En zym y aktivn í p i n ízkých tep lotách

FOBIA kongres

1.4. 2005 St. Jan pod Skalou

En zym y aktivn í p i n ízkých tep lotách Vojtch Sp iwok sp iwokv@vsch t.cz Ústav b ioch em ie a m ikrob iologie VŠCHT v Praze

FOBIA kongres


Organ ism y adap tovan é n a n ízké tep loty:

FOBIA kongres


ADAPTACE: - en zym y

100

80

aktivita

60

40

20

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

o

teplota [ C]

- m em b rán y +

+

N

O O P O O O O

O O

O O

O O

- d alší …

N

O O P O O

O O P O O

O O

N

+

N

O O

- cold sh ock / cold aclim ation p rotein y

- an tifreeze p rotein y

+

+

O O P O O

O O P O O

O O

N

+

N

O O

O O

O O

O O P O O O O

O O

FOBIA kongres


Enzym y aktivní p i nízkých teplotách:

100

term ofilní

aktivita

80

m esofilní

60

psychrofilní

40

20

0 0

10

20

30

40

50

60 o

teplota [ C]

70

80

90

100

FOBIA kongres



100

aktivita

80

60

40

20

0 0

10

20

30

40

50

60 o

teplota [ C]

70

80

90

100

FOBIA kongres


Enzym y aktivní p i nízkých teplotách: 20 100

0

80

aktivita

0

10

20

60

40

20

0 0

10

20

30

40

50

60 o

teplota [ C]

70

80

90

100

FOBIA kongres



Xylan asa z b akterie Pseu doalterom on as h aloplan k tis TAH3a je:

9 x aktivn jší n ež ze Streptom yces sp . S38 a 130 x aktivn jší n ež z Clostridiu m th erm ocellu m p i 10 ºC

15 x aktivn jší n ež ze Streptom yces sp . S38 a 260 x aktivn jší n ež z Clostridiu m th erm ocellu m p i 0 ºC

T Collin s, M-A Meuwis, C Gerday, G Feller (2003) Activity, Stability and Flexibility in Glycosidases Adapted to Extrem e Therm al Environm ents. J Mol Biol 328, 419–428.

FOBIA kongres



www.neb.com

www.prom ega.com

FOBIA kongres


Enzym y aktivní p i nízkých teplotách: Vlastn osti: - více h yd rofob n ích am in okyselin n a p ovrch u - více n ab itých am in okyselin u vn it glob u le - v tší p om r Lys / (Arg+Lys) - více Gly ve sm y kách - m én p itažlivých elektrostatických in terakcí - více Gln n a p ovrch u - m én Pro - Pro v h elixech - m én π – π in terakcí - m én kation – π in terakcí - n ižší d ip ólové m om en ty h elix - zm n a elektrostatických vlastn ostí aktivn íh o m ísta - vyšší dostu p n ost aktivn íh o m ísta …

FOBIA kongres


TEORIE I.: - vyšší aktivity je dosažen o d íky vyšší flexibilit (celkové n eb o lokáln í) - vyšší flexib ilita je n a ú kor stab ility

FOBIA kongres


IPMDH z term ofiln íh o m ikroorgan ism u vykazu je n ižší flexib ilitu p i 25 ºC, ob a en zym y vykazu jí p ib ližn stejn ou flexib ilitu p i op tim áln ích svých tep lotách .

Flexibilita proteinu hraje zásadní roli v teplotní adaptaci

P Závod szky, J Kardos, Á Svin gor, GA Petsko (1998) Adjustm ent of conform ational flexibility is a key event in the therm al adaptation of proteins. PN AS 95(13): 7406-7411.

FOBIA kongres


Mu tace am in okyselin aktivn íh o m ísta (Am p C β-laktam asy a lysozym u ) vedla k zvýšen í stab ility.

Aktivní m ísta enzym jsou optim alizována pro katalysu a ne pro stabilitu.

BM Beadle, BK Shoichet (2002) Structural Bases of Stability–function Tradeoffs in Enzym es. J Mol Biol 321(2): 285-296. BK Shoichet, WA Baase, R Ku roki, BW Matthews (1995) A relationship between protein stability and protein function. PNAS 92(2): 452-456.

FOBIA kongres


Dynam ika proteinu hraje klí ovou roli v reakci katalysované adenylatkinasou

M Wolf-Watz, V Thai, K Hen zler-Wildm an , G Hadjipavlou, EZ Eisen m esser, D Kern (2004) Linkage between dynam ics and catalysis in a therm ophilic-m esophilic enzym e pair. Nat Stru ct Mol Biol. 11, 945-949.

FOBIA kongres


Míra fluktuací protein roste s teplotou více u protein psychrofilních m ikroorganism

M Tehei, B Fran zetti, D Madern , M Gin zburg, BZ Gin zburg, MT Giudici-Orticon i, M Bruschi, G Zaccai (2004) Adaptation to extrem e environm ents: m acrom olecular dynam ics in bacteria com pared in vivo by neutron scattering. EMBO Rep 5, 66-70.

FOBIA kongres


TEORIE II.: - aktivita n em á p ím ou sou vislost s flexibilitou - vyšší/ n ižší stab ilita je d sled kem evolu n ích tlak

FOBIA kongres


Evolu n í stu d ie p om ocí m ížkovéh o m od elu p rotein u u kázala: proteiny jsou nestabilní p i vyšších teplotách v d sledku absence evolu ních tlak proudržení stability.

n ativn í

den atu rovan ý

DM Tavern a, RA Goldstein (2002) Why are proteins m arginally stable? Protein s 46(1):105-109.

FOBIA kongres


U n kterých enzym se pr b h aktivity na teplot nem ní p i teplotách pod teplotu dynam ického p echodu

Xylanasa

0

100

200

300

400

RV Dun n , V Réat, J Fin n ey, M Ferran d, JC Sm ith, RM Dan iel (2000) Enzym e Activity and Dynam ics: Xylanase Activity in the Absence of fast Anharm onic Dynam ics. Biochem J 346: 355-358

Glutam atdehydrogenasa RM Dan iel, JC Sm ith, M Ferran d, S Héry, R Dun n , JL Fin n ey (1998) Enzym e Activity below the Dynam ical Transition at 220 K. Biophys J 75: 2504–2507. RM Dan iel, JL Fin n ey, V Réat, R Dun n , M Ferran d, JC Sm ith (1999) Enzym e Dynam ics and Activity: Tim e-Scale Dependence of Dynam ical Transitions in Glutam ate Dehydrogenase Solution. Bioph ys J 77: 2184–2190.

FOBIA kongres


U n kterých enzym se naopak m ní

Bacteriorhodopsin

0

100

200

300

400

M Ferran d, AJ Dian oux, W Petry, G Zaccai (1993) Therm al m otions and function of bacteriorhodopsin in purple m em branes: effects of tem perature and hydration studied by neutron scattering. PNAS. 90: 9668 –9672.

Ribonukleasa A BF Rassm ussen , AM Stock, D Rin ge, GA Petsko (1992) Crystalline ribonuclease A loses function below the dynam ical transition at 220K. Natu re. 357: 523– 424.

FOBIA kongres


Studium flexibility: m etoda

krystalové struktury (B-faktor)

výhody

nevýhody

atom ové rozlišení

nem ožné srovnávat více protein

NMR


om ezená velikost proteinu

rozptyl n 0 , m etody založené na rozptylu

m ožné m it pro sm si, in vivo atd.

sim ulace m olekulové dynam iky


H/D vým na

áste né atom ové rozlišení

bez atom ového rozlišení znám a 3D struktura, om ezené asové m ítko om ezená m ožnost asového rozlišení

FOBIA kongres


α-am ylasa 1AQM-1HX0

alkalická p roteasa 1G9K-1KAP

citratsyn th asa 1A59-1AJ8

xylan asa 1H12-1CEM

m alatdeh ydrogen asa 1B8P-1IZ9

FOBIA kongres

Alterom on as h aloplan ctis

1AQM

1.85

448

Ca 2+, Cl -

Prase

1H X0

1.38

495

antarktická bakterie DS23R

1A59

2.09

2x 377

-

Pyrococcu s fu riosu s

1AJ8

1.9 0 1.9 0 2.0 0 1.9 6 1.6 4

2x 371 2x 327

-

Aqu aspirillu m arcticu m h erm u s th erm oph ilu s Hb8

alkalická proteasa

Pseu dom on as sp . Pseu dom on as aeru gin osa Alterom on as h aloplan k tis

xylanasa Clostridiu m th erm ocellu m

1B8 P 1IZ 9 1G9 K 1KA P 1H1 2 1CE M

1.20 1.6 5

Ca 2+, Cl -

-

2x 327 461

Identita sekvencí [%]

m alátdehy dro-genasa

Kofaktory

citrátsyntha sa

PDB

Po et am inokys. zbytk

α-am ylasa

Organism us

Rozlišení [Å]

Enzym


5 0.7

3 9.3

6 2.5

Stru ctu re 6: 1503-1516 (1998) Biochem istry 40(25): 7700-7709 (2001) Stru ctu re 6: 351-361 (1998) Bioch em istry 36(33): 9983-9994 (1997) J. Biol. Ch em . 272(17): 11761-11767 (1999) dosu d n epu blik ován o

Zn 2+, Ca 2+

470

Zn 2+, Ca 2+

404

-

5 5.3

Protein s 50: 636-647 (2003) EMBO J. 12(9): 3357-3364 (1993) J. Biol. Ch em . 278(9): 7531-7539 (2003)

23.0 363

Odkaz

-

Stru ctu re 4(3): 265-275 (1996)

FOBIA kongres


Sim ulace m olekulové dynam iky: p rogram silové p ole

GROMACS 3.1.4 GROMACS

sim u lovan á d ob a asový krok

1.0 – 1.4 n s 2 fs

tep lota regu lace tep loty tlak regu lace tlaku

300 K Beren d sen u v term ostat 0.1 b ar Parin ell v & Rah m an v barostat

m odel vody p o et m oleku l vod y

SPC (exp licit) 10 152 – 23 842

m ezn í vzd álen ost p ro n evazeb n é in terakce algoritm u s con strain t

1.4 n m LINCS

E Lin dahl, B Hess, D van der Spoel (2001) J Mol Mod 7: 306–317. (www.grom acs.org)

FOBIA kongres


Sim ulace m olekulové dynam iky: 0

200 p s

400 p s

600 ps

800 ps

16 x 50 ps 800 ps An alýza: root-m ean -squ are d eviation 1 Σ (r – r 0)2 N root-m ean -squ are flu ctu ation RMSD =

RMSF =

Σ (r - )

2

1 n kom p on en t an alýza h lavn ích

E Lin dahl, B Hess, D van der Spoel (2001) J Mol Mod 7: 306–317. (www.grom acs.org)

1000 ps

α-am ylasa 1AQM – Alterom on as h aloplan ctis

FOBIA kongres

cit rat sy nt hasa 1A59 – Ant arkt ická bakt erie DS2-3R


1HX0 – p rase

1AJ8 - Pyrococcu s fu riosu s

FOBIA kongres

1.4. 2005 St. Jan pod Skalou m alatdeh yd rogen asa 1B8P – Aqu aspirillu m 1IZ9 – Th erm u s th erm oph ilu s arcticu m Hb 8

alkalická p roteasa 1G9K – Pseu dom on as sp . 1KAP – Pseu dom on as aeru gin osa

FOBIA kongres


xylan asa 1H12 – Alterom on as h aloplan k tis 1CEM – Clostridiu m th erm ocellu m

RMSF [nm ]

FOBIA kongres


α-am ylasa 1AQM-1HX0

N

citratsyn th asa 1A59-1AJ8

C

N

alkalická p roteasa 1G9K-1KAP

m alatdeh yd rogen asa 1B8P-1IZ9

C

N

C

N

C

xylan asa 1H12-1CEM Rozložen í RMSF p odél et zce - po ít áno po 50 ps

N

C

FOBIA kongres

Prm rn á flexib ilita C α atom - p o ítán o p o 50 p s


FOBIA kongres

Prm rn á flexib ilita C α atom - p o ítán o p o 800 p s


FOBIA kongres


korelace flexib ility jed n otlivých Ca atom (m eso/ term ofiln í vs. p sych rofiln í) - p o ítán o p o 50 p s α-am ylasa

citratsyn th asa

alkalická p roteasa

xylan asa

m alatd eh yd rogen asa


RMSF [n m ]

FOBIA kongres

d RMSF/ d T [n m / K]

tep lota [K]

xylan asa 1H12 – Alterom on as h aloplan k tis 1CEM – Clostridiu m th erm ocellu m

FOBIA kongres


r

r

r

r

1A59 – Antarktická bakterie DS2-3R 1AJ8 - Pyrococcus furiosus

r [nm ]

citratsyn th asa

as [ps]

FOBIA kongres


An alýza h lavn ích kom p on en t (essen tial d yn am ics): atom 1

atom 2 vlastní ísla rep resen tu jí m íru vzájem n n ezávislých p oh ybu ve sm ru vlastních vektor

trajektorie:

výp o et p r m rn ých sou ad n ic jedn otlivých atom

diagon alizace m atice kovarian ní m atice:

výp o et vektor r(t) -

FOBIA kongres


An alýza h lavn ích kom p on en t (essen tial d yn am ics): citratsyn th asa 1A59 – Antarktická bakterie DS2-3R 1AJ8 - Pyrococcus furiosus

FOBIA kongres

An alýza h lavn ích kom p on en t (essen tial d yn am ics):


FOBIA kongres


Role vody:

FOBIA kongres


Sh rn u tí: - až n a α-am ylasu jsou en zym y z p sych rofiln ích m ikroorgan ism (o troch u ) celkov více flexib iln í - ím d elší asové m ítko tím více se p rojevu je vyšší flexibilita - vyšší flexib ilita u α-am ylasy je p atrn zp soben á vzájem n ým i in zercem i - vyšší flexib ilita je sp ojen a s rozsáh lejším i kon form a n ím i zm n am i (otevírán í a zavírán í aktivn íh o m ísta atd …) - závislost flexib ility n a tep lot je strm jší p ro p sych rofiln í xylan asu - term ofiln í en zym y vykazu jí siln jší in terakce s vodou

FOBIA kongres


Pod kování: Prof. B. Králová, P. Lip ovová, Z. Pu rkrtová, E. Ben ešová, M. Marková, Š. Malá,Z. Win terová J. Hašek, J. Doh n álek, T. Skálová, E. Von d rá ková1, H. Petroková Prof. G. Folkers, Prof. V. Pliška, Prof. L. Scap ozza P. Posp íšil

PRÁZDNINOVÉ PO ÍTÁNÍ

Prof. K. Dem n erová, P. Jen , M. Marková, Doc. J. Pazlarová, H. Strn ad, Prof. O. Valen tová … a Vám za p ozorn ost

En zym y aktivn í p i n ízkých tep lotách

Recommend Documents