INOKULUM Inokulum adalah bahan padat/cair yang mengandung mikrobia/spora/enzim yang ditambahkan kedalam substrat/media fermentasi Kriteria inokulum untuk industri : 1. Kultur mikrobia sehat dan aktif (dalam fase logaritmik) fase lag pendek 2. Tersedia dalam jumlah cukup untuk tercapainya proporsi inokulum dan media fermentasi yang optimal 3. Bebas kontaminan 4. Memiliki kemampuan membentuk produk yang tetap stabil 5. Berada dalam bentuk morfologi yang sesuai
Pada tahap awal pengembangan inokulum diutamakan jumlah sel tinggi dan aktif, bukan pembentukan produk komposisi media yang digunakan berbeda dengan media untuk fermentasi Tujuan penyiapan media untuk inokulum: 1. Menyediakan nutrisi bagi pertumbuhan sel 2. Memberikan fase lag minimal
Secara umum susunan media untuk inokulum/starter memiliki kadar sumber karbon yang relatif lebih rendah dibandingkan media untuk produksi Proporsi inokulum yang ditambahkan umumnya 3 – 10 % dari volume total media fermentasi pertumbuhan cepat fase lag singkat efisiensi penggunaan subtrat tinggi Bila konsentrasi inokulum terlalu kecil mudah mengalami kontaminasi
Inokulum dikembangkan dari kultur stock melalui beberapa tahap untuk mencapai jumlah inokulum yang didinginkan semakin panjang tahap pengembangan inokulum semakin besar resiko terjadinya kontaminasi Preparasi/penyiapan inokulum : Ambil inokulum dari kultur stock yang disimpan dalam agar slant Lakukan rekonstitusi (diremajakan), tempatkan pada cawan agar Ambil mikrobia pada cawan agar dengan jarum ose, goreskan pada cawan agar lain, biakan pada starter I, II, III Starter III dapat digunakan untuk produksi
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pengembangan inokulum 1. Kemurnian inokulum 2. Cara pemeliharaan yang sesuai 3. Umur kultur 4. Jumlah sel mikrobia : bakteri = 108 – 109 sel/ml yeast = 106 sel/ml jamur = 104 spora/ml
Aplikasi pengembangan dalam industri fermentasi 1. Inokulum yeast a. Inokulum yeast dalam industri bir Yeast diambil dari kultur stock, tempatkan dalam agar slant 2 - 3 hari lakukan pengembangan inokulum hingga mencapai 150 ml 150 ml kultur yeast aktif dibiakkan 3 - 4 hari dalam wadah 1,5 liter pompakan ke tanki 150 liter yang berisi wort steril lakukan aerasi, inkubasi 3 - 4 hari setelah inkubasi sebagian (1,5 liter) kultur dikembalikan ke tanki kecil, sisanya dialirkan ke tanki produksi dengan volum 1000 liter dimungkinkan penggunaan inokulum dari proses fermentasi sebelumnya dalam praktek hanya dilakukan 5 – 10 kali untuk mencegah kemungkinan kontaminasi
b. Produksi baker’s yeast komersil lakukan beberapa tahap pengembangan inokulum tahap I : 0,2 kg 190 kg dalam waktu 24 jam tahap II : 190 kg 1000 kg dalam waktu 9 jam tahap III : 1000 kg 5000 kg dalam waktu 11 jam tahap IV : 1000 kg 5000 kg dalam waktu 11 jam tahap V : 1000 kg 5000 kg dalam waktu 11 jam Tahap I dan II dilakukan secara aseptis Tahap III, IV dan V dilakukan dalam tanki yang bagian atasnya terbuka
2. Inokulum Bakteri tujuan utama adalah memperoleh sejumlah massa sel aktif pada fase logaritmik panjang fase logaritmik ditentukan jumlah dan keadaan fisiologis inokulum (bentuk spora atau sel vegetatif)
a. Pengembangan inokulum Bacillus subtilis untuk produksi protease (bacitrasin) Tahap
Kondisi
waktu
1
4 liter media diinokulasi dengan kultur stock
18 – 24 jam
2
Kultur tahap 1, diinokulasi dalam 759 liter media
6 jam
3
Kultur tahap 2, diinokulasi dalam 6000 liter media
6 jam
4
Kultur tahap 3, diinokulasi dalam media produksi 120.000 liter
Sampai produksi enzim optimal
b. Pengembangan ionkulum Clostridium acetobutylicum (anaerob) pada proses produksi aseton-butanol Tahap
Kultur
Medium
1
Rekonstitusi sel kultur stock (24 jam)
Potato Glucose broth
2
4% glukosa, 5% amonium Kultur tahap 1, diinokulasi dalam 600 ml sulfat, 6% CaCO3, 6,2% media (20 -24 jam) P2O4
3
90 ml kultur tahap 2 diinokulasi dalam 3000 ml media (20 – 24 jam)
Seperti tahap 2
4
3000 ml kultur tahap 3, diinokulasi dalam 25.000 liter media
Seperti tahap 2, glukosa 6%
5
Kultur tahap 4, diinokulasi (0,5 – 3% Seperti tahap 4 dengan inokulum) ke dalam media 300.000 – 2,5 amonia sebagai kontrol juta liter media untuk skala produksi pH
3. Inokulum Jamur Sebagian besar jamur dapat membentuk spora aseksual. Suspensi spora dibutuhkan dalam jumlah banyak untuk skala produksi. Jamur dapat membentuk spora pada media yang sesuai dan luas permukaan yang cukup a. Sporulasi pada media biji-bijian media biji seperti barley atau sekam disterilisasi, inokulasi dengan spora jamur inkubasi pada suhu 28oC selama 6 hari pada RH 98 % spora jamur Aspergillus ochraeus dilakukan dalam gelas 2,8 liter yang diisi 100 gr barley dan sekam, diperoleh 5 x 1011 konidia jamur
b. Secara Submerged Culture Spora jamur dikembangkan dalam media whey dan corn step liquor, diaerasi dilakukan dalam pengembangan jamur Penicillium patulum untuk produksi Griseovulvin
c. Sistem roll Bottle media agar 36% disterilisasi dalam botol 1 liter berbentuk silinder didinginkan hingga suhu 40 – 50oC botol diputer sehingga media menempel pada seluruh permukaan bagian dalam botol inokulasikan dengan spora jamur, inkubasi 6 – 7 hari pada suhu 24oC
Pengembangan inokulum Penicillium chrysogenum untuk produksi penisilin Tahap 1
Kultur stock spora dalam pasir steril
Tahap 2
Kultur dipindahkan dalam media agar
Tahap 3
Kultur dikembangkan dalam roll tube
Tahap 4
Miselia dan spora tumbuh dalam skala produksi pertama
Tahap 5
Digunakan untuk inokulasi skala produksi kedua (volume inokulum 7 – 10%)
d. Menggunakan sel vegetatif cara ini relatif sulit untuk memperoleh populasi inokulum yang sesuai perlu pemotongan miselia sebelum digunakan untuk inokulasi (dengan waring blender) digunakan pada produksi Giberelin oleh jamur Giberella fujikuroi Kultur ditumbuhkan pada long slant agar (PDA) selama 1 minggu pada suhu 24oC Inokulum dipindahkan kedalam media cair yang terdiri dari : 2 % glukosa, 0,3 % MgSO4.7H2O, 0,3 %NH4CL dan 0,3 % KH2PO4 Diaerasi selama 75 jam pada suhu 28oC
