LightCycler, s. 21–34. In: Meuer S., Wittwer C., Nakagawara K. (ed), Rapid cycle real-time PCR, methods and applications. Springer Press, Heidelberg, 200 s. Rehfeldt C., Fiedler I., Dietl G., Ender, K., 2000: Myogenesis and postnatal skeletal muscle cell growth as influenced by selection. Livest. Prod. Sci., 66 (2): 177–188. Rehfeldt C., Fiedler I., Stickland N. C., 2004: Number and Size of Muscle Fibres in Relation to Meat, s. 1–38. In: te Pas M. F. W., Everts M. E., Haagsman H. P., Muscle development of livestock animals: physiology, genetics, and meat quality. CABI Publishing, Wallingfrod, 428s. Rehfeldt C., Mau M., Wimmers K., 2010: Regulatory Aspects of Fetal Growth and Muscle Development Relating to Postnatal Growth and Carcass Quality in Pigs, s. 203–

128

244. In: Greenwood P. L., Bell A. W., Vercoe P. E., Viljoen G. J., Managing the Prenatal Environment to Enhance Livestock Productivity. Springer, Dordrecht, 300 s. Reimers M., 2010: Making informed choices about microarray data analysis. PLoS Comput. Biol., 6 (5): e1000786. Reiser P. J., Bicer S., 2006: Multiple isoforms of myosin light chain 1 in pig diaphragm slow fibers: correlation with maximal shortening velocity and force generation. Arch. Biochem. Biophys., 456 (2): 112–118. Reshef R., Maroto M., Lassar A. B., 1998: Regulation of dorsal somitic cell fates: BMPs and Noggin control the timing and pattern of myogenic regulator expression. Genes Dev., 12 (3): 290–303. Ritchie M. E., Silver J., Oshlack A., Holmes M., Diyagama D., Holloway A., Smyth G. K., 2007: A comparison of background correction methods for two-colour microarrays. Bioinformatics, 23 (20): 2700–2707. Roche, 2006: PCR Applications Manual - 3rd edition. Roche Applied Science [cit. 2011-05-15]. Dostupné na: http://www.roche-applied-science.com/publications/print_ mat/pcr_application_manual_3rd_edition.pdf. Rothschild M. F., Hu Z. L., Jiang Z., 2007: Advances in QTL mapping in pigs. Int. J. Biol. Sci., 3 (3):192–197. Ruijter J. M., Ramakers C., Hoogaars W. M., Karlen Y., Bakker O., van den Hoff M. J., Moorman A. F., 2009: Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res., 37 (6): e45. Rytina L., 2010: Šlechtění prasat se globalizuje. Agroweb [cit. 2011-03-05]. Dostupné na: http://www.agroweb.cz/zivocisna-vyroba/Slechteni-prasat-se-globalizuje__s45x456 11.html. Sadler T. W., 2010: Langmanova lékařská embryologie. Překlad 10. vydání. Grada, Praha, 432 s. Sambraus H. H., 2006: Atlas plemen hospodářských zvířat. Brázda, Praha, 296 s.

129

Sarbassov D. D., Ali S. M., Sabatini D. M., 2005: Growing roles for the mTOR pathway. Curr. Opin. Cell Biol., 17 (6): 596–603. Sauer U., Preininger C., Hany-Schmatzberger R., 2005: Quick and simple: quality control of microarray data. Bioinformatics, 21(8):1572–1578. Schmittgen T. D., Zakrajsek B. A., 2000: Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative RT-PCR. J. Biochem. Biophys. Methods, 46 (1-2): 69–81. Schrenzel J., Kostic T., Bodrossy L., Francois P., 2009: Introduction to MicroarrayBased Detection Methods, s 1–34. In: Kostic T., Butaye P., Schrenzel J. (ed), Detection of Highly Dangerous Pathogens: Microarray Methods for BSL 3 and BSL 4 Agents, Wiley-Blackwell, Weinheim,193s. Scielzo C., Ghia P., Conti A., Bachi A., Guida G., Geuna M., Alessio M., CaligarisCappio F., 2005: HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J. Clin. Invest., 115 (6):1644–1650. Seger R., Krebs E. G., 1995: The MAPK signaling cascade. FASEB J., 9 (9): 726–735. Sekaninová I., 2011: Spotřeba drůbežího masa roste. Vetweb [cit. 2011-03-05]. Dostupné na: http://www.vetweb.cz/Spotreba-drubeziho-masa-roste__s1501x55075. html. Sellheyer K., Belbin T. J., 2004: DNA microarrays: from structural genomics to functional genomics. The applications of gene chips in dermatology and dermatopathology. J. Am. Acad. Dermatol., 51 (5): 681–692. Shi X. W., Fitzsimmons C. J., Genêt C., Prather R., Whitworth K., Green J. A., Tuggle C. K., 2001: Radiation hybrid comparative mapping between human chromosome 17 and porcine chromosome 12 demonstrates conservation of gene order. Anim. Genet., 32 (4): 205–209. Shibukawa Y., Yamazaki N., Kumasawa K., Daimon E., Tajiri M., Okada Y., Ikawa M., Wada Y., 2010: Calponin 3 regulates actin cytoskeleton rearrangement in trophoblastic cell fusion. Mol. Biol. Cell, 21 (22): 3973–3984.

130

Shipley G. L., 2006: An introduction to real-time PCR, s. 1–37. In: Dorak M. T. (ed), Real-time PCR. Taylor & Francis Group, New York, 333 s. Shiu S. H., Borevitz J. O., 2008: The next generation of microarray research: applications in evolutionary and ecological genomics. Heredity, 100 (2): 141–149. Shyy W., Wang K., Sheffield V. C., Morcuende J. A., 2010: Evaluation of embryonic and perinatal myosin gene mutations and the etiology of congenital idiopathic clubfoot. J. Pediatr. Orthop., 30 (3): 231–234. Smits K., Goossens K., Van Soom A., Govaere J., Hoogewijs M., Vanhaesebrouck E., Galli C., Colleoni S., Vandesompele J., Peelman L., 2009: Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in equine in vivo and fresh and frozen-thawed in vitro blastocysts. BMC Res. Notes, 2: 246. Snustad D. P., Simmons M. J., Relichová, J., Doškař, J., Fajkus J., Hořín P., Knoll A., Kuglík P., Šmarda J., Šmardová J., Veselská R., Vyskot B., 2009: Genetika. Masarykova univerzita, Brno, 894 s. Spinsanti G., Panti C., Lazzeri E., Marsili L., Casini S., Frati F., Fossi C. M., 2006: Selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies in striped dolphin (Stenella coeruleoalba) skin biopsies. BMC Mol. Biol., 7:32. Staal F. J, Luis T. C., Tiemessen M. M., 2008: WNT signalling in the immune system: WNT is spreading its wings. Nat. Rev. Immunol., 8 (8): 581–593. Stears R. L., Martinsky T., Schena M., 2003: Trends in microarray analysis. Nat. Med., 9 (1): 140–145. Steinhauser L. (ed.), 1995: Hygiena a technologie masa. LAST, Brno, 664 s. Stibal J., Jelínková V., 2010: Ročenka 2009. Vydavatelství Houška, Praha, 48s. Su D. M., Zhang Q., Wang X., He P., Zhu Y. J., Zhao J., Rennert O. M., Su Y. A., 2009: Two types of human malignant melanoma cell lines revealed by expression patterns of mitochondrial and survival-apoptosis genes: implications for malignant melanoma therapy. Mol. Cancer Ther., 8 (5): 1292–1304.

131

Svestak M., Sporova L., Hejduk P., Lacnak B., Stejskal D., 2010: Collagenous repeatcontaining sequence of 26 kDa protein - a newly discovered adipokine - sensu lato A minireview. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub., 154 (3): 199–202. Svobodová K., Bílek K., Knoll A., 2008: Verification of reference genes for relative quantification of gene expression by real-time reverse transcription PCR in the pig. J. Appl. Genet., 49 (3): 263–265. Šmarda J., Doškař J., Pantůček R., Růžičková V., Koptíková J., 2008: Metody molekulární biologie. Masarykova univerzita, Brno, 188 s. Tan W., Fang X., Li J., Liu X., 2000: Molecular beacons: a novel DNA probe for nucleic acid and protein studies. Chemistry, 6 (7): 1107–1111. Taylor G. A., Hudson E., Resau J. H., Vande Woude G. F., 2000: Regulation of P311 expression by Met-hepatocyte growth factor/scatter factor and the ubiquitin/proteasome system. J. Biol. Chem., 275 (6): 4215–4219. Teufel A. , Krupp M. , Weinmann A. , Galle P. R., 2006: Current bioinformatics tools in genomic biomedical research (Review). Int. J. Mol. Med., 17 (6): 967–973. Thorrez L., Van Deun K., Tranchevent L. C., Van Lommel L., Engelen K., Marchal K., Moreau Y., Van Mechelen I., Schuit F., 2008: Using ribosomal protein genes as reference: a tale of caution. PLoS One, 3 (3): e1854. Townsend P. J., Barton P. J., Yacoub M. H., Farza H., 1995: Molecular cloning of human cardiac troponin T isoforms: expression in developing and failing heart. J. Mol. Cell. Cardiol., 27 (10): 2223–2236. Trevino V., Falciani F., Barrera-Saldana H. A., 2007: DNA microarrays: a powerful genomic tool for biomedical and clinical research. Mol. Med.,13 (9-10): 527–541. Tsai S., Cassady J. P., Freking B. A., Nonneman D. J., Rohrer G. A., Piedrahita J. A., 2006: Annotation of the Affymetrix porcine genome microarray. Anim. Genet., 37 (4): 423–424.

132

Turner C. E., 2000: Paxillin and focal adhesion signalling. Nat. Cell Biol., 2 (12): E231– E236. Tzahor E., Kempf H., Mootoosamy R. C., Poon A. C., Abzhanov A., Tabin C. J., Dietrich S., Lassar A. B., 2003: Antagonists of Wnt and BMP signaling promote the formation of vertebrate head muscle. Genes Dev., 17 (24): 3087–3099. Tzivion G., Gupta V. S., Kaplun L., Balan V., 2006: 14-3-3 proteins as potential oncogenes. Semin. Cancer Biol., 16 (3): 203–213. Valente V., Teixeira S. A., Neder L., Okamoto O. K., Oba-Shinjo S. M., Marie S. K., Scrideli C. A., Paçó-Larson M. L., Carlotti C. G. Jr., 2009: Selection of suitable housekeeping genes for expression analysis in glioblastoma using quantitative RT-PCR. BMC Mol. Biol., 10: 17. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A., Speleman F., 2002: Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol., 3 (7): RESEARCH0034. Velleman S. G., 2012: Extracellular matrix regulation of skeletal muscle formation. J. Anim. Sci., 90(3):936–941. Verrijzer C. P., Tjian R., 1996: TAFs mediate transcriptional activation and promoter selectivity. Trends Biochem. Sci., 21 (9): 338–342. Veugelers M., Bressan M., McDermott D. A., Weremowicz S., Morton C. C., Mabry C. C., Lefaivre J. F., Zunamon A., Destree A., Chaudron J. M., Basson C. T., 2004: Mutation of perinatal myosin heavy chain associated with a Carney complex variant. N. Engl. J. Med., 351 (5): 460–469. Vicencio J. M., Estrada M., Galvis D., Bravo R., Contreras A. E., Rotter D., Szabadkai G., Hill J. A., Rothermel B. A., Jaimovich E., Lavandero S., 2011: Anabolic androgenic steroids and intracellular calcium signaling: a mini review on mechanisms and physiological implications. Mini Rev. Med. Chem., 11 (5): 390–398.

133

Vykoukalová Z., Knoll A., Čepica S., 2009: Porcine perilipin (PLIN) gene: Structure, polymorphism and association study in Large White pigs. Czech J. Anim. Sci., 54 (8): 359–364. Wang H., Noulet F., Edom-Vovard F., Tozer S., Le Grand F., Duprez D., 2010: Bmp signaling at the tips of skeletal muscles regulates the number of fetal muscle progenitors and satellite cells during development. Dev. Cell., 18 (4): 643–654. Weiler U., Appell H. J., Kremser M., Hofacker S., Claus R., 1995: Consequences of selection on muscle composition. A comparative study on gracilis muscle in wild and domestic pigs. Anat. Histol. Embryol., 24 (2): 77–80. Wiedmann B., Sakai H., Davis T. A., Wiedmann M., 1994: A protein complex required for signal-sequence-specific sorting and translocation. Nature, 370 (6489): 434–40. Willmer P., Stone G., Johnston I., 2005: Environmental Physiology of Animals. Blackwell Publishing, Malden, 754 s. Wong M. L., Medrano J. F., 2005: Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1): 75–85. Wu K. C., Jin J. P., 2008: Calponin in non-muscle cells. Cell Biochem. Biophys., 52 (3): 139–148. Xiang C. C., Chen Y., 2000: cDNA microarray technology and its applications. Biotechnol. Adv.,18 (1): 35–46. Yamanashi Y., Okada M., Semba T., Yamori T., Umemori H., Tsunasawa S., Toyoshima K., Kitamura D., Watanabe T., Yamamoto T., 1993: Identification of HS1 protein as a major substrate of protein-tyrosine kinase(s) upon B-cell antigen receptor-mediated signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 90 (8): 3631–3635. Yanagisawa M., Nakashima K., Takeda K., Ochiai W., Takizawa T., Ueno M., Takizawa M., Shibuya H., Taga T., 2001: Inhibition of BMP2-induced, TAK1 kinasemediated neurite outgrowth by Smad6 and Smad7. Genes Cells, 6 (12): 1091–1099.

134

Yokoyama S., Asahara H., 2011: The myogenic transcriptional network. Cell. Mol. Life Sci., 68 (11): 1843–1849. Yotov W. V, Moreau A., St-Arnaud R., 1998: The alpha chain of the nascent polypeptide-associated complex functions as a transcriptional coactivator. Mol. Cell. Biol., 18 (3): 1303–1311. Zhang A., 2006: Advanced analysis of gene expression microarray data. World Scientific, Singapore, 339s. Zheng Q., Wang X. J., 2008: GOEAST: a web-based software toolkit for Gene Ontology enrichment analysis. Nucleic Acids Res., 36 (Web Server issue): W358–63. Zolk O., Frohme M., Maurer A., Kluxen F. W., Hentsch B., Zubakov D., Hoheisel J. D., Zucker I. H., Pepe S., Eschenhagen T., 2002: Cardiac ankyrin repeat protein, a negative regulator of cardiac gene expression, is augmented in human heart failure. Biochem. Biophys. Res. Commun., 293 (5): 1377–1382. Zolk O., Marx M., Jäckel E., El-Armouche A., Eschenhagen T., 2003: Beta-adrenergic stimulation induces cardiac ankyrin repeat protein expression: involvement of protein kinase A and calmodulin-dependent kinase. Cardiovasc. Res., 59 (3): 563–572.

135

8 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1: Struktura kosterního svalu. Obr. 2: Schematické znázornění vzniku kosterní svaloviny. Obr. 3: Úloha myogenních regulačních faktorů (MRF) v myogenezi. Obr. 4: Regulačních dráhy kontrolující vznik a vývoje specifické svalové tkáně obratlovců. Obr. 5: Schematické znázornění molekulární regulace satelitních buněk v průběhu regenerace kosterní svalové tkáně. Obr. 6: Regulace myogeneze kosterní svaloviny růstovými faktory. Obr 7: Biogeneze a funkce miRNA. Obr. 8: Prase divoké. Obr. 9: Diverzita a fylogenetické vztahy mezi druhy prasat. Obr. 10: České bílé ušlechtilé plemeno prasat. Obr. 11: Typická amplifikační křivka vznikající při real-time PCR reakci. Obr. 12.: Princip detekce PCR produktů v průběhu real-time PCR reakce pomocí SYBR Green I barviva (A), TaqMan (B) a FRET sond (C). Obr. 13: Molekulární majáková sonda. Obr. 14.: Princip detekce PCR produktů v průběhu real-time PCR reakce pomocí Scorpions (A), LUX (B) a Sunrise primerů (C). Obr. 15.: Typická kalibrační přímka zobrazující princip stanovení koncentrace analyzovaného vzorku. Obr. 16: Princip amplifikace mRNA. Obr. 17: Vazba dendrimerních komplexů k molekule nukleové kyseliny. Obr. 18: Histogram intenzit mikročipových dat před (A) a po (B) log transformaci. Obr. 19: Nejčastěji užívané vizualizační nástroje microarray analýzy pro interpretaci výsledků z experimentu. Obr. 20: Krabicové grafy microarray dat před a po kvantilové normalizaci. Obr. 21: Princip Affymetrix GeneChip mikročipů. Obr. 22: Ověření specifity PCR produktů pomocí gelové elektroforézy. Obr. 23: Stanovení optimálního počtu referenčních genů pro normalizaci real-time PCR dat. Obr. 24: Počet GO termínů generovaných vybranými webovými aplikacemi pro anotaci dat z microarray experimentu. 136

Obr. 25: Krabicový graf (tzv. graf vousatých krabiček) výsledků stanovení exprese studovaných genů pomocí programu REST 2009 ve svalu m. longissimus dorsi. Obr. 26: Krabicový graf (tzv. graf vousatých krabiček) výsledků stanovení exprese studovaných genů pomocí programu REST 2009 ve svalu m. biceps femoris. Obr. 27: Porovnání výsledků kvantitativní real-time PCR(Q) a microarray (M) analýzy genové exprese vybraných genů v kosterní svalové tkáni prasat. Obr.28: Výsledky real-time PCR analýzy C5orf13 genu v kosterní svalové tkáni českého bílého ušlechtilého a divokého prasete (program DataAssist; Applied Biosystems). Obr. 29: Výsledný produkt amplifikace PCR produktů určených k sekvenování pomocí primerů C5orf13_DNA_F2 a C5orf13_DNA_R2. Obr. 30: Gelová elektroforéza zobrazující polymorfizmus c.129C>T v genu C5orf13 po štěpení PCR produktu pomocí restrikčního enzymu DdeI.

137

9 SEZNAM TABULEK Tab. 1: Složení vepřového masa. Tab. 2: Typy vláken kosterního svalu. Tab. 3: Vlastní užitkovost českého bílého ušlechtilého plemene prasat v roce 2009 – polní test. Tab. 4: Symbol, název a číslo v databázi GenBank vybraných kandidátních referenčních genů. Tab. 5: Sekvence primerů pro real-time PCR analýzu vybraných referenčních genů. Tab. 6: Symbol, název a číslo v databázi GenBank nebo Ensembl vybraných analyzovaných genů pomocí kvantitativní real-time PCR. Tab. 7: Sekvence primerů pro kvantitativní real-time PCR analýzu vybraných genů. Tab. 8: Informace o primerech použitých k PCR amplifikaci vybraných úseků C5orf13 genu. Tab. 9: Detailní výsledky real-time PCR analýzy. Tab. 10: Stabilita exprese analyzovaných referenčních genů vyhodnocená pomocí programu geNorm. Tab. 11: Rozdíl mezi expresí genů zapojených v TGF–ß signální dráze. Tab. 12: Rozdíl mezi expresí genů zapojených v MAPK signální dráze. Tab. 13: Rozdíl mezi expresí genů zapojených ve Wnt signální dráze. Tab. 14 : Rozdíl mezi expresí genů zapojených v kalciové signální dráze. Tab. 15: Rozdíl mezi expresí genů zapojených signální dráze interakcí ECM a receptoru. Tab. 16: Rozdíl mezi expresí genů zapojených v mTOR signální dráze. Tab. 17.: Rozdíl mezi expresí genů zapojených signální dráze fokální adheze. Tab. 18: Výsledky analýzy genové exprese studovaných genů pomocí programu REST 2009 Software. Tab. 19: Výsledky microarray analýzy genů, které byly validovány pomocí real-time PCR metody. Tab. 20: Frekvence alel a genotypů čtyř lokusů genu C5orf13 u tří různých chovů prasat českého bílého ušlechtilého plemene. Tab. 21: Asociační analýza nalezených polymorfizmů v genu C5orf13 a znaky masné užitkovosti v chovu číslo 1 a 2.

138

Tab. 22: Asociační analýza nalezených polymorfizmů v genu C5orf13 a znaky masné užitkovosti v chovu číslo 3.

139

PŘÍLOHY

140

SEZNAM PŘÍLOH Příloha 1: Křivky tání genů 1) HPRT1, 2) RPS18, 3) NACA, 4) TBP, 5) TAF4B, 6) RPL32 a 7) OAZ1. Příloha 2: Stanovení stability genové exprese analyzovaných referenčních genů pomocí geNorm programu. Příloha 3: Seznam prvních osmi nejpočetnějších skupin GO termínů popisující biologické procesy a počet genů v každé skupině. Příloha 4: Seznam prvních osmi nejpočetnějších skupin GO termínů popisující molekulární funkce a počet genů v každé skupině. Příloha 5: Seznam prvních osmi nejpočetnějších skupin GO termínů popisující buněčné komponenty a počet genů v každé skupině. Příloha 6: Sloupcový graf zobrazující GO termíny, které byly generovány aplikací agriGo. Příloha 7: Sloupcový graf zobrazující GO termíny popisující biologické procesy, které byly generovány aplikací GOEAST. Příloha 8: Sloupcový graf zobrazující GO termíny popisující molekulární funkce, které byly generovány aplikací GOEAST. Příloha 9: Sloupcový graf zobrazující GO termíny popisující buněčné komponenty, které byly generovány aplikací GOEAST. Příloha 10: Sloupcový graf zobrazující KEGG PATHWAY, které byly generovány aplikací GOEAST. Příloha 11: Grafické zobrazení GO termínů popisující biologické procesy dle aplikace GOEAST. Příloha 12: Část grafického zobrazení GO termínů popisující molekulární funkce dle aplikace GOEAST. Příloha 13: Část grafického zobrazení GO termínů popisující buněčné komponenty dle aplikace GOEAST. Příloha 14: Seznam genů, jejichž funkce souvisí s kosterní svalovou tkání, jejím vývojem, růstem a nebo regenerací dle aplikace agriGo. Příloha 15: Seznam genů, jejichž funkce souvisí s kosterní svalovou tkání, jejím vývojem, růstem a nebo regenerací dle aplikace DAVID (ID Affymetrix Human prób).

141

Příloha 16: Seznam genů, jejichž funkce souvisí s kosterní svalovou tkání, jejím vývojem, růstem a nebo regenerací dle aplikace Genecodis. Příloha 17: Seznam genů, jejichž funkce souvisí s kosterní svalovou tkání, jejím vývojem, růstem a nebo regenerací dle aplikace GOEAST (ID Affymetrix Human prób). Příloha 18: Seznam genů, jejichž funkce souvisí s kosterní svalovou tkání, jejím vývojem, růstem a nebo regenerací dle aplikace DAVID s GOEAST (ID Affymetrix Porcine prób). Příloha 19: TGF–ß signální dráha dle aplikace KEGG pathway. Příloha 20: MAPK signální dráha dle aplikace KEGG pathway. Příloha 21: Wnt signální dráha dle aplikace KEGG pathway. Příloha 22: Kalciová signální dráha dle aplikace KEGG pathway. Příloha 23: Signální dráha interakcí ECM a receptoru dle aplikace KEGG pathway. Příloha 24: Signální dráha mTOR dle aplikace KEGG pathway. Příloha 25: Signální dráha fokální adheze dle aplikace KEGG pathway. Příloha 26: Detailní výsledky real-time PCR analýzy. Příloha 27: Křivky tání genů 1) ANKRD1, 2) C1QTNF3, 3) C5orf13, 4) CNN3, 5) ENHO, 6) MLC1SA, 7) GDF8, 8) POSTN, 9) TNNT2, 10) YWHAQ, 11) HLA–DRB4, 12) IGF2 a 13) MYH8.

142

Příloha 1: Křivky tání genů 1) HPRT1, 2) RPS18, 3) NACA, 4) TBP, 5) TAF4B, 6) RPL32 a 7) OAZ1. cDNA použitá pro tuto analýzu byla ze svalové tkáně dospělých prasat.

143

Average expression stability M

Average expression stability values of remaining control genes 0,9 0,8 0,7

Řada1

plod

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 TAF4B

HPRT1

TBP

NACA

<::::: Least stable genes

OAZ1

RPS18/RPL32

Most stable genes ::::>

Average expression stability M

Average expression stability values of remaining control genes 1 0,9 0,8

seleŘada1

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 NACA

RPL32

OAZ1

<::::: Least stable genes

TBP

RPS18

HPRT1/TAF4B

Most stable genes ::::>

Average expression stability M

Average expression stability values of remaining control genes

dospělé Řada1 prase

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 TAF4B

NACA

TBP

<::::: Least stable genes

OAZ1

RPL32

HPRT1/RPS18

Most stable genes ::::>

Příloha 2: Stanovení stability genové exprese analyzovaných referenčních genů pomocí geNorm programu.

144

Příloha 3: Seznam prvních osmi nejpočetnějších skupin GO termínů popisující biologické procesy a počet genů v každé skupině. Biologický proces

Počet

GO

cellular process

111

0009987

metabolic process

82

0008152

primary metabolic process

71

0044238

cellular metabolic process

65

0044237

biological regulation

62

0065007

regulation of biological process

58

0050789

macromolecule metabolic process

54

0043170

regulation of cellular process

47

0050794

intracellular signaling cascade

46

0035556

response to wounding

40

0009611

regulation of cell proliferation

39

0042127

biological adhesion

36

0022610

DAVID

cell adhesion

36

0007155

(ID Affymetrix Human)

response to organic substance

36

0010033

regulation of apoptosis

34

0042981

regulation of programmed cell death

34

0043067

oxidation reduction

12

0055114

regulation of cellular component size

4

0032535

positive regulation of apoptosis

3

0043065

positive regulation of cell death

3

0010942

DAVID

positive regulation of cell proliferation

3

0008284

(ID Affymetrix Porcine)

positive regulation of programmed cell death

3

0043068

growth

3

0040007

amine biosynthetic process

3

0009309

signal transduction

49

0007165

cell adhesion

29

0007155

multicellular organismal development

26

0007275

cell differentiation

22

0030154

response to drug

21

0042493

negative regulation of cell proliferation

20

0008285

blood coagulation

19

0007596

transport

18

0006810

cellular process

280

0009987

GOEAST

regulation of biological process

191

0050789

(ID Affymetrix Human)

145

Aplikace

AgriGO

Genecodis

response to stimulus

173

0050896

multicellular organismal process

155

0032501

developmental process

137

0032502

multicellular organismal development

131

0007275

anatomical structure development

128

0048856

system development

117

0048731

cellular process

68

0009987

cellular component organization

19

0016043

cellular component organization or biogenesis

19

0071840

metabolic process

54

0008152

GOEAST

response to stress

22

0006950

(ID Affymetrix Porcine)

response to stimulus

39

0050896

protein metabolic process

26

0019538

response to wounding

10

0009611

146

Příloha 4: Seznam prvních osmi nejpočetnějších skupin GO termínů popisující molekulární funkce a počet genů v každé skupině. Molekulární funkce

Počet

GO

binding

111

0005488

protein binding

76

0005515

catalytic activity

70

0003824

hydrolase activity

31

0016787

cation binding

25

0043169

ion binding

25

0043167

metal ion binding

23

0046872

nucleotide binding

22

0000166

calcium ion binding

37

0005509

identical protein binding

28

0042802

cytoskeletal protein binding

27

0008092

structural molecule activity

27

0005198

DAVID

carbohydrate binding

24

0030246

(ID Affymetrix Human)

protein dimerization activity

24

0046983

actin binding

22

0003779

polysaccharide binding

21

0030247

growth factor activity

6

008083

protein binding

124

0005515

metal ion binding

62

0046872

nucleotide binding

46

0000166

ATP binding

36

0005524

calcium ion binding

33

0005509

binding

29

0005488

hydrolase activity

25

0016787

oxidoreductase activity

23

0016491

binding

307

0005488

protein binding

241

0005515

catalytic activity

146

0003824

receptor binding

44

0005102

GOEAST

structural molecule activity

30

0005198

(ID Affymetrix Human)

growth factor binding

22

0019838

carbohydrate binding

22

0030246

cofactor binding

20

0048037

147

Aplikace

AgriGO

DAVID (ID Affymetrix Porcine)

Genecodis

binding

90

0005488

protein binding

61

0005515

GOEAST

receptor binding

20

0005102

(ID Affymetrix Porcine)

growth factor activity

7

0008083

148

Příloha 5: Seznam prvních osmi nejpočetnějších skupin GO termínů popisující buněčné komponenty a počet genů v každé skupině. Buněčná komponenta

Počet

GO

cell part

134

0044464

cell

134

0005623

intracellular part

105

0044424

intracellular

105

0005622

cytoplasm

89

0005737

intracellular organelle

88

0043229

organelle

88

0043226

cell part

134

0044464

extracellular region

96

0005576

extracellular region part

54

0044421

cytoskeleton

45

0005856

mitochondrion

44

0005739

DAVID

extracellular matrix

36

0031012

(ID Affymetrix Human)

proteinaceous extracellular matrix

31

0005578

extracellular space

29

005615

mitochondrial part

27

0044429

lysosome

4

0005764

lytic vacuole

4

0000323

12

0043232

non-membrane-bounded organelle

12

0043228

vacuole

4

0005773

peroxisome

3

0005777

microbody

3

0042579

cytoskeleton

7

0005856

cytoplasm

128

0005737

membrane

101

0016020

extracellular region

94

0005576

integral to membrane

85

0016021

plasma membrane

84

0005886

cytosol

62

0005829

mitochondrion

52

0005739

extracellular space

41

0005615

cytoplasmic part

156

0044444

intracellular non-membrane-bounded organelle

149

Aplikace

AgriGO

DAVID (ID Affymetrix Porcine)

Genecodis

GOEAST

extracellular region

94

0005576

extracellular region part

62

0044421

mitochondrion

46

0005739

extracellular space

39

0005615

extracellular matrix

37

0031012

proteinaceous extracellular matrix

28

0005578

cytoplasmic vesicle part

19

0044433

extracellular region

30

0005576

extracellular region part

21

0044421

extracellular space

15

0005615

GOEAST

lytic vacuole

7

0000323

(ID Affymetrix Porcine)

lysosome

7

0005764

vacuole

7

0005773

(ID Affymetrix Human)

Příloha 6: Sloupcový graf zobrazující GO termíny, které byly generovány aplikací AgriGo.

150

Příloha 7: Sloupcový graf zobrazující GO termíny popisující biologické procesy, které byly generovány aplikací GOEAST.

151

Příloha 8: Sloupcový graf zobrazující GO termíny popisující molekulární funkce, které byly generovány aplikací GOEAST.

152

Příloha 9: Sloupcový graf zobrazující GO termíny popisující buněčné komponenty, které byly generovány aplikací GOEAST.

153

Příloha 10: Sloupcový graf zobrazující KEGG PATHWAY, které byly generovány aplikací GOEAST.

154

Příloha 11: Grafické zobrazení GO termínů popisující biologické procesy dle aplikace GOEAST.

155

Příloha 12: Část grafického zobrazení GO termínů popisující molekulární funkce dle aplikace GOEAST.

156

Příloha 13: Část grafického zobrazení GO termínů popisující buněčné komponenty dle aplikace GOEAST.

157

Příloha 14: Seznam genů, jejichž funkce souvisí s kosterní svalovou tkání, jejím vývojem, růstem a nebo regenerací dle aplikace agriGo. Červenou barvou jsou označeny geny, které byly nalezeny i v dalších z užitých aplikací.

X

X

4

CSRP2

X

X

X

5

SORT1

X

X

X

6

TGFB2

X

7

SGCD

X

8

MLC1SA

X

X

9

IGFBP5

X

X

10

TNNI3

X

11

CDLC2

X

12

IGF2

X

X

13

IGF1

X

X

14

GDF8

X

X

15

CCNB1

X

16

DLC1

X

17

CXCL12

X

18

NDUFS3

X

X

X

19

DAB2

X

X

X

20

TKT

X

X

21

ENO1

X

X

X

22

BBS2

X

X

X

23

IL18

X

24

VEGF

X

25

IGFBP7

X

26

EMP3

X

X

X X

X X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X X

X

X

X

X

X

X

X

X

X X

X

X X

X

158

X

X

X

X

X

X X

X

X

X

X

lopment

TNNT2

X

X

Striated muscle tissue deve-

3

X

Negative regulation of

X

Muscle system process

Muscle organ development

X

Growth factor activity

BTG2

lopment

2

Regulation of growth

X

Growth

X

lopment

ACTC

agriGO 1

Název genu

growth

Myofibril

Skeletal muscle organ deve-

X

Muscle tissue development

X

Muscle cell differentiation

Skeletal muscle tissue deve-

GO

27

DTR

X

28

MDK

X

29

MYH3

30

TAGLN3

31

MYH8

32

DTNBP1

33

CLIC1

X

X

X

X X

X

X

X X

X X X

159

Příloha 15: Seznam genů, jejichž funkce souvisí s kosterní svalovou tkání, jejím vývojem, růstem a nebo regenerací dle aplikace DAVID (ID Affymetrix Human prób). Červenou barvou jsou označeny geny, které byly nalezeny i v dalších z užitých aplikací.

COL6A3

X

6

CSRP2

X

7

DTR

X

X

8

IGF1

X

9

MYH3

X

10

MLC1SA

X

11

GDF8

X

12

DSCR1

X

13

TGFB2

X

14

TAGLN2

X

15

TNNT2

X

X

16

CMYA1

X

X

17

CD44

X

18

HOP

X

19

PRSS11

X

20

DAB2

X

21

DCBLD2

X

22

ENPP1

X

23

P09565

X

X

X

24

IGF2

X

X

X

25

IGFBP7

X

26

MAP1B

X

signaling pathway

5

Regulation of insulin receptor

X

mental growth

CHODL

Positive regulation of develop-

4

Muscle adaptation

X

Skeletal muscle regeneration

ACTC

signaling pathway

3

Regulation of TGF–ß receptor

X

Muscle cell differentiation

TIPARP

thway

2

TGF–ß receptor signaling pa-

X

MAPKKK cascade

AEBP1

Growth

1

Regulation of growth

Název genu

Muscle organ development

(ID Affymetrix Human)

DAVID

GO

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X X

X

X

X X

X

X

160

27

TKT

X

28

TN-

X

X

FRSF12A 29

CCNB1

X

30

DCAMKL1

X

31

EMP3

X

32

FGFR1

X

33

PLAU

X

34

SERPINE1

X

35

TGFB3

X

36

SMAD1

37

CCL2

X

38

COL1A2

X

39

COL3A1

X

40

PTPRK

X

41

MDFIC

X

42

DUSP10

X

43

DUSP16

X

44

MAP3K5

X

45

RET

X

46

THBS1

X

47

SORT1

48

C5orf13

X

49

CDKN1C

X

50

Q86TG7

X

51

CYBA

X

52

HMOX1

X

53

GRB14

X X X

X

X

X

X

X X

X

161

Příloha 16: Seznam genů, jejichž funkce souvisí s kosterní svalovou tkání, jejím vývojem, růstem a nebo regenerací dle aplikace Genecodis. Červenou barvou jsou označeny geny, které byly nalezeny i dalších z užitých aplikací.

1

COL6A3

X

2

DTR

X

3

MYH3

X

4

AEBP1

X

5

TAGLN2

X

6

GDF8

X

7

IGF1

X

8

CHODL

X

9

TNNT2

X

10

MYH8

X

X

11

MLC1SA

X

X

12

ACTC

X

13

PLAU

X

14

GJA1

X

15

KCNIP2

X

16

MYLK

X

17

COL1A2

X

18

PTPRK

X

19

TGFB3

X

20

COL3A1

X

21

CCL2

X

22

TGFB2

X

23

SMAD1

X

24

PRSS11

X

25

ASPN

X

26

Q86TG7

X

X

X

X

X

162

X

ß receptor signaling pa-

Positive regulation of TGF–

TGF–ß receptor signaling

Negative regulation of

pathway

TGF–ß receptor signaling

Muscle contraction

neration

Skeletal muscle tissue rege-

Muscle filament sliding

Název genu

Muscle organ development

Genecodis

GO

27

CDKN1C

X

28

Q6UXI9

X

29

THBS1

X

163

Příloha 17: Seznam genů, jejichž funkce souvisí s kosterní svalovou tkání, jejím vývojem, růstem a nebo regenerací dle aplikace GOEAST (ID Affymetrix Human prób). Červenou barvou jsou označeny geny, které byly nalezeny i dalších z užitých aplikací.

X

TGFB2

X

2

TKT

X

3

CD44

X

4

HBEGF

X

5

IGFBP7

X

6

TLR2

X

7

TNFRSF12A

X

X

8

IGF2

X

X

9

FGFR1

X

10

RRAD

X

11

DAB2

X

12

GDF8

X

13

HTRA1

X

14

ENPP1

X

15

MYD88

X

16

DCBLD2

X

17

CSRP2

X

18

SORT1

X

19

IGF1

20

AEBP1

X

21

COL6A3

X

22

TAGLN2

X

23

ACTC

24

X

X

X

X

X X

X

X

X

X X X

X

X X

X

X

X

X

TNNT2

X

X

X

25

MYL6B

X

X

X

26

RCAN1

X

X

164

X X

X

X

X

signaling pathway

Regulation of IGF receptor

Muscle hypertrophy

ation

Skeletal muscle cell differenti-

ration

Skeletal muscle tissue regene-

signaling pathway

Regulation of TGF–ß receptor

MAPKKK cascade

Positive regulation of

Positive regulation of growth

thway

1

X

X

TGF–ß receptor signaling pa-

Muscle tissue development

Muscle system process

Muscle organ development

Název genu

Regulation of growth

(ID Affymetrix Human

GOEAST

GO

27

CHODL

X

28

MYH3

X

29

HMOX1

X

30

CYBA

X

31

KCNIP2

X

32

MYH8

X

33

EDNRB

X

34

GUCY1A3

X

35

GJA1

X

36

TIPARP

37

COL3A1

X

38

SMAD1

X

39

PTPRK

X

40

COL1A2

X

41

TGFB3

X

42

CCL2

X

43

CD44

44

PEG10

X

45

C5orf13

X

46

RUNX1

X

47

CDKN1C

X

48

THBS1

X

49

PLAU

50

ATXN1

X

X

X X

X X

165

Příloha 18: Seznam genů, jejichž funkce souvisí s kosterní svalovou tkání, jejím vývojem, růstem a nebo regenerací dle aplikace DAVID s GOEAST (ID Affymetrix Porcine prób). Červenou barvou jsou označeny geny, které byly nalezeny i dalších z užitých aplikací.

1

growth factor activity 3

genu

growth 2

Název

growth factor activity 1

GO

1

IGF1

X

X

2

HBEGF

X

X

3

MDK

X

4

TGFB3

X

X

X

5

GDF8

X

X

X

6

TGFB2

X

X

X

7

IGF2

X

X

GOEAST

2, 3

DAVID

166

Příloha 19: TGF–ß signální dráha dle aplikace KEGG pathway. Červeně jsou vyznačeny diferenciálně exprimované geny z našeho seznamu analyzovaných genů.

167

Příloha 20: MAPK signální dráha dle aplikace KEGG pathway. Červeně jsou vyznačeny diferenciálně exprimované geny z našeho seznamu analyzovaných genů.

168

Příloha 21: Wnt signální dráha dle aplikace KEGG pathway. Červeně jsou vyznačeny diferenciálně exprimované geny z našeho seznamu analyzovaných genů.

169

Příloha 22: Kalciová signální dráha dle aplikace KEGG pathway. Červeně jsou vyznačeny diferenciálně exprimované geny z našeho seznamu analyzovaných genů.

170

Příloha 23: Signální dráha interakcí ECM a receptoru dle aplikace KEGG pathway. Červeně jsou vyznačeny diferenciálně exprimované geny z našeho seznamu analyzovaných genů.

171

Příloha 24: Signální dráha mTOR dle aplikace KEGG pathway. Červeně jsou vyznačeny diferenciálně exprimované geny z našeho seznamu analyzovaných genů.

172

Příloha 25: Signální dráha fokální adheze dle aplikace KEGG pathway. Červeně jsou vyznačeny diferenciálně exprimované geny z našeho seznamu analyzovaných genů.

173

Příloha 26: Detailní výsledky real-time PCR analýzy. Gen

R2

Průměrná CT

Průměrná CT

Efektivita

hodnota

hodnota

reakce (%)

(m. b. femoris)

(m. l. dorsi)

ANKRD1

0,998

20,018

18,869

103,532

C1QTNF3

0,999

24,671

25,099

81,816

C5orf13

0,999

21,053

20,613

93,244

CNN3

0,996

23,306

24,323

109,479

ENHO

0,996

20,423

19,500

103,14

GDF8

0,996

28,053

27,375

108,713

POSTN

0,994

26,796

27,268

97,229

TNNT2

0,998

22,763

21,335

104,283

YWHAQ

0,998

24,613

23,873

103,559

MYH8

0,998

23,962

21,171

96,592

IGF2

0,996

19,652

20,051

102,238

MLC1SA

0,999

18,499

19,800

96,195

HLA–DRB4

0,998

22,470

25,105

100,61

HPRT1

0,999

24,984

25,770

98,949

RPS18

0,998

19,602

15,756

94,891

OAZ1

0,999

23,976

25,406

96,224

ANKRD1

0,998

23,091

22,236

103,532

C1QTNF3

0,999

27,206

27,185

81,816

C5orf13

0,999

24,792

24,489

93,244

CNN3

0,996

25,411

25,399

109,479

ENHO

0,996

24,548

22,928

103,14

GDF8

0,996

31,668

31,284

108,713

POSTN

0,994

32,897

30,893

97,229

TNNT2

0,998

27,373

26,616

104,283

YWHAQ

0,998

26,285

24,931

103,559

MYH8

0,998

31,941

28,626

96,592

IGF2

0,996

26,293

24,650

102,238

MLC1SA

0,999

22,388

21,414

96,195

HLA–DRB4

0,998

29,987

27,591

100,61

HPRT1

0,999

25,397

25,431

98,949

RPS18

0,998

19,028

15,121

94,891

OAZ1

0,999

24,486

25,342

96,224

174

Vzorek

České bílé ušlechtilé plemeno prasat

Divoké prase

Příloha 27: Křivky tání genů 1) ANKRD1, 2) C1QTNF3, 3) C5orf13, 4) CNN3, 5) ENHO, 6) MLC1SA, 7) GDF8, 8) POSTN, 9) TNNT2, 10) YWHAQ, 11) HLA–DRB4, 12) IGF2 a 13) MYH8. cDNA použitá pro tuto analýzu byla ze svalové tkáně longissimus dorsi českého bílého ušlechtilého plemene prasat.

175