PENGARUH PENAMBAHAN URASIL DALAM MEDIA FERMENTASI TERHADAP HASIL β-glukan DARI DUA GALUR AGROBACTERIUM

MAKARA, SAINS, VOL. 11, NO. 2, NOVEMBER 2007: 68-74

PENGARUH PENAMBAHAN URASIL DALAM MEDIA FERMENTASI TERHADAP HASIL β-GLUKAN DARI DUA GALUR AGROBACTERIUM Kusmiati1, Swasono R.Tamat2,3, Sukma Nuswantara1, dan Salmah Muhamad3 1. Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI, Cibinong, Bogor 16911, Indonesia 2. Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka, BATAN, Kawasan Puspiptek, Serpong, Banten 15310, Indonesia 3. Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila, Jakarta 12640, Indonesia E-mail: [email protected]

Abstrak Produksi β-glukan yang maksimal dapat ditempuh melalui optimalisasi kondisi media fermentasi. Urasil sebagai prekursor UDP-glukosa dapat menjadi donor residu glukosa dalam proses pembentukan polisakarida seperti β-glukan. Dihipotesakan bahwa konsentrasi dan waktu penambahan urasil yang tepat pada fase pertumbuhan Agrobacterium radiobacter A1.5 dan Agrobacterium sp. Bro 1.2.1 dapat meningkatkan produksi β-glukan. Pada penelitian ini urasil ditambahkan ke dalam media fermentasi sebesar 0,025%, 0,05% dan 0,1% pada fase logaritmik (24 jam) dan fase stasioner (46 jam) pertumbuhan. Hasil β-glukan dinilai dari bobot kering β-glukan (crude), dan dari kadar β-glukan yang ditetapkan ekivalen glukosa dengan metode Hisamatsu-AOAC dan KCKT. Bobot kering β-glukan (crude) tertinggi dari A.1.5 dihasilkan dari media mengandung urasil 0,025% (24 jam), sedangkan dari A. Bro 1.2.1 dihasilkan dari media mengandung urasil 0,1% (46 jam), keduanya lebih tinggi dari kontrol. Kadar β-glukan tertinggi dari A 1.5 (27,03%) dihasilkan dalam media mengandung urasil 0,025% (46 jam), dibandingkan kontrol 23,28%. Kadar β-glukan tertinggi dari A. Bro 1.2.1 (29,34%) dihasilkan dalam media mengandung urasil 0,025% (24 jam), dibandingkan kontrol 28,75%. Uji anova dua arah menunjukkan tidak ada perbedaan pengaruh bermakna (α = 0,05) dari berbagai konsentrasi urasil dan saat penambahan, terhadap bobot kering β-glukan ataupun kadar β-glukan ekivalen glukosa yang dihasilkan.

Abstract Influence of Uracil in Fermentation Media on β-Glucan Production by Agrobacterium Radiobacter A 1.5 and Agrobacterium sp. Bro 1.2.1. Optimum β-glucan production can be achieved by an optimum condition in the fermentation media. Uracil, as a precursor of UDP-glucose, may act as a glucose donor in the formation of polysaccharides such as β-glucan. It is expected that addition of certain quantity of uracil into the fermentation media in a suitable growth phase of Agrobacterium radiobacter A 1.5 and Agrobacterium sp. Bro 1.2.1, will significantly increase the β-glucan production. In this investigation, 0.025%; 0.05% or 0.1% of uracil were added into the fermentation media during the logarithmic phase (24 hour) or stationary phase (46 hour) of growth. The β-glucan product was evaluated from the β-glucan (crude) dry-weight and from the β-glucan content. Beta-glucan content was determined as glucose by the Hisamatsu-AOAC and HPLC methods. The highest β-glucan (crude) dry-weight produced by the A. 1.5 was in a medium containg 0.025% uracil (24 hour), whilst by the A. Bro 1.2.1 was in a medium containg 0.1% uracil (46 hour), both higher than control. The highest β-glucan content produced by the A. 1.5 (27.03%) was in a medium containg 0.025% uracil (46 hour), while control produced only 23.28%. The highest β-glucan content produced by the Bro 1.2.1 (29.34%) was in a medium containg 0.025% uracil (24 hour), while control produced only 28.75%. Two-way anova analysis showed that there were no significant influence difference (α = 0,05) from various concentration of uracil in either growth phases, to the yield of β-glucan (crude) dry-weight nor to the β-glucan equivalent glucose content. Keywords: Agrobacterium radiobacter A 1.5, Agrobacterium sp. Bro 1.2.1 mutant, β-glucan, Uracil umumnya menghasilkan senyawa polisakarida ekstraseluler, yaitu β-glukan dalam jumlah yang cukup besar dan bermanfaat baik di bidang industri makanan maupun di bidang kesehatan [1,2]. Beta glukan

1. Pendahuluan Agrobacterium sp. dapat tumbuh dengan baik dalam media yang mengandung karbohidrat. Bakteri ini

68

69


termasuk senyawa homopolisakarida, yaitu polisakarida yang tersusun dari satu jenis gula, yakni monomer Dglukosa [3,4]. Beta glukan yang dihasilkan oleh Agrobacterium dalam bentuk β-1,2 dan β-1,3 glukan. Molekul-molekul glukosa sebagai monomer dihubungkan antara C1 dan C2 atau C1 dan C3 dengan ikatan glikosidik [5,6]. Dilaporkan kelompok bakteri bintil akar Bradyrhizobium menghasilkan tipe β-1,3 dan 1,6 glukan [7], Demikian halnya Saccharomyces cerevisiae menghasilkan tipe β-1,3 dan 1,6 glukan [8]. Beta-glukan memiliki keunggulan dibandingkan dengan bahan lain seperti gelatin, gellan, agar-agar dan karagenan, karena lebih baik dalam hal tekstur, rasa dan elastisitasnya. Selain itu β-glukan digunakan pula untuk menjaga kelembaban pada adonan makanan yang mengandung lemak, pembentuk citarasa dan elastisitas pada produk seperti mie dan lain-lain [3,9]. Aplikasinya sangat luas sebagai senyawa aktif obatobatan dan kosmetika. Berbagai penelitian melaporkan bahwa β-glukan memiliki dua khasiat utama yaitu meningkatkan sistem kekebalan tubuh dan untuk menurunkan kadar kolesterol dalam darah, dan juga berkhasiat sebagai antimikroba, antioksidan, antiinfeksi, perlindungan terhadap radiasi, antiinflamasi, antidiabetes dan sebagai antitumor [10,11]. Laporan terakhir sebagai antiretrovirus HIV. Produksi β-glukan yang maksimal dapat ditempuh melalui berbagai cara antara lain dengan mutagenesis terhadap galur potensial baik secara fisik (sinar UV), kimia (Acridine orange), maupun genetik (transposomal mutagenesis), atau melalui optimalisasi kondisi fermentasi yaitu modifikasi media maupun faktor lingkungan yang optimum [12]. Biosintesis β-1,3glukan (curdlan) sebagai polisakarida ekstraseluler secara umum ditampilkan pada Gambar 1 [13]. Glucose ↓ Glucose-6-phosphate ↓ Glucose-1-phosphate UTP │ ↓ ppi UDP-glucose ↓ Lipid-P-Glc UDP-glucose ↓ ↓ UDP ↓ Lipid-P-(Glc)n │ ↓ Curdlan

Penelitian ini bertujuan meningkatkan produksi βglukan menggunakan urasil sebagai prekursor pembentukan senyawa UDP-glukosa. Konsentrasi dan waktu penambahan urasil yang tepat ke dalam media fermentasi diharapkan dapat meningkatkan produksi βglukan oleh Agrobacterium radiobacter A 1.5 (referensi) dan Agrobacterium sp. Bro 1.2.1 mutan. Beta-glukan dihidrolisis dan ditetapkan kadarnya ekivalen glukosa menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

2. Metode Penelitian Bahan yang digunakan adalah bakteri Agrobacterium sp. Bro 1.2.1 mutan dan Agrobacterium radiobacter A 1.5 (referensi); Agar (Oxoid); Ekstrak ragi (Oxoid); Kaldu pepton (Oxoid); Glukosa (Merck); Glukosa(Sigma); Beta-glukan(Takeda);Urasil (Sigma); Bovine serum albumin (BSA) (Sigma); Pereaksi Folin Ciocalteu(Sigma); Asam trifluoro asetat(TFA)(Sigma). Peralatan yang digunakan adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi detektor refraktometer differensial (R400,Waters); Spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu UV-VIS 160); Spectronic OD-21 Produksi β-glukan dalam media fermentasi. Agrobacterium sp. diregenerasi dalam media PY agar dengan komposisi sebagai berikut: 1% kaldu pepton, 0,5% Ekstrak ragi, 0,5% NaCl dan 1,5% Agar. Biakan Agrobacterium sp. sebanyak 1 mL dalam media PY cair diinokulasikan ke dalam media fermentasi secara aseptis. Media fermentasi dengan komposisi 4% glukosa, 0,15% (NH4)2HPO4, 0,1% KH2PO4, 0,05% MgSO4 7H2O, Ekstrak ragi 0,1% CaCO3 dan 0,001% larutan mineral. Fermentasi dilakukan pada suhu kamar dengan putaran 150 rpm. Setelah inkubasi selama 24 jam (fase logaritmik), atau 46 jam (fase stasioner), urasil ditambahkan sedemikian sehingga variasi konsentrasi akhir 0,1 %, 0,05 % dan 0,025 % dalam kultur Agrobacterium sp. Masing-masing perlakuan dilakukan duplo termasuk media kontrol. Fermentasi dilanjutkan pada suhu kamar selama 4 hari dan 5 hari dengan kecepatan putaran 150 rpm. Ekstraksi β-glukan [14,15]. Kultur Agrobacterium sp. dalam media fermentasi, disentrifus dengan kecepatan putaran 10.000 rpm pada suhu 20oC selama 20 menit untuk memisahkan media fermentasi yang berupa supernatan dari sel bakteri.

Lipid-P

Gambar 1. Postulasi jalur metabolisme sintesis β-1,3glukan (curdlan).

Endapan yang terpisah ditambah 20 mL HCl 5 N untuk melarutkan CaCO3, lemak dan protein bebas yang berada di luar sel, disentrifus kembali dengan putaran 10.000 rpm, pada suhu 20oC selama 20 menit. Endapan dipisahkan dan dilarutkan dengan 20 mL NaOH 1 N untuk melarutkan β-glukan. Selanjutnya disentrifus lagi dengan putaran 10.000 rpm pada suhu 20oC selama 20


Baku pembanding β-glukan 10 mg dilarutkan dalam 1 mL NaOH 1N dan diencerkan dengan akuades sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi β-glukan 100 bpj. Sejumlah 500 μl larutan β-glukan tersebut masingmasing ditambah 500 μl TFA 2 N dan 2,5 N, dikocok homogen, dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 2 jam, 3 jam, 4 jam, 5 jam, atau 6 jam, dan didinginkan sampai suhu kamar. Kemudian dianalisis menggunakan KCKT dengan kondisi sebagai berikut: kolom Karbohidrat μ-Bondapak-NH2 (3,9 x 300 mm); detektor Refraktometer Diferensial R-400; fase gerak asetonitril-air (80:20); aliran 1,0 ml/menit; dan volume sampel 20μL. Selanjutnya dari kromatogram dipilih konsentrasi TFA dan waktu hidrolisis yang menghasilkan luas puncak paling besar dan konstan. Konsentrasi TFA dan waktu hidrolisis yang terpilih selanjutnya digunakan dalam analisis kadar β-glukan ekivalen glukosa dalam setiap zat uji β-glukan (crude). Analisis kadar β-glukan ekivalen glukosa (modifikasi metode Hisamatsu-AOAC). Masingmasing zat uji β-glukan (crude) yang berasal dari berbagai media fermentasi, ditimbang kemudian dilarutkan dalam 0,5 mL NaOH 1 N. Sebagian volume larutan uji ini akan digunakan untuk analisis kadar βglukan ekivalen glukosa dan sebagian lainnya untuk analisis kadar protein. Masing-masing dipipet 0,5 ml blangko dan 0,5 ml larutan uji yang telah diencerkan akuades. Selanjutnya dihidrolisis menggunakan TFA dengan konsentrasi dan waktu hidrolisis yang terpilih pada tahap 2.3. Hasil pengukuran luas puncak diekstrapolasikan ke persamaan garis regresi baku pembanding glukosa untuk memperoleh konsentrasi glukosa dalam larutan uji yang diukur, dengan memperhitungkan faktor pengenceran pada setiap larutan uji dan bobot kering βglukan (crude). Analisis kadar β-glukan menggunakan

Analisis kadar protein dalam β-glukan (crude) (metode Lowry-Spektrofotometri cahaya tampak). Analisis kadar protein dalam β-glukan menggunakan metode Lowry-Spektrofotometri cahaya tampak didahului dengan uji linearitas dengan 340 bpj, 300 bpj, 260 bpj, 220 bpj, 180 bpj, 140 bpj dan 100 bpj; dan uji perolehan kembali dengan penambahan 25% dan 50% larutan baku pembanding protein BSA. Masing-masing dipipet 0,5 ml larutan baku pembanding protein BSA, blangko, dan larutan uji, kemudian ditambah 0,5 mL NaOH 1 N, dididihkan selama 20 menit dan didinginkan. Selanjutnya masing-masing larutan ditambah pereaksi Lowry dengan urutan prosedur yang sudah baku. Masing-masing larutan kemudian diukur serapannya dengan spektrofotometer pada 750 nm [16,17]. Hasil pengukuran serapan larutan uji diekstrapolasikan ke persamaan garis regresi baku pembanding untuk memperoleh kadar protein dalam larutan uji. Kemudian dengan memperhitungkan faktor pengenceran pada setiap larutan uji dan bobot kering βglukan (crude) diperoleh kadar protein (%) dalam βglukan (crude).

3. Hasil dan Pembahasan Kurva pertumbuhan Agrobacterium sp. Pengamatan kurva pertumbuhan Agrobacterium A 1.5 dan Bro 1.2.1 mutan bertujuan untuk pemilihan fase yang tepat untuk penambahan urasil ke dalam media fermentasi. Pertumbuhan A 1.5 dan Bro 1.2.1 mutan diamati dengan pengukuran OD (Optical density) pada panjang gelombang 560 nm. 1,400

1,200

1,000

0,800

0,600

⎠ : 560 nm

Hidrolisis β-glukan menjadi glukosa. Penentuan kadar β-glukan tidak dapat dilakukan secara langsung karena tingkat polimerisasinya sangat bervariasi, maka penentuan kadar dilakukan melalui hidrolisis β-glukan menjadi monomer glukosa, kemudian glukosa ditentukan kadarnya dengan cara KCKT [2,3].

modifikasi metode AOAC-Hisamatsu-KCKT juga disertai dengan uji perolehan kembali dan pembuatan kurva kalibrasi menggunakan baku pembanding glukosa 200 bpj, 160 bpj, 120 bpj, 80 bpj, dan 40 bpj.

OD (Optical Dencity )

menit. Supernatan dinetralisasi dengan HCl 5 N agar βglukan dapat terendapkan kembali, kemudian disentrifus dengan kecepatan putaran 10.000 rpm pada suhu 20oC selama 20 menit. Endapan yang diperoleh dicuci 2 kali dengan 10 mL akuades, disentrifus dengan kecepatan putaran 7000 rpm pada suhu 20oC selama 10 menit, kemudian endapan dicuci dengan 10 mL etanol absolut dan disentrifus dengan kecepatan 7000 rpm pada suhu 20oC selama 10 menit. Endapan yang diperoleh adalah β-glukan, dipisahkan, dikeringkan di oven pada suhu 50oC hingga bobot tetap yaitu bobot β-glukan (crude).

70

0,400

0,200

0,000 0

4

16

20

24

28

44

48

72

120

Waktu (jam)

A 1.5

Bro 1.2.1 mutan

Gambar 2. Kurva pertumbuhan Agrobacterium sp. dalam media fermentasi tanpa urasil

71


Gambar 2 menunjukkan bahwa fase lag kedua bakteri tercapai pada 2 jam masa inkubasi. Selanjutnya kedua isolat memasuki fase logaritmik dalam rentang waktu 230 jam masa inkubasi pada A 1.5 dan 2-26 jam masa inkubasi pada Bro 1.2.1 mutan. Fase stasioner A 1.5 dan Bro 1.2.1 mutan terjadi dalam rentang waktu yang sama yaitu 26-72 jam masa inkubasi. Waktu penambahan urasil ke dalam media fermentasi bagi kedua isolat yaitu 24 jam masa inkubasi (fase logaritmik) dan 46 jam masa inkubasi (fase stasioner). Bobot kering β-glukan (crude). Sel dan β-glukan (dari berbagai perlakuan) yang masing-masing telah diekstraksi dari A 1.5 dan Bro 1.2.1 mutan, dikeringkan dalam oven pada suhu 50oC hingga bobot tetap. Bobot kering sel dan β-glukan (crude) kedua isolat dapat dilihat pada Gambar 3, yang menunjukkan bahwa bobot kering β-glukan (crude) tertinggi dari A 1.5 diperoleh dari media yang ditambah urasil 0,025% setelah 24 jam masa inkubasi dan juga pada penambahan urasil 0,1% setelah 46 jam masa inkubasi. Sedangkan dari Bro 1.2.1 mutan bobot kering β-glukan tertinggi diperoleh dari media yang ditambah urasil 0,1% setelah 46 jam masa inkubasi.

14

Bobot kering β− glukan (crude ) (mg)

12 10 8 6 4 2 0 0

Uji kesempurnaan hidrolisis β-glukan menjadi glukosa. Hidrolisis β-glukan menjadi glukosa antara lain menggunakan enzim hidrolitik atau asam kuat seperti TFA (Trifluoro Acetic Acid), HCl dan H2SO4. Penetapan kadar polisakarida dalam bentuk monomernya telah banyak dilakukan antara lain: metode kolorimetri seperti fenol-sulfat, anthrone-sulfat, metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, dan metode derivatisasi dan penetapan secara Kromatografi GasCair (2,15,18). Menurut penelitian terdahulu, hidrolisis β-glukan menjadi monomer glukosa menggunakan TFA 2 N dan pemanasan pada 120˚ C selama 2 jam (15). Namun karena suhu tersebut tidak dapat dicapai, digunakan konsentrasi TFA yang lebih tinggi. Kromatogram

0.05

0.1

0

0.025

0.05

0.1

Konsentrasi urasil (%)

A.1.5

logaritmik

Bro 1.2.1 mutan

stasioner

Gambar 3. Bobot kering β-glukan (crude) hasil fermentasi

250000 y = 113,5528+1097,7816x r = 0,9999

Luas Puncak

200000

Penambahan urasil sebesar 0,025% dalam media fermentasi A 1.5 pada fase logaritmik, dapat meningkatkan bobot kering β-glukan (crude) menjadi 12,5 mg dibandingkan dengan kontrol yang hanya 3,5 mg. Namun penambahan lebih banyak urasil pada fase logaritmik tersebut dapat menurunkan hasil bobot kering β-glukan (crude). Penambahan tiga konsentrasi urasil pada fase stasioner hanya sedikit meningkatkan bobot kering β-glukan (crude), dibandingkan dengan kontrol. Analisis varian dua arah memperlihatkan tidak ada perbedaan bermakna (α = 0,05) pada kedua isolat antara variasi konsentrasi urasil dan waktu penambahan serta interaksi variasi konsentrasi urasil dengan waktu penambahan terhadap bobot kering β-glukan (crude) yang dihasilkan.

0.025

150000 100000 50000 0 0

50

100 150 Konsentrasi (bpj)

200

250

Gambar 4. Kurva kalibrasi baku pembanding glukosa dengan modifikasi metode Hisamatsu-AOACKCKT

KCKT menunjukkan bahwa TFA 2,5 N dapat menghidrolisis β-glukan lebih sempurna daripada menggunakan TFA 2 N. Konsentrasi TFA 2,5 N selanjutnya dipilih untuk digunakan dalam analisis βglukan ekivalen glukosa dalam β-glukan (crude). Selanjutnya pengujian kesempurnaan hidrolisis menggunakan TFA 2,5 N tersebut, menunjukkan bahwa pemanasan 2-3 jam masih belum sempurna menghidrolisis seluruh β-glukan, sebagaimana ditunjukkan oleh luas area yang semakin besar sampai waktu hidrolisis 4 jam, dan tidak meningkat lagi dengan waktu hidrolisis 5 dan 6 jam. Dengan demikian pemanasan selama 4 jam hidrolisis β-glukan menjadi glukosa dianggap telah sempurna, dan untuk seterusnya digunakan pada analisis kadar β-glukan ekivalen glukosa dalam β-glukan (crude).


72

Uji presisi menggunakan larutan baku pembanding glukosa 120 bpj menghasilkan simpangan baku relatif (SBR) sebesar 1,15% atau presisi 98,85%. Dengan demikian metode analisis ini memenuhi syarat (19) dan dapat digunakan pada tahap selanjutnya.

Analisis varian dua arah menunjukkan tidak ada perbedaan bermakna (α = 0,05) pada kedua isolat antara variasi konsentrasi urasil dan waktu penambahan serta interaksi konsentrasi dan waktu penambahan terhadap kadar β-glukan yang dihasilkan.

Uji linearitas dengan larutan baku pembanding glukosa menghasilkan kurva kalibrasi dengan persamaan garis regresi y = 113,5528 + 1097,78x (Gambar 4) dan koefisien korelasi (r = 0,9999) menunjukkan bahwa ada hubungan linear yang baik antara konsentrasi glukosa dengan luas puncak kromatogram dalam rentang konsentrasi 0 -200 bpj.

Uji perolehan kembali metode Hisamatsu-AOACKCKT yang dilakukan dengan β-glukan (crude) dari Agrobacterium radiobacterA 1.5 hasil fermentasi dalam media mengandung urasil 0,025% setelah 24 jam masa inkubasi, menunjukkan bahwa pada penambahan baku pembanding glukosa 25% didapatkan rerata perolehan kembali (89,95±1,46)%, sedangkan pada penambahan baku pembanding glukosa 50% didapatkan rerata perolehan kembali (95,17±0,53)%. Dengan demikian menunjukkan kedekatan hasil analisis dengan nilai yang sebenarnya.

Analisis Kadar β-Glukan Ekivalen glukosa (Modifikasi Metode Hisamatsu-AOAC). Kadar βglukan ekivalen glukosa tertinggi pada perlakuan penambahan urasil 0,025% setelah 24 jam inkubasi diperoleh sebesar 29,34%, sedangkan media kontrol tanpa penambahan urasil mencapai 28,75%. Penambahan urasil 0,0025% setelah 46 jam inkubasi menghasilkan kadar β-glukan ekivalen glukosa tertinggi (27,03%), sedangkan dalam media kontrol tanpa urasil mencapai 23,28%, hasil dapat dilihat pada Gambar 5. Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa penggunaan urasil sebesar 0,05% (b/v) pada produksi β-glukan dari Agrobacterium sp. (ATCC 31750) skala fermentor yang ditambahkan setelah 46 jam masa inkubasi, dapat meningkatkan produksi β-glukan sampai 93 g/L [14]. Adanya perbedaan peningkatan produksi β-glukan pada fase pertumbuhan kedua isolat ini dapat disebabkan karena adanya perbedaan sifat fisiologis dari tiap individu bakteri secara genetik, sehingga proses metabolisme senyawa tertentu seperti urasil dalam selnya masing-masing sangat spesifik termasuk pembentukan produk seperti β-glukan.

30

Kandungan protein dalam β-glukan (crude) diharapkan dapat ditekan seminimal mungkin, terutama bila senyawa β-glukan tersebut diaplikasikan untuk obatobatan, hal ini untuk menghindari reaksi alergi bagi pengguna. Gambar 7 menunjukkan bahwa perlakuan berbagai konsentrasi urasil dalam media fermentasi Agrobacterium radiobacter A1.5 menyebabkan peningkatan kadar protein dibandingkan perlakuan kontrol (urasil : 751 nm

25 20 15 10 5 0 0

0 ,0 2 5

0 ,0 5 0 ,1 0 0 ,0 2 5 r a.1silm(% A .1K.5o n se n tr Barosi 1u.2 u ta)n

logaritmik

0 ,0 5

0 ,1

stasioner

Gambar 5. Histogram kadar β-glukan sebagai glukosa dari Agrobacterium radiobacter A 1.5 dan Agrobacterium sp. Bro 1.2.1 mutan (metode KCKT)

Serapan pada

glukosa (%)

Kadar⎯ -glukan sebagai

35

Analisis Kadar Protein (Metode Lowry– Spektrofotometri Cahaya Tampak). Uji presisi menggunakan larutan baku pembanding BSA 260 bpj (5 kali pengulangan) menghasilkan simpangan baku relatif (SBR) sebesar 1,04%, atau dengan presisi 98,96%. Dengan demikian metode analisis ini dapat digunakan dan memenuhi syarat ketelitian SBR ≤ 2% (19). Kurva kalibrasi larutan baku pembanding BSA menghasilkan persamaan garis regresi y = 0,01161 + 1,9364.10-3 x (Gambar 6), serta koefisien korelasi (r = 0,9977) menunjukkan bahwa ada hubungan linear yang baik antara konsentrasi BSA dengan serapan cahaya tampak dalam rentang konsentrasi BSA 0-340 bpj.

0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

-3

y = 0,01161 + 1,9364.10 x r = 0,9977

0

100

200

300

400

Konsentrasi (bpj)

Gambar 6. Kurva kalibrasi baku pembanding BSA dengan metode Lowry-pektro-fotometri cahaya tampak

73


logaritmik

stasioner

4. Kesimpulan Penambahan urasil terhadap peningkatan produksi βglukan dari kedua Agrobacterium sp. terjadi pada konsentrasi urasil yang sama (0,025%) namun waktu penambahan pada fase pertumbuhan yang berbeda.

70

Kadar Protein (%)

60 50 40 30 20 10 0 0

0.025

0.05

0.1

0

0.025

0.05

0.1

Konsentrasi urasil (%)

A.1.5

Bro 1.2.1 mutan

Gambar 7. Histogram kadar protein dari Agrobacterium radiobacter A 1.5 dan Agrobacterium sp. Bro 1.2.1 mutan

0%) yang mencapai kadar protein terendah yaitu 15,66% pada fase logaritmik. Namun penambahan urasil pada fase stasioner justru menyebabkan sedikit penurunan kadar protein dibandingkan terhadap media kontrol (tanpa urasil). Kadar protein terendah (47,29%) terdapat dalam media yang mengandung urasil 0,1%. Kecenderungan yang sama ditunjukkan oleh Agrobacterium sp. Bro 1.2.1 mutan, yaitu peningkatan kadar protein, dengan kadar protein terendah (23,61%) dihasilkan dari media mengandung 0,025% urasil yang ditambahkan pada fase logaritmik, namun sebaliknya penambahan urasil pada fase stasioner, kadar protein terendah (26,44%) dihasilkan dalam media mengandung urasil 0,05%. Adanya peningkatan kadar protein bila pemberian urasil pada fase logaritmik dapat disebabkan karena urasil juga merupakan prekursor dari sintesis asam amino dalam sel, dimana pada fase ini sintesis protein dalam dinding sel berlangsung aktif sehingga induksi urasil dapat mempengaruhi produksi protein dalam sel bakteri. Penurunan kadar protein pada pemberian urasil fase stasioner dapat disebabkan karena urasil mulai terkonsentrasi pada pembentukan β-glukan. Analisis varian dua arah memperlihatkan ada perbedaan bermakna (α = 0,05) pada kedua isolat antara variasi konsentrasi urasil dan waktu penambahan serta interaksi konsentrasi urasil dan waktu penambahan terhadap kadar protein yang dihasilkan. Uji perolehan kembali dengan β-glukan (crude) dan penambahan baku pembanding BSA 25% dan 50% didapatkan rerata perolehan kembali (87,71 ± 0,59)% dan (82,98 ± 0,26)%, dan menunjukkan kedekatan hasil analisis dengan nilai yang sesungguhnya.

Agrobacterium radiobacter A 1.5 (referensi) dalam media fermentasi mengandung urasil 0,025% 46 jam masa inkubasi, menghasilkan kadar β-glukan ekivalen glukosa tertinggi (27,03%) dan protein (57,38%). Sedangkan Agrobacterium sp. Bro 1.2.1 mutan dalam media fermentasi mengandung urasil 0,025% 24 jam masa inkubasi, menghasilkan kadar β-glukan ekivalen glukosa tertinggi (29,34%) dan protein (23,61%). Analisis varian dua arah pada masing-masing isolat Agrobacterium sp. menunjukkan tidak ada perbedaan pengaruh bermakna (α = 0,05) antara variasi konsentrasi urasil dan waktu penambahan terhadap bobot kering β-glukan (crude) yang dihasilkan maupun kadar β-glukan ekivalen glukosa.. Analisis varian dua arah pada masing-masing isolat Agrobacterium sp. menunjukkan ada perbedaan bermakna (α = 0,05) antara variasi konsentrasi urasil dan waktu penambahan terhadap kadar protein yang dihasilkan.

Daftar Acuan [1] J.G. Holt, N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T Staley, S.T. Williams (Eds.), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th ed, Baltimore: The Williams & Wilkins Company, 1984, p.74-75, 130131. [2] I.W. Sutherland, Biotechnology of Microbial Exopolysaccharides, Cambridge University Press, New York, 1990, p.1-53, 117-148. [3] Curdlan. http://www.fao.org/docrep/x3860e/x38060 Eoo.htm. FNP 52 Add 7, 1999:Diakses 8 Mei 2004 [4] I.M. Cheseemen, R. Malcolm Brown Jr., Microscopy of curdlan structure. http://www.botany.utexas.edu/facstaff/facpage/mbr own/ongres/icheese/htm. Diakses 2-9-2004 [5] M.K. Kim, I.Y. Lee, J.H. Lee, K.T. Kim, Y.H. Rhee, Y.H. Park, Journal of Industrial Microbiol. and Biotechnol. 25(4) (2000) 180-183. [6] J.H. Lee, Y.H. Park, Biotechnology Letters (2001) 23: 525-530. [7] M.W. Breedveld, K.J. Miller, Microbiology Review (1994) 145-161. [8] Yeast beta-D-Glucan, http://www. Pdrhealth.com/. diakses 28 Januari 2007 [9] Dies RC. Reducing fat: a cutting-edge strategy, http://www.foodproductsdesign.com/archive/1997/0 397cs.htm. Diakses 28 Agustus 2004.


[10] Beta glucan, http://www.mycustompack.com/ healthnotes/supp/Beta-lucan.htm, Diakses 8 Mei, 2004. [11] History of beta-1,3 and -1,6-glucan research, http://www. betaglucan. org/ history. htm. Diakses 8 Mei, 2004. [12] B.A. Stone, A.E. Clark, Chemistry and biology of (1-3)-β glucans, La trobe University Press, Australia 1992, p.283-365. [13] I.Y. Lee, Curdlan, http: //www.wiley-uch.de/ books/ biopoly/ pdf_v05/ bpo15006_135_144.pdf. Diakses 6 Januari, 2005. [14] Lee Jung-heon, Lee In Young, Optimization of uracil addition for curdlan (β-1→3-glucan) production by Agrobacterium sp., http://www.infomag.ru:8082/dbase/JO41E/01116168.txt, Diakses 28 Agustus, 2004.

74

[15] Hisamatsu, Workshop Japan: JICA Short-term Expert, 1995, p.1-4. [16] Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Farmakope Indonesia, Ed IV, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta, 1995, p.1009-1016. [17] A.R. Copeland, Methods for protein analysis, Chapman and Hall, New York, 1994, p.39-57. [18] M.F. Chaplin, In: J.F Kennedy (Eds.), Carbohydrate analysis a practical approach, 2nd ed., New York, Oxford University Press, 1994, p.73-94. [19] United States Pharmacopeial Convention, The United States Pharmacopeia, Ed XXV: United States Pharmacopeial Convention Inc, Rockville, 2002, p.1988-1992, 2256-2260.

PENGARUH PENAMBAHAN URASIL DALAM MEDIA FERMENTASI TERHADAP HASIL β-glukan DARI DUA GALUR AGROBACTERIUM

Recommend Documents