Ekstraksi Lovastatin

Industri Kimia Kecil dan Menengah ISSN 1410-9891

Ekstraksi Lovastatin Tigor Nauli Puslit Informatika - LIPI, Jalan Cisitu, Bandung 40135, Indonesia Tel. (022) 2504711, Fax. (022) 2504712, e-mail: [email protected] Abstrak Lovastatin adalah suatu ‘pro-drug’, yang memiliki arti penting secara medis sebagai obat antikolesterol dan diindikasikan dapat menurunkan resiko arteriosklerosis. Biosintesis lovastatin dapat dilakukan melalui fermentasi cair terhadap jamur Aspergillus terreus dengan sumber karbon 5-15 g dan kondisi proses yang terjaga pada agitasi 150 rpm dan suhu 28 oC. Produk dipanen setelah 90 jam fermentasi dan selanjutnya diekstraksi untuk memperoleh lovastatin murni. Efisiensi ekstraksi dicari melalui dua teknik pemisahan cair-cair, yaitu pemisahan aliran silang (crosscurrent) dan pemisahan aliran balik (countercurrent). Proses pemisahan tersebut dilakukan dalam beberapa tahapan dengan pemakaian etil asetat sebagai pelarut. Banyaknya ekstraksi pada pemisahan aliran silang ditentukan oleh korelasi antara fraksi total yang terekstrak dan yang tersisa. Sedangkan banyaknya ekstraksi pada pemisahan aliran balik berkaitan dengan jumlah perangkat pemisah dan fraksi relatif zat terlarutnya. Kadar lovastatin yang bervariasi antara 598.6 - 885.8 µg/mL media telah didapatkan dari percobaan ini dengan perolehan produk sebesar 91.3% pada tahap kelima dari pemisahan aliran silang. Sementara perolehan produk sebesar 94.7% dihasilkan pada tahap ketiga pemisahan aliran balik Pemilihan terhadap proses ekstraksi mana yang terbaik, haruslah mempertimbangkan antara besarnya perolehan dan ongkos pemakaian pelarut. Abstract Lovastatin is a pro-drug for reduction of plasma cholesterol. It was indicated as an agent for preventing arteriosclerosis risk in human. Lovastatin is biosynthetically produced from a liquid fermentation of Aspergillus terreus by 5-15 g of C-source in a controlled condition of 150 rpm agitation and 28 0C temperature. Product was harvested after 90-days of fermentation and followed by an extraction to obtain the pure lovastatin. The efficiency of the extraction is investigated through an interphase separation technique, that is crosscurrent and countercurrent. The separation process has been done in several steps using ethylacetate as solvent. The number of extraction in crosscurrent separation depends on the total fraction of extracted and the fraction of remaining in one of the phases. In countercurrent separation, the number of extraction depends on the number of separator and the relative fraction of solute. The 598.6 - 885.8 µg/mL medium of lovastatin was produced from the experiment with 91.3 % yield at the fifth step of crosscurrent separation. Besides, 94.7 % yield was obtained at the third step of countercurrent separation. Selecting for the better extraction process should consider the product yield and the cost of the solvent usage. 1.

Pendahuluan

Lovastatin adalah suatu pro-drug, yang di dalam tubuh akan segera terhidrolisis menghasilkan suatu senyawa yang dapat menghambat bersaing kerja dari HMG-CoA reduktase, yaitu sebuah enzim yang mengkatalisis perubahan HMG-CoA menjadi mevalonat, yang merupakan sebuah tahap penting dalam biosintesis kolesterol. Hambatan enzim ini meningkatkan densitas reseptor LDL dalam sel hati sehingga terjadi penurunan LDL-kolesterol. Aktivitas lovastatin ini memiliki arti penting secara medis sebagai obat anti-hiperkolesterolemia (Hardmann, 1996) dan diindikasikan dapat menurunkan resiko arteriosklerosis (Cottingham, 1998).

Peningkatan Daya Saing Nasional Melalui Pemanfaatan Sumber Daya Alam untuk Pengembangan Produk dan Energi Alternatif

1

Industri Kimia Kecil dan Menengah ISSN 1410-9891 Lovastatin telah diketahui dapat diturunkan dari asetat melalui lintas poliketida (Moore, 1985). Aspergillus terreus merupakan salah satu jamur poliketida sintetase yang diharapkan dapat menghasilkan salah satu metabolit sekunder poliketida, yaitu: Lovastatin. Proses pembentukan metabolit sekunder tersebut dapat dilakukan dengan menggunakan cara fermentasi cair. Di dalam suatu proses fermentasi, umumnya terjadi pembentukan metabolit sekunder yang lebih dari satu. Sehingga untuk menarik satu produk spesifik diantara metabolit-metabolit tersebut, diperlukan pemilihan pelarut yang tepat dan teknik ekstraksi yang efektif. Disini akan dibicarakan tentang ekstraksi lovastatin kasar (crude) hasil fermentasi dengan membandingkan penerapan dari dua metoda pemisahan. 2.

Tinjauan Pustaka

Ekstraksi suatu zat terlarut dari suatu fasa cairan ke fasa cairan lainnya, digunakan untuk memisahkan berbagai jenis senyawa, khususnya antara zat terlarut polar dan zat terlarut non polar atau antara ion kompleks dan ion logam bebasnya. Pemisahan cair-cair dapat dilakukan dengan menggunakan metoda ekstraksi aliran silang (crosscurrent) dan aliran balik (countercurrent). Pada aliran silang, salah satu pelarut diganti dengan yang segar setiap kali masa ekstraksi. Sedangkan pada aliran balik, kedua fasa diperbaharui dengan pelarut segar secara berkesinambungan (Ewing, 1975). Pemisahan sempurna dengan menggunakan kedua metoda ini adalah mustahil, tetapi pemisahan dapat diselesaikan hingga derajat tertentu dimana masih dimungkinkan mendapat perolehan yang cukup besar. 2.2.

Ekstraksi Aliran Silang

Pada ekstraksi ini, sebuah zat A dimisalkan berada pada fasa 2. Seporsi fasa 1 ditambahkan kedalamnya dan sistem disetimbangkan. Setelah seimbang, maka fraksi total komponen A di dalam kedua fasa adalah p dan q (Gambar 1). n=0 n=1 n=2

A

p

p'

Fasa 1

q

qq

Fasa 2

Gambar 1. Distribusi komponen pada aliran silang. Kedua fasa dipisahkan secara mekanis dan porsi baru fasa 1 ditambahkan, lalu sistem disetimbangkan kembali. Fraksi A yang masih tersisa di fasa 2 akan menjadi qq = q2. Sedangkan gabungan porsi A di fasa 1 (atau p = p’) menjadi 1 - q2. Proses ini dapat diulangi n kali sesuai keperluan. Fraksi A yang tersisa di fasa 2 dan fraksi total yang terekstrak adalah: 1 qn = (1) ( K + 1) n Ptotal = 1 − q n

(2)

Hubungan ini (persamaan 1 dan 2) dapat digunakan untuk menentukan banyaknya ekstraksi yang diperlukan untuk mencapai derajat pemisahan tertentu, dengan diketahuinya nilai K.

2.2.

Ekstraksi Aliran Balik

Berbeda dengan metoda aliran silang, dimana hanya salah satu fasa yang diperbaharui, maka pada teknik aliran balik ini kedua fasa tersebut akan diperbaharui. Secara visual seolah fasa 1 bergeser ke satu jurusan, sedangkan fasa 2 bergerak berlawanan arah. Pada metoda ini, dilakukan kesetimbangan secara bertahap. Dipewrlukan adanya sejumlah perangkat pemisah yang sesuai dengan banyaknya ekstraksi (n). Sejumlah volum yang sama dari kedua pelarut disetimbangkan pada setiap tahapan. Pada keadaan awal (Gambar 2), komponen A hanya terdapat pada pemisah 0, dan terdistribusi dalam perbandingan p dan q. Porsi fasa 1 selanjutnya dipindahkan ke pemisah baru di kanan, dan disetimbangkan dengan pelarut (fasa 2) baru. Sedangkan pemisah 0 disetimbangkan dengan fasa 1 yang baru. Jumlah komponen A di pemisah 1 setelah setimbang akan sama dengan p dan rasio kedua fasa menjadi K = p/q = p2/pq. Pada posisi s = 0, jumlah q akan terdistribusi sendiri dalam rasio K = p/q = pq/q2.


2

Industri Kimia Kecil dan Menengah ISSN 1410-9891

s=0 n=0

n=1

n=2

n=3

s=1

s=2

s=3

p

Fasa 1

q

Fasa 2

s=0

s=1

s=2

s=3

pq

p2

Fasa 1

q2

pq

Fasa 2

s=0

s=1

s=2

pq2

2 p 2q

p3

Fasa 1

q3

2 pq2

p 2q

Fasa 2

s=0

s=1

s=2

s=3

pq3

3 p2q2

3 p 3q

p4

Fasa 1

q4

3 pq3

3 p2q2

p 3q

Fasa 2

s=3

Gambar 2. Distribusi komponen pada aliran balik. Dengan cara yang sama, maka didapatkan jumlah total di pemisah 1 adalah 2 pq, yaitu jumlah dari pq (yang berasal dari fasa 1 di pemisah 0) ditambah dengan pq (yang berasal dari fasa 2 di pemisah 1). Keduanya mencapai kesetimbangan dengan rasio K = p/q, atau p(2 pq) = 2 p2q di fasa 1 dan q(2 pq) = 2 pq2 di fasa 2. Dapat dilihat bahwa koefisien dari fraksi-fraksi disemua pemisah, merupakan suatu perluasan dari binomial (seperti pada segitiga Pascal). Koefisien untuk fasa 1 pada n = 3 adalah: p(q3 + 3 pq2 + 3 p2q + p3). Atau secara umum, fraksi total dalam fasa 1 di atas adalah p(p + q)n dan fraksi total dalam fasa 2 di bawah adalah q(p + q)n, sedangkan n! (3) ( p + q) n = p s q n− s s!( n − s )! Persamaan 3 ini dapat langsung memberikan jumlah fraksi total fn,s dari komponen bersangkutan di pemisah s setelah kesetimbangan yang ke n kali. Dengan menggantikan nilai K untuk p dan q, maka didapatkan f n, s =

n! Ks s!(n − s )! ( K + 1) s

(4)

Dengan mengambil jumlah komponen yang sama pada awal ekstraksi, maka berdasarkan persamaan 4 ini, akan dapat ditabulasikan distribusi masing-masing komponen disetiap perangkat pemisah.

3.

Metodologi

Penelitian ini mencakup dua kegiatan utama, yaitu memproduksi lovastatin secara fermentasi cair dan mengekstraksinya dari cairan kasar fermentasi. Percobaan ditekankan pada upaya menarik ekstrak lovastatin sebanyak mungkin dengan memvariasi perlakuan dari dua metoda pemisahan.


3

Industri Kimia Kecil dan Menengah ISSN 1410-9891 3.1.

Mikroorganisme

Jamur Aspergillus terreus yang digunakan sebagai penghasil lovastatin secara fermentasi didapatkan dari koleksi LIPI.

3.2.

Media fermentasi

Media fermentasi cair steril terdiri dari laktosa 9 g; pepton 0.6 g; corn steep liquor 1 g; gliserol 3 g; susu skim 0.42 g; glukosa (dalam beberapa konsentrasi) dan aquades. pH media diatur sebesar 6.8 dengan penambahan NaOH 1.125 N atau HCl 25 %, lalu media disterilisasi pada 121 °C selama 15 menit.

3.3.

Fermentasi Aspergillus terreus

Produksi metabolit sekunder dari Aspergillus terreus dilakukan melalui metode fermentasi kultur curah atau media cair dengan melakukan peragaman konsentrasi glukosa yaitu 5, 7.5, 10, 12.5, dan 15 g. Inokulum 10 % dengan usia 30 jam diinokulasikan ke dalam tabung Erlenmeyer 500 mL yang berisi 100 mL media fermentasi cair steril. Biakan dikocok dengan pengocok orbital kecepatan 150 rpm, suhu 28 °C selama 90 jam.

3.4.

Ekstraksi Hasil Fermentasi

Hasil fermentasi disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm, suhu 4 °C, selama 20 menit. Filtrat dipisahkan dari endapannya dan diekstraksi 2 kali dengan heksana (perbandingan volume 1 : 1) menggunakan corong pisah, agar bersih dari pengotor minyak. Fasa air dipisahkan dan diekstraksi dengan pelarut etil asetat dengan menggunakan dua metoda pemisahan. Fraksi akhir etil asetat kemudian dipisahkan dan dievaporasi. Ekstraknya disimpan dalam botol sampel dan dibiarkan mengering pada suhu kamar, untuk selanjutnya diukur kadar produk (Lovastatin) nya dengan HPLC.

3.5.

Analisa Kualitatif Lovastatin

Analisa kualitatif terhadap ada/tidaknya lovastatin dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi puncak yang muncul pada kromatogram dengan waktu retensi lovastatin standar, menggunakan TLC. Rf sampel hasil ekstraksi dan kristal putih dibandingkan dengan Rf standar lovastatin (SIGMA).

3.6.

Penentuan Kadar Lovastatin

Penentuan kadar lovastatin dilakukan dengan menggunakan HPLC, pada kolom C18, fase gerak metanol : air (9 : 1), panjang gelombang (λ) 254 nm, dan flow/pressure 1/88 kg cm m-1, terhadap ekstrak hasil pemisahan dengan etil asetat. Kadar lovastatin diperoleh dengan membandingkan luas area lovastatin sampel dengan luas area lovastatin standar, yaitu: Csampel = (Lsampel / Lstandar) x Cstandar.

3.7.

Metoda pemisahan aliran silang

Fasa air hasil pencucian dengan heksana ditempatkan pada corong pisah. Dilakukan ekstraksi dengan menambahkan sejumlah mL pelarut etil asetat. Setelah terjadi kesetimbangan, fasa air dan fasa etil asetat lalu dipisahkan. Dan proses ekstraksi diulangi beberapa kali dengan penambahan sejumlah pelarut etil asetat yang baru. Pada setiap tahapan ekstraksi, ditentukan kadar lovastation pada kedua fasa tersebut. Porsi fasa 2 ditetapkan sebesar 100 mL.

3.8.

Metoda pemisahan aliran balik

Fasa air hasil pencucian dengan heksana ditempatkan pada corong pisah 0. Dilakukan ekstraksi dengan menambahkan sejumlah mL pelarut etil asetat. Setelah terjadi kesetimbangan, fasa 1 dipindahkan ke corong pisah lain (corong pisah 1) dan kedalamnya ditambahkan pelarut 2. Fasa 2 yang terdapat di corong pisah 0 ditambahkan dengan pelarut 1. Kemudian ditentukan kadar lovastatin di masing-masing fasa pada kedua corong pisah tersebut. Proses ekstraksi dilanjutkan dengan menggunakan corong pisah baru. Dan pada setiap pemindahan fasa ke corong pisah berikutnya, maka dilakukan penambahan pelarut yang berkaitan, yaitu pelarut 2 untuk fasa 1 dan pelarut 1 untuk fasa 2, masing-masing sebanyak 20 mL.


4

Industri Kimia Kecil dan Menengah ISSN 1410-9891 4.

Hasil dan Pembahasan

Produksi lovastatin melalui fermentasi Aspergillus terreus telah menunjukkan hasil yang prospektif. Perolehan produk diperbaiki dengan memilih teknik ekstraksi lovastatin yang lebih cocok dan yang mampu mengekstraksi lebih banyak, seperti yang diuraikan berikut.

4.1.

Fermentasi Aspergillus terreus

Analisa kualitatif terhadap metabolit sekunder hasil fermentasi Aspergillus terreus memastikan bahwa produk tersebut adalah lovastatin. Puncak khromatogram lovastatin muncul pada waktu retensi 5.4 menit, baik untuk sampel maupun standar. Karakteristik lovastatin hasil fermentasi ini adalah sesuai dengan ciri lovastatin menurut pustaka (Hardmann, 1996). Analisa kuantitatif terhadap metabolit sekunder hasil fermentasi Aspergillus terreus pada tiga batch yang berbeda, masing-masing dengan lima ragam kadar glukosa, memberikan hasil seperti yang terlihat pada Tabel 3 berikut. Tabel 3. Perolehan lovastatin pada tiga batch fermentasi Aspergillus terreus dengan ekstraksi aliran silang Kadar Lovastatin (µg/mL media)

Kadar glukosa (%)* I

II

III

Rata-rata

5.0

842.9

822.3

830.9

832.0 ± 7.2

7.5

885.1

891.1

881.1

885.8 ± 3.6

10.0

702.2

722.1

709.9

711.4 ± 7.1

12.5

609.5

611.8

610.1

610.5 ± 0.9

595.8

600.1

599.9

598.6 ± 1.9

15.0 *glukosa = sumber C

4.2.

Hasil Ekstraksi Lovastatin

Perolehan lovastatin seperti yang tampak pada Tabel 3, dihasilkan melalui ekstraksi aliran silang terhadap ke lima belas produk fermentasi. Strategi ekstraksi direncanakan terlebih dahulu dengan memvariasi porsi pemakaian pelarut, seperti yang terlihat pada Tabel 4. Meskipun porsi pelarut dapat diperkecil lagi, misalnya per 10 mL, namun jumlah ektraksinya akan menjadi semakin banyak. Dengan memilih lima kali ekstraksi dengan porsi pelarut sebanyak 20 mL, maka perolehan produk dapat mencapai 91.3 %. Perolehan ini hampir tiga kali lebih efektif dibandingkan dengan satu kali ekstraksi menggunakan porsi pelarut 100 mL. Tabel 4. Pemakaian pelarut untuk ekstraksi aliran silang. Porsi

Pelarut (mL)

Perolehan (%)

1

100

38.6

2

50

62.3

4

25

85.8

5

20

91.3

Landainya kurva diujung kanan Gambar 3 dapat memperlihatkan lebih jelas tentang kurang efektifnya ektraksi bila porsi pelarut akan diperkecil lagi. Perolehan 91.3 % sesungguhnya masih belum optimal, mengingat hampir 10 % produk masih tertinggal dalam cairan fermentasi. Tetapi dilain pihak, ektraksi tidak mungkin dicapai hingga 100 %, karena adanya keterbatasan kelarutan diantara zat terlarut dan pelarutnya, yang ditunjukkan oleh tetapan distribusi (atau koefisien partisi). Perbaikan terhadap perolehan produk dengan memilih metoda pemisahan aliran balik, memerlukan studi awal terhadap banyaknya ekstraksi yang harus dilakukan. Dengan menerapkan teknik tersebut pada enam perangkat pemisah, ternyata tidak nampak adanya perbaikan hasil. Perolehan produk di pemisah #5, yaitu sebesar


5

Industri Kimia Kecil dan Menengah ISSN 1410-9891 91.38 %, adalah hampir sama dengan perolehan produk pada pemisahan aliran silang, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 5 di bawah ini. 100 91.3

Perolehan produk (%)

90 85.8

80 70 60

62.3

50 40

38.6

30 20 10 0 1 x 100

2 x 50

4 x 25

5 x 20

Porsi pelarut (mL)

Gambar 3. Tingkat perolehan ekstrak dengan pemisahan aliran silang. Kurang tepatnya strategi ekstraksi yang dipilih untuk penerapan metoda aliran balik ini, juga tergambarkan dari banyaknya pelarut yang akan dipakai, yaitu sebanyak 320 mL, dibandingkan dengan 5 x 20 mL (atau 100 mL) pada metoda aliran silang. Tabel 5. Pemakaian pelarut untuk ekstraksi aliran balik (n = 5). Pemisah #

Pelarut (mL)

Perolehan (%)

0

120

0.00

1

80

0.00

2

60

0.005

3

40

0.30

4

20

8.31

5

0

91.38

Dengan melibatkan perangkat pemisah sebanyak empat buah dengan pengulangan proses sebanyak tiga kali (n = 3), maka akan terlihat adanya kenaikan pada perolehan produk hingga 94.7 % seperti yang tertera pada Tabel 6 maupun Gambar 4. Perolehan tertinggi terdapat pada pemisah #3 dengan penggunaan total pelarut sebanyak 120 mL. Peningkatan perolehan produk dengan mengurangi lagi banyaknya ekstraksi tidak mungkin dilakukan, karena zat terlarut akan terdistribusi secara hampir merata diantara perangkat-perangkat pemisah, yang menyebabkan tidak akan dapat ditemukannya perolehan yang maksimum. Tabel 6. Pemakaian pelarut untuk ekstraksi aliran balik (n = 3). Pemisah #

Pelarut (mL)

Perolehan (%)

0

80

0.00

1

40

0.09

2

20

5.17

3

0

94.74

Perolehan produk sebesar 94.7 % menyebabkan konsentrasi lovastatin yang didapatkan menjadi berkisar antara 618.95 - 915.92 µg/mL media. Meskipun terjadi peningkatan perolehan produk sebesar 3.4 % dengan


6

Industri Kimia Kecil dan Menengah ISSN 1410-9891 penerapan metoda aliran balik ini, namun kenaikan tersebut harus dipertimbangkan secara cermat dengan meningkatnya penggunaan pelarut sebanyak 120 % dibandingkan dengan metoda aliran silang.

100

94.7

Perolehan produk (%)

90 80 70 60 50 40 30 20 10

0.0

5.2

0.1

0

0

1

2

3

Perangkat pemisah

Gambar 4. Tingkat perolehan ekstrak dengan pemisahan aliran balik. Oleh karena penerapan metoda pemisahan aliran balik bergantung pula pada tetapan distribusi antara zat terlarut dan pelarut, maka teknik ini masih dapat disempurnakan lebih lanjut untuk mendapatkan perolehan produk yang mendekati 99 %. Menggantikan pelarut etil asetat dengan pelarut yang lebih polar, seperti misalnya butil asetat atau aseton, merupakan salah satu kemungkinan yang dapat diambil untuk keperluan tersebut.

5.

1. 2. 3.

Kesimpulan

Dari hasil penelitian tentang perbaikan teknik ekstraksi lovastatin, maka dapat disimpulkan hal-hal berikut: Ekstraksi lovastatin dengan metoda pemisahan aliran silang dapat memberikan perolehan produk sebesar 91.3 %, jika dilakukan dalam beberapa tahapan ekstrasi dengan porsi kecil pelarut. Ekstraksi lovastatin dengan metoda pemisahan aliran balik dapat meningkatkan perolehan produk hingga 94.7 %, meskipun harus dikompensasikan dengan meningkatnya penggunaan pelarut. Kadar lovastatin hasil fermentasi Aspergillus terreus yang diekstraksi dengan teknik aliran balik adalah 618.95 - 915.92 µg/mL media.

Daftar Pustaka 1.

Cottingham, J., (1998), ” Lovastatin / Mevacor™ : Cholesterol Control”, hal. 1-3, The Parkins List Drug Database Index.

2.

Ewing, G., (1975), ”Instrumental Methods of Chemical Analysis”, 4th ed., McGraw-Hill Book Co., Tokyo.

3.

Hamilton, L.F., Simpson, S.G., dan D.W. Ellis, (1960), “Calculation of Analytical Chemistry”, 7th ed., McGraw-Hill Book Co., New York.

4.

Hardmann, J.G. et al., (editor), (1996), “Goodman and Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics”, hal. 885-887, McGraw-Hill Book Co., New York.

5.

Holbrook, W.B., dan J.E. Rein, (1964), “Extraction and Spectrophotometric Determination of Gold”, Anal. Chem., vol. 36, no. 13, hal. 2451-2453.

6.

Moore, R.N. et al., (1985), “Biosynthesis of the hypocholesterolemic agent mevinolin by Aspergillus terreus. Determination of the origin of carbon, hydrogen, and oxygen atoms by carbon-13 NMR and mass spectrometry ”, J. Am. Chem. Soc., vol. 107, no. 12, hal. 3694-3701.


7

Ekstraksi Lovastatin

Recommend Documents