Peningkatan produksi β-glukan dengan penambahan EDTA pada media fermentasi Agrobacterium Kusmiati Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI Jl. Raya Bogor Km 46, Cibinong 16911 Bogor Tel.(021)8754587 Fax.(021)8754588 e-mail:
[email protected] Abstrak
β-Glukan merupakan polisakarida yang dihasilkan oleh mikroorganisme Agrobacterium melalui fermentasi glukosa. Senyawa ini ditemukan pada tahun 1966 dan diproduksi secara komersial di Jepang tahun 1989. Saat ini digunakan secara luas di industri makanan dan farmasi. Aplikasinya sebagai antimikroba, antikolesterol, antiinflamasi, antioksidan dan sebagai imunostimulan.Percobaan ini bertujuan untuk memproduksi β-glukan dengan menggunakan 3 galur Agrobacterium yaitu A1-5 , B4.4 dan Bro3/2. Perlakuan menggunakan beberapa konsentrasi EDTA yaitu 0mM, 0,1mM, 0,5mM dan 1 mM dalam media fermentasi. Bakteri diinkubasi pada suhu ruangan selama 6 hari. Kultur diekstraksi dengan metode netralisasi asam basa untuk memperoleh β-glukan. Berat kering β-glukan dihitung setelah dikeringkan semalam pada suhu 50°C. Kandungan glukosa ditentukan dengan metode fenol sulfat dan protein dengan metode Lowry. Hasil menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi EDTA disertai meningkatnya produksi glukan. Produksi β-(1,3) glukan tertinggi dihasilkan oleh Agrobacterium Bro3/2 dalam media mengandung EDTA 1mM sebesar 0,393 mg/ml, diikuti galur B4.4 (0,193 mg/ml) dan galur A1-5 (0,187 mg/ml). β-(1,2)glukan tertinggi dihasilkan oleh Agrobacterium A1-5 dalam medium mengandung EDTA 0,5 mM (2,70 mg/ml), diikuti galur B4-4 (1,455 mg/ml) dan Bro3/2 (1,367 mg/ml) dalam media EDTA 1 mM. Abstract
β-Glucan is a polysaccharide produced by the microorganism Agrobacterium, through glucose fermentation. It was discovered in 1966, and it was put into commercial production in Japan in 1989, and is currently widely used in the food industry and pharmaceutical product. The application of β-glucan as antimicrobial, anticholesterol, antiinflammation, antioxidant and immunostimulant. The aim of experiment to produce of β-glucan by using the three strains of Agrobacterium sp i.e. A1-5, B4.4 and Bro3/2. Several of EDTA concentration i.e. 0 mM, 0,1 mM, 0,5 mM and 1 mM was treated in fermentation medium. The bacteria were incubated at room temperature for six days. The cultures was extracted by the acid-alkaline neutralized method to the β-glucan obtain. The crudeβ-glucan was harvested by centrifugation; the dry weight of the β-glucan was measured after overnight incubation at 50°C. The amount of glucose was determined by the phenol-sulfuric acid assay and the protein contain was measured by Lowry method. The result showed that enhanced of EDTA concentration was followed the increase of β-glucan production. The highest β-(1,3) glucan production by Agrobacterium Bro3/2 strains in media contained of EDTA 1mM (0,393 mg/ml), it’s followed B4.4 strains (0,193 mg/ml) and A1-5 strains (0,187 mg/ml). The highest β-(1,2)glucan was resulted by Agrobacterium A1-5 in media contained of EDTA 0,5 mM (2,70 mg/ml), it’s followed B4.4 strain (1,455 mg/ml) and Bro3/2(1,367mg/ml)in media with EDTA 1mM. I. Pendahuluan Perkembangan bioteknologi mikroba memegang peranan penting untuk menghasilkan polisakarida tertentu yang berkualitas tinggi. Polisakarida berfungsi sebagai unsur struktural di dalam dinding sel dan jaringan pengikat. Galur-galur bakteri tertentu seperti Alcaligenes faecalis, Agrobacterium sp dan Rhizobium sp dapat menghasilkan jenis polisakarida ini dengan bobot molekul tinggi hingga mencapai 74.000. Pada penelitian ini akan menggunakan Agrobacterium sp. Bakteri ini bersifat aerob, dengan tipe metabolisme respirasinya menggunakan oksigen sebagai aseptor electron terminal. Suhu optimum pertumbuhan antara 25-28°C. Koloni umumnya berbentuk cembung , sirkular, halus, tidak berpigmen sampai berwarna putih kekuningan. Bakteri ini dijumpai disekitar permukaan akar tanaman. Agrobacterium sp kecuali A. radiobacter dapat masuk ke dalam bagian tanaman seperti mahkota, akar dan batang dari tanaman dikotil (contoh apel dan pear) maupun monokotil (brokoli, sawi, kubis) melalui luka. Hal ini dapat menyebabkan perubahan sel tanaman menjadi sel tumor yang
berfloriferasi secara otonom yang dikenal dengan istilah crown gall, hairy root dan cane gall (Kreig &Holt, 1984). Struktur dinding sel Agrobacterium sp pada dasarnya sama dengan dinding sel bakteri Gram negatif lainnya yaitu terdiri dari senyawa peptidoglikan. Polimer ini terdiri dari tiga macam bahan pembangun yaitu N-asetil glukosamin (AGA), asam N-asetilmuramat (AAM) dan suatu peptida (Pelczar & Chan, 1986). Jenis polisakarida yang banyak diteliti saat ini yaitu β-glukan. Polisakarida ini dicirikan oleh pengulangan subunit-subunit glukosa yang digabungkan melalui suatu ikatan β antara karbon pertama dan ketiga cincin glukosa yang struktur primernya merupakan suatu rantai panjang, Jenis ini dikenal curdlan.(Saito et al, 1990) Sedangkan yang memiliki ikatan antara karbon pertama dan kedua cincin glukosa, struktur primernya merupakan suatu siklik dan dikenal Siklosporan. Jenis β-glukan yang banyak digunakan di industri farmasi adalah β-1,2-glukan (siklosporan), β-1,3glukan(curdlan) dan β-1,6-glukan. Perbedaan ketiganya terletak pada ikatan antara monomer glukosa satu dengan monomer glukosa lainnya. Pada Gambar 1 menunjukkan struktur β-1,3-glukan, disini monomer glukosa pada C1 terikat dengan C3 glukosa lainnya dengan ikatan β-glikosidik membentuk rantai polimer lurus yang sangat panjang. Agrobacterium sp. dalam metabolismenya menghasilkan glukan jenis β-1,2-glukan dan β-1,3-glukan (Lippen & Bohin, 1997) Rumus bangun : (C6H10O5)n
Gambar 1. Struktur kimia β-1,3-glukan (Cheesman & Brown, 1995) Sifat fisika β-1,3-glukan merupakan serbuk putih atau hampir putih, tidak berbau atau hampir tidak berbau. Bersifat tidak larut dalam air dan etanol, larut dalam alkali. Sifatnya netral dalam 1% cairan suspensi pH 6 –7,5. Aplikasinya sebagai zat pengokoh, pembentuk gel, stabilisator, pengental. Curdlan membentuk gel yang bersifat kenyal (resilient) bila suspensinya dipanaskan di atas suhu 54ºC, kekuatan gelnya semakin meningkat dengan bertambahnya temperatur. Struktur curdlan yang linier menyebabkan tahan terhadap pemanasan dan faktor eksternal lainnya seperti pH (Lee&Park, 2001). Indikasi sebagai senyawa antiinfeksi, antikolesterol, antidiabetes, antioksidan dan dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh (Anonim, 1999). β-1,2-glukan memiliki sifat yang berbeda dengan β-1,3-glukan. β-1,2-glukan dikenal juga dengan siklik glukan karena polimernya berbentuk siklik. Perbedaan letak ikatan antara monomer satu dengan lainnya menyebabkan perbedaan kelarutan antara keduanya. β-1,2-glukan bersifat larut dalam air. Struktur bagian luarnya bersifat hidrofilik sedangkan bagian dalamnya bersifat hidrofobik sehingga dapat digunakan sebagai carrier bahanbahan yang sukar larut dalam air (Breedveld et al, 1990) Umumnya dalam media pertumbuhan bakteri ditambahkan komponen zat yang bersifat pengkhelat yang berfungsi untuk mengikat logam-logam divalen. Senyawa yang biasanya ditambahkan ke dalam media pertumbuhan bakteri antara lain adalah EDTA (Ethylen Diamin Tetraacetic Acid). Dalam beberapa penelitian dilaporkan bahwa EDTA mampu mengaktivasi nukleotida yang merupakan aktivator Glucansynthetase (mengaktifkan sintesis βglukan). Penambahan EDTA dalam jumlah yang tepat akan meningkatkan produksi β-glukan dari Agrobacterium sp.(Breedveld, 1992). Penambahan EDTA ke dalam media fermentasi, selain berfungsi untuk mengikat cemaran ion logam yang terdapat dalam media pertumbuhan, sebagai aktivator Glucansynthetase pada bakteri, juga berfungsi untuk mengikat ion logam (Ca2+) yang terdapat pada dinding sel bakteri. Terikatnya logam ini diperkirakan akan melemahkan ikatan pada dinding sel bakteri sehingga β-glukan akan terbebas dalam jumlah yang lebih besar (Brock &Katherine, 1973). Tujuan penelitian ini adalah untuk meningkatkan produksi β-glukan yang dihasilkan oleh bakteri Agrobacterium sp dengan menambah senyawa pengkhelat EDTA ke dalam media fermentasi bakteri tersebut.
2
II. Bahan dan Metode Mikroorganisme. Bakteri yang digunakan terdiri dari 3 galur Agrobacterium sp yaitu A. radiobacter A1-5 (referensi), Bro 1.2.1 dan Bro 3/2 (lokal). Masing-masing isolat diremajakan di dalam medium Luria agar (LA) dalam tabung reaksi. Media. Media pertumbuhan bakteri yang digunakan yaitu medium PY dengan komposisi sebagai berikut: Ekstrak ragi 0,5%, Kaldu pepton 1%, dan NaCl 0,5%. Bahan-bahan tersebut ditimbang dan dilarutkan dengan akuades di dalam erlenmeyer. Selanjutnya disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C, tekanan 1 atmosfer selama 15 menit. Media fermentasi yang digunakan dengan komposisi sebagai berikut : 4 g Glukosa, 500 mg CaCO3, 150 mg (NH4)2HPO4, 100 mg KH2PO4, 50 mg MgSO4.7H2O, 100 mg ekstrak ragi, 0,1 ml Larutan mineral A, 0,1 ml Larutan mineral B dan 100 ml akuades. Media fermentasi kemudian ditambahkan larutan EDTA dengan berbagai konsentrasi yaitu masing-masing 0 mM (kontrol), 0,1 mM, 0,5 mM dan 1,0mM. Media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C, tekanan 1 atmosfer selama 15 menit Prakultur Bakteri. Sebanyak satu ose stok 3 galur Agrobacterium sp segar hasil peremajaan dalam medium LA miring, masingmasing diinokulasikan ke dalam medium PY cair untuk prakultur. Biakan diinkubasi pada shaker dengan putaran 150 rpm selama 1 hari pada suhu ruangan. Produksi β-glukan Sebanyak 2% prakultur masing-masing galur bakteri yang diuji diinokulasikan ke dalam media fermentasi yang mengandung konsentrasi EDTA berbeda-beda. Kultur diinkubasi pada shaker dengan putaran 150 rpm selama 6 hari pada suhu ruangan untuk memproduksi β-glukan. Ekstraksi β-glukan Kultur yang tumbuh pada media fermentasi disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 25 °C. Endapan yang terbentuk merupakan biomassa sel sedangkan supernatan dipisahkan untuk mendapatkan β-1,2-glukan. Endapan ditambahkan dengan HCl dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu ruang. Endapan yang terbentuk dilarutkan kembali dengan NaOH 1N dan disentrifugasi kembali pada kondisi yang sama. Endapan yang terbentuk dipisahkan dan dikeringkan sebagai berat sel kering (gram). Supernatan ditambah HCl 5N hingga mencapai pH netral, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit. Endapan yang dihasilkan ditambah H2O dan etanol kemudian secara berurutan disentrifugasi pada kecepatan 5.000 selama 15 menit pada suhu ruang. Hasil ekstraksi β-1,3-glukan dikeringkan dan ditimbang (gram) (Hisamatsu, 1995). Untuk analisis kandungan glukosa dan protein endapan β-1,3-glukan dilarutkan dalam larutan NaOH encer. Bagian supernatan yang dipisahkan dari endapan sel pada sentrifus kultur bakteri, ditambah etanol sebanyak dua kali volume larutan dan disentrifugasi pada kecepatan 6.000 selama 10 menit pada suhu ruang. Supernatan dievaporasi hingga ± 1 ml. Hasil evaporasi kemudian ditambah etanol sebanyak 10 kali volume larutan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6.000 selama 15 menit. Endapan yang terbentuk kemudian dikeringkan dan ditimbang sebagai β-1,2-glukan (gram) (Breedveld, 1990). Untuk analisis kimia β-1,2-glukan dilarutkan dengan air. Pengukuran kandungan glukosa Analisis menggunakan metode fenol sulfat. Dibuat standar glukosa 1000 ppm dan diencerkan menjadi deret standar dengan konsentrasi berturut-turut 0, 20, 40, 60, 80, 100 dan 120 ppm. Sebanyak 200µl larutan sampel glukan, larutan deret standar dan blanko dipipet dan ditambah 200µl larutan fenol 5%. Campuran divorteks hingga homogen, ditambah 1 ml asam sulfat pekat kocok dan diamkan 10 menit. Larutan tersebut dididihkan selama 15 menit kemudian didinginkan. Analisis dilakukan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm.(Breedveld & Karen, 1994) Pengukuran kandungan protein Analisis menggunakan metode Lowry. Dibuat deret standar Bovine Serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi berturut-turut 0, 50, 100, 200, 300, 400 dan 500 ppm. Sebanyak 500 µl larutan sampel β-glukan, larutan deret standar dan blanko dipipet, kemudian ditambah 500 µl NaOH 1N. Larutan kocok hingga homogen kemudian
3
dididihkan selama 20 menit. Tambahkan 2.5 ml larutan D (campuran 50 ml Na2CO3 5%, 1 ml CuSO4 5 H2O 1 % dan 1 ml Na-K tartrat 2%), Larutan divortek hingga homogen dan didinginkan selama 10 menit kemudian ditambahkan larutan Folin C. Larutan didiamkan 30 menit dan diukur dengan spektrofotometer pada λ 750 nm.(Lowry et al, 1954) III. Hasil dan Pembahasan Morfologi Sel Agrobacterium sp. Agrobacterium sp digolongkan ke dalam famili Rhizobiaceae yang merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang. Bakteri ini berukuran (0,6-1) x (1,5-3) µm, selnya dapat tunggal atau berpasangan. Selnya tidak membentuk spora dan dapat bergerak (motil) dengan 1-6 flagela (peritrik). Hasil pengamatan di bawah mikroskop terhadap sel Agrobacterium sp diperlihatkan pada Gambar 2 berikut ini:
Gambar 2. Morfologi sel Agrobacterium sp di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100
Bobot beta 1,3 glukan (mg)
Efek Konsentrasi EDTA terhadap produksi β-glukan a. Produksi β-(1,3) glukan (Curdlan) Kultur Agrobacterium sp. masing-masing galur A1-5, B4.4 dan Bro 3/2 yang berumur 6 hari dalam medium produksi (100 ml) dipanen untuk diekstraksi β-glukannya. Media kultur tersebut masing-masing mengandung variasi konsentrasi EDTA sebagai berikut: 0 mM, 0,1mM, 0.5 mM dan 1 mM. Produksi β-(1,3)glukan diperoleh melalui proses ekstraksi menggunakan metode netralisasi asam basa. Pada awalnya kultur disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Untuk mendapatkan β-(1,3)glukan, maka ekstraksi dilakukan terhadap endapan hasil sentrifusi. Endapan tersebut terdiri dari sel Agrobacterium, senyawa CaC03 yang tersisa dalam media dan β-(1,3)glukan. Bagian supernatan yang diperoleh dari sentrifusi kultur, diekstraksi juga dengan sistem pengendapan menggunakan etanol absolut untuk memperoleh senyawa β(1,2)glukan (siklosporan). Hasil produksi β-(1,3)glukan dari 3 galur Agrobacterium sp yang diuji dalam media mengandung berbagai konsentrasi EDTA diperlihatkan pada Gambar 2 berikut ini:
0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
0,1
0,5
Konsentrasi EDTA (mM)
1
A 1.5 M B 4.4 Bro 3/2
Gambar 3. Produksi β(1,3)glukan dari tiga galur Agrobacterium sp. dengan penambahan EDTA
4
Perbedaan galur bakteri memberikan hasil produksi β(1,3)glukan bervariasi. Produksi tertinggi diperoleh pada media mengandung 1 mM EDTA oleh Agrobacterium Bro3/2 (galur lokal) yaitu sebesar 0,393 mg/ml. Selanjutnya diikuti galur B4.4 sebesar 0,193 mg/ml dan galur A1-5 sebesar 0,187 mg/ml. Hasil produksi β(1,3)glukan menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi EDTA yang ditambahkan ke dalam medium fermentasi, maka produksi β-(1,3)glukannya semakin meningkat (Gambar 3). Hal ini disebabkan EDTA dapat melemahkan lapisan lipopolisakarida (LPS) dinding sel bakteri melalui pengaruhnya sebagai senyawa pengkhelat yang membentuk komplek yang kuat dengan kation-kation divalen contohnya dengan Ca2+ yang merupakan stabilisator LPS pada dinding sel. Lemahnya ikatan memudahkan eksresi β-glukan ke media (Breedveld, 1992).
Berat beta (1,2)glukan (mg)
b. Produksi β-(1,2) glukan (Siklosporan) Siklik β-(1,2) glukan ditemukan pertama kali pada kultur Agrobacterium tumefasciens disebut Crown gall polysaccharide. Bobot molekul senyawa ini 3600 Da. Glukan tipe ini diisolasi dari supernatan melalui pengendapan dengan 10 kali volume etanol, setelah Senyawa EPS yang berbobot molekul tinggi diendapkan dengan 2 kali volume etanol. Selanjutnya β-(1,2) glukan dijumpai juga pada spesies Agrobacterium lainnya dan Rhizobium (Hisamatsu et al, 1983)
3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
A 1.5 M B 4.4 Bro 3/2
0
0,1
0,5
1
Konsentrasi EDTA (mM)
Gambar 4. Grafik Bobot Beta-1,2-glukan dari tiga isolat Agrobacterium sp. dengan penambahan EDTA Pada Gambar 4 menunjukkan bahwa Agrobacterium galur A1-5 menghasilkan β-(1,2) glukan paling tinggi yaitu sebesar 2,70 mg/ml pada media mengandung EDTA 0,5 mM. Sedangkan galur B4.4 dan Bro 3/2 menghasilkan β-(1,2) glukan tertinggi pada media mengandung EDTA 1mM yaitu berturut-turut (1,455 mg/ml) dan (1,367 mg/ml). Data produksi β-glukan hasil ekstraksi kultur Agrobacterium sp yang berumur 6 hari dapat dilihat pada Tabel 1 berikut ini: Tabel 1. Pengaruh penambahan EDTA terhadap produksi β-glukan (mg). Galur Agrobacterium sp
Produksi β-(1,3)glukan (mg) EDTA (mM) 0 0,1 0,5 1,0
Produksi β-(1,2)glukan (mg) EDTA (mM) 0 0,1 0,5 1,0
A1-5
0,153
0,160
0,160
0,187
0,880
0,813
2,700
1,813
B 4.4
0,080
0,107
0,127
0,193
1,033
1,077
1,000
1,455
Bro3/2
0,293
0,320
0,353
0,393
0,887
1,227
1,040
1,367
Perbedaan produksi dapat terjadi akibat perbedaan genotif antara tiga spesies Agrobacterium sp. Perbedaan kemampuan pembentukan protein atau enzim yang terlibat di dalam sintesa β-glukan akan mengakibatkan perbedaan jumlah β-glukan yang diproduksi. Selain itu kemampuan mikroba untuk beradaptasi di lingkungan media dan kemampuannya memanfaatkan sumber nutrisi untuk kelangsungan metabolisme dan pembentukan struktur sel bervariasi.
5
Absorban pada 490 nm
Analisis Glukosa dalam β-glukan Penentuan kandungan glukosa dilakukan karena merupakan monomer dari β-glukan. Analisis menggunakan metode fenol sulfat. Larutan standar yang digunakan adalah glukosa 1000 ppm yang diencerkan menjadi deret standar dengan konsentrasi sebagai berikut:0, 20, 40, 60, 80, 100, 120 ppm. Analisis dilakukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm. Kurva hubungan antara konsentrasi standar glukosa dengan absorban dapat dilihat pada Gambar 5 berikut ini:
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
20
40
60
80
100
120
140
Konsentrasi Glukosa (ppm)
Gambar 5. Kurva Hubungan konsentrasi standar glukosa (ppm) dengan absorbansi pada λ 490 nm. Hasil analisis kandungan glukosa dalam β glukan sangat bervariasi(Tabel 2). Hal ini dapat disebabkan pengaruh penambahan EDTA pada konsentrasi berbeda-beda. Namun pola dari data yang diperoleh masih belum jelas diketahui, dimungkinkan selain pengaruh dari perlakuan yang diberikan juga lebih disebabkan hasil ekstrak β glukan masih dalam bentuk crude (kasar), sehingga perlu dilakukan purifikasi. Tabel 2. Kandungan glukosa dalam sampel β-glukan yang diproduksi 3 galur Agrobacterium sp pada medium mengandung konsentrasi berbeda. Sampel
Konsentrasi EDTA (mM)
β(1,3)glukan
0 0,1 0,5 1,0
β(1,2)glukan
0 0,1 0,5 1,0
Konsentrasi Glukosa (ppm) Galur A1- Galur Galur Bro 5 B4.4 3/2 9,8 13,8 18,1 29,4 2,2 10,7 22,5 25,1 36,8 33,7 6,2 13,5 5,1 57,8 13,8 2,0
93,8 84,0 131,0 63,5
52,0 39,3 48,2 33,2
Pada kondisi belum dilakukan pemurnian terhadap produk diyakini bahwa β glukan yang dianalisis masih mengandung senyawa-senyawa lain, yang terikat dalam bentuk komplek dengan glukan dan sulit untuk dipisahkan. Analisis Protein dalam β-glukan Analisis kandungan protein dilakukan menggunakan metode Lowry yang mempunyai sensitifitas tinggi antara 10-200 µg/mg protein. Pengukuran dilakukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm. Standar protein yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin. Hubungan antara konsentrasi standar BSA dengan absorbansi tercantum pada Gambar 6 berikut ini:
6
Absorban pada 750 nm
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
100
200
300
400
500
600
Konsentrasi BSA (ppm)
Gambar 6. Kurva Hubungan konsentrasi standar Bovine Serum Albumin (ppm) dengan absorbansi pada λ750 nm. Hasil pengukuran kandungan protein dalam sampel β glukan tercantum pada Tabel 3 di bawah ini: Tabel 3. Kandungan protein dalam sampel β-glukan yang diproduksi 3 galur Agrobacterium sp pada medium mengandung konsentrasi berbeda. Sampel
Konsentrasi EDTA (mM)
β(1,3)glukan
0 0,1 0,5 1,0
β(1,2)glukan
0 0,1 0,5 1,0
Konsentrasi Protein (ppm) Galur A1-5 Galur B4.4 Galur Bro 3/2 351,5 138,2 316,1 262,8 201,6 315,3 220,8 293,4 324,7 394,4 357,9 343,2 19,5 43,4 15,2 21,4
140,5 127,5 96,8 97,5
18,1 17,6 14,1 14,5
Secara umum kandungan protein pada sampel β(1,3) glukan lebih tinggi dibandingkan pada sampel β(1,2) glukan, hal ini disebabkan β(1,3) glukan diekstraksi dari bagian endapan sel, dari kultur bakteri yang disentrifusi pertamakali. Bagian endapan sel mengandung banyak senyawa pembentuk struktur dinding sel terutama protein. Protein sebagai penyusun dinding sel terdapat dalam bentuk senyawa komplek seperti lipoprotein. Senyawa ini bersama-sama lipid (lemak) saling berikatan kuat. Selain itu dalam bentuk proteoglikan yaitu protein berikatan dengan glukan menjadi komponen tertinggi dinding sel sebagai peptidoglikan. IV. Kesimpulan Penambahan EDTA dalam berbagai konsentrasi terhadap media fermentasi Agrobacterium sp. mampu meningkatkan produksi β glukan. Dari tiga galur yang diuji yaitu Agrobacterium sp. A1-5, B.4.4 dan Bro 3/2 memberikan respon yang berbeda-beda terhadap peningkatan produksi β glukan. Peningkatan konsentrasi EDTA diikuti oleh kenaikan produksi β glukan (mg). Analisis glukosa dan protein dalam β glukan memberikan pola data yang bervariasi, karena dipengaruhi oleh berbagai faktor selain perlakuan penambahan EDTA.
7
Ucapan Terima Kasih Rasa terima kasih disampaikan kepada Bapak Dr. Sukma Nuswantara, yang telah memberikan fasilitas untuk penelitian. Rasa terima kasih disampaikan juga kepada Sdr.Evandri Ramadhan, yang telah membantu selama penelitian berlangsung. Daftar Pustaka 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.
Anonim, (1999). “Curdlan.FNP 52 add7. http://apps3.fao.org/jcfco/additive spec/docs/g/additive. 332.html Breedveld, M.W., Ludovicus, P.T.M.Zepenhuizen, dan A.J.B Zehnder (1990),”Excessive Excretion of Cyclic β-(1,2)Glucan by Rhizobium trifolii TA-1. App.Environt.Microb, 56, hal 2080-2086 Breedveld, M.W., (1992).”Oligo and Polysaccharide Synthesis by Rhizobium leguminosarum and Rhizobium meliloti” WAU Dissertation no 1477. http://www.agralin.nl/wda/abstracts/ab1477.html Breedveld, M.W. dan J.M.Karen, (1994).”Cyclic β-Glucan of Member of Family Rhizobiaceae”, Microbiol Rev 58, hal 145-148. Brock, T.D dan M.B. Katherine, (1973). “Basic Microbiology with Application”, Pretince Hall Inc., New Jersey. Hal 41 Cheesman, I.M., dan M.R Brown., (1995),”Microscopy of Curdlan Structure”, http://www.Botany.Utexas.Edu/facstaff/facpages/mbrown/ongres/icheese.htm. Hisamatsu, M., A.Amemura, K.Koizumi, T.Utamura and Y.Okada. (1993).”Structural Studies on Cyclic β(1,2)Glucan (cycloshoraoses)produces by Agrobacterium and Rhizobium. Carbohydrate Res.121, hal 3140 Hisamatsu, M. (1995),”Isolation of Rhizobium, Production of Polysaccharide and Analysis of Sugar Component. Workshop Japan, JICA Short Term. Japan, hal 1-4 Krieg, N.R. dan J.G.Holt. 1984. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology vol I. Williams &Wilkins, Baltimore, hal. 244-245 Lee, J.H. dan Y.H.Park, ((2001)”Optimal Production of Curdlan by Agrobacterium sp with Feedback Inferential Control of Optimal pH Profile”Biotech Letter 23, hal 525-530 Lippens, G dan J.P.Bohin, (1997).”Structural Diversity of the Osmoregulated Periplasmic Glucans of Gram-Negative Bacteria by a Combined Genetics and Nuclear Magnetic Resonance Approach”.The third Electronic Glycoscience Conference. http://www.oueba.univ.lille1.fr/egc3/egc3.htm Lowry, O.H, J.R.A.,Nira, F.Lewis, dan J.R.Rose, (1954).” Protein Measurement with the Folin Phenol Reagen”, J Biol. Chemistry 193, hal 265-273. Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan, (1986),”Dasar-Dasar Mikrobiologi” Jilid I. Diterjemahkan oleh Hadioetomo, R. Penerbit Universitas Indonesia, Jakarta, hal. 106-118, 148-155 Saito, H, Y. Yoshioka, M.Yokoy, dan J. Yamada, (1990),”Distinct Gelatin Mechanism between Linear and Branched (1,3)-β-D-Glucan as revealed by high-resolution solid state BC-NMR” .Biopolymer 29, hal 16891698
8
9
