Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Analýza variability a exprese genů pro eukaryotický elongační faktor 1 alfa (EEF1A1 a EEF1A2) u prasat Doktorská disertační práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D.
Ing. Kateřina Svobodová
Brno 2011
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem disertační práci na téma Analýza variability a exprese genů pro eukaryotický elongační faktor 1 alfa (EEF1A1 a EEF1A2) u prasat vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího disertační práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne……………………………………… podpis doktoranda………………………
Předkládaná doktorská disertační práce byla vypracována v letech 2005 – 2008 na Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Agronomické fakulty Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a ve spolupráci s Laboratoří genomiky ţivočichů Ústavu ţivočišné fyziologie a genetiky AV ČR v Liběchově za podpory grantů: GA ČR 523/06/1302, GA ČR 523/03/0858, GA ČR 523/03/H076 a prostředků ze specifického vysokoškolského výzkumu prostřednictvím projektu IGA AF MZLU v Brně č. 18/2007. Doktorand: Ing. Kateřina Svobodová Školitel: prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Školitel specialista: prof. Ing. Antonín Stratil, DrSc. Doktorský studijní program: P 4103 – Zootechnika Studijní obor: 1515 V 008 – Molekulární biologie a genetika ţivočichů
Poděkování Ráda bych na tomto místě poděkovala svým školitelům prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za umoţnění doktorského studia vůbec a prof. Ing. Antonínu Stratilovi, DrSc. za cenné rady a ochotu kdykoli pomoci. Poděkovaní patří také kolektivu pracovníků a studentů Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, zejména Mgr. Zuzaně Vykoukalové, Ph.D. a Ing. Karlu Bílkovi, Ph.D. za zasvěcení do tajů laboratorní práce. Velký dík patří mé kolegyni a kamarádce Ing. Janě Zrůstové, Ph.D. za to, ţe se mnou doktorské studium proţila a přeţila, a především mým nejbliţším za všestrannou podporu a za to, ţe jsou.
ABSTRAKT Analýza variability a exprese genů pro eukaryotický elongační faktor 1 alfa (EEF1A1 a EEF1A2) u prasat Tato disertační práce se zabývá studiem struktury, polymorfizmů, mapování a exprese dvou prasečích genů pro eukaryotický elongační faktor 1 alfa – EEF1A1 a EEF1A2. U genu EEF1A1 byla navíc studována i stabilita exprese v 7 tkáních dospělého prasete. V naší práci byla stanovena částečná genomická sekvence prasečího EEF1A1 (800 bp) a kompletní genomická sekvence prasečího EEF1A2 (9965 bp). Odvozený protein eEF1A2 je sloţen z 463 aminokyselin a vykazuje 100% shodnost s eEF1A2 člověka a skotu a 92% podobnost s eEF1A1 prasete, člověka, myši a skotu. Porovnáním získaných sekvencí čtyř plemen prasat bylo u EEF1A2 objeveno 9 polymorfizmů, zatímco u EEF1A1 nebyl v analyzovaných 800 bp polymorfizmus nalezen. EEF1A2 byl pomocí RH i vazbového mapování popsán na prasečím chromozomu 17 (GNAS – EEF1A2 – SW2427). Analýza stability exprese genu EEF1A1 ukázala, ţe EEF1A1 je stabilní ve 4 ze 7 studovaných tkání. EEF1A1 byla exprimována ve všech studovaných tkáních, i kdyţ hladina exprese je variabilní. Vysoká exprese se v porovnání s expresí s dospělé svalovině vyskytuje ve fetální kosterní svalovině. Nízká exprese naopak v játrech a mozku dospělého prasete. EEF1A2 byl exprimován pouze v postnatální kosterní svalovině, srdci, bránici a mozku. Naše výsledky naznačují, ţe i u prasat dochází po narození k vývojovému „přepnutí“ mezi expresí EEF1A1 a EEF1A2 a ţe eEF1A2 je dospělá izoforma elongačního faktoru, zatímco eEF1A1 je spíše embryonální izoforma. Tuto hypotézu by však bylo třeba ověřit na větším mnoţství vzorků. Klíčová slova: myogeneze, genom, polymorfismus Analysis of variability and expression of genes for eukaryotic elongation factor 1 alpha (EEF1A1 and EEF1A2) in pigs This PhD thesis was aimed at the study of structure, polymorphism, mapping and expression of two porcine genes for eukaryotic translation elongation factor 1 alpha, EEF1A1 and EEF1A2. Moreover, the mRNA expression stability of EEF1A1 was studied in 7 adult porcine tissues. We determined a part of genomic sequence of porcine EEF1A1 (800 bp) and a complete genomic sequence of porcine EEF1A2 (9965 bp). The deduced eEF1A2 protein contains 463 amino acids and shares 100% identity with human and bovine eEF1A2, and 92% identity with porcine, human, mouse and bovine eEF1A1. By comparative sequencing nine polymorphisms in EEF1A2 were detected, whereas no polymorphism was found in the analyzed part (800 bp) of the genomic sequence of EEF1A1. EEF1A2 was mapped on IMpRH panel to SSC17. Polymorphism EEF1A2 – FM992107:g.6609C>G was used for linkage assignment in the Hohenheim F2 family M × P and for estimation of allele frequencies in different breeds. EEF1A2 was mapped to SSC17 (GNAS – EEF1A2 – SW2427). EEF1A1 proved to be a stable reference gene for real-time reverse transcription PCR in 4 of 7 studied porcine tissues. EEF1A1 was expressed in all studied tissues, but the level of expression varied. Very high expression was found in foetal muscle in comparison with adult skeletal muscle. Low expression occurred in adult liver and brain. EEF1A2 was expressed in postnatal skeletal muscles, heart, diaphragm and brain. Our results show that in porcine skeletal muscle developmental switch occurs after birth between EEF1A1 and EEF1A2 expression and that eEF1A2 is the adult isoform of peptide elongation factor, while eEF1A1 is more likely the embryonic isoform. This hypothesis should be verified by testing samples of wider pig population. Key words: myogenesis, genome, polymorphism
OBSAH 1
ÚVOD
2
LITERÁRNÍ PŘEHLED
2.1
Analýza genomu prasete
10
2.2
Myogeneze
13
2.3
Základní funkce elongačních faktorů v buňce
14
Biosyntéza nukleových kyselin a bílkovin
14
2.3.1
9 10
2.3.1.1
Transkripce
14
2.3.1.2
Translace
15
Ribozómy a jejich funkce v translaci
15
2.3.1.2.2
Zahájení translace (iniciace)
15
2.3.1.2.3
Syntéza polypeptidových řetězců (elongace)
16
2.3.1.2.4
Ukončení translace (terminace)
16
Elongační faktory
2.3.2 2.4
2.3.1.2.1
Eukaryotický elongační faktor 1 alfa
17 19
2.4.1
eEF1A jako biomarker poškození DNA
20
2.4.2
Strukturní rozdíly izoforem genu EEF1A – EEF1A1 a EEF1A2
20
2.4.3
Porovnání vlastností a funkcí izoforem eEF1A – eEF1A1 a eEF1A2
21
2.4.4
EEF1A1 jako referenční gen
23
2.4.5
Lokalizace genů EEF1A1 a EEF1A2
23
2.4.6
Exprese eEF1A1 (EF-1α1) a eEF1A2 (EF-1α2)
23
2.4.7
EEF1A, EEF1A1 a EEF1A2 jako onkogeny
24
Vybrané metody vyuţívané ke genetickým analýzám
26
2.5 2.5.1
Mapování pomocí radiačně hybridního panelu buněk
26
2.5.2
Vazbové mapování
27
2.5.3
Real-time RT-PCR
27
2.5.3.1
Disociační analýza
29
2.5.3.2
Efektivita PCR reakce
30
2.5.4 2.5.4.1
Kvantifikace genové exprese Relativní kvantifikace
31 31
2.5.4.1.1
Referenční geny
31
2.5.4.1.2
Hodnocení relativní kvantifikace
32
3
CÍL PRÁCE
33
4
MATERIÁL A METODY
34
4.1
Sledovaná populace zvířat
34
4.2
Nukleové kyseliny
35
4.2.1
Izolace DNA
35
4.2.2
Izolace RNA
35
4.2.3
Reverzní transkripce
37
4.3
Pouţité metody Polymerázová řetězová reakce
4.3.1
38 38
4.3.1.1
Gen EEF1A1
39
4.3.1.2
Gen EEF1A2
39
4.3.2
Sekvenování a analýza jeho výsledků
40
4.3.3
„Primer walking“
41
4.3.4
Klonování vybraných úseků DNA
42
4.3.5
Mapování pomocí radiačně hybridního panelu buněk
43
4.3.6
Polymorfismus a vazbové mapování
44
4.3.6.1
PCR
44
4.3.6.2
PCR-RFLP
44
4.3.6.3
Vazbové mapování
44
4.3.7
Mnohonásobná PCR (multiplex PCR)
45
4.3.8
Analýza stability genu EEF1A1 v různých tkáních dospělého prasete
46
4.3.8.1
Stanovení efektivity reakce
47
4.3.8.2
Testování stability genů
47
4.3.9
Relativní kvantifikace pomocí PCR v reálném čase
5
VÝSLEDKY A DISKUSE
5.1
Analýza genu EEF1A1
48
49 49
5.1.1
Nukleotidová sekvence genu EEF1A1 a analýza polymorfismů
49
5.1.2
Analýza stability genu EEF1A1 v různých tkáních dospělého prasete
50
5.2
Analýza genu EEF1A2
53
5.2.1
Nukleotidová sekvence genu EEF1A2 a analýza polymorfismů
53
5.2.2
Polymorfismus EEF1A2 u různých plemen prasat a mapování genu
56
5.2.3
Komparativní analýza genomické organizace genů EEF1A1 a EEF1A2 prasete
59
5.3
Analýza exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 pomocí metody multiplex PCR
60
5.4 5.4.1
Analýza exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 pomocí metody real-time RT-PCR Analýza hladiny exprese genu EEF1A1 v testovaných tkáních ve srovnání s expresí ve vzorku kosterní svaloviny dospělých jedinců
5.4.2
62
63
Analýza hladiny exprese genu EEF1A2 v testovaných tkáních ve srovnání s expresí ve vzorku kosterní svaloviny dospělých jedinců
64
5.4.3
Analýza hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v kosterní svalovině
65
5.4.4
Analýza hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v srdeční svalovině
67
5.4.5
Analýza hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v mozku
69
5.4.6
Analýza hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v játrech
71
5.4.7
Analýza hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v ledvině
73
5.4.8
Analýza hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v plicích
74
6
ZÁVĚR
75
7
POUŽITÁ LITERATURA
77
8
SEZNAM OBRÁZKŮ
99
9
SEZNAM TABULEK
100
10
SEZNAM ZKRATEK
101
11
PŘÍLOHY
103
11.1
Seznam příloh
103
1
ÚVOD Během myogenze je aktivováno mnoho genů, které mohou předurčovat diferenciaci
a postnatální růst svalů a jejichţ studium proto můţe být přínosem pro výzkum v oblasti uţitkovosti hospodářských zvířat. Gen pro eukaryotický elongační faktor 1 alfa 1 (EEF1A1) studovaný v předkládané práci byl vybrán na základě výsledků subtraktivní hybridizace a následného mapování genů provedeného na spolupracujícím pracovišti Ústavu ţivočišné fyziologie a genetiky Akademie věd České republiky v Liběchově (ÚŢFG AV ČR v Liběchově). Při tamních analýzách byla u řady studových genů včetně EEF1A1 popsána vyšší hladina exprese ve vzorcích svaloviny z plodů neţ ve vzorcích svaloviny dospělých prasat, coţ naznačovalo, ţe se jedná o geny významně se podílející na myogenezi. Další studovaný gen, gen pro eukaryotický elongační faktor 1 alfa 2 (EEF1A2), byl zvolen jako paralog genu EEF1A1, který má stejnou funkci jako EEF1A1, ale odlišnou tkáňovou expresi. Tyto dva geny kódují izoformy eukaryotického elongačního faktoru alfa (eEF1A), které působí v elongační fázi translace, kde katalyzují navázání aminoacyl-tRNA na ribozóm. U obou izoforem však byly popsány i různé další funkce, které s translací nesouvisí. Proces translace je mimo jiné povaţován za důleţité vodítko pro pochopení onkogeneze a eEF1A1 a zejména eEF1A2 se zvláště v publikacích uveřejňovaných v poslední době objevují nejen ve spojitosti s různými nádory, ale i moţnou genovou terapií. Vzhledem k tomu, ţe prase je fyziologicky velmi podobné člověku a ţe nukleotidová sekvence genu EEF1A2 u prasete nebyla před dokončením této práce zveřejněna, mohly by výsledky předkládané disertační práce přispět nejen k obohacení poznatků základního výzkumu a výzkumu spojeného s uţitkovostí hospodářských zvířat, ale mohly by být např. v budoucnu vyuţívány i v analýzách spojených s výzkumy karcinomů.
9
2
LITERÁRNÍ PŘEHLED
2.1 Analýza genomu prasete Většina uţitkových vlastností hospodářských zvířat patří mezi kvantitativní znaky, jsou tedy kontrolovány neznámým počtem genů s malým účinkem (polygenů) a ovlivněny prostředím (např. výţivou, typem ustájení, zdravotním stavem apod.) Tradiční způsob selekce zaloţený na kvantitativní genetice a genetice populací neumoţňuje zjistit efekty jednotlivých genů na uţitkové znaky. Vývoj molekulární genetiky a její metodologie v posledních letech umoţňuje přímou selekci zvířat zaloţenou na genotypech. Předpokladem pro pouţití genomiky ve šlechtění je znalost struktury a organizace genomu hospodářských zvířat. To zahrnuje identifikaci genů
a markerů, konstrukci
genomových
map, nalezení
oblastí
chromozomů
obsahujících QTL, identifikace mutací v genech, markerech a regulačních sekvencích atd. Hlavním cílem genomové analýzy je stanovení kompletní DNA sekvence studovaných druhů a identifikace všech důleţitých vlastností (genů, regulačních oblastí, SNP a dalších mutací atd.). Na základě komparativních genomických studií se zdá, ţe prasečí genom má stejnou velikost i sloţitost a obsahuje stejný počet genů jako lidský genom. Aktuální stav poznání lidského genomu je uveden v databázi Ensembl (Assembly GRCh37.p3; aktualizace z dubna
2011;
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/index).
Lidský
genom
obsahuje celkem 3 280 481 986 bp (to je přibliţně 99 % euchromatického genomu). V této sekvenci bylo identifikováno 20 930 genů kódujících proteiny, předpovězeno 893 nových protein kódujících genů, dále bylo zjištěno 14 040 pseudogenů a 8 271 RNA genů. Je zde popsáno 108 848 transkriptů genů. Tyto genové lokusy mají celkově 615 132 exonů. Znalosti prasečího genomu nejsou tak rozsáhlé. Počátky jeho analýz spadají do devadesátých let minulého století a byly při nich pouţity následující přístupy: identifikace genů a markerů a jejich polymorfismů, vazbové mapování, cytogenetické mapování, komparativní mapování, mapování za pouţití somatického hybridního panelu, mapování pomocí radiačního hybridního panelu, sekvenování, získání sekvencí EST a jejich mapování, získání koncových sekvencí klonů BAC, BAC „fingerprinting“, sestavení kontigů a jejich mapování, atd. Tyto přístupy umoţnily popsat a zmapovat více neţ 10 000 genů a markerů a zkonstruovat velmi podrobné mapy prasečího genomu, které mohou napomáhat
jeho
sekvenování.
Některé 10
informace
jsou
dostupné
na
http://www.animalgenome.org/pigs/. Sekvenování prasečího genomu bylo zahájeno v roce 2006 a očekávalo se, ţe bude kompletní na začátku roku 2008 (CHEN et al., 2007). V současnosti je dostupná verze Sscrofa 9 (z května 2011), která uvádí 211 285 872 nt dokončených
sekvencí
a
2 788 382 248 nt
nedokončených
sekvencí
(celkově
2 999 668 120 nt) (http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_scrofa). Aţ bude genom prasete kompletně osekvenován a popsán, bude to důleţitý zdroj informací, který bude umoţňovat rychlejší rozvoj v nalézání genů a oblastí s biologickým významem. Vyuţitím poznatků z analýzy genomů hospodářských zvířat lze identifikovat příčinné geny (geny, jejichţ varianty přímo ovlivňují některý uţitkový znak), případně vytipovat kandidátní geny (geny, u kterých se předpokládá vliv na daný uţitkový znak). Některé znaky u prasat jsou ovlivněny záměnou jedné báze v genu. Například odolnost vůči stresu (syndrom maligní hypertermie) je ovlivněna záměnou báze T za C v pozici 1843 v genu RYR1 (FUJII et al., 1991); vysoký obsah glykogenu v kosterní svalovině prasat plemene hampshire je ovlivněn mutací v genu PRKAG3 (záměna A za G; MILAN et al., 2000) a nedostatek vitaminu C zapříčiňuje mutace (intragenová delece) v genu GULO (HASAN et al., 2004). Kandidátní geny mohou být vybírány z QTL oblastí na chromozomu (poziční kandidáti), nebo je jejich selekce zaloţena na biochemických a fyziologických vlastnostech a jejich funkci v metabolizmu (funkční kandidáti). Je vhodnější, kdyţ je gen obojí – poziční i funkční kandidát. Je mnoho příkladů popsaných kandidátních genů ovlivňujících různé uţitkové znaky, či zdraví u prasat (FUT1, ESR, MYOG, FABP3, A-FABP, LEP, LEPR, PIT1, GH1, SPP1 atd.). Nicméně v mnoha případech není asociace mezi kandidátním genem a hodnotou sledovaného znaku zaloţena na efektu izolovaného genu, ale na QTL efektu více či méně rozsáhlého chromozomálního intervalu. V posledních letech je také větší pozornost věnována expresi genů v různých tkáních a rozdílných vývojových stadiích hospodářských zvířat. Ta můţe být studována pomocí exprimovaných sekvenčních markerů (EST), které umoţňují stanovení expresních profilů genů v jednotlivých tkáních, v různých vývojových stádiích a za různých podmínek a tak identifikovat regulované geny. EST jsou vyuţívány pro studie organizace genomu (identifikace genů, umístění na chromozomu analyzované pomocí somatického hybridního panelu nebo RH panelu), coţ jsou informace důleţité pro identifikaci genů nebo QTL. EST jsou významné také v komparativní genomice, kde mohou pomoci k odhalení funkcí genů porovnáním různých druhů. V průběhu minulých let mnoho laboratoří vytvořilo a osekvenovalo prasečí ESTs z mnoha cDNA knihoven. Např. DFCI Pig Gene Index (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=pig) ukazuje 1 463 960 11
EST a 10 773 exprimovaných transkriptů (ET). EST jsou uspořádány do 114 321 předpokládaných klastrů (tentative clusters; TC) a je zde 141 226 osamocených EST a 752 osamocených
ET.
Jiný
bohatý
zdroj
informací
o
EST
je
NCBI
databáze
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Testovány byly například následující tkáně: tenké střevo (WINTERO et al., 1996), granulózní buňky (TOSSER-KLOPP et al., 1997), kosterní svalovina dospělého prasete (DAVOLI et al., 1999, 2000,. 2002), kosterní svalovina plodu ve 45. a 90. dni březosti, při narození, v sedmi týdnech a 1 roce věku (YAO et al., 2002), kosterní svalovina 28. dní starého embrya (KARNUAH et al., 2001), játra (PONSUKSILI et al., 2001), blastocysta (SMITH et al., 2001), neonatální kosterní svalovina zdravých selat a selat s roznoţkou (splay leg) (MAAK et al., 2001) a další. Z pohledu masné uţitkovosti prasete jsou nejdůleţitější EST z cDNA knihovny kosterní svaloviny dospělého prasete. DAVOLI et al. (1999, 2000, 2002) identifikovali 701 EST z prasečí kosterní svaloviny a ty roztřídili do 306 odlišných druhů cDNA. 107 z těchto EST bylo zmapováno pomocí somatického hybridního panelu. Ke studiu exprese genů a genů rozdílně exprimovaných v různých tkáních nebo rozdílných fenotypech existuje mnoho přístupů např. studium EST, SAGE, „differential display“ RT-PCR, subtraktivní hybridizace, real-time RT-PCR, či microarray, která se jeví jako nejvýkonnější pro studium celého transkriptomu zkoumaných tkání i studium rozdílné genové exprese. Microarray byla pouţita v různých studiích zaměřených např. na mezidruhovou hybridizaci prasečí RNA na lidské microarraye; expresi ve fetálních a postnatálních dospělých kosterních svalech (ZHAO et al., 2003); analýzu rozdílné exprese transkriptu ve fenotypicky odlišných svalech (BAI et al., 2003); molekulární změny jako odpověď na potravní omezení u mladých rostoucích kosterních svalů; porovnání exprese v prenatálních svalech u plemen duroc a pietrain (te PAS et al., 2005; CAGNAZZO et al., 2006); porovnání transkripční exprese v kosterní svalovině u plemene duroc a taoyuan; vyhledávání specifických genů souvisejícíh s růstem prasečích svalů. Detailnější informace jsou uvedeny v publikacích WIMMERS et al. (2004) a TUGGLE et al. (2007). Ačkoli mohou technologie microarray měřit rozdílné exprese velkého počtu genů ve studovaných tkáních zároveň, bylo zjištěno, ţe se jedná o semikvantitativní metodu, která v některých případech dokonce můţe poskytovat falešné pozitivní výsledky. Proto by měla být interpretace rozdílné exprese jednotlivých genů uskutečňována s rozmyslem a výsledky je vhodné ověřit například pouţitím real-time RT-PCR. Tato metoda je citlivější a můţe poskytovat přesné hodnoty rozdílů genetické exprese, je však pracná a drahá, proto je vhodná spíše k analýze omezeného počtu genů. 12
2.2 Myogeneze Svalová tkáň je sloţena z různých typů buněk (svalová vlákna, adipocyty, buňky pojivových tkání, nervové buňky, endoteliální buňky atd.). Svalová tkáň je tvořena převáţně svalovými vlákny, ostatní sloţky jsou ve vztahu k celkové hmotě svalu zastoupeny méně. Aby mohla být pochopena biologie masné produkce, je třeba získávat znalosti o buněčném a molekulárním dění odehrávajícím se během vývoje a růstu svalů. Vývoj svalových vláken začíná v části somitu coelomového váčku označované jako myotom (PERRY et RUDNICK, 2000) a probíhá během embryonálního a fetálního vývoje. U embrya se z prekurzorů myogenních buněk mezodermálního původu vyvíjejí jednojaderné primární myoblasty. Tyto buňky jsou schopné proliferace a dělení. Spojením myoblastů se vytvářejí myotubuly, které se pak vyvíjejí ve svalová vlákna (MUNTZ, 1990). U prasat vykazuje svalová tkáň dvě fáze vývoje. V první fázi, která trvá aţ do 60. dne březosti, se z primárních myoblastů utvářejí primární myofibrily. Ve druhé fázi, mezi 54. a 90. dnem březosti, se sekundární myoblasty přetvářejí na sekundární myofibrily (WIGMORE et STICKLAND, 1983; PECK et WALSH, 1993). Z jiné populace myoblastů vznikají satelitní buňky asociované se svalovými vlákny (MUNTZ, 1990). Satelitní buňky jsou schopné dělení a slouţí jako zdroj jader pro rostoucí svalová vlákna během postnatálního vývoje (REHFELDT et al., 2000). Přibliţně 80 – 90 % svalových vláken přítomných při narození vzniká ze sekundárních myofibril a jen 10 – 20 % z primárních myofibril (SWATLAND, 1973). Bylo popsáno, ţe počet svalových vláken přítomných při narození určuje maximální schopnost růstu libového masa u prasat (HÄNDEL et STICKLAND, 1987; 1988). STICKLAND et al. (2004) uvádí, ţe po narození jiţ nedochází k průkazným změnám v počtu svalových vláken. Někteří autoři však popisují zvýšení počtu vláken krátce po narození, a to u hlodavců, kuřat a prasat (REHFELDT et al., 2004). U prasat bylo zjištěno, ţe v m. sartorius je přibliţně 19 000 myofibril vytvořeno během prvních sedmi dní ţivota (u plodu vzniká přibliţně 900 vláken za den) (SWATLAND, 1973). Předpokládá se, ţe tento nárůst je dán spíše dozráváním a prodluţováním jiţ existujících myotubulů neţ vznikem nových vláken (REHFELDT et al., 2000). Růst svaloviny po narození jedince je omezen na hypertrofický růst prenatálně vyvinutých svalových vláken (HÄNDEL et STICKLAND, 1987; 1988). Postnatální hypertrofie svalových vláken závisí na celkovém počtu svalových vláken ve svalu. Rychlost postnatálního růstu jednotlivých svalových vláken je niţší, kdyţ je ve svalu
13
obsaţen velký počet vláken, a vyšší, kdyţ je v něm niţší počet vláken. Tento antagonistický vztah mezi tloušťkou svalových vláken a jejich počtem můţe být vysvětlen skutečností, ţe nutriční energie je rozdělena mezi všechna vlákna (REHFELDT et al., 2004). Během postnatálního růstu se svalová vlákna zvětšují co do délky a obvodu. Zvětšování co do délky se děje pravidelným přidáváním sarkomer na konce jiţ existujících myofibril, zvětšování obvodu se děje díky podélnému štěpení existujících myofibril, kdyţ dosáhnou kritické velikosti (GOLDSPINK, 2004). Během embryonálního a fetálního vývoje je ve svalech aktivováno mnoho genů, které mohou předurčovat diferenciaci a postnatální růst svalů, proto můţe být velkým přínosem studium genů, které mají odlišnou expresi ve fetálních a dospělých tkáních.
2.3 Základní funkce elongačních faktorů v buňce Elongační faktory jsou v buňce činné zejména v elongační fázi translace při biosyntéze proteinů. 2.3.1 Biosyntéza nukleových kyselin a bílkovin Genetická informace kaţdého organismu je obsaţena v pořadí (sekvenci) nukleotidů v polynukleotidových řetězcích molekul DNA a RNA. Podle této informace se vytváří pořadí nukleotidů v ribonukleových kyselinách a následně pořadí aminokyselin v bílkovinách (primární struktura). Genetická informace se nejprve přepisuje z DNA do mediátorové RNA (mRNA). Tento přepis se děje syntézou molekul RNA na molekulách DNA a označuje se transkripce. Na základě informace v molekulách mRNA se pak syntetizují bílkoviny, tento děj se označuje translace. 2.3.1.1 Transkripce Transkripce je enzymatický proces závislý na katalytickém působení enzymu RNApolymerázy. Při transkripci dochází nejprve k rozvolnění dvoušroubovicovité struktury DNA, a to v oblasti nazývané promotor. Podle nukleotidové matrice jednoho z řetězců DNA
se
k jednotlivým
deoxyribonukleotidům
přiřazují
volné
komplementární
ribonukleotidy. Jejich vzájemným spojením diesterickými vazbami vzniká souvislý polyribonukleotidový řetězec (pre-mRNA), který podléhá post-transkripčním úpravám (připojení čepičky, polyadenylace a sestřih), a vzniklá zralá mRNA přechází do buněčné
14
cytoplazmy, kde se napojuje na ribozómy. Transkripce končí v oblasti molekuly DNA nazývané terminátor. Rozsah informace, který v sobě nese molekula mRNA můţe být různý, u eukaryotických organismů to bývá informace pouze pro jediný polypeptidový řetězec (PIKÁLEK, 1998).
2.3.1.2 Translace Translace je proces syntézy bílkovin podle informace obsaţené v molekulách mRNA. Probíhá na ribozómech a je katalyzován mnoha enzymy, které se vyskytují volně v cytoplazmě, nebo jsou vázány na strukturu ribozómů. 2.3.1.2.1 Ribozómy a jejich funkce v translaci Ribozómy jsou buněčné útvary tvořené ribonukleoproteinovým komplexem, kterých je v buňkách velké mnoţství. Jsou vţdy sloţeny z menší a větší podjednotky. mRNA se na menší podjednotku ribozómu navazuje vţdy 5’koncem své molekuly. Ribozóm se poté po navázané molekule mRNA posunuje (od jejího 5’konce k 3’konci). Volný 5’konec molekuly mRNA se můţe napojovat na další ribozómy, čímţ vzniká polyribozóm. mRNA se při posunování dostává na kaţdém ribozómu do kontaktu s jeho dvěma vazebnými místy, která svou velikostí odpovídají trojicím ribonukleotidů v mRNA (kodónům). Tato vazebná místa se označují jako aminoacylové (A) a peptidylové (P) místo a dochází v nich k připojování aminokyselin a k jejich spojování do polypeptidového řetězce. Aminokyseliny jsou k ribozómům přinášeny ve formě komplexu s transferovou RNA (tRNA). Ke vzniku těchto aminoacyl-tRNA komplexů dochází v cytoplazmě buňky za katalytického působení enzymů nazývaných aminoacyl-tRNA-syntetázy (PIKÁLEK, 1998).
2.3.1.2.2 Zahájení translace (iniciace) K zahájení translačního procesu dochází tehdy, kdyţ se do vazebného P-místa ribozómu dostane iniciační kodón molekuly mRNA (obvykle AUG). Následně dochází k připojení iniciační tRNA s navázanou iniciační aminokyselinou (u eukaryot metionin) za katalytického působení enzymů označovaných jako iniciační faktory.
15
2.3.1.2.3 Syntéza polypeptidových řetězců (elongace) Důsledkem pohybu ribozómu po molekule mRNA se do vazebného A-místa dostane kodón molekuly mRNA nejblíţe následující po iniciačním kodónu. To je signálem pro připojení
dalšího
komplexu
aminoacyl-tRNA
(s
odpovídajícím
antikodónem).
Na ribozómu jsou tedy vedle sebe připojeny dva komplexy aminoacyl-tRNA („iniciační“ a nejblíţe následující) současně. Mezi aminokyselinami těchto komplexů vzniká peptidová vazba. Zároveň se však ruší vazba iniciační aminokyseliny na „iniciační“ tRNA, která se následně z ribozómu uvolňuje. Vazebné P-místo je tedy volné, zatímco na A-místo ribozómu je připojen komplex tvořený molekulou tRNA a dvojicí vzájemně spojených aminokyselin (dipeptidem). Dalším pohybem ribozómu po mRNA se kodón s připojeným komplexem tRNA-dipeptid přesune do P-místa. Do A-místa se dostává nejbliţší následující kodón, k němuţ se připojuje další komplex aminoacyl-tRNA s odpovídajícím antikodónem. Mezi sousedícími aminokyselinami se opět vytváří peptidová vazba a stávající dipeptid se napojí na tento další komplex aminoacyl-tRNA (vzniká tripeptid). tRNA, na níţ byl dipeptid původně připojen, se z ribozómu uvolňuje a celý proces se můţe opakovat. Připojování komplexů aminoacyl-tRNA na ribozómy, tvorba peptidových vazeb a přemísťování komplexů z A-místa do P-místa je katalyticky podmíněno činností enzymů nazývaných elongační faktory (PIKÁLEK, 1998).
2.3.1.2.4 Ukončení translace (terminace) Elongace probíhá tak dlouho, dokud se do A-místa ribozómu nedostane tripletová oblast mRNA, která svým nukleotidovým sloţením odpovídá některému z terminačních kodónů. Pro tyto kodóny neexistuje odpovídající typ tRNA s komplementárním antikodónem. Na poslední začleněnou aminokyselinu se proto nemůţe napojit další aminokyselina a vytvořený polypeptidový řetězec se tak uvolní z ribozómu. Ukončení translace je katalyzováno enzymy, které jsou nazývány terminační faktory.
16
2.3.2 Elongační faktory V eukaryotických buňkách jsou při translaci aktivní tyto elongační faktory – eukaryotický elongační faktor 1 (EF-1; eEF-1), který u zvířat zahrnuje čtyři podjednotky α, β, γ, a δ (JANSSEN et al., 1994), dále eukaryotický elongační faktor 2 (EF-2; eEF-2) a eukaryotický elongační faktor 3 (EF-3; eEF-3). EF-1α (eEF1A) katalyzuje navázání aminoacyl-tRNA na ribozóm (KAZIRO, 1978). Po správném navázání dochází k hydrolýze GTP, coţ vede k uvolnění komplexu EF-1α · GDP a k nasednutí aminoacyl-tRNA na A-místo ribozómu (viz Obr. 1) (MERRICK, 1992). U prasat byla pro EF-1α zjištěna molekulární hmotnost 53 000 (IWASAKI et al., 1974). EF-1β (eEF1Bα) a EF-1γ (eEF1Bγ) tvoří komplex eEF-1βγ, který stimuluje přeměnu EF-1α · GDP na EF-1α · GTP (MOTOYOSHI et al., 1977). U prasat byla pro EF-1β zjištěna molekulární hmotnost 30 000 a pro EF-1γ 53 000 (HATTORI et IWASAKI, 1980). EF-1δ (eEF1Bβ) popsali CARVALHO et al., (1984) v retikulocytech králíka. Ve své práci došli k názoru, ţe se jedná o defektní produkt EF-1γ. VAN DAMME et al. (1990) popsali EF-1δ u Artemia salina jako podjednotku funkčně i strukturně velmi podobnou podjednotce β. JANSSEN et al., (1994) následně uvádí, ţe EF-1δ vytváří u Artemia salina komplex s ostatními podjednotkami v poměru 2α:1β:1γ:1δ, přičemţ účinnými proteiny při přeměně EF-1α · GDP na EF-1α · GTP jsou podle autorů podjednotky β a δ, zatímco γ podjednotka působí jako stavební součást celého komplexu nazývaného EF-1H. EF-2 (eEF-2) podporuje na GTP-závislou translokaci peptidyl-tRNA z A-místa do P-místa téhoţ ribozómu (WEISSBACH et OCHOA, 1976). EF-3 (eEF-3) se vyskytuje u hub. Byl popsán např. u Saccharomyces cerevisiae, (SKOGERSON et WAKATAMA, 1976), Candida albicans (DI DOMENICO et al., 1992), Pneumocystis carinii (YPMA-WONG et al., 1992) a také u rodů Neurospora, Aspergillus a Mucor (KAMATH et CHAKRABURTTY, 1989). EF-3 stimuluje na EF-1α závislé navázání aminoacyl-tRNA na ribozóm (KAMATH et CHAKRABURTTY, 1989).
17
Obr. 1. Elongační cyklus u eukaryot (převzato z MERRICK, 1992)
18
2.4 Eukaryotický elongační faktor 1 alfa Eukaryotický elongační faktor 1 alfa (EF-1α; eEF1A) patří mezi nejhojnější proteiny eukaryotických buněk (NEGRUTSKII et EL’SKAYA, 1998). Jedná se po aktinu o druhý nejrozšířenější protein, který tvoří 1 – 2 % z celkového obsahu proteinů normálních buněk (CONDEELIS, 1995). EF-1α je mezidruhově velmi podobný protein. Například mezi člověkem a králíkem byla na aminokyselinové úrovni zjištěna 100% identita (MERRICK et al., 1990). Molekula EF-1α má pozitivní náboj (pI=8,5-9,1) (NEGRUTSKII et EL’SKAYA, 1998), coţ můţe vysvětlovat její schopnost působit společně s RNA o vysokých molekulárních hmotnostech jako jsou poly(U), poly(G) a ribozomální RNA (SLOBIN, 1983). U EF-1α byly popsány různé posttranslační modifikace jako například methylace (HIATT et al., 1982, COPPARD et al., 1983, DEVER et al., 1989) nebo fosforylace (VENEMA et al., 1991a, VENEMA et al., 1991b, KIELBASSA et al., 1995). Prokazatelné zvýšení hladiny mRNA pro EF-1α bylo pozorováno u embryí (KRIEG et al., 1989), silně proliferujících buněk (SANDERS et al., 1992), a při onkogenezi (GRANT et al., 1992). Efektivita exprese EF-1α můţe být na úrovni translace regulována pomocí selektivní translace (JEFFERIES et al., 1994), nebo pomocí represe translace EF-1α mRNA (SLOBIN et RAO, 1993). Zvýšená exprese EF-1α zvyšuje u Saccharomyces cerevisiae přesnost translace (SONG et al., 1989) a u transgenických krátce ţijících mutantů Drosophily melanogaster zvyšuje dokonce délku jejich ţivota (SHEPHERD et al., 1989). DUTTAROY et al. (1998) zjistili, ţe hladina EF-1α hraje důleţitou roli při apoptóze buněk. Popsána byla také souvislost EF1α se stavbou buněčné kostry a vazbou aktinových vláken a mikrotubulů (CONDEELIS, 1995; MURRAY et al., 1996). EF-1α také ovlivňuje citlivost buněk k transformaci (TATSUKA et al., 1992). CHUANG et al. (2005) popsali funkci eEF1A v degradaci poškozených proteinů zprostředkované proteozomy a KHACHO et al. (2008) zjistili, ţe stimuluje export proteinů z buněčného jádra. Svou roli hraje eEF1A také v reakci na teplotní šok u obratlovců (SHAMOVSKY et al., 2006).
19
Kvůli velkému počtu homologních sekvencí je sloţité stanovit přesný počet genů pro EF-1α v genomu. V lidském genomu bylo popsáno více neţ 20 takových sekvencí, z nich většina jsou pseudogeny (OPDENAKKER et al., 1987, MADSEN et al., 1990). Nejméně dva geny pro EF-1α byly popsány u Saccharomyces cerevisiae (SCHIRMAIER et PHILIPPSEN, 1984), Drosophila melanogaster (HOVEMANN et al., 1988), potkana, myši (SHIRASAWA et al., 1992, ANN et al., 1992, LEE et al., 1992), králíka (KAHNS et al., 1998) a člověka (UETSUKI et al., 1989, KNUDSEN et al., 1993) a čtyři geny pro EF-1α byly popsány u Xenopus laevis (KRIEG et al., 1989, DJÉ et al., 1990, PÖTING et al., 1990). Geny u D. melanogaster a X. laevis jsou vývojově regulovány. U D. melanogaster je jeden gen (F1) transkribován ve všech buňkách během vývoje i v dospělosti, zatímco druhý (F2) pouze ve stádiu kukly (WALLDORF et al., 1985). U Xenopus je jeden gen (42Sp50) exprimován pouze v oocytech a druhý (EF-la0) v časné embryogenezi (DJÉ et al., 1990). 2.4.1 eEF1A jako biomarker poškození DNA VON FIGURA et al. (2009) pouţili eEF1A jako jeden ze čtyř biomarkerů, které by mohly mít vliv na stárnutí buněk. Zjistili, ţe hladina exprese zkoumaných markerů se zvyšuje jako odpověď na dysfunkci telomer a hromadění poškozené DNA v buňkách. Testováni byli zdraví lidé i lidé s různými diagnózami (např. diabetes, srdeční a mozkové choroby) a zjistilo se, ţe analyzované biomarkery by mohly odráţet poškození DNA způsobené věkem i nemocemi. Mladší pacienti s nemocemi charakterizovanými silným poškozením DNA (např. cirhóza jater, nebo rakovina) tak mohou mít v krvi vyšší hladinu těchto biomarkerů neţ zdraví starší lidé. Mechanismus zvýšení hladiny studovaných biomarkerů však autory nebyl rozluštěn.
2.4.2
Strukturní rozdíly izoforem genu EEF1A – EEF1A1 a EEF1A2 U člověka se geny pro obě izoformy skládají z osmi exonů a sedmi intronů, avšak gen
pro izoformu EEF1A1 je asi třikrát menší neţ pro izoformu EEF1A2, coţ způsobuje rozdílná délka intronů. Kódující oblasti lidského EEF1A1 a EEF1A2 jsou velmi podobné, zatímco mezi introny a netranslatovanými oblastmi byly pozorovány výrazné rozdíly. Dalším rozdílem je, ţe v sekvenci izorformy EEF1A1 je obsaţen TATA-box, zatímco v sekvenci izoformy EEF1A2 nikoli (BISCHOFF et al., 2000).
20
2.4.3 Porovnání vlastností a funkcí izoforem eEF1A – eEF1A1 a eEF1A2 U člověka, myši, potkana a králíka byly pro EF-1α (eEF1A) popsány dvě izoformy – EF-1α1 (eEF1A1) a EF-1α2 (eEF1A2). U člověka vykazují tyto izoformy na úrovni aminokyselin 92% podobnost, (KNUDSEN et al., 1993; SOARES et al., 2009). U králíka je pak na úrovni aminokyselin popsána 92,3% podobnost (KAHNS et al., 1998). Mezi králíkem a myší a potkanem se aminokyselinová sekvence u izoformy eEF1A2 liší pouze o jednu aminokyselinu a mezi člověkem a králíkem byla pro izoformu eEF1A2 nalezena na úrovni aminokyselin dokonce 100% podobnost (KAHNS et al., 1998). V translační analýze in vitro vykazují u králíka obě izoformy stejnou aktivitu, bylo však zjištěno, ţe eEF1A1 váţe GTP silněji neţ GDP, zatímco u eEF1A2 je tomu naopak (KAHNS et al., 1998). Při studiu myotubů bylo dále prokázáno, ţe zatímco eEF1A1 je proapoptický, eEF1A2 se vyznačuje antiapoptickou aktivitou (RUEST et al., 2002). eEF1A1 má kromě své úlohy při translaci ještě další funkce. Například DITZEL et al. (2000) objevili zvýšenou hladinu anti-eEF1A1 protilátek u 66 % pacientů s Feltyho syndromem (varianta revmatoidní artritidy, kdy se k jejím typickým příznakům přidává ještě nízký obsah neutrofilních granulocytů v krvi a nadměrné zvětšení sleziny). Nově byla také popsána role eEF1A1 v ovlivňování vytváření neuritů (HASHIMOTO et ISHIMA, 2011). U genu EEF1A2 byl studován vliv jeho polymorfismu na parametry masné uţitkovosti prasat. Při této analýze však nebyla prokázána ţádná asociace (PAVELKOVÁ, 2010). Pro prozkoumání strukturálních základů funkčních rozdílů byl vytvořen srovnávací trojrozměrný model lidského eEF1A1 a eEF1A2 (viz Obr. 2 a 3). SOARES et al., (2009) tak ve své práci potvrdili hypotézy, ţe rozdíly mezi aminokyselinami obou variant určují odlišnosti v jejich afinitě k aminoacyl-tRNA a aktinu a ţe rozdílná fosforylace těchto dvou variant zvyšuje nejen jejich chemické rozdíly, ale podporuje i jejich funkční odlišnosti.
21
Obr. 2: 3-D modely lidských proteinů eEF1A1 a eEF1A2. Pozn.: U eEF1A1 (modrý) a eEF1A2 (červený) je znázorněno umístění rozdílných bočních řetězců (zbarveny zeleně) a u eEF1A2 je označeno umístění jednotlivých domén (převzato dle SOARES et al., 2009).
Obr. 3: Umístění rozdílů mezi aminokyselinami zmapovanými na povrchu u eEF1A1 a eEF1A2. Pozn.: Rozdíly jsou zbarveny zeleně a popsány u modelu lidského eEF1A2 - varianta aminokyseliny pro eEF1A1 je na pravé, varianta aminokyseliny pro eEF1A2 na levé straně popisku (přepracováno dle SOARES et al., 2009)
22
2.4.4
EEF1A1 jako referenční gen EEF1A1 byl v několika studiích ověřován jako vhodný referenční gen. SHEN et al.
(2010) popsali EEF1A1 jako nejstabilnější z 12 genů při studiu tkání děloţního krčku a jeho karcinomů u lidí. Podobnou problematikou se zabývali také STEINAU et al. (2006). EEF1A1 figuruje jako kontrolní gen také při studiu genové exprese u prasat (TSAI et al., 2006 a AFFYMETRIX, 2011).
2.4.5 Lokalizace genů EEF1A1 a EEF1A2 U člověka byl gen EEF1A1 zmapován na šestý chromozom (oblast 6q14), a EEF1A2 na dvacátý chromozom (oblast 20q13.3) (LUND et al., 1996). U myší byl gen EEF1A1 popsán na devátém chromozomu a EEF1A2 na druhém chromozomu (NEWBERY et al., 2007). U prasete byl gen EEF1A1 pomocí radiačního hybridního mapování dle KARNUAH et al., (2001) identifikován na chromozomu 8 (8q11). Lokalizace genu EEF1A2 u prasete nebyla před dokončením této práce popsána.
2.4.6 Exprese eEF1A1 (EF-1α1) a eEF1A2 (EF-1α2) Exprese izoforem EF-1α je různá. EF-1α1 je vysoce exprimována ve tkáních s vysokou mírou syntézy proteinů a se značnou proliferací buněk, jako jsou plíce, játra, placenta, zatímco v kosterní svalovině je exprese velmi nízká. EF-1α2 je naopak vysoce exprimována v kosterní svalovině, srdeční svalovině a mozku, coţ jsou tkáně, ve kterých je většina buněk plně diferencována a k buněčnému dělení dochází velmi málo nebo vůbec (KNUDSEN et al., 1993). Podobnou tkáňově specifickou expresi popisují u potkanů a myší LEE et al. (1992) a také KHALYFA et al. (2001), kteří upřesňují, ţe v mozkové tkáni dospělé myši je eEF1A2 přítomen pouze v neuronech, zatímco eEF1A1 hlavně v ostatních buňkách mozkové tkáně (astrocyty, mikroglie), coţ popisuje i LEE et al. (1995). Během vývoje kosterní a srdeční svaloviny a mozku dochází k „přepínání“ exprese izoforem eEF1A1 a eEF1A2. U myší a potkanů je v těchto tkáních izoforma eEF1A1 exprimována během embryonálního a časného postnatálního vývoje, ale uţ sedm dní po narození začíná být nahrazována izoformou eEF1A2, která se tam pak exprimuje po celou dobu dospělosti (LEE et al., 1993; KHALYFA et al., 2001).
23
Zajímavostí je, ţe např. svalové buňky se vracejí ke zvýšené expresi eEF1A1 při odpovědi na toxinem vyvolané poškození. Po zotavení se ve svalovině opět exprimují vysoké hodnoty eEF1A2 (KHALYFA et al., 1999). Vývojové „přepnutí“ mezi eEF1A1 a eEF1A2 by mohlo být zapříčiněno protiapoptickou funkcí izoformy eEF1A2 (RUEST et al., 2002), avšak tato problematika není dosud zcela objasněna. Exprese eEF1A2 je v kosterní svalovině, srdeční svalovině a neuronech zvyšována během procesu terminální diferenciace (LEE et al., 1995). Existují však i terminálně diferencované buňky (např. keratinocyty), ve kterých eEF1A2 exprimován není (NEWBERY et al., 2007). Zvýšení exprese eEF1A2 se objevuje současně se sníţením exprese eEF1A1, coţ naznačuje, ţe eEF1A2 tkáňově specificky přebírá funkci eEF1A1 v syntéze proteinů (BISCHOFF et al., 2000). Delece 15,8 kB v genu eEF1A2, která zamezuje jeho expresi (CHAMBERS et al., 1998), je u myší spojena s tzv. „wasted“ mutací, kterou poprvé popsali SCHULTZ et al. (1982). Myši s touto mutací se vyznačují atrofií svalů a neurologickými a imunologickými abnormalitami, které se začínají projevovat 21. den po narození. Uţ 28. den po narození tyto myši hynou. U takto zmutovaných myší nedochází ke kompenzaci absence eEF1A2 zvýšením exprese eEF1A1, čímţ dochází zejména ve svalovině k nedostatečné syntéze proteinů, která vede ke smrti jedince (CHAMBERS et al., 1998; KHALYFA et al., 2001). Ţe je za abnormality pozorované u „wasted“ myší zodpovědný opravdu pouze eEF1A2, potvrdili NEWBERY et al. (2007). U genu EEF1A1 byly popsány změny v jeho expresi ve sliznici březí dělohy potkanů (VALLEJO et al., 2010). SERÃO et al. (2011) studovali vliv exprese EEF1A2 na obsah intramuskulárního tuku (IMT) u prasat. Při analýze souboru 72 jedinců nenašli autoři mezi expresí EEF1A2 a obsahem IMT pozitivní korelaci.
2.4.7 EEF1A, EEF1A1 a EEF1A2 jako onkogeny eEF1A je zmiňován například v souvislosti s rakovinou prostaty (MOHLER et al., 2002). Zvýšená exprese eEF1A byla popsána při rakovině slinivky (GRANT et al., 1992) nebo u nádorů prsu (EDMONDS et al., 1996). eEF1A je v souvislosti s vývojem nádorů popisován také v práci KIM et al. (2009). 24
SHEN et al. (1995) popisují eEF1A v souvislosti s PTI-1 (prostate carcinoma tumorinducing gene 1), jehoţ expresi detekovali u primárního karcinomu prostaty, ale ne v normální tkáni prostaty lidí. PTI-1 je dle SHEN et al. (1995) zkrácená, zmutovaná varianta lidského eEF1A spojená s bakteriální ribosomální 23S RNA, dle MANSILLA et al. (2005) se můţe jednat i o zkrácenou, ale nezmutovanou variantu lidského eEF1A1. Mutace v eEF1A mohou tedy přispívat k rakovinným procesům (SHEN et al., 1995). Analýzou exprese PTI-1 v nádorech prostaty se zabýval také SUN et al (1997). Zvýšená exprese PTI-1 byla popsána také v souvislosti s rakovinou slinivky (OHNAMI et al., 1999). Variabilitou exprese PTI-1 v liniích hematopoetických buněk odolných lékům se zabývali BEYER-SEHLMEYER et al. (1999), kteří zároveň uvedli, ţe PTI-1 má 94% podobnost s eEF1A, zatímco BERTRAM et al. (1998), kteří se zabývají zkoumáním exprese PTI-1 v tumorech střeva, uvádějí 96% homologii mezi eEF1A a PTI-1. SU et al. (1998) naznačují, ţe PTI-1 by mohl slouţit při genové terapii rakoviny prostaty i jiných tkání. Tuto teroii podporuje i práce YU et al. (2006). SCAGGIANTE et al. (2008) naopak naznačují, ţe PTI-1 by nemusel nutně hrát hlavní roli v počátcích tumorgeneze prostaty. eEF1A1 je zmiňován v souvislosti s hepatocelulárním karcinomem jater (GRASSI et al., 2007) a také s nádory slinivky, leukémií a kostními nádory (SELGA et al., 2009). Zvýšená exprese eEF1A2 byla zjištěna u nádorů vaječníků (ANAND et al., 2002). Souvislost eEF1A2 s rakovinou popisují také TOMLINSON et al. (2005), kteří zjistili jeho zvýšenou expresi u 2/3 testovaných prsních nádorů, zatímco v normální prsní tkáni expresi eEF1A2 neidentifikovali. Také u nádorů slinivky byla u 83 % sledovaných vzorků zjištěna zvýšená exprese eEF1A2 (CAO et al., 2009). eEF1A2 jiţ byl také zmiňován v souvislosti s rakovinou plic (LAM et al., 2006), ţaludku (YAMASHITA et al., 2006), jater (GRASSI et al., 2007), ledvin, recta a tlustého střeva (JOSEPH et al., 2004). TOMLINSON et al. (2007) popisují, ţe počet DNA kopií v lokusu EEF1A2 není vţdy v korelaci s hladinou exprese a ţe zvýšená exprese v nádorech vaječníků není závislá na genetických nebo epigenetických změnách v lokusu EEF1A2. Autoři se domnívají, ţe onkogenní vlastnosti eEF1A2 mohou být spojeny buď s jeho funkcí v syntéze proteinů, nebo jeho potenciálními funkcemi, které se syntézou proteinů nesouvisí. SUN et al. (2008) pak ve své práci uvádějí moţné vzájemné ovlivňování EEF1A2 a transkripčního faktoru ZNF217 (zinc finger 217, který stejně jako EEF1A2 leţí u člověka v lokusu 20q13), při vzniku nádorů vaječníků.
25
2.5 Vybrané metody vyuţívané ke genetickým analýzám Při genetických analýzách byly v této práci pouţity obecně známé metody jako je izolace nukleových kyselin, gelová elektroforéza, polymerázová řetězová reakce (PCR), sekvenování, polymorfismus délky restrikčních fragmentů (PCR-RFLP), klonování DNA, strategie „primer walking“, mnohonásobná PCR (multiplex PCR) a dále metody mapování pomocí radiačně hybridního panelu buněk (RH mapování), vazbové mapování a real-time RT-PCR, které jsou níţe podrobněji popsány.
2.5.1 Mapování pomocí radiačně hybridního panelu buněk Při konstrukci radiačně hybridního panelu se vychází z buněk hlodavců, které obsahují fragmenty chromozomů z jiného organismu vznikající ozářením X paprsky nebo rentgenovým zářením. Ozáření má na buňku letální vliv, fragmenty chromozomů se však mohou udrţovat, pokud je buňka bezprostředně po ozáření fúzována s neozářenou hlodavčí buňkou. V buňkách vzniklých hybridů jsou chromozómové fragmenty náhodně začleněny do chromozomů hlodavčí buňky. Pomocí selekce mnoţících se buněk s úspěšně zabudovanými chromozómovými fragmenty se vytvoří panel hybridních buněk, které pokrývají celý chromozóm (ŠMARDA et al., 2005). Tato technika umoţňuje konstrukci vazbových map pro málo informativní a nepolymorfní lokusy. Pravděpodobnost, ţe dva markery budou od sebe odděleny zlomem způsobeným zářením, bude tím větší, čím vzdálenější bude pozice sledovaných markerů. U prasat byl vytvořen radiačně hybridní panel celého genomu s osmnáctkrát vyšším rozlišením neţ při běţné vazbové analýze. Tento panel je tvořen 126 klony (YERLE et al., 1998). HAWKEN et al. (1999) studovali lokalizaci 900 markerů. Odhalili 128 vazbových skupin rozloţených na všech prasečích chromozomech. Později byl panel zredukován na 90 klonů, které jsou vyhovující pro dostatečné mapování. Panel, označovaný jako IMpRH panel, je poskytován zájemcům o mapování pomocí radiačně hybridního panelu buněk a software pro vyhodnocování výsledků je volně dostupný na internetu (https://wwwlgc.toulouse.inra.fr/pig/RH/IMpRH.htm).
26
2.5.2 Vazbové mapování Cílem vazbového mapování je zjištění vzájemné polohy lokusů ve vazbové skupině. Vzdálenost je udávána v centimorganech (cM). Jeden centimorgan odpovídá v klasické hybridologické analýze 1 % rekombinací. Celé vazbové mapování stojí na základním předpokladu, ţe procento rekombinací mezi vzdálenějšími markery je vyšší neţ mezi markery bliţšími. Detekce vazby a stanovení její síly, tedy vzdálenosti mezi geny se provádí pomocí statistické metody LOD skóre. Protoţe byly pozorovány značné rozdíly v procentu rekombinací mezi pohlavími s jasnou tendencí nárůstu u samic, je nutné počet rekombinací mezi pohlavími zprůměrovat. Průměrný poměr rekombinantů samec:samice byl odhadnut na 1,0:1,4. Nicméně tento poměr se liší mezi jednotlivými chromozomy i mezi segmenty uvnitř chromozomů (MARKLUND et al., 1996). Tvorba vazbových map má dva poţadavky: vhodné rodiny zvířat se známým rodokmenem a dostatečný počet polymorfních lokusů. Nejčastěji se pouţívá „intercross desing“. Rodičovská generace sestává z čistých plemen, nejlépe geneticky co nejodlišnějších. Genetické markery musí splňovat několik kritérií: být rovnoměrně rozloţeny po celém genomu a na chromozomech, být vysoce polymorfní (měly by mít několik dobře rozlišitelných alel) a snadno a levně testovatelné běţnými metodami (BRASCAMP et al., 1995). Nejčastěji pouţívanými markery jsou mikrosatelity, AFLPs (amplified fragment length polymorphisms) a v poslední době hlavně SNPs (single nucleotide polymorphisms) (ROTHSCHILD, 2003).
2.5.3 Real-time RT-PCR Real-time RT-PCR umoţňuje velmi citlivou absolutní i relativní kvantifikaci mRNA. Metoda zahrnuje detekční rozmezí více neţ 107 (BUSTIN et al., 2005). Metoda real-time RT-PCR je zaloţena na přepisu mRNA na cDNA reverzní transkriptázou. Enzym reverzní transkriptáza potřebuje pro zahájení přepisu přítomnost primeru. Primery pro reverzní transkripci (RT) mohou být specifické, náhodné nebo primery sloţené z několika tyminů za sebou – oligo-dT primery. cDNA získaná reverzní transkripcí je následně ve speciálním přístroji zmnoţena pomocí PCR, při které je amplifikovaný PCR produkt v reálném čase monitorován a hodnoty jeho fluorescence jsou zaznamenávány. Fluorescenci produkuje pouţitý fluorofor 27
(hybridizační sonda, interkalační barvivo), který je excitován halogenovou lampou nebo laserem. Graficky je průběh PCR reakce znázorněn na obrázku 4. Během počátečních cyklů PCR dochází jen k mírným oscilacím fluorescence, tedy nedochází k detekovatelnému nárůstu mnoţství PCR produktu (TICHOPAD et al., 2003; SCHMITTGEN et al., 2000). Toto počáteční stadium reakce je označováno jako Baseline. S přibývajícími cykly narůstá mnoţství PCR produktu a tím i mnoţství měřeného fluorescenčního signálu. Bod, ve kterém dochází k významnému nárůstu fluorescence, určuje hranici nazývanou Threshold. Threshold je pouţívaným softwarem vyhledáván na základě porovnávání hodnot Baseline a trendu hodnoty Rn, která se stanovuje jako poměr intenzity fluorescence fluoroforu hybridizujícího se vzorkem (reportér) a intenzity fluorescence fluoroforu nehybridizujícího se vzorkem (pasivní reference, např. ROX). Rn+ se určuje jako podíl intenzity fluorescence reportéru a intenzity fluorescence pasivní reference s templátem a Rn- jako podíl intenzity fluorescence reportéru a intenzity fluorescence pasivní reference bez templátu. ∆Rn je fluorescenční signál amplifikovaného templátu a stanoví se dle vzorce ∆Rn = Rn+ - Rn(GIBSON et al., 1996). Cyklus, ve kterém hodnota ∆Rn protne Threshold, je definován jako hodnota Threshold cycle (CT). NTC je označení pro kontrolní vzorek bez templátu (no template control).
Obr 4. Znázornění průběhu amplifikace při real-time RT-PCR (dle APPLIED BIOSYSTEMS, 2004)
28
2.5.3.1 Disociační analýza Díky vysoké citlivosti je metoda real-time RT-PCR poměrně náchylná k detekci případných nespecifických produktů, a to zejména jsou-li pouţívána nespecifická barviva (např. SYBR). Pro ověření specifičnosti PCR produktu je obvykle pouţívána disociační analýza (RIRIE et al., 1997). Při disociační analýze dochází postupným zvyšováním teploty k postupné denaturaci dsDNA (PCR produktu) a tím k odštěpení (disociaci) fluoroforu od dsDNA. Teplota, při které je denaturována polovina dsDNA, se nazývá disociační teplota – Tm (melting temperature). Intenzita fluorescene a tím i hodnota Tm je závislá na délce PCR produktu, zastoupení GC nukleotidů a pořadí nukleotidů v něm (RIRIE et al., 1997; VITZTHUM et al., 1999). Hodnota Tm je pro daný PCR produkt specifická (RIRIE et al., 1997; GIGLIO et al., 2003). Pomocí disociační analýzy lze odhalit i kontaminaci PCR reakce dimery primerů (Obr. 5). Jedná se o vzájemně spárované primery tvořící krátkou dsDNA, do které se můţe nespecifické fluorescenční barvivo inkorporovat. Intenzita takto vzniklé fluorescence závisí zejména na koncentraci primerů. Tm dimerů primerů se obvykle pohybuje do 75 °C (VANDESOMPELE et al., 2002a).
Obr. 5: Znázornění Tm křivek pro zkoumaný vzorek a dimery primerů (dle APPLIED BIOSYSTEM, 2004). Pozn. Nejvyšší bod odpovídá Tm.
29
2.5.3.2 Efektivita PCR reakce Efektivita hodnotí průběh PCR reakce. Za ideálních podmínek by se po kaţdém cyklu PCR mělo zdvojnásobit mnoţství templátu. Platila by tedy rovnice: P = T × 2n
[1],
kde P je mnoţství PCR produktu po n cyklech a T je původní mnoţství templátu před započetím reakce. Tato rovnice však platí pouze za ideálních podmínek a pouze v určitých fázích PCR. Skutečnost lépe vyjadřuje rovnice: P = T × (1 + E)n
[2],
kde E odpovídá hodnotě skutečné efektivity reakce (TICHOPÁD, 2004). Jedna z metod pro určení efektivity reakce (E) je zaloţena na výpočtu pomocí dekadického ředění z hodnoty slope standardní křivky dle vzorce: E = (10-1/slope - 1)
[3],
kde hodnota 10 znamená dekadické ředění a slope je strmost standardní křivky určená z grafu, který znázorňuje vztah logaritmických hodnot koncentrace jednotlivých ředění a dosaţených Ct hodnot (RUTLEDGE et CÔTÉ, 2003; STÅHLBERG et al., 2003). Hodnota procentuální efektivity by se ideálně měla pohybovat v rozmezí 90 – 105 %. Koeficient determinace by měl být větší neţ 0,980 (BIO-RAD LABORATORIES, 2011).
30
2.5.4 Kvantifikace genové exprese Pro zjištění mnoţství exprimované mRNA resp. sledovaného genu můţe být pouţita kvantifikace absolutní nebo relativní. Absolutní kvantifikace porovnává počáteční mnoţství vzorku s kalibračními křivkami, které jsou tvořeny standardy o známé koncentraci. Absolutní kvantifikace je ve spojení s real-time PCR pouţívaná například ke stanovení mnoţství geneticky modifikovaných surovin v potravinách (TOYOTA et al., 2006), stanovení koncentrace patogenů (DENG et al., 2008) nebo virové náloţe v organismu (WASILK et al., 2004; CIGLENEČKI et al., 2008).
2.5.4.1 Relativní kvantifikace Relativní kvantifikace popisuje změnu exprese zkoumaného genu v testovaném vzorku ve vztahu k expresi genu srovnávacího (referenčního). Pokud tedy chceme pomocí realtime RT-PCR kvantifikovat genovou expresi, je nutné současně s amplifikací sekvence specifické pro zkoumaný gen provést i amplifikaci genu referenčního. 2.5.4.1.1 Referenční geny Jako referenční geny jsou nejčastěji pouţívány tzv. udrţovací geny neboli housekeeping geny (HKG), které kódují esenciální proteiny zastoupené v organismu ve všech tkáních i ţivotních stádiích. Je všeobecně uznáváno, ţe exprese HKG by měla být za všech podmínek stejná (HARTL et JONES, 1998; LEE et al., 2007). Ţe ani exprese HKG není zcela neměnná, však ukazují analýzy prováděné např. pomocí real-time RT-PCR (např. AYERS et al., 2007; NYGARD et al., 2007) nebo i rozsáhlejší studie zaloţené na metodě microarray (např. HSIAO et al., 2001; LEE et al., 2007). Proto je pro zajištění správného průběhu relativní kvantifikace důleţitý také výběr referenčních genů. Analýzu stability genové exprese a tím i výběr vhodného referenčního genu usnadňují různé počítačové aplikace, jako je například geNorm (VANDESOMPELE et al., 2002b). Metoda analýzy stability exprese genů je zde zaloţena na přepočtu Ct hodnot získaných z real-time RT-PCR na relativní hodnoty, a to dle pořadí Ct hodnot. Stabilita jednotlivých testovaných
genů
je
pak
porovnávána
párovou
(VANDESOMPELE et al., 2002b).
31
variací
mezi
všemi
vzorky
2.5.4.1.2 Hodnocení relativní kvantifikace Relativní kvantifikaci je moţno hodnotit pomocí metody 2-∆∆CT, kterou popisuje LIVAK et SCHMITTGEN (2001) nebo materiál „User bulletin #2“ (APPLIED BIOSYSTEMS, 1997; 2001) a kterou pro výpočty vyuţívá aplikace 7500 System SDS Software v1.2 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). Tato metoda předpokládá ideální průběh PCR reakce, tedy efektivitu 100 %, coţ vyjadřuje číslice 2 ve vzorci. Hodnoty relativní kvantifikace (RQ) zkoumaného vzorku (target) jsou vztaţeny ke zvolenému kalibrátoru (např. tkáň, věková kategorie atd.), jehoţ RQ je rovno 1. Pro normalizaci hladiny exprese je pouţit referenční gen. Hodnota ∆∆CT se vypočítá dle vzorce: ∆∆CT = ∆CT target - ∆CT kalibrátoru
[4], kde
∆CT target = průměrné CT target - průměrné CT referenčního genu pro target
[5] a
∆CT kalibrátoru = průměrné CT kalibrátoru - průměrné CT ref. genu pro kalibrátor [6] Hodnota relativní kvantity zkoumaného vzorku je pak stanovena dle rovnice: RQ = 2-∆∆CT
[7]
32
3
CÍL PRÁCE Disertační práce byla zpracována v laboratořích Ústavu morfologie, fyziologie
a genetiky zvířat Mendelovy univerzity v Brně a Laboratořích genomiky ţivočichů Ústavu ţivočišné fyziologie a genetiky Akademie věd České republiky, v.v.i . v Liběchově. Toto studium bylo součástí výzkumného programu zaměřeného na studium genů podílejících se na myogenezi u prasat. Program zahrnoval identifikaci genů diferenčně exprimovaných ve fetálních kosterních svalech a svalech dospělých zvířat, jejich částečnou nebo úplnou strukturní analýzu a zjištění genomické organizace, identifikaci polymorfismů (včetně jejich dalšího vyuţití pro vazbové mapování, mapování QTL a asociační analýzu), studium mRNA exprese vybraných genů ve fetálních, postnatálních a dospělých svalech a v různých tkáních prasat. V rámci tohoto programu jsem se zaměřovala - buď ve spolupráci, nebo v návaznosti na předběţné výsledky získané v ÚŢFG AV ČR v Liběchově - na studium následujících aspektů: 1) Strukturní a genetické analýzy: výběr výrazně diferenčně exprimovaného genu (fetální sval – dospělý sval), kterým byl EEF1A1 určení mRNA sekvence a celé kódující genomické sekvence EEF1A1 studium polymorfismů v EEF1A1 2) Analýza stability genu EEF1A1 v různých tkáních dospělého prasete Vzhledem k přítomnosti sekvencí v genomu prasat homologních s EEF1A1 byl do programu zařazen i paralogní gen, EEF1A2, pro zjištění odlišnosti těchto dvou genů, a to jak strukturní, tak funkční. Toto studium pak zahrnovalo: identifikaci EST odpovídajícího pravděpodobně prasečímu EEF1A2 genu navrţení PCR primerů a amplifikace fragmentů genomické DNA EEF1A2 získání klonu PAC z prasečí genomické knihovny obsahující celý gen EEF1A2 získání genomické sekvence celého genu EEF1A2 a charakterizace jeho organizace identifikace polymorfismů v EEF1A2 vazbové a RH mapování EEF1A2 U obou genů (EEF1A1 a EEF1A2) pak bylo provedeno detailní komparativní studium exprese mRNA při vyuţití real-time RT-PCR ve fetálních a postnatálních svalech a svalech dospělých zvířat a rovněţ i studium exprese v různých tkáních. 33
4
MATERIÁL A METODY
4.1 Sledovaná populace zvířat Pro optimalizace PCR reakcí, sekvenování, detekci polymorfismů a klonování úseků, které nebylo moţno sekvenovat přímo z PCR fragmentů (dlouhé repetice, inzerce, delece), byl pouţit soubor jedinců, který zahrnoval dospělá zvířata plemen české bílé ušlechtilé, landrace, české výrazně masné, přeštické černostrakaté, pietrain, duroc, hampshire a meishan a také kříţence plemen meishan a pietrain. Pro vazbové mapování byla vyuţita hohenheimské třígenerační rodina meishan × pietrain (GELDERMANN et al., 2003). Pro analýzu stability genů byly pouţity tkáně z dospělých kříţenců několika plemen (50 % pietrain, 25 % L08 hybrid, 12,5 % bílé ušlechtilé a 12,5 % landrace). Od kaţdého z deseti jedinců byly odebrány vzorky sedmi tkání - plíce, srdeční svalovina, ledvina, slezina, játra, kosterní svalovina (musculus longissimus lumborum et thoracis) a bránice. Pro multiplex PCR bylo pouţito 12 tkání (kosterní svalovina - musculus longissimus lumborum et thoracis a musculus biceps femoris, jazyk, bránice, mozek, srdce, játra, ledvina, plíce, vaječníky, tuk a mízní uzlina) z dospělého kříţence několika plemen prasat (50 % pietrain, 25 % L08 hybrid, 12,5 % české bílé ušlechtilé a 12,5 % landrace) a dále byly pouţity vzorky selat různého stáří, vţdy dva jedinci z různé věkové kategorie – selata 1 den, 7 dní a 14 dní stará. U selat jeden den starých se jednalo o plemeno landrace a kříţence landrace × duroc, u selat sedm dní starých o plemeno landrace a u selat 14 dní starých opět o plemeno landrace a o kříţence landrace × české bílé ušlechtilé. Od těchto selat byly odebrány vzorky z kosterní svaloviny (musculus longissimus thoracis et lumborum), mozku, srdce, jater, ledviny a plic. Pro analýzu exprese pomocí real-time RT-PCR byl pouţit výše popsaný soubor selat (selata 1 den, 7 dní a 14 dní stará) a dále opět dva vzorky plodů (44 dní starých) plemene české bílé ušlechtilé a dva vzorky dospělých zvířat, kdy se jednalo opět o kříţence několika
plemen
(50 % pietrain,
25 % L08 hybrid,
12,5 % české
bílé
ušlechtilé
a 12,5 % landrace). Z plodů byly odebrány vzorky kosterní svaloviny z pánevní končetiny. U ostatních jedinců byly odebrány vzorky kosterní svaloviny (musculus longissimus thoracis et lumborum), mozku, srdce, jater, ledviny a plic. Odběry vzorků tkání byly vţdy prováděny pod dohledem veterinárního lékaře a byly dodrţeny veškeré zásady etického zacházení se zvířaty.
34
4.2 Nukleové kyseliny V předkládané práci byla k analýzám pouţita deoxyribonukleová kyselina (DNA) i ribonukleová kyselina (RNA), respektive komplementární DNA (cDNA). 4.2.1 Izolace DNA DNA byla izolovaná z krve pomocí QIAamp Blood Kitu (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). Při izolaci byl dodrţován postup dle protokolu výrobce. DNA byla následně vizuálně kontrolována. Na 1% agarosový gel (Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, Německo) s přídavkem ethidium bromidu (0,1 µg na 1 ml gelu) bylo nanášeno 5 µl DNA smíchané s nanášecím pufrem (40% sacharóza a bromfenolová modř). Po elektroforéze (10 – 20 minut při napětí 100 V) byla v UV-světle hodnocena kvalita získané DNA (Obr. 6). Jako velikostní marker byl pouţit DNA hmotnostní marker (MBI Fermentas, Vilnius, Litva).
Obr. 6: Izolovaná DNA Pozn. M 100+ - hmotnostní marker, VZ 1 a VZ 2 – izolovaná DNA
4.2.2 Izolace RNA Vzorky jednotlivých tkání byly po odběru okamţitě vkládány do stabilizačního činidla RNAlater (QIAGEN, Hilden, Německo) a uchovávány při -20 °C. Homogenizace vzorků byla prováděna na přístroji FastPrep FP 120 (ThermoSavant, Holbrook, NY, USA) a celková RNA byla izolována pomocí kitu FastRNA Pro Green Kit (Q-BIOgene, Solon, Ohio, USA) u vzorků pro určení stability exprese housekeepingových genů a kitu RNA blue Kit (Top-Bio, Praha, Česká republika) u vzorků pouţitých pro analýzu rozdílů v expresi genů EEF1A1 a EEF1A2.
35
Izolovaná RNA byla následně vizuálně kontrolována pomocí formaldehydové gelové elektroforézy, jejíţ metodika dle BRYANT et MANNING (1998) byla upravena pro podmínky naší laboratoře. 1% FA agarozový gel (Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, Německo) byl připraven dle tabulky 3 a před nanášením vzorků byl 30 minut ponořen v 1 × FA pufru (viz tabulka 4). 4 µl izolované RNA smíchané s 1 µl nanášecího pufru (viz tabulka 2) byly inkubovány 3 – 5 minut při 65 ºC pak ihned ochlazeny na ledu a nanášeny na gel. Tab. 1: Sloţení 10 × FA pufru
Tab. 2: Sloţení nanášecího pufru pro RNA
Nanášecí pufr pro RNA (2 ml)
10 × FA pufr (250 ml) Použitá chemikálie MOPS octan sodný 0,5 M EDTA (pH 8) voda bez RNáz
Množství 10,465 g 1,025 g 5 ml 245 ml
Tab. 3: Sloţení FA gelu
Použitá chemikálie Množství (µl) nasycený vodný roztok bromfenolové modři 3,2 16 0,5 M EDTA (pH 8) 144 37% (12,3 M) formaldehyd 400 glycerol 616,8 formamid 10 × FA pufr 800 voda bez RNáz 20 Tab. 4: Sloţení 1 × FA pufru
FA agarozový gel (30 ml) Použitá chemikálie agaroza (Serva) 10 × FA pufr voda bez RNáz
Množství 0,36 g 3 ml 27 ml
1 × FA pufr (500 ml) Použitá chemikálie Množství (ml) 10 × FA pufr 50 10 37% (12,3 M) formaldehyd 440 voda bez RNáz
Po elektroforéze (20 minut při napětí 100 V) byla v UV-světle hodnocena kvalita získané RNA (Obr. 7). Jako velikostní marker byl pouţit RNA Ladder, High Range (Fermentas, Ontario, Kanada).
RNA Ladder
sval S14
srdce S14
srdce S14
sval S7
Obr. 7: Celková RNA izolovaná z různých tkání
36
srdce S7
Případná kontaminace DNA byla odstraňována pomocí Ambion® DNA-free™ DNase Treatment and Removal Reagent (Applied Biosystems Foster City, CA, USA). Koncentrace a čistota jednotlivých vzorků byla spektrofotometricky stanovena na přístroji GeneQuant (Pharmacia Bitech Ltd., Cambridge, UK). Naměřená koncentrace se u vzorků pouţitých pro analýzu rozdílů v expresi genů EEF1A1 a EEF1A2 pohybovala v rozmezí 0,32 – 5,82 μg/μl a čistota byla 92 – 100 %.
4.2.3 Reverzní transkripce Vţdy 1 μg RNA z kaţdého vzorku byl pomocí Omniscript® Reverse Transcriptase kitu (QIAGEN, Hilden, Německo) převeden na cDNA. Pro zamezení degradace RNA byl do reakce přidáván inhibitor RNáz (RiboLock™ RNase Inhibitor; Frementas, Ontario, Kanada). Jako primery pro reverzní transkriptázu byly pouţity krátké oligonukleotidy – Oligo(dT)20 Primer (Invitrogen, Carlsbad, California, USA), tedy primery specificky se vázající na polyA konec mRNA.
37
4.3 Pouţité metody Při zpracovávání disertační práce byly vyuţity následující metody: polymerázová řetězová reakce (PCR), sekvenování, „primer walking“, klonování DNA, mapování pomocí radiačně hybridního panelu buněk, PCR-RFLP, vazbové mapování, multiplex PCR, relativní kvantifikace pomocí PCR v reálném čase (real-time RT-PCR) 4.3.1 Polymerázová řetězová reakce PCR byla prováděna na teplotním cykleru PTC-100™ (fy MJ Research. Inc.). Primery byly vybírány pomocí aplikace
OLIGO v 4.0 popsané
v publikaci RYCHLIK et
RHOADS (1989). Po ukončení amplifikace byla provedena kontrola kvality PCRproduktu. Na 1 – 2% agarosový gel (Serva) s přídavkem ethidium bromidu (0,1 µg na 1 ml gelu) bylo nanášeno 5 µl PCR-produktu smíchaného s nanášecím pufrem (40% sacharóza a bromfenolová modř). Po elektroforéze (10 – 20 minut při 100 V) byl PCR-produkt vizualizován v UV-světle. Byl posuzován výskyt nespecifických fragmentů a mnoţství amplifikované DNA. Velikost produktů byla ověřována pomocí DNA hmotnostních markerů (MBI Fermentas, Vilnius, Litva). Koncentrace PCR-produktů byla určována porovnáváním intenzity fluorescence zkoumaného vzorku s intenzitou fluorescence standardů o známé koncentraci (Obr. 8).
Obr 8. Stanovení koncentrace PCR-produktů pomocí standardů Pozn. VZ1 – VZ4 jsou označny vzorky jednotlivých PCR-produktů, ST1 – ST6 jsou standardy
38
4.3.1.1 Gen EEF1A1 Amplifikace zkoumaného úseku genu EEF1A1 byla prováděna pomocí primerů uváděných v tabulce 5. V PCR reakci (25 µl) bylo pouţito 18,8 µl deionizované vody, 2 µl lyzátu DNA, 2,5 µl 10 × LA PCR kompletního pufru (Top Bio, Praha, ČR), 0,5 µl dNTP (MBI Fermentas, Vilnius, Litva), 0,5 µl kaţdého primeru (10 pmol/µl) (KRD, Praha, ČR) a 0,2 µl LA DNA polymerázy – LA (Top Bio, Praha, ČR). Teplotní profil reakce byl: 95 ºC/2 minuty – 30 × (95 ºC/20 s, 60 ºC/20 s, 68 ºC/60 – 90 s) – 68 ºC/7 minut. Tab. 5: Primery pro analýzu genu EEF1A1 z genomické DNA
Analýza sekvence EEF1A1 z genomické DNA Umístění Délka Teplota MgCl 2 Název Sekvence primeru (5´-3´) v genom. ampl. anneal. primeru (mM) sekvenci (bp) (°C)
Výchozí sekvence FM_995600
EEF_2A acgtcgattcgggcaagtc
exon 2
857
60
2,25
EEF_2B ccagaaattggcacaaatgcta exon 4 Pozn.: A = přímý (forward) primer, B = zpětný (reverse) primer
Poznámky LA DNA polymeráza, sekvenování
4.3.1.2 Gen EEF1A2 Sekvence genu EEF1A2 z genomické DNA byla získána pomocí primerů uvedených v tabulce 6. V PCR reakcích (o celkovém objemu 25 µl) bylo pro primery označené EEF2_2 – EEF2_4 pouţito 18,8 µl deionizované vody, 2 µl lyzátu DNA, 2,5 µl 10 × LA PCR kompletního pufru (Top Bio, Praha, ČR), 0,5 µl dNTP (MBI Fermentas, Vilnius, Litva), 0,5 µl kaţdého primeru (10 pmol/µl) (KRD, Praha, ČR) a 0,2 µl LA DNA polymerázy – LA (Top Bio, Praha, ČR) a teplotní profil reakce byl: 95 ºC/2 minuty – 30 × (95 ºC/20 s, 62 ºC/30 s, 68 ºC/60 s) – 68 ºC/7 minut. Pro primery s označením EEF2_1 bylo pouţito 16,8 µl deionizované vody, 2 µl lyzátu DNA, 2,5 µl 10x LA PCR pufru bez Mg2+ (Top Bio, Praha, ČR), 0,5 µl dNTP (MBI Fermentas, Vilnius, Litva), 0,75 µl kaţdého primeru (10 pmol/µl) (KRD, Praha, ČR), 1,5 µl MgCl2 25mM (QIAGEN Inc. Valencia, CA, USA) a 0,2 µl LA DNA polymerázy – LA (Top Bio, Praha, ČR) a teplotní
profil
byl:
95 ºC/2 minuty – 30 × (95 ºC/20 s,
65 ºC/30 s,
68 ºC/60 s) –
68 ºC/7 minut. Pro primery navrhované dle sekvence FM992107.1 bylo pouţito 9,5 µl deionizované vody, 2 µl lyzátu DNA, 0,5 µl kaţdého primeru (KRD, Praha, ČR) a 12,5 µl HotStar Taq™ Master Mix (QIAGEN Inc. Valencia, CA, USA) a teplotní profil byl: 95 ºC/15 minut – 35 × (95 ºC/20 s, 60 ºC/30 s, 72 ºC/40 s) – 72 ºC/10 minut. 39
Tab. 6: Primery pro analýzu sekvence genu EEF1A2 z genomické DNA
Analýza sekvence EEF1A2 z genomické DNA Umíst. v Sekvence primeru (5´-3´) genom. sekv. EEF2_1A cgacaacatgctggagccct exon 4 EEF2_1B gagcctccagcagggacacg exon 5 EEF2_2A ggttcaagggctggaaagtgga exon 5 EEF2_2B ggcctcgctcagagcctcg exon 6 TC_348097 EEF2_3A accttcgcgcccgtgaaca exon 6 EEF2_3B gggccgtgtggcagtcaatg exon 7 EEF2_4A gcagatcagcgccggctact exon 7 EEF2_4B gccgctcttcttctccacgttc exon 8 EEF2_27A gtgggcaccgcacagacatt intron 1 EEF2_16B agaaaggggaggtcagccagtg intron 2 EEF2_22A attttgcagacagtgggggtgc intron 2 EEF2_15B gggacaccctgacctcaaccaa intron 2 EEF2_26A caagccagagagccccaggt exon 2 FM_992107 EEF2_17B gacaccctgcaaacaccctcag intron 2 EEF2_28A gaaagagctggaaggcaggg intron 2 EEF2_14B ggcctctgtgtctgaccttgaa intron 3 EEF2_29A ctcgccctcaaagaactgacca intron 3 EEF2_12B gcaccgcacgtgtccacac intron 4 Pozn.: A = přímý (forward) primer, B = zpětný (reverse) primer Výchozí sekvence
Název primeru
Délka Teplota MgCl 2 ampl. anneal. (mM) (bp) (°C) 745
65
1,5
1224 1447
62
Poznámky
2,0
LA DNA polymeráza, sekvenování
878 969 Taq DNA polymeráza
646 989
60
1,5
(HotStarTaq™ Master Mix),
903
sekvenování
697
4.3.2 Sekvenování a analýza jeho výsledků Ke stanovení sekvencí analyzovaných úseků DNA byla pouţita Sangerova sekvenační metoda (SANGER et al., 1977). Pomocí značených dideoxinukleotidů a za pouţití automatického sekvenátoru ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Ca, USA) bylo prováděno přímé sekvenování PCR produktů. Při analýzách byly dodrţovány pokyny výrobců jednotlivých kitů. Před pouţitím v sekvenační reakci byly PCR-produkty nejprve přečištěny pomocí MinElute™ PCR Purification kitu (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) a kvantifikovány porovnáním s DNA hmotnostními markery (MBI Fermentas, Vilnius, Litva) (Obr. 8). Sekvenační směs byla připravena z přečištěného PCR produktu, specifického primeru a Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kitu v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvenační reakce o celkovém objemu 20 μl probíhala v amplifikátoru GeneAmp®PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) za těchto podmínek: 96 ºC/1 minuta – 25 × (96 ºC/10 s, 50 ºC/5 s, 60 ºC/4 minuty). Výsledná sekvenační směs byla dále přečištěna pomocí kolonek SigmaSpin™ PostReaction Clean-Up Columns (Sigma-Aldrich®) a precipitována etanolem nebo přečištěna
40
kitem BigDye® XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Poté byla sekvenační směs vloţena do sekvenátoru a analyzována pomocí aplikací Sequencing Analysis Software v3.7 a Sequence Scanner v1.0 (Applied Biosystems, Foster City, Ca, USA). Získané sekvence byly porovnávány pomocí online nástroje ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) a aplikace SeqScape v2.1 (Applied Biosystems, Foster City, Ca, USA).
4.3.3 „Primer walking“ Analýze sekvence genu EEF1A2 z genomické DNA předcházelo nalezení sekvence EST v databázi The Gene Index Project (TC348097; http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/), která byla homologní se sekvencí lidského EEF1A2 (Ensembl, ENST00000217182; http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index). Na základě této sekvence byly navrţeny primery pro amplifikaci fragmentů genomické DNA (viz tabulka 6). Pomocí páru primerů EEF2_9A, EEF2_9B (viz tabulka 7) byl identifikován (ve spolupráci s Prof. C. Knorrem, Gottingen University, Německo) klon PAC v prasečí genomické knihovně (PAC-TAIGP714, plemeno německá landrace; AL-BAYATI et al., 1999) a následně byl celý gen v klonu PAC sekvenován při vyuţití strategie „primer walking“. Podmínky pro amplifikaci PCR-produktu EEF2_9A9B o délce 169 bp byly 95 ºC/2 minuty – 30 × (95 ºC/20 s, 60 ºC/20 s, 68 ºC/30 s) – 68 ºC/7 minut. Koncentrace DNA klonu PAC byla 520 ng/µl, do kaţdé sekvenační reakce bylo tedy pouţito 3,85 µl. Sekvenační směs byla připravena z DNA klonu PAC, specifického primeru a Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kitu v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Byly dodrţeny pokyny výrobce kitu. Sekvenační reakce o celkovém objemu 20 μl probíhala v amplifikátoru GeneAmp®PCR Systém 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Jako první byly pouţity primery navrţené podle prasečí EST sekvence TC348097. Po úspěšném sekvenování byl získaný úsek ke stávající sekvenci připojen a vznikla tak tzv. „referenční sekvence“ (vţdy s postupně narůstajícím číslem), podle které byly navrhovány primery pro další analýzu. Všechny primery byly navrţeny pomocí aplikace OLIGO v4.0 (RYCHLIK et RHOADS, 1989) a jsou uvedeny v tabulce 7. U většiny primerů platily následující podmínky: 95 ºC/5 minut – 60 × (95 ºC/30 s, 60 ºC/10 s, 60 ºC/4 minuty). Pouze u primerů EEF2_12A a EEF2_14B byla teplota annealingu 55 ºC a u primeru EEF2_10A 65 ºC. 41
Tab. 7: Primery pro analýzu sekvence genu EEF1A2 z DNA klonu PAC
Analýza sekvence EEF1A2 z DNA klonu PAC Umístění Sekvence primeru (5´-3´) v genom. Poznámky sekvenci exon 4 primer walking TC_348097 EEF2_1A cgacaacatgctggagccct exon 6 primer walking TC_348097 EEF2_3A accttcgcgcccgtgaaca EEF2_8A atcccagctgcatctgcaaccta intron 6 ověření sekvence ref 2 EEF2_9A tgagcaagtatgaggcccagga intron 5 mapování ref 2 exon 8 primer walking TC_348097 EEF2_10A cgacatgaggcagacggtgg EEF2_12A gctcttcacgcctcctaccc intron 7 primer walking ref 5 EEF2_15A gggtctctctgagaatgggatgag 3´ UTR primer walking ref 6 EEF2_23A cctggtgccctcctctggtg intron 6 primer walking ref 12 exon 6 primer walking TC_348097 EEF2_2B ggcctcgctcagagcctcg exon 7 primer walking TC_348097 EEF2_3B gggccgtgtggcagtcaatg exon 8 primer walking TC_348097 EEF2_4B gccgctcttcttctccacgttc EEF2_8B gcattgccatgagctgtggtgt intron 6 ověření sekvence ref 2 EEF2_9B ctggtctccctggcggtgac intron 5 primer walking, mapování ref 2 EEF2_12B gcaccgcacgtgtccacac intron 4 primer walking ref 4 EEF2_14B ggcctctgtgtctgaccttgaa intron 3 primer walking ref 5 EEF2_15B gggacaccctgacctcaaccaa intron 2 primer walking ref 6 EEF2_17B gacaccctgcaaacaccctcag intron 2 primer walking ref 7 EEF2_18B ctcccatctggacgctccga intron 2 primer walking ref 8 ref 9 EEF2_19B ggagagatggagacacccaggct intron 1 primer walking ref 10 EEF2_20B ttcctctgctgacagggtcaca intron 1 primer walking ref 11 EEF2_21B gagccgaggtctcagccagag exon 1 primer walking ref 12 EEF2_22B gctgcagttcctgccgtacca 3´ UTR primer walking ref 12 EEF2_25B gaagacaggtgggtgggtggt intron 5 primer walking Pozn.: A = přímý (forward) primer, B = zpětný (reverse) primer, ref = referenční sekvence Výchozí sekvence
Název primeru
4.3.4 Klonování vybraných úseků DNA V některých úsecích analyzované DNA genu EEF1A2 se vyskytovaly repetice, které znemoţňovaly sekvenování genomické DNA výše popsaným způsobem. Proto byly PCRprodukty, které tyto úseky DNA zahrnovaly, klonovány a následně znovu sekvenovány. PCR-produkty byly nejprve přečištěny pomocí MinElute PCR Purification kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). Pak byla za pouţití QIAGEN PCR Cloning kit provedena ligace a transformace do QIAGEN EZ Competent Cells (QIAGEN Inc. Valencia, CA, USA). Výsledná směs byla rozetřena na Petriho misky s připraveným agarem. Ten vznikl z LB media (Luria Bertani, Invitrogen) připraveného z tryptonu, kvasnicového extraktu, NaCl, agaru a deioninizované vody (pH = 7), které bylo autoklávováno. Po vychlazení na 55 ºC do něj byl přidán ampicilin (100 mg/ml) (Sigma) a po zaschnutí byl na povrch aplikován X-gal (40 mg/ml) (Sigma) s IPTG (100 mM) (Sigma). Po vsáknutí výsledné směsi do agaru byly misky otočeny dnem vzhůru a inkubovány v termostatu při 37 °C přes noc. Bílé kolonie, které přes noc narostly, byly pomocí párátka vloţeny do LB media s ampicilinem a míchány na třepačce při 37 °C přes noc. Následná izolace plazmidové DNA byla 42
provedena pomocí QIAGEN Plasmid Mini kitu (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). Postupy byly dodrţovány dle protokolů výrobce. Primery pro klonované PCR-produkty jsou uvedeny v tabulce 8. Podmínky PCR reakce pro primery EEF2_1A1B jsou uvedeny v kapitole 4.3.1.2. Do PCR reakce (o celkovém objemu 25 µl) s primery EEF2_4A5B bylo pouţito 18,8 µl deionizované vody, 2 µl lyzátu DNA, 2,5 µl 10 × LA PCR kompletního pufru (Top Bio, Praha, ČR), 0,5 µl dNTP (MBI Fermentas, Vilnius, Litva), 0,5 µl kaţdého primeru (10 pmol/µl) (KRD, Praha, ČR) a 0,2 µl LA DNA polymerázy – LA (Top Bio, Praha, ČR) a teplotní profil reakce byl 95 ºC/2 minuty – 30 × (95 ºC/20 s, 60 ºC/30 s, 68 ºC/40 s) – 68 ºC/7 minut. Tab. 8: Primery pro analýzu vybraných úseků genu EEF1A2 pomocí klonování
Analýza vybraných úseků genu EEF1A2 pomocí klonování Umístění Délka Teplota MgCl 2 Sekvence primeru (5´-3´) v genom. ampl. anneal. Poznámky (mM) sekvenci (bp) (°C) EEF2_1A cgacaacatgctggagccct exon 4 745 65 1,5 EEF2_1B gagcctccagcagggacacg exon 5 LA DNA TC_348097 EEF2_4A gcagatcagcgccggctact exon 7 polymeráza 359 60 2,0 EEF2_5B cgtgtgctccgggagacaaa intron 7 Pozn.: A = přímý (forward) primer, B = zpětný (reverse) primer Výchozí sekvence
Název primeru
4.3.5 Mapování pomocí radiačně hybridního panelu buněk Gen EEF1A2 byl mapován na radiačním hybridním panelu. Mapování bylo uskutečněno na Univerzitě v Ghentu (prof. L. J. Peelman, Dr. M. Van Poucke). Byl pouţit celogenomový 7000-rad panel INRA – University Minnesota (IMpRH) (YERLE et al., 1998; HAWKEN et al., 1999), který pouţívá 90 klonů a obsahuje prasečí a křeččí chromozomy. K mapování byly vyuţity primery EEF2_9A a EEF2_9B (viz tabulka 7). Výsledky
byly
analyzovány
pomocí
IMpRH
aplikace
dostupné
na
http:\\imprh.toulouse.infra.fr. Radiační hybridní mapa byla zkonstruována pomocí statistické aplikace RHMAP3.0 (LANGE et al., 1995). Dvoubodové vzdálenosti mezi jednotlivými markery byly počítány pomocí aplikace RH2PT. Pro definování vazbové skupiny byla pouţita prahová hodnota „lod score“ 4,8.
43
4.3.6 Polymorfismus a vazbové mapování 4.3.6.1 PCR Vazbové mapování bylo provedeno za pouţití SNP EEF1A2 FM992107:g.C>G. Amplifikace zkoumaného úseku genu EEF1A2 o délce 212 bp, ve kterém byl SNP obsaţen, byla prováděna pomocí primerů uváděných v tabulce 9. Tab. 9: Primery pro analýzu polymorfismu v genu EEF1A2
Analýza polymorfismu EEF1A2 Výchozí sekvence
Název primeru
Sekvence primeru (5´-3´)
Umístění v genom. sekvenci
EEF2_11A ctgaggtcaagtgggtggagatg exon 6 EEF2_11B cgctgcctgggaagacgg intron 6 Pozn.: A = přímý (forward) primer, B = zpětný (reverse) primer ref 3
Délka Teplota ampl. anneal. Poznámky (bp) (°C) 212
64
HotStar Mix
V PCR reakci (25 µl) bylo pouţito 9,5 µl deionizované vody, 2 µl lyzátu DNA, 0,5 µl kaţdého primeru (10 pmol/µl) (KRD, Praha, ČR) a 12,5 µl HotStar mixu (Qiagen). Teplotní profil reakce byl: 95 ºC/15 minut – 30 × (95 ºC/20 s, 64 ºC/20 s, 72 ºC/10 s) – 72 ºC/10 minut. Po ukončení amplifikace byla provedena kontrola kvality PCR-produktu. Na 3% agarosový gel (Serva) s přídavkem ethidium bromidu (0,1 µg na 1 ml gelu) bylo nanášeno 5 µl PCR-produktu smíchaného s nanášecím pufrem (40% sacharóza a bromfenolová modř). Výsledek byl vizualizován UV-světlem. 4.3.6.2 PCR-RFLP Získaný úsek byl štěpen pomocí enzymu Hin6I (Fermentas). Štěpení probíhalo v termostatu při 37 ºC po dobu 12 hodin. Výsledky štěpení byly ověřovány na 4% agarózovém gelu obsahujícím barvivo GelStar® Nucleic Acid Gel Stain (FMC Corporation, Philadelphia) a vizualizovány UV-světlem. Za přítomnosti alely C docházelo ke štěpení na fragmenty 173 bp a 39 bp, v přítomnosti alely G zůstával fragment neštěpen. Elektroforéza pro ověření výsledku PCR i RFLP probíhala v TBE pufru při napětí 100 V po dobu 30 - 40 minut. Velikost produktů byla ověřována pomocí DNA hmotnostních markerů (MBI Fermentas, Vilnius, Litva). 4.3.6.3 Vazbové mapování Vazbové mapování genu EEF1A2 bylo provedeno na hohenheimské třígenerační rodině meishan × pietrain (počet informativních meióz byl 626) pomocí CRI-MAP aplikace (GREEN et al., 1990). 44
4.3.7 Mnohonásobná PCR (multiplex PCR) Exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v různých tkáních prasete byla prokazována pomocí multiplex PCR. Kromě zmiňovaných dvou genů byl v reakci jako referenční gen pouţit ještě GAPDH. Primery pro jednotlivé geny jsou uvedeny v tabulce 10. Do reakce o celkovém objemu 12,5 µl bylo pouţito 3,45 µl deionizované vody, 1 µl lyzátu cDNA, 0,2 µl kaţdého primeru pro gen GAPDH, 0,3 µl kaţdého primeru pro gen EEF1A2 a 0,4 µl kaţdého primeru pro gen EEF1A1 (všechny primery KRD, Praha, ČR) a 6,25 µl HotStar Taq™ Master Mix (QIAGEN Inc. Valencia, CA, USA). Teplotní profil reakce byl: 95 ºC/15 minut – 30 × (95 ºC/20 s,
60 ºC/20 s,
72 ºC/30 s) – 72 ºC/10 minut.
Stejný
teplotní profil byl pouţit i na PCR pro jednotlivé geny samostatně. Vzniklé PCR-produkty byly pouţity jako referenční. Do těchto reakcí bylo pouţito 4,75 µl deionizované vody, 1 µl lyzátu cDNA, po 0,25 µl jednotlivých primerů (KRD, Praha, ČR) a 6,25 µl HotStar Taq™ Master Mix (QIAGEN Inc. Valencia, CA, USA). Tab. 10: Primery pro analýzu exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v různých tkáních prasete
Analýza exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 pomocí multiplex PCR Umístění Délka Teplota Sekvence primeru (5´-3´) v genom. ampl. anneal. Poznámky sekvenci (bp) (°C) EEF_11A ttgcattctaccaccaactcgt exon 5 NM_001097418.1 157 EEF_11B aacattgactggagcaaaggtg exon 6 Taq DNA EEF2_7A aacgtgtcagtcaaggacatcc exon 6 polymeráza 60 FM_992107 111 EEF2_7B cgggtggttcagaatgatga exon 7 (HotStarTaq™ Master Mix) GAPDH_3A aaaggccatcaccatcttcc exon 4 AF_141959 135 GAPDH_3B gccccacccttcaagtgagcc exon 5-6 Pozn.: A = přímý (forward) primer, B = zpětný (reverse) primer Výchozí sekvence
Název primeru
Výsledek byl ověřen na 4% agarosovém gelu (Serva) s přídavkem ethidium bromidu (0,1 µg na 1 ml gelu). Na gel byly nanášeny 4 µl PCR-produktu z multiplex PCR a pro ověření velikosti produktů 4 µl DNA hmotnostního markeru (MBI Fermentas, Vilnius, Litva) a 3 µl PCR-produktu jednotlivých genů. Kaţdý vzorek byl smíchán s nanášecím pufrem (40% sacharóza a bromfenolová modř). Po elektroforéze (10 – 20 minut při 100 V) byly PCR-produkty vizualizovány v UV-světle.
45
4.3.8 Analýza stability genu EEF1A1 v různých tkáních dospělého prasete PCR primery pro testování všech zkoumaných genů byly navrţeny pomocí programu OLIGO v 4.0 (RYCHLIK et RHOADS, 1989) a jsou uvedeny v tabulce 11. Tab. 11: Primery pro analýzu stability exprese genů v různých tkáních dospělého prasete Analýza stability exprese genů v různých tkáních dospělého prasete Umístění v Délka Teplota genom. ampl. anneal. Pozn. sekvenci (bp) (°C) EEF_8A tcattgatgctccaggacaca exon 3 NM_001097418.1 127 EEF_8B ccgttcttggaaatacctgctt exon 4 GAPDH_1A cagcaatgcctcctgcacca exon 6 a 7 70 GAPDH_1B gatgccgaagtggtcatgga exon 7 AF141959 GAPDH_3A aaaggccatcaccatcttcc exon 4 135 GAPDH_3B gccccacccttcaagtgagcc exon 5 a 6 ACTB_1A catcaggaaggacctctacgc exon 5 129 ACTB_1B gcgatgatcttgatcttcatgg exon 5 a 6 Power ACTB_2A ttcctgggcatggagtcc exon 4 a 5 U07786 164 SYBR® ACTB_2B agggccgtgatctccttct exon 5 Green ACTB_3A aagtgcgacgtggacatcag exon 5 60 143 PCR ACTB_1B gcgatgatcttgatcttcatgg exon 5 a 6 Master PPIA_1A gcactggtggcaagtccat exon 4 71 Mix PPIA_1B aggacccgtatgcttcagga exon 4 PPIA_2A tccttcgagctgtttgcaga exon 1 a 2 NM_214353 140 PPIA_2B aagtcaccaccctggcacat exon 3 a 4 PPIA_3A ctgagtggttggatggcaaa exon 4 a 5 130 PPIA_3B ccacagtcagcaatggtgatct exon 5 HPRT_1A aaggacccctcgaagtgttg exon 7 NM_001032376 122 HPRT_1B cacaaacatgattcaagtccctg exon 8 a 9 TOP2B_2A ctaatgatgctggtggcaaac exon 11 a 12 AF222921 100 TOP2B_2B ccgatcactcctagcccag exon 12 Pozn.: A = přímý (forward) primer, B = zpětný (reverse) primer Výchozí sekvence
Název primeru
Sekvence primeru (5´-3´)
Reakce byly prováděny na přístoji 7500 Real time PCR System (Applied Biosystems Foster City, California, USA) za pouţití kitu Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems Foster City, California, USA). Koncentrace primerů byla 200 nM. Před vlastní real-time RT-PCR byly vzorky proti případné kontaminaci PCR produktem z předchozí PCR ošetřeny přidáním enzymu AmpErase® Uracil N-glykosyláza (Applied Biosystems, Foster City, California, USA), a to po dobu 2 minuty při 50 °C.
46
4.3.8.1 Stanovení efektivity reakce Z cDNA získaných ze zkoumaných tkání byly vţdy pro kaţdou tkáň vytvořeny směsné vzorky a z nich namíchány dekadické ředící řady. Efektivita reakce byla ověřována pomocí standardní křivky vzniklé dekadickým ředěním za následujících reakčních podmínek: počáteční denaturace 10 minut / 95 °C, cyklování 50 × (15 s / 95 °C a 1 minuta / 60 °C). Specifita vzniklých produktů byla ověřena pomocí disociační křivky vzniklé zvyšováním teploty z 60 na 95 °C postupně kaţdých 15 s vţdy o 0,2 °C. Jednotlivé vzorky byly analyzovány ve dvou opakováních a negativní kontrola (NTC) byla vyhodnocována pro kaţdý gen a kaţdou tkáň. Procentuální efektivita (%E) byla počítána z hodnoty slope standardní křivky dle vzorce: %E = (10-1/slope - 1) ×100 kde:
[8],
hodnota 10 znamená dekadické ředění slope je strmost standardní křivky (viz kapitola 2.5.3.2)
Hodnota slope i hodnota koeficientu determinace (R2) byly stanoveny v aplikaci 7500 System SDS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
4.3.8.2 Testování stability genů Reakční podmínky pro testování jednotlivých vzorků byly stejné jako pro ověřování efektivity primerů, rozdílem bylo pouze pouţití 40 cyklů a to, ţe kaţdý vzorek byl analyzován ve třech opakováních. Negativní kontrola byla opět vyhodnocována pro kaţdý gen a kaţdou tkáň. Stanovené hodnoty Ct (zjednodučeně řečeno – hodnota signifikantního nárůstu fluorescence) byly převedeny do aplikace Microsoft Excel, kde byly upraveny pro aplikaci geNorm (VANDESOMPELE et al., 2002b), která byla pouţita pro normalizaci hladiny genové exprese. Pro tuto aplikaci bylo třeba zjištěné Ct hodnoty převést na relativní hodnoty dle vzorce: Q = E(minCt - sampleCt) kde:
[9],
Q zastupuje vzorek převáděný do relativní hodnoty vzhledem k vzorku s nejvyšší expresí. E je efektivita amplifikace E = 10-1/slope minCt je nejniţší hodnota Ct ze sledovaných vzorků sampleCt je hodnota Ct vlastního převáděného vzorku (GENORM, 2004) 47
4.3.9 Relativní kvantifikace pomocí PCR v reálném čase Pouţité primery byly navrţeny pomocí aplikace OLIGO v4.0 (RYCHLIK et RHOADS, 1989) a jsou uvedeny v následující tabulce (tabulka 12). Jako referenční gen byl pouţit HPRT1, který byl v práci SVOBODOVÁ et al. (2008) ověřen jako stabilní pro svalové tkáně dospělého prasete a v práci NESVADBOVÁ et KNOLL (2011) jako stabilní v kosterní svalovině dospělého prasete i selat. Tab. 12: Primery pro analýzu exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 pomocí real-time RT-PCR
Analýza exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 pomocí real-time RT-PCR Umístění Délka Teplota Sekvence primeru (5´-3´) v genom. ampl. anneal. Poznámky sekvenci (bp) (°C) EEF_11A ttgcattctaccaccaactcgt exon 5 NM_001097418.1 157 Power EEF_11B aacattgactggagcaaaggtg exon 6 SYBR® EEF2_7A aacgtgtcagtcaaggacatcc exon 6 60 FM_992107 111 EEF2_7B cgggtggttcagaatgatga exon 7 Green PCR HPRT_1A aaggacccctcgaagtgttg exon 7 Master Mix NM_001032376.2 122 HPRT_1B cacaaacatgattcaagtccctg exon 8 a 9 Pozn.: A = přímý (forward) primer, B = zpětný (reverse) primer Výchozí sekvence
Název primeru
Metodika provádění reakcí, ověřování a výpočet efektivity primerů i reakční podmínky pro testování jednotlivých vzorků byly shodné s metodikou popsanou v kapitole 4.3.8. Hodnoty relativní kvantifikace byly stanoveny pomocí aplikace 7500 System SDS Software v1.2 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA), kde jsou výpočty zaloţeny na metodě ∆∆CT popsané v materiálu „User bulletin #2“ (APPLIED BIOSYSTEMS, 1997 a 2001). Grafy zobrazují průměrnou hodnotu relativní kvantifikace (RQ) a horní (max) a dolní (min) mez 95% intervalu spolehlivosti.
48
5
VÝSLEDKY A DISKUSE
5.1 Analýza genu EEF1A1 U genu EEF1A1 byla na našem pracovišti analyzována část jeho nukleotidové sekvence a v této části hledány polymorfismy porovnáním sekvencí DNA získaných ze čtyř různých plemen prasat. Dále byla testována stabilita tohoto genu v různých tkáních dospělého prasete a analyzována exprese genu EEF1A1 ve vybraných tkáních dospělého prasete i různě starých selat jak pomocí multiplex PCR, tak i pomocí real-time RT-PCR viz kapitoly 5.3 a 5.4. 5.1.1 Nukleotidová sekvence genu EEF1A1 a analýza polymorfismů Pro analýzu zkoumaného úseku nukleotidové sekvence byly navrţeny vhodné primery (viz tabulka 5), byly optimalizovány podmínky PCR a provedeno sekvenování oblasti od druhého po čtvrtý exon. Testováno bylo plemeno české bílé ušlechtilé (označení T4), landrace (označení T9), pietrain (označení P108) a kříţenec plemen meishan a pietrain (označení M222). Získané PCR produkty o velikosti 862 bp jsou znázorněny na obrázku 9.
Obr. 9: PCR produkty genu EEF1A1 získané z DNA různých plemen prasat Pozn.: M100+ = DNA hmotnostní marker (MBI Fermentas, Vilnius, Litva)
Celkově se podařilo osekvenovat úseky o délce 800 bp u vzorku T4, 796 bp u vzorku T9, 797 bp u vzorku M222 a 805 bp u vzorku P108. Z toho bylo získáno 67 – 74 bp z exonu 2, dále intron 2 o délce 195 bp, exon 3 o délce 180 bp, intron 3 o délce 121 bp a 227 – 237 bp z exonu 4.
49
Při srovnávání námi analyzovaných fragmentů zmiňovaných čtyř plemen prasat nebyl nalezen ţádný polymorfismus (viz příloha 1). Ani při porovnání sekvence mRNA z námi získaného fragmentu s mRNA dostupnou v NCBI databázi (NM_001097418.1) nebyl nalezen polymorfismus (viz příloha 2).
5.1.2 Analýza stability genu EEF1A1 v různých tkáních dospělého prasete Gen EEF1A1 byl spolu s geny ACTB (actin, beta – cytoskeletální strukturální protein), GAPDH (glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáza – regulační enzym), HPRT1 (hypoxanthin guanin fosforibosyltransferáza 1 – enzym hrající klíčovou roli v syntéze purinových nukleotidů), PPIA (peptidyl-prolyl isomeráza A – transportní protein) a TOP2B (topoisomeráza II beta – regulační enzym) zařazen do studie, ve které jsme ověřovali stabilitu exprese genů v sedmi různých tkáních dospělého prasete – plíce, srdeční svalovina, ledvina, slezina, játra, kosterní svalovina (musculus longissimus lumborum et thoracis) a bránice. Z cDNA získané ze zkoumaných vzorků byly vţdy pro kaţdou tkáň vytvořeny směsné vzorky, z nich namíchány dekadické ředící řady a v aplikaci 7500 System SDS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sestrojeny standardní křivky. Při výběru genů byl kladen důraz na jejich různou funkci, coţ eliminuje jejich vzájemné ovlivňování, a dále na moţnost vhodného umístění primerů do sekvence exon-exon. Během testování efektivity reakce bylo pouţito jedenáct párů primerů (viz tabulka 10). Pro kaţdý gen byl navrţen nejprve jeden pár primerů. U genů EEF1A1 (primery EEF_8A8B), HPRT1 (primery HPRT_1A1B) a TOP2B (primery_2A2B) bylo ihned dosaţeno na stanovenou hranici efektivity PCR reakce 85 – 115 % při koeficientu determinace 0,95 – 1 a tyto geny tak mohly být zařazeny do následného testování jejich stability v jednotlivých tkáních. U genu PPIA (primery PPIA_1A1B) vznikal při PCR reakci nespecifický produkt a objevovala se pozitivní slepá kontrola (NTC), u genu GAPDH (primery GAPDH_1A1B) byla také kontaminovaná slepá kontrola (NTC) a u genu ACTB (primery ACTB_1A1B) získaná hodnota slope nedosahovala 85 %. Proto byly pro tyto geny navrţeny a otestovány další páry primerů. Pouţití nově navrţených primerů pro gen GAPDH (primery GAPDH_3A3B) odstranilo problémy s kontaminací slepé kontroly (NTC), a protoţe efektivita PCR reakce i koeficient determinace byly ve výše uvedeném rozmezí, byl gen GAPDH zařazen do následného 50
testování stability. U genu ACTB byla u primerů ACTB_2A2B zjištěná hodnota slope vyšší neţ 115 %, a u primerů ACTB_3A1B se objevovaly nespecifické produkty a pozitivní slepá kontrola (NTC). U genu PPIA se jak u primerů PPIA_2A2B tak u primerů PPIA_3A3B opět objevovaly nespecifické produkty i pozitivní slepá kontrola (NTC). Proto musely být geny ACTB a PPIA z dalšího testování vyřazeny. Protoţe se předkládaná disertační práce zabývá analýzou genů pro eukaryotický elongační faktor 1 alfa, jsou v této kapitole uvedeny pouze výsledky pro gen EEF1A1. Podrobné výsledky analýzy stability exprese ostatních genů jsou uvedeny v pracích BÍLEK (2008) a SVOBODOVÁ et al. (2008). Průměrná Ct hodnota pro gen EEF1A1 byla 22,5 (směrodatná odchylka 1,8) a průměrná efektivita PCR reakce byla 95 % (minimální hodnota efektivity byla 90 %, maximální pak 105 %). Před vlastním určením stability exprese genu byly Ct hodnoty převedeny na relativní hodnoty (výpočet viz kapitola 4.3.8.2), čoţ odstranilo nepřesnost způsobenou rozdílnou efektivitou PCR reakce a připravilo výsledky k analýze stability exprese v aplikaci geNorm. V této aplikaci se na základě vzájemného porovnání hladiny exprese jednotlivých genů stanovuje hodnota M. Čím je tato hodnota niţší, tím stabilnější je exprese konkrétního genu. V aplikaci geNorm jsou vţdy porovnány hladiny exprese všech genů vzájemně a poté vyřazen gen s nejvyšší hodnotou M, tedy s nejniţší stabilitou exprese v testovaných vzorcích. Poté následuje další vzájemné srovnání hladiny exprese zbývajících genů a opět vyloučení nejméně stabilního genu. Tento postup se opakuje, dokud nezůstanou dva nejstabilnější geny pro daný vzorek (VANDESOMPELE et al., 2002b). Gen EEF1A1 patřil mezi dva nejstabilnější ve tkáních kosterní svalovina (M = 0,532), bránice (M = 0,558), slezina (M = 0,577) a ledvina (M = 0,742), jako třetí nejstabilnější byl zhodnocen v plicích (M = 1,298) a jako nejméně stabilní ze čtyř výše uvedených testovaných genů byl určen v játrech (M = 0,732) a v srdci (M = 1,648). Získané hodnoty M jsou poměrně nízké – v porovnání s dalšími pracemi, ve kterých byla testována stabilita genů v různých tkáních prasete (ERKENS et al., 2006; NYGARD et al., 2007), jsou námi zjištěné hodnoty ve většině případů asi poloviční, coţ naznačuje poměrně vysokou stabilitu exprese testovaného genu. Zjištěná stabilita exprese genu EEF1A1 je v souladu s pracemi STEINAU et al. (2006), SHEN et al. (2010) a také TSAI et al. (2006) a AFFYMETRIX (2011), kde byl gen EEF1A1 pouţit jako kontrolní gen pro microarray.
51
Další strukturní analýzy (osekvenování zbývajících částí genu – viz příloha 5, identifikace polymorfismů, testování polymorfismů), vazbové mapování (na třígeneračních rodinách divoké prase × pietrain, divoké prase × meishan a meishan × pietrain) a mapování na somatickém hybridním panelu (SCH) genu EEF1A1 byly realizovány na spolupracujícím pracovišti (ÚŢFG AV ČR v Liběchově), zatímco na našem pracovišti na Mendelově univerzitě jsme se podrobněji zabývali genem EEF1A2. Souhrnné výsledky práce jsou uvedeny v publikaci SVOBODOVÁ et al. (2010). Zajímavé bylo zjištění, ţe v naší práci byl zcela jednoznačně, pomocí vazbového mapování na třech třígeneračních rodinách i mapování na SCH panelu, gen EEF1A1 lokalizován na prasečí chromozom 1. To nekoresponduje s prací KARNUAH et al., (2001), kde autoři popisují lokalizaci EEF1A1 na prasečím chromozomu 8. Důvodem jejich chybného výsledku bylo, ţe k navrţení primerů na mapování pomocí radiačně hybridního panelu buněk pouţili sekvenci, která odpovídá sekvenci genu pro mitochondriální ribosomální protein L1, kterou mylně povaţovali za sekvenci EEF1A1.
52
5.2 Analýza genu EEF1A2 U genu EEF1A2 byla na našem pracovišti pomocí metod PCR, „primer walking“ a klonování PCR a pomocí sekvenování analyzována většina jeho nukleotidové sekvence, v níţ byly hledány polymorfismy porovnáním sekvencí čtyř různých plemen prasat. Ve spolupráci s ÚŢFG v Liběchově, University of Hohenheim (Německo) a Gent University (Belgie) byl gen také zmapován. Dále byla analyzována exprese genu EEF1A2 v různých tkáních a u různých věkových kategorií prasete, a to jak pomocí multiplex PCR, tak i pomocí real-time RT-PCR (viz kapitoly 5.3 a 5.4). 5.2.1 Nukleotidová sekvence genu EEF1A2 a analýza polymorfismů Pro analýzu nukleotidové sekvence byly nejprve za pouţití sekvence TC_348097 dostupné z databáze http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/ navrţeny vhodné primery (viz tabulka 6) a optimalizovány podmínky PCR. Testováno bylo stejně jako u genu EEF1A1 plemeno české bílé ušlechtilé (označení T4), landrace (označení T9), pietrain (označení P108) a kříţenec plemen meishan a pietrain (označení M222). Z genomické DNA byl nejprve získán fragment 2A2B o celkové délce 1224 bp, který zahrnuje část exonu 5 (144 bp), intron 5 (946 bp) a část exonu 6 (134 bp), dále fragment 3A3B o celkové délce 1447 bp, který zahrnuje část exonu 6 (195 bp), intron 6 (1182 bp) a část exonu 7 (70 bp) a také fragment 4A4B o celkové délce 878 bp, který zahrnuje část exonu 7 (212 bp), intron 7 (592 bp) a část exonu 8 (74 bp). Fragmenty 2A2B, 3A3B a 4A4B získané ze čtyř výše uvedených plemen prasat jsou znázorněny na obrázku 10. Po úpravě obsahu hořčíku v reakci byl následně získán i fragment 1A1B (Obr. 11) o celkové délce 769 bp, který zahrnuje část exonu 4 (28 bp), intron 4 (644 bp) a část exonu 5 (73 bp).
Obr. 10: PCR produkty 2A2B, 3A3B a 4A4B genu EEF1A2 získané z DNA různých plemen prasat Pozn.: M100+ = DNA hmotnostní marker (MBI Fermentas, Vilnius, Litva)
53
Při sekvenování jednotlivých fragmentů se vyskytly problémy při analýze fragmentů 1A1B a 4A4B, ve kterých byly zjištěny mnohonásobné repetice nukleotidu C, respektive nukleotidu G, které znemoţnily osekvenování celého PCR produktu získaného z genomické DNA. Proto byl navrţen ještě další primer s označením 5B (viz tabulka 8), který ve spojení s primerem 4A vytvořil fragment 4A5B o celkové délce 356 bp, který zahrnuje část exonu 7 a část intronu 7. Úseky 1A1B a 4A5B (Obr. 11) byly pak nejprve klonovány a poté jiţ úspěšně sekvenovány.
Obr. 11: PCR produkty 1A1B a 4A5B genu EEF1A2 získané z DNA různých plemen prasat Pozn.: M100+ a M100 = DNA hmotnostní markery (MBI Fermentas, Vilnius, Litva)
Protoţe při zpracovávání této disertační práce byla v internetových databázích dostupná pouze sekvence TC_348097, byla pro analýzu dalších úseků nukleotidové sekvence genu EEF1A2 zvolena strategie „primer walking“. Z námi získané sekvence byly navrţeny vhodné primery (tabulka 7), s jejichţ pomocí byl, ve spolupráci s prof. C. Knorrem (Gottingen University, Německo), v genomické PAC knihovně (AL-BAYATI et al., 1999) vyhledán pozitivní klon (PAC TAIGP714G09049Q). DNA klonu PAC byla pak pouţívána jako templát pro reakce s primery uvedenými v tabulce 7. Získaná sekvence byla vloţena do databáze EMBL/GenBank pod číslem FM992107.1 (viz příloha 6). Námi analyzovaná sekvence DNA klonu PAC má délku 9965 bp a zahrnuje všech 8 exonů a 7 intronů a část 5’UTR oblasti (viz přílohy 3 a 6). Kódující oblast začíná 2073. bazí, která se nachází v exonu 2, a končí 8742. bazí v exonu 8. Délky exonů a intronů genu EEF1A2 získané z DNA klonu PAC a jejich porovnání s některými druhy ţivočichů jsou uvedeny v tabulce 13, respektive 14.
54
Tab. 13: Porovnání délek exonů genu EEF1A2 u vybraných ţivočichů
Délka exonů (bp) genu EEF1A2 1 2 3 4 5 6 7 8 prase (sus scrofa ) 231 (nk) 222 (k 144) 180 297 151 257 235 406 (k 128) člověk (homo sapiens ) 95 (nk) 215 (k 144) 180 297 151 257 235 413 (k 128) skot (bos taurus ) 26 (nk) 221 (k 144) 180 297 151 257 235 405 (k 128) myš (mus musculus ) 292 (nk) 219 (k 145) 180 297 151 257 235 453 (k 127) Pozn.: Uváděné délky byly pro člověka, skot a myš zjištěny z databáze ENSEMBL (http://www.ensembl.org) nk = nekódující DNA, k = kódující DNA Tab. 14: Porovnání délek intronů genu EEF1A2 u vybraných ţivočichů
Délka intronů (bp) genu EEF1A2 1 2 3 4 5 6 7 prase (sus scrofa ) 1331 1505 409 644 946 1182 592 člověk (homo sapiens ) 1223 1548 754 1517 2401 1326 492 skot (bos taurus ) 1303 1544 446 370 981 604 657 myš (mus musculus ) 1242 1432 570 1714 986 843 491 Pozn.: Uváděné délky byly pro člověka, skot a myš zjištěny z databáze ENSEMBL (http://www.ensembl.org)
Výše popsaná sekvence z DNA klonu PAC (FM_992107) byla poté pouţita k navrţení dalších primerů (viz tabulka 7) potřebných k získání nukleotidové sekvence genu EEF1A2 z genomické DNA čtyř různých plemen prasat (české bílé ušlechtilé, landrace, pietrain a kříţenec plemen meishan a pietrain). Z genomické DNA všech plemen byla získána sekvence začínající iniciačním kodonem v druhém exonu a končící 74. bazí osmého exonu. Do terminačního kodonu chybí 54 bazí, které se bohuţel kvůli velkému obsahu bazí C a G v osmém exonu zatím nepodařilo osekvenovat. Porovnáním
získaných
sekvencí
jednotlivých
plemen
bylo
nalezeno
devět
jednonukleotidových polymorfismů (SNP), které jsou popsány v tabulce 15. Tab. 15: Jednonukleotidové polymorfismy nalezené v nukleotidové sekvenci genu EEF1A2
Polymorfismy nalezené v nukleotidové sekvenci genu EEF1A2 Intron 2 Intron 2 Intron 2 Intron 2 Intron 4 Exon 6 Intron 6 Intron 6 Intron 6 oblast SNP dle kódující 161 231 997 1244 2964 4365 4537 5077 5303 sekvence ČBU C/A G/G C/G C/T A/G T/G C/G T/T C/C L C/A A/G G/G T/T A/G T/G C/C T/G C/T P (matka) C/C A/A G/G T/T A/A T/T C/C G/G C/C M × P (potomek) C/A A/G C/G C/T A/G T/G C/G G/G C/C Pozn.: ČBU = české bílé ušlechtilé, L = landrace, P = pietrain, M × P = kříţenec plemen meishan a pietrain
Osm z devíti nalezených SNP se nachází v intronech, jeden v exonu, a to na třetí pozici v tripletu, takţe nedochází ke změně v sekvenci aminokyseliny (viz příloha 4). 55
V oblasti intronu 6 byly objeveny dvě SINE sekvence o délce 232 bp (viz Obr. 14). Při porovnání aminokyselinové sekvence eEF1A2 praste s dalšími třemi druhy ţivočichů (Homo sapiens, Mus musculus a Bos taurus) bylo zjištěno, ţe mezi prasetem, člověkem a skotem je 100% podobnost a ţe myš vykazuje s prasetem, člověkem i skotem 99% podobnost aminokyselinové sekvence eEF1A2 (viz tabulka 16 a příloha 9), coţ je v souladu s výsledky uvedenými v práci KAHNS et al. (1998). Při porovnání aminokyselinové sekvence proteinů eEF1A1 a eEF1A2 zmiňovaných druhů byla podobnost vţdy 92% (viz přílohy 8 a 9). Tyto výsledky jsou v souladu s pracemi KNUDSEN et al. (1993), KAHNS et al. (1998) a SOARES et al. (2009). Tab. 16: Podobnost aminokyselinové sekvence proteinu eEF1A2 (%) u čtyř druhů ţivočichů
eEF1A2 SS eEF1A2 HS eEF1A2 MM eEF1A2 BT eEF1A2 SS 100 99 100 eEF1A2 HS 100 99 100 eEF1A2 MM 99 99 99 eEF1A2 BT 100 100 99 Pozn.: SS – Sus scrofa, HS – Homo sapiens, MM – Mus musculs, BT – Bos taurus
5.2.2 Polymorfismus EEF1A2 u různých plemen prasat a mapování genu Vazbové mapování bylo provedeno za pouţití SNP EEF1A2 FM992107:g.C>G. Úsek genu EEF1A2 o délce 212 bp, ve kterém byl SNP obsaţen, byl štěpen pomocí enzymu Hin6I (Fermentas). Za přítomnosti alely C docházelo ke štěpení na fragmenty 173 bp a 39 bp, v přítomnosti alely G zůstával fragment neštěpen (viz obrázek 12).
Obr. 12: Štěpení fragmentu 11A11B genu EEF1A2 Pozn. T4 – české bílé ušlechtilé, T9 – landrace, P108 – pietrain, M220 a M205 – meishan × pietrain, M100 - DNA hmotnostní marker (MBI Fermentas, Vilnius, Litva)
56
Frekvence jednotlivých alel byly zjišťovány na vzorcích různých plemen (viz tabulka 17). Tab 17: Frekvence alel prasečího EEF1A2 u osmi různých plemen (SNP FM992107:g.6609C>G)
Plemeno České bílé ušlechtilé Landrace České výrazně masné Pietrain Přeštické černostrakaté Hampshire Duroc Meishan
Počet frekvence frekvence testovaných alely G alely C zvířat 14 0,14 0,86 25 0 1 15 0,3 0,7 23 0,04 0,96 7 0,29 0,71 6 0,83 0,17 12 0,54 0,46 8 1 0
Počet zvířat GG 0 0 2 0 0 4 3 8
GC 4 0 5 2 4 2 7 0
CC 10 25 8 21 3 0 2 0
Stejný polymorfismus byl ověřen v hohenheimské rodině meishan × pietran a výsledky byly pouţity pro vazbovou analýzu. Bylo zjištěno následující pořadí lokusů na SSC17: SW335 – 13.3 – SW1891 – 16.0 – S0296 – 27.7 – SW1920 – 1.1 – GHRH – 1.8 – RBM39 – 20.7 – Sj063 – 17.6 – GNAS – 8.8 – EEF1A2 – 3.4 – SW2427. EEF1A2 se nachází 106,9 cM od prvního markeru (SW335) na SSC17. Pozice na chromozomu a vzdálenosti v Kosambi cM jsou patrné z tabulky 18. Tab. 18: Vazbová mapa (průměr pohlaví) chromozomu 17 prasete zahrnující gen EEF1A2; hohenheimská rodina M × P
Gen/marker 6
SW335
0
SW1891
1
S0296
2
SW1920
3
GHRH
8
RNPC2
7
Sj063
Rekombinační frakce
16,0 29,3
0,25
27,7 57,0
0,01
1,1 58,1
0,02
4
13,3 13,3
0,15
9
Kosambi cM (od 1. markeru) 0
0,13
5
Kosambi cM (mezi lokusy)
1,8 59,8
0,20
20,7
0,17
17,6
0,09
8,8
0,03
3,4
80,6
GNAS
98,1
EEF1A2
106,9
SW2427
110,3
57
Při radiačním hybridním mapování na IMpRH panelu dvoubodová analýza ukázala nejvýznamnější asociaci EEF1A2 s SW2427 na chromozómu 17 (25 cR, LOD = 10,92) s následujícím
pořadím
lokusů
SW2431 – EEF1A2 – SW2427
(viz
obrázek
13).
Cytogenetická lokalizace genu bude zřejmě odpovídat poloze 17q23, neboť oba dva sousedící markery, SW2431 and SW2427, byly mapovány do této oblasti chromozómu. Výsledky obou typů mapování - jak vazbového, tak RH - jsou ve vzájemné shodě.
Obr. 13: Radiační hybridní mapa části chromozomu 17 prasete znázorňující polohu EEF1A2
58
5.2.3 Komparativní analýza genomické organizace genů EEF1A1 a EEF1A2 prasete Genomické uspořádání genů EEF1A1 a EEF1A2 (Obr. 14) je velmi podobné. Oba geny jsou sloţeny z osmi exonů a délka kódujících exonů je shodná (s výjimkou exonu osm, jehoţ část je nekódující). Délka intronů je ve studovaných genech však značně odlišná (viz tabulka 19). Navíc EEF1A1 obsahuje TATA box, zatímco EEF1A2 nikoliv.
Obr. 14: Genomická struktura prasečího genu EEF1A2 Pozn. Exony jsou zobrazeny jako obdélníky, introny jako přímka mezi nimi. Na obrázku je znázorněno umístění start (ATG) a stop (TGA) kodonu i sekvence SINE (PRE-1) a polyA signál.
EEF1A1 má stejnou genomickou strukturu, pouze introny jsou kratší (viz tabulka 19). Tab. 19: Porovnání délky exonů a intronů (bp) genů EEF1A1 a EEF1A2
Exony
EEF1A1
EEF1A2
Introny
EEF1A1
EEF1A2
683 195 121 83 88 88 100
1331 1505 409 644 946 1182 592
1358
6609
233 (nk) 231 (nk) Exon 1 Intron 1 Exon 2 179 (cds 144) 222 (cds 144) Intron 2 Exon 3 Intron 3 180 180 Exon 4 Intron 4 297 297 Exon 5 Intron 5 151 151 Exon 6 Intron 6 257 257 Exon 7 Intron 7 235 235 Exon 8 412 (cds 125) 406 (cds 128) Celková Celkově 1389 1392 introny cds
Podobnost kódující sekvence zkoumaných genů je 78 % (viz příloha 7) a podobnost aminokyselinové sekvence odvozených proteinů je 92 % (viz příloha 8).
59
5.3 Analýza exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 pomocí metody multiplex PCR Exprese zkoumaných genů byla pomocí metody multiplex PCR ověřována na 11 různých tkáních dospělých prasat – kosterní svalovina (m. longissimus thoracis et lumborum a m. biceps femoris), mozek, srdce, játra, ledviny, plíce, jazyk, bránice, vaječníky, tuk a mízní uzlina) a také na šesti tkáních různě starých selat – kosterní svalovina, srdce, mozek, plíce, játra a ledvina. Jako referenční gen byl pro své snadné začlenění do multiplex PCR pouţit GAPDH. Primery (viz tabulka 9) pro geny EEF1A1 a EEF1A2 byly navrhovány tak, aby nedocházelo k případnému nasedání primerů pro EEF1A1 na EEF1A2 a opačně, coţ nebylo při podobnosti kódující části nukleotidové sekvence těchto genů 78 % (viz příloha 7) jednoduché. Specifita primerů byla ověřena následným sekvenováním vzniklých fragmentů. Po optimalizování podmínek multiplex PCR bylo zjištěno, ţe gen EEF1A1 byl jak u dospělých jedinců (viz Obr. 15), tak u selat (viz Obr. 16) exprimován ve všech analyzovaných tkáních, zatímco gen EEF1A2 byl prokazatelný pouze ve tkáních svalového původu – kosterní svalovina (m. longissimus thoracis et lumborum a m. biceps femoris), srdce, jazyk, bránice – a také v mozkové tkáni.
Obr. 15: Analýza exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v tkáních dospělého prasete pomocí multiplex PCR Pozn.: M100 = DNA hmotnostní marker (MBI Fermentas, Vilnius, Litva) m. long. th. et lu. = musculus longissimus thoracis et lumborum
60
Obr. 16: Analýza exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v tkáních dospělého prasete a různě starých selat pomocí multiplex PCR Pozn.: M100 = DNA hmotnostní marker (MBI Fermentas, Vilnius, Litva) D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará svalovina = m. longissimus thoracis et lumborum
Podobné výsledky popsali uţ v roce 1992 LEE et al. u potkanů a myší. KNUDSEN et al. (1993) popisuje rovněţ rozdílnou expresi těchto genů u člověka. Podle jeho zjištění však EEF1A1 v kosterní a srdeční svalovině téměř není přítomný, coţ výsledkům našich výzkumů neodpovídá. Přítomnost EEF1A2 pouze v kosterní a srdeční svalovině a v mozku popisuje také LEE et al. (1993) a KHALYFA et al. (2001).
61
5.4 Analýza exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 pomocí metody real-time RT-PCR Pro podrobnější analýzu exprese zkoumaných genů byla zvolena metoda real-time RTPCR. Exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 byla touto metodou ověřována u dospělých prasat a souboru různě starých selat na šesti tkáních – kosterní svalovina (m. longissimus thoracis et lumborum), srdce, mozek, játra, ledviny, plíce – a přidán byl ještě vzorek kosterní svaloviny plodu. Pro geny EEF1A1 a EEF1A2 byly pouţity stejné primery jako v analýze pomocí multiplex PCR, ale jako referenční gen byl pouţit HPRT1 (viz tabulka 11), který byl v pracech SVOBODOVÁ et al., 2008 či NESVADBOVÁ et KNOLL, 2011 popsán jako stabilní pro tkáně prasete. Efektivita reakce byla počítána z hodnoty slope standardní křivky stanovené v aplikaci 7500 System SDS Software v1.2 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). Efektivita PCR reakce se u všech vzorků pohybovala mezi 91 – 107 %, hodnoty koeficientu determinace (R2) pak mezi 0,98 – 1. Hodnoty relativní kvantifikace (RQ) byly stanoveny rovněţ v aplikaci 7500 System SDS Software v1.2 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA), a to na základě výpočtů zaloţených na metodě ∆∆CT, kterou tato aplikace vyuţívá. Byla analyzována hladina exprese genu EEF1A1 a genu EEF1A2 u různých věkových kategorií v šesti tkáních prasete, kalibrátorem byl vţdy u obou genů vzorek tkáně z dospělého jedince. Dále byla porovnána hladina exprese testovaných genů v jednotlivých tkáních a vzorcích s hladinou exprese v kosterní svalovině dospělého prasete. Výsledky jsou znázorněny v grafech v následujících kapitolách a přesné hodnoty RQ jsou vyčísleny v tabulkách v příloze 10.
62
5.4.1 Analýza hladiny exprese genu EEF1A1 v testovaných tkáních ve srovnání s expresí ve vzorku kosterní svaloviny dospělých jedinců Exprese genu EEF1A1 byla zjištěna ve všech zkoumaných tkáních (Obr. 17), coţ souhlasí s výsledky zjištěnými pomocí metody multiplex PCR (viz kapitola 5.3) i s údaji uváděnými v publikaci LEE et al. (1992). Ve srovnání se vzorkem z kosterní svaloviny dospělého prasete byla jednoznačně niţší exprese stanovena v játrech a mozku, a to u všech věkových kategorií, a také ve vzorku ze srdeční svaloviny dospělého prasete. Vyšší exprese byla zjištěna především v kosterní svalovině plodu a v plicích z dospělého prasete a 1 den starého selete a dále také v kosterní svalovině 1 a 7 dní starých selat. U ostatních vzorků nebyl vůči vzorku z kosterní svaloviny dospělce nalezen průkazný rozdíl. Zjištěné hodnoty jsou v rozporu s publikací KNUDSEN et al. (1993), která u člověka popisuje velmi nízkou expresi genu EEF1A1 v kosterní svalovině a naopak vysokou například v játrech nebo plicích. Zjištěná niţší exprese genu EEF1A1 v mozku a srdci dospělého jedince a zároveň vyšší exprese v kosterní svalovině plodu a 1 a 7 dní starých selat by mohla mít souvislost s „přepínáním“ izoforem EEF1A1 a EEF1A2 během vývoje jedince, které popisuje LEE et al. (1993) a KHALYFA et al. (2001).
Obr. 17: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v různých tkáních ve vztahu ke svalovině dospělého jedince Pozn.: D = dospělé prase, P = plod, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará sval (S1, S7, S14 a D) = m. longissimus thoracis et lumborum, sval P = m. biceps femoris
63
5.4.2 Analýza hladiny exprese genu EEF1A2 v testovaných tkáních ve srovnání s expresí ve vzorku kosterní svaloviny dospělých jedinců Exprese genu EEF1A2 byla pomocí metody real-time RT-PCR zjištěna také ve všech tkáních, ale v porovnání se vzorkem kosterní svaloviny dospělého prasete byly hodnoty v plicích, ledvině, játrech a také ve vzorku kosterní svaloviny plodu zanedbatelné (řádově 10-4 - 10-6, viz příloha 10), coţ odpovídá našim výsledkům zjištěným pomocí multiplex PCR (viz kapitola 5.3) a také publikacím LEE et al. (1992) a KNUDSEN et al. (1993), které popisují vysokou expresi genu EEF1A2 v kosterní a srdeční svalovině a v mozku u myši a člověka. Námi zjištěné hodnoty exprese v srdeční svalovině byly niţší neţ v kosterní svalovině dospělého jedince a hodnoty exprese v mozku pak ještě niţší neţ v srdeční svalovině. Také hodnoty exprese v kosterní svalovině 1 a 7 dní starých selat byly oproti vzorku kosterní svaloviny dospělce mírně sníţené (Obr. 18), coţ opět koresponduje s vývojovým „přepínáním“ izoforem EEF1A1 a EEF1A2 popsaném v publikacích LEE et al., (1993) a KHALYFA et al., (2001).
Obr. 18: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A2 v různých tkáních ve vztahu ke svalovině dospělého jedince Pozn.: D = dospělé prase, P = plod, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará sval (S1, S7, S14 a D) = m. longissimus thoracis et lumborum, sval P = m. biceps femoris
64
5.4.3 Analýza hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v kosterní svalovině Analýza exprese genu EEF1A1 v kosterní svalovině ukázala rozdíl mezi expresí u plodu, selat 1 den starých a selat 7 dní starých a expresí u dospělého jedince, u kterého je niţší. Mezi stanovenými hladinami exprese u plodu a selat 1, 7 a 14 dní starých není průkazný rozdíl, stejně jako mezi expresí u selat 14 dní starých a expresí u dospělých jedinců. Celkově mají hodnoty exprese genu EEF1A1 v kosterní svalovině s věkem klesající tendenci (Obr. 19). Tato zjištění jsou v souladu s publikacemi LEE et al. (1993) a KHALYFA et al. (2001) a mohla by naznačovat, ţe by u prasat mohlo začínat „přepínání“ izoforem EEF1A1 a EEF1A2 v kosterní svalovině jiţ mezi prvním a druhým týdnem věku.
Obr. 19: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v kosterní svalovině Pozn.:
Kalibrátor = sval dospělého prasete D = dospělé prase, P = plod, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará sval (S1, S7, S14 a D) = m. longissimus thoracis et lumborum, sval P = m. biceps femoris
65
U genu EEF1A2 byl v kosterní svalovině zjištěn rozdíl mezi expresí u selat 1 a 7 dní starých oproti expresi u selat 14 dní starých a dospělých jedinců, kde je vyšší. V kosterní svalovině plodu byla v porovnání s hladinou exprese u dospělého jedince detekována zanedbatelná exprese genu EEF1A2 (řádově 10-4). Mezi hladinami exprese u 1 a 7 dní starých selat není průkazný rozdíl, stejně jako mezi expresí u 14 dní starých selat a u dospělých jedinců. Z výsledků vyplývá, ţe exprese genu EEF1A2 v kosterní svalovině má s věkem celkově rostoucí tendenci (Obr. 20). Všechna tato zjištění jsou v souladu s výsledky prací LEE et al., (1993) a KHALYFA et al., (2001) a podporují teorii, ţe by k „přepínání“ izoforem mohlo v kosterní svalovině prasat docházet jiţ mezi prvním a druhým týdnem věku.
Obr. 20: Relativní kvantifikace hladiny exprese genů EEF1A2 v kosterní svalovině Pozn.:
Kalibrátor = sval dospělého prasete D = dospělé prase, P = plod, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará sval (S1, S7, S14 a D) = m. longissimus thoracis et lumborum, sval P = m. biceps femoris
66
5.4.4 Analýza hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v srdeční svalovině V srdeční svalovině byl u genu EEF1A1 zjištěn výrazný rozdíl mezi expresí u selat 1, 7 a 14 dní starých a expresí u dospělých jedinců, u kterých je niţší. Mezi expresí u jednotlivých věkových kategorií selat naopak ţádný průkazný rozdíl zaznamenán nebyl (Obr. 21). Tyto výsledky opět korespondují s pracemi LEE et al., (1993) a KHALYFA et al., (2001). Výrazný rozdíl mezi hladinou exprese EEF1A1 u selat a hladinou této exprese u dospělých jedinců by mohlo naznačovat, ţe v srdeční svalovině prasat by docházelo k „přepínání“ izoforem aţ po druhém týdnu věku.
Obr. 21: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v srdeční svalovině Pozn.:
Kalibrátor = srdce dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
67
U hladiny exprese genu EEF1A2 v srdeční svalovině také nebyl zjištěn rozdíl mezi selaty. Celkově je zjištěná hladina exprese u genu EEF1A2 v srdeční svalovině vyrovnanější neţ u genu EEF1A1, malý rozdíl byl nalezen pouze mezi expresí u dospělých jedinců a expresí u 7 dní starých selat (Obr. 22). Protoţe pro analýzu nebyly k dispozici vzorky srdeční svaloviny plodu, nelze z těchto výsledků určit, zda korespondují s teorií, ţe EEF1A1 je v srdci „embryonální“ a EEF1A2 „dospělá“ forma elongačního faktoru (KHALYFA et al. 2001), nicméně souhlasí s obvykle uváděným faktem, ţe izoforma EEF1A2 je přítomna v kosterní a srdeční svalovině a mozku (LEE et al., 1992; KNUDSEN et al., 1993; LEE et al., 1995; KHALYFA et al. 2001).
Obr. 22: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A2 v srdeční svalovině Pozn.:
Kalibrátor = srdce dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
68
5.4.5 Analýza hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v mozku Exprese genu EEF1A1 v mozkové tkáni je mezi zkoumanými věkovými kategoriemi poměrně vyrovnaná. Malý rozdíl byl nalezen pouze mezi expresí u 14 dní starých selat a expresí u dospělých jedinců (Obr. 23). Tyto výsledky jsou v souladu s pracemi LEE et al. (1995) a KHALYFA et al. (2001), kteří popisují, ţe v mozkové tkáni jsou přítomny obě izoformy genu EEF1A – EEF1A1 se exprimuje v astrocytech a mikrogliích, zatímco EEF1A2 v neuronech.
Obr. 23: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v mozkové tkáni Pozn.:
Kalibrátor = mozek dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
69
Při analýze exprese genu EEF1A2 v mozku byl nalezen rozdíl mezi hladinou exprese u selat 1 a 14 dní starých a hladinou exprese u dospělých jedinců. Mezi jednotlivými věkovými kategoriemi selat ani mezi 7 dní starými selaty a dospělými jedinci nebyl rozdíl v expresi detekován (Obr. 24). Nalezený rozdíl mezi hladinou exprese u selat 1 a 14 dní starých a hladinou exprese dospělých jedinců, u kterých je pozorována niţší hodnota, je v rozporu s pracemi LEE et al. (1993) a KHALYFA et al. (2001), podle kterých by se měla hladina exprese EEF1A2 v dospělosti spíše zvýšit. Námi získané hodnoty mohou být ovlivněny malým počtem analyzovaných vzorků. K přesnějším výsledkům by bylo třeba otestovat více vzorků, zajímavým přínosem by mohl být také vzorek mozku plodu, který nebyl pro naše analýzy k dispozici.
Obr. 24: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A2 v mozkové tkáni Pozn.:
Kalibrátor = mozek dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
70
5.4.6 Analýza hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v játrech U genu EEF1A1 byl při analýze jeho exprese v játrech zjištěn rozdíl mezi expresí u 1 den starých selat a expresí u selat 14 dní starých a u dospělých jedinců. Mezi expresí u selat 1 a 7 dní starých a mezi expresí u selat 7 a 14 dní starých a u dospělých jedinců nebyly zjištěny průkazné rozdíly. Přesto by se dalo říci, ţe celkově má exprese genu EEF1A1 v játrech s věkem zvyšující se tendenci (Obr. 25).
Obr. 25: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v játrech Pozn.:
Kalibrátor = játra dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
71
V játrech byla zjištěna velmi nízká exprese genu EEF1A2, a to aţ na hranici detekovatelnosti (v porovnání s expresí tohoto genu v kosterní svalovině dospělých jedinců je to řádově 10-6), čímţ vznikly při analýzách jednotlivých vzorků velké rozdíly mezi horní a dolní mezí intervalu spolehlivosti. U vzorku z 1 den starých selat dokonce nebyl kvůli nedostatku
detekovatelných
hodnot
exprese
interval
spolehlivosti
stanoven.
Dle dosaţených výsledků byl nalezen malý rozdíl mezi expresí u dospělých jedinců a expresí u 7 dní starých selat a celkově se zdá, ţe exprese genu EEF1A2 má v játrech s věkem klesající tendenci (Obr. 26). Vzhledem k horší detekovatelnosti a velkým intervalům spolehlivosti jsou však tyto závěry diskutabilní.
Obr. 26: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A2 v játrech Pozn.:
Kalibrátor = játra dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
72
5.4.7 Analýza hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v ledvině Při porovnání hladiny exprese genu EEF1A1 v ledvině nebyl mezi jednotlivými věkovými kategoriemi zjištěn ţádný průkazný rozdíl (Obr. 27).
Obr. 27: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v ledvině Pozn.:
Kalibrátor = ledvina dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
Stejně jako v játrech je i v ledvině hladina exprese genu EEF1A2 velmi nízká. (v porovnání s expresí tohoto genu v kosterní svalovině dospělých jedinců řádově 10-5), coţ opět v některých případech způsobilo velké rozdíly mezi horní a dolní mezí intervalu spolehlivosti (Obr. 28).
Obr. 28: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A2 v ledvině Pozn.:
Kalibrátor = ledvina dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
73
5.4.8 Analýza hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v plicích Testování hladiny exprese genu EEF1A1 v plicích neodhalilo ţádný průkazný rozdíl mezi jednotlivými věkovými kategoriemi (Obr. 29).
Obr. 29: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v plicích Pozn.: Kalibrátor = plíce dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
Zjištěná exprese genu EEF1A2 byla v plicích, stejně jako v předchozích dvou tkáních (játra a ledviny), nízká (v porovnání s expresí sledovaného genu v kosterní svalovině dospělých jedinců řádově 10-5) a i zde v důsledku toho vznikala u některých vzorků velká rozmezí mezi maximem a minimem intervalu spolehlivosti. Mezi hladinou exprese v plicích nebyly u genu EEF1A2 u jednotlivých věkových kategorií zjištěny průkazné rozdíly (Obr. 30).
Obr. 30: Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A2 v plicích Pozn.: Kalibrátor = plíce dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
74
6
ZÁVĚR V rámci studia genetické kontroly myogeneze byla studována exprese mRNA
v kosterních svalech plodů prasete (44 dnů vývoje) a dospělého prasete pomocí subtraktivní hybridizace. Byl identifikován větší počet genů, které vykazovaly výrazně vyšší expresi ve fetálních svalech neţ v dospělých svalech. Z těchto genů byl vybrán ke studiu výrazně diferenčně exprimovaný gen kódující eukaryotický elongační faktor 1 alfa 1 (EEF1A1), a studium bylo rozšířeno i o jeho izoformu, EEF1A2. U obou genů bylo realizováno komparativní studium, které zahrnovalo stanovení jejich nukleotidové sekvence, genomické organizace, vyhledávání polymorfismů, zjištění chromozómové lokalizace, vazbové mapování a studium exprese. U genu EEF1A1, který se na rozdíl od EEF1A2 vyskytuje ve všech tkáních, byla věnována velká pozornost studiu jeho stability a jeho vhodnosti pro pouţití jako referenčního genu. U genu EEF1A1 bylo osekvenováno přibliţně 800 bp, ve kterých nebyly u čtyř plemen prasat nalezeny polymorfismy. Co se týče stability genu EEF1A1 bylo zjištěno, ţe tento gen patří mezi dva nejstabilnější ve čtyřech ze sedmi sledovaných tkání dospělého prasete. U genu EEF1A2 bylo z DNA klonu PAC osekvenováno 9965 bp, které zahrnují všech 8 exonů, 7 intronů a část 5’UTR oblasti. Tato sekvence byla vloţena do databáze EMBL/GenBank pod číslem FM992107.1. Z genomické DNA čtyř plemen prasat pak byly získány sekvence o délce 6616 bp, které začínají iniciačním kodonem a končí na začátku exonu 8 (několik desítek bází před stop kodonem). Porovnáním těchto sekvencí bylo nalezeno 9 SNP, z nichţ ţádný nezpůsobuje záměnu aminokyseliny. Při srovnání aminokyselinových sekvencí eEF1A1 a eEF1A2 i při srovnání aminokyselinové sekvence eEF1A2 prasete se sekvencí jiných druhů ţivočichů byla zjištěna vysoká podobnost (92 – 100 %). Jeden SNP v EEF1A2 byl vyuţit pro zjištění frekvencí alel u různých plemen prasat a pro vazbové mapování, které bylo realizováno na hohenheimské třígenerační rodině meishan × pietrain. Gen byl rovněţ mapován na radiačním hybridním panelu. Oběma metodami byl gen zmapován na distální konec chromozómu 17 (mezi lokusy GNAS a SW2427). Při analýzách exprese se, jak pomocí metody multiplex PCR, tak pomocí metody realtime RT-PCR, prokázala shoda s obecně uváděným faktem (ze studia jiných druhů), ţe EEF1A2 je exprimován pouze v kosterní a srdeční svalovině a mozku. Zjištěná exprese EEF1A2 v ostatních sledovaných tkáních (játra, ledvina, plíce) byla ve srovnání s expresí tohoto genu v dospělé kosterní svalovině zanedbatelná. 75
Výsledky analýzy exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v kosterní svalovině ukazují, ţe i u prasat v této tkáni dochází k „přepínání“ zkoumaných izoforem během vývoje a ţe EEF1A1 je především „embryonální izoformou“ v této tkáni, zatímco EEF1A2 se začíná exprimovat aţ po narození jedince. Také výsledky analýzy exprese genu EEF1A1 v srdeční svalovině napovídají, ţe v této tkáni je EEF1A1 exprimován především v raném postnatálním období a v dospělosti se jeho exprese v této tkáni prasete sniţuje. Výsledky analýzy exprese EEF1A2 v srdeční svalovině však nepotvrdily, ţe by tomu u genu EEF1A2 bylo naopak. V mozkové tkáni byla dle očekávání zjištěna exprese obou genů u všech zkoumaných věkových kategorií. Předkládaná práce přispívá k rozšíření znalostí prasečího genomu. Zveřejnění sekvence genu EEF1A2, nalezení polymorfismů a zmapování tohoto genu umoţňuje provádění dalších analýz zaměřených například na identifikaci QTL a studium asociací s uţitkovými znaky. (Tyto asociační analýzy byly jiţ provedeny a výsledky budou součástí připravované publikace, která bude zahrnovat studium obou genů.) Výsledky analýz exprese obou genů také přispívají k poznání, ţe studované geny se uplatňují v myogenezi a jejich polymorfní varianty by mohly mít vliv na masnou uţitkovost prasat. Výsledky studia stability genu EEF1A1 navíc rozšiřují „seznam“ referenčních genů, vyuţitelných např. při kvantitativních analýzách u prasat.
76
7
POUŢITÁ LITERATURA
AFFYMETRIX (2011): Data Sheet – GeneChip® Porcine Genome Array. [cit. 2011-1-30]. Dostupné na: http://media.affymetrix.com/support/technical/datasheets/porcine_datasheet.pdf
AL-BAYATI H. K., DUSCHER S., KOLLERS S., RETTENBERGER G., FRIES R., BRENIG B. (1999): Construction and characterization of a porcine P1-derived artificial chromosome (PAC) library covering 3.2 genome equivalents and cytogenetical assignment of six type I and type III loci. Mammalian Genome, 6: 569–572.
ANAND N., MURTHY S., AMANN G., WERNICK M., PORTER L. A., CUKIER I. H., COLLINS C., GRAY J. W., DIEBOLD J., DEMETRICK D. J., LEE J. M. (2002): Gene encoding protein elongation factor EEF1A2 is a putative oncogene in ovarian cancer. Nature genetics, 31: 301–305.
ANN D. K., LIN H. H., LEE S., TU Z., WANG E. (1992): Characterization of the Statinlike S1 and Rat Elongation Factor lα as Two Distinctly Expressed Messages in Rat. The Journal of Biological Chemistry, 267 (2): 699–702.
APPLIED BIOSYSTEMS (1997, 2001 updated): User Bulletin #2, ABI PRISM 7700 Sequence Detection System – Relative Quantitation of Gene Expression. [cit. 2010-12-10]. Dostupné na: http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocumen ts/cms_040980.pdf.
APPLIED BIOSYSTEMS (2004): Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR System Absolute Quantification Getting Started Guide PN 4347825A. Dokument je součástí softwarové dokumentace k přístroji.
AYERS D., CLEMENTS D. N., SALWAY F., DAY P. J. (2007): Expression stability of commonly used reference genes in canine articular connective tissues. BMC Veterinary Research, 3 (7): 1–10.
77
BAI Q., MCGILLIVRAY C., DA COSTA N., DORNAN S., EVANS G., STEAR M. J., CHANG K. C. (2003): Development of a porcine skeletal muscle cDNA microarray: analysis of differential transcript expression in phenotypically distinct muscles. BMC Genomics, 4 (1): 8.
BERTRAM J., PALFNER K., HIDDEMANN W, KNEBA M. (1998): Overexpression of Ribosomal Proteins L4 and L5 and the Putative Alternative Elongation Factor PTI-1 in the Doxorubicin Resistant Human Colon Cancer Cell Line LoVoDxR. European Journal of Cancer, 34 (5): 731–736. BEYER-SEHLMEYER G., HIDDEMANN W., WÖRMANN B., BERTRAM J. (1999): Suppressive Subtractive Hybridisation Reveals Differential Expression of Serglycin, Sorcin, Bone Marrow Proteoglycan and Prostate-tumour-inducing Gene I (PTI-1) in Drugresistant and Sensitive Tumour Cell Lines of Haematopoetic Origin. European Journal of Cancer, 35 (12): 1735–1742. BIO-RAD LABORATORIES (2011): Gene Expression Gateway – Hallmarks of an Optimized qPCR Assay. [cit. 2011-4-20]. Dostupné na: http://www3.biorad.com/B2B/vanity/gexp/content.do?BV_SessionID=@@@@2055624441.1305791006 @@@@&BV_EngineID=ccccadfdikllkelcfngcfkmdhkkdfll.0&root=/Product%20Family/ GX/Home&pcatoid=-35468&ccatoid=36529&country=US&language=English&BV_SessionID=@@@@2055624441.13057910 06@@@@&BV_EngineID=ccccadfdikllkelcfngcfkmdhkkdfll.0 BISCHOFF C., KAHNS S., LUND A., JØRGENSEN H. F., PRÆSTEGAARD M., CLARK B. F. C., LEFFERS H. (2000): The Human Elongation Factor 1 A-2 Gene (EEF1A2): Complete Sequence and Characterization of Gene Structure and Promoter Activity. Genomics, 68: 63–70.
BÍLEK K. (2008): Analýza diferenciálně exprimovaných genů a validace referenčních genů u prasat, Disertační práce, MZLU v Brně, Brno, 97 s.
78
BRASCAMP E. W., HALEY C. S., GROENEN M. A. M., JANSS L. L. G. (1995): PiGMaP: gene mapping and its contribution to meat production and meat quality parameters. Pig News and Information, 16 (2): 41–46.
BRYANT S., MANNING D. L. (1998): Formaldehyde Gel Electrophoresis of Total RNA, s. 69–72. In. RAPLEY R., MANNING D. L. (ed.), RNA isolation and characterization protocols. Humana Press, New Jersey, 280 s., ISBN 0896034941.
BUSTIN S. A., BENES V., NOLAN T., PFAFFL M. W. (2005): Quantitative real-time RT-PCR - a perspective. Journal of Molecular Endocrinology, 34 (3): 597-601.
CAGNAZZO M., te PAS M. F., PRIEM J., DE WIT A. A., POOL M. H., DAVOLI R., RUSSO V. (2006): Comparison of prenatal muscle tissue expression profiles of two pig breeds differing in muscle characteristics. Journal of Animal Science, 84 (1): 1-10.
CAO H., ZHU Q., HUANG J., LI B., ZHANG S., YAO W., ZHANG Y. (2009): Regulation and functional role of eEF1A2 in pancreatic carcinoma. Biochemical and Biophysical Research Communications, 380: 11–16.
CARVALHO M. D., CARVALHO J. F., MERRICK W. C. (1984): Biological characterization of various forms of elongation factor 1 from rabbit reticulocytes. Archives of biochemistry and biophysics; 234 (2): 603–611. CIGLENEČKI J. U., GROM J., TOPLAK I., JEMERŠIĆ L., BARLIČ-MAGANJA D. (2008): Real-time RT-PCR assay for rapid and specific detection of classical swine fever virus: Comparison of SYBR Green and TaqMan MGB detection methods using novel MGB probes. Journal of Virological Methods, 147: 257–264. CONDEELIS J. (1995): Elongation factor 1α, translation and the cytoskeleton. Trends in Biochemical Science, 20 (5): 169–170.
COPPARD N. J., CLARK B. F. C., CRAMER F. (1983): Methylation of elongation factor Iα in mouse 3T3B and 3T3B/SV40 cells. FEBS Letters, 164 (2): 330–334.
79
DAVOLI R., ZAMBONELLI P., BIGI D., FONTANESI L., RUSSO V. (1999): Analysis of expressed sequence tags of porcine skeletal muscle. Gene, 233 (1-2): 181-188.
DAVOLI R., BIGI D., FONTANESI L., ZAMBONELLI P., YERLE M., ZIJLSTRA C., BOSMA A. A., ROBIC A., RUSSO V. (2000): Mapping of 14 expressed sequence tags (ESTs) from porcine skeletal muscle by somatic cell hybrid analysis. Animal Genetics, 31 (6): 400-403.
DAVOLI R., FONTANESI L., ZAMBONELLI P., BIGI D., GELLIN J., YERLE M., MILC J., BRAGLIA S., CENCI V., CAGNAZZO M., RUSSO V. (2002): Isolation of porcine expressed sequence tags for the construction of a first genomic transcript map of the skeletal muscle in pig. Animal Genetics, 33 (1): 3-18.
DENG S. X., CHENG A. C., WANG M. S., CAO P., YAN B., YIN N. C., CAO S. Y., ZHANG Z. H. (2008): Quantitative studies of the regular distribution pattern for Salmonella enteritidis in the internal organs of mice after oral challenge by a specific realtime polymerace chain reaction. World Journal of Gastroenterology, 14 (5): 782–789.
DEVER T. E., COSTELLO C. E., OWENS CH. L., ROSENBERRY T. L., MERRICK W. C. (1989): Location of Seven Post-translational Modifications in Rabbit Elongation Factor 1α Including Dimethyllysine, Trimethyllysine, and Glycerylphosphorylethanolamine. The Journal of Biological Chemistry, 264 (34): 20518–20525.
DI DOMENICO B. J., LUPISELLA J., SANDBAKEN M., CHAKRABURTTY K. (1992): Isolation and sequence analysis of the gene encoding translation elongation factor 3 from Candida albicans. Yeast, 8: 337–352.
DITZEL H. J., MASAKI Y., NIELSEN H., FARNAES L., BURTON D. R. (2000): Cloning and Expression of a Novel Human Antibody-antigen Pair Associated with Felty's Syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97 (16): 9234-9239.
80
DJÉ M. K., MAZABRAUD A., VIEL A., LE MAIRE M., DENIS H., CRAWFORDLT E. BROWN D. D. (1990): Three genes under different developmental control encode elongation factor 1-α in Xenopus laevis. Nucleic Acids Research, 18 (12): 3489–3493.
DUTTAROY A., BOURBEAU D., WANG X., WANG E. (1998): Apoptosis Rate Can Be Accerlerated or Decelerated by Overexpression or Reductin of the Level of Elongation Factor-1α. Experimental Cell Research, 238: 168–176.
EDMONDS B. T., WYCKOFF J., , YEUNG Y., , WANG Y., STANLEY E. R., JONES J., SEGALL J., CONDEELIS J. (1996): Elongation factor-1α is an overexpressed actin binding protein in metastatic rat mammary adenocarcinoma. Journal of Cell Science, 109: 2705–2714.
ERKENS T., VAN POUCKE M., VANDESOMPELE J., GOOSSENS K., VAN ZEVEREN A., PEELMAN L. J., (2006): Development of a new set of reference genes for normalization of real-time RT-PCR data of porcine backfat and longissimus dorsi muscle, and evaluation with PPARGCIA. BMC Biotechnology, 6: 41.
FUJII J., OTSU K., ZORZATO F., DE LEON S., KHANNA V. K., WEILER J. E., O'BRIEN P. J., MACLENNAN D. H. (1991): Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia. Science 253 (5018): 448-451. GELDERMANN H., MÜLLER E., MOSER G., REINER G., BARTENSCHLAGER H., ČEPICA S., STRATIL A. (2003): Genome-wide linkage and QTL mapping in porcine F2 families generated from Pietrain, Meishan and Wild Boar crosses. Journal of Animal Breeding and Genetics, 120: 363–393. GENORM (2004): GeNorm manual [cit. 2005-26-2]. Dostupené na: http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/
GIBSON U. E., HEID C. A., WILLIAMS P. M. (1996): A novel method for real time quantitative RT PCR. Genome Research, 6 (10): 995–1001.
81
GIGLIO S., MONIS P. T., SAINT C. P. (2003): Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Research, 31 (22): 136.
GOLDSPINK G. (2004): Local and systemic regulation of muscle growth. In: TE PAS M. F. W., EVERTS M. E., HAAGSMAN H. P. (eds.) Muscle Development of Livestock Animals: Physiology, Genetics and Meat Quality. CABI Publishing, Oxfordshire, UK, s. 157–171.
GRANT A. G., FLOMEN R. M., TIZARD M. L., GRANT D. A. (1992): Differential screening of a human pancreatic adenocarcinoma lambda gt11 expression library has identified increased transcription of elongation factor EF-1 alpha in tumour cells. International Journal of Cancer, 50 (5): 740–745.
GRASSI G., SCAGGIANTE B., FARRA R., DAPAS B., AGOSTINI F., BAIZ D., ROSSO N., TIRIBELLI C. (2007): The expression levels of the translational factors eEF1A 1/2 correlate with cell growth but not apoptosis in hepatocellular carcinoma cell lines with different differentiation grade. Biochimie, 89: 1544–1552.
GREEN P., FALLS K., CROOKS S. (1990): Documentation for CRI-MAP, Version 2.4. Washington University School of Medicine, St. Louis, MO. HARTL D. L., JONES E. W. (1998): Genetics Principles and Analysis. 4. vydání, Gareth Stevens Publishing, 840 s. ISBN: 0-7637-0489-X
HASAN L., VÖGELI P., STOLL P., KRAMER S. S., STRANZINGER G., NEUENSCHWANDER S. (2004):
Intragenic deletion in the gene encoding L-
gulonolactone oxidase causes vitamin C deficiency in pigs. Mammalian Genome, 15 (4): 323-333.
HASHIMOTO K., ISHIMA T. (2011): Neurite Outgrowth Mediated by Translation Elongation Factor eEF1A1: A Target for Antiplatelet Agent Cilostazol. Public Library of Science one, 6 (3): e17431.
82
HATTORI S., IWASAKI K. (1980): Studies on the High Molecular Weight Form of Polypeptide Chain Elongation Factor-1 from Pig Liver. The Journal of Biochemistry, 88 (3): 725–736.
HAWKEN R. J., MURTAUGH J., FLICKINGER G. H., YERLE M., ROBIC A., MILAN D., GELLIN J., BEATTIE C. W., SCHOOK L. B. A ALEXANDER L. J. (1999): A firstgeneration porcine whole-genome radiation hybrid map. Mammalian Genome, 10: 824– 830. HÄNDEL S. E., STICKLAND N. C. (1987): Muscle cellularity and birth weight. Animal Production, 44: 311–317. HÄNDEL S. E., STICKLAND N. C. (1988): Catch-up growth in pigs: a relationship with muscle cellularity. Animal Production, 47: 291–295.
HIATT W. R., GARCIA R., MERRICK W. C., SYPHERD P. S. (1982): Methylation of elongation factor lα from the fungus Mucor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 79: 3433–3437.
HOVEMANN B., RICHTER S., WALLDORF U., CZIEPLUCH C. (1988): Two genes encode related cytoplasmic elongation factors lα (EF-1α) in Drosophila melanogaster with continuous and stage specific expression. Nucleic Acids Research, 16 (8): 3175–3194.
HSIAO L. L., DANGOND F., YOSHIDA T., HONG R., JENSEN R. V., MISRA J., DILLON W., LEE K. F., CLARK K. E., HAVERTY P., WENG Z., MUTTER G. L., FROSCH M. P., MACDONALD M. E., MILFORD E. L., CRUM C. P., BUENO R., PRATT R. E., MAHADEVAPPA M., WARRINGTON J. A., STEPHANOPOULOS G., STEPHANOPOULOS G., GULLANS S. R. (2001): A compendium of gene expression in normal human tissues. Physiological Genomics, 7 (2): 97–104.
CHAMBERS D. M., PETERS J., ABBOTT C. M. (1998): The lethal mutation of the mouse wasted (wst) is a deletion that abolishes expression of a tissue-specific isoform of translation elongation factor 1alpha, encoded by the Eef1a2 gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95 (8): 4463-4468. 83
CHEN K., BAXTER T., MUIR W.M., GROENEN M. A., SCHOOK L. B. (2007): Genetic Resources, Genome Mapping and Evolutionary Genomics of the Pig (Sus scrofa). International Journal of Biological Sciences. 3 (3): 153-165.
CHUANG S. M., CHEN L., LAMBETRSON D., ANAND M, KINZY T. G., MADURA M. (2005): Proteosome-mediated degradation of contranslationally damaged proteins involves translation elongation factor 1A. Molecular and Cellular Biology, 25: 403–413.
IWASAKI K., NAGATA S, MIZUMOTO K., KAZIRO Y. (1974): The purification of low molecular weight form of polypeptide elongation factor 1 from pig liver. The Journal of Biological Chemistry, 249 (15): 5008–5010. JANSSEN G. M. C., van DAMME H. T. F., KRIEK J., AMONS R., MÖLLER W. (1994): The Subunit Structure of Elongation Factor 1 from Artemia, The Journal of Biological Chemistry, 269 (50): 31410–31417. JEFFERIES H. B. J., THOMAS G., THOMAS G. (1994): Elongation Factor-lα mRNA Is Selectively Translated following Mitogenic Stimulatio. The Journal of Biological Chemistry, 269 (6): 4367–4372.
JOSEPH P., O'KERNICK C. M., OTHUMPANGAT S., LEI Y. X., YUAN B. Z., ONG T. M. (2004): Expression profile of eukaryotic translation factors in human cancer tissues and cell lines. Molecular Carcinogenesis, 40 (3): 171–179.
KAHNS S., LUND A., KRISTENSEN P., KNUDSEN C. R., CLARK B. F. C., CAVALLIUS J. MERRICK W. C. (1998): The elongation factor 1 A-2 isoform from rabbit: cloning of the cDNA and characterization of the protein. Nucleic Acids Research, 26 (8): 1884–1890.
KAMATH A., CHAKRABURTTY K. (1989): Role of Yeast Elongation Factor 3 in the Elongation Cycle. The Journal of Biological Chemistry, 264 (26): 15423–15428
84
KARNUAH A. B., UENISHI H., KIUCHI S., KOJIMA M., ONISHI A., YASUE H., MITSUHASHI T. (2001): Assignment of 64 genes expressed in 28-day-old pig embryo to radiation hybrid map. Mammalian Genome, 12: 518–523.
KAZIRO Y. (1978): The role of guanosine 5'-triphosphate in polypeptide chain elongation. Biochimica et Biophysica Acta, 505 (1): 95–127.
KHALYFA A., CARLSON B. M., CARLSON J. A., WANG E. (1999): Toxin InjuryDependent Switched Expression Between EF-1α and Its Sister, S1, in Rat Skeletal Muscle. Developmental Dynamics, 216: 267–273.
KHALYFA A., BOURBEAU D., CHEN E., PETROULAKIS E., PAN J., XU S., WANG E. (2001): Characterization of Elongation Factor-1A (eEF1Α-1) and eEF1Α-2/S1 Protein Expression in Normal and Wasted Mice. The Journal of Biological Chemistry, 276: 22915–22922. KHACHO M., MEKHAIL K., PILON-LAROSE K., PAUSE A., COTÉ J., LEE S. (2008): eEF1A Is a Novel Komponent of the Mammalian Nuclear Protein Export Machiery. Molecular Biology of the Cell, 19: 5296–5308. KIELBASSA K., MÜLLER H, MEYER H. E., MARKS F., GSCHWENDT M. (1995): Protein Kinase Cσ-specific Phosphorylation of the Elongation Factor eEF-1α and an eEF1α Peptide at Threonine 431. The Journal of Biological Chemistry, 270 (11): 6156–6162.
KIM J., NAMKUNG W., YOON J. S., JO M. J., LEE S. H., KIM K. H., KIM J. Y., LEE M. G. (2009): The role of translation elongation factor eEF1A in intracellular alkalinization-induced tumor cell growth. Laboratory Investigation, 89: 867–874.
KNUDSEN S. M., FRYDENBERG J., CLARK B. F. C., LEFFERS H. (1993): Tissuedependent variation in the expression of elongation factor-lα isoforms: Isolation and characterisation of a cDNA encoding a novel variant of human elongation-factor lα. European Journal of Biochemistry, 215 (3): 549–554.
85
KRIEG P. A., VARNUM S. M., WORMINGTON W. M., MELTON D. A. (1989): The mRNA encoding elongation factor 1-alpha (EF-1 alpha) is a major transcript at the midblastula transition in Xenopus. Developmental Biology, 133 (1): 93–100.
LAM D. C. L., GIRARD L., SUEN W., CHUNG L., TIN V. P. C., LAM W., MINNA J. D., WONG M. P. (2006): Establishment and expression profiling of new lung cancer cell lines from Chinese smokers nad lifetime never-smokers. Journal of Thoracic Oncology, 1 (9): 932–942.
LANGE K., BOEHNKE M., COX D. R., LUNETTA K. L. (1995): Statistical methods for polyploid radiation hybrid mapping. Genome Research, 5: 136–150.
LEE S., FRANCOEUR A., LIU S., WANG E. (1992): Tissue-specific expression in mammalian brain, heart, and muscle of S1, a member of the elongation factor-lα gene family. The Journal of Biological Chemistry, 267 (33): 24064–24068.
LEE S., WOLFRAIM L. A., WANG E. (1993): Differential Expression of S1 and Elongation Factor-la during Rat Development. The Journal of Biological Chemistry, 268 (32): 24453–24459
LEE S., LE BLANC A., DUTTAROY A., WANG. E. (1995): Terminal differentiationdependent alternation in the expression of translation elongation factor-1 alpha and its sister gene, S1, in neurons. Experimental Cell Research, 219: 589–597.
LEE S., JO M., LEE J., KOH S. S., KIM S. (2007): Identification of novel universal housekeeping genes by statistical analysis of microarray data. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 40 (2): 226–231.
LIVAK K. J., SCHMITTGEN T. D. (2001): Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 25 (4): 402–408.
86
LUND A., KNUDSEN S. M.; VISSING H.; CLARK B.; TOMMERUP N. (1996): Assignment of human elongation factor 1-alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3. Genomics, 1996, 36: 359–361.
MAAK S., JAESERT S., NEUMANN K., YERLE M., von LENGERKEN G. (2001): Isolation of expressed sequence tags of skeletal muscle of neonatal healthy and splay leg piglets and mapping by somatic cell hybrid analysis. Animal Genetics, 32 (5): 303-307.
MADSEN H. O., POULEN K., DAHL O., CLARK B. F. C., HJORTH P. J. (1990): Retropseudogenes constitute the major part of the human elongation factor 1α gene family. Nucleic Acids Research, 18 (6): 1513–1516.
MANSILLA F., HANSEN L. L., JAKOBSEN H., KJELDGAARD N. O., CLARK B. F., KNUDSEN C. R. (2005): Deconstructing PTI-1: PTI-1 is a truncated, but not mutated, form of translation elongatin factor 1A1, eEF1A1. Biochimica et Biophysica Acta, 1727 (2): 116–124.
MARKLUND L., MOLLER M. J., HOYHEIM B., DAVIES V., FREDHOLM M., JUNEJA R. K., MARIANI P., COPPIETERS W., ELLEGREN H., ANDERSSON L. (1996): A comprehensive linkage map of the pig based on a wild pig-Large White intercross. Animal Genetics, 27: 255–269.
MERRICK W. C., DEVER T. E., KINZY T. G., CONROY S. C., CAVALLIUS J., OWENS C. L. (1990): Characterization of protein synthesis factors from rabbit reticulocytes. Biochimica et Biophysica Acta, 1050 (1-3): 235–240.
MERRICK W. C. (1992): Mechanism and Regulation of Eukaryotic Protein Synthesis. Microbiological Reviews, 56 (2): 291–315.
87
MILAN D., JEON J. T., LOOFT C., AMARGER V., ROBIC A., THELANDER M., ROGEL-GAILLARD C., PAUL S., IANNUCCELLI N., RASK L., RONNE H., LUNDSTRÖM K., REINSCH N., GELLIN J., KALM E., ROY P. L., CHARDON P., ANDERSSON L. (2000): A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen content in pig skeletal muscle. Science 288 (5469): 1248-1251.
MOHLER J. L., MORFIA T. L., FORD O. H., ALVEY R. F., SAKAMOTO CH., GREGORY CH., W. (2002): Identification of Differentially Expressed Genes Associated With Androgen-Independent Growth of Prostate Cancer. The Prostate, 51: 247–255.
MOTOYOSHI K., IWASAKI K., KAZIRO Y. (1977): Purification and Properties of Polypeptide Chain Elongation Factor-lβγ from Pig Liver. The Jouranl of Biochemistry, 82 (1): 145–155.
MUNTZ L. (1990): Cellular and biochemical aspects of muscle differentiation. Comparative Biochemistry and Physiology. B, Comparative Biochemistry, 97(2): 215–225.
MURRAY J. W., EDMONDS B. T., LIU G., CONDEELIS J. (1996): Bundling of Actin Filaments by Elongation Factor 1α Inhibits Polymerization at Filament Ends. The Journal of Cell Biology, 135 (5): 1309–1321.
NEGRUTSKII B. S., EL'SKAYA A. V. (1998): Eukaryotic Translation Elongation Factor 1α: Structure, Expression, Functions, and Possible Role in Aminoacyl-tRNA Channeling. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 60: 47–78. NESVADBOVÁ M., KNOLL A. (2011): The evaluation of reference genes for gene expression studies in pig muscle tissue with real-time PCR. Czech Journal of Animal Sciences, 56 (5): 213 - 216. NEWBERY H. J., LOH D. H., O´DONOGHUE J. E., TOMLINSON V. A. L., CHAU Y. Y., BOYD J. A., BERGMANN J. H., BROWNSTEIN D., ABBOTT C. M. (2007): Translation Elongation Factor eEF1A2 Is Essential for Post-weaning Survival in Mice. The Journal of Biological Chemistry, 282 (39): 28951–28959.
88
NYGARD A. B., JØRGENSEN C. B., CIRERA S., FREDHOLM M., (2007): Selection of reference genes for gene expression studies in pig tissues using SYBR green qPCR. BMC Molecular Biology, 8:67.
OHNAMI S., MATSUMOTO N., NAKANO M., AOKI K., NAGASAKI K., SUGIMURA T., TERADA M., YOSHIDA T. (1999): Identification of Genes Showing Differential Expression in Antisense K-rastransduced Pancreatic Cancer Cells with Suppressed Tumorigenicity. Cancer Research, 59: 5565–5571.
OPDENAKKER G., CABEZA-ARVELAIZ Y., FITEN P., DIJKMANS R., VAN DAMME J., VOLCKAERT G., BILLIAU A., VAN ELSEN A., VAN DER SCHUEREN B., VAN DEN BERGHE H., CASSIMAN J. (1987): Human elongation factor 1 alpha: a polymorphic and conserved multigene family with multiple chromosomal localizations. Human Genetics, 75 (4): 339–344. PAVELKOVÁ M. (2010): Analýza polymorfizmů v genu EEF1A2 u prasat, Diplomová práce, MZLU v Brně, Brno, 58 s.
PECK D., WALSH F. S. (1993): Differential Effects of Over-expressed Neural Cell Adhesion Molecule Isoforms on Myoblast Fusion. The Journal of Cell Biology, 123 (6): 587–1595.
PERRY R. L., RUDNICK M. A. (2000): Molecular mechanisms regulating myogenic determination and differentiation. Frontiers in Bioscience: a Journal and Virtual Library, 5: D750–767. PIKÁLEK P. (1998): Biosyntéza nukleových kyselin a bílkovin s. 176–183, In. ROSYPAL S., BENEŠ J., BENEŠ K., BUCHAR J., HERÁŇ I., HOMOLA J., HŮRKA K., KUBIŠTA V., KVAČEK Z., LINC R., LOSOS B., MLADÁ J., MLADÝ F., NOVOTNÝ I., PAVLOVÁ L., PIKÁLEK P., ROMANOVSKÝ A., SLAVÍKOVÁ Z., SLAVÍKOVÁ J., ŠAŠEK V., ŠEBÁNEK J., ŠMARDA J., ŠTYS P., URBAN Z., Přehled biologie. Scientia, spol. s r. o., Praha, 642 s., ISBN 80-7183-110-7.
89
PONSUKSILI S, WIMMERS K, YERLE M, SCHELLANDER K. (2001): Mapping of 93 porcine ESTs preferentially expressed in liver. Mammalian Genome, 12 (11): 869-872. PÖTING A., DANKER K., HARTMANN L., KÖSTER M., WEDLICH D., KNÖCHEL W. (1990): Two different mRNAs coding for identical elongation factor 1 alpha (EF-1 alpha) polypeptides in Xenopus laevis embryos. Differentiation; Research in Biological Diversity, 44 (2): 103–110.
REHFELDT C., FIEDLER I., DIETL G., ENDER K. (2000): Myogenesis and postnatal skeletal muscle cell growth as influenced by selection. Livestock Production Science, 66: 177–188.
REHFELDT C., FIEDLER I., STICKLAND N. C. (2004): Number and size of muscle fibres in relation to meat production. In: TE PAS M. F. W., EVERTS M. E., HAAGSMAN H. P. (eds.) Muscle Development of Livestock Animals: Physiology, Genetics and Meat Quality. CABI Publishing, Oxfordshire, UK, s. 1–38.
RIRIE K. M., RASMUSSEN R. P., WITTWER C. T. (1997): Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry, 245 (2): 154–160.
ROTHSCHILD M. F. (2003): Advances in pig genomics and functional gene discovery. Comparative and Functional Genomics, 4: 266–270.
RUEST L. B., MARCOTTE R., WANG E. (2002): Peptide Elongation Factor eEF1A-2/S1 Expression in Cultured Differentiated Myotubes and Its Protective Effect against Caspase3-mediated Apoptosis. The Journal of Biological Chemistry, 277 (7): 5418–5425. RUTLEDGE R. G., CÔTÉ C. (2003): Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves. Nucleic Acids Research, 31 (16): 93.
RYCHLIK W., RHOADS R. E. (1989): A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucleic Acids Research, 17 (21): 8543–8551. 90
SANDERS J., MAASSEN J. A., MÖLLER W. (1992): Elongation factor-1 messengerRNA levels in cultured cells are high compared to tissue and are not drastically affected further by oncogenic transformation. Nucleic Acids Research, 20 (22): 5907–5910.
SANGER F., NICKLEN S., COULSON A. R. (1977): DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74 (12): 5463–5467.
SCAGGIANTE B., BONIN S., CRISTIANO L., SIRACUSANO S., STANTA G., DAPAS B., GIANSANTE C., FIOTTI N., GRASSI G. (2008): Prostate-tumor-inducing gene-1 analysis in human prostate cancer cells and tissue in relation to Mycoplasma infection. Cancer Investigation, 26 (8): 800–808. SELGA E., OLEAGA C., RAMÍREZ S., DE ALMAGRO M. C., NOÉ V., CIUDAD C. J. (2009): Networking of differentially expressed genes in human cancer cells resistant to methotrexate. Genome Medicine, 1 (9): 83. SERÃO N. V., VERONEZE R., RIBEIRO A. M., VERARDO L. L., BRACCINI NETO J., GASPARINO E., CAMPOS C.F., LOPES P. S., GUIMARÃES S. E. (2011): Candidate gene expression and intramuscular fat content in pigs. Journal of animal breeding and genetics, 128 (1): 28-34.
SHAMOVSKY I., IVANNIKOV M., KANDEL E. S., GERSHON D., NUDLER E. (2006): RNA-mediated response to heat shock in mammalian cells. Nature, 440: 556–660.
SHEN R., SU Z. Z., OLSSON C. A., FISHER P. B (1995): Identification of the human prostatic carcinoma oncogene PTI-I by rapid expression cloning and differnetial RNA display. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92: 6778–6782.
SHEN Y., LI Y., YE F., WANG F., LU W., XIE X. (2010): Identification of suitable reference genes for measurement of gene expression in human cervical tissues. Analytical Biochemistry, 405: 224–229.
91
SHEPHERD J. C, W., WALLDORF U., HUG P., GEHRING W. J. (1989): Fruit flies with additional expression of the elongation factor EF-1α live longer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86: 7520–7521.
SHIRASAWA T., SAKAMOTO K., AKASHI T., TAKAHASHI H., KAWASHIMA A. (1992): Nucleotide sequence of rat elongation factor-1α cDNA. Nucleic Acids Research, 20, (4): 909.
SHULTZ L. D., SWEET H. O., DAVISSON M. T., COMAN D. R. (1982): 'Wasted', a new mutant of the mouse with abnormalities characteristic of ataxia telangiectasia. Nature, 297: 402–404.
SCHIRMAIER F., PHILIPPSEN P. (1984): Identification of two genes coding for the translation elongation factor EF-lα of S. cerevisiae. The EMBO Journal, 3 (13): 3311–3315
SCHMITTGEN T. D., ZAKRAJSEK B. A., MILLS A. G., GORN V., SINGER M. J., REED M. W. (2000): Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods. Analytical Biochemistry, 285 (2): 194–204.
SKOGERSON L., WAKATAMA E. (1976): A ribosome-dependent GTPase from yeast distinct from elongation factor 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 73 (1): 73–76.
SLOBIN L. I. (1983): Binding of Eucaryotic Elongation Factor Tu to Nucleic Acids. The Journal of Biological Chemistry, 258 (8): 4895–4900. SLOBIN L. I., RAO M. N. (1993): Translational repression of EF-lα mRNA in vitro. European Journal of Biochemistry / FEBS, 213, 919–926.
SMITH T. P., FAHRENKRUG S. C., ROHRER G. A., SIMMEN F. A., REXROAD C. E., KEELE J. W. (2001): Mapping of expressed sequence tags from a porcine early embryonic cDNA library. Animal Genetics, 32 (2): 66-72.
92
SOARES D. C., BARLOW P. N., NEWBERY H. J., PORTEOUS D. J., ABBOTT J. M. (2009): Structural Models of Human eEF1A1 and eEF1A2 Reveal Two Distinct Surface Clusters of Sequence Variation and Potential Differences in Phosphorylation. PLoS ONE 4, (7): e6315
SONG J. M., PICOLOGLOU S., GRANT CH. M., FIROOZAN M., TUITE M. F., LIEBMAN S. (1989): Elongation Factor EF-lα Gene Dosage Alters Translational Fidelity in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology, 9 (10): 4571–4575. STÅHLBERG A., AMAN P., RIDELL B., MOSTAD P., KUBISTA M. (2003): Quantitative real-time PCR method for detection of B-lymphocyte monoclonality by comparison of kappa and lambda immunoglobulin light chain expression. Clinical Chemistry, 49 (1): 51-59.
STEINAU M., RAJEEVAN M. S., UNGER E. R. (2006): DNA and RNA references for RT-qPCR assays in exfoliated cervical cells, Journal of Molecular Diagnostics, 8 (1): 113– 118.
STICKLAND N. C., BAYOL S., ASHTON C., REHFELDT C. (2004): Manipulation of muscle fibre number during prenatal development. In: TE PAS M. F. W., EVERTS M. E., HAAGSMAN H. P. (eds.) Muscle Development of Livestock Animals: Physiology, Genetics and Meat Quality. CABI Publishing, Oxfordshire, UK, s. 69–82.
SU Z., GOLDSTEIN N. I., FISHER P. B. (1998): Antisense inhibition of the PTI-1 oncogene reverses cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95 (4): 1764-1769.
SUN Y., LIN J., KATZ A. E., FISHER P. B. (1997): Human prostatic carcinoma oncogene PTI-1 is expressed in human tumor cell lines and prostate carcinoma patient blood samples. Cancer Research, 57 (1): 18–23.
93
SUN Y., WONG N., GUAN Y., SALAMANCA C. M., CHENG J. CH., LEE J. M. GRAY J. W., AUERSPERG N. (2008): The eukaryotic translation elongation factor eEF1A2 induces neoplastic properties and mediates tumorigenic effects of ZNF217 in precursor cells of ovarian carcinomas. International Journal of Cancer. 123: 1761–1769.
SVOBODOVÁ K., BÍLEK K., KNOLL A. (2008): Verification of reference genes for relative quantification of gene expression by real-time reverse transcription PCR in the pig. Journal of Applied Genetics, 49 (3): 263–265. SVOBODOVÁ K., HORÁK P., STRATIL A., KNOLL A., BARTENSCHLAGER H., VAN POUCKE M., CHALUPOVÁ P., PEELMAN L. J., KNORR, C., GELDERMANN H. (2010): Comparative analysis of porcine EEF1A1 and EEF1A2 genes: structure, polymorphism, mapping and expression. In: XXXIII Conference of the International Society for Animal Genetics (ISAG 2010). Edinburgh, Scotland. Poster 1030.
SWATLAND H. J. (1973): Muscle growth in the fetal and neonatal pig. Journal of Animal Science, 37(2): 536–545. ŠMARDA J., DOŠKAŘ J., PANTŮČEK R., RŮŢIČKOVÁ V., KOPTÍKOVÁ J. (2005): Metody molekulární biologie. Masarykova Univerzita, Vydavatelství MU, Brno-Kraví Hora, 188 s., ISBN 80-210-3841-1.
TATSUKA M., MITSUI H., WADA M., NAGATA A., NOJIMA H., OKAYAMA H. (1992): Elongation factor-1α gene determines susceptibilit to transformation. Nature, 359 (6393): 333–336.
TE PAS M. F., DE WIT A. A., PRIEM J., CAGNAZZO M., DAVOLI R., RUSSO V., POOL M. H. (2005): Transcriptome expression profiles in prenatal pigs in relation to myogenesis. Journal of Muscle Research and Cell Motility, 26 (2-3): 157-165.
TICHOPAD A., DILGER M., SCHWARZ G., PFAFFL M. W. (2003): Standardized determination of real-time PCR efficiency from a single reaction set-up. Nucleic Acids Research, 31 (20):122.
94
TICHOPÁD A. (2004): Quantitative real-time RT-PCR based transcriptomics: Improvement of evaluation methods. Lehrstuhl für Physiologie. Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan. Technische Universität München. [cit. 2011_4_20]. Dostupné na: http://deposit.ddb.de/cgibin/dokserv?idn=972765069&dok_var=d1&dok_ext=pdf&filename=972765069.pdf.
TOMLINSON V. A. L., NEWBERY H. J., WRAY N. R., JACKSON J., LARIONOV A., MILLER W. R., DIXON. J. M., ABBOTT C. M. (2005): Translation elongation factor eEF1A2 is a potential oncoprotein that is overexpressed in two-thirds of breast tumours. BMC Cancer, 5:113.
TOMLINSON V. A. L., NEWBERY H. J., BERGMANN J. H., BOYD J., SCOTT D., WRAY N. R., SELLAR G. C., GABRA H., GRAHAM A., WILLIAMS A. R., ABBOTT C. M. (2007): Expression of eEF1A2 is associated with clear cell histology in ovarian carcinomas: overexpression of the gene is not dependent on modifications at the EEF1A2 locus. British Journal of Cancer, 96 (10): 1613-1620.
TOSSER-KLOPP G., BENNE F., BONNET A., MULSANT P., GASSER F., HATEY F. (1997): A first catalog of genes involved in pig ovarian follicular differentiation. Mammalian Genome, 8 (4): 250-254.
TOYOTA A., AKIYAMA H., SUGIMURA M., WATANABE T., KIKUCHI H., KANAMORI H., HINO A., ESAKA M., MAITANI T. (2006): Quantification of genetically modified soybeans using a combination of a capillary-type real-time PCR system and a plasmid reference standard. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 70 (4): 821–827.
TSAI S., CASSADY J. P, FREKING B. A., NONNEMAN D. J., ROHRER G. A., PIEDRAHITA J. A., (2006). Annotation of the Affymetrix porcine genome microarray. Animal Genetics, 37: 423–424.
TUGGLE C. K., WANG Y., COUTURE O. (2007): Advances in swine transcriptomics. International Journal of Biological Sciences, 3 (3): 132-152.
95
UETSUKI T., NAITO A., NAGATA S., KAZIRO Y. (1989): Isolation and Characterization of the Human Chromosomal Gene for Polypeptide Chain Elongation Factor-1α. The Journal of Biological Chemistry, 264 (10): 5791–5798.
VALLEJO G., MASCHI D., CITRINOVITZ A. C. M., AIBA K., MARONNA R., YOHAI V., KO M. S. H., BEATO M., SARAGÜETA P. (2010): Changes in global gene expression during in vitro decidualization of rat endometrial stromal cells. Journal of Cellular Physiology, 222 (1): 127–137
VAN DAMME H. T., AMONS R., KARSSIES R., TIMMERS C. J., JANSSEN G. M., MÖLLER W. (1990): Elongation factor 1 beta of artemia: localization of functional sites and homology to elongation factor 1 delta. Biochimica et Biophysica Acta, 1050 (1-3): 241–247.
VANDESOMPELE J., DE PAEPE A., SPELEMAN F. (2002a) Elimination of primerdimer artifacts and genomic coamplification using a two-step SYBR green I real-time RTPCR. Analytical Biochemistry, 303 (1): 95–98.
VANDESOMPELE J., DE PRETER K., PATTYN F., POPPE B., VAN ROY N., DE PAEPE A., SPELEMAN F. (2002b): Accurate normalization of real-time quantitative RTPCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology, 3 (7): research 0034.1–0034.11.
VENEMA R. C., PETERS H. I., TRAUG J. A. (1991a): Phosphorylation of Valyl-tRNA Synthetase and Elongation Factor 1 in Response to Phorbol EstersI s Associated with Stimulation of Both Activities. The Journal of Biological Chemistry, 266 (18): 11993– 1199.
VENEMA R. C., PETERS H. I., TRAUG J. A. (1991b): Phosphorylation of Elongation Factor 1 (EF-1) and Valyl-tRNA Synthetase by Protein Kinase C and Stimulation of EF-1 Activity. The Journal of Biological Chemistry, 266 (19): 12574–12580.
96
VITZTHUM F., GEIGER G., BISSWANGER H., BRUNNER H., BERNHAGEN J. (1999): A Quantitative Fluorescence-Based Microplate Assay for the Determination of Double-Stranded DNA Using SYBR Green I and a Standard Ultraviolet Transilluminator Gel Imaging System. Analytical Biochemistry, 276 (1): 59–64
VON FIGURA G., HARTMAN D., SONG Z., RUDOLPH K. L. (2009): Role of telomere dysfunction in aging and its detection by biomarkers, Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany), (87): 1165–1171.
WALLDORF U., HOVEMANN B., BAUTZ E. K. F. (1985): Fl and F2: Two similar genes regulated differently during development of Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 82: 5795–5799.
WASILK A., CALLAHAN J. D., CHRISTOPHER-HENNINGS J., GAY T. A., FANG Y., DAMMEN M., REOS M. E., TORREMORELL M., POLSON D., MELLENCAMP M., NELSON E., NELSON W. M. (2004): Detection of U.S., Lelystad, and European-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses and relative quantitation in boar semen and serum samples by real-time PCR. Journal of Clinical Microbiology, 42 (10): 4453–4461.
WEISSBACH H., OCHOA S. (1976): Soluble Factors Required for Eukaryotic Protein Synthesi. Annual Review of Biochemistry. 45: 191–216.
WIGMORE P. M., STICKLAND N. C. (1983): Muscle Development in Large and Small Pig Fetuses. Journal of Anatomy, 137(2): 235–245.
WIMMERS K., PONSUKSILI S., SCHELLANDER K. (2004): The muscle transcriptome. In: TE PAS M. F. W., EVERTS M. E., HAAGSMAN H. P. (eds.) Muscle Development of Livestock Animals: Physiology, Genetics and Meat Quality. CABI Publishing, Oxfordshire, UK, s. 225-245.
WINTERO A. K., FREDHOLM M., DAVIES W. (1996): Evaluation and characterization of a porcine small intestine cDNA library: analysis of 839 clones. Mammalian Genome, 7 (7): 509-517. 97
YAMASHITA S., TSUJINO Y., MORIGUCHI K., TATEMATSU M., USHIJIMA T. (2006): Chemical genomic screening for methylation-silenced genes in gastric cancer cell lines using 5-aza-2´-deoxycytidine treatment and oligonucleotide microarray. Cancer Science, 97 (1): 64–71.
YAO J., COUSSENS P. M., SAAMA P., SUCHYTA S., ERNST C. W. (2002): Generation of expressed sequence tags from a normalized porcine skeletal muscle cDNA library. Animal biotechnology, 13 (2): 211-222.
YERLE M., PINTON P., ROBIC A., ALFONSO A., PALVADEU Y., DELCROS C., HAWKEN R., ALEXANDER L., BEATTIE C., SCHOOK L., MILAN D., GELLIN J. (1998): Construction of a whole-genome radiation hybrid panel for high-resolution gene mapping in pigs. Cytogenetics and Cell Genetics, 82: 182–188.
YPMA-WONG M. F., FONZI W. A., SYPHERD P. S. (1992): Fungus-specific translation elongation factor 3 gene present in Pneumocystis carinii. Infection and Imunity, 60 (10): 4140–4145.
YU L., WU G., WANG L., WANG H., ZHANG G. (2006): Transient reduction of PTI-1 expression by short interfering RNAs inhibits the growth of human prostate cancer cell lines. The Tohoku Journal of Experimental Medicine, 209 (2): 141–148.
ZHAO S. H., NETTLETON D., LIU W., FITZSIMMONS C., ERNST C. W., RANEY N. E., TUGGLE C. K. (2003): Complementary DNA macroarray analyses of differential gene expression in porcine fetal and postnatal muscle. Journal of Animal Science, 81 (9): 2179-2188.
98
8
SEZNAM OBRÁZKŮ
Obr. 1:
Elongační cyklus u eukaryot
Obr. 2:
3-D modely lidských proteinů eEF1A1 a eEF1A2
Obr. 3:
Umístění rozdílů mezi aminokyselinami zmapovanými na povrchu u eEF1A1 a eEF1A2
Obr. 4:
Znázornění průběhu amplifikace při real-time RT-PCR
Obr. 5:
Znázornění Tm křivek pro zkoumaný vzorek a dimery primerů
Obr. 6:
Izolovaná DNA
Obr. 7:
Celková RNA izolovaná z různých tkání
Obr. 8:
Stanovení koncentrace vzorků DNA pomocí standardů
Obr. 9:
PCR produkty genu EEF1A1 získané z DNA různých plemen prasat
Obr. 10:
PCR produkty 2A2B, 3A3B a 4A4B genu EEF1A2 získané z DNA různých plemen prasat
Obr. 11:
PCR produkty 1A1B a 4A5B genu EEF1A2 získané z DNA různých plemen prasat
Obr. 12:
Štěpení fragmentu 11A11B genu EEF1A2
Obr. 13:
Radiační hybridní mapa části chromozomu 17 prasete znázorňující polohu EEF1A2
Obr. 14:
Genomická struktura prasečího genu EEF1A2
Obr. 15:
Analýza exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v tkáních dospělého prasete pomocí multiplex PCR
Obr. 16:
Analýza exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v tkáních dospělého prasete a různě starých selat pomocí multiplex PCR
Obr. 17:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v různých tkáních ve vztahu ke svalovině dospělého jedince
Obr. 18:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A2 v různých tkáních ve vztahu ke svalovině dospělého jedince
Obr. 19:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v kosterní svalovině
Obr. 20:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genů EEF1A2 v kosterní svalovině
Obr. 21:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v srdeční svalovině
Obr. 22:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A2 v srdeční svalovině
Obr. 23:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v mozkové tkáni
Obr. 24:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A2 v mozkové tkáni
Obr. 25:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v játrech
Obr. 26:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A2 v játrech
Obr. 27:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v ledvině
Obr. 28:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A2 v ledvině
Obr. 29:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A1 v plicích
Obr. 30:
Relativní kvantifikace hladiny exprese genu EEF1A2 v plicích 99
9
SEZNAM TABULEK
Tab. 1:
Sloţení 10 × FA pufru
Tab. 2:
Sloţení nanášecího pufru pro RNA
Tab. 3:
Sloţení FA gelu
Tab. 4:
Sloţení 1 × FA pufru
Tab. 5:
Primery pro analýzu genu EEF1A1 z genomické DNA
Tab. 6:
Primery pro analýzu sekvence genu EEF1A2 z genomické DNA
Tab. 7:
Primery pro analýzu sekvence genu EEF1A2 z DNA klonu PAC
Tab. 8:
Primery pro analýzu vybraných úseků genu EEF1A2 pomocí klonování
Tab. 9:
Primery pro analýzu polymorfismu v genu EEF1A2
Tab. 10:
Primery pro analýzu exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v různých tkáních prasete
Tab. 11:
Primery pro analýzu stability exprese genů v různých tkáních dospělého prasete
Tab. 12:
Primery pro analýzu exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 pomocí real-time RTPCR
Tab. 13:
Porovnání délek exonů genu EEF1A2 u vybraných ţivočichů
Tab. 14:
Porovnání délek intronů genu EEF1A2 u vybraných ţivočichů
Tab. 15:
Jednonukleotidové polymorfismy nalezené v nukleotidové sekvenci genu EEF1A2
Tab. 16:
Podobnost aminokyselinové sekvence proteinu eEF1A2 (%) u čtyř druhů ţivočichů
Tab 17:
Frekvence alel prasečího EEF1A2 u osmi různých plemen (SNP FM992107:g.6609C>G)
Tab. 18:
Vazbová mapa (průměr pohlaví) chromozomu 17 prasete zahrnující gen EEF1A2; hohenheimská rodina M × P
Tab. 19:
Porovnání délky exonů a intronů (bp) genů EEF1A1 a EEF1A2
100
10 SEZNAM ZKRATEK A
adenin; purinová báze
A-FABP
Fatty Acid Binding Protein 4, adipocyte
AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism; polymorfismus délek amplifikovaných lokusů
BAC
Bacterial Artificial Chromosome
bp
basis pairs; páry bazí
C
cytosin; pyrimidinová báze
cDNA
complementary (copy) DNA; komplementární DNA
cM
centimorgan
CT
Threshold Cycle; cyklus, ve kterém fluorescence vzorku protne stanovený treshold
DNA
Deoxyribonucleic Acid; deoxyribonukleová kyselina
dsDNA
Double-stranded DNA; dvouřetězcová DNA
E
Efficiency; efektivita resp. efektivita PCR
EEF1A, EF-1α
gen pro eukaryotický elongační faktor 1 alfa
eEF1A, EF-1α
eukaryotický elongační faktor 1 alfa
EEF1A1, EF-1α1
gen pro eukaryotický elongační faktor 1 alfa 1
eEF1A1, EF-1α1
eukaryotický elongační faktor 1 alfa 1
EEF1A2, EF-1α2
gen pro eukaryotický elongační faktor 1 alfa 2
eEF1A2, EF-1α2
eukaryotický elongační faktor 1 alfa 2
ESR
Estrogen Receptor 1
EST
Expressed Sequence Tag; exprimovaný sekvenční marker
ET
Expressed Transcripts; exprimovaný transkript
EtBr
ethidium bromid; fenantridinium, 3,8-diamino-5-etyl-6-fenyl bromid
FABP3
Fatty Acid Binding Protein 3, muscle and heart (mammary-derived growth inhibitor)
FUT1
Fucosyltransferase 1
G
guanin; purinová báze
GDP
guanosindifosfát; purinový ribonukleotid
GH1
Growth Hormone 1
GTP
guanosintrifosfát; purinový ribonukleotid
GULO
Gulonolactone (L-) oxidase
HKG
Housekeeping Gene; udrţovací gen
IMT
intramuskulární (vnitrosvalový) tuk
IPTG
Isopropyl-Beta-d-Thiogalactopyranoside
LEP
Leptin
101
LEPR
Leptin Receptor
LOD
Logarithm of Odds;
mRNA
messenger RNA; mediátorová RNA
MYOG
Myogenin
NTC
No Template Control; vzorek bez templátu (kontrola)
PAC
P1-derived artificial chromosome
PCR
Polymerase Chain Reaction; polymerázová řetězová reakce
pH
Potential of Hydrogen; potenciál vodíku, míra kyselosti
pI
Isoelectric Point; izoelektrický bod
PIT1
Growth Hormone Factor 1
PRKAG3
Protein Kinase, AMP-activated, Gamma 3 Non-catalytic Subunit
PTI-1
Prostate Carcinoma Tumor-inducing Gene 1
QTL
Quantitative Trait Loci; lokus kvantitativního znaku
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism; polymorfismus délek restrikčních fragmentů
Rn
Normalized Reporter
RNA
Ribonucleic Acid; ribonukleová kyselina
RNázy
skupina enzymů specificky štěpící RNA
ROX
6-Carboxyl-X-Rhodamine; barvivo
rRNA
ribosomal RNA; ribozomová RNA
RT
Reverse Transcription; reverzní transkripce
RT-PCR
Reverse Transcription PCR; reverzně transkripční PCR
RYR1
ryanodine receptor 1; ryanodinový receptor
SAGE
Serial Analysis of Gene Expression; sériová analýza genové exprese
SINE
Short Interspersed Nuclear Elements; krátké rozptýlené sekvence
SNP
Single Nucleotide Polymorphism; jednonukleotidový polymorfismus
SPP1
Secreted Phosphoprotein 1
SYBR
synergy brands, Inc.
TATA box
sekvence DNA nalézající se v oblasti promoteru
tRNA
transfer RNA; transferová RNA
T
thymin; pyrimidinová báze
TBE
Tris-Borate-Edta Buffer
TC
Tentative Clusters; předpokládaný klastr
Tm
Melting Temperature; teplota tání
U
uracil; pyrimidinová báze
UNG
Uracil-N glycosylase; enzym uracil N-glykosyláza
102
11 PŘÍLOHY 11.1 Seznam příloh Příloha 1:
Srovnání analyzovaných fragmentů genu EEF1A1 u čtyř plemen prasat: české bílé ušlechtilé (označení T4), landrace (označení T9), pietrain (označení P108) a kříţenec plemen meishan a pietrain (označení M222)
Příloha 2:
Srovnání mRNA z námi získaného fragmentu genu EEF1A1 z plemene pietrain
(označení
P108)
s mRNA
dostupnou
v NCBI
databázi
(NM_001097418.1) Příloha 3:
Sekvence genu EEF1A2 získaná z klonu PAC a umístění pouţitých primerů
Příloha 4:
Polymorfismy nalezené při porovnání sekvence genu EEF1A2 u čtyř plemen prasat: české bílé ušlechtilé (označení T4), landrace (označení T9), pietrain (označení P108) a kříţenec plemen meishan a pietrain (označení M222) a klonu PAC
Příloha 5:
Sekvence genu EEF1A1 prasete (exony 1 – 8)
Příloha 6:
Sekvence genu EEF1A2 prasete
Příloha 7:
Porovnání kódující sekvence genů EEF1A1 (NM_001097418) a EEF1A2 (FM992107) a umístění primerů pro multiplex PCR a real time RT-PCR
Příloha 8:
Porovnání aminokyselinové sekvence eEF1A1 a eEF1A2 prasete
Příloha 9:
Porovnání aminokyselinové sekvence eEF1A1 a eEF1A2 u prasete, člověka, myši a skotu
Příloha 10: Relativní kvantifikace exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v testovaných tkáních
103
Příloha 1: Srovnávání analyzovaných fragmentů genu EEF1A1 u čtyř plemen prasat: české bílé ušlechtilé (označení T4), landrace (označení T9), pietrain (označení P108) a kříţenec plemen meishan a pietrain (označení M222)
45 Část 43 exonu 2 48 50 T4-69 bp T9-67 bp P108-72 bp 95 M222-74 bp 93 98 100
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
-----CATCTGATCTACAAATGCGGTGGGATCGACAAAAGAACCATCGAA -------TCTGATCTACAAATGCGGTGGGATCGACAAAAGAACCATCGAA --GGCCATCTGATCTACAAATGCGGTGGGATCGACAAAAGAACCATCGAA CTGGCCATCTGATCTACAAATGCGGTGGGATCGACAAAAGAACCATCGAA *******************************************
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
AAGTTCGAAAAAGAGGCTGCGGAGGTCGGTAAAGTAACGTCAGCAAATTA AAGTTCGAAAAAGAGGCTGCGGAGGTCGGTAAAGTAACGTCAGCAAATTA AAGTTCGAAAAAGAGGCTGCGGAGGTCGGTAAAGTAACGTCAGCAAATTA AAGTTCGAAAAAGAGGCTGCGGAGGTCGGTAAAGTAACGTCAGCAAATTA **************************************************
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
AGTGGTAGTTCTCTAAAACTAGTGTATATCTGACTTGAACTAGTACATTG AGTGGTAGTTCTCTAAAACTAGTGTATATCTGACTTGAACTAGTACATTG AGTGGTAGTTCTCTAAAACTAGTGTATATCTGACTTGAACTAGTACATTG AGTGGTAGTTCTCTAAAACTAGTGTATATCTGACTTGAACTAGTACATTG **************************************************
145 Intron 2 143 148 195 bp 150
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
CAAAGTTTGCTAAGTGGCTTAACTCCAGCCAAGTTTAGGAGATGGAAGTG CAAAGTTTGCTAAGTGGCTTAACTCCAGCCAAGTTTAGGAGATGGAAGTG CAAAGTTTGCTAAGTGGCTTAACTCCAGCCAAGTTTAGGAGATGGAAGTG CAAAGTTTGCTAAGTGGCTTAACTCCAGCCAAGTTTAGGAGATGGAAGTG **************************************************
195 193 198 200
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
AAACCTAGCATTGCTTCCAAGTGGGACTAAGGAGTTTAGTTACCGAGTAA AAACCTAGCATTGCTTCCAAGTGGGACTAAGGAGTTTAGTTACCGAGTAA AAACCTAGCATTGCTTCCAAGTGGGACTAAGGAGTTTAGTTACCGAGTAA AAACCTAGCATTGCTTCCAAGTGGGACTAAGGAGTTTAGTTACCGAGTAA **************************************************
245 243 248 250
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
CCCTTCTTAATCCCTGCAGATGGGAAAGGGCTCCTTCAAGTATGCCTGGG CCCTTCTTAATCCCTGCAGATGGGAAAGGGCTCCTTCAAGTATGCCTGGG CCCTTCTTAATCCCTGCAGATGGGAAAGGGCTCCTTCAAGTATGCCTGGG CCCTTCTTAATCCCTGCAGATGGGAAAGGGCTCCTTCAAGTATGCCTGGG **************************************************
295 293 298 300
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
TCTTGGACAAACTAAAGGCTGAACGTGAGCGTGGTATTACCATTGACATC TCTTGGACAAACTAAAGGCTGAACGTGAGCGTGGTATTACCATTGACATC TCTTGGACAAACTAAAGGCTGAACGTGAGCGTGGTATTACCATTGACATC TCTTGGACAAACTAAAGGCTGAACGTGAGCGTGGTATTACCATTGACATC **************************************************
345 343 348 350
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
TCCCTGTGGAAATTCGAGACCAGCAAGTACTACGTGACCATCATTGATGC TCCCTGTGGAAATTCGAGACCAGCAAGTACTACGTGACCATCATTGATGC TCCCTGTGGAAATTCGAGACCAGCAAGTACTACGTGACCATCATTGATGC TCCCTGTGGAAATTCGAGACCAGCAAGTACTACGTGACCATCATTGATGC **************************************************
395 393 398 400
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
TCCAGGACACAGAGACTTTATTAAGAACATGATTACAGGCACTTCCCAGG TCCAGGACACAGAGACTTTATTAAGAACATGATTACAGGCACTTCCCAGG TCCAGGACACAGAGACTTTATTAAGAACATGATTACAGGCACTTCCCAGG TCCAGGACACAGAGACTTTATTAAGAACATGATTACAGGCACTTCCCAGG **************************************************
445 443 448 450
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
TTTGTAGGATTAAGAACTCCTGAGAGTAACATTTTGAGTTATCTATAAAT TTTGTAGGATTAAGAACTCCTGAGAGTAACATTTTGAGTTATCTATAAAT TTTGTAGGATTAAGAACTCCTGAGAGTAACATTTTGAGTTATCTATAAAT TTTGTAGGATTAAGAACTCCTGAGAGTAACATTTTGAGTTATCTATAAAT **************************************************
495 493 Intron 3 498 500 121 bp
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
TGGCGAAACCATGGATCTGTCCTTTTTGGAGAGGTTTTCACAGGGTGTGG TGGCGAAACCATGGATCTGTCCTTTTTGGAGAGGTTTTCACAGGGTGTGG TGGCGAAACCATGGATCTGTCCTTTTTGGAGAGGTTTTCACAGGGTGTGG TGGCGAAACCATGGATCTGTCCTTTTTGGAGAGGTTTTCACAGGGTGTGG **************************************************
545 543 548 550
104
Exon 3 180 bp
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
CCTTTTTTTCTTTTTTAAAGGCTGACTGTGCTGTCCTGATTGTTGCTGCT CCTTTTTTTCTTTTTTAAAGGCTGACTGTGCTGTCCTGATTGTTGCTGCT CCTTTTTTTCTTTTTTAAAGGCTGACTGTGCTGTCCTGATTGTTGCTGCT CCTTTTTTTCTTTTTTAAAGGCTGACTGTGCTGTCCTGATTGTTGCTGCT **************************************************
595 593 598 600 Část exonu 4
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
GGTGTTGGTGAATTCGAAGCAGGTATTTCCAAGAACGGGCAGACCCGTGA GGTGTTGGTGAATTCGAAGCAGGTATTTCCAAGAACGGGCAGACCCGTGA GGTGTTGGTGAATTCGAAGCAGGTATTTCCAAGAACGGGCAGACCCGTGA GGTGTTGGTGAATTCGAAGCAGGTATTTCCAAGAACGGGCAGACCCGTGA **************************************************
645 643 648 650
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
GCATGCTCTTCTGGCCTACACCCTGGGTGTGAAACAGCTCATTGTTGGCG GCATGCTCTTCTGGCCTACACCCTGGGTGTGAAACAGCTCATTGTTGGCG GCATGCTCTTCTGGCCTACACCCTGGGTGTGAAACAGCTCATTGTTGGCG GCATGCTCTTCTGGCCTACACCCTGGGTGTGAAACAGCTCATTGTTGGCG **************************************************
695 693 698 700
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
TTAACAAAATGGATTCCACTGAGCCACCCTACAGCCAGAAGAGATATGAA TTAACAAAATGGATTCCACTGAGCCACCCTACAGCCAGAAGAGATATGAA TTAACAAAATGGATTCCACTGAGCCACCCTACAGCCAGAAGAGATATGAA TTAACAAAATGGATTCCACTGAGCCACCCTACAGCCAGAAGAGATATGAA **************************************************
745 743 748 750
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
GAGATTGTAAAGGAAGTCAGCACCTACATTAAGAAAATTGGCTACAACCC GAGATTGTAAAGGAAGTCAGCACCTACATTAAGAAAATTGGCTACAACCC GAGATTGTAAAGGAAGTCAGCACCTACATTAAGAAAATTGGCTACAACCC GAGATTGTAAAGGAAGTCAGCACCTACATTAAGAAAATTGGCTACAA--***********************************************
795 793 798 797
eEF1A1_fr_2A2B_vz_T4 eEF1A1_fr_2A2B_vz_T9 eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108 eEF1A1_fr_2A2B_vz_M222
TGATA-- 800 TGA---- 796 TGATACA 805 -------
105
T4-235 bp T9-233 bp P108-237 bp M222-227 bp
Příloha 2: Srovnávání mRNA z námi získaného fragmentu genu EEF1A1 z plemene pietrain (označení P108) s mRNA dostupnou v NCBI databázi (NM_001097418.1) EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------GCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGGACACAGGTGTCGTGAAAGCCAT 50
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------CGCTAAAAGCTAAGCAAAAATGGGAAAGGAGAAGACTCACATCAACATCG 100
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-----------------------------------------GGCCATCTG 9 TCGTCATCGGACACGTCGATTCGGGCAAGTCCACCACTACTGGCCATCTG 150 *********
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
ATCTACAAATGCGGTGGGATCGACAAAAGAACCATCGAAAAGTTCGAAAA 59 ATCTACAAATGCGGTGGGATCGACAAAAGAACCATCGAAAAGTTCGAAAA 200 **************************************************
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
AGAGGCTGCGGAGATGGGAAAGGGCTCCTTCAAGTATGCCTGGGTCTTGG 109 AGAGGCTGCGGAGATGGGAAAGGGCTCCTTCAAGTATGCCTGGGTCTTGG 250 **************************************************
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
ACAAACTAAAGGCTGAACGTGAGCGTGGTATTACCATTGACATCTCCCTG 159 ACAAACTAAAGGCTGAACGTGAGCGTGGTATTACCATTGACATCTCCCTG 300 **************************************************
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
TGGAAATTCGAGACCAGCAAGTACTACGTGACCATCATTGATGCTCCAGG 209 TGGAAATTCGAGACCAGCAAGTACTACGTGACCATCATTGATGCTCCAGG 350 **************************************************
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
ACACAGAGACTTTATTAAGAACATGATTACAGGCACTTCCCAGGCTGACT 259 ACACAGAGACTTTATTAAGAACATGATTACAGGCACTTCCCAGGCTGACT 400 **************************************************
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
GTGCTGTCCTGATTGTTGCTGCTGGTGTTGGTGAATTCGAAGCAGGTATT 309 GTGCTGTCCTGATTGTTGCTGCTGGTGTTGGTGAATTCGAAGCAGGTATT 450 **************************************************
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
TCCAAGAACGGGCAGACCCGTGAGCATGCTCTTCTGGCCTACACCCTGGG 359 TCCAAGAACGGGCAGACCCGTGAGCATGCTCTTCTGGCCTACACCCTGGG 500 **************************************************
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
TGTGAAACAGCTCATTGTTGGCGTTAACAAAATGGATTCCACTGAGCCAC 409 TGTGAAACAGCTCATTGTTGGCGTTAACAAAATGGATTCCACTGAGCCAC 550 **************************************************
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
CCTACAGCCAGAAGAGATATGAAGAGATTGTAAAGGAAGTCAGCACCTAC 459 CCTACAGCCAGAAGAGATATGAAGAGATTGTAAAGGAAGTCAGCACCTAC 600 **************************************************
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1 EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
ATTAAGAAAATTGGCTACAACCCTGATACA-------------------- 489 ATTAAGAAAATTGGCTACAACCCTGATACAGTAGCATTTGTGCCAATTTC 650 ****************************** -------------------------------------------------TGGCTGGAATGGTGACAACATGCTGGAGCCAAGTGCTAATATGCCTTGGT 700
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------TCAAGGGATGGAAAGTCACCCGTAAAGATGGCAATGCCAGTGGAACCACA 750
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------CTGCTTGAAGCTCTGGATTGCATTCTACCACCAACTCGTCCAACTGACAA 800
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------GCCCTTGCGCCTGCCCCTCCAGGACGTCTACAAAATTGGTGGTATTGGTA 850
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------CAGTCCCTGTGGGCCGAGTGGAGACCGGTGTTCTCAAACCTGGCATGGTG 900
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------GTCACCTTTGCTCCAGTCAATGTTACAACTGAAGTCAAGTCTGTTGAAAT 950
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------GCACCATGAAGCTTTGAGTGAAGCCCTTCCTGGGGACAACGTGGGCTTTA 1000
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------ATGTCAAAAACGTGTCTGTCAAAGACGTTCGTCGTGGCAATGTGGCTGGT 1050
106
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------GACAGCAAAAATGACCCACCTATGGAAGCAGCTGGCTTTACAGCTCAGGT 1100
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------GATTATCCTGAACCATCCTGGCCAGATCAGTGCTGGTTACGCACCTGTGC 1150
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------TGGATTGCCACACAGCTCACATTGCCTGCAAGTTTGCTGAACTGAAGGAG 1200
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------AAGATTGATCGTCGTTCTGGGAAAAAGCTGGAAGATGGCCCCAAGTTCTT 1250
eEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------GAAATCTGGTGATGCTGCCATTGTCGATATGGTTCCTGGCAAGCCCATGT 1300
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------GTGTTGAGAGCTTCTCTGACTATCCTCCTCTGGGCCGATTTGCTGTTCGT 1350
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------GACATGAGACAGACAGTTGCTGTGGGTGTCATCAAAGCTGTGGACAAGAA 1400
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------GGCAGCTGGAGCTGGCAAGGTCACCAAGTCTGCTCAGAAAGCTCAGAAGG 1450
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------CTAAATGAATATTATCCCCAATACCTGCCACCCCAGTCTTAATCAGTGGT 1500
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------GGAAGAACGGTCTCAGAACTGTTTGTCTCAATTGGCCATTTAAGTTTAAT 1550
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------AGTAAAAGACTGGTTAATGATAACAATGCATCGTAAAACCTTCAGAAGGA 1600
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------AAGGAGAATGTTTTGTGGACCATTTGTTTTGTGTGTGGCAGTTTTTAAGT 1650
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------TATTAGTTTTTAAAATCAGTACTTTTTAATGGAAACAACTTGACCAAAAA 1700
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
-------------------------------------------------TCTGTCACAGAATTTTGAGACCCATTAAAAAAAGTTTAATGAGAAAAAAA 1750
EEF1A1_fr_2A2B_vz_P108_mRNA NM_001097418.1_mRNA_EEF1A1
--------------------------AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1777
107
Příloha 3: Sekvence genu EEF1A2 získaná z klonu PAC a umístění pouţitých primerů CCCCCGGGGCAGAAGCCTGGGGACACTGCTCCATTTGTAAATCAGGCTCCAAGCACGTGCACGGCCCAGT GCTGGCCCCAGGGATGCAGGCTGGGGGCCGCCCAGACTCCCCACCCGGCGAGTCTGGCCCGCTCCGCCCC TGCCCCCACCGGCTCGCATCCCTGCGCCCTTCTTCTATGACTGGGGGGTCTTTCTGCTTCTCTCCCCGCG CGGGAGTGTGCCCGAGCCTGCGGTCTCAGGCTGCGCTTTGTCCGTGCTCTGCCTCTGGCTGTGGGTCTCT CCCGCCGCCACTCTCCGTCTCTGCCCCTCCTCCCTTCTGCCTCCCTCTCGGGTCCCCTGCTCTCTGCAGC CGCCGCCTGTTTTTCTCTCCCCGCCCGGGCTCCCTCCGGGTGCGTCTCGGCTCCGCCTTTGTAGTTCGCT CCCTCGCCGCATCCTCCTCTCGCGTCCCTGTCGCGCCCGCGCGCGTCCGCGGGCTCGCGGTCCCTGTATC CCTGCATCCCTCGCCTCGCCGCCCCCGGCCCCGCCCGCGCGGGTACCGCATTGCCGTACTGCAGGGGCGC AGTGCATTGCGCCTGCTCCGTCAATAGGTGGACCCCCCTCCCGGAGAGATAAAACCGCCGGCGCCGGCGC CTCCAGTCCCTCTGGCTGAGACCTCGGCTCTGGGTAAGGACGCTGGGCCTCCGGGTCCCCGCCCCCAGCT TTCTGCAGGAGGGTCCCTTCCCCGGGGACCGGTCCTTAGGGACAGAGACCGGCCGGCCCGGTGCCTGGCA CAGCAGCGCTGCTCGCCGCGGAGATCGACCACCCGCCCCGCGCCCCGGGTCCCGGCACCGGGGGTCGGTC CCCTGAGAGGCCTGGGGTGGGGTGGGGGCACCCCGGTGGCGCTTGTTTATGCGGCGGCTGCGCACCTCCT GGGCGGCGGCGATCCGCGGCAGCCGTGACCTTGGGAAGGCTCGGGGGATCCCTGTGGGATTGGGGAAGGG TCCTCAGCGCGGGGGGCTGGGGGGCTGCTGAGGGTGGGCGCTGGGGGTGCCCTCCTTGACCATAGCAGGG TAGGGGGAGGCGGTGAGAAGAGACCCGAGGGGTCCTTGCCACCCTGCCCCCACCGGGGCTGCTGTGTCTA CCTGGGGCTGGCCCCCTAGGGTGCCCCTTTTTTGCCCGCTTTCCCTTCCCCAGCCACCTGTCCCCTCCTG GGCTGCCTAGGTTTCTCCTTTGACCTCCAGAATGGGCAGGGGCTGTGACCCTGTCAGCAGAGGAAAGGGG GAGGGGATGGCCCCCTGTCCCCACCAGGCTGAGGGCATCCCTGGCTGGCATCTGCTGAGCTTGGCTGCCG GGGCCAGATCCTCCCTCCTCAGGACAGAGCAGGGACCCCCACCCGCCTGCCCTACTGTCCACCCTGTCCC CATCCAGGGAGGGCCTGAGCTATTCTGGGGCCCTGATCTGGGCACCGCATCACCCAGCCTGAGCTCTGGC CCAGCCTGCTCCCTGGTGCCAGCCTGCCCGGCAGGGACGAGCCGAAGATGGCGTCGTCCTTGTTAGAGGG AGTGAAAAGCACTGACCGTCTCTCCGTGTGGCAGCTCTGGGGTGGGGGTGGGGTGAGAGAGGGGACAGTG TCCCAGCCCAGGACTCTGGGTCGGGGAGCAAGCACTGGGGACAGGGCACGGAGAGCCGAGCAGGGTGAGT CATCTCCTGACTGGTCATGGGGCTCACCCAGCCTGGGTGTCTCCATCTCTCCAGATGGGGGGGTGCCTTC TTTCACGGGCCACGGGGCGGGGGGGGGGGCTCTGTGGGCACCGCACAGACATTTACGGCTCTTGGACCGT GTGGGGCTGCCCCCCAGCTCTGCGGGGCAGGCACAGGCTGGGGAGGCTCCCGGGGGCCCCAGTACATGCG GAGCCCTGGCCCCGCCTCAGGACGCGCGCCCCGCCTGTGCAGGCGGTGTCTTTGCGGGGCTCCCCTCCCT CACGGGTGCCTCCCCCCCCCGCCTTGACCCACAGAGTCCCTGCTCAGCACCCCCCTTGCCCCAAGCCAGA GAGCCCCAGGTCGTGCCAGCCCCTCCCCACCGCCCGGGCACGATGGGCAAGGAGAAGACCCACATCAACA TTGTGGTCATCGGCCACGTGGACTCGGGCAAGTCCACCACCACCGGCCACCTCATCTACAAATGTGGGGG CATCGACAAGAGGACCATCGAGAAGTTTGAGAAGGAGGCGGCCGAGGTGAGCCCGGGGCCCCCCCTTTGC CTCCGCCGTGGGGATGGGCGCTCCTTGTGGCAGCCCGTCCGCTGCCTCCCAGAGCCTGGGTCACGGCGGC AGATGACCCCTGGGGCGGGGGGGGGGGTGCGGCCTAGAGGCCCCCGCGTGGGGGCTGTGCTCCTCGGAGC GTCCAGATGGGAGTGGCTGGGGGGTCTCGGGGGGCAGCTCCCTGGGGAGATGCTTGGAGGGGGGGATGGA CCTGCCCCTGGTGGGGGAGGGGCTGGAGGCGCATATCTGTCCCCCCTCTGCAGCGTGCCTGAGCCCCCAG GGTTGGGTTCCCGTGTCCCCAGGGCTGGAGTCTGGGGCTGGAGGTGGCACTGTCCTCGCTTGTCCCAGGG CTGGGCCAGGACTCAGGGTGGCTATTAATAGCTGATTGATGGGCACCCGGCCCATCAGCTCCATTTTCCA GTGCCCGGCTTGTTCAGGGTGGCACCCTGGGGGGAGGGTCTTGGGGGCCTGGCAAGGATGAGAGGGGCCC CACTGGCTGACCTCCCCTTTCTTGAAGCTGATCCTCTGGTGTCCGAGGCCCCGGGGAGGTCTGCTCTCTG TACCCCTCCCTCCGGCCCCAAGCTCTGGGAGGAGTCCCCTTCGGGGGCCGCTGTGAGGGCTTCCGCGGGG ATGACAGGCTGGGGCCAGGGCTGGGGAGGGGCGGTTGCTGGCCTGGGCTGAACCATGATTTTGCAGACAG TGGGGGTGCTCCTGGGCCCCAAAGCTGTGTCTCTCCTTCCCTGCGGGGCTGAGGGTGTTTGCAGGGTGTC ATGCAGGTCTGGCAGGGCCCTAGCTGGGCAGCCTCCCTGGAGGCTGAGCCCTTCCGGCGTGGCCCTGGCA GGGCAGTGACCGCAGCCCGGCCCTGGGCGTGGGGGTCTCGCTGGGCACAGGTGAGGGCCAAGGGCTGCCA GGCCGGCTTCCCCTGTGCAGGTGGGGCCGGGAGGGGAGGAGGAGCCTCAGAGCAGCCAGGGAGCTTCAGC CGCTGTAGAAAGAGCTGGAAGGCAGGGCCCTTTCTTGCTATCTCATCCGATTTCTTTCTCTCTTTTTACC TTAAAAAAACAAATCACAGAGGCGCTTTTTGTTTGGACAGCCTGAAACCCAGGGGTGTCATCGGCTGACC CCAGGATCTGGGTGCGGGGCAGGGGGAGCCGGCTTCGGATAAAGGGGAGCCCTCAGCCAGGGGAGGGCTG CAAACCGCCTGGCAGCTAGCTAGCTTCTCTCCAAGAGCGGCTCCCAGGCCCTTGCGCCCCCTGCTGGTGG GCGCTGGAGCGGCTCCCCTTTAGGCGGCAGGAGGCTGGCAGGGGGCAGGGCTTGGTTGAGGTCAGGGTGT CCCCCGTCCCAGAGTCGGGTCCGGGGTCCTAGGGCCGCGGCAGGAGCGAGGGGCCTCTCTGCTGCGACTC GCCGCTCCCGCAGCCCGGGGGGACCTGCTGGCCAGGCCAGCTGCGTTGGGTCCGTCCTGAGCCGCGCCCC CACCCCTCCAGATGGGGAAGGGCTCCTTCAAGTACGCCTGGGTGCTGGACAAGCTGAAGGCGGAGCGCGA GCGCGGCATCACCATCGACATCTCCCTCTGGAAGTTCGAGACCACCAAGTACTACATCACCATCATCGAC GCGCCGGGCCACCGCGACTTCATCAAGAACATGATCACCGGCACCTCCCAGGTGGGCGGGGCCTCGGGGC CTGGGGGCGGGGCGAGGGCGCCCATGGGGGGGGGGGGCGGAGCCCGCGAGCGAGCCGCAGCTGGGTCTCC TGTGCTTCCTGGCGAGGCCAGGGGACCCCTCACCTTTGTCGCCCCTCGCCCTCAAAGAACTGACCACGTC TCAGCCGGGCGAGGGCGCCTGTAAGGACAGCCCGCCAGCCAGGCCCCCTTCAAGGTCAGACACAGAGGCC AGGACGGGGGCCCTGGAATGGGGGCAGAAATGCCCCCAGACAATCCAGCGTGGCCAGGGCATCACCCAGA CAGACAGACAGACAGACAGACGCGGGCCCTCAGGGGGAGACCCCAGGTGCCAGACTCCCCAGAGGGGCCT GGGCGGGGTCTGCGGCTCACCCTGACGGCCTGCGGGGCAGGCGGACTGCGCAGTGCTGATCGTGGCGGCG GGAGTGGGCGAGTTCGAGGCGGGCATCTCTAAGAACGGGCAGACCCGCGAGCACGCGCTGCTGGCCTACA CGCTGGGCGTGAAGCAGCTGATCGTCGGCGTCAACAAGATGGACTCCACGGAGCCGGCCTACAGCGAGAA
108
EX 1: 231bp
EEF2 21B
IN 1: 1331 bp
EEF2 20B
EEF2 19B EEF2 27A
EX 2: 222bp EEF2 26A
Iniciační kodon IN 2: 1505 bp EEF2 18B
EEF2 16B
EEF2 22A EEF2 17B
EEF2 28A
EEF2 15B
EX 3: 180 bp IN 3: 409 bp EEF2 29A EEF2 14B
EX 4: 297 bp
GCGCTACGACGAGATCGTCAAGGAGGTCAGCGCCTACATCAAGAAGATCGGCTACAACCCGGCCACCGTG CCCTTCGTGCCCATCTCGGGCTGGCACGGCGACAACATGCTGGAGCCCTCCCCCAACGTGAGTGCCCAGC AGGGGCGGGGCTCCTCGGGCCCCTCCCAGAGGGCCCTGGGTCCGGCGGGCACAGACGGGTCTCCCCCCCC CCAGCCCTCCCAAGGTCCCGTGGTGTGGACACGTGCGGTGCCAGCCCCGGTGGGTGTCAGAGCCCGGTGG GACCCCCAGCCCCCTTCCGTTCAGAAGCCTCTGCATCCCCTCCTCTGGCCAGGGCCGCTCCCCGGGGCGG ACGTCAGAAGGCAGCCGCCGCTGCCGCCCGCCCCCCATCTCTGGACGCCCCGTGTGGTGGGGCTGGTTCT CACCTTCCCCAGGATCAGGGGCCAGAGGCTGGCTCTCTGCTGGTCAGCTGGGGAGCTGTGGCTCTGGCTG CGGGTGTCCTGAGGACTCGGACTGGGCAGGAGGTGATGAGGGGAGCCTGAGACCCAGCGCCTGGCAAGGG CGCCATAGGACAGCCGTTCTGGCCAGGCTGGGGGAGGCGGGCGTGGAGGGGGCCAAGGAGACCCAGGGAG ACTTAACCTGGAGCCCCGTGGTCGGGGTTCCTGGTCGGGCTGGGTCTCACGTGGGACAGGGCCACCGACG GGGGTCAGGGAGGCCAAGGCTGGGGGGTGGGGGAGGGGCGCTACAACAGGTGCCTTCTTCCTCCCGCCCA GATGCCCTGGTTCAAGGGCTGGAAAGTGGAGCGGAAGGAAGGGAATGCCAGTGGCGTGTCCCTGCTGGAG GCTCTGGACACCATCCTGCCCCCCACACGCCCCACAGACAAGCCCCTGCGCCTGCCGCTGCAGGACGTGT ACAAGATTGGCGGTGAGTGAAGCCTCTTCAGCTGCCCTCCCAGCCCAGCCGCCGGCTCTGCCCTCAGACC CCTCCTGAGAACCGGCTCTGGCGAGGAGCCTGGGGCAGGGTTATTTCTGCCTCTCCCCCGAGGCTGCACT CTTTCCAGGGGACCACCCACCCACCTGTCTTCATCCATTCATCTGTCTGTCTGTCCCTCTGTCCACTCCC ACCTGCCCATCGGGCTGTCCCGCAAGGGTCCTCCTTCCTCCAGCTCAGTGCCCAGCCCTATGCCAGCAGC GGGTGGCACAAGGGAGCCACACGTTGCCCTCGTTGCCCTCCCCCTGGAGGTCTGGGGCCTGTGGGAGACA TGATCCACTCCAGAAGGAGAACAGCCATTCATGAGATGGTACAGAACCTTGAGCAAGTATGAGGCCCAGG AGGGCAGCGGTGGGGGCTCGCGGCCAGCAGGCTGCGGCTGGAGATGTCAGGCCTGTGTGCAGACTGGGGG TCCACGCCCACCCGGCACAGAGAACGCCACCAGGCTCGGTAATGCCACACGAGCCGCTGTCACCGCCAGG GAGACCAGGAGGAGCCCCCTGCCGCCGCCCTAGGGGGCACCGTACCTCTTCAGGAATAGCCCCCGAGACG GCAGCACCAGTACTGGGCCGGGTCAATCCAGGGGGACCGGTTCATGCTGCTGCCTCGGAAGGAGAGGCCC CGGAGAGGGGAGGCGGTCCCTGGGGCAGGGGCGGGACCCCTCTTTCAGACGGCCCTCTCCTTGCCCGTTT GCCCCGTGTTATGGGCACTCTCTTCCCGAGTCCCTTCTCCCGGAGGGGCCGGGAAGCTCCCACTTCTGGC CGAATGTCTCGGCGTCTCCCTGTCCCCTCACCTCCTCCATGTGGCCACCCCTCCCCTGCCAGGGCGAAGG GCACCCCCCGCCAGGCCTGCCTTCTCAGCCTCCTTCCTCTCGACGCAGGCATTGGCACTGTGCCTGTGGG CCGAGTGGAGACGGGCATCCTCCGGCCGGGCATGGTGGTGACCTTCGCGCCCGTGAACATCACCACTGAG GTGAAGTCGGTGGAGATGCACCACGAGGCTCTGAGCGAGGCCCTGCCCGGGGACAACGTCGGCTTCAACG TGAAGAACGTGTCAGTCAAGGACATCCGTCGGGGCAACGTGTGTGGGGACAGCAAGTCCGACCCGCCCCA GGAGGCCGCCCAGTTCACTTCCCAGGTGCGCGGCCCGGGGGCCAGAGGGCCGTCTTCCCAGGCAGCGCAG GGCTGTCCTCGGCGAGGCGGCTGCCTGGTGCCAGGAAGGACTCGGATCCCCACGTTAGAGACGGGCCGTC GAGGCCGGGCGGAGGTGGAACCTCAGGAAGAGCCGACAGGGTGACCAGGCTGCCCAGCCTCAGGGGGTCC CACTTCGGTCCTGGAAATGCTGTAATCAGCTTATCGCCTGGGGCCCATCTGCAAGGCTCTCCTCTGTTTT CACTGCGCCTTCTTTGGTCATCTCTTTATTTATTTATTTATATTTATTTATTATTATTATTATTTTTTGT CTTTTTGCTATTTCTTTGGGCCGCTCCCGCAGCATATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGGTCGAATCGGAGCT GTAGCCACCGGCCTACGCCAGAGCCACAGCAACGCGGGATCCCAGCTGCATCTGCAACCTACACCACAGC TCACGGCAACGCCGGATCGCTAACCCACTGAGCAAGGGCAGGGACCGAACCCGCAACCTCATGGTTCCTA GTCGGATTGGTTAACCACTGCGCCACGACGGGAACTCCTGGTCATCTCTTTAACGTGACTACAAAGTTTG TCTGTTTTTCTTTCTCTCCTTCTAGGGCTTCACCCGTGGCATATGGAGATCCCCAGGCTAGAGGTCGACT CAGAGCTGCAGCTGCCGGCCTGCCCCACAGCCACAGCCCCACGGGACCCGAGCCTTGTCTGTGACCTACA CCACAGCTCATGGCAATGCCAGATCCTTAACCCACTGAGCAGGGCCAGGGATCAAACCCGCATCCTCGTG GATACTAGTTGGGTTCTTAACTCATTGAGCCACAGCGGGAACTCCACTACAGTGTTTAAAATTGGCTTTA CTGAGGTATGGTTGAAATACGACAGTCGGGCCCGGGTTTGTCTCCCTGCTCCTTCGGCTCTGGCCTCTGG CCCTTTCAAATGATGCTCTCGGTGTTTATCTTCTGTGGCTTTTCAGACCCTTGAAGACAACCAGCCTCGG GCTCTGTAGGTCTGGGGGCCTGGGCCCCCTGGAGCCTGACCGTTCTCCAGGGTCAGCACCCAGGGCCCCT GGGGTGGGCAGGGCCTCTTCCAGCCTGGTGCCCTCCTCTGGTGCCCACCCGGGGCAGGGCTGATGGCCTC TGCCACTCTGCCCGCAGGTCATCATTCTGAACCACCCGGGGCAGATCAGCGCCGGCTACTCACCGGTCAT TGACTGCCACACGGCCCACATCGCCTGCAAGTTTGCCGAGCTCAAGGAGAAGATTGACCGGCGCTCTGGC AAGAAGCTGGAGGACAACCCCAAGTCCCTGAAGTCTGGCGACGCGGCCATTGTAGAGATGGTCCCTGGGA AGCCCATGTGTGTGGAGAGCTTCTCCCAGTACCCGCCCCTCGGTGAGCCGGGAGGGGAGGTGGCGGGCCC AGGCCAAGGGCAGGAGACCCCTGGGTGGGGGGGGGGGGTGGATCCTGAACTTTGCTGCAGCACTGAGAAC TCAGTAGGAGACTCCCGGCCTTGGCCTTTGTCTCCCGGAGCACACGTGGCCCCACTAGGTGGGCCTGAAA TGGTGTCCCCTCTGCAAAGGAAGTCCCCTAAGGGAGTGGTCCAAGGCCCACAGCTAGTCTCGAGGCAGAG TCAGACTGACCTCCTGCCTCCAACTGGCCTCCCTCACAGATACCCTAGGATGACCCACAGACCTGTATTG GAGAGCTGCCTAATGCCAGGGTGGGGCCACCGTCAAAACAGCCGAGCGTGTTCTCGGCATGGTTCACAGG CCATTTACTTCTGGCAACTGTGCCTTGACGGAGTCCTATGTGCATCTAAGTAGATGGGAGCCCGTACTCC ACCCTGTCCCCGGAAACAGGCGCAGGGAACCCCGTCCCCACCGCGAGGGTCGCAGCCCCAGGGCCTGGGT TGGGGAGGATGCTGCGGGCGCGAGTGCGCCTGCGCGTGGCATCCGGGCCGGCTCTTCACGCCTCCTACCC GCAGGCCGCTTCGCCGTGCGCGACATGAGGCAGACGGTGGCCGTGGGCGTCATCAAGAACGTGGAGAAGA AGAGCGGCGGCGCCGGCAAGGTCACCAAGTCGGCGCAGAAGGCGCAGAAGGCGGGCAAGTGAAGCGCGGG CGCCCGCGGCGCGACCCTCCCCGGCGGCGCCGCGCCCCGCCCTCGGCCCCGCCCCCGGCCCCGCCCCCGG CGCGGCCCCAGGCGCCCCGCCCCCCCGCCAGGCGCATGTCTGTACCTCCGCTTGTAAGAGGCTCTCCGTC AGCGACTGGATGCTGGCCATCAAGGTCCAGTGGAAGTTCTTTAAGAGGAAAAGCGCCCCCGCCGCCCCGG CTTCCGCGTCCAGCCTTCGCCACGCTCAGTGTCCGTTTTACCAATAAACTGAGCGACCCCGGAACCGTGT GTGCGCCTGCTGCTGGGGGGTGGGCGGCCCGCCGTGCGGGAGGGCGCGCCTTCGTACCCCCCACCCGGCC CCCCACCAAGCTGCTAGCCCAGCGGCCCACTCGGCACCCACTGGCCCTGCGGCCGATCTGGCCAGGTGTC CACCTGCACTACCCAGGGTGGGCTGTGGGCCGCTGGGTCTGGAGTCCAGAGGGTGAGGGGACTTTGGGGT
109
EEF2 1A EEF2 12B
EX 5: 151 bp EEF2 2A EEF2 1B
IN 5: 946 bp EEF2 25B EEF2 9A
EEF2 9B
EX 6: 257 bp EEF2 3A EEF2 11A EEF2 2B EEF2 7A
IN 6: 1182 bp EEF2 11B SINE 1 EEF2 8A SINE 2 EEF2 8B
EEF2 23A
EX 7: 235 bp EEF2 7B EEF2 4A EEF2 3B
IN 7: 592 bp EEF2 5B
EEF2 12A
EX 8: 406 bp EEF2 10A EEF2 4B
terminační kodon
CCCCCTGTGGGGGGATCCAAGGCAAAGACTGGGTCACTGCGGAGCTGCAGAAGGGGATTGAAAGTTTGGG EEF2 15A GGTCTCTCTGAGAATGGGATGAGCCCAGAGCCCCTCCCCCGCGAGTGGCTCTCACACACACTGTGCTTCG CCCGGGTCTTCCGGCTCCCTGGCTCTTGGAAGCCCAGTCTTACTGCCCCCACCGCCACCCCCGAGCCGGT CACTGTGGCTGGAGGCTCCTCAGCGCGGTCCTTGGTACGGCAGGAACTGCAGCCCCAGAAACCCCAGAAC EEF2 22B AAGCCCTGACCTTGGTCAGCAAGCACCGGGGGGCTGGCAGGACCACGCCCTGCCCAGCCATGCCTGCGCC CAGAAAGCAGCGGCAGTGCGCGTGCGGGGGTCAGGGTGAGGATGAGCTGGTTCCGACGACGGACACAGCT GCCCACAGCAGGTCTGGGCTGGGGAGAGGAGCAGGCCAGCCACAGGGTCCCCTGGGATTGAGTCCCCTGG GGCTGCAGCAACAAATGGACTGCAAGCTGGCAGCTGAAAACCACATACACGAACCGTCTCAGTCCATACC ACTGGGACAGACTCCAGTGCAGGCAGGGTCTGCTCCCTCCAGAGGCTCCAGGGAGGGTCTGTCCTGTGCC TCTTGCGGCTTCTGGTGGCTGCCCAAGTTCCCTGGCTTGTGGCCACATTCCTGCAACCTCTGCCTCCACG GTCGCATGGGCTCATCTTCTCTGGG
110
Příloha 4: Polymorfismy nalezené při porovnání sekvence genu EEF1A2 u čtyř plemen prasat: české bílé ušlechtilé (označení T4), landrace (označení T9), pietrain (označení P108) a kříţenec plemen meishan a pietrain (označení M222) a klonu PAC P108 PAC M222 T9 T4
ATGGGCAAGGAGAAGACCCACATCAACATTGTGGTCATCGGCCACGTGGACTCGGGCAAG ATGGGCAAGGAGAAGACCCACATCAACATTGTGGTCATCGGCCACGTGGACTCGGGCAAG ATGGGCAAGGAGAAGACCCACATCAACATTGTGGTCATCGGCCACGTGGACTCGGGCAAG ATGGGCAAGGAGAAGACCCACATCAACATTGTGGTCATCGGCCACGTGGACTCGGGCAAG ATGGGCAAGGAGAAGACCCACATCAACATTGTGGTCATCGGCCACGTGGACTCGGGCAAG ************************************************************
60 60 60 60 60
P108 PAC M222 T9 T4
TCCACCACCACCGGCCACCTCATCTACAAATGTGGGGGCATCGACAAGAGGACCATCGAG TCCACCACCACCGGCCACCTCATCTACAAATGTGGGGGCATCGACAAGAGGACCATCGAG TCCACCACCACCGGCCACCTCATCTACAAATGTGGGGGCATCGACAAGAGGACCATCGAG TCCACCACCACCGGCCACCTCATCTACAAATGTGGGGGCATCGACAAGAGGACCATCGAG TCCACCACCACCGGCCACCTCATCTACAAATGTGGGGGCATCGACAAGAGGACCATCGAG ************************************************************
120 120 120 120 120
P108 PAC M222 T9 T4
AAGTTTGAGAAGGAGGCGGCCGAGGTGAGCCCGGGGCCCCCCCTTTGCCTCCGCCGTGGG AAGTTTGAGAAGGAGGCGGCCGAGGTGAGCCCGGGGCCCCCCCTTTGCCTCCGCCGTGGG AAGTTTGAGAAGGAGGCGGCCGAGGTGAGCCCGGGGCCCCCCCTTTGCCTCCGCCGTGGG AAGTTTGAGAAGGAGGCGGCCGAGGTGAGCCCGGGGCCCCACCTTTGCCTCCGCCGTGGG AAGTTTGAGAAGGAGGCGGCCGAGGTGAGCCCGGGGCCCCACCTTTGCCTCCGCCGTGGG ****************************************.*******************
180 180 180 180 180
pozice 161
P108 PAC M222 T9 T4
GATGGGCGCTCCTTGTGGCAGCCCGTCCGCTGCCTCCCAGAGCCTGGGTCACGGCGGCAG GATGGGCGCTCCTTGTGGCAGCCCGTCCGCTGCCTCCCAGAGCCTGGGTCACGGCGGCAG GATGGGCGCTCCTTGTGGCAGCCCGTCCGCTGCCTCCCAGAGCCTGGGTCGCGGCGGCAG GATGGGCGCTCCTTGTGGCAGCCCGTCCGCTGCCTCCCAGAGCCTGGGTCACGGCGGCAG GATGGGCGCTCCTTGTGGCAGCCCGTCCGCTGCCTCCCAGAGCCTGGGTCACGGCGGCAG **************************************************.*********
240 240 240 240 240
pozice 231
P108 PAC M222 T9 T4
ATGACCCCTGGGGCGGGGGGGGGGGTGCGGCCTAGAGGCCCCCGCGTGGGGGCTGTGCTC ATGACCCCTGGGGCGGGGGGGGGGGTGCGGCCTAGAGGCCCCCGCGTGGGGGCTGTGCTC ATGACCCCTGGGGCGGGGGGGGGGGTGCGGCCTAGAGGCCCCCGCGTGGGGGCTGTGCTC ATGACCCCTGGGGCGGGGGGGGGGGTGCGGCCTAGAGGCCCCCGCGTGGGGGCTGTGCTC ATGACCCCTGGGGCGGGGGGGGGGGTGCGGCCTAGAGGCCCCCGCGTGGGGGCTGTGCTC ************************************************************
300 300 300 300 300
P108 PAC M222 T9 T4
CTCGGAGCGTCCAGATGGGAGTGGCTGGGGGGTCTCGGGGGGCAGCTCCCTGGGGAGATG CTCGGAGCGTCCAGATGGGAGTGGCTGGGGGGTCTCGGGGGGCAGCTCCCTGGGGAGATG CTCGGAGCGTCCAGATGGGAGTGGCTGGGGGGTCTCGGGGGGCAGCTCCCTGGGGAGATG CTCGGAGCGTCCAGATGGGAGTGGCTGGGGGGTCTCGGGGGGCAGCTCCCTGGGGAGATG CTCGGAGCGTCCAGATGGGAGTGGCTGGGGGGTCTCGGGGGGCAGCTCCCTGGGGAGATG ************************************************************
360 360 360 360 360
P108 PAC M222 T9 T4
CTTGGAGGGGGGGATGGACCTGCCCCTGGTGGGGGAGGGGCTGGAGGCGCATATCTGTCC CTTGGAGGGGGGGATGGACCTGCCCCTGGTGGGGGAGGGGCTGGAGGCGCATATCTGTCC CTTGGAGGGGGGGATGGACCTGCCCCTGGTGGGGGAGGGGCTGGAGGCGCATATCTGTCC CTTGGAGGGGGGGATGGACCTGCCCCTGGTGGGGGAGGGGCTGGAGGCGCATATCTGTCC CTTGGAGGGGGGGATGGACCTGCCCCTGGTGGGGGAGGGGCTGGAGGCGCATATCTGTCC ************************************************************
420 420 420 420 420
P108 PAC M222 T9 T4
CCCCTCTGCAGCGTGCCTGAGCCCCCAGGGTTGGGTTCCCGTGTCCCCAGGGCTGGAGTC CCCCTCTGCAGCGTGCCTGAGCCCCCAGGGTTGGGTTCCCGTGTCCCCAGGGCTGGAGTC CCCCTCTGCAGCGTGCCTGAGCCCCCAGGGTTGGGTTCCCGTGTCCCCAGGGCTGGAGTC CCCCTCTGCAGCGTGCCTGAGCCCCCAGGGTTGGGTTCCCGTGTCCCCAGGGCTGGAGTC CCCCTCTGCAGCGTGCCTGAGCCCCCAGGGTTGGGTTCCCGTGTCCCCAGGGCTGGAGTC ************************************************************
480 480 480 480 480
P108 PAC M222 T9 T4
TGGGGCTGGAGGTGGCACTGTCCTCGCTTGTCCCAGGGCTGGGCCAGGACTCAGGGTGGC TGGGGCTGGAGGTGGCACTGTCCTCGCTTGTCCCAGGGCTGGGCCAGGACTCAGGGTGGC TGGGGCTGGAGGTGGCACTGTCCTCGCTTGTCCCAGGGCTGGGCCAGGACTCAGGGTGGC TGGGGCTGGAGGTGGCACTGTCCTCGCTTGTCCCAGGGCTGGGCCAGGACTCAGGGTGGC TGGGGCTGGAGGTGGCACTGTCCTCGCTTGTCCCAGGGCTGGGCCAGGACTCAGGGTGGC ************************************************************
540 540 540 540 540
P108 PAC M222 T9 T4
TATTAATAGCTGATTGATGGGCACCCGGCCCATCAGCTCCATTTTCCAGTGCCCGGCTTG TATTAATAGCTGATTGATGGGCACCCGGCCCATCAGCTCCATTTTCCAGTGCCCGGCTTG TATTAATAGCTGATTGATGGGCACCCGGCCCATCAGCTCCATTTTCCAGTGCCCGGCTTG TATTAATAGCTGATTGATGGGCACCCGGCCCATCAGCTCCATTTTCCAGTGCCCGGCTTG TATTAATAGCTGATTGATGGGCACCCGGCCCATCAGCTCCATTTTCCAGTGCCCGGCTTG ************************************************************
600 600 600 600 600
111
P – C/C M×P – C/A L – C/A ČBU – C/A
P – A/A M×P – A/G L – A/G ČBU – G/G
P108 PAC M222 T9 T4
TTCAGGGTGGCACCCTGGGGGGAGGGTCTTGGGGGCCTGGCAAGGATGAGAGGGGCCCCA TTCAGGGTGGCACCCTGGGGGGAGGGTCTTGGGGGCCTGGCAAGGATGAGAGGGGCCCCA TTCAGGGTGGCACCCTGGGGGGAGGGTCTTGGGGGCCTGGCAAGGATGAGAGGGGCCCCA TTCAGGGTGGCACCCTGGGGGGAGGGTCTTGGGGGCCTGGCAAGGATGAGAGGGGCCCCA TTCAGGGTGGCACCCTGGGGGGAGGGTCTTGGGGGCCTGGCAAGGATGAGAGGGGCCCCA ************************************************************
660 660 660 660 660
P108 PAC M222 T9 T4
CTGGCTGACCTCCCCTTTCTTGAAGCTGATCCTCTGGTGTCCGAGGCCCCGGGGAGGTCT CTGGCTGACCTCCCCTTTCTTGAAGCTGATCCTCTGGTGTCCGAGGCCCCGGGGAGGTCT CTGGCTGACCTCCCCTTTCTTGAAGCTGATCCTCTGGTGTCCGAGGCCCCGGGGAGGTCT CTGGCTGACCTCCCCTTTCTTGAAGCTGATCCTCTGGTGTCCGAGGCCCCGGGGAGGTCT CTGGCTGACCTCCCCTTTCTTGAAGCTGATCCTCTGGTGTCCGAGGCCCCGGGGAGGTCT ************************************************************
720 720 720 720 720
P108 PAC M222 T9 T4
GCTCTCTGTACCCCTCCCTCCGGCCCCAAGCTCTGGGAGGAGTCCCCTTCGGGGGCCGCT GCTCTCTGTACCCCTCCCTCCGGCCCCAAGCTCTGGGAGGAGTCCCCTTCGGGGGCCGCT GCTCTCTGTACCCCTCCCTCCGGCCCCAAGCTCTGGGAGGAGTCCCCTTCGGGGGCCGCT GCTCTCTGTACCCCTCCCTCCGGCCCCAAGCTCTGGGAGGAGTCCCCTTCGGGGGCCGCT GCTCTCTGTACCCCTCCCTCCGGCCCCAAGCTCTGGGAGGAGTCCCCTTCGGGGGCCGCT ************************************************************
780 780 780 780 780
P108 PAC M222 T9 T4
GTGAGGGCTTCCGCGGGGATGACAGGCTGGGGCCAGGGCTGGGGAGGGGCGGTTGCTGGC GTGAGGGCTTCCGCGGGGATGACAGGCTGGGGCCAGGGCTGGGGAGGGGCGGTTGCTGGC GTGAGGGCTTCCGCGGGGATGACAGGCTGGGGCCAGGGCTGGGGAGGGGCGGTTGCTGGC GTGAGGGCTTCCGCGGGGATGACAGGCTGGGGCCAGGGCTGGGGAGGGGCGGTTGCTGGC GTGAGGGCTTCCGCGGGGATGACAGGCTGGGGCCAGGGCTGGGGAGGGGCGGTTGCTGGC ************************************************************
840 840 840 840 840
P108 PAC M222 T9 T4
CTGGGCTGAACCATGATTTTGCAGACAGTGGGGGTGCTCCTGGGCCCCAAAGCTGTGTCT CTGGGCTGAACCATGATTTTGCAGACAGTGGGGGTGCTCCTGGGCCCCAAAGCTGTGTCT CTGGGCTGAACCATGATTTTGCAGACAGTGGGGGTGCTCCTGGGCCCCAAAGCTGTGTCT CTGGGCTGAACCATGATTTTGCAGACAGTGGGGGTGCTCCTGGGCCCCAAAGCTGTGTCT CTGGGCTGAACCATGATTTTGCAGACAGTGGGGGTGCTCCTGGGCCCCAAAGCTGTGTCT ************************************************************
900 900 900 900 900
P108 PAC M222 T9 T4
CTCCTTCCCTGCGGGGCTGAGGGTGTTTGCAGGGTGTCATGCAGGTCTGGCAGGGCCCTA CTCCTTCCCTGCGGGGCTGAGGGTGTTTGCAGGGTGTCATGCAGGTCTGGCAGGGCCCTA CTCCTTCCCTGCGGGGCTGAGGGTGTTTGCAGGGTGTCATGCAGGTCTGGCAGGGCCCTA CTCCTTCCCTGCGGGGCTGAGGGTGTTTGCAGGGTGTCATGCAGGTCTGGCAGGGCCCTA CTCCTTCCCTGCGGGGCTGAGGGTGTTTGCAGGGTGTCATGCAGGTCTGGCAGGGCCCTA ************************************************************
960 960 960 960 960
P108 PAC M222 T9 T4
GCTGGGCAGCCTCCCTGGAGGCTGAGCCCTTCCGGCGTGGCCCTGGCAGGGCAGTGACCG GCTGGGCAGCCTCCCTGGAGGCTGAGCCCTTCCGGCGTGGCCCTGGCAGGGCAGTGACCG GCTGGGCAGCCTCCCTGGAGGCTGAGCCCTTCCGGCGTGGCCCTGGCAGGGCAGTGACCG GCTGGGCAGCCTCCCTGGAGGCTGAGCCCTTCCGGCGTGGCCCTGGCAGGGCAGTGACCG GCTGGGCAGCCTCCCTGGAGGCTGAGCCCTTCCGGCCTGGCCCTGGCAGGGCAGTGACCG ************************************ ***********************
1020 1020 1020 1020 1020
P108 PAC M222 T9 T4
CAGCCCGGCCCTGGGCGTGGGGGTCTCGCTGGGCACAGGTGAGGGCCAAGGGCTGCCAGG CAGCCCGGCCCTGGGCGTGGGGGTCTCGCTGGGCACAGGTGAGGGCCAAGGGCTGCCAGG CAGCCCGGCCCTGGGCGTGGGGGTCTCGCTGGGCACAGGTGAGGGCCAAGGGCTGCCAGG CAGCCCGGCCCTGGGCGTGGGGGTCTCGCTGGGCACAGGTGAGGGCCAAGGGCTGCCAGG CAGCCCGGCCCTGGGCGTGGGGGTCTCGCTGGGCACAGGTGAGGGCCAAGGGCTGCCAGG ************************************************************
1080 1080 1080 1080 1080
P108 PAC M222 T9 T4
CCGGCTTCCCCTGTGCAGGTGGGGCCGGGAGGGGAGGAGGAGCCTCAGAGCAGCCAGGGA CCGGCTTCCCCTGTGCAGGTGGGGCCGGGAGGGGAGGAGGAGCCTCAGAGCAGCCAGGGA CCGGCTTCCCCTGTGCAGGTGGGGCCGGGAGGGGAGGAGGAGCCTCAGAGCAGCCAGGGA CCGGCTTCCCCTGTGCAGGTGGGGCCGGGAGGGGAGGAGGAGCCTCAGAGCAGCCAGGGA CCGGCTTCCCCTGTGCAGGTGGGGCCGGGAGGGGAGGAGGAGCCTCAGAGCAGCCAGGGA ************************************************************
1140 1140 1140 1140 1140
P108 PAC M222 T9 T4
GCTTCAGCCGCTGTAGAAAGAGCTGGAAGGCAGGGCCCTTTCTTGCTATCTCATCCGATT GCTTCAGCCGCTGTAGAAAGAGCTGGAAGGCAGGGCCCTTTCTTGCTATCTCATCCGATT GCTTCAGCCGCTGTAGAAAGAGCTGGAAGGCAGGGCCCTTTCTTGCTATCTCATCCGATT GCTTCAGCCGCTGTAGAAAGAGCTGGAAGGCAGGGCCCTTTCTTGCTATCTCATCCGATT GCTTCAGCCGCTGTAGAAAGAGCTGGAAGGCAGGGCCCTTTCTTGCTATCTCATCCGATT ************************************************************
1200 1200 1200 1200 1200
P108 PAC M222 T9 T4
TCTTTCTCTCTTTTTACCTTAAAAAAACAAATCACAGAGGCGCTTTTTGTTTGGACAGCC TCTTTCTCTCTTTTTACCTTAAAAAAACAAATCACAGAGGCGCTTTTTGTTTGGACAGCC TCTTTCTCTCTTTTTACCTTAAAAAAACAAATCACAGAGGCGCCTTTTGTTTGGACAGCC TCTTTCTCTCTTTTTACCTTAAAAAAACAAATCACAGAGGCGCTTTTTGTTTGGACAGCC TCTTTCTCTCTTTTTACCTTAAAAAAACAAATCACAGAGGCGCTTTTTGTTTGGACAGCC ******************************************* ****************
1260 1260 1260 1260 1260
112
pozice 997 P – G/G M×P – C/G L – G/G ČBU – C/G
pozice 1244 P – T/T M×P – C/T L – T/T ČBU – C/T
P108 PAC M222 T9 T4
TGAAACCCAGGGGTGTCATCGGCTGACCCCAGGATCTGGGTGCGGGGCAGGGGGAGCCGG TGAAACCCAGGGGTGTCATCGGCTGACCCCAGGATCTGGGTGCGGGGCAGGGGGAGCCGG TGAAACCCAGGGGTGTCATCGGCTGACCCCAGGATCTGGGTGCGGGGCAGGGGGAGCCGG TGAAACCCAGGGGTGTCATCGGCTGACCCCAGGATCTGGGTGCGGGGCAGGGGGAGCCGG TGAAACCCAGGGGTGTCATCGGCTGACCCCAGGATCTGGGTGCGGGGCAGGGGGAGCCGG ************************************************************
1320 1320 1320 1320 1320
P108 PAC M222 T9 T4
CTTCGGATAAAGGGGAGCCCTCAGCCAGGGGAGGGCTGCAAACCGCCTGGCAGCTAGCTA CTTCGGATAAAGGGGAGCCCTCAGCCAGGGGAGGGCTGCAAACCGCCTGGCAGCTAGCTA CTTCGGATAAAGGGGAGCCCTCAGCCAGGGGAGGGCTGCAAACCGCCTGGCAGCTAGCTA CTTCGGATAAAGGGGAGCCCTCAGCCAGGGGAGGGCTGCAAACCGCCTGGCAGCTAGCTA CTTCGGATAAAGGGGAGCCCTCAGCCAGGGGAGGGCTGCAAACCGCCTGGCAGCTAGCTA ************************************************************
1380 1380 1380 1380 1380
P108 PAC M222 T9 T4
GCTTCTCTCCAAGAGCGGCTCCCAGGCCCTTGCGCCCCCTGCTGGTGGGCGCTGGAGCGG GCTTCTCTCCAAGAGCGGCTCCCAGGCCCTTGCGCCCCCTGCTGGTGGGCGCTGGAGCGG GCTTCTCTCCAAGAGCGGCTCCCAGGCCCTTGCGCCCCCTGCTGGTGGGCGCTGGAGCGG GCTTCTCTCCAAGAGCGGCTCCCAGGCCCTTGCGCCCCCTGCTGGTGGGCGCTGGAGCGG GCTTCTCTCCAAGAGCGGCTCCCAGGCCCTTGCGCCCCCTGCTGGTGGGCGCTGGAGCGG ************************************************************
1440 1440 1440 1440 1440
P108 PAC M222 T9 T4
CTCCCCTTTAGGCGGCAGGAGGCTGGCAGGGGGCAGGGCTTGGTTGAGGTCAGGGTGTCC CTCCCCTTTAGGCGGCAGGAGGCTGGCAGGGGGCAGGGCTTGGTTGAGGTCAGGGTGTCC CTCCCCTTTAGGCGGCAGGAGGCTGGCAGGGGGCAGGGCTTGGTTGAGGTCAGGGTGTCC CTCCCCTTTAGGCGGCAGGAGGCTGGCAGGGGGCAGGGCTTGGTTGAGGTCAGGGTGTCC CTCCCCTTTAGGCGGCAGGAGGCTGGCAGGGGGCAGGGCTTGGTTGAGGTCAGGGTGTCC ************************************************************
1500 1500 1500 1500 1500
P108 PAC M222 T9 T4
CCCGTCCCAGAGTCGGGTCCGGGGTCCTAGGGCCGCGGCAGGAGCGAGGGGCCTCTCTGC CCCGTCCCAGAGTCGGGTCCGGGGTCCTAGGGCCGCGGCAGGAGCGAGGGGCCTCTCTGC CCCGTCCCAGAGTCGGGTCCGGGGTCCTAGGGCCGCGGCAGGAGCGAGGGGCCTCTCTGC CCCGTCCCAGAGTCGGGTCCGGGGTCCTAGGGCCGCGGCAGGAGCGAGGGGCCTCTCTGC CCCGTCCCAGAGTCGGGTCCGGGGTCCTAGGGCCGCGGCAGGAGCGAGGGGCCTCTCTGC ************************************************************
1560 1560 1560 1560 1560
P108 PAC M222 T9 T4
TGCGACTCGCCGCTCCCGCAGCCCGGGGGGACCTGCTGGCCAGGCCAGCTGCGTTGGGTC TGCGACTCGCCGCTCCCGCAGCCCGGGGGGACCTGCTGGCCAGGCCAGCTGCGTTGGGTC TGCGACTCGCCGCTCCCGCAGCCCGGGGGGACCTGCTGGCCAGGCCAGCTGCGTTGGGTC TGCGACTCGCCGCTCCCGCAGCCCGGGGGGACCTGCTGGCCAGGCCAGCTGCGTTGGGTC TGCGACTCGCCGCTCCCGCAGCCCGGGGGGACCTGCTGGCCAGGCCAGCTGCGTTGGGTC ************************************************************
1620 1620 1620 1620 1620
P108 PAC M222 T9 T4
CGTCCTGAGCCGCGCCCCCACCCCTCCAGATGGGGAAGGGCTCCTTCAAGTACGCCTGGG CGTCCTGAGCCGCGCCCCCACCCCTCCAGATGGGGAAGGGCTCCTTCAAGTACGCCTGGG CGTCCTGAGCCGCGCCCCCACCCCTCCAGATGGGGAAGGGCTCCTTCAAGTACGCCTGGG CGTCCTGAGCCGCGCCCCCACCCCTCCAGATGGGGAAGGGCTCCTTCAAGTACGCCTGGG CGTCCTGAGCCGCGCCCCCACCCCTCCAGATGGGGAAGGGCTCCTTCAAGTACGCCTGGG ************************************************************
1680 1680 1680 1680 1680
P108 PAC M222 T9 T4
TGCTGGACAAGCTGAAGGCGGAGCGCGAGCGCGGCATCACCATCGACATCTCCCTCTGGA TGCTGGACAAGCTGAAGGCGGAGCGCGAGCGCGGCATCACCATCGACATCTCCCTCTGGA TGCTGGACAAGCTGAAGGCGGAGCGCGAGCGCGGCATCACCATCGACATCTCCCTCTGGA TGCTGGACAAGCTGAAGGCGGAGCGCGAGCGCGGCATCACCATCGACATCTCCCTCTGGA TGCTGGACAAGCTGAAGGCGGAGCGCGAGCGCGGCATCACCATCGACATCTCCCTCTGGA ************************************************************
1740 1740 1740 1740 1740
P108 PAC M222 T9 T4
AGTTCGAGACCACCAAGTACTACATCACCATCATCGACGCGCCGGGCCACCGCGACTTCA AGTTCGAGACCACCAAGTACTACATCACCATCATCGACGCGCCGGGCCACCGCGACTTCA AGTTCGAGACCACCAAGTACTACATCACCATCATCGACGCGCCGGGCCACCGCGACTTCA AGTTCGAGACCACCAAGTACTACATCACCATCATCGACGCGCCGGGCCACCGCGACTTCA AGTTCGAGACCACCAAGTACTACATCACCATCATCGACGCGCCGGGCCACCGCGACTTCA ************************************************************
1800 1800 1800 1800 1800
P108 PAC M222 T9 T4
TCAAGAACATGATCACCGGCACCTCCCAGGTGGGCGGGGCCTCGGGGCCTGGGGGCGGGG TCAAGAACATGATCACCGGCACCTCCCAGGTGGGCGGGGCCTCGGGGCCTGGGGGCGGGG TCAAGAACATGATCACCGGCACCTCCCAGGTGGGCGGGGCCTCGGGGCCTGGGGGCGGGG TCAAGAACATGATCACCGGCACCTCCCAGGTGGGCGGGGCCTCGGGGCCTGGGGGCGGGG TCAAGAACATGATCACCGGCACCTCCCAGGTGGGCGGGGCCTCGGGGCCTGGGGGCGGGG ************************************************************
1860 1860 1860 1860 1860
P108 PAC M222 T9 T4
CGAGGGCGCCCATGGGGGGGGGGGGCGGAGCCCGCGAGCGAGCCGCAGCTGGGTCTCCTG CGAGGGCGCCCATGGGGGGGGGGGGCGGAGCCCGCGAGCGAGCCGCAGCTGGGTCTCCTG CGAGGGCGCCCATGGGGGGGGGGGGCGGAGCCCGCGAGCGAGCCGCAGCTGGGTCTCCTG CGAGGGCGCCCATGGGGGGGGGGGGCGGAGCCCGCGAGCGAGCCGCAGCTGGGTCTCCTG CGAGGGCGCCCATGGGGGGGGGGGGCGGAGCCCGCGAGCGAGCCGCAGCTGGGTCTCCTG ************************************************************
1920 1920 1920 1920 1920
113
P108 PAC M222 T9 T4
TGCTTCCTGGCGAGGCCAGGGGACCCCTCACCTTTGTCGCCCCTCGCCCTCAAAGAACTG TGCTTCCTGGCGAGGCCAGGGGACCCCTCACCTTTGTCGCCCCTCGCCCTCAAAGAACTG TGCTTCCTGGCGAGGCCAGGGGACCCCTCACCTTTGTCGCCCCTCGCCCTCAAAGAACTG TGCTTCCTGGCGAGGCCAGGGGACCCCTCACCTTTGTCGCCCCTCGCCCTCAAAGAACTG TGCTTCCTGGCGAGGCCAGGGGACCCCTCACCTTTGTCGCCCCTCGCCCTCAAAGAACTG ************************************************************
1980 1980 1980 1980 1980
P108 PAC M222 T9 T4
ACCACGTCTCAGCCGGGCGAGGGCGCCTGTAAGGACAGCCCGCCAGCCAGGCCCCCTTCA ACCACGTCTCAGCCGGGCGAGGGCGCCTGTAAGGACAGCCCGCCAGCCAGGCCCCCTTCA ACCACGTCTCAGCCGGGCGAGGGCGCCTGTAAGGACAGCCCGCCAGCCAGGCCCCCTTCA ACCACGTCTCAGCCGGGCGAGGGCGCCTGTAAGGACAGCCCGCCAGCCAGGCCCCCTTCA ACCACGTCTCAGCCGGGCGAGGGCGCCTGTAAGGACAGCCCGCCAGCCAGGCCCCCTTCA ************************************************************
2040 2040 2040 2040 2040
P108 PAC M222 T9 T4
AGGTCAGACACAGAGGCCAGGACGGGGGCCCTGGAATGGGGGCAGAAATGCCCCCAGACA AGGTCAGACACAGAGGCCAGGACGGGGGCCCTGGAATGGGGGCAGAAATGCCCCCAGACA AGGTCAGACACAGAGGCCAGGACGGGGGCCCTGGAATGGGGGCAGAAATGCCCCCAGACA AGGTCAGACACAGAGGCCAGGACGGGGGCCCTGGAATGGGGGCAGAAATGCCCCCAGACA AGGTCAGACACAGAGGCCAGGACGGGGGCCCTGGAATGGGGGCAGAAATGCCCCCAGACA ************************************************************
2100 2100 2100 2100 2100
P108 PAC M222 T9 T4
ATCCAGCGTGGCCAGGGCATCACCCAGACAGACAGACAGACAGACAGACGCGGGCCCTCA ATCCAGCGTGGCCAGGGCATCACCCAGACAGACAGACAGACAGACAGACGCGGGCCCTCA ATCCAGCGTGGCCAGGGCATCACCCAGACAGACAGACAGACAGACAGACGCGGGCCCTCA ATCCAGCGTGGCCAGGGCATCACCCAGACAGACAGACAGACAGACAGACGCGGGCCCTCA ATCCAGCGTGGCCAGGGCATCACCCAGACAGACAGACAGACAGACAGACGCGGGCCCTCA ************************************************************
2160 2160 2160 2160 2160
P108 PAC M222 T9 T4
GGGGGAGACCCCAGGTGCCAGACTCCCCAGAGGGGCCTGGGCGGGGTCTGCGGCTCACCC GGGGGAGACCCCAGGTGCCAGACTCCCCAGAGGGGCCTGGGCGGGGTCTGCGGCTCACCC GGGGGAGACCCCAGGTGCCAGACTCCCCAGAGGGGCCTGGGCGGGGTCTGCGGCTCACCC GGGGGAGACCCCAGGTGCCAGACTCCCCAGAGGGGCCTGGGCGGGGTCTGCGGCTCACCC GGGGGAGACCCCAGGTGCCAGACTCCCCAGAGGGGCCTGGGCGGGGTCTGCGGCTCACCC ************************************************************
2220 2220 2220 2220 2220
P108 PAC M222 T9 T4
TGACGGCCTGCGGGGCAGGCGGACTGCGCAGTGCTGATCGTGGCGGCGGGAGTGGGCGAG TGACGGCCTGCGGGGCAGGCGGACTGCGCAGTGCTGATCGTGGCGGCGGGAGTGGGCGAG TGACGGCCTGCGGGGCAGGCGGACTGCGCAGTGCTGATCGTGGCGGCGGGAGTGGGCGAG TGACGGCCTGCGGGGCAGGCGGACTGCGCAGTGCTGATCGTGGCGGCGGGAGTGGGCGAG TGACGGCCTGCGGGGCAGGCGGACTGCGCAGTGCTGATCGTGGCGGCGGGAGTGGGCGAG ************************************************************
2280 2280 2280 2280 2280
P108 PAC M222 T9 T4
TTCGAGGCGGGCATCTCTAAGAACGGGCAGACCCGCGAGCACGCGCTGCTGGCCTACACG TTCGAGGCGGGCATCTCTAAGAACGGGCAGACCCGCGAGCACGCGCTGCTGGCCTACACG TTCGAGGCGGGCATCTCTAAGAACGGGCAGACCCGCGAGCACGCGCTGCTGGCCTACACG TTCGAGGCGGGCATCTCTAAGAACGGGCAGACCCGCGAGCACGCGCTGCTGGCCTACACG TTCGAGGCGGGCATCTCTAAGAACGGGCAGACCCGCGAGCACGCGCTGCTGGCCTACACG ************************************************************
2340 2340 2340 2340 2340
P108 PAC M222 T9 T4
CTGGGCGTGAAGCAGCTGATCGTCGGCGTCAACAAGATGGACTCCACGGAGCCGGCCTAC CTGGGCGTGAAGCAGCTGATCGTCGGCGTCAACAAGATGGACTCCACGGAGCCGGCCTAC CTGGGCGTGAAGCAGCTGATCGTCGGCGTCAACAAGATGGACTCCACGGAGCCGGCCTAC CTGGGCGTGAAGCAGCTGATCGTCGGCGTCAACAAGATGGACTCCACGGAGCCGGCCTAC CTGGGCGTGAAGCAGCTGATCGTCGGCGTCAACAAGATGGACTCCACGGAGCCGGCCTAC ************************************************************
2400 2400 2400 2400 2400
P108 PAC M222 T9 T4
AGCGAGAAGCGCTACGACGAGATCGTCAAGGAGGTCAGCGCCTACATCAAGAAGATCGGC AGCGAGAAGCGCTACGACGAGATCGTCAAGGAGGTCAGCGCCTACATCAAGAAGATCGGC AGCGAGAAGCGCTACGACGAGATCGTCAAGGAGGTCAGCGCCTACATCAAGAAGATCGGC AGCGAGAAGCGCTACGACGAGATCGTCAAGGAGGTCAGCGCCTACATCAAGAAGATCGGC AGCGAGAAGCGCTACGACGAGATCGTCAAGGAGGTCAGCGCCTACATCAAGAAGATCGGC ************************************************************
2460 2460 2460 2460 2460
P108 PAC M222 T9 T4
TACAACCCGGCCACCGTGCCCTTCGTGCCCATCTCGGGCTGGCACGGCGACAACATGCTG TACAACCCGGCCACCGTGCCCTTCGTGCCCATCTCGGGCTGGCACGGCGACAACATGCTG TACAACCCGGCCACCGTGCCCTTCGTGCCCATCTCGGGCTGGCACGGCGACAACATGCTG TACAACCCGGCCACCGTGCCCTTCGTGCCCATCTCGGGCTGGCACGGCGACAACATGCTG TACAACCCGGCCACCGTGCCCTTCGTGCCCATCTCGGGCTGGCACGGCGACAACATGCTG ************************************************************
2520 2520 2520 2520 2520
P108 PAC M222 T9 T4
GAGCCCTCCCCCAACGTGAGTGCCCAGCAGGGGCGGGGCTCCTCGGGCCCCTCCCAGAGG GAGCCCTCCCCCAACGTGAGTGCCCAGCAGGGGCGGGGCTCCTCGGGCCCCTCCCAGAGG GAGCCCTCCCCCAACGTGAGTGCCCAGCAGGGGCGGGGCTCCTCGGGCCCCTCCCAGAGG GAGCCCTCCCCCAACGTGAGTGCCCAGCAGGGGCGGGGCTCCTCGGGCCCCTCCCAGAGG GAGCCCTCCCCCAACGTGAGTGCCCAGCAGGGGCGGGGCTCCTCGGGCCCCTCCCAGAGG ************************************************************
2580 2580 2580 2580 2580
114
P108 PAC M222 T9 T4
GCCCTGGGTCCGGCGGGCACAGACGGGTCTCCCCCCCCCCAGCCCTCCCAAGGTCCCGTG GCCCTGGGTCCGGCGGGCACAGACGGGTCTCCCCCCCCCCAGCCCTCCCAAGGTCCCGTG GCCCTGGGTCCGGCGGGCACAGACGGGTCTCCCCCCCCCCAGCCCTCCCAAGGTCCCGTG GCCCTGGGTCCGGCGGGCACAGACGGGTCTCCCCCCCCCCAGCCCTCCCAAGGTCCCGTG GCCCTGGGTCCGGCGGGCACAGACGGGTCTCCCCCCCCCCAGCCCTCCCAAGGTCCCGTG ************************************************************
2640 2640 2640 2640 2640
P108 PAC M222 T9 T4
GTGTGGACACGTGCGGTGCCAGCCCCGGTGGGTGTCAGAGCCCGGTGGGACCCCCAGCCC GTGTGGACACGTGCGGTGCCAGCCCCGGTGGGTGTCAGAGCCCGGTGGGACCCCCAGCCC GTGTGGACACGTGCGGTGCCAGCCCCGGTGGGTGTCAGAGCCCGGTGGGACCCCCAGCCC GTGTGGACACGTGCGGTGCCAGCCCCGGTGGGTGTCAGAGCCCGGTGGGACCCCCAGCCC GTGTGGACACGTGCGGTGCCAGCCCCGGTGGGTGTCAGAGCCCGGTGGGACCCCCAGCCC ************************************************************
2700 2700 2700 2700 2700
P108 PAC M222 T9 T4
CCTTCCGTTCAGAAGCCTCTGCATCCCCTCCTCTGGCCAGGGCCGCTCCCCGGGGCGGAC CCTTCCGTTCAGAAGCCTCTGCATCCCCTCCTCTGGCCAGGGCCGCTCCCCGGGGCGGAC CCTTCCGTTCAGAAGCCTCTGCATCCCCTCCTCTGGCCAGGGCCGCTCCCCGGGGCGGAC CCTTCCGTTCAGAAGCCTCTGCATCCCCTCCTCTGGCCAGGGCCGCTCCCCGGGGCGGAC CCTTCCGTTCAGAAGCCTCTGCATCCCCTCCTCTGGCCAGGGCCGCTCCCCGGGGCGGAC ************************************************************
2760 2760 2760 2760 2760
P108 PAC M222 T9 T4
GTCAGAAGGCAGCCGCCGCTGCCGCCCGCCCCCCATCTCTGGACGCCCCGTGTGGTGGGG GTCAGAAGGCAGCCGCCGCTGCCGCCCGCCCCCCATCTCTGGACGCCCCGTGTGGTGGGG GTCAGAAGGCAGCCGCCGCTGCCGCCCGCCCCCCATCTCTGGACGCCCCGTGTGGTGGGG GTCAGAAGGCAGCCGCCGCTGCCGCCCGCCCCCCATCTCTGGACGCCCCGTGTGGTGGGG GTCAGAAGGCAGCCGCCGCTGCCGCCCGCCCCCCATCTCTGGACGCCCCGTGTGGTGGGG ************************************************************
2820 2820 2820 2820 2820
P108 PAC M222 T9 T4
CTGGTTCTCACCTTCCCCAGGATCAGGGGCCAGAGGCTGGCTCTCTGCTGGTCAGCTGGG CTGGTTCTCACCTTCCCCAGGATCAGGGGCCAGAGGCTGGCTCTCTGCTGGTCAGCTGGG CTGGTTCTCACCTTCCCCAGGATCAGGGGCCAGAGGCTGGCTCTCTGCTGGTCAGCTGGG CTGGTTCTCACCTTCCCCAGGATCAGGGGCCAGAGGCTGGCTCTCTGCTGGTCAGCTGGG CTGGTTCTCACCTTCCCCAGGATCAGGGGCCAGAGGCTGGCTCTCTGCTGGTCAGCTGGG ************************************************************
2880 2880 2880 2880 2880
P108 PAC M222 T9 T4
GAGCTGTGGCTCTGGCTGCGGGTGTCCTGAGGACTCGGACTGGGCAGGAGGTGATGAGGG GAGCTGTGGCTCTGGCTGCGGGTGTCCTGAGGACTCGGACTGGGCAGGAGGTGATGAGGG GAGCTGTGGCTCTGGCTGCGGGTGTCCTGAGGACTCGGACTGGGCAGGAGGTGATGAGGG GAGCTGTGGCTCTGGCTGCGGGTGTCCTGAGGACTCGGACTGGGCAGGAGGTGATGAGGG GAGCTGTGGCTCTGGCTGCGGGTGTCCTGAGGACTCGGACTGGGCAGGAGGTGATGAGGG ************************************************************
2940 2940 2940 2940 2940
P108 PAC M222 T9 T4
GAGCCTGAGACCCAGCGCCTGGCAAGGGCGCCATAGGACAGCCGTTCTGGCCAGGCTGGG GAGCCTGAGACCCAGCGCCTGGCAAGGGCGCCATAGGACAGCCGTTCTGGCCAGGCTGGG GAGCCTGAGACCCAGCGCCTGGCGAGGGCGCCATAGGACAGCCGTTCTGGCCAGGCTGGG GAGCCTGAGACCCAGCGCCTGGCGAGGGCGCCATAGGACAGCCGTTCTGGCCAGGCTGGG GAGCCTGAGACCCAGCGCCTGGCGAGGGCGCCATAGGACAGCCGTTCTGGCCAGGCTGGG ***********************.************************************
3000 pozice 2964 3000 3000 P – A/A 3000 M×P – A/G 3000 L – A/G
P108 PAC M222 T9 T4
GGAGGCGGGCGTGGAGGGGGCCAAGGAGACCCAGGGAGACTTAACCTGGAGCCCCGTGGT GGAGGCGGGCGTGGAGGGGGCCAAGGAGACCCAGGGAGACTTAACCTGGAGCCCCGTGGT GGAGGCGGGCGTGGAGGGGGCCAAGGAGACCCAGGGAGACTTAACCTGGAGCCCCGTGGT GGAGGCGGGCGTGGAGGGGGCCAAGGAGACCCAGGGAGACTTAACCTGGAGCCCCGTGGT GGAGGCGGGCGTGGAGGGGGCCAAGGAGACCCAGGGAGACTTAACCTGGAGCCCCGTGGT ************************************************************
3060 3060 3060 3060 3060
P108 PAC M222 T9 T4
CGGGGTTCCTGGTCGGGCTGGGTCTCACGTGGGACAGGGCCACCGACGGGGGTCAGGGAG CGGGGTTCCTGGTCGGGCTGGGTCTCACGTGGGACAGGGCCACCGACGGGGGTCAGGGAG CGGGGTTCCTGGTCGGGCTGGGTCTCACGTGGGACAGGGCCACCGACGGGGGTCAGGGAG CGGGGTTCCTGGTCGGGCTGGGTCTCACGTGGGACAGGGCCACCGACGGGGGTCAGGGAG CGGGGTTCCTGGTCGGGCTGGGTCTCACGTGGGACAGGGCCACCGACGGGGGTCAGGGAG ************************************************************
3120 3120 3120 3120 3120
P108 PAC M222 T9 T4
GCCAAGGCTGGGGGGTGGGGGAGGGGCGCTACAACAGGTGCCTTCTTCCTCCCGCCCAGA GCCAAGGCTGGGGGGTGGGGGAGGGGCGCTACAACAGGTGCCTTCTTCCTCCCGCCCAGA GCCAAGGCTGGGGGGTGGGGGAGGGGCGCTACAACAGGTGCCTTCTTCCTCCCGCCCAGA GCCAAGGCTGGGGGGTGGGGGAGGGGCGCTACAACAGGTGCCTTCTTCCTCCCGCCCAGA GCCAAGGCTGGGGGGTGGGGGAGGGGCGCTACAACAGGTGCCTTCTTCCTCCCGCCCAGA ************************************************************
3180 3180 3180 3180 3180
P108 PAC M222 T9 T4
TGCCCTGGTTCAAGGGCTGGAAAGTGGAGCGGAAGGAAGGGAATGCCAGTGGCGTGTCCC TGCCCTGGTTCAAGGGCTGGAAAGTGGAGCGGAAGGAAGGGAATGCCAGTGGCGTGTCCC TGCCCTGGTTCAAGGGCTGGAAAGTGGAGCGGAAGGAAGGGAATGCCAGTGGCGTGTCCC TGCCCTGGTTCAAGGGCTGGAAAGTGGAGCGGAAGGAAGGGAATGCCAGTGGCGTGTCCC TGCCCTGGTTCAAGGGCTGGAAAGTGGAGCGGAAGGAAGGGAATGCCAGTGGCGTGTCCC ************************************************************
3240 3240 3240 3240 3240
115
ČBU – A/G
P108 PAC M222 T9 T4
TGCTGGAGGCTCTGGACACCATCCTGCCCCCCACACGCCCCACAGACAAGCCCCTGCGCC TGCTGGAGGCTCTGGACACCATCCTGCCCCCCACACGCCCCACAGACAAGCCCCTGCGCC TGCTGGAGGCTCTGGACACCATCCTGCCCCCCACACGCCCCACAGACAAGCCCCTGCGCC TGCTGGAGGCTCTGGACACCATCCTGCCCCCCACACGCCCCACAGACAAGCCCCTGCGCC TGCTGGAGGCTCTGGACACCATCCTGCCCCCCACACGCCCCACAGACAAGCCCCTGCGCC ************************************************************
3300 3300 3300 3300 3300
P108 PAC M222 T9 T4
TGCCGCTGCAGGACGTGTACAAGATTGGCGGTGAGTGAAGCCTCTTCAGCTGCCCTCCCA TGCCGCTGCAGGACGTGTACAAGATTGGCGGTGAGTGAAGCCTCTTCAGCTGCCCTCCCA TGCCGCTGCAGGACGTGTACAAGATTGGCGGTGAGTGAAGCCTCTTCAGCTGCCCTCCCA TGCCGCTGCAGGACGTGTACAAGATTGGCGGTGAGTGAAGCCTCTTCAGCTGCCCTCCCA TGCCGCTGCAGGACGTGTACAAGATTGGCGGTGAGTGAAGCCTCTTCAGCTGCCCTCCCA ************************************************************
3360 3360 3360 3360 3360
P108 PAC M222 T9 T4
GCCCAGCCGCCGGCTCTGCCCTCAGACCCCTCCTGAGAACCGGCTCTGGCGAGGAGCCTG GCCCAGCCGCCGGCTCTGCCCTCAGACCCCTCCTGAGAACCGGCTCTGGCGAGGAGCCTG GCCCAGCCGCCGGCTCTGCCCTCAGACCCCTCCTGAGAACCGGCTCTGGCGAGGAGCCTG GCCCAGCCGCCGGCTCTGCCCTCAGACCCCTCCTGAGAACCGGCTCTGGCGAGGAGCCTG GCCCAGCCGCCGGCTCTGCCCTCAGACCCCTCCTGAGAACCGGCTCTGGCGAGGAGCCTG ************************************************************
3420 3420 3420 3420 3420
P108 PAC M222 T9 T4
GGGCAGGGTTATTTCTGCCTCTCCCCCGAGGCTGCACTCTTTCCAGGGGACCACCCACCC GGGCAGGGTTATTTCTGCCTCTCCCCCGAGGCTGCACTCTTTCCAGGGGACCACCCACCC GGGCAGGGTTATTTCTGCCTCTCCCCCGAGGCTGCACTCTTTCCAGGGGACCACCCACCC GGGCAGGGTTATTTCTGCCTCTCCCCCGAGGCTGCACTCTTTCCAGGGGACCACCCACCC GGGCAGGGTTATTTCTGCCTCTCCCCCGAGGCTGCACTCTTTCCAGGGGACCACCCACCC ************************************************************
3480 3480 3480 3480 3480
P108 PAC M222 T9 T4
ACCTGTCTTCATCCATTCATCTGTCTGTCTGTCCCTCTGTCCACTCCCACCTGCCCATCG ACCTGTCTTCATCCATTCATCTGTCTGTCTGTCCCTCTGTCCACTCCCACCTGCCCATCG ACCTGTCTTCATCCATTCATCTGTCTGTCTGTCCCTCTGTCCACTCCCACCTGCCCATCG ACCTGTCTTCATCCATTCATCTGTCTGTCTGTCCCTCTGTCCACTCCCACCTGCCCATCG ACCTGTCTTCATCCATTCATCTGTCTGTCTGTCCCTCTGTCCACTCCCACCTGCCCATCG ************************************************************
3540 3540 3540 3540 3540
P108 PAC M222 T9 T4
GGCTGTCCCGCAAGGGTCCTCCTTCCTCCAGCTCAGTGCCCAGCCCTATGCCAGCAGCGG GGCTGTCCCGCAAGGGTCCTCCTTCCTCCAGCTCAGTGCCCAGCCCTATGCCAGCAGCGG GGCTGTCCCGCAAGGGTCCTCCTTCCTCCAGCTCAGTGCCCAGCCCTATGCCAGCAGCGG GGCTGTCCCGCAAGGGTCCTCCTTCCTCCAGCTCAGTGCCCAGCCCTATGCCAGCAGCGG GGCTGTCCCGCAAGGGTCCTCCTTCCTCCAGCTCAGTGCCCAGCCCTATGCCAGCAGCGG ************************************************************
3600 3600 3600 3600 3600
P108 PAC M222 T9 T4
GTGGCACAAGGGAGCCACACGTTGCCCTCGTTGCCCTCCCCCTGGAGGTCTGGGGCCTGT GTGGCACAAGGGAGCCACACGTTGCCCTCGTTGCCCTCCCCCTGGAGGTCTGGGGCCTGT GTGGCACAAGGGAGCCACACGTTGCCCTCGTTGCCCTCCCCCTGGAGGTCTGGGGCCTGT GTGGCACAAGGGAGCCACACGTTGCCCTCGTTGCCCTCCCCCTGGAGGTCTGGGGCCTGT GTGGCACAAGGGAGCCACACGTTGCCCTCGTTGCCCTCCCCCTGGAGGTCTGGGGCCTGT ************************************************************
3660 3660 3660 3660 3660
P108 PAC M222 T9 T4
GGGAGACATGATCCACTCCAGAAGGAGAACAGCCATTCATGAGATGGTACAGAACCTTGA GGGAGACATGATCCACTCCAGAAGGAGAACAGCCATTCATGAGATGGTACAGAACCTTGA GGGAGACATGATCCACTCCAGAAGGAGAACAGCCATTCATGAGATGGTACAGAACCTTGA GGGAGACATGATCCACTCCAGAAGGAGAACAGCCATTCATGAGATGGTACAGAACCTTGA GGGAGACATGATCCACTCCAGAAGGAGAACAGCCATTCATGAGATGGTACAGAACCTTGA ************************************************************
3720 3720 3720 3720 3720
P108 PAC M222 T9 T4
GCAAGTATGAGGCCCAGGAGGGCAGCGGTGGGGGCTCGCGGCCAGCAGGCTGCGGCTGGA GCAAGTATGAGGCCCAGGAGGGCAGCGGTGGGGGCTCGCGGCCAGCAGGCTGCGGCTGGA GCAAGTATGAGGCCCAGGAGGGCAGCGGTGGGGGCTCGCGGCCAGCAGGCTGCGGCTGGA GCAAGTATGAGGCCCAGGAGGGCAGCGGTGGGGGCTCGCGGCCAGCAGGCTGCGGCTGGA GCAAGTATGAGGCCCAGGAGGGCAGCGGTGGGGGCTCGCGGCCAGCAGGCTGCGGCTGGA ************************************************************
3780 3780 3780 3780 3780
P108 PAC M222 T9 T4
GATGTCAGGCCTGTGTGCAGACTGGGGGTCCACGCCCACCCGGCACAGAGAACGCCACCA GATGTCAGGCCTGTGTGCAGACTGGGGGTCCACGCCCACCCGGCACAGAGAACGCCACCA GATGTCAGGCCTGTGTGCAGACTGGGGGTCCACGCCCACCCGGCACAGAGAACGCCACCA GATGTCAGGCCTGTGTGCAGACTGGGGGTCCACGCCCACCCGGCACAGAGAACGCCACCA GATGTCAGGCCTGTGTGCAGACTGGGGGTCCACGCCCACCCGGCACAGAGAACGCCACCA ************************************************************
3840 3840 3840 3840 3840
P108 PAC M222 T9 T4
GGCTCGGTAATGCCACACGAGCCGCTGTCACCGCCAGGGAGACCAGGAGGAGCCCCCTGC GGCTCGGTAATGCCACACGAGCCGCTGTCACCGCCAGGGAGACCAGGAGGAGCCCCCTGC GGCTCGGTAATGCCACACGAGCCGCTGTCACCGCCAGGGAGACCAGGAGGAGCCCCCTGC GGCTCGGTAATGCCACACGAGCCGCTGTCACCGCCAGGGAGACCAGGAGGAGCCCCCTGC GGCTCGGTAATGCCACACGAGCCGCTGTCACCGCCAGGGAGACCAGGAGGAGCCCCCTGC ************************************************************
3900 3900 3900 3900 3900
116
P108 PAC M222 T9 T4
CGCCGCCCTAGGGGGCACCGTACCTCTTCAGGAATAGCCCCCGAGACGGCAGCACCAGTA CGCCGCCCTAGGGGGCACCGTACCTCTTCAGGAATAGCCCCCGAGACGGCAGCACCAGTA CGCCGCCCTAGGGGGCACCGTACCTCTTCAGGAATAGCCCCCGAGACGGCAGCACCAGTA CGCCGCCCTAGGGGGCACCGTACCTCTTCAGGAATAGCCCCCGAGACGGCAGCACCAGTA CGCCGCCCTAGGGGGCACCGTACCTCTTCAGGAATAGCCCCCGAGACGGCAGCACCAGTA ************************************************************
3960 3960 3960 3960 3960
P108 PAC M222 T9 T4
CTGGGCCGGGTCAATCCAGGGGGACCGGTTCATGCTGCTGCCTCGGAAGGAGAGGCCCCG CTGGGCCGGGTCAATCCAGGGGGACCGGTTCATGCTGCTGCCTCGGAAGGAGAGGCCCCG CTGGGCCGGGTCAATCCAGGGGGACCGGTTCATGCTGCTGCCTCGGAAGGAGAGGCCCCG CTGGGCCGGGTCAATCCAGGGGGACCGGTTCATGCTGCTGCCTCGGAAGGAGAGGCCCCG CTGGGCCGGGTCAATCCAGGGGGACCGGTTCATGCTGCTGCCTCGGAAGGAGAGGCCCCG ************************************************************
4020 4020 4020 4020 4020
P108 PAC M222 T9 T4
GAGAGGGGAGGCGGTCCCTGGGGCAGGGGCGGGACCCCTCTTTCAGACGGCCCTCTCCTT GAGAGGGGAGGCGGTCCCTGGGGCAGGGGCGGGACCCCTCTTTCAGACGGCCCTCTCCTT GAGAGGGGAGGCGGTCCCTGGGGCAGGGGCGGGACCCCTCTTTCAGACGGCCCTCTCCTT GAGAGGGGAGGCGGTCCCTGGGGCAGGGGCGGGACCCCTCTTTCAGACGGCCCTCTCCTT GAGAGGGGAGGCGGTCCCTGGGGCAGGGGCGGGACCCCTCTTTCAGACGGCCCTCTCCTT ************************************************************
4080 4080 4080 4080 4080
P108 PAC M222 T9 T4
GCCCGTTTGCCCCGTGTTATGGGCACTCTCTTCCCGAGTCCCTTCTCCCGGAGGGGCCGG GCCCGTTTGCCCCGTGTTATGGGCACTCTCTTCCCGAGTCCCTTCTCCCGGAGGGGCCGG GCCCGTTTGCCCCGTGTTATGGGCACTCTCTTCCCGAGTCCCTTCTCCCGGAGGGGCCGG GCCCGTTTGCCCCGTGTTATGGGCACTCTCTTCCCGAGTCCCTTCTCCCGGAGGGGCCGG GCCCGTTTGCCCCGTGTTATGGGCACTCTCTTCCCGAGTCCCTTCTCCCGGAGGGGCCGG ************************************************************
4140 4140 4140 4140 4140
P108 PAC M222 T9 T4
GAAGCTCCCACTTCTGGCCGAATGTCTCGGCGTCTCCCTGTCCCCTCACCTCCTCCATGT GAAGCTCCCACTTCTGGCCGAATGTCTCGGCGTCTCCCTGTCCCCTCACCTCCTCCATGT GAAGCTCCCACTTCTGGCCGAATGTCTCGGCGTCTCCCTGTCCCCTCACCTCCTCCATGT GAAGCTCCCACTTCTGGCCGAATGTCTCGGCGTCTCCCTGTCCCCTCACCTCCTCCATGT GAAGCTCCCACTTCTGGCCGAATGTCTCGGCGTCTCCCTGTCCCCTCACCTCCTCCATGT ************************************************************
4200 4200 4200 4200 4200
P108 PAC M222 T9 T4
GGCCACCCCTCCCCTGCCAGGGCGAAGGGCACCCCCCGCCAGGCCTGCCTTCTCAGCCTC GGCCACCCCTCCCCTGCCAGGGCGAAGGGCACCCCCCGCCAGGCCTGCCTTCTCAGCCTC GGCCACCCCTCCCCTGCCAGGGCGAAGGGCACCCCCCGCCAGGCCTGCCTTCTCAGCCTC GGCCACCCCTCCCCTGCCAGGGCGAAGGGCACCCCCCGCCAGGCCTGCCTTCTCAGCCTC GGCCACCCCTCCCCTGCCAGGGCGAAGGGCACCCCCCGCCAGGCCTGCCTTCTCAGCCTC ************************************************************
4260 4260 4260 4260 4260
P108 PAC M222 T9 T4
CTTCCTCTCGACGCAGGCATTGGCACTGTGCCTGTGGGCCGAGTGGAGACGGGCATCCTC CTTCCTCTCGACGCAGGCATTGGCACTGTGCCTGTGGGCCGAGTGGAGACGGGCATCCTC CTTCCTCTCGACGCAGGCATTGGCACTGTGCCTGTGGGCCGAGTGGAGACGGGCATCCTC CTTCCTCTCGACGCAGGCATTGGCACTGTGCCTGTGGGCCGAGTGGAGACGGGCATCCTC CTTCCTCTCGACGCAGGCATTGGCACTGTGCCTGTGGGCCGAGTGGAGACGGGCATCCTC ************************************************************
4320 4320 4320 4320 4320
P108 PAC M222 T9 T4
CGGCCGGGCATGGTGGTGACCTTCGCGCCCGTGAACATCACCACTGAGGTGAAGTCGGTG CGGCCGGGCATGGTGGTGACCTTCGCGCCCGTGAACATCACCACTGAGGTGAAGTCGGTG CGGCCGGGCATGGTGGTGACCTTCGCGCCCGTGAACATCACCACTGAGGTGAAGTCGGTG CGGCCGGGCATGGTGGTGACCTTCGCGCCCGTGAACATCACCACTGAGGTGAAGTCGGTG CGGCCGGGCATGGTGGTGACCTTCGCGCCCGTGAACATCACCACTGAGGTGAAGTCGGTG ******************************************** ***************
4380 4380 4380 4380 4380
P108 PAC M222 T9 T4
GAGATGCACCACGAGGCTCTGAGCGAGGCCCTGCCCGGGGACAACGTCGGCTTCAACGTG GAGATGCACCACGAGGCTCTGAGCGAGGCCCTGCCCGGGGACAACGTCGGCTTCAACGTG GAGATGCACCACGAGGCTCTGAGCGAGGCCCTGCCCGGGGACAACGTCGGCTTCAACGTG GAGATGCACCACGAGGCTCTGAGCGAGGCCCTGCCCGGGGACAACGTCGGCTTCAACGTG GAGATGCACCACGAGGCTCTGAGCGAGGCCCTGCCCGGGGACAACGTCGGCTTCAACGTG ************************************************************
4440 4440 4440 4440 4440
P108 PAC M222 T9 T4
AAGAACGTGTCAGTCAAGGACATCCGTCGGGGCAACGTGTGTGGGGACAGCAAGTCCGAC AAGAACGTGTCAGTCAAGGACATCCGTCGGGGCAACGTGTGTGGGGACAGCAAGTCCGAC AAGAACGTGTCAGTCAAGGACATCCGTCGGGGCAACGTGTGTGGGGACAGCAAGTCCGAC AAGAACGTGTCAGTCAAGGACATCCGTCGGGGCAACGTGTGTGGGGACAGCAAGTCCGAC AAGAACGTGTCAGTCAAGGACATCCGTCGGGGCAACGTGTGTGGGGACAGCAAGTCCGAC ************************************************************
4500 4500 4500 4500 4500
P108 PAC M222 T9 T4
CCGCCCCAGGAGGCCGCCCAGTTCACTTCCCAGGTGCGCGGCCCGGGGGCCAGAGGGCCG CCGCCCCAGGAGGCCGCCCAGTTCACTTCCCAGGTGCGCGGCCCGGGGGCCAGAGGGCCG CCGCCCCAGGAGGCCGCCCAGTTCACTTCCCAGGTGCGCGGCCCGGGGGCCAGAGGGCCG CCGCCCCAGGAGGCCGCCCAGTTCACTTCCCAGGTGCGCGGCCCGGGGGCCAGAGGGCCG CCGCCCCAGGAGGCCGCCCAGTTCACTTCCCAGGTGGGCGGCCCGGGGGCCAGAGGGCCG ************************************ ***********************
4560 4560 4560 4560 4560
pozice 4365
117
P – T/T M×P – T/G L – T/G ČBU – T/G
pozice 4537 P – C/C M×P – C/G L – C/C ČBU – C/G
P108 PAC M222 T9 T4
TCTTCCCAGGCAGCGCAGGGCTGTCCTCGGCGAGGCGGCTGCCTGGTGCCAGGAAGGACT TCTTCCCAGGCAGCGCAGGGCTGTCCTCGGCGAGGCGGCTGCCTGGTGCCAGGAAGGACT TCTTCCCAGGCAGCGCAGGGCTGTCCTCGGCGAGGCGGCTGCCTGGTGCCAGGAAGGACT TCTTCCCAGGCAGCGCAGGGCTGTCCTCGGCGAGGCGGCTGCCTGGTGCCAGGAAGGACT TCTTCCCAGGCAGCGCAGGGCTGTCCTCGGCGAGGCGGCTGCCTGGTGCCAGGAAGGACT ************************************************************
4620 4620 4620 4620 4620
P108 PAC M222 T9 T4
CGGATCCCCACGTTAGAGACGGGCCGTCGAGGCCGGGCGGAGGTGGAACCTCAGGAAGAG CGGATCCCCACGTTAGAGACGGGCCGTCGAGGCCGGGCGGAGGTGGAACCTCAGGAAGAG CGGATCCCCACGTTAGAGACGGGCCGTCGAGGCCGGGCGGAGGTGGAACCTCAGGAAGAG CGGATCCCCACGTTAGAGACGGGCCGTCGAGGCCGGGCGGAGGTGGAACCTCAGGAAGAG CGGATCCCCACGTTAGAGACGGGCCGTCGAGGCCGGGCGGAGGTGGAACCTCAGGAAGAG ************************************************************
4680 4680 4680 4680 4680
P108 PAC M222 T9 T4
CCGACAGGGTGACCAGGCTGCCCAGCCTCAGGGGGTCCCACTTCGGTCCTGGAAATGCTG CCGACAGGGTGACCAGGCTGCCCAGCCTCAGGGGGTCCCACTTCGGTCCTGGAAATGCTG CCGACAGGGTGACCAGGCTGCCCAGCCTCAGGGGGTCCCACTTCGGTCCTGGAAATGCTG CCGACAGGGTGACCAGGCTGCCCAGCCTCAGGGGGTCCCACTTCGGTCCTGGAAATGCTG CCGACAGGGTGACCAGGCTGCCCAGCCTCAGGGGGTCCCACTTCGGTCCTGGAAATGCTG ************************************************************
4740 4740 4740 4740 4740
P108 PAC M222 T9 T4
TAATCAGCTTATCGCCTGGGGCCCATCTGCAAGGCTCTCCTCTGTTTTCACTGCGCCTTC TAATCAGCTTATCGCCTGGGGCCCATCTGCAAGGCTCTCCTCTGTTTTCACTGCGCCTTC TAATCAGCTTATCGCCTGGGGCCCATCTGCAAGGCTCTCCTCTGTTTTCACTGCGCCTTC TAATCAGCTTATCGCCTGGGGCCCATCTGCAAGGCTCTCCTCTGTTTTCACTGCGCCTTC TAATCAGCTTATCGCCTGGGGCCCATCTGCAAGGCTCTCCTCTGTTTTCACTGCGCCTTC ************************************************************
4800 4800 4800 4800 4800
P108 PAC M222 T9 T4
TTTGGTCATCTCTTTATTTATTTATTTATATTTATTTATTATTATTATTATTTTTTGTCT TTTGGTCATCTCTTTATTTATTTATTTATATTTATTTATTATTATTATTATTTTTTGTCT TTTGGTCATCTCTTTATTTATTTATTTATATTTATTTATTATTATTATTATTTTTTGTCT TTTGGTCATCTCTTTATTTATTTATTTATATTTATTTATTATTATTATTATTTTTTGTCT TTTGGTCATCTCTTTATTTATTTATTTATATTTATTTATTATTATTATTATTTTTTGTCT ************************************************************
4860 4860 4860 4860 4860
P108 PAC M222 T9 T4
TTTTGCTATTTCTTTGGGCCGCTCCCGCAGCATATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGGTCGAA TTTTGCTATTTCTTTGGGCCGCTCCCGCAGCATATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGGTCGAA TTTTGCTATTTCTTTGGGCCGCTCCCGCAGCATATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGGTCGAA TTTTGCTATTTCTTTGGGCCGCTCCCGCAGCATATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGGTCGAA TTTTGCTATTTCTTTGGGCCGCTCCCGCAGCATATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGGTCGAA ************************************************************
4920 4920 4920 4920 4920
P108 PAC M222 T9 T4
TCGGAGCTGTAGCCACCGGCCTACGCCAGAGCCACAGCAACGCGGGATCCCAGCTGCATC TCGGAGCTGTAGCCACCGGCCTACGCCAGAGCCACAGCAACGCGGGATCCCAGCTGCATC TCGGAGCTGTAGCCACCGGCCTACGCCAGAGCCACAGCAACGCGGGATCCCAGCTGCATC TCGGAGCTGTAGCCACCGGCCTACGCCAGAGCCACAGCAACGCGGGATCCCAGCTGCATC TCGGAGCTGTAGCCACCGGCCTACGCCAGAGCCACAGCAACGCGGGATCCCAGCTGCATC ************************************************************
4980 4980 4980 4980 4980
P108 PAC M222 T9 T4
TGCAACCTACACCACAGCTCACGGCAACGCCGGATCGCTAACCCACTGAGCAAGGGCAGG TGCAACCTACACCACAGCTCACGGCAACGCCGGATCGCTAACCCACTGAGCAAGGGCAGG TGCAACCTACACCACAGCTCACGGCAACGCCGGATCGCTAACCCACTGAGCAAGGGCAGG TGCAACCTACACCACAGCTCACGGCAACGCCGGATCGCTAACCCACTGAGCAAGGGCAGG TGCAACCTACACCACAGCTCACGGCAACGCCGGATCGCTAACCCACTGAGCAAGGGCAGG ************************************************************
5040 5040 5040 5040 5040
P108 PAC M222 T9 T4
GACCGAACCCGCAACCTCATGGTTCCTAGTCGGATTGGTTAACCACTGCGCCACGACGGG GACCGAACCCGCAACCTCATGGTTCCTAGTCGGATTGGTTAACCACTGCGCCACGACGGG GACCGAACCCGCAACCTCATGGTTCCTAGTCGGATTGGTTAACCACTGCGCCACGACGGG GACCGAACCCGCAACCTCATGGTTCCTAGTCGGATTGGTTAACCACTGCGCCACGACGGG GACCGAACCCGCAACCTCATGGTTCCTAGTCGGATTTGTTAACCACTGCGCCACGACGGG ************************************ ***********************
5100 5100 5100 5100 5100
P108 PAC M222 T9 T4
AACTCCTGGTCATCTCTTTAACGTGACTACAAAGTTTGTCTGTTTTTCTTTCTCTCCTTC AACTCCTGGTCATCTCTTTAACGTGACTACAAAGTTTGTCTGTTTTTCTTTCTCTCCTTC AACTCCTGGTCATCTCTTTAACGTGACTACAAAGTTTGTCTGTTTTTCTTTCTCTCCTTC AACTCCTGGTCATCTCTTTAACGTGACTACAAAGTTTGTCTGTTTTTCTTTCTCTCCTTC AACTCCTGGTCATCTCTTTAACGTGACTACAAAGTTTGTCTGTTTTTCTTTCTCTCCTTC ************************************************************
5160 5160 5160 5160 5160
P108 PAC M222 T9 T4
TAGGGCTTCACCCGTGGCATATGGAGATCCCCAGGCTAGAGGTCGACTCAGAGCTGCAGC TAGGGCTTCACCCGTGGCATATGGAGATCCCCAGGCTAGAGGTCGACTCAGAGCTGCAGC TAGGGCTTCACCCGTGGCATATGGAGATCCCCAGGCTAGAGGTCGACTCAGAGCTGCAGC TAGGGCTTCACCCGTGGCATATGGAGATCCCCAGGCTAGAGGTCGACTCAGAGCTGCAGC TAGGGCTTCACCCGTGGCATATGGAGATCCCCAGGCTAGAGGTCGACTCAGAGCTGCAGC ************************************************************
5220 5220 5220 5220 5220
118
pozice 5077 P – G/G M×P – G/G L – T/G ČBU – T/T
P108 PAC M222 T9 T4
TGCCGGCCTGCCCCACAGCCACAGCCCCACGGGACCCGAGCCTTGTCTGTGACCTACACC TGCCGGCCTGCCCCACAGCCACAGCCCCACGGGACCCGAGCCTTGTCTGTGACCTACACC TGCCGGCCTGCCCCACAGCCACAGCCCCACGGGACCCGAGCCTTGTCTGTGACCTACACC TGCCGGCCTGCCCCACAGCCACAGCCCCACGGGACCCGAGCCTTGTCTGTGACCTACACC TGCCGGCCTGCCCCACAGCCACAGCCCCACGGGACCCGAGCCTTGTCTGTGACCTACACC ************************************************************
5280 5280 5280 5280 5280
P108 PAC M222 T9 T4
ACAGCTCATGGCAATGCCAGATCCTTAACCCACTGAGCAGGGCCAGGGATCAAACCCGCA ACAGCTCATGGCAATGCCAGATCCTTAACCCACTGAGCAGGGCCAGGGATCAAACCCGCA ACAGCTCATGGCAATGCCAGATCCTTAACCCACTGAGCAGGGCCAGGGATCAAACCCGCA ACAGCTCATGGCAATGCCAGATTCTTAACCCACTGAGCAGGGCCAGGGATCAAACCCGCA ACAGCTCATGGCAATGCCAGATCCTTAACCCACTGAGCAGGGCCAGGGATCAAACCCGCA ************************************************************
5340 pozice 5303 5340 5340 P – C/C 5340 M×P – C/C 5340 L – C/T ČBU – C/C
P108 PAC M222 T9 T4
TCCTCGTGGATACTAGTTGGGTTCTTAACTCATTGAGCCACAGCGGGAACTCCACTACAG TCCTCGTGGATACTAGTTGGGTTCTTAACTCATTGAGCCACAGCGGGAACTCCACTACAG TCCTCGTGGATACTAGTTGGGTTCTTAACTCATTGAGCCACAGCGGGAACTCCACTACAG TCCTCGTGGATACTAGTTGGGTTCTTAACTCATTGAGCCACAGCGGGAACTCCACTACAG TCCTCGTGGATACTAGTTGGGTTCTTAACTCATTGAGCCACAGCGGGAACTCCACTACAG ************************************************************
5400 5400 5400 5400 5400
P108 PAC M222 T9 T4
TGTTTAAAATTGGCTTTACTGAGGTATGGTTGAAATACGACAGTCGGGCCCGGGTTTGTC TGTTTAAAATTGGCTTTACTGAGGTATGGTTGAAATACGACAGTCGGGCCCGGGTTTGTC TGTTTAAAATTGGCTTTACTGAGGTATGGTTGAAATACGACAGTCGGGCCCGGGTTTGTC TGTTTAAAATTGGCTTTACTGAGGTATGGTTGAAATACGACAGTCGGGCCCGGGTTTGTC TGTTTAAAATTGGCTTTACTGAGGTATGGTTGAAATACGACAGTCGGGCCCGGGTTTGTC ************************************************************
5460 5460 5460 5460 5460
P108 PAC M222 T9 T4
TCCCTGCTCCTTCGGCTCTGGCCTCTGGCCCTTTCAAATGATGCTCTCGGTGTTTATCTT TCCCTGCTCCTTCGGCTCTGGCCTCTGGCCCTTTCAAATGATGCTCTCGGTGTTTATCTT TCCCTGCTCCTTCGGCTCTGGCCTCTGGCCCTTTCAAATGATGCTCTCGGTGTTTATCTT TCCCTGCTCCTTCGGCTCTGGCCTCTGGCCCTTTCAAATGATGCTCTCGGTGTTTATCTT TCCCTGCTCCTTCGGCTCTGGCCTCTGGCCCTTTCAAATGATGCTCTCGGTGTTTATCTT ************************************************************
5520 5520 5520 5520 5520
P108 PAC M222 T9 T4
CTGTGGCTTTTCAGACCCTTGAAGACAACCAGCCTCGGGCTCTGTAGGTCTGGGGGCCTG CTGTGGCTTTTCAGACCCTTGAAGACAACCAGCCTCGGGCTCTGTAGGTCTGGGGGCCTG CTGTGGCTTTTCAGACCCTTGAAGACAACCAGCCTCGGGCTCTGTAGGTCTGGGGGCCTG CTGTGGCTTTTCAGACCCTTGAAGACAACCAGCCTCGGGCTCTGTAGGTCTGGGGGCCTG CTGTGGCTTTTCAGACCCTTGAAGACAACCAGCCTCGGGCTCTGTAGGTCTGGGGGCCTG ************************************************************
5580 5580 5580 5580 5580
P108 PAC M222 T9 T4
GGCCCCCTGGAGCCTGACCGTTCTCCAGGGTCAGCACCCAGGGCCCCTGGGGTGGGCAGG GGCCCCCTGGAGCCTGACCGTTCTCCAGGGTCAGCACCCAGGGCCCCTGGGGTGGGCAGG GGCCCCCTGGAGCCTGACCGTTCTCCAGGGTCAGCACCCAGGGCCCCTGGGGTGGGCAGG GGCCCCCTGGAGCCTGACCGTTCTCCAGGGTCAGCACCCAGGGCCCCTGGGGTGGGCAGG GGCCCCCTGGAGCCTGACCGTTCTCCAGGGTCAGCACCCAGGGCCCCTGGGGTGGGCAGG ************************************************************
5640 5640 5640 5640 5640
P108 PAC M222 T9 T4
GCCTCTTCCAGCCTGGTGCCCTCCTCTGGTGCCCACCCGGGGCAGGGCTGATGGCCTCTG GCCTCTTCCAGCCTGGTGCCCTCCTCTGGTGCCCACCCGGGGCAGGGCTGATGGCCTCTG GCCTCTTCCAGCCTGGTGCCCTCCTCTGGTGCCCACCCGGGGCAGGGCTGATGGCCTCTG GCCTCTTCCAGCCTGGTGCCCTCCTCTGGTGCCCACCCGGGGCAGGGCTGATGGCCTCTG GCCTCTTCCAGCCTGGTGCCCTCCTCTGGTGCCCACCCGGGGCAGGGCTGATGGCCTCTG ************************************************************
5700 5700 5700 5700 5700
P108 PAC M222 T9 T4
CCACTCTGCCCGCAGGTCATCATTCTGAACCACCCGGGGCAGATCAGCGCCGGCTACTCA CCACTCTGCCCGCAGGTCATCATTCTGAACCACCCGGGGCAGATCAGCGCCGGCTACTCA CCACTCTGCCCGCAGGTCATCATTCTGAACCACCCGGGGCAGATCAGCGCCGGCTACTCA CCACTCTGCCCGCAGGTCATCATTCTGAACCACCCGGGGCAGATCAGCGCCGGCTACTCA CCACTCTGCCCGCAGGTCATCATTCTGAACCACCCGGGGCAGATCAGCGCCGGCTACTCA ************************************************************
5760 5760 5760 5760 5760
P108 PAC M222 T9 T4
CCGGTCATTGACTGCCACACGGCCCACATCGCCTGCAAGTTTGCCGAGCTCAAGGAGAAG CCGGTCATTGACTGCCACACGGCCCACATCGCCTGCAAGTTTGCCGAGCTCAAGGAGAAG CCGGTCATTGACTGCCACACGGCCCACATCGCCTGCAAGTTTGCCGAGCTCAAGGAGAAG CCGGTCATTGACTGCCACACGGCCCACATCGCCTGCAAGTTTGCCGAGCTCAAGGAGAAG CCGGTCATTGACTGCCACACGGCCCACATCGCCTGCAAGTTTGCCGAGCTCAAGGAGAAG ************************************************************
5820 5820 5820 5820 5820
P108 PAC M222 T9 T4
ATTGACCGGCGCTCTGGCAAGAAGCTGGAGGACAACCCCAAGTCCCTGAAGTCTGGCGAC ATTGACCGGCGCTCTGGCAAGAAGCTGGAGGACAACCCCAAGTCCCTGAAGTCTGGCGAC ATTGACCGGCGCTCTGGCAAGAAGCTGGAGGACAACCCCAAGTCCCTGAAGTCTGGCGAC ATTGACCGGCGCTCTGGCAAGAAGCTGGAGGACAACCCCAAGTCCCTGAAGTCTGGCGAC ATTGACCGGCGCTCTGGCAAGAAGCTGGAGGACAACCCCAAGTCCCTGAAGTCTGGCGAC ************************************************************
5880 5880 5880 5880 5880
119
P108 PAC M222 T9 T4
GCGGCCATTGTAGAGATGGTCCCTGGGAAGCCCATGTGTGTGGAGAGCTTCTCCCAGTAC GCGGCCATTGTAGAGATGGTCCCTGGGAAGCCCATGTGTGTGGAGAGCTTCTCCCAGTAC GCGGCCATTGTAGAGATGGTCCCTGGGAAGCCCATGTGTGTGGAGAGCTTCTCCCAGTAC GCGGCCATTGTAGAGATGGTCCCTGGGAAGCCCATGTGTGTGGAGAGCTTCTCCCAGTAC GCGGCCATTGTAGAGATGGTCCCTGGGAAGCCCATGTGTGTGGAGAGCTTCTCCCAGTAC ************************************************************
5940 5940 5940 5940 5940
P108 PAC M222 T9 T4
CCGCCCCTCGGTGAGCCGGGAGGGGAGGTGGCGGGCCCAGGCCAAGGGCAGGAGACCCCT CCGCCCCTCGGTGAGCCGGGAGGGGAGGTGGCGGGCCCAGGCCAAGGGCAGGAGACCCCT CCGCCCCTCGGTGAGCCGGGAGGGGAGGTGGCGGGCCCAGGCCAAGGGCAGGAGACCCCT CCGCCCCTCGGTGAGCCGGGAGGGGAGGTGGCGGGCCCAGGCCAAGGGCAGGAGACCCCT CCGCCCCTCGGTGAGCCGGGAGGGGAGGTGGCGGGCCCAGGCCAAGGGCAGGAGACCCCT ************************************************************
6000 6000 6000 6000 6000
P108 PAC M222 T9 T4
GGGTGGGGGGGGGGGGTGGATCCTGAACTTTGCTGCAGCACTGAGAACTCAGTAGGAGAC GGGTGGGGGGGGGGGGTGGATCCTGAACTTTGCTGCAGCACTGAGAACTCAGTAGGAGAC GGGTGGGGGGGGGGGGTGGATCCTGAACTTTGCTGCAGCACTGAGAACTCAGTAGGAGAC GGGTGGGGGGGGGGGGTGGATCCTGAACTTTGCTGCAGCACTGAGAACTCAGTAGGAGAC GGGTGGGGGGGGGGGGTGGATCCTGAACTTTGCTGCAGCACTGAGAACTCAGTAGGAGAC ************************************************************
6060 6060 6060 6060 6060
P108 PAC M222 T9 T4
TCCCGGCCTTGGCCTTTGTCTCCCGGAGCACACGTGGCCCCACTAGGTGGGCCTGAAATG TCCCGGCCTTGGCCTTTGTCTCCCGGAGCACACGTGGCCCCACTAGGTGGGCCTGAAATG TCCCGGCCTTGGCCTTTGTCTCCCGGAGCACACGTGGCCCCACTAGGTGGGCCTGAAATG TCCCGGCCTTGGCCTTTGTCTCCCGGAGCACACGTGGCCCCACTAGGTGGGCCTGAAATG TCCCGGCCTTGGCCTTTGTCTCCCGGAGCACACGTGGCCCCACTAGGTGGGCCTGAAATG ************************************************************
6120 6120 6120 6120 6120
P108 PAC M222 T9 T4
GTGTCCCCTCTGCAAAGGAAGTCCCCTAAGGGAGTGGTCCAAGGCCCACAGCTAGTCTCG GTGTCCCCTCTGCAAAGGAAGTCCCCTAAGGGAGTGGTCCAAGGCCCACAGCTAGTCTCG GTGTCCCCTCTGCAAAGGAAGTCCCCTAAGGGAGTGGTCCAAGGCCCACAGCTAGTCTCG GTGTCCCCTCTGCAAAGGAAGTCCCCTAAGGGAGTGGTCCAAGGCCCACAGCTAGTCTCG GTGTCCCCTCTGCAAAGGAAGTCCCCTAAGGGAGTGGTCCAAGGCCCACAGCTAGTCTCG ************************************************************
6180 6180 6180 6180 6180
P108 PAC M222 T9 T4
AGGCAGAGTCAGACTGACCTCCTGCCTCCAACTGGCCTCCCTCACAGATACCCTAGGATG AGGCAGAGTCAGACTGACCTCCTGCCTCCAACTGGCCTCCCTCACAGATACCCTAGGATG AGGCAGAGTCAGACTGACCTCCTGCCTCCAACTGGCCTCCCTCACAGATACCCTAGGATG AGGCAGAGTCAGACTGACCTCCTGCCTCCAACTGGCCTCCCTCACAGATACCCTAGGATG AGGCAGAGTCAGACTGACCTCCTGCCTCCAACTGGCCTCCCTCACAGATACCCTAGGATG ************************************************************
6240 6240 6240 6240 6240
P108 PAC M222 T9 T4
ACCCACAGACCTGTATTGGAGAGCTGCCTAATGCCAGGGTGGGGCCACCGTCAAAACAGC ACCCACAGACCTGTATTGGAGAGCTGCCTAATGCCAGGGTGGGGCCACCGTCAAAACAGC ACCCACAGACCTGTATTGGAGAGCTGCCTAATGCCAGGGTGGGGCCACCGTCAAAACAGC ACCCACAGACCTGTATTGGAGAGCTGCCTAATGCCAGGGTGGGGCCACCGTCAAAACAGC ACCCACAGACCTGTATTGGAGAGCTGCCTAATGCCAGGGTGGGGCCACCGTCAAAACAGC ************************************************************
6300 6300 6300 6300 6300
P108 PAC M222 T9 T4
CGAGCGTGTTCTCGGCATGGTTCACAGGCCATTTACTTCTGGCAACTGTGCCTTGACGGA CGAGCGTGTTCTCGGCATGGTTCACAGGCCATTTACTTCTGGCAACTGTGCCTTGACGGA CGAGCGTGTTCTCGGCATGGTTCACAGGCCATTTACTTCTGGCAACTGTGCCTTGACGGA CGAGCGTGTTCTCGGCATGGTTCACAGGCCATTTACTTCTGGCAACTGTGCCTTGACGGA CGAGCGTGTTCTCGGCATGGTTCACAGGCCATTTACTTCTGGCAACTGTGCCTTGACGGA ************************************************************
6360 6360 6360 6360 6360
P108 PAC M222 T9 T4
GTCCTATGTGCATCTAAGTAGATGGGAGCCCGTACTCCACCCTGTCCCCGGAAACAGGCG GTCCTATGTGCATCTAAGTAGATGGGAGCCCGTACTCCACCCTGTCCCCGGAAACAGGCG GTCCTATGTGCATCTAAGTAGATGGGAGCCCGTACTCCACCCTGTCCCCGGAAACAGGCG GTCCTATGTGCATCTAAGTAGATGGGAGCCCGTACTCCACCCTGTCCCCGGAAACAGGCG GTCCTATGTGCATCTAAGTAGATGGGAGCCCGTACTCCACCCTGTCCCCGGAAACAGGCG ************************************************************
6420 6420 6420 6420 6420
P108 PAC M222 T9 T4
CAGGGAACCCCGTCCCCACCGCGAGGGTCGCAGCCCCAGGGCCTGGGTTGGGGAGGATGC CAGGGAACCCCGTCCCCACCGCGAGGGTCGCAGCCCCAGGGCCTGGGTTGGGGAGGATGC CAGGGAACCCCGTCCCCACCGCGAGGGTCGCAGCCCCAGGGCCTGGGTTGGGGAGGATGC CAGGGAACCCCGTCCCCACCGCGAGGGTCGCAGCCCCAGGGCCTGGGTTGGGGAGGATGC CAGGGAACCCCGTCCCCACCGCGAGGGTCGCAGCCCCAGGGCCTGGGTTGGGGAGGATGC ************************************************************
6480 6480 6480 6480 6480
P108 PAC M222 T9 T4
TGCGGGCGCGAGTGCGCCTGCGCGTGGCATCCGGGCCGGCTCTTCACGCCTCCTACCCGC TGCGGGCGCGAGTGCGCCTGCGCGTGGCATCCGGGCCGGCTCTTCACGCCTCCTACCCGC TGCGGGCGCGAGTGCGCCTGCGCGTGGCATCCGGGCCGGCTCTTCACGCCTCCTACCCGC TGCGGGCGCGAGTGCGCCTGCGCGTGGCATCCGGGCCGGCTCTTCACGCCTCCTACCCGC TGCGGGCGCGAGTGCGCCTGCGCGTGGCATCCGGGCCGGCTCTTCACGCCTCCTACCCGC ************************************************************
6540 6540 6540 6540 6540
120
P108 PAC M222 T9 T4
AGGCCGCTTCGCCGTGCGCGACATGAGGCAGACGGTGGCCGTGGGCGTCATCAAGAACGT AGGCCGCTTCGCCGTGCGCGACATGAGGCAGACGGTGGCCGTGGGCGTCATCAAGAACGT AGGCCGCTTCGCCGTGCGCGACATGAGGCAGACGGTGGCCGTGGGCGTCATCAAGAACGT AGGCCGCTTCGCCGTGCGCGACATGAGGCAGACGGTGGCCGTGGGCGTCATCAAGAACGT AGGCCGCTTCGCCGTGCGCGACATGAGGCAGACGGTGGCCGTGGGCGTCATCAAGAACGT ************************************************************
P108 PAC M222 T9 T4
GGAGAAGAAGAGCGGC GGAGAAGAAGAGCGGC GGAGAAGAAGAGCGGC GGAGAAGAAGAGCGGC GGAGAAGAAGAGCGGC ****************
6616 6616 6616 6616 6616
121
6600 6600 6600 6600 6600
Příloha 5: Sekvence genu EEF1A1 prasete (exony 1 – 8) Sus scrofa EEF1A1 gene for eukaryotic translation elongation factor 1 alpha, exons 1-8, breed Pietrain GenBank: FM995601.1 LOCUS
FM995601
6624 bp
DNA
DEFINITION
linear
MAM 09-FEB-2009
Sus scrofa EEF1A1 gene for eukaryotic translation elongation factor 1 alpha, exons 1-8, breed Pietrain. ACCESSION FM995601 VERSION FM995601.1 GI:223019598 KEYWORDS . SOURCE Sus scrofa (pig) ORGANISM Sus scrofa Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Suina; Suidae; Sus. REFERENCE 1 AUTHORS Svobodova,K., Horak,P., Stratil,A., Knoll,A., Van Poucke,M., Bartenschlager,H., Knorr,C., Peelman,L.J., Brenig,B. and Geldermann,H. TITLE The porcine EEF1A1 and EEF1A2 genes: structure, polymorphism, mapping and expression JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 6624) AUTHORS Knoll,A. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (04-FEB-2009) Knoll A., Dept. Morphol. Physiol. & Genet., Mendel Univ. Agricult. & Forestry, Zemedelska 1, Brno, 613 00, CZECH REPUBLIC FEATURES Location/Qualifiers source 1..6624 /organism="Sus scrofa" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:9823" /chromosome="1" /note="breed:Pietrain" TATA_signal 1461..1468 /note="inference=non-experimental evidence" gene 1491..4592 /gene="EEF1A1" mRNA join(1491..1523,2207..2385,2581..2760,2882..3178, 3262..3412,3501..3757,3846..4080,4181..4592) /gene="EEF1A1" /note="inference=similar to DNA sequence:AK222515" exon 1491..1523 /gene="EEF1A1" /number=1 intron 1524..2206 /gene="EEF1A1" /number=1 exon 2207..2385 /gene="EEF1A1" /number=2 CDS join(2242..2385,2581..2760,2882..3178,3262..3412, 3501..3757,3846..4080,4181..4305) /gene="EEF1A1" /function="GTP-binding protein that catalyzes binding of aminoacyl-tRNAs to the ribosome" /note="inference=similar to DNA sequence:AK222515" /codon_start=1 /product="eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1" /protein_id="CAX36487.1" /db_xref="GI:223019599"
122
intron exon intron exon intron exon intron exon intron exon intron exon polyA_signal
/db_xref="GOA:Q0PY11" /db_xref="InterPro:IPR000795" /db_xref="InterPro:IPR004160" /db_xref="InterPro:IPR004161" /db_xref="InterPro:IPR004539" /db_xref="InterPro:IPR009000" /db_xref="InterPro:IPR009001" /db_xref="UniProtKB/TrEMBL:Q0PY11" /translation="MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEK EAAEMGKGSFKYAWVLDKLKAERERGITIDISLWKFETSKYYVTIIDAPGHRDFIKNM ITGTSQADCAVLIVAAGVGEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIVGVNKMDSTEP PYSQKRYEEIVKEVSTYIKKIGYNPDTVAFVPISGWNGDNMLEPSANMPWFKGWKVTR KDGNASGTTLLEALDCILPPTRPTDKPLRLPLQDVYKIGGIGTVPVGRVETGVLKPGM VVTFAPVNVTTEVKSVEMHHEALSEALPGDNVGFNVKNVSVKDVRRGNVAGDSKNDPP MEAAGFTAQVIILNHPGQISAGYAPVLDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDGPK FLKSGDAAIVDMVPGKPMCVESFSDYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKAVDKKAAGAGK VTKSAQKAQKAK" 2386..2580 /gene="EEF1A1" /number=2 2581..2760 /gene="EEF1A1" /number=3 2761..2881 /gene="EEF1A1" /number=3 2882..3178 /gene="EEF1A1" /number=4 3179..3261 /gene="EEF1A1" /number=4 3262..3412 /gene="EEF1A1" /number=5 3413..3500 /gene="EEF1A1" /number=5 3501..3757 /gene="EEF1A1" /number=6 3758..3845 /gene="EEF1A1" /number=6 3846..4080 /gene="EEF1A1" /number=7 4081..4180 /gene="EEF1A1" /number=7 4181..4592 /gene="EEF1A1" /number=8 4573..4578 /gene="EEF1A1"
ORIGIN 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661
gaaactaaaa tacaaatttg gattgtgggt tagctctggc agtagtgctc ctctttcttc tgtcttgccc agccgtttat ggagtagtaa tcgtgtataa gtatacactg aataaaatta
ggactggaaa cttttaacta ttcttccccc cacatagtag tacacgtgga aggaatattt tggatttatg tcaaatggga attgggtgga gcactgaact gaaaaaaaat ggattagaag
aactagattc cttcccattg aaaggaagta gttctcaaat agagacgatc ttgaatatct cctaaaatgc taggccattt taagcttcct caaaaaattc gttaatagga taaagaaaac
tacaatggaa ctctatatat tttcttttgc atttgttgat tagtaattag gcctgattgc agtcacaatg ttgagaaaca ggcgctgtag tttttaggtt gggtagacac tgtagtactt
123
tagaaagtaa tagtttccct atatgcttcg agattggctc ctcatttaaa caaccaaaaa gataggacga gtgatttcac atcttagtct tttcatgctt acactcaggg aagtctattc
ggaagcacca tttccaatta gagccactct aaaaagttgc ataaaggttc ggcctcatct caaaagatga agcaaacgtt ctacttgaga gcaaccaaga tcttaaacgt taaactcaaa
721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741
aactggacgt gaaaaagcca ccactcgcgg gccttttacg cccggcagag accggtgggg gaccggttca agtaattcat actcccacta gtcatcctcc cgcacatcgc gtggaggtgg ccgagggtgg acgggtttgc ccggtggcca ggtcctgatt ggttccctac cgcgccttcg actgccaggg gcagacggcc ctgcgagcgc gcgcacaaag gggaggggct gggcgccggt tccggtcgtc atcgctaaaa ggacacgtcg atcgacaaaa tcagcaaatt gcaaagtttg attgcttcca atgggaaagg cgtggtatta atcattgatg gtttgtagga catggatctg ggctgactgt caagaacggg cattgttggc agagattgta agcatttgtg aagtggtttt attgatgatc ggcaatgcca ccaactgaca aacgttacac ctgtgctgtg tctcaaacct tgttgaaatg tgtcaaaaac tgacccacct taaactgcca ctaaggtgat attgccacac gttctgggaa tcgatatggt gtaagagtgc gaaagtgttt atgagacaga ggcaaggtca cctgccaccc ggccatttaa agaaggaaag attagttttt attttgagac gtaacttcct gatttgtgga actcaaatct
ctggagtacc agaggtcagc attctcggcc cctccctctc gaagcggctc tactgccggg gggaagattc acaaaaggag aacctagaac tggttgagag ccacggtccc cgcggggtaa gggaggacca cgccaggaca cggccttagc ccgagctgcg cgcgtgcccg cgcccgcccc cggcccagcc gcggcggggc ggaaagatgg ggccgggcgg gggcgccggg actaatgctc gggacagtag gctaagcaaa attcgggcaa gaaccatcga aagtggtagt ctaagtggct agtgggacta gctccttcaa ccattgacat ctccaggaca ttaagaactc tcctttttgg gctgtcctga cagacccgtg gttaacaaaa aaggaagtca ccaatttctg gatgagttct ttgtgtttta gtggaaccac agcccttgcg tcagctggta aatacttcag ggcatggtgg caccatgaag gtgtctgtca atggaagcag gaaccttaac tatcctgaac agctcacatt aaagctggaa tcctggcaag ctttttagtg ctcatggtga cagttgctgt ccaagtctgc cagtcttaat gtttaatagt gagaatgttt aaaatcagta ccattaaaaa atgaaggtaa tgtttttttc gcttaattac
acgtggtgtg gcaggagcct ctgaagaccg cagccggaag caggggttag taagggctcc tggacgcctc gactctcctc cgagtgagcg gagcatgcgc cgaagatggg actgggaaag tatataagcg caggtgagta gtgcctcccg ggcgggggga gtggcggcct gtctgtcttc gaggccgccc ggggcgggcg ccgctcccgg tgctgcccgc gcggccccgt cctggagttt tttaaagaag aatgggaaag gtccaccact aaagttcgaa tctctaaaac taactccagc aggagtttag gtatgcctgg ctccctgtgg cagagacttt ctgagagtaa agaggttttc ttgttgctgc agcatgctct tggattccac gcacctacat gctggaatgg caaaacttaa gatgccttgg actgcttgaa cctgcccctc tgggttgcag gtattggtac tcacctttgc ctttgagtga aagacgttcg ctggctttac tgtctaaatg catcctggcc gcctgcaagt gatggcccca cccatgtgtg taattaagct tttaattttt gggtgtcatc tcagaaagct cagtggtgga aaaagactgg tgtggaccat ctttttaatg aagtttaatg aggctggtca tgggtatgag agagccaagt
tagaacgaac gttcgccagg ccccgaggcc gggcgcggac tccttaacct catctcggtc cccgccgccc agccagggaa ctcgaccccg cgggcgccgt gggaggggac tggtgtcgtg ccgtggtccc cgggtgtggc gccccccgcg ggtggagaac gctggggcgc gcgctcgagt aaggtggcct gtcggagacc tctcaagatg gccgcttccc tcgctgggtg gcccttggct gtttttgtcg gagaagactc actggccatc aaagaggctg tagtgtatat caagtttagg ttaccgagta gtcttggaca aaattcgaga attaagaaca cattttgagt acagggtgtg tggtgttggt tctggcctac tgagccaccc taagaaaatt tgacaacatg gtctgggaag ttcaagggat gctctggatt caggacgtct tgatgtttgt agtccctgtg tccagtcaat agcccttcct tcgtggcaat agctcaggta tctaaaatgt agatcagtgc ttgctgaact agttcttgaa ttgagagctt tcagtaaaaa gttttaatag aaagctgtgg cagaaggcta agaacggtct ttaatgataa ttgttttttg gaaacaactt agaaacctgt taacctattt cttcatgttt gttggcacaa
124
ttagataaaa ctgttggtca cctgccgccg ggcaagggcg gcgagaccgc caactttgca caccccccag atcccaggga cctcccaccc gtgctcgtca ggcggtggaa tgctggctcc cgcgaacgtt ctccgtccgc cgtagagggc tcgaggccct cgtggccgcc tcggccggca ccgtgcccgg cagcgccccg gaggacgcgg gggactcgcg taggccgggc gttggggttg tcttaggtgt acatcaacat tgatctacaa cggaggtcgg ctgacttgaa agatggaagt acccttctta aactaaaggc ccagcaagta tgattacagg tatctataaa gccttttttt gaattcgaag accctgggtg tacagccaga ggctacaacc ctggagccaa ggataagttt ggaaagtcac gcattctacc acaaaattgg cttcatacga ggccgagtgg gttacaactg ggggacaacg gtggctggtg acacttcagt gctaaatgca tggttacgca gaaggagaag atctggtgat ctctgactat tggaaaagca gccgatttgc acaagaaggc aatgaatatt cagaactgtt caatgcatcg tgtgtggcag gaccaaaaat gtgttctttt ctagtgttac ctcaagactg cacttaatag
gaactgaatg gcaaactgag cggttccccg gtggagaagc aagactgagg gttaagctag ctgtgcggag ccgtcgataa accagcagtc gtgggctgaa ccggtgccgg gcccttttcc ctttttcgca atggcctccg tctgcgccct ccgctctcgc gcgtgcgatc gccgcgtgtt cggtcccggg cccgggcggg acggcgggcg gcccgggtgg agggcccgca tgcctgagtc cgtgaaagcc cgtcgtcatc atgcggtggg taaagtaacg ctagtacatt gaaacctagc atccctgcag tgaacgtgag ctacgtgacc cacttcccag ttggcgaaac cttttttaaa caggtatttc tgaaacagct agagatatga ctgatacagt gtgctaatgt gaaaacacta ccgtaaagat accaactcgt tggtaagttg gataattatg agaccggtgt aagtcaagtc tgggctttaa acagcaaaaa gacaggtttt aattttctcc cctgtgctgg attgatcgtc gctgccattg cctcctctgg gttatgtaga tgttcgtgac agctggagct atccccaata tgtctcaatt taaaaccttc tttttaagtt ctgtcacaga ggtcaacaga atagaaacaa tctacagaga gttaggatag
4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341 5401 5461 5521 5581 5641 5701 5761 5821 5881 5941 6001 6061 6121 6181 6241 6301 6361 6421 6481 6541 6601
ataagcaaac tgttgcataa ggggaatgtt ctcttaccct tgttacttag agattgccat ttgcagttaa acaacactgc atccttgggt ttgtgtattt gggaaattta ttgctaattt tgtattttcc tggtttgaaa gagctgatgg aaactacaga tgtctattat aaagtaactt aggtttttta aaccgcttga tgtattagag tgggaaaggc tatttttaaa tgacagttac agctgtctgg aagaatcaat cccgcccccc ccagatcctt ttaaataatc tttaaatgta aagtacgagg
aatgacttta gactatatag agaatcacat gcttggggca gtagaaattc actgaagatt gtgtatggta ttgctggaag gttgacaaca gatgaagcag cccagctgga tgcttaagtg tttatcactt agactgaaga aacagcaaat aagtaactca accagattgt ctctaggttc cacaaagttg ccttaaacta atgttgaaac attctggatt ctactgtggt ttaatcccat accaagaggg tcaggtgaat agcctatgca aactgttcag ccctcgactc atttttaagg tttgatgtag
tgtaagctag gttcataaat tgacagtact tcagagtcta tgaatagagg aaagaagcat gggtgaagaa gtcagaatct attgagggac tctataattc attttggtga tccaattaag aaccaaacat tggagacaaa ctgacaaagc gttctgaaga ctgatttgag agaatgaagt cctttccttt tattttaggt ttgtacccag aagagttttt taccagaata taacagaatt agatagataa aattcctttg cctggccagg ccaccaggga tcaaaactac cagaataaat cagc
gttgtaagaa tgagtaagtc ggagtaatgt gaaaaagtaa tttttatcta tttgaggaac gtttggaaac gaaaatggct ctgagttggg tgtgatattg aatcaccaga tatgtagatg ccctgaggcc atggcgttaa tggaggattt ggagcagggc caccacctac gtctttggtt tatttgaatg tggctagctg gaattctggt aacacaggtt ggcaatcttg tacctcccat aatttactgt aaactaccac ggtagaaccc attcccaaaa tgaagtcacc tgaccatact
125
cctcaaattg aaaagttgtt ggggtttcaa catgctggaa atgaacaagg tatggtgata gtgtaagtta caaaaagggt gtagttaagt gcttggcttt tgtattctat agaactttgc agctccactt gaattgctgg taaatccaac cacacacagt tggtcactac tttggggggg ataaaatttg ttgaaataca gcggtttcaa gccagtagta aataaattcg atctggtgca gaattaatca agactctaca atgccagggc ggcattaact tcagtttttt acaaatttta
tgaaaggtta tcccagtcat tagtattgag gtgcacttcc ttggtggaag gaagggccct acagctgttt catggttaat ctgagtacac tcagattaaa atggcttttt agttggaaga tcttagcctt ctgtcaagtg ccccgccctt tggtctacat aaagtaggtt ggggctcctg ctttataaaa gagtatagga gataggaaaa atacatttct ggccagatct tgagcagctt actcattccc cccccccccc aatgacaagg agatactgat ggatttttgt ggaagtgcca
Příloha 6: Sekvence genu EEF1A2 prasete Sus scrofa EEF1A2 gene for eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2, clone TAIGP714G09049Q GenBank: FM992107.1 LOCUS DEFINITION
FM992107 9965 bp DNA linear MAM 26-JAN-2009 Sus scrofa EEF1A2 gene for eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2, clone TAIGP714G09049Q. ACCESSION FM992107 VERSION FM992107.1 GI:222066101 KEYWORDS . SOURCE Sus scrofa (pig) ORGANISM Sus scrofa Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Suina; Suidae; Sus. REFERENCE 1 AUTHORS Svobodova,K., Horak,P., Stratil,A., Knoll,A., Van Poucke,M., Bartenschlager,H., Knorr,C., Peelman,L.J., Brenig,B. and Geldermann,H. TITLE The porcine EEF1A1 and EEF1A2 genes: structure, polymorphism, mapping and expression JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 9965) AUTHORS Svobodova,K. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (23-JAN-2009) Svobodova K., Dept. Morphol. Physiol. & Genet., Mendel Univ. Agricult. & Forestry, Zemedelska 1, Brno, 613 00, CZECH REPUBLIC FEATURES Location/Qualifiers source 1..9965 /organism="Sus scrofa" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:9823" /chromosome="17" /clone="TAIGP714G09049Q" /clone_lib="PAC-TAIGP714" /note="breed: German Landrace" gene 433..9020 /gene="EEF1A2" mRNA join(433..663,1995..2216,3722..3901,4311..4607,5252..5402, 6349..6605,7788..8022,8615..9020) /gene="EEF1A2" exon 433..663 /gene="EEF1A2" /number=1 intron 664..1994 /gene="EEF1A2" /number=1 exon 1995..2216 /gene="EEF1A2" /number=2 CDS join(2073..2216,3722..3901,4311..4607,5252..5402, 6349..6605,7788..8022,8615..8742) /gene="EEF1A2" /function="GTP-binding protein that catalyzes binding of aminoacyl-tRNAs to the ribosome" /inference="similar to DNA sequence:Ensembl:ENSG00000101210, transcript EEF1A2-201" /codon_start=1 /product="eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2" /protein_id="CAX28482.1" /db_xref="GI:222066102" /db_xref="GOA:B9W5V0"
126
intron exon intron exon intron exon intron exon intron repeat_region repeat_region repeat_region repeat_region
repeat_region repeat_region
exon intron
/db_xref="InterPro:IPR000795" /db_xref="InterPro:IPR004160" /db_xref="InterPro:IPR004161" /db_xref="InterPro:IPR004539" /db_xref="InterPro:IPR009000" /db_xref="InterPro:IPR009001" /db_xref="UniProtKB/TrEMBL:B9W5V0" /translation="MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEK EAAEMGKGSFKYAWVLDKLKAERERGITIDISLWKFETTKYYITIIDAPGHRDFIKNM ITGTSQADCAVLIVAAGVGEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIVGVNKMDSTEP AYSEKRYDEIVKEVSAYIKKIGYNPATVPFVPISGWHGDNMLEPSPNMPWFKGWKVER KEGNASGVSLLEALDTILPPTRPTDKPLRLPLQDVYKIGGIGTVPVGRVETGILRPGM VVTFAPVNITTEVKSVEMHHEALSEALPGDNVGFNVKNVSVKDIRRGNVCGDSKSDPP QEAAQFTSQVIILNHPGQISAGYSPVIDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDNPK SLKSGDAAIVEMVPGKPMCVESFSQYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKNVEKKSGGAGK VTKSAQKAQKAGK" 2217..3721 /gene="EEF1A2" /number=2 3722..3901 /gene="EEF1A2" /number=3 3902..4310 /gene="EEF1A2" /number=3 4311..4607 /gene="EEF1A2" /number=4 4608..5251 /gene="EEF1A2" /number=4 5252..5402 /gene="EEF1A2" /number=5 5403..6348 /gene="EEF1A2" /number=5 6349..6605 /gene="EEF1A2" /number=6 6606..7787 /gene="EEF1A2" /number=6 6875..6888 /gene="EEF1A2" /rpt_type=DIRECT 6889..7178 /gene="EEF1A2" /rpt_family="SINE (PRE-1)" 7179..7192 /gene="EEF1A2" /rpt_type=DIRECT 7198..7209 /gene="EEF1A2" /note="imperfect direct repeat" /rpt_type=OTHER 7210..7465 /gene="EEF1A2" /rpt_family="SINE (PRE-1)" 7466..7477 /gene="EEF1A2" /note="imperfect direct repeat" /rpt_type=OTHER 7788..8022 /gene="EEF1A2" /number=7 8023..8614 /gene="EEF1A2"
127
exon polyA_signal
/number=7 8615..9020 /gene="EEF1A2" /number=8 9003..9008 /gene="EEF1A2"
ORIGIN 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601
cccccggggc acggcccagt agtctggccc ctggggggtc ctgcgctttg ctgcccctcc ttttctctcc ccctcgccgc tccctgtatc ttgccgtact ccggagagat tgggtaagga cccggggacc gctcgccgcg ccctgagagg cgcacctcct cctgtgggat ctgggggtgc ggtccttgcc gtgccccttt gtttctcctt gaggggatgg ttggctgccg cctactgtcc ggcaccgcat gcagggacga tctccgtgtg ggactctggg catctcctga gggtgccttc atttacggct gggaggctcc ccgcctgtgc gccttgaccc tcgtgccagc ttgtggtcat aatgtggggg gcccggggcc gctgcctccc ggcctagagg ggggtctcgg gtgggggagg ggttgggttc tgtcccaggg cccatcagct ttgggggcct atcctctggt agctctggga ggggccaggg tgggggtgct gcagggtgtc cttccggcgt ctgggcacag gaggggagga ggcagggccc aaatcacaga ccaggatctg gggagggctg cttgcgcccc gggggcaggg agggccgcgg
agaagcctgg gctggcccca gctccgcccc tttctgcttc tccgtgctct tcccttctgc ccgcccgggc atcctcctct cctgcatccc gcaggggcgc aaaaccgccg cgctgggcct ggtccttagg gagatcgacc cctggggtgg gggcggcggc tggggaaggg cctccttgac accctgcccc tttgcccgct tgacctccag ccccctgtcc gggccagatc accctgtccc cacccagcct gccgaagatg gcagctctgg tcggggagca ctggtcatgg tttcacgggc cttggaccgt cgggggcccc aggcggtgtc acagagtccc ccctccccac cggccacgtg catcgacaag ccccctttgc agagcctggg cccccgcgtg ggggcagctc ggctggaggc ccgtgtcccc ctgggccagg ccattttcca ggcaaggatg gtccgaggcc ggagtcccct ctggggaggg cctgggcccc atgcaggtct ggccctggca gtgagggcca ggagcctcag tttcttgcta ggcgcttttt ggtgcggggc caaaccgcct ctgctggtgg cttggttgag caggagcgag
ggacactgct gggatgcagg tgcccccacc tctccccgcg gcctctggct ctccctctcg tccctccggg cgcgtccctg tcgcctcgcc agtgcattgc gcgccggcgc ccgggtcccc gacagagacc acccgccccg ggtgggggca gatccgcggc tcctcagcgc catagcaggg caccggggct ttcccttccc aatgggcagg ccaccaggct ctccctcctc catccaggga gagctctggc gcgtcgtcct ggtgggggtg agcactgggg ggctcaccca cacggggcgg gtggggctgc agtacatgcg tttgcggggc tgctcagcac cgcccgggca gactcgggca aggaccatcg ctccgccgtg tcacggcggc ggggctgtgc cctggggaga gcatatctgt agggctggag actcagggtg gtgcccggct agaggggccc ccggggaggt tcgggggccg gcggttgctg aaagctgtgt ggcagggccc gggcagtgac agggctgcca agcagccagg tctcatccga gtttggacag agggggagcc ggcagctagc gcgctggagc gtcagggtgt gggcctctct
128
ccatttgtaa ctgggggccg ggctcgcatc cgggagtgtg gtgggtctct ggtcccctgc tgcgtctcgg tcgcgcccgc gcccccggcc gcctgctccg ctccagtccc gcccccagct ggccggcccg cgccccgggt ccccggtggc agccgtgacc ggggggctgg tagggggagg gctgtgtcta cagccacctg ggctgtgacc gagggcatcc aggacagagc gggcctgagc ccagcctgct tgttagaggg gggtgagaga acagggcacg gcctgggtgt gggggggggc cccccagctc gagccctggc tcccctccct cccccttgcc cgatgggcaa agtccaccac agaagtttga gggatgggcg agatgacccc tcctcggagc tgcttggagg cccccctctg tctggggctg gctattaata tgttcagggt cactggctga ctgctctctg ctgtgagggc gcctgggctg ctctccttcc tagctgggca cgcagcccgg ggccggcttc gagcttcagc tttctttctc cctgaaaccc ggcttcggat tagcttctct ggctcccctt cccccgtccc gctgcgactc
atcaggctcc cccagactcc cctgcgccct cccgagcctg cccgccgcca tctctgcagc ctccgccttt gcgcgtccgc ccgcccgcgc tcaataggtg tctggctgag ttctgcagga gtgcctggca cccggcaccg gcttgtttat ttgggaaggc ggggctgctg cggtgagaag cctggggctg tcccctcctg ctgtcagcag ctggctggca agggaccccc tattctgggg ccctggtgcc agtgaaaagc ggggacagtg gagagccgag ctccatctct tctgtgggca tgcggggcag cccgcctcag cacgggtgcc ccaagccaga ggagaagacc caccggccac gaaggaggcg ctccttgtgg tggggcgggg gtccagatgg gggggatgga cagcgtgcct gaggtggcac gctgattgat ggcaccctgg cctccccttt tacccctccc ttccgcgggg aaccatgatt ctgcggggct gcctccctgg ccctgggcgt ccctgtgcag cgctgtagaa tctttttacc aggggtgtca aaaggggagc ccaagagcgg taggcggcag agagtcgggt gccgctcccg
aagcacgtgc ccacccggcg tcttctatga cggtctcagg ctctccgtct cgccgcctgt gtagttcgct gggctcgcgg gggtaccgca gacccccctc acctcggctc gggtcccttc cagcagcgct ggggtcggtc gcggcggctg tcgggggatc agggtgggcg agacccgagg gccccctagg ggctgcctag aggaaagggg tctgctgagc acccgcctgc ccctgatctg agcctgcccg actgaccgtc tcccagccca cagggtgagt ccagatgggg ccgcacagac gcacaggctg gacgcgcgcc tccccccccc gagccccagg cacatcaaca ctcatctaca gccgaggtga cagcccgtcc gggggggtgc gagtggctgg cctgcccctg gagcccccag tgtcctcgct gggcacccgg ggggagggtc cttgaagctg tccggcccca atgacaggct ttgcagacag gagggtgttt aggctgagcc gggggtctcg gtggggccgg agagctggaa ttaaaaaaac tcggctgacc cctcagccag ctcccaggcc gaggctggca ccggggtcct cagcccgggg
3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341 5401 5461 5521 5581 5641 5701 5761 5821 5881 5941 6001 6061 6121 6181 6241 6301 6361 6421 6481 6541 6601 6661 6721 6781 6841 6901 6961 7021 7081 7141 7201 7261 7321 7381 7441 7501 7561 7621 7681
ggacctgctg gatggggaag gcgcggcatc catcatcgac ggtgggcggg agcccgcgag cacctttgtc gtaaggacag ccctggaatg cagacagaca agaggggcct cagtgctgat agacccgcga tcaacaagat aggaggtcag ccatctcggg aggggcgggg ctcccccccc tgggtgtcag tcctctggcc ccccccatct gccagaggct gaggactcgg cgccatagga acccagggag gtgggacagg ctacaacagg gcggaaggaa ccccacacgc cggtgagtga cctcctgaga aggctgcact ctgtccctct cagctcagtg cgttgccctc acagccattc tgggggctcg tccacgccca caccgccagg caggaatagc ttcatgctgc gcgggacccc tcttcccgag ggcgtctccc gcaccccccg tgcctgtggg ccgtgaacat ccctgcccgg ggggcaacgt cccaggtgcg ggcgaggcgg gaggccgggc cagggggtcc gcaaggctct tatttattta agcatatgga gagccacagc gccggatcgc gtcggattgg acaaagtttg ccccaggcta acgggacccg cccactgagc ctcattgagc gttgaaatac ccctttcaaa ccagcctcgg ggtcagcacc
gccaggccag ggctccttca accatcgaca gcgccgggcc gcctcggggc cgagccgcag gcccctcgcc cccgccagcc ggggcagaaa gacagacaga gggcggggtc cgtggcggcg gcacgcgctg ggactccacg cgcctacatc ctggcacggc ctcctcgggc ccagccctcc agcccggtgg agggccgctc ctggacgccc ggctctctgc actgggcagg cagccgttct acttaacctg gccaccgacg tgccttcttc gggaatgcca cccacagaca agcctcttca accggctctg ctttccaggg gtccactccc cccagcccta cccctggagg atgagatggt cggccagcag cccggcacag gagaccagga ccccgagacg tgcctcggaa tctttcagac tcccttctcc tgtcccctca ccaggcctgc ccgagtggag caccactgag ggacaacgtc gtgtggggac cggcccgggg ctgcctggtg ggaggtggaa cacttcggtc cctctgtttt ttattattat ggttcccagg aacgcgggat taacccactg ttaaccactg tctgtttttc gaggtcgact agccttgtct agggccaggg cacagcggga gacagtcggg tgatgctctc gctctgtagg cagggcccct
ctgcgttggg agtacgcctg tctccctctg accgcgactt ctgggggcgg ctgggtctcc ctcaaagaac aggccccctt tgcccccaga cgcgggccct tgcggctcac ggagtgggcg ctggcctaca gagccggcct aagaagatcg gacaacatgc ccctcccaga caaggtcccg gacccccagc cccggggcgg cgtgtggtgg tggtcagctg aggtgatgag ggccaggctg gagccccgtg ggggtcaggg ctcccgccca gtggcgtgtc agcccctgcg gctgccctcc gcgaggagcc gaccacccac acctgcccat tgccagcagc tctggggcct acagaacctt gctgcggctg agaacgccac ggagccccct gcagcaccag ggagaggccc ggccctctcc cggaggggcc cctcctccat cttctcagcc acgggcatcc gtgaagtcgg ggcttcaacg agcaagtccg gccagagggc ccaggaagga cctcaggaag ctggaaatgc cactgcgcct tattttttgt ctaggggtcg cccagctgca agcaagggca cgccacgacg tttctctcct cagagctgca gtgacctaca atcaaacccg actccactac cccgggtttg ggtgtttatc tctgggggcc ggggtgggca
129
tccgtcctga ggtgctggac gaagttcgag catcaagaac ggcgagggcg tgtgcttcct tgaccacgtc caaggtcaga caatccagcg cagggggaga cctgacggcc agttcgaggc cgctgggcgt acagcgagaa gctacaaccc tggagccctc gggccctggg tggtgtggac ccccttccgt acgtcagaag ggctggttct gggagctgtg gggagcctga ggggaggcgg gtcggggttc aggccaaggc gatgccctgg cctgctggag cctgccgctg cagcccagcc tggggcaggg ccacctgtct cgggctgtcc gggtggcaca gtgggagaca gagcaagtat gagatgtcag caggctcggt gccgccgccc tactgggccg cggagagggg ttgcccgttt gggaagctcc gtggccaccc tccttcctct tccggccggg tggagatgca tgaagaacgt acccgcccca cgtcttccca ctcggatccc agccgacagg tgtaatcagc tctttggtca ctttttgcta aatcggagct tctgcaacct gggaccgaac ggaactcctg tctagggctt gctgccggcc ccacagctca catcctcgtg agtgtttaaa tctccctgct ttctgtggct tgggccccct gggcctcttc
gccgcgcccc aagctgaagg accaccaagt atgatcaccg cccatggggg ggcgaggcca tcagccgggc cacagaggcc tggccagggc ccccaggtgc tgcggggcag gggcatctct gaagcagctg gcgctacgac ggccaccgtg ccccaacgtg tccggcgggc acgtgcggtg tcagaagcct gcagccgccg caccttcccc gctctggctg gacccagcgc gcgtggaggg ctggtcgggc tggggggtgg ttcaagggct gctctggaca caggacgtgt gccggctctg ttatttctgc tcatccattc cgcaagggtc agggagccac tgatccactc gaggcccagg gcctgtgtgc aatgccacac tagggggcac ggtcaatcca aggcggtccc gccccgtgtt cacttctggc ctcccctgcc cgacgcaggc catggtggtg ccacgaggct gtcagtcaag ggaggccgcc ggcagcgcag cacgttagag gtgaccaggc ttatcgcctg tctctttatt tttctttggg gtagccaccg acaccacagc ccgcaacctc gtcatctctt cacccgtggc tgccccacag tggcaatgcc gatactagtt attggcttta ccttcggctc tttcagaccc ggagcctgac cagcctggtg
cacccctcca cggagcgcga actacatcac gcacctccca gggggggcgg ggggacccct gagggcgcct aggacggggg atcacccaga cagactcccc gcggactgcg aagaacgggc atcgtcggcg gagatcgtca cccttcgtgc agtgcccagc acagacgggt ccagccccgg ctgcatcccc ctgccgcccg aggatcaggg cgggtgtcct ctggcaaggg ggccaaggag tgggtctcac gggaggggcg ggaaagtgga ccatcctgcc acaagattgg ccctcagacc ctctcccccg atctgtctgt ctccttcctc acgttgccct cagaaggaga agggcagcgg agactggggg gagccgctgt cgtacctctt gggggaccgg tggggcaggg atgggcactc cgaatgtctc agggcgaagg attggcactg accttcgcgc ctgagcgagg gacatccgtc cagttcactt ggctgtcctc acgggccgtc tgcccagcct gggcccatct tatttattta ccgctcccgc gcctacgcca tcacggcaac atggttccta taacgtgact atatggagat ccacagcccc agatccttaa gggttcttaa ctgaggtatg tggcctctgg ttgaagacaa cgttctccag ccctcctctg
7741 7801 7861 7921 7981 8041 8101 8161 8221 8281 8341 8401 8461 8521 8581 8641 8701 8761 8821 8881 8941 9001 9061 9121 9181 9241 9301 9361 9421 9481 9541 9601 9661 9721 9781 9841 9901 9961
gtgcccaccc accacccggg tcgcctgcaa aggacaaccc agcccatgtg tggcgggccc tttgctgcag cacacgtggc agggagtggt caactggcct taatgccagg ccatttactt cccgtactcc cgcagcccca atccgggccg cagacggtgg gtcaccaagt gcgaccctcc cgcggcccca gctctccgtc aagcgccccc ccaataaact gccgtgcggg agcggcccac acccagggtg ccccctgtgg aaagtttggg ctcacacaca tactgccccc cttggtacgg aagcaccggg cggcagtgcg gcccacagca agtcccctgg gaaccgtctc agaggctcca cctggcttgt ctggg
ggggcagggc gcagatcagc gtttgccgag caagtccctg tgtggagagc aggccaaggg cactgagaac cccactaggt ccaaggccca ccctcacaga gtggggccac ctggcaactg accctgtccc gggcctgggt gctcttcacg ccgtgggcgt cggcgcagaa ccggcggcgc ggcgccccgc agcgactgga gccgccccgg gagcgacccc agggcgcgcc tcggcaccca ggctgtgggc ggggatccaa ggtctctctg ctgtgcttcg accgccaccc caggaactgc gggctggcag cgtgcggggg ggtctgggct ggctgcagca agtccatacc gggagggtct ggccacattc
tgatggcctc gccggctact ctcaaggaga aagtctggcg ttctcccagt caggagaccc tcagtaggag gggcctgaaa cagctagtct taccctagga cgtcaaaaca tgccttgacg cggaaacagg tggggaggat cctcctaccc catcaagaac ggcgcagaag cgcgccccgc ccccccgcca tgctggccat cttccgcgtc ggaaccgtgt ttcgtacccc ctggccctgc cgctgggtct ggcaaagact agaatgggat cccgggtctt ccgagccggt agccccagaa gaccacgccc tcagggtgag ggggagagga acaaatggac actgggacag gtcctgtgcc ctgcaacctc
130
tgccactctg caccggtcat agattgaccg acgcggccat acccgcccct ctgggtgggg actcccggcc tggtgtcccc cgaggcagag tgacccacag gccgagcgtg gagtcctatg cgcagggaac gctgcgggcg gcaggccgct gtggagaaga gcgggcaagt cctcggcccc ggcgcatgtc caaggtccag cagccttcgc gtgcgcctgc ccacccggcc ggccgatctg ggagtccaga gggtcactgc gagcccagag ccggctccct cactgtggct accccagaac tgcccagcca gatgagctgg gcaggccagc tgcaagctgg actccagtgc tcttgcggct tgcctccacg
cccgcaggtc tgactgccac gcgctctggc tgtagagatg cggtgagccg ggggggggtg ttggcctttg tctgcaaagg tcagactgac acctgtattg ttctcggcat tgcatctaag cccgtcccca cgagtgcgcc tcgccgtgcg agagcggcgg gaagcgcggg gcccccggcc tgtacctccg tggaagttct cacgctcagt tgctgggggg ccccaccaag gccaggtgtc gggtgagggg ggagctgcag cccctccccc ggctcttgga ggaggctcct aagccctgac tgcctgcgcc ttccgacgac cacagggtcc cagctgaaaa aggcagggtc tctggtggct gtcgcatggg
atcattctga acggcccaca aagaagctgg gtccctggga ggaggggagg gatcctgaac tctcccggag aagtccccta ctcctgcctc gagagctgcc ggttcacagg tagatgggag ccgcgagggt tgcgcgtggc cgacatgagg cgccggcaag cgcccgcggc ccgcccccgg cttgtaagag ttaagaggaa gtccgtttta tgggcggccc ctgctagccc cacctgcact actttggggt aaggggattg gcgagtggct agcccagtct cagcgcggtc cttggtcagc cagaaagcag ggacacagct cctgggattg ccacatacac tgctccctcc gcccaagttc ctcatcttct
Příloha 7: Porovnání kódující sekvence genů EEF1A1 (NM_001097418) a EEF1A2 (FM992107) a umístění primerů pro multiplex PCR a real time RT-PCR
CLUSTAL 2.1 Multiple Sequence Alignments Sequence 1: eEF1A1_CDS 1389 aa Sequence 2: eEF1A2_PAC_CDS 1392 aa Sequences (1:2) Aligned. Score: 78 EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
ATGGGAAAGGAGAAGACTCACATCAACATCGTCGTCATCGGACACGTCGATTCGGGCAAG 60 ATGGGCAAGGAGAAGACCCACATCAACATTGTGGTCATCGGCCACGTGGACTCGGGCAAG 60 *****.*********** *********** ** ********.***** ** *********
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
TCCACCACTACTGGCCATCTGATCTACAAATGCGGTGGGATCGACAAAAGAACCATCGAA 120 TCCACCACCACCGGCCACCTCATCTACAAATGTGGGGGCATCGACAAGAGGACCATCGAG 120 ******** ** ***** ** *********** ** ** ********.**.********.
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
AAGTTCGAAAAAGAGGCTGCGGAGATGGGAAAGGGCTCCTTCAAGTATGCCTGGGTCTTG 180 AAGTTTGAGAAGGAGGCGGCCGAGATGGGGAAGGGCTCCTTCAAGTACGCCTGGGTGCTG 180 ***** **.**.***** ** ********.***************** ******** **
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
GACAAACTAAAGGCTGAACGTGAGCGTGGTATTACCATTGACATCTCCCTGTGGAAATTC 240 GACAAGCTGAAGGCGGAGCGCGAGCGCGGCATCACCATCGACATCTCCCTCTGGAAGTTC 240 *****.**.***** **.** ***** ** ** ***** *********** *****.***
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
GAGACCAGCAAGTACTACGTGACCATCATTGATGCTCCAGGACACAGAGACTTTATTAAG 300 GAGACCACCAAGTACTACATCACCATCATCGACGCGCCGGGCCACCGCGACTTCATCAAG 300 ******* **********.* ******** ** ** **.**.***.*.***** ** ***
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
AACATGATTACAGGCACTTCCCAGGCTGACTGTGCTGTCCTGATTGTTGCTGCTGGTGTT 360 AACATGATCACCGGCACCTCCCAGGCGGACTGCGCAGTGCTGATCGTGGCGGCGGGAGTG 360 ******** **.***** ******** ***** **:** ***** ** ** ** **:**
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
GGTGAATTCGAAGCAGGTATTTCCAAGAACGGGCAGACCCGTGAGCATGCTCTTCTGGCC 420 GGCGAGTTCGAGGCGGGCATCTCTAAGAACGGGCAGACCCGCGAGCACGCGCTGCTGGCC 420 ** **.*****.**.** ** ** ***************** ***** ** ** ******
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
TACACCCTGGGTGTGAAACAGCTCATTGTTGGCGTTAACAAAATGGATTCCACTGAGCCA 480 TACACGCTGGGCGTGAAGCAGCTGATCGTCGGCGTCAACAAGATGGACTCCACGGAGCCG 480 ***** ***** *****.***** ** ** ***** *****.***** ***** *****.
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
CCCTACAGCCAGAAGAGATATGAAGAGATTGTAAAGGAAGTCAGCACCTACATTAAGAAA 540 GCCTACAGCGAGAAGCGCTACGACGAGATCGTCAAGGAGGTCAGCGCCTACATCAAGAAG 540 ******** *****.*.** **.***** **.*****.******.******* *****.
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
ATTGGCTACAACCCTGATACAGTAGCATTTGTGCCAATTTCTGGCTGGAATGGTGACAAC 600 ATCGGCTACAACCCGGCCACCGTGCCCTTCGTGCCCATCTCGGGCTGGCACGGCGACAAC 600 ** *********** *. **.**. *.** *****.** ** ******.* ** ******
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
ATGCTGGAGCCAAGTGCTAATATGCCTTGGTTCAAGGGATGGAAAGTCACCCGTAAAGAT 660 ATGCTGGAGCCCTCCCCCAACATGCCCTGGTTCAAGGGCTGGAAAGTGGAGCGGAAGGAA 660 ***********.: * ** ***** ***********.******** .. ** **.**:
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
GGCAATGCCAGTGGAACCACACTGCTTGAAGCTCTGGATTGCATTCTACCACCAACTCGT 720 GGGAATGCCAGTGGCGTGTCCCTGCTGGAGGCTCTGGACACCATCCTGCCCCCCACACGC 720 ** ***********.. :*.***** **.******** : *** **.**.**.**:**
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
CCAACTGACAAGCCCTTGCGCCTGCCCCTCCAGGACGTCTACAAAATTGGTGGTATTGGT 780 CCCACAGACAAGCCCCTGCGCCTGCCGCTGCAGGACGTGTACAAGATTGGCGGCATTGGC 780 **.**:********* ********** ** ******** *****.***** ** *****
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
ACAGTCCCTGTGGGCCGAGTGGAGACCGGTGTTCTCAAACCTGGCATGGTGGTCACCTTT 840 EEF 11B ACTGTGCCTGTGGGCCGAGTGGAGACGGGCATCCTCCGGCCGGGCATGGTGGTGACCTTC 840 **:** ******************** ** .* ***...** *********** *****
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
GCTCCAGTCAATGTTACAACTGAAGTCAAGTCTGTTGAAATGCACCATGAAGCTTTGAGT 900 GCGCCCGTGAACATCACCACTGAGGTGAAGTCGGTGGAGATGCACCACGAGGCTCTGAGC 900 ** **.** ** .* **.*****.** ***** ** **.******** **.*** ****
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
GAAGCCCTTCCTGGGGACAACGTGGGCTTTAATGTCAAAAACGTGTCTGTCAAAGACGTT 960 GAGGCCCTGCCCGGGGACAACGTCGGCTTCAACGTGAAGAACGTGTCAGTCAAGGACATC 960 EEF2 7A **.***** ** *********** ***** ** ** **.********:*****.***.*
131
EEF 11A
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
CGTCGTGGCAATGTGGCTGGTGACAGCAAAAATGACCCACCTATGGAAGCAGCTGGCTTT 1020 CGTCGGGGCAACGTGTGTGGGGACAGCAAGTCCGACCCGCCCCAGGAGGCCGCCCAGTTC 1020 ***** ***** *** *** ********.:. *****.** .:***.**.** . **
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
ACAGCTCAGGTGATTATCCTGAACCATCCTGGCCAGATCAGTGCTGGTTACGCACCTGTG 1080 ACTTCCCAGGTCATCATTCTGAACCACCCGGGGCAGATCAGCGCCGGCTACTCACCGGTC 1080 **: * ***** ** ** ******** ** ** ******** ** ** *** **** ** EEF2 7B
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
CTGGATTGCCACACAGCTCACATTGCCTGCAAGTTTGCTGAACTGAAGGAGAAGATTGAT 1140 ATTGACTGCCACACGGCCCACATCGCCTGCAAGTTTGCCGAGCTCAAGGAGAAGATTGAC 1140 .* ** ********.** ***** ************** **.** **************
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
CGTCGTTCTGGGAAAAAGCTGGAAGATGGCCCCAAGTTCTTGAAATCTGGTGATGCTGCC 1200 CGGCGCTCTGGCAAGAAGCTGGAGGACAACCCCAAGTCCCTGAAGTCTGGCGACGCGGCC 1200 ** ** ***** **.********.** ..******** * ****.***** ** ** ***
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
ATTGTCGATATGGTTCCTGGCAAGCCCATGTGTGTTGAGAGCTTCTCTGACTATCCTCCT 1260 ATTGTAGAGATGGTCCCTGGGAAGCCCATGTGTGTGGAGAGCTTCTCCCAGTACCCGCCC 1260 *****.** ***** ***** ************** *********** * ** ** **
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
CTGGGCCGATTTGCTGTTCGTGACATGAGACAGACAGTTGCTGTGGGTGTCATCAAAGCT 1320 CTCGGCCGCTTCGCCGTGCGCGACATGAGGCAGACGGTGGCCGTGGGCGTCATCAAGAAC 1320 ** *****.** ** ** ** ********.*****.** ** ***** ********...
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
GTGGACAAGAAGGCAGCTGGAGCTGGCAAGGTCACCAAGTCTGCTCAGAAAGCTCAGAAG 1380 GTGGAGAAGAAGAGCGGCGGCGCCGGCAAGGTCACCAAGTCGGCGCAGAAGGCGCAGAAG 1380 ***** ******. .* **.** ***************** ** *****.** ******
EEF1A1_CDS EEF1A2_PAC_CDS
GCT---AAATGA 1389 GCGGGCAAGTGA 1392 ** **.***
132
Příloha 8: Porovnání aminokyselinové sekvence eEF1A1 a eEF1A2 prasete CLUSTAL 2.1 Multiple Sequence Alignments Sequence 1: eEF1A1 462 aa Sequence 2: eEF1A2 463 aa Sequences (1:2) Aligned. Score: 92 eEF1A1 eEF1A2
MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMGKGSFKYAWVL 60 MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMGKGSFKYAWVL 60 ************************************************************
eEF1A1 eEF1A2
DKLKAERERGITIDISLWKFETSKYYVTIIDAPGHRDFIKNMITGTSQADCAVLIVAAGV 120 DKLKAERERGITIDISLWKFETTKYYITIIDAPGHRDFIKNMITGTSQADCAVLIVAAGV 120 **********************:***:*********************************
eEF1A1 eEF1A2
GEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIVGVNKMDSTEPPYSQKRYEEIVKEVSTYIKK 180 GEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIVGVNKMDSTEPAYSEKRYDEIVKEVSAYIKK 180 ****************************************.**:***:*******:****
eEF1A1 eEF1A2
IGYNPDTVAFVPISGWNGDNMLEPSANMPWFKGWKVTRKDGNASGTTLLEALDCILPPTR 240 IGYNPATVPFVPISGWHGDNMLEPSPNMPWFKGWKVERKEGNASGVSLLEALDTILPPTR 240 ***** **.*******:********.********** **:*****.:****** ******
eEF1A1 eEF1A2
PTDKPLRLPLQDVYKIGGIGTVPVGRVETGVLKPGMVVTFAPVNVTTEVKSVEMHHEALS 300 PTDKPLRLPLQDVYKIGGIGTVPVGRVETGILRPGMVVTFAPVNITTEVKSVEMHHEALS 300 ******************************:*:***********:***************
eEF1A1 eEF1A2
EALPGDNVGFNVKNVSVKDVRRGNVAGDSKNDPPMEAAGFTAQVIILNHPGQISAGYAPV 360 EALPGDNVGFNVKNVSVKDIRRGNVCGDSKSDPPQEAAQFTSQVIILNHPGQISAGYSPV 360 *******************:*****.****.*** *** **:***************:**
eEF1A1 eEF1A2
LDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDGPKFLKSGDAAIVDMVPGKPMCVESFSDYPP 420 IDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDNPKSLKSGDAAIVEMVPGKPMCVESFSQYPP 420 :****************************.** *********:*************:***
eEF1A1 eEF1A2
LGRFAVRDMRQTVAVGVIKAVDKKAAGAGKVTKSAQKAQKA-K 462 LGRFAVRDMRQTVAVGVIKNVEKKSGGAGKVTKSAQKAQKAGK 463 ******************* *:**:.*************** *
133
Příloha 9: Porovnání aminokyselinové sekvence eEF1A1 a eEF1A2 u prasete, člověka, myši a skotu Podobnost aminokyselinové sekvence proteinů eEF1A1 a eEF1A2 (%) u čtyř druhů ţivočichů eEF1A1 eEF1A2 eEF1A1 eEF1A2 eEF1A1 eEF1A2 eEF1A1 eEF1A2 SS SS HS HS MM MM BT BT eEF1A1 SS 92 100 92 99 92 100 92 eEF1A2 SS 92 92 100 92 99 92 100 eEF1A1 HS 100 92 92 99 92 100 92 eEF1A2 HS 92 100 92 92 99 92 100 eEF1A1 MM 99 92 99 92 92 99 92 eEF1A2 MM 92 99 92 99 92 92 99 eEF1A1 BT 100 92 100 92 99 92 92 eEF1A2 BT 92 100 92 100 92 99 92 Pozn.: SS – Sus scrofa, HS – Homo sapiens, MM – Mus musculs, BT – Bos taurus sekvence získány z databáze Pubmed: SS: eEF1A1 - NP_001393.1, eEF1A2 - CAX28482.1 HS: eEF1A1 - NP_001393.1, eEF1A2 - NP_001949 MM: eEF1A1 - NP_034236.2, eEF1A2 - NP_031932.1 BT: eEF1A1 - NP_776960.1, eEF1A2 - NP_001032541.1
CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment eEF1A1_HS_NP_001393.1 eEF1A1_BT_NP_776960.1 eEF1A1_SS_NP_001090887.1 eEF1A1_MM_NP_034236.2 eEF1A2_SS_CAX28482.1 eEF1A2_HS_NP_001949 eEF1A2_BT_NP_001032541.1 eEF1A2_MM_NP_031932.1
MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMG MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMG MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMG MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMG MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMG MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMG MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMG MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMG **************************************************
50 50 50 50 50 50 50 50
eEF1A1_HS_NP_001393.1 eEF1A1_BT_NP_776960.1 eEF1A1_SS_NP_001090887.1 eEF1A1_MM_NP_034236.2 eEF1A2_SS_CAX28482.1 eEF1A2_HS_NP_001949 eEF1A2_BT_NP_001032541.1 eEF1A2_MM_NP_031932.1
KGSFKYAWVLDKLKAERERGITIDISLWKFETSKYYVTIIDAPGHRDFIK KGSFKYAWVLDKLKAERERGITIDISLWKFETSKYYVTIIDAPGHRDFIK KGSFKYAWVLDKLKAERERGITIDISLWKFETSKYYVTIIDAPGHRDFIK KGSFKYAWVLDKLKAERERGITIDISLWKFETSKYYVTIIDAPGHRDFIK KGSFKYAWVLDKLKAERERGITIDISLWKFETTKYYITIIDAPGHRDFIK KGSFKYAWVLDKLKAERERGITIDISLWKFETTKYYITIIDAPGHRDFIK KGSFKYAWVLDKLKAERERGITIDISLWKFETTKYYITIIDAPGHRDFIK KGSFKYAWVLDKLKAERERGITIDISLWKFETTKYYITIIDAPGHRDFIK ********************************:***:*************
100 100 100 100 100 100 100 100
eEF1A1_HS_NP_001393.1 eEF1A1_BT_NP_776960.1 eEF1A1_SS_NP_001090887.1 eEF1A1_MM_NP_034236.2 eEF1A2_SS_CAX28482.1 eEF1A2_HS_NP_001949 eEF1A2_BT_NP_001032541.1 eEF1A2_MM_NP_031932.1
NMITGTSQADCAVLIVAAGVGEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIV NMITGTSQADCAVLIVAAGVGEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIV NMITGTSQADCAVLIVAAGVGEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIV NMITGTSQADCAVLIVAAGVGEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIV NMITGTSQADCAVLIVAAGVGEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIV NMITGTSQADCAVLIVAAGVGEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIV NMITGTSQADCAVLIVAAGVGEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIV NMITGTSQADCAVLIVAAGVGEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIV **************************************************
150 150 150 150 150 150 150 150
eEF1A1_HS_NP_001393.1 eEF1A1_BT_NP_776960.1 eEF1A1_SS_NP_001090887.1 eEF1A1_MM_NP_034236.2 eEF1A2_SS_CAX28482.1 eEF1A2_HS_NP_001949 eEF1A2_BT_NP_001032541.1 eEF1A2_MM_NP_031932.1
GVNKMDSTEPPYSQKRYEEIVKEVSTYIKKIGYNPDTVAFVPISGWNGDN GVNKMDSTEPPYSQKRYEEIVKEVSTYIKKIGYNPDTVAFVPISGWNGDN GVNKMDSTEPPYSQKRYEEIVKEVSTYIKKIGYNPDTVAFVPISGWNGDN GVNKMDSTEPPYSQKRYEEIVKEVSTYIKKIGYNPDTVAFVPISGWNGDN GVNKMDSTEPAYSEKRYDEIVKEVSAYIKKIGYNPATVPFVPISGWHGDN GVNKMDSTEPAYSEKRYDEIVKEVSAYIKKIGYNPATVPFVPISGWHGDN GVNKMDSTEPAYSEKRYDEIVKEVSAYIKKIGYNPATVPFVPISGWHGDN GVNKMDSTEPAYSEKRYDEIVKEVSAYIKKIGYNPATVPFVPISGWHGDN **********.**:***:*******:********* **.*******:***
200 200 200 200 200 200 200 200
134
eEF1A1_HS_NP_001393.1 eEF1A1_BT_NP_776960.1 eEF1A1_SS_NP_001090887.1 eEF1A1_MM_NP_034236.2 eEF1A2_SS_CAX28482.1 eEF1A2_HS_NP_001949 eEF1A2_BT_NP_001032541.1 eEF1A2_MM_NP_031932.1
MLEPSANMPWFKGWKVTRKDGNASGTTLLEALDCILPPTRPTDKPLRLPL MLEPSANMPWFKGWKVTRKDGNASGTTLLEALDCILPPTRPTDKPLRLPL MLEPSANMPWFKGWKVTRKDGNASGTTLLEALDCILPPTRPTDKPLRLPL MLEPSANMPWFKGWKVTRKDGSASGTTLLEALDCILPPTRPTDKPLRLPL MLEPSPNMPWFKGWKVERKEGNASGVSLLEALDTILPPTRPTDKPLRLPL MLEPSPNMPWFKGWKVERKEGNASGVSLLEALDTILPPTRPTDKPLRLPL MLEPSPNMPWFKGWKVERKEGNASGVSLLEALDTILPPTRPTDKPLRLPL MLEPSPNMPWFKGWKVERKEGNASGVSLLEALDTILPPTRPTDKPLRLPL *****.********** **:*.***.:****** ****************
250 250 250 250 250 250 250 250
eEF1A1_HS_NP_001393.1 eEF1A1_BT_NP_776960.1 eEF1A1_SS_NP_001090887.1 eEF1A1_MM_NP_034236.2 eEF1A2_SS_CAX28482.1 eEF1A2_HS_NP_001949 eEF1A2_BT_NP_001032541.1 eEF1A2_MM_NP_031932.1
QDVYKIGGIGTVPVGRVETGVLKPGMVVTFAPVNVTTEVKSVEMHHEALS QDVYKIGGIGTVPVGRVETGVLKPGMVVTFAPVNVTTEVKSVEMHHEALS QDVYKIGGIGTVPVGRVETGVLKPGMVVTFAPVNVTTEVKSVEMHHEALS QDVYKIGGIGTVPVGRVETGVLKPGMVVTFAPVNVTTEVKSVEMHHEALS QDVYKIGGIGTVPVGRVETGILRPGMVVTFAPVNITTEVKSVEMHHEALS QDVYKIGGIGTVPVGRVETGILRPGMVVTFAPVNITTEVKSVEMHHEALS QDVYKIGGIGTVPVGRVETGILRPGMVVTFAPVNITTEVKSVEMHHEALS QDVYKIGGIGTVPVGRVETGILRPGMVVTFAPVNITTEVKSVEMHHEALS ********************:*:***********:***************
300 300 300 300 300 300 300 300
eEF1A1_HS_NP_001393.1 eEF1A1_BT_NP_776960.1 eEF1A1_SS_NP_001090887.1 eEF1A1_MM_NP_034236.2 eEF1A2_SS_CAX28482.1 eEF1A2_HS_NP_001949 eEF1A2_BT_NP_001032541.1 eEF1A2_MM_NP_031932.1
EALPGDNVGFNVKNVSVKDVRRGNVAGDSKNDPPMEAAGFTAQVIILNHP EALPGDNVGFNVKNVSVKDVRRGNVAGDSKNDPPMEAAGFTAQVIILNHP EALPGDNVGFNVKNVSVKDVRRGNVAGDSKNDPPMEAAGFTAQVIILNHP EALPGDNVGFNVKNVSVKDVRRGNVAGDSKNDPPMEAAGFTAQVIILNHP EALPGDNVGFNVKNVSVKDIRRGNVCGDSKSDPPQEAAQFTSQVIILNHP EALPGDNVGFNVKNVSVKDIRRGNVCGDSKSDPPQEAAQFTSQVIILNHP EALPGDNVGFNVKNVSVKDIRRGNVCGDSKSDPPQEAAQFTSQVIILNHP EALPGDNVGFNVKNVSVKDIRRGNVCGDSKADPPQEAAQFTSQVIILNHP *******************:*****.**** *** *** **:********
350 350 350 350 350 350 350 350
eEF1A1_HS_NP_001393.1 eEF1A1_BT_NP_776960.1 eEF1A1_SS_NP_001090887.1 eEF1A1_MM_NP_034236.2 eEF1A2_SS_CAX28482.1 eEF1A2_HS_NP_001949 eEF1A2_BT_NP_001032541.1 eEF1A2_MM_NP_031932.1
GQISAGYAPVLDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDGPKFLKSGDAA GQISAGYAPVLDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDGPKFLKSGDAA GQISAGYAPVLDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDGPKFLKSGDAA GQISAGYAPVLDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDGPKFLKSGDAA GQISAGYSPVIDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDNPKSLKSGDAA GQISAGYSPVIDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDNPKSLKSGDAA GQISAGYSPVIDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDNPKSLKSGDAA GQISAGYSPVIDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDNPKSLKSGDAA *******:**:****************************.** *******
400 400 400 400 400 400 400 400
eEF1A1_HS_NP_001393.1 eEF1A1_BT_NP_776960.1 eEF1A1_SS_NP_001090887.1 eEF1A1_MM_NP_034236.2 eEF1A2_SS_CAX28482.1 eEF1A2_HS_NP_001949 eEF1A2_BT_NP_001032541.1 eEF1A2_MM_NP_031932.1
IVDMVPGKPMCVESFSDYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKAVDKKAAGAGK IVDMVPGKPMCVESFSDYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKAVDKKAAGAGK IVDMVPGKPMCVESFSDYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKAVDKKAAGAGK IVDMVPGKPMCVESFSDYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKAVDKKAAGAGK IVEMVPGKPMCVESFSQYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKNVEKKSGGAGK IVEMVPGKPMCVESFSQYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKNVEKKSGGAGK IVEMVPGKPMCVESFSQYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKNVEKKSGGAGK IVEMVPGKPMCVESFSQYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKNVEKKSGGAGK **:*************:********************** *:**:.****
450 450 450 450 450 450 450 450
eEF1A1_HS_NP_001393.1 eEF1A1_BT_NP_776960.1 eEF1A1_SS_NP_001090887.1 eEF1A1_MM_NP_034236.2 eEF1A2_SS_CAX28482.1 eEF1A2_HS_NP_001949 eEF1A2_BT_NP_001032541.1 eEF1A2_MM_NP_031932.1
VTKSAQKAQKA-K VTKSAQKAQKA-K VTKSAQKAQKA-K VTKSAQKAQKA-K VTKSAQKAQKAGK VTKSAQKAQKAGK VTKSAQKAQKAGK VTKSAQKAQKAGK *********** *
462 462 462 462 463 463 463 463
135
Příloha 10: Relativní kvantifikace exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v testovaných tkáních Hodnoty relativní kvantifikace hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v různých tkáních ve vztahu ke svalovině dospělého jedince vzorek sval_P sval_S1 sval_S7 sval_S14 sval_D
EEF1A1 RQ min 3,44 2,80 2,54 1,57 2,15 1,50 1,77 0,97 1,00 0,70
max 4,23 4,11 3,09 3,22 1,43
vzorek sval_P sval_S1 sval_S7 sval_S14 sval_D
EEF1A2 RQ min max 0,000460 0,000347 0,000609 0,34 0,23 0,50 0,46 0,31 0,69 1,46 1,08 1,97 1,00 0,72 1,40
srdce_S1 srdce_S7 srdce_S14 srdce_D
1,72 1,35 1,58 0,18
1,30 1,09 0,92 0,12
2,27 1,68 2,72 0,27
srdce_S1 srdce_S7 srdce_S14 srdce_D
0,35 0,42 0,31 0,21
0,27 0,36 0,16 0,15
0,45 0,50 0,61 0,28
mozek_S1 mozek_S7 mozek_S14 mozek_D
0,23 0,16 0,26 0,12
0,16 0,07 0,19 0,08
0,32 0,36 0,36 0,19
mozek_S1 mozek_S7 mozek_S14 mozek_D
0,04 0,04 0,07 0,02
0,03 0,02 0,04 0,01
0,06 0,10 0,12 0,03
játra_S1 játra_S7 játra_S14 játra_D
0,05 0,08 0,12 0,20
0,04 0,05 0,08 0,10
0,06 0,12 0,17 0,40
játra_S1 játra_S7 játra_S14 játra_D
3,5×10-6 2,9×10-6 1,9×10-6 0,8×10-6
1,6×10-6 0,5×10-6 0,5×10-6
5,1×10-6 7,4×10-6 1,5×10-6
ledvina_S1 ledvina_S7 ledvina_S14 ledvina_D
1,12 1,15 0,65 1,06
0,66 0,52 0,16 0,89
1,89 2,56 2,70 1,28
ledvina_S1 ledvina_S7 ledvina_S14 ledvina_D
8,0×10-5 1,1×10-5 3,3×10-5 2,1×10-5
2,2×10-5 29,7×10-5 0,6×10-5 2,2×10-5 1,1×10-5 9,8×10-5 1,5×10-5 2,8×10-5
1,1×10-5 0,8×10-5 1,4×10-5 plíce_S1 2,79 2,59 3,01 plíce_S1 4,6×10-5 1,3×10-5 16,7×10-5 plíce_S7 1,35 0,61 2,98 plíce_S7 1,8×10-5 0,5×10-5 5,7×10-5 plíce_S14 1,44 0,41 5,03 plíce_S14 0,7×10-5 0,6×10-5 0,9×10-5 plíce_D 2,32 1,89 2,85 plíce_D Pozn.: D = dospělé prase, P = plod, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará sval (S1, S7, S14 a D) = m. longissimus thoracis et lumborum, sval P = m. biceps femoris
Hodnoty relativní kvantifikace hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v srdeční svalovině
Relativní kvantifikace exprese genu Relativní kvantifikace exprese genu EEF1A1 v srdeční svalovině EEF1A2 v srdeční svalovině vzorek RQ min max vzorek RQ min max srdce_S1 9,59 7,24 12,70 srdce_S1 1,70 1,31 2,20 srdce_S7 7,55 6,07 9,39 srdce_S7 2,05 1,76 2,40 srdce_S14 8,83 5,13 15,19 srdce_S14 1,52 0,78 2,97 srdce_D 1,00 0,66 1,52 srdce_D 1,00 0,75 1,34 Pozn.: Kalibrátor = srdce dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
136
Hodnoty relativní kvantifikace hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v mozkové tkáni
Relativní kvantifikace exprese genu Relativní kvantifikace exprese genu EEF1A1 v mozku EEF1A2 v mozku vzorek RQ min max vzorek RQ min max mozek_S1 1,88 1,32 2,69 mozek_S1 2,35 1,68 3,29 mozek_S7 1,30 0,55 3,03 mozek_S7 2,52 1,10 5,78 mozek_S14 2,17 1,60 2,96 mozek_S14 4,03 2,23 7,31 mozek_D 1,00 0,65 1,54 mozek_D 1,00 0,65 1,54 Pozn.: Kalibrátor = mozek dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
Hodnoty relativní kvantifikace hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v játrech
Relativní kvantifikace exprese genu Relativní kvantifikace exprese genu EEF1A1 v játrech EEF1A2 v játrech vzorek RQ min max vzorek RQ min max játra_S1 0,22 0,17 0,29 játra_S1 4,14 játra_S7 0,38 0,24 0,61 játra_S7 3,41 1,90 6,12 játra_S14 0,59 0,41 0,85 játra_S14 2,21 0,55 8,89 játra_D 1,00 0,51 1,97 játra_D 1,00 0,56 1,79 Pozn.: Kalibrátor = játra dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
Hodnoty relativní kvantifikace hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v ledvině
Relativní kvantifikace exprese genu Relativní kvantifikace exprese genu EEF1A1 v ledvině EEF1A2 v ledvině vzorek RQ min max vzorek RQ min max ledvina_S1 1,05 0,62 1,78 ledvina_S1 3,86 1,05 14,26 ledvina_S7 1,08 0,48 2,41 ledvina_S7 0,55 0,28 1,07 ledvina_S14 0,61 0,15 2,54 ledvina_S14 1,57 0,52 4,73 ledvina_D 1,00 0,83 1,20 ledvina_D 1,00 0,74 1,35 Pozn.: Kalibrátor = ledvina dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
Hodnoty relativní kvantifikace hladiny exprese genů EEF1A1 a EEF1A2 v plicích
Relativní kvantifikace exprese genu Relativní kvantifikace exprese genu EEF1A1 v plicích EEF1A2 v plicích vzorek RQ min max vzorek RQ min max plíce_S1 1,20 1,12 1,30 plíce_S1 1,44 1,11 1,87 plíce_S7 0,58 0,26 1,29 plíce_S7 6,36 1,76 22,89 plíce_S14 0,62 0,18 2,17 plíce_S14 2,41 0,74 7,82 plíce_D 1,00 0,82 1,23 plíce_D 1,00 0,81 1,24 Pozn.: Kalibrátor = plíce dospělého prasete D = dospělé prase, S1 = selata 1 den stará, S7 = selata 7 dní stará, S14 = selata 14 dní stará
137
