Model Fermentasi Lovastatin*

Akta Kimindo Vol. 1 No. 2 April 2006: 99-104

AKTA KIMIA

INDONESIA

Model Fermentasi Lovastatin* Tigor Nauli**1 dan Linar Z. Udin2 1Pusat Penelitian Informatika - LIPI, Jalan Cisitu, Bandung 40135 2Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Jalan Cisitu, Bandung 40135

ABSTRAK Lovastatin adalah suatu ‘pro-drug’, yang memiliki arti penting secara medis sebagai zat penurun kadar kolesterol darah dan diindikasikan berguna untuk mengurangi resiko arteriosklerosis. Biosintesis lovastatin dapat dilakukan melalui fermentasi cair terhadap jamur Aspergillus terreus dengan tersedianya sumber karbon yang cukup dan kondisi proses yang terjaga pada agitasi 150 rpm dan suhu 28 oC. Produk dipanen setelah 6 hari fermentasi dan selanjutnya diekstraksi untuk memperoleh lovastatin murni. Profil pertumbuhan sel Aspergillus terreus selama waktu fermentasi dapat dinyatakan sebagai

d [Sel ] [Sel ] = k1 × [Sel ] × (1.0 − ) dt k2 dimana k1 adalah 0.09 untuk tahap awal pertumbuhan hingga tahap stasioner, dan k1 adalah -0.058 untuk tahap kematian sel. Sedangkan nilai k2 untuk semua tahapan adalah 61.57. Dengan menggunakan lima konsentrasi tepung jagung sebagai sumber karbon, maka laju produksi lovastatin akan mengikuti model pembentukan

d [Lovastatin ] = k 3 × [Sel ] + k 4 × [Lovastatin ] dt dimana k3 adalah 0.01, 0.06, 0.037, 0.024, dan 0.024 untuk berturut-turut 2.5 %, 5 %, 7.5 %, 10 %, dan 12.5 % tepung jagung. Nilai tetapan kinetika k4 adalah sama untuk semua konsentrasi, yaitu sebesar 0.027. Dalam lingkupan kondisi proses fermentasi yang diteliti, kadar lovastatin tertinggi sebesar 2808 g/L media dicapai pada penggunaan 5 % tepung jagung. Optimalisasi perolehan lovastatin ini lebih lanjut dapat diupayakan dengan memanfaatkan model kinetika proses yang telah didapatkan. Kata kunci: fermentasi, laju reaksi, lovastatin, model kinetika ABSTRACT Lovastatin is a pro-drug for reduction of plasma cholesterol. It was indicated as an agent for preventing arteriosclerosis risk in human. Lovastatin is biosynthetically produced from a liquid fermentation of Aspergillus terreus with sufficient amount of C-source in a controlled condition of 150 rpm agitation and 28 0C temperature. Product was harvested after 6 days of fermentation and followed by an extraction to obtain the pure lovastatin. The cell growth of Aspergillus terreus during the fermentation period can be expressed as

d [ Sel ] [ Sel ] = k1 × [ Sel ] × (1.0 − ) dt k2 where k1 is 0.09 for the beginning until the stationary phase and k1 is -0.058 for the cell death phase. The value of k2 is 61.57 for all phases.

Makalah ini disajikan pada Seminar Nasional Kimia VII, di Surabaya 9 Agustus 2005 ** Corresponding author Phone : (022) 2504711, Fax.: (022) 2504712; e-mail: [email protected] *

© Kimia ITS – HKI Jatim

99

Nauli dan Udin-Model Fermentasi Lovastatin

By introducing five different concentrations of cornstarch as the C-source, the biosynthesis of lovastatin can be modeled as

d [ Lovastatin] = k 3 × [ Sel ] + k 4 × [ Lovastatin] dt where k3 are 0.01, 0.06, 0.037, 0.024 and 0.024 for 2.5 %, 5 %, 7.5 %, 10 %, and 12.5 % cornstarch, respectively. The kinetic constant k4 is 0.027 for all cornstarch concentrations. The highest production of lovastatin for 2808 g/L medium was discovered in the usage of 5 % cornstarch. The optimum product recovery of lovastatin can be found by applying these kinetic models. PENDAHULUAN Lovastatin adalah suatu pro-drug, yang di dalam tubuh akan segera terhidrolisis menghasilkan suatu senyawa yang dapat menghambat bersaing kerja dari HMG-CoA reduktase, yaitu sebuah enzim yang mengkatalisis perubahan HMG-CoA menjadi mevalonat, yang merupakan sebuah tahap penting dalam biosintesis kolesterol. Hambatan enzim ini meningkatkan densitas reseptor LDL dalam sel hati sehingga terjadi penurunan LDLkolesterol. Aktivitas lovastatin ini memiliki arti penting secara medis sebagai obat anti hiperkolesterol-emia [Hardmann, et al., 1996] dan diindikasikan dapat menurunkan resiko arteriosklerosis [Cottingham, 1998]. Biosintesis Lovastatin Lovastatin telah diketahui dapat diturunkan dari asetat melalui lintas poliketida [Moore, 1985]. Biosintesis poliketida di dalam bakteri dan jamur adalah berkaitan dengan metabolisme asam lemak meski memiliki perbedaan dimana beberapa reaksi reduksi atau dehidrasi yang dikatalisa oleh poliketida sintase (PKS) akan ditekan pada tahap biosintesis tertentu. Substratsubstrat selain asetil-CoA dan malonil-CoA dapat digunakan oleh PKS untuk menyusun suatu rantai karbon. Dengan menggabungkan produk metabolisme asam lemak dan modifikasi PKS maka dimungkinkan diperolehnya berbagai macam metabolit sekunder yang bersifat biologis aktif [O’Hagan, 1991]. Aspergillus terreus merupakan salah satu jamur PKS yang diharapkan dapat menghasilkan salah satu metabolit sekunder poliketida, yaitu: Lovastatin. Aspergillus terreus mengalami metabolisme sekunder ketika sumber makanan dalam media telah berkurang akibat digunakan untuk metabolisme primer. Sumber makanan yang tersisa di dalam media akan digunakan oleh Aspergillus terreus untuk melakukan metabolisme sekunder tersebut. Hasil dari metabolisme sekunder ini disebut sebagai metabolit sekunder Proses pembentukan metabolit sekunder dapat dilakukan dengan cara fermentasi menggunakan metode batch dengan sistem terendam, dimana kultur Aspergillus terreus 100

berada di bawah permukaan media. Melalui cara ini maka jenis dan konsentrasi komponen dalam media cair dapat diatur agar mencapai kondisi optimum pertumbuhan dan pemakaian media yang lebih efisien. Sehingga akan dapat dicapai perolehan produk metabolit sekunder yang maksimum. Pada proses fermentasi, Aspergillus terreus memerlukan sumber karbon sebagai sumber nutrisi untuk dapat tumbuh dan melakukan metabolisme. Sumber ini dapat diperoleh dari senyawa yang mengandung karbohidrat (atau senyawa gula), seperti misalnya glukosa, laktosa, gliserol, dan tepung dalam berbagai konsentrasi. Model Fermentasi Kinetika proses fermentasi dapat dimodelkan sebagai ekspresi laju reaksi dalam bentuk persamaan diferensial biasa (ordinary differential equation). Secara umum, proses batch fermentasi tersebut dapat diwakili oleh laju pertumbuhan sel dan laju pembentukan metabolit sekunder. Ekspresi laju reaksi yang dicocokan (mathematical fiting) terhadap data percobaan dapat dicarikan solusinya dengan menggunakan metoda analisis regresi tak linier (non linear regression analysis). Model fermentasi yang terdiri dari sejumlah persamaan diferensial dapat ditunjukkan dalam bentuk

Y ′ = g ( x ,Y , b)

(1)

dimana Y′ = vektor turunan dari Y, g = vektor dari fungsi, x = variabel bebas, Y = vektor dari variabel tak bebas, dan b = vektor dari parameter. Solusi terhadap model adalah mencari nilai parameter b dari persamaan diferensial tersebut [Constantinides, 1987]. Jika kondisi batas dapat terpenuhi dan jika vektor b dapat diperkirakan, maka persamaan diferensial (1) dapat diintegrasikan secara numerik atau analitik menjadi

Y = f ( x , b) Jumlah kuadrat persamaan

residu,

(2) Φ,

diberikan

Φ = (Y * − Y − AΔb)T (Y * − Y − AΔb)

oleh (3)

© Kimia ITS – HKI Jatim

Akta Kimindo Vol. 1 No. 2 Oktober 2005: 99-104

dimana Y* = vektor dari variabel tak bebas hasil pengamatan percobaan, A = matriks Jacobi dari turunan parsial Y terhadap b yang dihitung terhadap semua titik pengamatan percobaan. Dengan mengambil turunan parsial Φ terhadap Δb dan membuat ruas persamaan menjadi nol, dan Δb diselesaikan, maka diperoleh

Δb = ( AT A) −1 AT (Y * − Y )

(4)

dimana Δb = vektor koreksi yang digunakan untuk memperkirakan nilai b dalam pendekatan vektor parameter yang baru bbaru = blama + Δb (5) Metoda Gauss-Newton digunakan untuk melakukan iterasi terhadap persamaan (5) dengan setiap kali memasukan nilai Δb dari persamaan (4) yang dihitung dari data percobaan, sehingga berakhir pada saat Φ tidak berubah lagi atau Δb menjadi sangat kecil. Pada akhir iterasi tersebut, maka bbaru adalah vektor parameter yang dicari. Dalam penelitian ini akan dilakukan biosintesis lovastatin melalui fermentasi cair terhadap jamur Aspergillus terreus. Serta akan ditentukan model kinetika pertumbuhan sel dan pembentukan metabolit sekundernya. BAHAN DAN METODE Mikroorganisme Jamur Aspergillus terreus ATCC 20542 yang digunakan dalam percobaan, diperoleh dari koleksi Pusat Penelitian Kimia - LIPI. Media Fermentasi Media fermentasi cair steril terdiri dari laktosa 9 g; pepton 0.6 g; corn steep liquor 1 g; gliserol 3 g; susu skim 0.42 g; tepung jagung (dalam beberapa konsentrasi) dan aquades. pH media diatur sebesar 6.8 dengan penambahan NaOH 1.125 N atau HCl 25 %, lalu media disterilisasi pada 121 °C selama 15 menit. Fermentasi Aspergillus terreus Produksi metabolit sekunder dari Aspergillus terreus dilakukan melalui metode fermentasi kultur curah atau media cair dengan melakukan peragaman konsentrasi tepung jagung yaitu 2.5, 5, 7.5, 10, dan 12.5 %. Inokulum 10 % dengan usia 30 jam diinokulasikan ke dalam tabung Erlenmeyer 500 mL yang berisi 100 mL media fermentasi cair steril. Biakan dikocok dengan pengocok orbital kecepatan 150 rpm, suhu 28 °C selama 144 jam (atau 6 hari). Ekstraksi Hasil Fermentasi Hasil fermentasi disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm, suhu 4 °C, selama 20 © Kimia ITS – HKI Jatim

menit. Filtrat dipisahkan dari endapannya dan diekstraksi 2 kali dengan heksana (perbandingan volume 1 : 1) menggunakan corong pisah, agar bersih dari pengotor minyak. Fasa air dipisahkan dan diekstraksi dengan pelarut etil asetat dengan menggunakan dua metoda pemisahan. Fraksi akhir etil asetat kemudian dipisahkan dan dievaporasi. Ekstraknya disimpan dalam botol sampel dan dibiarkan mengering pada suhu kamar, untuk selanjutnya diukur kadar produk (lovastatin) nya dengan HPLC. Analisa Kualitatif Lovastatin Analisa kualitatif terhadap ada/tidaknya lovastatin dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi puncak yang muncul pada kromatogram dengan waktu retensi lovastatin standar, menggunakan TLC. Rf sampel hasil ekstraksi dan kristal putih dibandingkan dengan Rf standar lovastatin (SIGMA). Penentuan Kadar Lovastatin Penentuan kadar lovastatin dilakukan dengan menggunakan HPLC, pada kolom C18, fase gerak metanol : air (9 : 1), panjang gelombang (λ) 254 nm, dan flow/pressure 1/88 kg cm m-1, terhadap ekstrak hasil pemisahan dengan etil asetat. Kadar lovastatin diperoleh dengan membandingkan luas area lovastatin sampel dengan luas area lovastatin standar, yaitu: Csampel = (Lsampel / Lstandar) x Cstandar. Kinetika Fermentasi Ditetapkan model pertumbuhan sel Aspergillus terreus dan model pembentukan lovastatin dalam bentuk persamaan-persamaan laju reaksi. Solusi terhadap kedua persamaan simultan ini dicari dengan menggunakan analisis regresi tak linier berganda (multiple non-linear regression) terhadap data percobaan dengan memasukan hasil fermentasi sebagai variabel tak bebas dan waktu fermentasi sebagai variabel bebasnya. HASIL DAN PEMBAHASAN Pertumbuhan sel Aspergillus terreus Ketika mikroorganisme Aspergillus terreus tumbuh di dalam fermentor dalam kondisi yang terjaga, maka sel akan bertambah dengan laju yang dapat dimodelkan sesuai kaidah logistik, yaitu:

dy1 y = k1y1 (1.0 − 1 ) dt k2

(6)

dimana y1 adalah konsentrasi (atau banyaknya) sel dalam satuan gram berat kering atau satuan kekeruhan larutan. Selama masa fermentasi berlangsung, perubahan konsentrasi sel yang diamati pada setiap 6 jam sekali, memberikan profil pertumbuhan seperti yang terdapat pada 101

Nauli dan Udin-Model Fermentasi Lovastatin

Pembentukan Metaboliut Sekunder Lovastatin Laju pembentukan metabolit sekunder lovastatin secara matematis dapat dikuantifikasi melalui persamaan

Gambar 1. Profil yang ditunjukkan oleh percobaan ini merupakan model normal yang umum terjadi pada suatu pertumbuhan sel. Disana terlihat dengan jelas adanya fasa awal pertumbuhan (6 jam pertama), fasa eksponensial (hingga hari kedua fermentasi), fasa stasioner (antara hari kedua hingga hari ketiga), dan fasa kematian sel (melewati hari ketiga fermentasi).

dy 2 = k 2 y1 + k3y 2 dt

dimana y2 adalah konsentrasi lovastatin dalam g/mL media dan y1 adalah banyaknya sel yang berasal dari persamaan (6) sebelumnya. Dengan pemakaian lima macam konsentrasi tepung jagung sebagai sumber karbon di dalam media fermentasi, maka diperoleh gambaran mengenai laju pembentukan lovastatin seperti pada Gambar 2. Kurva laju tersebut hanya terlihat sebanyak empat buah, karena kinetika laju pembentukan lovastatin dengan penggunaan 10% dan 12.5% tepung jagung adalah tepat sama besarnya (atau kedua kurva saling berhimpitan).

70 60

Sel (% T)

50 40 30 20 10 0 0

24

48

72

96

120

144

(9)

168

Waktu fermentasi (jam)

Gambar 1.

2.5%

Profil pertumbuhan sel Aspergillus terreus.

5%

7.5%

10%

12.5% tepung jagung

3500

Panjangnya selang waktu pada setiap fasa adalah khas untuk setiap sel dan bergantung pula pada pengaturan kondisi fermentasi yang dilakukan. Informasi yang diperoleh ini akan menjadi pertimbangan pada fermentasi berikutnya, apabila perolehan produk fermentasi tidaklah sesuai dengan yang telah diperkirakan. Dari hasil perhitungan kinetika terhadap data percobaan, maka laju pertumbuhan sel Aspergillus terreus hingga fasa stasioner dapat dimodelkan menjadi

[Sel ] d [Sel ] ) = 0.09 × [Sel ] × (1.0 − 61.57 dt

(7)

Sedangkan setelah fasa stasioner, model pertumbuhan sel Aspergillus terreus adalah

d [Sel ] [Sel ] = −0.058 × [Sel ] × (1.0 − ) dt 61.57

(8)

Nilai tetapan kinetika k1 yang negatif (pada persamaan 8) menyatakan laju pertumbuhan sel yang menurun, yaitu pada saat sel-sel mulai berhenti tumbuh setelah melewati hari ketiga fermentasi. Waktu itu merupakan saat dimana sel-sel Aspergillus terreus mulai membentuk metabolit-metabolit sekunder, terutama lovastatin. Konfirmasi terhadap peristiwa sintesis metabolit sekunder terlihat nyata pada kurvakurva laju pembentukan (dalam Gambar 2) yang menaik secara tajam setelah hari ketiga (atau 72 jam) fermentasi. Kemudian kurva tersebut mencapai maksimumnya pada hari ke enam fermentasi, dimana sel sudah tidak ada lagi yang tumbuh.

102

Lovastatin (g/L media)

3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0

24

48

72

96

120

144

168

Waktu fermentasi (jam)

Gambar 2.

Laju pembentukan lovastatin pada lima kondisi fermentasi.

Dari perhitungan terhadap kadar metabolit sekunder yang terbentuk selama perioda fermentasi, maka dapat dimodelkan laju pembentukan lovastatin sebagai

d [Lovastatin ] = (10) dt k 3 × [Sel ] + k 4 × [Lovastatin ] dimana nilai dari tetapan kinetika k3 adalah 0.01, 0.06, 0.037, 0.024, dan 0.024 untuk berturutturut pemakaian 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, dan 12.5% tepung jagung. Dan nilai tetapan kinetika k4 adalah sama untuk semua konsentrasi, yaitu sebesar 0.027. Model kinetika pembentukan lovastatin (persamaan 10) memperlihat-kan bahwa laju pembentukan ditentukan oleh banyaknya sel pada satu waktu fermentasi dan ditentukan oleh banyaknya lovastatin yang telah dihasilkan pada saat itu. Dalam keadaan konsentrasi lovastatin tertentu (yang diekspresikan oleh parameter k4 yang tetap), maka faktor penentu laju lebih © Kimia ITS – HKI Jatim

Akta Kimindo Vol. 1 No. 2 Oktober 2005: 99-104

dominan pada banyaknya sel (yang dinyatakan oleh tetapan laju k3 yang bervariasi). Laju pembentukan paling rendah, dimana k3 = 0.01, terjadi pada proses fermentasi dengan menggunakan 2.5% tepung jagung. Sedangkan laju pembentukan tertinggi, dimana k3 = 0.06, teramati pada pemakaian 5% tepung jagung.

perolehan lovastatin pada pemakaian 2.5% tepung jagung. Pada perancangan penelitian yang berikutnya, dapat diupayakan variasi konsentrasi yang lebih cermat pada selang 2.5% hingga 7.5% tepung jagung, agar dapat ditemukan secara akurat perolehan lovastatin yang maksimum.

Perolehan Lovastatin Profil pertumbuhan sel Aspergillus terreus yang terlihat normal (pada Gambar 1), dapat menyatakan bahwa proses fermentasi telah berjalan secara baik. Sehingga dapat diharapkan akan diperolehnya metabolit sekunder lovastatin dalam jumlah yang menggembirakan. Perolehan lovastatin pada lima batch fermentasi ditunjukkan pada Gambar 3 berikut ini. Kecenderungannya adalah mirip dengan laju pembentukannya, dimana terlihat lonjakan yang tajam antara penggunaan 2.5% dan 5% tepung jagung. Dan menurun kembali hingga stagnan pada pemakaian tepung jagung yang lebih tinggi lagi.

KESIMPULAN Dari hasil percobaan fermentasi Aspergillus terreus menggunakan tepung jagung sebagai sumber karbon, maka disimpulkan bahwa:

2808

3000

1. Profil pertumbuhan Aspergillus terreus terlihat mengikuti kaidah logistik umum dan dapat dimodelkan sebagai

d [Sel ] [Sel ] = 0.09 × [Sel ] × (1.0 − ) dt 61.57 pada fasa awal pertumbuhan hingga fasa stasioner. Dan dapat dimodelkan sebagai

d [Sel ] [Sel ] = −0.058 × [Sel ] × (1.0 − ) dt 61.57 pada fasa kematian sel.

Lovastatin (g/L media)

2500

2. Laju pembentukan lovastatin selama enam hari (atau 144 jam) fermentasi cair dapat dimodelkan sebagai

1804

2000 1500

1060

1060

1000

484 500 0 2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

Konsentrasi tepung jagung (%)

Gambar 3.

Perolehan lovastatin pada lima kondisi fermentasi.

Aspergillus terreus menggunakan tepung jagung secara optimal pada konsentrasi 5% (5 g/100 mL). Penam-bahan konsentrasi tepung jagung lebih besar dari 5% ternyata justru menurunkan konsentrasi lovastatin yang dihasilkan. Peristiwa ini mirip seperti kinetika enzimatis substrat tunggal, dimana penambahan substrat yang lebih banyak dari suatu konsentrasi tertentu akan dapat menurunkan jumlah produknya [Laidler, 1973]. Disini kemungkinan telah terjadi suatu peristiwa inhibisi balik (feed-back inhibition), dimana penambahan konsentrasi tepung jagung yang melebihi dari kadar optimalnya justru akan menghambat terbentuknya lovastatin, sehingga akhirnya jumlah lovastatin yang dihasilkan akan menjadi lebih sedikit. Dari kondisi fermentasi yang telah ditetapkan dalam percobaan ini, maka perolehan tertinggi produk lovastatin adalah sebanyak 2808 g/L media. Perolehan ini hampir enam kali lipat © Kimia ITS – HKI Jatim

d [ Lovastatin] = dt k 3 × [Sel ] + k 4 × [ Lovastatin] dengan tetapan k3 adalah 0.01, 0.06, 0.037, 0.024, dan 0.024 untuk pemakaian 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, dan 12.5% tepung jagung. Dan tetapan k4 adalah 0.027 untuk semua konsentrasi. 3. Dalam kondisi percobaan yang telah dilakukan, kadar lovastatin tertinggi sebesar 2808 g/L media dicapai pada penggunaan 5 % tepung jagung. DAFTAR PUSTAKA Constantinides, A., 1987, Applied Numerical Methods with Personal Computers, McGrawHill Book Co., New York, 563-571. Cottingham, J., 1998, Lovastatin/ Mevacor™: Cholesterol Control, The Parkins List Drug Database Index, 1-3. Hardmann, J.G. et al., Eds., 1996, Goodman and Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, McGraw-Hill Book Co., New York, 885-887. Laidler, K.J., Bunting, P.S., 1973, The Chemical Kinetics of Enzyme Action, Clarendon Press, Oxford. 103

Nauli dan Udin-Model Fermentasi Lovastatin

Moore, R.N. et al., 1985, Biosynthesis of the hypocholesterolemic agent mevinolin by Aspergillus terreus. Determination of the origin of carbon, hydrogen, and oxygen atoms by carbon-13 NMR and mass spectrometry, J. Am. Chem. Soc. 107:12, 3694-3701.

104

O’Hagan, D., 1991, The Polyketide Metabolites, Ellis Horwood, New York.

© Kimia ITS – HKI Jatim