EFEKTIVITAS IMUNOGLOBULIN Y(IG Y) ANTILIPASE SEBAGAI INHIBITOR ENZIM LIPASE PANKREAS UNTUK PENCEGAHAN OBESITAS RONALD TARIGAN

EFEKTIVITAS IMUNOGLOBULIN Y(IG Y) ANTILIPASE SEBAGAI INHIBITOR ENZIM LIPASE PANKREAS UNTUK PENCEGAHAN OBESITAS

RONALD TARIGAN

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Efektivitas Immunoglobulin Y (IgY) Antilipase sebagai Inhibitor Lipase Pankreas untuk Pencegahan Obesitas adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, September 2013 Ronald Tarigan NIM B151110011

RINGKASAN RONALD TARIGAN. Efektivitas Immunoglobulin Y (IgY) Antilipase sebagai Inhibitor Lipase Pankreas untuk Pencegahan Obesitas. Dibimbing oleh WASMEN MANALU dan NASTITI KUSUMORINI. Obesitas merupakan faktor pemicu dari berbagai penyakit degeneratif dengan prevalensi yang terus meningkat. Enzim lipase pankreas yang bertanggung jawab dalam 50-70 persen penyerapan lemak makanan merupakan target kerja antiobesitas yang paling banyak dipelajari. Imunisasi ayam petelur dengan enzim lipase pankreas mamalia akan menghasilkan telur yang mengandung IgY antilipase. IgY antilipase tersebut akan berikatan dengan sisi aktif enzim lipase pankreas sehingga pencernaan dan penyerapan lemak di saluran pencernaan akan terhambat. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi efektivitas IgY antilipase sebagai senyawa antiobesitas. IgY antilipase dari kuning telur dipurifikasi dengan presipitasi sodium sulfat, konsentrasi IgYnya diukur dengan metode Bradford, dan keberadaannya dikonfirmasi dengan Western Immunoblotting. Kemampuan IgY antilipase dalam menghambat aktivitas enzim lipase pankreas diukur dengan metode colorimetric microplate assay. Kuning telur yang mengandung IgY antilipase tersebut diuji secara in vivo kemampuannya menghambat lemak makanan pada kelinci. IgY yang dipurifikasi mengandung dua protein dengan bobot molekul 61,2 kDa dan 26,9 kDa, memiliki konsentrasi IgY 30.1 ± 6.3mg/mL kuning telur, dan bereaksi positif terhadap konjugat rabbit IgG antichicken pada Immunoblotting. IgY antilipase pada uji in vitro memiliki kemampuan inhibisi aktivitas enzim lipase pankreas yang tidak berbeda nyata dibandingkan dengan orlistat pada berbagai konsentrasi (p<0.05). Kuning telur yang mengandung IgY antilipase memiliki kemampuan untuk menghambat absorbsi lemak di saluran pencernaan pada uji in vivo, namun aktivitasnya masih di bawah orlistat (p<0.05). Kata kunci: IgY antilipase, orlistat, antiobesitas, penghambatan enzim lipase pankreas, absorbsi lemak

SUMMARY RONALD TARIGAN. Effectivity of Immunoglobulin Y Antilipase as Pancreatic Lipase Inhibitor for Prevention of Obesity. Supervised by WASMEN MANALU and NASTITI KUSUMORINI. Obesity has been a major risk for many degenerative diseases with an increasing prevalence.Pancreatic lipase is responsible for 50-70% of total dietary fat absorbtion and has been studied widely for new anti-obesity invention. Hen immunized with porcine pancreatic lipase will produce yolk containing IgY antilipase. IgY antilipase will bind the active site of pancreatic lipase in gastrointestinal tract and inhibit the activity of pancreatic lipase in the gastrointestinal tract. This research was conducted to evaluate the effectivity of IgY antilipase as anti-obesity. IgY antilipase was purified with sodium sulphate precipitation. The protein was analysed by SDS-PAGE and was identified by Immunoblotting. The ability of IgY antilipase to inhibit pancreatic lipase was tested by colorimetric microplate assay at five grades of concentration. Yolk containing IgY antilipase was then tested in rabbit to evaluate its ability to inhibit fat absorbtion in vivo. The result showed that IgY contained two proteins with molecular weights of 61.2 kDa and 26.9 kDa. IgY was confirmed because it positively reacted with rabbit-anti-chicken HRP. The average IgY concentration was 30.1 ± 6.3 mg/mL yolk. IgY antilipase and orlistat did not differ in inhibition capacity at various concentrations (p<0.05). The inhibition capacity of IgY obtained from unimmunized hen was significantly lower as compared to those of IgY antilipase and orlistat (p<0.05). Yolk containing IgY antilipase also had the ability to inhibit dietary fat absorbtion in vivo, but its inhibition capacity was lower than that of orlistat (p<0.05). It is concluded that IgY antilipase could be used to inhibit fat absorbtion to prevent obesity. Keywords:IgY antilipase, orlistat, anti-obesity, pancreatic lipase inhibition, diatery fat absorbtion

©Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

EFEKTIVITAS IMUNOGLOBULIN Y(IG Y) ANTILIPASE SEBAGAI INHIBITOR ENZIM LIPASE PANKREAS UNTUK PENCEGAHAN OBESITAS

RONALD TARIGAN

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu-Ilmu Faal dan Khasiat Obat

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:Dr drh Joko Pamungkas, MSc

Judul Tesis : Efektivitas Imunoglobulin Y (IgY) Antilipase sebagai Inhibitor Enzim Lipase Pankreas untuk Pencegahan Obesitas Nama : Ronald Tarigan NIM : B151110011

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Prof Dr Ir Wasmen Manalu, AIF Ketua

Dr dra Nastiti Kusumorini, AIF Anggota

Diketahui oleh Ketua Program Studi Ilmu-Ilmu Faal dan Khasiat Obat

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Agik Suprayogi, MSc, AIF

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 29 Juli 2013

Tanggal Lulus:

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan November 2012 sampai April 2013 ini ialah telur antiobesitas, dengan judul Efektivitas Imunoglobulin Y (IgY) Antilipase sebagai Inhibitor Enzim Lipase Pankreas untuk Pencegahan Obesitas. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Ir Wasmen Manalu dan Ibu Dr Nastiti Kusumorini selaku pembimbing, serta Bapak Dr drh Joko Pamungkas MSc selaku penguji. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada semua staf Bagian Patologi Balai Besar Penelitian Veteriner dan Unit Pengelolaan Hewan Laboratorium FKH IPB, yang telah membantu selama pengumpulan data. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2013 Ronald Tarigan

DAFTAR ISI 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian

1 1 2 3 4

2 TINJAUAN PUSTAKA

5

3 METODE Bahan Alat Prosedur Analisis Data

16 16 16 22

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

23

5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran

31 31 31

DAFTAR PUSTAKA

32

LAMPIRAN

37

DAFTAR TABEL 1 Perbandingan IgG mamalia dengan IgY unggas 2 Daya inhibisi terhadap enzim lipase pankreas babi 3 Rata-rata kadar lemak, jumlah, dan persentase lemak yang diserap

11 29 30

DAFTAR GAMBAR 1 Perbandingan sekuens asam amino di daerah binding site antarberbagai spesies, yaitu lipase pankreas: hPL (manusia), pPL (babi), dPL (anjing), lipase hepatik: hHL (manusia), rHL (tikus), lipase lipoprotein: hLPL (manusia), mLPL (mencit), bLPL (sapi) (Lowe et al. 1989). 2 Pencernaan dan penyerapan lemak di usus halus (Gurr et al. 2002) 3 Ikatan kovalen antara tetrahidrolipstatin dan human pancreatic lipase (Peng et al. 1992). 4 Perbandingan struktur molekul IgG kelinci dengan IgY ayam (Chalgoumi et al. 2009). 5 Aktivitas IgY saat diinkubasikan dengan pepsin (■) dan tripsin (□) tanpa pemberian protektan (NA), dengan pemberian cyclodextrin, dextran, laktosa, trehalosa, sukrosa, kuning telur, dan susu formula (Jaradat & Marquardt 2000). 6 Profil pita protein S (Standar), T (Larutan Lipase), LT (Lipase Terlarut), LTT (Lipase Tak Terlarut) 7 Nilai rata-rata OD serum ayam yang diimunisasi pada panjang gelombang 420 nm 8 Hasil SDS PAGE (A), hasil Immunoblotting (B) 9 Rata-rata daya inhibisi orlistat, IgY antilipase, dan IgY kontrol terhadap enzim lipase pada berbagai ragam konsentrasi.Contoh gambar yang memiliki lebar kurang dari 10 cm

6 7 9 10

14 24 25 26

29

DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Analisis Karakteristik Enzim Lipase Perhitungan Konsentrasi Protein Enzim Lipase Pembuatan Reagensia SDS PAGE Perhitungan Bobot Molekul Enzim Lipase Reagensia untuk ELISA Penghitungan Titer Antibodi Serum Perhitungan Bobot Molekul IgY Antilipase Perhitungan Konsentrasi Protein IgY Antilipase Penghitungan Titer Antibodi IgY Kuning Telur Penghitungan Inhibisi Aktivitas Lipase secara In Vitro Kandungan Nutrisi Pakan Penghitungan Kadar Air Feses pada Uji In Vivo Penghitungan Kadar Lemak Feses pada Uji In Vivo

37 41 42 43 44 45 46 47 48 49 51 52 53

54

1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perubahan gaya hidup, seperti peningkatan konsumsi makanan dengan kadar lemak tinggi meningkatkan kejadian obesitas di masyarakat. Menurut data Riset Dasar Kesehatan tahun 2007, prevalensi kejadian obesitas pada penduduk dewasa di Indonesia sebesar 10,3%. Menurut data WHO (2008), jumlah penduduk dewasa dunia yang menderita obesitas adalah 1,5 miliar jiwa. Dengan jumah penduduk dewasa sebesar 150 juta jiwa (BPS 2010), maka terdapat sebanyak 15,45 juta penduduk Indonesia yang menderita obesitas. Obesitas adalah kondisi patologis yang terdapat akumulasi lemak berlebih pada tubuh dengan Indeks Massa Tubuh (IMT) lebih besar dari 30 (WHO 2010). Obesitas sudah menjadi isu nasional di hampir semua negara karena meningkatkan peluang terkena penyakit kardiovaskuler, terutama stroke dan penyakit jantung koroner, diabetes, gangguan muskuloskeletal, seperti osteoartritis dan kanker. Setiap tahun tercatat 2,5 juta kematian akibat penyakit yang terkait obesitas (WHO 2010). Berdasarkan data dan fakta di atas, obesitas telah menjadi masalah besar yang harus mendapat perhatian serius. Sampai saat ini, terdapat dua golongan obat antiobesitas, yaitu penghilang nafsu makan (appetide suppressant) dan inhibitor lipase. Inhibitor lipase lebih disukai karena bekerja lokal, dapat digunakan dalam jangka waktu lama, dan memiliki efek samping minimum (USDHHS 2004). Enzim lipase pankreas memegang peranan penting dalam pencernaan lemak karena menghidrolisis 5070% total asupan lemak dari makanan dan menjadi enzim yang paling banyak dipelajari untuk menemukan obat antiobesitas baru (Birari dan Bhutani 2007). Penghambatan aktivitas enzim lipase pankreas di saluran pencernaan merupakan cara paling efektif untuk menghambat absorbsi lemak dalam kaitannya untuk mencegah dan mengatasi obesitas. Inhibitor lipase yang pertama kali ditemukan adalah lipstatin yang diisolasi dari Streptomyces toxytricini. Derivat lipstatin, yaitu tetradihidrolipstatin (orlistat), merupakan pilihan utama inhibitor lipase di dunia kedokteran (Hadvary et al. 1988). Orlistat akan berikatan secara kovalen dengan binding site pada enzim lipase sehingga mengubah konformasi enzim lipase. Pemberian orlistat akan menurunkan absorbsi lemak sebesar 20-25% (Zhi et al.1994). Orlistat tidak direkomendasikan untuk anak-anak berumur di bawah 10 tahun, ibu hamil, dan penderita sindrom malabsorbsi kronis (kolestasis). Sampai saat ini, belum ada laporan kejadian keracunan orlistat. Kaya et al. (2004) melaporkan efek samping ringan pada saluran pencernaan serta meningkatkan peluang terkena batu empedu (Hopman et al. 1997). Kendala utama sediaan obat ini adalah harganya cukup mahal dan tidak terjangkau oleh semua kalangan masyarakat.

2 Berbagai penelitian sudah dilakukan untuk mencari inhibitor enzim lipase baru dari berbagai ekstrak tanaman herbal, seperti biji kacang kedelai, Cassia mimosoides, teasaponin, daun jati belanda, bangle, biji anggur, rimpang jahe, buah Kochia scoparia, akar Platycodin glandiflorum, buah Juglans mandshurica, akar Actinidia arguta, asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur (Iswantini et al. 2010). Tanaman-tanaman ini secara in vitro dapat menghambat aktivitas enzim lipase dan beberapa di antaranya sudah dipatenkan. Pendekatan lain yang mungkin dapat dilakukan adalah dengan memanfaatkan IgY antilipase. IgY antilipase didapat dengan cara menghiperimunisasi ayam dengan enzim lipase mamalia dosis tinggi secara berulang sehingga akan didapatkan IgY antibodi lipase dalam jumlah besar di kuning telur. Ayam memiliki sistem imunitas yang cukup berkembang dan memiliki sensitivitas tinggi terhadap protein asing sehingga memberikan respons pembentukan antibodi yang tinggi. Ayam akan menghasilkan antibodi spesifik terhadap mamalia dalam jumlah lebih banyak dibandingkan mamalia itu sendiri (Li et al. 1998, Wibawan et al. 2009). Ayam menghasilkan antibodi dalam jumlah yang lebih banyak dibanding hewan model lain, seperti tikus dan mencit, sehingga dapat dikatakan sebagai pabrik biologis yang efektif dan efisien (Schade et al. 1996). IgY cukup stabil terhadap pemanasan dan IgY tetap stabil saat dipanaskan pada suhu 70oC selama 15 menit (Carlender 2002). IgY juga cukup stabil terhadap digesti enzim-enzim proteolitik saluran pencernaan, seperti tripsin dan kimotripsin (Loeken dan Roth 1983). IgY akan tetap stabil pada pH 4.0, namun pada pH 2.03.0 stabilitasnya akan menurun. Akan tetapi, penambahan sukrosa pada IgY serta IgY dalam kuning telur mampu mempertahankan stabilitas IgY terhadap panas, tekanan tinggi, dan kondisi yang sangat asam (Hatta et al. 1990, Jaradat dan Marquardt 2000). Oleh karena itu, pemberian kuning telur yang mengandung IgY antilipase sangat memungkinkan untuk dijadikan sebagai obat antiobesitas. Penelitian tentang antibodi IgY telah banyak dilakukan, seperti IgY antivirus Avian Influenza H5N1 (Wibawan et al. 2009), IgY anti-Aeromonas hydrophillia (Kurnia 2006), IgY anti-karies gigi yang disebabkan Streptococcus mutans dan Streptococcus sobrinus (Poetri et al. 2008, Wijaja dan Suhartini 2008) dan IgY anti-Staphylococcus aureus (Guimares et al. 2009).

Perumusan Masalah Berdasarkan data dan fakta yang telah dikemukakan sebelumnya, obesitas merupakan masalah besar di dunia yang perlu mendapat penanganan serius. Hal ini terlihat dari maraknya penelitian untuk mencari antiobesitas baru dan sampai saat ini sudah terdapat 52 biomaterial asal alam yang telah diuji secara in vitro dan in vivo dan terbukti dapat menghambat kerja enzim lipase pankreas, namun sampai saat ini tidak ada yang dilirik industri farmasi (Yun 2010). Selain itu, sudah ada 3 obat antiobesitas sintetis baru dengan mekanisme kerja inhibitor lipase yang sudah didaftarkan ke FDA. Sampai saat ini, hanya satu obat antiobesitas dengan mekanisme kerja inhibitor lipase yang beredar di masyarakat, yaitu orlistat. Meskipun telah terbukti secara klinis, orlistat kurang diminati masyarakat. Hal itu disebabkan harganya

3 yang cukup mahal, tidak praktis, dan efek samping yang ditimbulkannya. Hal ini tergambar dari market share orlistat di Amerika Serikat yang kurang dari 20%, nilai ini jauh lebih kecil dibandingkan dengan penderita obesitas di Amerika Serikat yang mencapai 65% (Melnikova dan Wages 2006). Oleh karena itu, perlu dilakukan pendekatan baru untuk menemukan sediaan antiobesitas baru. Salah satunya dengan memanfaatkan IgY antilipase dalam bentuk kuning telur, dan IgY antilipase akan dihasilkan dengan menghiperimunisasi ayam dengan enzim lipase. Telur merupakan makanan sehari-hari sehingga pasti mudah untuk diterima di masyarakat. Selain itu, pendekatan ini juga akan meningkatkan nilai tambah telur menjadi pangan fungsional antiobesitas. Penelitian ini bertujuan menganalisis kelayakan penggunaan IgY antilipase dari kuning telur dalam penghambatan aktivitas enzim lipase pankreas. Penggunaan IgY antilipase merupakan salah satu alternatif antiobesitas yang sangat menarik karena cara ini aman dan alamiah. Selain itu, cara ini juga berpotensi sangat murah mengingat kandungan IgY pada kuning telur sangat tinggi, yaitu 100-150 mg/butir (Carlender 2002). Jika dibandingkan dengan total sekresi enzim lipase pankreas manusia 3 jam setelah makan makanan dengan kadar lemak tinggi, yaitu 200-250 mg (Carierre et al. 2005), total IgY antilipase dalam satu kuning telur mampu menghambat setengah dari total sekresi enzim lipase pankreas. Melakukan imunisasi ayam sehingga menghasilkan antibodi terhadap enzim lipase bukanlah masalah karena ayam memiliki sistem imunitas yang cukup berkembang dan memiliki sensitivitas tinggi terhadap protein asing, seperti enzim lipase dari spesies berbeda mampu memberikan respons pembentukan antibodi yang tinggi dan bersifat spesifik di darah dan kuning telur (Wibawan et al. 2009). Akan tetapi, apakah antibodi yang dihasilkan memiliki kemampuan menetralisasi aktivitas enzimatik lipase harus dibuktikan terlebih dahulu. Selain itu, perlu dibuktikan apakah IgY antilipase di kuning telur yang diberikan per oral tidak kehilangan aktivitasnya pada saat menghadapi sekresi asam lambung dan enzimenzim proteolitik di saluran pencernaan. Penelitian ini didisain untuk menjawab kedua pertanyaan tersebut.

Tujuan Penelitian Berdasarkan permasalahan yang ada, maka pada penelitian ini dirumuskan empat tujuan, yaitu: 1. Memproduksi IgY antilipase melalui hiperimunisasi ayam petelur. 2. Membuktikan kemampuan IgY antilipase untuk menetralisasi kerja enzim lipase pankreas secara in vitro. 3. Membuktikan kemampuan kuning telur yang mengandung IgY antilipase untuk menghambat absorbsi lemak di saluran pencernaan.

4 Manfaat Penelitian Hasil penelitian diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang potensi kuning telur yang mengandung IgY antilipase sebagai inhibitor enzim lipase pankreas atau antiobesitas. Hal tersebut dapat mempopulerkan kuning telur yang dipandang sebagai bahan pangan penyebab obesitas menjadi bahan pangan fungsional antiobesitas. Pada akhirnya, penggunaan kuning telur yang mengandung IgY antilipase dapat dimanfaatkan bagi masyarakat umum dan atau khususnya penderita obesitas sebagai pencegahan dan terapi yang alami dengan memanfaatkan bahan yang murah dan mudah didapat.

5

2 TINJAUAN PUSTAKA Enzim Lipase Enzim lipase tersebar luas di alam dan dapat ditemukan pada manusia, hewan, tumbuhan, dan mikroorganisme. Enzim ini bekerja dengan memecah asam lemak teresterifikasi pada atom karbon 1 dan 3 menghasilkan 2-monoasilgliserol (Gurr et al. 2002, Hertzel et al. 2008, Iswari dan Manalu 2010). Lipase tidak efektif dalam menghidrolisis ikatan ester pada posisi 2 atom karbon. Beberapa lipase tidak hanya menghidrolisis asam lemak dari asilgliserol, tetapi juga membebaskan asam lemak teresterifikasi pada atom karbon 1 dari fosfogliserida. Ikatan ester dengan panjang rantai kurang dari 12 karbon, seperti lemak susu, dipecah lebih cepat dibandingkan ikatan ester asam lemak pada umumnya yang terdiri atas 14-18 karbon (Gurr et al. 2010). Lipase pankreas manusia telah berhasil diisolasi 35 tahun yang lalu dengan estimasi bobot molekul 46.000 Da. Struktur primernya atau sekuens asam amino lipase pankreas baru berhasil diprediksi berdasarkan cDNAnya (complementary DNA) 20 tahun setelah isolasi. Berdasarkan perbandingan sekuens hasil analisis cDNA lipase pankreas manusia yang dilakukan oleh Lowe et al. (1989), lipase pankreas manusia terdiri atas 465 asam amino dan memiliki estimasi bobot molekul 51.156 Da, setelah dikurangi signal peptida sebanyak 16 asam amino, bobot molekul lipase pankreas manusia adalah 49.558 Da. Prediksi sekuens asam amino lipase pankreas manusia tersebut memiliki homologi 85% dengan sekuens asam amino lipase pankreas babi yang ditemukan oleh De Caro et al. (1981) serta memiliki homologi masing-masing 65% dengan hasil prediksi dari cDNA lipase pankreas anjing. Lipase pankreas manusia memiliki homologi 37% dengan lipase hepatik, 36% dengan lipase lipotrotein, dan 4% dengan lipase lambung. Sekuens asam amino lipase pankreas babi berbentuk rantai tunggal dengan 449 asam amino dan memiliki bobot molekul 50-52 kDa (De Caro et al. 1981). Enzim lipase pankreas kelinci terdiri atas 469 asam amino dan memiliki homologi sekuens asam amino 65% dengan anjing, 76% dengan babi, dan 63% dengan tikus (Gomez et al. 1992). Homologi tertinggi antarspesies terletak pada daerah binding site, yaitu asam amino serin (Ser-152 pada babi dan Ser-153 pada manusia), tepatnya pada bagian gugus hidroksil asam amino serin (Peng et al. 1992). Homologi antarspesies juga ditemukan pada asam amino di sekitar Ser-152/153, sekuens asam amino lipase pankreas manusia, babi, dan anjing memiliki urutan glisinhistidin-serin-leusin–glisin (Gambar 1), sedangkan pada lipase lain (lipoprotein dan hepatik) sekuensnya adalah glisin-X-serin-X-glisin. Berdasarkan homologi tersebut dapat disimpulkan bahwabinding site semua enzim lipase terletak di daerah tersebut. Ser-152 ditetapkan sebagai binding site karena ikatan kovalen antara tetrahidrolipstatin (lipase inhibitor) dengan gugus hidroksil Ser-152. Ser-152 berperan sangat penting dalam aktivitas dan ikatan lipase dengan substrat yang bersifat hidrofobik. Pemberian diethyl p-nitrophenyl phosphate pada penelitian Lowe et al. (1989) akan memodifikasi asam amino serin, termasuk Ser-152. Modifikasi ini mengakibatkan lipase kehilangan aktivitasnya terhadap substrat

6 hidrofobik, namun tetap memiliki aktivitas terhadap substrat yang hidrofilik. Hal ini menunjukkan Ser-152 merupakan binding site lipase, bukan sisi aktif. Sisi aktif lipase pankreas belum berhasil dipastikan, namun diduga berada pada residu histidin. Hal ini disebabkan inaktivasi lipase melalui proses fotooksidasi paling baik dilakukan pada residu histidin.Selain itu, lipase yang residu histidinnya dimodifikasi dengan diethyl pyrocarbonate akan kehilangan aktivitasnya terhadap substrat hidrofilik dan misel, tetapi tidak terhadap interfacial binding. Lokasi residu histidin sebagai sisi aktif lipase diduga berada pada His-354, lipase yang His-354nya dimodifikasi dengan ethoxyformic anhydrideakan kehilangan aktivitasnya (Lowe et al. 1989).

Gambar 1

Perbandingan sekuens asam amino di daerah binding site antarberbagai spesies, yaitu lipase pankreas: hPL (manusia), pPL (babi), dPL (anjing), lipase hepatik: hHL (manusia), rHL (tikus), lipase lipoprotein: hLPL (manusia), mLPL (mencit), bLPL (sapi) (Lowe et al. 1989).

Berdasarkan analisis prediksi karakteristik sekuens enzim lipase pankreas babi dari De Caro et al. (1981) yang menggunakan IEDB Analysys Resource, terlihat His-354 memiliki nilai hydrophilicity prediction sebesar6,943 dan merupakan nilai maksimum (Lampiran 1). Berdasarkan prediksi sifatnya yang sangat hidrofilik, kemungkinan His-354 berada pada sisi luar lipase. Hal ini juga didukung nilai surface accessability prediction dan nilai beta turn His-354 yang tinggi, yaitu 2,904 dan 1,223. Posisi tersebut mendukung pernyataan Loew et al. (1987) mengenai His-354 sebagai sisi aktif karena posisi tersebut mempermudahnya untuk mengkatalisis reaksi hidrolisis substrat trigliserida di saluran pencernaan. Dilihat dari sisi antigenesitasnya, His-354 kurang bersifat antigenik dengan nilai 0,912 (Lampiran 1). Berdasarkan nilai tersebut, terdapat kemungkinan enzim lipase kurang bersifat antigenik sehingga antibodi yang dihasilkan kurang bersifat antigenik. Hal tersebut akan diteliti pada penelitian ini. Peranan Lipase dalam Pencernaan Lemak Enzim lipase lambung bertanggung jawab terhadap 25% pemecahan trigliserida yang menghasilkan droplet lemak yang akan menjadi substrat yang baik untuk enzim lipase pankreas. Lambung juga akan mengaduk droplet lemak sehingga menghasilkan emulsi minyak dalam air dan emulsi ini akan distabilkan oleh fosfolipid. Emulsi ini bersifat asam sehingga harus dinetralkan oleh sekresi empedu dan pankreas. Emulsi asam ini akan merangsang sekresi hormon

7 kolesistokinin (CCK) dari mukosa duodenum, dan hormon ini lalu akan merangsang sekresi empedu. Sekresi pankreas berisi bikarbonat dan enzim (lipase, fosfolipase A2, dan kolesterol esterase). Bikarbonat berfungsi untuk menetralisasi keasaman isi lambung yang berada di duodenum. Enzim lipase akan menghidrolisis trigliserida menjadi monoasilgliserol dan asam lemak, enzim phospholipase A2 akan menghidrolisis fosfolipid menjadi lisofosfolipid dan asam lemak, sedangkan enzim kolesterol esterase akan memecah ester kolesterol menjadi kolesterol dan asam lemak. Getah empedu akan memodifikasi emulsi lemak sehingga permukaan luarnya mengandung gugus hidroksil (-OH) yang bersifat hidrofilik dan memberikan ion negatif yang nantinya akan diikat oleh protein kolipase untuk meningkatkan aktivitas enzim lipase. Getah empedu, kolipase, dan enzim lipase lalu akan bersatu dalam terniary complex yang juga mengandung ion kalsium. Produk aktivitas hidrolitik tersebut adalah misel yang berdiameter 4-6 nm. Lipofosfolid dan monoasilgliserol yang bersifat sangat amfipatik akan distabilkan oleh getah empedu. Bentuk amphiphiles ini mengakibatkan senyawa non-polar, seperti kolesterol dan vitamin yang larut lemak dapat bergabung ke dalam misel (Gurr et al. 2002; Guyton dan Hall 2006).

Gambar 2 Pencernaan dan penyerapan lemak di usus halus (Gurr et al. 2002) Misel ini akan diabsorbsi ke enterosit menembus brush border membrane di enterosit, sedangkan getah empedu akan diabsorbsi di ileum untuk kemudian diresirkulasikan ke hati melalui pembuluh portal. Misel sebernarnya tidak dapat menembus membran enterosit, tetapi sekreta mukosa yang berbentuk mukopolisakarida ini nantinya akan merangsang protonisasi nonesterified fatty acid (NEFA) menjadi tidak bermuatan (nonpolar) sehingga dapat berdifusi menembus membran enterosit. Difusi misel menembus membran enterosit dibantu oleh protein transporter spesifik, yaitu FABP (Fatty Acid Binding Protein) dan FAT (Fatty Acid Translocase). Di dalam enterosit akan terjadi reesterifikasi asam lemak menjadi trigliserida dan fosfolipid melalui monoacylglycerol pathway. Trigliserida lalu dikemas bersama protein, kolesterol, fosfolipid, dan vitamin larut lemak dalam bentuk kilomikron, dan kilomikron kemudian dikeluarkan dari sel epitel melalui mekanisme eksositosis dan disalurkan ke pembuluh limfe dan

8 mengalir ke dalam aliran darah melalui duktus torasikus (Gurr et al. 2002, Iswari dan Manalu 2010). Obesitas Obesitas adalah kelebihan bobot tubuh akibat tertimbunnya lemak, untuk pria dan wanita masing-masing melebihi 20% dan 25% dari bobot tubuh. Seseorang yang memiliki bobot badan 20% lebih tinggi dari nilai tengah kisaran bobot badannya yang normal dianggap mengalami obesitas. Tingkat obesitas dapat diketahui dengan menghitung indeks massa tubuh (IMT). Klasifikasi IMT menurut WHO yang cocok untuk masyarakat Asia adalah: kurus (IMT<18), normal (IMT=18-25), gemuk sehat (IMT=25-30), dan gemuk tidak sehat atau obesitas (IMT>30) (Siagian 2004). Obesitas digolongkan menjadi 3 kelompok:  Obesitas ringan : kelebihan bobot badan 20-40%  Obesitas sedang : kelebihan bobot badan 41-100%  Obesitas berat : kelebihan bobot badan >100%. Obesitas berat ditemukan sebanyak 5% dari antara orang-orang gemuk. Terjadinya obesitas melibatkan beberapa faktor, diantaranya genetik, fisiologis, makanan, dan perilaku (gaya hidup). Secara ilmiah, obesitas terjadi akibat mengkonsumsi kalori lebih banyak daripada yang diperlukan tubuh. Obesitas meningkatkan risiko menderita penyakit jantung koroner, hiperlipidemia, penyakit hati dan kantong empedu, osteoartritis, kanker, dan penyakit saluran pernapasan dibandingkan orang dengan bobot badan normal (Pi-Sunyer 1993).

Inhibitor Lipase Inhibitor enzim lipase yang biasa digunakan saat ini adalah orlistat yang mengandung tetrahydrolipstatin. Tetrahydrolipstatin merupakan derivat lipstatin yang diisolasi dari Streptomyces toxytricini. Orlistat merupakan inhibitor lipase pertama yang bersifat selektif dan ireversibel. Selektivitas dibuktikan dengan penghambatan enzim hidrolase yang seratus kali lebih rendah dibandingkan enzim lipase. Sebelum penemuan orlistat, inhibitor enzim lipase yang digunakan, seperti alkyl dan boronic acid, bersifat reversibel sehingga efektivitasnya berkurang karena ikatannya dengan enzim tidak bersifat permanen (Hadvary et al. 1988, Weibel et al. 1987). Lipstatin telah diidentifikasi struktur kimianya oleh Hochuli et al. (1987) dengan metode kimia dan spektroskopi, struktur kimianya adalah 2S,3S,5S,7Z,10Z)-5-[(S)-2-formamido-4-methylpentanoyloxy]-2-hexyl-3 hydroxy 7,10- hexadecadienoic lactone. Orlistat berikatan secara kovalen dengan sisi aktif enzim lipase membentuk kompleks enzim-inhibitor yang kuat dan stabil (Gambar 3) (Hadvary et al. 1990). Kestabilan ikatan ini dibuktikan dengan hidrolisis tetrahidrolipstatin oleh buffer yang tidak mempengaruhi kekuatan ikatan kovalen (Hadvery et al. 1988). Ikatan ini akan mengalkilasi gugus hidroksil serin pada sisi aktif enzim lipase. Lipase yang inaktif ini tidak mampu menghidrolisis lemak menjadi asam lemak dan monoasilgliserol (Hadvary et al. 1988). Lipstatin dan tetrahydrolipstatin tidak dapat menghambat aktivitas enzim lain, seperti tripsin, chymotrypsin, fosfolipase A2, amilase, dan esterase hati(Weibel et al. 1987).

9

Gambar 3 Ikatan kovalen antara tetrahidrolipstatin dan human pancreatic lipase (Peng et al. 1992). Orlistat diabsorbsi secara minimum ke sirkulasi. Hal ini ditunjukkan dari 360 mg orlistat radioaktif yang diberikan, hanya 1% yang ditemukan di urine dan 96% ditemukan di feses 4 hari setelah pemberian. Waktu paruh orlistat adalah 1419 jam. Orlistat dimetabolisme di hati dan diekskresikan lewat empedu dalam bentuk metabolit M1 dan M3. M1 dihasilkan dari pembukaan -lakton dan gugus ester dari N-formyl leucine side chain. Orlistat tidak dapat dideteksi di plasma setelah 96 jam pascapemberian 400 mg orlistat selama 16 hari (Zhi et al. 1996). lakton sangat vital peranannya dalam aktivitas inhibisi lipstatin, pada tetrahydrolipstatin yang dihilangkan gugus -lactonenya mengalami penurunan IC50 sebesar 20 kali (Weibel et al. 1987). Orlistat akan menurunkan absorbsi lemak sebesar 20% pada pemberian dosis rendah (80 mg) dan 35% pada pemberian dosis tinggi (400 mg) (Zhi et al. 1994). Penurunan absorbsi lemak pada pemberian dosis yang lebih tinggi tidak lebih dari 35%. Pemberian orlistat yang diikuti diet rendah kalori dan olahraga akan menurunkan bobot badan 0,5 kg/minggu. Pemberian 120 mg orlistat pada 688 pasien obesitas (BMI 28-40 kg/m2) selama 52 minggu akan menurunkan bobot badan 10,25 persen. Setelah pemberian orlistat dihentikan, pasien mengalami kenaikan bobot badan 52 persen dari bobot badan yang hilang. Menurut Nicholls (2001), pemberian orlistat akan meningkatkan sensitivitas insulin dan menurunkan kadar glukosa darah sehingga mengurangi kebergantungan penderita diabetes pada injeksi insulin. Orlistat juga akan menurunkan kadar LDL dan kolesterol, tetapi juga menurunkan kadar HDL. Pada uji in vitro, lipstatin menghambat hidrolisis trioleat oleh porcine pancreatic lipase dengan IC50 0,14 µM pada uji in vitro (Weibel et al. 1987). Orlistat tidak direkomendasikan kepada anak-anak berusia di bawah 10 tahun, wanita hamil dan menyusui, dan sindrom malabsorbsi kronis. Sampai saat ini, belum ada laporan efek samping serius, keracunan, dan overdosis orlistat. Kaya et al. (2004) melaporkan efek samping gejala gangguan pencernaan ringan, seperti diare, flatus, dan konsistensi feses yang berminyak. Hopman et al. (1997) melaporkan orlistat meningkatkan peluang pembentukan batu empedu karena menurunkan kontraksi empedu.

10 Imunoglobulin Y (IgY) Imunoglobulin adalah molekul glikoprotein yang diproduksi oleh sel plasma sebagai respons keberadaan imunogen dan berperan sebagai komponen utama sistem kekebalan humoral. Imunoglobulin tersusun atas 2 rantai bobot (heavy chain) dan 2 rantai ringan (light chain) yang dihubungkan oleh ikatan disulfida sehingga membentuk struktur Y. Keberadaan IgY pertama kali dilaporkan oleh Leslie dan Clem pada tahun 1969. Mereka menemukan molekul yang mirip dengan IgG mamalia pada serum unggas, namun struktur kimianya berbeda. Imunoglobulin ini juga ditemukan dalam jumlah dominan di amfibia dan reptilia (Nolan dan Mine 2004). Pada mamalia terdapat lima jenis imunoglobulin, yaitu IgG, IgA, IgM, IgD, dan IgE. Pada ayam terdapat tiga jenis imunoglobulin, yaitu IgA, IgM, dan IgY. IgA banyak ditemukan di organ sekresi eksternal, seperti empedu dan oviduk. IgA dan IgM unggas memiliki bobot molekul, struktur, dan mobilitas elektroforesis yang sama dengan IgM dan IgA mamalia. IgY adalah imunoglobulin yang paling banyak ditemukan di serum dan kuning telur serta mencakup 75% dari total antibodi unggas (Chalgoumi et al. 2009). Secara umum, struktur IgY dan IgG memiliki kesamaan. IgY dan IgG sama-sama terdiri atas dua rantai bobot dengan bobot molekul masing-masing 6770 kDa dan dua rantai ringan dengan bobot molekul masing-masing 25 kDa. Rantai bobot IgG terdiri atas 3 daerah C (Cv1-Cv3), sedangkan rantai bobot IgY terdiri atas 4 daerah C (Cv1-Cv4). Kelebihan 2 daerah C mengakibatkan IgY memiliki bobot molekul yang lebih besar dibandingkan IgG (180 kDa dan 150 kDa). IgG lebih fleksibel dibandingkan IgY karena memiliki satu engsel (hinge) yang lebih banyak diantara Cv1 dan Cv2 dibandingkan IgG. Beberapa daerah, khususnya diantara Cv1 dan Cv2, mengandung residu asam amino prolin dan glisin yang menghambat fleksibilitas IgY (Michael et al. 2010).

Gambar 4 Perbandingan struktur molekul IgG kelinci dengan IgY ayam (Chalgoumi et al. 2009). IgY diangkut ke kuning telur dari sirkulasi induk melewati oolema menuju oosit matang di folikel ovarium. IgY lalu berikatan dengan reseptor spesifiknya di permukaan kuning telur sehingga memungkinkan perpindahan IgY ke dalam

11 kuning telur. Setelah itu, IgY masuk ke dalam pembuluh darah anak, Proses ini menghabiskan waktu 3-6 hari. Beberapa bagian dari IgY berperan penting dalam perpindahan tersebut, diantaranya CH2 dan CH3 yang dikenali oleh reseptor IgY di membran kuning telur serta daerah Fc dan engsel (hinge region). Ig A dan IgM juga ditransfer dari oviduk ke albumin, setelah itu menembus cairan amnion untuk menetap di embryonic gut. Konsentrasi IgM, IgA, dan IgY didalam sebutir telur adalah masing-masing ~0,15 mg/mL, ~0,7 mg/mL, dan ~8-25 mg/mL (Chalgoumi et al. 2009). Hal penting yang membedakan IgY dari IgG adalah IgY lebih resisten terhadap suhu, pH, dan kekuatan ion dibandingkan IgG. IgY ayam tidak berikatan dengan reseptor Fc manusia dan juga tidak bereaksi dengan anti-antibodi manusia, seperti faktor rheumatoid dan antiIgG manusia (Schade et al. 1996). IgY tidak menyebabkan reaksi silang dengan komponen struktural jaringan mamalia dan sel darah mamalia (Wibawan et al. 2009). Tabel 1 Perbandingan IgG Mamalia dengan IgY Unggas IgG

IgY

Mamalia

Unggas, reptil, amfibi

Serum

Kuning telur

Bobot molekul (SDS-PAGE)

150 kDa

180 kDa

Bobot molekul (MALDI-TOF MS)

150 kDa

167 kDa

Struktur dasar

Regio hinge fleksibel, regio Fc lebih pendek dengan satu pasang gugus karbohidrat

Regio hinge sempit dan kurang fleksibel, regio Fc lebih panjang dengan dua pasang gugus karbohidrat

Reaksi silang

Bereaksi dengan antibodi Tidak bereaksi manusia antibodi manusia

Afinitas purifikasi

Protein A atau G

Kestabilan

Stabil pada pH 3-10, suhu Stabil pada pH 4-9, suhu 70oC 65oC

Hidrofobisitas

Kurang hidrofobik Regio Fc hidrofobik dibanding IgY

Produktivitas

Terbatas dalam durasi dan Durasi panjang dalam jumlah menghasilkan antibodi dengan jumlah besar

Hewan Penghasil Sumber

(Sumber: Schade et al. 1996)

dengan

Protein L

12 Potensi Produksi IgY Antilipase Reaksi imun muncul akibat rangsangan antigen yang dikenali tubuh sebagai benda asing. Antigen dapat berbentuk multiantigen kompleks, seperti bakteri, virus, dan parasit ataupun antigen tunggal, seperti protein, peptida, dan polisakarida. Protein merupakan imunogen yang paling efektif karena strukturnya yang beragam (polymorphism) serta perbedaan antarspesies dan individu (jarak filogenetik). Apabila peptida ingin digunakan sebagai imunogen, peptida tersebut harus diberikan karier, seperti Bovine Serum Albumin (BSA) terlebih dahulu. Lemak dan asam nukleat tidak dapat digunakan sebagai imunogen (Goldsby et al. 2003). Fakta-fakta ini memungkinkan pembentukan antibodi terhadap enzim lipase mamalia pada ayam. Enzim lipase mamalia yang dapat digunakan untuk merangsang pembentukan antibodi terhadap lipase pada ayam adalah enzim lipase pankreas manusia, anjing, dan babi. cDNA enzim lipase pankreas anjing memiliki kesamaan 69% dengan cDNA enzim lipase pankreas manusia, sedangkan sekuens NH2 terminal enzim lipase babi memiliki kesamaan 85% dengan sekuens NH2 terminal enzim lipase manusia. Dengan demikian, hiperinfeksi ayam dengan enzim lipase babi dan anjing akan menghasilkan antibodi terhadap enzim lipase (IgY antilipase) yang hampir sama dengan IgY antilipase manusia. Jarak filogenetik antara ayam dan mamalia memungkinkan produksi antibodi dalam jumlah banyak dengan hanya menggunakan sedikit antigen. IgY yang dapat dipanen dari kuning telur bisa mencapai setengah liter pada ayam selama satu bulan. Jumlah ini sepuluh kali lipat dibandingkan dengan jumlah yang dapat dipanen dari darah. Konsentrasi IgY pada kuning telur cenderung konstan sesuai dengan tingkat kematangan oosit, yaitu pada kuning telur yang telah siap ditemukan 10-20 mg/mL, sedangkan konsentrasi IgY pada serum ayam berkisar antara 5-7 mg/mL (Rose et al. 1974). Jika seekor induk ayam menghasilkan 20 butir telur setiap bulan, maka kita dapat mengisolasi IgY sebanyak lebih dari 2 g per ekor selama satu bulan. Oleh karena kandungan 2 g IgY kuning telur sama dengan kandungan IgY pada 300 mL serum darah atau 600 mL darah, dengan demikian antibodi yang dihasilkan oleh ayam ini 10 kali lipat dibandingkan antibodi kelinci. Total sekresi enzim lipase pankreas manusia 3 jam setelah makan makanan dengan kadar lemak tinggi sebanyak 700 mL adalah 200-250 mg (Carriere et al. 2005). Dengan ratarata kandungan IgY pada kuning telur sebesar 10-20 mg/mL dan rata-rata volume kuning telur 15 mL, maka dalam satu butir telur akan terdapat 150-300 mg IgY antilipase. Jumlah IgY dalam satu butir telur cukup untuk menghambat aktivitas semua enzim lipase manusia di saluran pencernaan. IgY antilipase dapat diberikan dalam bentuk telur yang sudah dimasak dengan air dibawah 80oC karena pemasakan telur yang mengandung IgY akan menurunkan aktivitas IgY menjadi 7%. IgY dalam kuning telur, susu formula, trehalosa, sukrosa, dan fruktosa masih memiliki aktivitas 70% saat dimasak dengan air 70oC selama 20 menit. Semakin cepat waktu masak, aktivas IgY antilipase akan lebih baik (Jaradat dan Marquardt 2000).

13 IgY Antilipase dalam Saluran Pencernaan IgY antilipase sebelum bertemu dengan enzim lipase di usus halus akan menghadapi sekreta dari berbagai organ pencernaan, mulai dari saliva sampai dengan sekresi enzim pankreas. Sekreta-sekreta tersebut memiliki sifat kimia yang bervariasi sehingga kemampuan IgY antilipase untuk bertahan menghadapi hambatan-hambatan tersebut perlu dikaji secara mendalam. a. Saliva Saliva disekresikan oleh kelenjar sublingualis, submandibularis, dan parotis dengan jumlah sekresi saliva berkisar antara 800-1500 mL per hari dengan rata-rata 1000 mL per hari. Kelenjar parotis mensekresikan saliva yang mengandung enzim ptialin (α-amilase) yang akan menghidrolisis amilum, sedangkan kelenjar sublingualis dan kelenjar submandibularis mensekresikan mukus yang berfungsi untuk lubrikasi dan melindungi permukaan rongga mulut. Saliva mempunyai pH 6.0–7.0 dan nilai pH tersebut merupakan nilai yang optimum bagi enzim ptialin (Guyton dan Hall 2006). Berdasarkan karakteristik tersebut, maka Ig Y antilipase tidak mengalami gangguan dan hambatan di rongga mulut karena IgY bersifat stabil pada pH 6.0-7.0 karena memiliki pH isoelektrik 5.7–7.6 (Nolan dan Mine 2004) dan di rongga mulut tidak terdapat enzim yang mencerna glikoprotein. b. Sekresi esofagus Membran esofagus dilapisi oleh kelenjar mukus, kelenjar di bagian atas esofagus mensekresikan mukus yang berfungsi untuk mencegah perlukaan mukosa esofagus akibat partikel makanan, sedangkan kelenjar di bagian bawah esofagus mukus untuk mencegah autodigesti mukosa esofagus oleh sekresi asam lambung (Guyton & Hall 2006). Berdasarkan karakteristik tersebut, sama seperti rongga mulut, IgY antilipase tidak mengalami gangguan dan hambatan di esofagus. c. Sekresi lambung Hambatan utama bagi IgY antilipase di lambung adalah sekresi HCl dari sel parietal lambung yang memiliki pH yang sangat asam dan pepsin. HCl akan bertemu dengan pepsinogen yang disekresikan oleh chief cell lambunguntuk membentuk pepsin yang mempunyai aktivitas proteolitik (digesti protein) pada pH 1.8-3.5. Pepsin akan inaktif pada pH diatas 5. Menurut Nolan dan Mine (2004), aktivitas IgY akan menurun pada pH di bawah 3.5 dan bersifat sensitif terhadap pepsin. Penurunan aktivitas IgY disebabkan perubahan konformasi di bagian Fab (tempat antigen binding site) sehingga IgY tidak dapat berikatan dengan antigen pada kondisi asam. IgY tetap stabil pada kondisi basa sampai pH 11 dan baru akan kehilangan aktivitasnya pada pH 12. Stabilitas IgY terhadap digesti pepsin bergantung pada kondisi pH. Pada pH 2, pepsin akan menghidrolisis IgY menjadi peptida sedangkan pada pH 4, IgY dapat mempertahankan aktivitasnya sebesar 91% setelah inkubasi dengan pepsin selama 4 jam (Chalgoumi et al. 2009). Jika melihat fakta diatas, maka dapat dikatakan IgY antilipase tidak dapat diberikan secara oral, namun pemberian IgY anti-Clostridium jejuni secara oral pada ayam dapat menurunkan jumlah bakteri di feses sebanyak 99% jika dibandingkan dengan kelompok kontrol. Gurtler (2004) memberikan IgY antiSalmonella enteritidis dalam bentuk tepung tulang yang dicampur pakan dengan

14 dosis 3 g/hari/ekor selama 23-26 hari pada ayam yang diinfeksi S.enteritidis dengan dosis 2 x 108 cfu/ekor. Hasilnya, pemberian tepung telur yang mengandung IgY anti-S.enteritidis dapat menurunkan kontaminasi S. enteritidis di telur sebanyak 29.4% jika dibandingkan dengan kelompok kontrol. Rahimi et al. (2007) memberikan 15 mL kuning telur yang mengandung IgY-anti S.enteritidis yang dicampur dalam 3.84 mL air minum, hasilnya menurunkan faecal shedding bakteri di feses sebanyak 14% dan menurunkan konsentrasi bakteri jika dibandingkan dengan kontrol (0.27 log10 dan 3.98 log10 CFU) serta menurunkan jumlah bakteri yang dapat diisolasi di hati, limpa, dan ileum (Nolan dan Mine 2004). Menurut Jaradat et al. (2000), aktivitas IgY di saluran pencernaan dapat dilindungi dengan microencapsulation IgY, tetapi akan menambah biaya sehingga pemberian IgY dalam tepung telur merupakan solusi yang efektif dan ekonomis. IgY yang diinkubasikan dengan pepsin pada pH 2.5 akan kehilangan aktivitasnya apabila ditambahkan gula sukrosa, laktosa, dan trehalosa, cyclodextrin, dextran, dan pada saat tidak ditambahkan protektan, tetapi aktivitasnya dapat dipertahankan sebanyak 34% dan 39% (Gambar 5) saat diberikan dengan susu formula dan kuning telur. Kemampuan susu formula dan kuning telur untuk menstabilisasi IgY disebabkan kemampuan buffering sehingga pH larutan meningkat. Peningkatan pH larutan akan menurunkan aktivas pepsin sehingga digesti IgY oleh pepsin menurun. Selain itu, susu formula dan kuning telur memiliki efek protektif terhadap IgY dengan cara menjauhkan IgY dari pepsin. Kemampuan kuning telur menghambat aktivitas pepsin membuktikan IgYantilipase dapat diberikan dalam bentuk telur (kuning telur utuh) tanpa harus dipurifikasi dulu dan memiliki ketahanan terhadap pepsin (Jaradat dan Marquardt 2000).

Gambar 5Aktivitas IgY saat diinkubasikan dengan pepsin (■) dan tripsin (□) tanpa pemberian protektan (NA), dengan pemberian cyclodextrin, dextran, laktosa, trehalosa, sukrosa, kuning telur, dan susu formula (Jaradat & Marquardt 2000). d. Sekresi pankreas Di usus halus, hambatan terhadap aktivitas IgY antilipase hanya enzim tripsin dan kimotripsin yang bersifat proteolitik. pH tidak menjadi hambatan karena pH lingkungan usus halus yang netral (7.0–8.0). IgY sendiri tidak

15 terpengaruh aktivitasnya oleh enzim tripsin dan kimotripsin. Pada Gambar 5, terlihat aktivitas IgY setelah inkubasi dengan tripsin tanpa protektan adalah 80%, sedangkan dengan penambahan trehalosa dan kuning telur tidak menurunkan aktivitas IgY (100%). Bentuk sediaan makanan juga berpengaruh pada aktivitas IgY karena makanan yang cair akan dicerna lebih cepat (berada dalam saluran pencernaan dalam waktu yang lebih singkat) dibandingkan makanan padat sehingga exposure terhadap enzim pepsin, tripsin, dan kimotripsin dapat diminimalisir. Setelah berhasil melewati empat hambatan utama dalam saluran pencernaan (HCl, pepsin, tripsin, dan kimotripsin), binding site IgY antilipase pada bagian Fab akan berikatan dengan binding site enzim lipase, yaitu gugus hidroksil dari asam amino serine (Ser-152). Ikatan ini bersifat sangat spesifik. Akibatnya, lemak tidak dapat dipecah oleh enzim lipase sehingga tidak dapat diserap ke dalam usus halus. IgY antilipase pertama kali diperkenalkan oleh Julio Pimentel melalui paten yang diperolehnya pada tahun 2008. IgY antilipase yang digunakan Julio Pimentel adalah dalam bentuk murni, dengan bentuk sediaan tersebut sangat kemungkinan besar IgY antilipase yang diberikan akan terdegradasi oleh asam lambung dan enzim-enzim proteolitik saluran cerna sehingga kehilangan aktivitasnya. Pemberian IgY antilipase dalam kuning telur merupakan upaya perlindungan terhadap aktivitas IgY antilipase.

16

3 METODE Bahan Hewan coba yang digunakan dalam penelitian adalah 4 ekor ayam petelur ras ISA Brown berumur 10 minggu untuk menghasilkan Imunoglobulin Y Antilipase dan 1 ekor ayam petelur ras ISA Brown berumur 10 minggu sebagai kontrol, serta 12 ekor kelinci jantan ras New Zealand White berumur 6 bulan. Enzim lipase pankreas yang digunakan adalah enzim lipase pankreas babi (Appli Chem #A9520). Bahan-bahan yang digunakan untuk metode Bradford adalah: Larutan dye commasie brilliant blue (Bio-Rad #500-0006) dan protein Bovine Gamma Globulin. Bahan-bahan yang digunakan untuk SDS-PAGE adalah: Acrylamide 40% (Bio-Rad #161-0154), Ammonium Ferrosulfat (AFS), buffer Tris HCl, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Acrilamide, Tetra Mehyl Etilen Diamin (TEMED), air deionisasi, bromphenol blue, -mercaptoethanol, dan pewarna commasie blue. Bahan-bahan yang digunakan untuk ELISA adalah: non dried fat milk, konjugat rabbit anti-chickhen IgY (IgG)yang dilabel Horseradish Peroxidase (HRP)(Sigma #A9046), dan substrat ABTS (2,2'-azino-bis(3ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid). Bahan-bahan yang digunakan untuk purifikasi IgY adalah: kuning telur, TBS-Tween, dekstran sulfat, CaCl2, sodium sulfat, TBS, dan PBS. Bahan-bahan yang digunakan untuk Immunoblotting adalah: Tris, glisin, metanol, kertas transfer (pure nitrocellulose membrane 0.45 µm), non fat milk, PBS, TBS-T, konjugat rabbit anti-chickhen IgY (IgG)yang dilabel peroxidase (Sigma #A9046), Pewarna Ponceaus, dan Pewarna Diaminobenzidine. Bahan-bahan yang digunakan untuk uji in vitro adalah: orlistat (Xenical®), IgY antilipase, IgY kontrol, substrat DTNB (((5,5’-dithiobis(2-nitro benzoic acid) dan DMPTB (2,3-dimercapto-1-propanol tributyrate). Bahan-bahan untuk uji in vivo adalah orlistat (Xenical®), PBS, kuning telur, kuning telur yang mengandung IgY antilipase, dan pakan standar (Indo Feed® K-03 Super). Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Mini-PROTEAN® 3 Cell (Bio Rad #165-3301), ELISA reader (Multiskan EX, Thermo), spektrofotometer (Ultrospec® 1100 pro), magnetic stirer, ELISA plate, high speed refrigerated micro centrifuge (Tomy MX-307), safety cabinet,inkubator, mikropipet, oven, dan soxhlet. Preparasi Enzim Lipase Enzim lipase pankreas babi dilarutkan dalam PBS (Phosphate Buffer Saline) steril 1 M pH 7,4 dengan konsentrasi 2,5 mg/mL. Akan tetapi, enzim lipase pankreas babi tersebut tidak sepenuhnya larut dalam PBS atau air. Hal ini menimbulkan pertanyaan, apakah lipase berada pada bagian terlarut atau tidak terlarut. Untuk memastikan hal tersebut, dilakukan SDS-PAGE pada larutan lipase, fraksi terlarut, dan fraksi tidak terlarut untuk melihat profil protein pada masing-masing fraksi. Fraksi terlarut merupakan supernatan yang didapat setelah larutan lipase disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 x g selama 10 menit,

17 sedangkan fraksi tidak terlarut merupakan platelet yang didapat setelah larutan lipase disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 x g selama 10 menit sebanyak dua kali. Larutan lipase, fraksi terlarut, dan fraksi tidak terlarut kemudian diukur masing-masing konsentrasi proteinnya menggunakan metode Bradford. Metode Bradford Metode ini berdasarkan pengikatan protein pada larutan dye comassie brilliant blue. Larutan dye comassie brilliant blue setelah berikatan dengan protein akan diabsorbsi secara maksimum pada panjang gelombang 595 nm (Wilson dan Walker 2000). Sebagai standar, digunakan protein Bovine Gamma Globulin (Bovine IgG)dengan berbagai konsentrasi. Sebanyak 200 µL larutan Bradford (dye comassie brilliant blue, etanol 95%, asam orto fosfat 85%, dan akuades) ditambahkan pada 800 µL sampel (protein standar atau lipase), kemudian diinkubasikan selama 10 menit, lalu dilakukan pembacaan pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 595 nm. Kurva standar dibuat dari pengenceran Bovine IgG, kemudian dibuat persamaan regresinya, yaitu: Y = ax + b, Y adalah besarnya absorbsi, a adalah koefisien regresi, x adalah konsentrasi sampel dan b adalah suatu konstanta. Konsentrasi protein dihitung dari persamaan regresi kurva standar. Analisis Kemurnian Enzim Lipase dengan SDS-PAGE SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) dilakukan pada larutan lipase, fraksi terlarut, dan fraksi tidak terlarut. Prosedur elektroforesis sebagai berikut. Gel pemisah (separating gel) terdiri atas: 50 µL APS (Ammonium Persulfat), buffer Tris HCl 1.5 M pH 8.8, 100 µL SDS, Acrilamide 40%, 5 µL TEMED, dan air deionisasi sampai volume 4.9 mL. Setelah gel pemisah mengeras, disiapkan gel pengumpul (stacking gel) yang terdiri atas: 25 µL APS (Ammonium Persulfat), 1.25 mL buffer Tris HCl 1.5 M pH 6.8, 5 µL SDS, 375 µL Acrilamide 40%, 5 µL TEMED, dan air deionisasi sampai volume 3.25 mL. Gel pengumpul dicetak dengan bantuan “sisir” (comb) untuk membuat sumur tempat memasukkan sampel. Setelah gel mengeras, sisir diangkat. Sampel dilarutkan dalam campuran buffer sampel (SDS Reducing Buffer) dan -mercaptoethanol (perbandingan 5:1). Sampel lalu dipanaskan pada suhu 95oC selama 5 menit. Sebanyak 20 µL sampel dimasukkan ke dalam sumur gel. Proses pemisahan protein menggunakan buffer pemisah (running buffer) yang terdiri atas: Tris HCl 0,025 M, glisin 0,192 M, dan SDS 0,1% pH 8.8. Pemisahan dilakukan pada kekuatan arus 400 mA dengan voltase 90 V untuk setiap gel. Setelah elektroforesis selesai, gel diwarnai commasie blue sambil digoyanggoyang selama 20 menit. Sisa pewarnaan kemudian dihilangkan dengan destaining solution (metanol 40%, asam asetat 10%, air deionisasi 50%) . Kurva standar dibuat dari nilai Mobility Rate (Mfatau Rf), kemudian dibuat persamaan regresinya, yaitu: Y = ax + b, Y adalah log bobot molekul, x adalah Mobility Rate dan b adalah suatu konstanta. Mobility Rate diukur dengan rumus: Rf

=

Jarak pergerakan pita protein dari tempat awal Jarak pergerakan warna pelacak dari tempat awal

18 Produksi Antibodi IgY Antilipase pada Ayam Produksi IgY antilipase dilakukan pada 4 ekor ayam betina ras ISA Brown berumur 10 minggu,sedangkan 1 ekor ayam betina ras ISA Brown berumur 10 minggu dijadikan kontrol. Ayam-ayam tersebut dipelihara dalam kandang baterai dan diberi pakan komersial standar CP 324 dan air minum secara ad libitum. Lima ekor ayam petelur yang digunakan dipastikan terlebih dahulu tidak memiliki antibodi terhadap enzim lipase. Setelah dipastikan tidak memiliki antibodi terhadap enzim lipase, empat ekor ayam petelur diimunisasi dengan 0,5 mL larutan enzim lipase (2,5 mg/mL dalam PBS), 0,55 mL adjuvan Quil-A 2 mg/mL, dan merthiolate 0.01% secara intramuskuler pada minggu ke-12. Satu ekor dijadikan sebagai kontrol negatif. Penyuntikan kemudian diulang pada minggu ke14 dan 18.Dua minggu setelah imunisasi, dilakukan pengambilan darah dari vena brachialis, untuk kemudian dilakukan pengukuran titer antibodi terhadap lipase pada serum. Penghitungan Titer Antibodi terhadap Enzim Lipase dengan ELISA Sebelum menghitung titer antibodi terhadap enzim lipase pada serum, dilakukan ELISA Checkerboard untuk menentukan konsentrasi optimum enzim lipase dan serum sehingga penghitungan titer antibodi memberikan hasil optimum. Konsentrasi optimum enzim lipase yang didapat adalah 8 µg/mL dengan pengenceran serum 1/200. Prinsip ELISA adalah ikatan antara antigen dengan antibodi yang dideteksi dengan antibodi yang dilabel. Teknik ELISA yang digunakan sesuai dengan Akita dan Nakai (1994) dengan beberapa modifikasi. Enzim lipase 8 µg/mL dicoating pada ELISA plate, kemudian diinkubasikan pada suhu 4oC selama satu malam. Kemudian dilakukan bloking dengan susu skim (non dried fat milk) 50 mg/mL untuk menutupi bagian sumur yang tidak dicoating agar tidak berikatan dengan antibodi. Serum dengan pengenceran 1/200 dimasukkan ke lajur pertama, kemudian diencerkan secara serial. Kemudian diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang, diikuti dengan pencucian dengan washing buffer (0.2 g KCl, 0,2 g KH2PO4, 500 µL Tween, 1.15 g Na2HPO4, dan 37.5 g NaCl dalam 1 L akuabidest). Konjugat rabbit antichickhen IgY (IgG)yang dilabel Horseradish Peroxidase (HRP) (Sigma no catalog #A9046) dengan pengenceran 1/2500 lalu ditambahkan, kemudian diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang. Kemudian dilakukan pencucian dengan washing buffer sebanyak lima kali. Substrat ABTS lalu ditambahkan, kemudian diinkubasikan selama 15 menit dan dilakukan pembacaan OD (Optical Density) dengan ELISA reader pada panjang gelombang 420 nm. Purifikasi IgY dari Kuning Telur Prosedur purifikasi IgY yang dilakukan mengikuti metode yang dilakukan Jenesius dan Koch (1997). Kuning telur dari setiap ayam dipisahkan dari putih telur, kemudian dilarutkan dalam TBS-Tween dengan perbandingan 1:4. Kemudian larutan tersebut disentrifugasi pada kecepatan 3000 x g selama 30 menit. Dekstran sulfat 10% sebanyak 120 µL/mL supernatan ditambahkan kemudian diikuti 50 µL CaCl2 1 M. Kemudian dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 3000 x g selama 30 menit, apabila supernatan yang dihasilkan belum jernih dilakukan penambahan dekstran sulfat dan CaCl2 serta sentrifugasi kembali sampai menghasilkan supernatan yang jernih. Supernatan yang jernih menunjukkan tidak ada lagi lemak yang terdapat di dalamnya.

19 Purifikasi IgY dilakukan dengan presipitasi sodium sulfat. Metode ini merupakan pilihan utama karena menghasilkan IgY dalam bentuk paling murni dibandingkan metode-metode lainnya. Purifikasi diawali dengan menambahkan 20 g Na2SO4 secara perlahan pada telur delipidasi sambil distir. Suspensi kemudian disentrifugasi pada kecepatan 3000 x g selama 20 menit. Platelet yang didapat lalu dilarutkan dalam 10 mL TBS dan disentrifugasi kembali untuk diambil supernatannya. Supernatan kemudian distir sambil ditambahkan 8 mL Na2SO4 36% pada suhu 40oC. Jika suspensi yang terbentuk berwarna keruh, hal itu menunjukkan terdapat protein didalamnya. Kemudian dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 3000 x g selama 20 menit. Platelet yang didapat kemudian dilarutkan dalam PBS dan didialisis terhadap PBS. Kemurnian IgY yang berhasil dipurifikasi kemudian divalidasi dengan SDS PAGE dan Immunobloting.Konsentrasi protein dalam larutan tersebut dihitung dengan metode Bradford.Titer IgY antilipase diukur dengan ELISA. Identifikasi Kemurnian IgY dengan SDS PAGE dan Immunoblotting Gel hasil elektroforesis ditransfer ke transfer buffer (3.02 g Tris, 14.4 g glisin, dan 200 mL metanol dalam 1 L akuabidest). Kertas transfer lalu diletakkan diatas gel selama 15 menit, kemudian dialiri arus listrik 350 mA dengan voltase 100 V selama 60 menit. Metode ini dinamakan electrophoretic elution dengan sistem wet transfer. Kertas transfer (pure nitrocellulose membrane 0.45 µm) lalu diwarnai dengan Ponceaus 0.01% kemudian dibloking dengan non fat milk 5% dalam PBS selama 24 jam. Kertas transfer lalu dicuci TBS-T (Tris Buffer Saline yang mengandung 0.05% Tween, pH 7.4) sebanyak 4 kali. Kemudian konjugat rabbit anti-chickhen IgY (IgG)yang dilabel peroxidase dengan pengenceran 1/5000 ditambahkan pada kertas transfer sambil digoyang-goyang selama 90 menit. Kertas transfer lalu dicuci dengan TBS-T sebanyak 4 kali, kemudian direaksikan dengan substrat Diaminobenzidine (0,006 µL DAB, 10 µL H2O2, dan 10 mL Tris 50 mM pH 7.6). Pengukuran titer IgY Antilipase dengan ELISA Teknik ELISA yang digunakan sesuai dengan Akita dan Nakai (1994) dengan beberapa modifikasi. Enzim lipase 8 µg/mL dicoating pada ELISA plate, kemudian diinkubasikan pada suhu 4oC selama 24 jam. Kemudian dilakukan bloking dengan susu skim (non dried fat milk) 50 mg/mL untuk menutupi bagian sumur yang tidak dicoating agar tidak berikatan dengan antibodi. IgY antilipase dengan pengenceran 1/200 dimasukkan ke lajur pertama, kemudian diencerkan secara serial. Kemudian diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang, diikuti dengan pencucian dengan washing buffer (0.2 g KCl, 0,2 g KH2PO4, 500 µL Tween, 1.15 g Na2HPO4, dan 37.5 mg NaCl dalam 1 L akuabidest). Konjugat rabbit IgG antichickhen yang dilabel Horseradish Peroxidase (HRP) dengan pengenceran 1/2500 lalu ditambahkan, kemudian diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang. Kemudian dilakukan pencucian dengan washing buffer sebanyak lima kali. Substrat ABTS lalu ditambahkan, kemudian diinkubasikan selama 15 menit dan dilakukan pembacaan OD (Optical Density) dengan ELISA reader pada panjang gelombang 420 nm.

20 Uji In Vitro Penghambatan Aktivitas Enzim Lipase Uji in vitro menggunakan modifikasi metode colorimetric microplate assay yang dilakukan Choi et al. (2003). Aktivitas penghambatan dilihat pada empat kelompok, yaitu IgY antilipase, Xenical® (orlistat) sebagai kontrol positif, IgY dari telur kontrol (tidak diimunisasi), dan tanpa inhibitor. Konsentrasi IgY (antilipase dan kontrol) dan orlistat yang digunakan didasarkan atas perbandingan molaritas (molar ratio) antara IgY dan orlistat terhadap enzim lipase. Dengan mengetahui perbandingan tersebut, konsentrasi dimana IgY dan orlistat memiliki jumlah yang sama dengan lipase akan didapat. Substrat yang digunakan adalah DMPTB (2,3-dimercapto-1-propanol tributyrate). DMPTB akan dihidrolisis oleh lipase sehingga terjadi pelepasan gugus thiol dari DMPTB. Gugus thiol tersebut akan bereaksi dengan TNB (5-thio, 2-nitrobenzoat). TNB merupakan hasil reduksi DTNB (((5,5’-dithiobis(2-nitro benzoic acid) oleh lipase. Reaksi tersebut ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning Enzim lipase dengan konsentrasi 0,5 mg/mL dalam buffer L (10 mM KCl, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) ditambahkan sebanyak 10 µL. Setiap inhibitor diencerkan secara serial, IgY antilipase dan IgY kontrol diencerkan dari 5 mg/mL sampai 0,078125 mg/mL sedangkan orlistat diencerkan dari 50 µg/mL sampai 0,78125 µg/mL. Kemudian ditambahkan sebanyak 10 µL. ELISA plate kemudiandiinkubasikan pada suhu 37oC selama 30 menit supaya terjadi ikatan yang kuat antara lipase dan IgY antilipase. Sebanyak180 µL pereaksi campuran (20 µL 10 mM DMPTB, 20 µL DTNB 40 mM, 2 µL EDTA 1 mM, 2 µL Triton X-100, dan 50 µL Tris-Cl 1 M dengan 803 µL air deionisasi) kemudian ditambahkan ke setiap sumur. ELISA plate laludiinkubasikan pada suhu 37oC selama 30 menit, kemudian dilakukan pembacaaan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 405 nm. Aktivitas penghambatan enzim lipase sampel diukur dengan rumus: Aktivitas penghambatan =

ODkontrol- – ODsampel ODkontrol-

x 100%

Uji In Vivo Penghambatan Absorbsi Lemak di Saluran Pencernaan Kelinci Sebelum mendapat perlakuan, 12 ekor kelinci diaklimasi selama 1 minggu dengan menggunakan antibiotik enrofloksasin 5 mg/kg bobot badan (BB) 2x sehari selama 3 hari, ivermectine 0,2-0,44 mg/kg BB secara subkutan (SC) sebagai antiektoparasit, dan mebendazole 50 mg/kg BB secara peroral (PO) sebagai antiendoparasit. Pada tahap ini, semua kelinci diberi ransum standar (Indo Feed® K-03 Super) dan minum ad libitum. Sebelum diberi perlakuan, kelinci ditempatkan pada masing-masing kandangnya, kelinci ditimbang bobotnya untuk mengetahui bobot badannya. Selanjutnya hewan percobaan secara acak dibagi menjadi 4 kelompok perlakuan yang masing-masing terdiri atas 3 ekor kelinci. Adapun kelompok perlakuan adalah sebagai berikut:  Kelompok 1. Merupakan kelompok kontrol negatif. Kelompok ini hanya diberi pakan standar 50 g/ekor 2 kali sehari.  Kelompok 2. Merupakan kelompok kontrol positif. Kelompok ini diberi pakan standar 50 g/ekor dan kuning telur 5 g/ekor 2 kali sehari.  Kelompok 3. Merupakan kelompok yang diberi pakan standar 50 g/ekor, kuning telur 5 g/ekor dan orlistat (Xenical®) 5,285 mg/kg BB/ekor 2 kali sehari. Orlistat diberikan 1 jam setelah makan.

21 

Kelompok 4. Merupakan kelompok yang diberi pakan standar 50 g/ekor, kuning telur 5 g/ekordan kuning telur yang mengandung IgY antilipase 2 g/ekor 2 kali sehari secara bersamaan.

Perhitungan dosis orlistat didasarkan pada perbandingan luas permukaan tubuh (Laurence dan Bacharach 1964). Rumus perbandingan dosis disajikan sebagai berikut: Dosis untuk kelinci = 1,5kg (mg/kg)

Dosis manusia x dewasa (mg/kg)

Faktor konversi manusia ke kelinci (0,07)

Dosis untuk kelinci 1,5 kg = 120 mg/kg x 0,07 Dosis untuk kelinci = 8,4 mg/1,2 kg Dosis untuk kelinci = 5,6 mg/kg BB Sebelum perlakuan, semua kelinci diaklimasi selama 1 minggu dengan menggunakan antibiotik enrofloksasin 5 mg/kg bobot badan (BB) 2x sehari selama 3 hari, ivermectine 0,2-0,44 mg/kg BB secara subkutan (SC) sebagai antiektoparasit, dan mebendazole 50 mg/kg BB secara peroral (PO) sebagai antiendoparasit. Seminggu setelah aklimasi dilakukan pemeriksaan fisik untuk memastikan bahwa semua kelinci yang akan digunakan berada dalam kondisi sehat. Setelah semua kelinci dipastikan berada dalam kondisi sehat, perlakuan dilakukan selama 1 minggu. Satu hari sesudah perlakuan dilakukan pengumpulan feses dari setiap individu untuk kemudian dilakukan pengukuran kadar lemak feses dengan metode sokhletisasi. Absorbsi lemak di saluran pencernaan dihitung dari selisih lemak pakan dengan lemak feses. Analisis Kimia Feses Analisis Kadar Air dengan Metode Oven Analisis kadar air dengan metode oven dimulai dengan mengeringkan cawan/botol timbang beserta tutupnya dalam oven 105 ± 2oC selama 15 menit kemudian didinginkan di dalam desikator lalu ditimbang sampai ketelitian 0,1 mg. Sebanyak 3-5 g feses dimasukkan ke dalam cawan kemudian dikeringkan dalam oven 105 ± 2oC selama 3 jam kemudian didinginkan di dalam desikator selama 15-30 menit. Cawan beserta sampel kemudian ditimbang sampai ketelitian 0,1 mg dan dilakukan penetapan blanko. Rumus penghitungan kadar air dilakukan dengan persamaan: Kadar air

=

w1 – w2 w1 – w0

x

100 %

dimana w0: bobot cawan w1: bobot cawan + sampel sebelum dikeringkan (g) w2: bobot cawan + sampel sesudah dikeringkan (g)

22

Analisis Kadar Lemak dengan Metode Soxhlet Analisis kadar lemak dimulai dengan menghaluskan sampel feses hingga ukurannya <1 mm. Kemudian sampel tersebut ditimbang sebesar 2-4 g lalu dimasukkan ke dalam thimble dan ditutup dengan kapas agar tidak bocor. Thimble berisi sampel kemudian dimasukkan ke dalam alat Soxhlet dan diekstrak selama 4 jam, lalu labu lemak berisi residu lemak disuling dan dikeringkan dalam oven 105oC sampai tidak berbau pelarut selama 3 jam kemudian didinginkan dalam desikator selama 30-45 menit. Kemudian labu berisi lemak ditimbang dan dikerjakan blanko. Rumus penghitungan kadar lemak dilakukan dengan persamaan: w1 – w2 Kadar lemak = x 100 % w1 – w0 dimana w0 : bobot labu (g) w1: bobot labu + sampel sebelum ekstraksi (g) w2: bobot labu + residu minyak setelah ekstraksi (g) Prosedur Analisis Data Data inhibisi aktivitas lipase pankreas, kadar lemak feses, persentase dan jumlah lemak pakan yang dicerna yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) dan jika terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji Duncan.

23

4 HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis Enzim Lipase (Metode Bradford dan SDS-PAGE) Enzim lipase yang dipakai dalam penelitian ini tidak sepenuhnya larut dalam air (PBS). Hal tersebut menimbulkan keraguan tentang kemurnian sediaan enzim lipase pankreas babi yang digunakan. Analisis kemurnian enzim lipase dengan SDS-PAGE (Gambar 6) menunjukkan enzim lipase total dan fraksi terlarut memiliki pita protein dominan dengan bobot molekul mirip, yaitu 50,138 kDa untuk enzim lipase terlarut dan 49,106 untuk fraksi terlarut (Gambar 6 dan Lampiran 2). Hal ini sesuai dengan penelitian De Caro et al. (1981) yang mengatakan bahwa enzim lipase pankreas babi memiliki bobot molekul 49,859 kD dan berbentuk rantai tunggal yang terdiri atas 449 asam amino. Fraksi tidak terlarut enzim lipase memiliki pita protein dominan dengan bobot molekul 22,585 kDa (Gambar 6 dan Lampiran 2). Keberadaan hanya satu pita protein dominan juga memastikan lipase pankreas babi berbentuk rantai tunggal (struktur primer). Hal ini sesuai dengan pernyataan De Caro et al. (1981). Kesamaan profil protein larutan lipase dengan fraksi terlarut serta perbedaan profil protein antara fraksi terlarut dan tidak terlarut serta persamaan menunjukkan lipase larut sepenuhnya di dalam PBS sehingga immunogen yang disuntikkan pada ayam nantinya benarbenar hanya terdiri atas lipase. Larutan lipase (2,5 mg/mL) dan fraksi terlarut memiliki konsentrasi protein yang serupa pada pengukuran konsentrasi protein dengan metode Bradford, yaitu 2,017 mg/mL dan 1,949 mg/mL. Fraksi tidak terlarut memiliki konsentrasi protein 0,574 mg/mL (Lampiran 2). Data tersebut menunjukkan sediaan lipase pankreas tersebut tidak sepenuhnya berisi protein. Konsentrasi protein pada larutan lipase dan fraksi terlarut adalah sebesar 80,7% dan 77,96%. Penurunan konsentrasi protein ini kemungkinan disebabkan oleh denaturasi sebagian kecil protein dalam proses produksi. Dosis enzim lipase yang kemudian digunakan dalam imunisasi disesuaikan berdasarkan konsentrasi protein.Hal ini dilakukan mengingat protein adalah komponen imunogenik yang nantinya akan merangsang pembentukan antibodi. Imunogenesitas suatu bahan berhubungan langsung dengan bobot molekul. Bahan dengan bobot molekul lebih besar dari 5 kDa adalah imunogen yang baik sedangkan bahan dengan bobot molekul 4.5 kDa adalah imunogen yang kurang baik, dan bahan dengan bobot molekul kurang dari 1 kDa termasuk bahan yang tidak imunogenik. Jumlah antigen yang umum dipakai untuk imunisasi adalah 10 ng sampai 1 mg dengan volume yang diinjeksi tidak lebih dari 1 mL (Schade 1996). Imunogen yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 1,25 mg dan memiliki bobot molekul ±50 kDa sehingga syarat dari imunogen yang baik sudah terpenuhi.

24

S

T

LT

LTT

Gambar 6. Profil pita protein S (Standar), T (Larutan Lipase), LT (Lipase Terlarut), LTT (Lipase Tak Terlarut) Produksi Antibodi IgY Antilipase pada Ayam Imunogenesitas enzim lipase pankreas babi pada ayam petelur terlihat dari peningkatan nilai OD (Optical Density) mulai dari sebelum imunisasi sampai dengan imunisasi terakhir (Gambar 7 dan Lampiran 6). Peningkatan nilai OD menggambarkan peningkatan titer antibodi terhadap lipase pankreas babi di serum. Rata-rata nilai OD mulai dari preimunisasi sampai dengan imunisasi terakhir adalah 2.199 ± 0.626, 2.008 ± 0.457, 0.473 ± 0.093, and 0.289 ± 0.047. Imunisasi pertama hanya meningkatkan rata-rata nilai OD 1,6 kali, sedangkan imunisasi kedua dan ketiga mampu meningkatkan rata-rata nilai OD 6,9 dan 7,6 kali dibandingkan OD sebelum imunisasi. Peningkatan rata-rata nilai OD atau titer antibodi secara drastis mulai dari imunisasi kedua menunjukkan imunisasi secara berulang (booster) akan mempertahankan titer antibodi dan meningkatkan titer antibodi secara drastis dibandingkan imunisasi pertama karena antigen sudah dikenali oleh sistem kekebalan tubuh. Terlebih antigen yang disuntikkan adalah protein asal mamalia. Li et al. (1998) mengatakan ayam akan memproduksi antibodi spesifik terhadap protein mamalia lebih banyak dibandingkan mamalia itu sendiri. Pada penelitian Li et al (1998), imunisasi ayam dengan BSA (Bovine Serum Albumin) akan terus meningkat 14 hari pascaimunisasi dan mencapai puncak pada hari ke-56. Waktu imunisasi dan selang booster berbeda setiap hewan. Pada mencit dilakukan setiap 2 minggu, pada hewan besar dilakukan imunisasi dilakukan setiap 2 bulan, sedangkan pada kuda dilakukan setiap bulan. Pada ayam, booster dilakukan dengan interval 4-6 minggu (Schade et al. 1996). Imunisasi dihentikan setelah imunisasi ketiga karena nilai rata-rata OD setelah imunisasi kedua cenderung stabil karena hanya terdapat sedikit

25 peningkatan setelah imunisasi ketiga. Hal tersebut menunjukkan respons pembentukkan antibodi pada tubuh ayam sudah maksimal. Rata-Rata OD pada pembacaan 420 nm

2,5

2

1,5

1

0,5

0 Pre

1

2

3

Imunisasi ke-

Gambar 7. Nilai rata-rata OD serum ayam yang diimunisasi pada panjang gelombang 420 nm Beberapa faktor yang berpengaruh pada pembentukan antibodi adalah umur hewan, ukuran molekul antigen, kerumitan stuktur kimiawi antigen, genetik, rute imunisasi, dosis antigen, serta waktu dan pengulangan imunisasi. Efektivitas produksi antibodi pada serum bergantung pada pelepasan antigen yang konstan untuk merangsang sistem imun. Bahan yang digunakan adalah adjuvan (Lindel dan Weeks 1995). Penggunaan adjuvan bersama dengan antigen akan lebih meningkatkan produksi antibodi dibandingkan penggunaan antigen tunggal. Adjuvan Quil-A adalah derivat saponin dari ekstrak air tanaman Quillaja saponaria dan adjuvan ini telah digunakan secara luas dalam produksi vaksin. Adjuvan ini akan berikatan dengan membran sel yang hidrofobik, lalu masuk ke dalam sel membran melalui interaksinya dengan kolesterol membentuk “lubang” yang akan mempermudah interaksi dengan Antigen Percenting Cell (APC) sehingga merangsang aktivitas sitokin (interferon dan interleukin) dan limfosit T. (Iqbal et al.2007; Sun et al. 2009). Purifikasi IgY Antilipase IgY dimurnikan dengan metode presipitasi dengan sodium sulfat. Metode ini merupakan pilihan utama dalam purifikasi IgY dan memiliki kemurnian 98,7 persen sebanyak 70-100 mg/telur setelah tiga kali salting-out dengan sodium sulfat (Hatta et al. 1993, Jenesius & Koch 1993). Pada penelitian ini dilakukan salting-out dengan sodium sulfat sebanyak tiga kali. Proses presipitasi IgYoleh sodium sulfat digambarkan dalam dua fase, yaitu salting-in dan salting-out. Pada salting-in, penambahan garam sodium sulfat pada awalnya (konsentrasi garam rendah dan tidak jenuh) mengakibatkan protein (IgY) menjadi bermuatan dan menjadi larut dalam larutan garam. Kelarutan IgY akan terus meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi garam sampai pada suatu kondisi yang larutan

26 garam sodium sulfat sudah jenuh (salting-out) dimana IgY akan mengendap. Pengendapan disebabkan persaingan antara garam dan IgY untuk mengikat air. Pada konsentrasi tinggi, kekuatan ionik garam semakin kuat dibandingkan IgY sehingga garam lebih dapat mengikat air dan IgY akan mengendap (Fatchiyah et al. 2011). IgY yang mengendap dalam platelet kemudian didialisis dalam larutan PBS pH 8 selama 24 jam. Dialisis bertujuan untuk meningkatkan kemurnian IgY yang dihasilkan dengan cara menghilangkan sisa-sisa garam sodium sulfat melalui buffer exchanges dan menghilangkan molekul protein-protein kecil dengan berat molekul dibawah 10 kDa (cut of 10 kDa). Berdasarkan karakterisasi protein dengan SDS-PAGE, diketahui molekul yang dipurifikasi memiliki dua pita protein utama dengan bobot molekul 61.2 kDa dan 26.9 kDa (Gambar 8A dan Lampiran 7). Pita protein tersebut identik dengan rantai panjang dan rantai pendek IgY. Rantai panjang dan rantai pendek IgY diketahui berukuran 67-70 kDa dan 22-30 kDa. Hatta et al. (1990) mendapatkan dua pita protein IgY dengan bobot molekul 70 kDa untuk rantai bobot dan 21 kDa untuk rantai ringan. Dengan demikian, IgY yang dipurifikasi memiliki bobot molekul 176,2 kDa, rata-rata bobot molekul IgY utuh adalah 180200 kDa (Hatta et al. 1990; Michael et al. 2010).Pemecahan molekul utuh IgY menjadi rantai panjang dan rantai pendek disebabkan pemutusan ikatan disulfida yang menghubungkan rantai panjang dan rantai pendek oleh SDS dan mercaptoethanol. Ketiadaan protein lain selain rantai panjang dan pendek pada SDS-PAGE juga menunjukkan kemurnian IgY yang dihasilkan.

Gambar 8. Hasil SDS PAGE (A), hasil Immunoblotting (B) Immunoblotting (Western Blot) merupakan imunodeteksi yang dilakukan untuk mengkonfirmasi molekul yang dipurifikasi adalah benar IgY. Terlihat pada Gambar 8B, dua protein yang pada SDS PAGE diduga adalah rantai panjang dan rantai pendek bereaksi terhadap konjugat rabbit IgG antichicken. Hal ini menunjukkan IgY telah berhasil dipurifikasi. Konjugat rabbit IgG

27 antichickenmerupakan antibodi monoklonal terhadap IgY yang diambildari darah kelinci sehingga memiliki spesifisitas tinggi. yang digunakan harus memiliki spesifisitas dan afinitas yang tinggi. Rata-rata konsentrasi IgY pada kuning telur ayam yang diimunisasi dengan lipase pankreas babi adalah30.13 ± 6.29 mg/mL kuning telur. Konsentrasi IgY pada ayam yang diimunisasi dengan lipase jauh lebih tinggi dibandingkan ayam yang tidak diimunisasi. Hasil ini menunjukkan bahwa imunisasi yang dilakukan berhasil meningkatkan konsentrasi IgY total di kuning telur. Konsentrasi IgY normal pada kuning telur adalah 10-15 mg/mL (Michael et al. 2010). Total sekresi lipase pankreas manusia saat diberi makanan dengan kadar lemak tinggi adalah 200-250 mg (Carriereet al. 2005). Dengan perbandingan bobot molekul IgY dan lipase sebesar 1 : 3,478, maka dibutuhkan IgY antilipase sebanyak 374,8 - 434,75 mg untuk dapat berikatan dengan enzim lipase pankreas manusia dalam jumlah sama banyak. Molekul IgY memiliki dua binding site sehingga satu molekul IgY dapat mengikat dua molekul lipase. Total IgY yang dihasilkan di kuning telur (571,4 mg/butir telur) diharapkan mampu mengikat semua enzim lipase pankreas manusia. Pada pengukuran titer IgY antilipase dengan ELISA, IgY dari kuning telur ayam yang diimunisasi memiliki rata-rata nilai Optical Density (OD) sebesar 1,842 ± 0,007, nilai ini jauh lebih tinggi dibandingkan nilai OD pada IgY dari kuning telur ayam yang tidak diimunisasi, yaitu 0,07 (Lampiran 9). Hal ini menunjukkan IgY yang dihasilkan pada kuning telur ayam yang diimunisasi bersifat spesifik terhadap enzim lipase pankreas babi. Meskipun antibodi yang spesifik terhadap enzim lipase berhasil diproduksi di serum dan kuning telur, kemampuan antibodi tersebut dalam menetralisir aktivitas enzim lipase pankreas masih menjadi pertanyaan. Hal ini disebabkan pada saat dilakukan analisis antigenisitas terhadap sekuens asam amino lipase pankreas babi, asam amino His-352 yang merupakan sisi aktif lipase diketahui kurang bersifat antigenik dengan nilai Kolaskar and Tongaunkar Antigenicity sebesar 0,912. Nilai maksimum, minimum, dan rata-rata antigenesitas asam amino pada lipase pankreas babi adalah 1,027, 0,862, dan 1. Kemampuan neutralisasi dari IgY antilipase dibuktikan pada uji in vitro dan in vivo. Inhibisi Aktivitas Enzim Lipase secara In Vitro Metode inhibisi yang digunakan mengacu pada metode ELISA colorimetric microplate assay yang dikembangkan oleh Choi et al (2003). Keunggulan metode ini adalah jumlah sampel inhibitor yang dibutuhkan sangat kecil, yaitu 10 µL sehingga uji dapat dilakukan dengan cepat dan dengan sampel yang banyak. Metode ini juga lebih ringkas dan lebih sensitif dibandingkan metode colorimetric konvensional dan metode lain, seperti titrimetrik dan spektrofotometrik. Keunggulan lain adalah substrat DMPTB lebih memiliki kemiripan dengan trigliserida dibandingkan substrat p-nitrophenyl ester yang biasa digunakan dalam metode colorimetric konvensional. Penghambatan terhadap aktivitas lipase ditentukan dengan mengukur laju penghambatan reduksi DTNB menjadi TNB dan hidrolisis atau pelepasan gugus thiol dari DMPTB. Orlistat(Xenical®) merupakan satu-satunya sediaan lipase inhibitor yang diizinkan beredar di masyarakat. Xenical® digunakan karena mempunyai kandungan utama orlistat (tetrahidrolipstatin) yang merupakan salah satu inhibitor

28 lipase pankreas yang bersifat selektif irreversibel yang pertama kali ditemukan (Hadvary et al.1988). Selain itu, telah diketahui bahwa orlistat menginhibisi lipase pankreas melalui mekanisme inhibisi nonkompetitif (Carriere et al. 2001). Uji inhibisi dilakukan menggunakan lima ragam konsentrasi inhibitor dan lipase dengan konsentrasi 2 mg/mL. Ragam konsentrasi ini dimaksudkan untuk melihat hubungan penambahan konsentrasi inhibitor terhadap daya inhibisi enzim lipase pankreas. Pemilihan konsentrasi didasarkan pada perbandingan bobot molekul inhibitor (orlistat, IgY antilipase, dan IgY kontrol). Enzim lipase pankreas babi, IgY, dan orlistat memiliki bobot molekul masing-masing 50 kDa, 200 kDa, dan 0,5 kDa. Perbandingan bobot molekul IgY dengan lipase pankreas adalah 4:1 dan setiap IgY mampu mengikat dua molekul lipase maka dibutuhkan IgY (IgY antilipase dan IgY kontrol) 2 kali lebih banyak dibandingkan lipase agar supaya IgY dan lipase dapat berikatan dalam jumlah sama banyak. Perbandingan bobot molekul IgY dengan orlistat adalah 400:1, maka dibutuhkan IgY (IgY antilipase dan IgY kontrol)400 kali lebih banyak dibandingkan orlistat agar supaya IgY (IgY antilipase dan IgY kontrol) dan orlistat dapat mengikat lipase dalam jumlah sama. Reaksi enzimatis lipase, yaitu pelepasan gugus thiol dari substrat DMPTB ditandai dengan rata-rata nilai Optical Density (OD)kelompok kontrol (tanpa inhibitor lipase) yang tinggi (1,216 ± 0,08) pada pembacaan dengan panjang gelombang 405 nm (Lampiran 10). Rata-rata nilai OD pada kelompok yang diberi inhibitor lipase (orlistat dan IgY antilipase) dengan berbagai konsentrasi jauh lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol (Lampiran 10). Penurunan nilai OD tersebut menunjukkan kemampuan orlistat dan IgY antilipase dalam menghambat aktivitas enzim lipase pankreas babi.Rata-rata nilai OD pada kelompok yang diberi IgY kontrol (IgY dari kuning telur ayam yang tidak diimunisasi) kurang lebih sama dibandingkan dengan kelompok kontrol (tanpa inhibitor lipase). Ketiadaan penghambatan aktivitas lipase yang dimiliki oleh IgY dari ayam yang tidak diimunisasi menunjukkan aktivitas penghambatan yang dimiliki oleh IgY antilipase berasal dari proses imunisasi yang dilakukan. Pada Tabel 2 dan Gambar 9 terlihat orlistat dan IgY antilipase memiliki kemampuan yang sama dalam menghambat aktivitas enzim lipase pankreas (p < 0,05). Hubungan yang linear antara logaritma konsentrasi inhibitor dan daya inhibisi terhadap enzim lipase pankreas menunjukkan hubungan antara penambahan konsentrasi inhibitor (IgY antilipase dan orlistat) dan daya inhibisi. Orlistat memiliki IC50 sebesar 0,996 µg/mg lipase, sedangkan IgY antilipase memiliki IC50 sebesar 340,08 µg/mg lipase. Nilai IC50 orlistat terhadap lipase menggunakan metode ELISA colorimetric microplate assay menurut Ramirez et al. (2012) adalah sebesar 0,142 µg/mg lipase. Nilai IC50 IgY antilipase lebih tinggi dibandingkan ekstrak tanaman herbal yang diuji dengan metode serupa pada penelitian Ramirez et al. (2012) seperti ekstrak Carmellia sinensis (IC50 299µg/mL), Ludwigia octovalvis (IC50 202 µg/mL), dan Iosthephane heterophyllia (IC50 509 µg/mL). Substrat yang digunakan dalam uji in vitroialah DMPTB, merupakan analog trigliserida dan memiliki dua gugus thioester yang akan dihidrolisis oleh lipase pankreas (Park et al. 2007). Enzim lipase pankreas babi memiliki aktivitas 30-90 U/mg. Artinya, enzim tersebut mampu melepaskan 30-90 µmol substrat trigliserida per menit. IgY antilipase sendiri memiliki IC50 sebesar 340,08 µg/mg

29 lipase. Dengan demikian, 340,08 µg IgY antilipase mampu menghambat pemecahan 15-45 µmol substrat trigliserida per menit. Dengan bobot molekul DMPTB sebesar 334,49 g/mol, maka 340,08 µg IgY antilipase mampu menghambat hidrolisis 5-15 g DMPTB atau trigliserida. Total sekresi enzim lipase pankreas manusia ketika diberi makan lemak tinggi sebanyak 700 mL adalah 200-250 mg (Carriereet al. 2005). Dengan demikian, dibutuhkan 68-85 mg IgY antilipase untuk menghambat setengah aktivitas lipase pankreas. Tabel 2. Daya inhibisi terhadap enzim lipase pankreas babi Orlistat Konsentrasi Rata-rata daya (µg/mL) inhibisi (%)

69,844 ±0,952 a 65,598 ±0,616 a 56,642 ± 1,109 a 44,563 ± 0,635 a 39,743 ± 0,906 a

12,5 6,25 3,125 1,5625 0,78125

IgY antilipase Konsentrasi Rata-rata daya (µg/mL) inhibisi

65,598 ± 2,170 a 61,079 ± 3,867 a 54,095 ± 1,480a 50,534 ± 0,575a 43,084 ± 1,163a

5000 2500 1250 625 312,5

IgY kontrol Konsentrasi Rata-rata daya (µg/mL) inhibisi

5000 2500 1250 625 312,5

13,585 ± 6,574 b 19,584 ± 2,257 b 12,106 ± 3,210 b 17,913 ± 1,265b 15,174 ± 5,819 b

100 80

Inhibisi (%)

y = 21,58x + 44,44

y = 18,461x + 8,8201

60 40 20 0

-1

0

1

2

3

4

Log konsentrasi (µg/mL) IgY antilipase

IgY kontrol

Orlistat

Gambar 9. Rata-rata daya inhibisi orlistat, IgY antilipase, dan IgY kontrol terhadap enzim lipase pada berbagai ragam konsentrasi Inhibisi absorbsi lemak secara in vivo IgY antilipase yang diunggulkan pada penelitian ini sebagai antiobesitas memiliki mekanisme kerja sebagai penghambat aktivitas enzim lipase pankreas. Hal ini telah terbukti pada uji in vitro, dimana IgY antilipase memiliki kemampuan yang serupa dengan orlistat dalam menghambat aktivitas IgY antilipase. Hewan coba yang digunakan dalam uji in vivo adalah kelinci, sekuens asam amino lipase pankreas kelinci memiliki homologi sebesar 76% dengan

30 sekuens asam amino lipase pankreas babi. Dengan demikian, kelinci dapat dikatakan sebagai hewan coba yang tepat. Tabel 3. Rata-rata kadar lemak feses, jumlah dan persentase lemak yang diserap Kelompok

1 2 3 4

Lemak yang dimakan (g) 4,11 ± 0,18 4,72 ± 0,19 3,78 ± 0,25 4,45±0,24

Lemak di feses Jumlah Presentase (g) (%) 0,78±0,18a 2,59 ± 0,17a 1,1 ± 0,01b 2,68 ± 0,23a 1,22± 0,08b 5,9 ± 1,8b b 1,14±0,02 3,96 ± 0,57a

Lemak pakan yang diabsorbsi Jumlah Presentase (g) (%) 3,33 ± 0,26b 80,8 ± 4,59a 3,625 ± 0,19c 76,60 ±0,96b 2,56 ± 0,22a 67,7 ± 2,03c b 3,27 ± 0,25 74,07 ± 1,2b

Kelompok 1: Pakan standar, Kelompok 2: Pakan hiperlipidemik, Kelompok 3: Pakan hiperlipidemik dan orlistat, Kelompok 4: Pakan hiperlipidemik dan kuning telur IgY antilipase Angka-angka pada baris yang sama yang diikuti oleh huruf yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji lanjut Duncan).

Pada Tabel 3 terlihat bahwa pemberian pakan dengan kadar lemak tinggi pada kelompok 2 akan meningkatkan jumlah lemak pakan yang diabsorbsi dalam saluran cerna. Hal ini disebabkan pakan dengan kadar lemak tinggi akan meningkatkan sekresi enzim lipase pankreas, akibatnya terjadi peningkatan hidrolisis lemak menjadi asam lemak untuk kemudian diabsorbsi di usus halus (Dojana et al. 2012). Pemberian inhibitor orlistat (kelompok 3) mampu menghambat absorbsi lemak di saluran cerna. Hal ini terlihat dari presentase absorbsi lemak pakan (67,7 ± 2,03%) dan jumlah lemak pakan yang diabsorbsi saluran cerna (2,56 ± 0,22 g) yang lebih rendah dan berbeda nyata (p < 0,05) dibandingkan kelompok lain. Pemberian orlistat pada penelitian ini mampu menghambat absorbsi lemak sebanyak 32,3%. Penurunan jumlah lemak pakan yang diabsorbsi mengakibatkan peningkatan jumlah lemak feses pada kelompok 3. Pada penelitian yang dilakukan Carriere et al. (2005), pemberian orlistat pada manusia yang diberi makanan dengan kadar lemak tinggi sebanyak 700 mL mampu menginaktivasi 51,2 ± 34,6% enzim lipase pankreas dan jumlah lemak makanan yang diabsorbsi hanya 43,6 ± 16,8%. Pemberian kuning telur yang mengandung IgY antilipase (kelompok 4) terlihat mampu menurunkan absorbsi lemak di saluran cerna. Hal ini terlihat dari jumlah lemak yang diabsorbsi pada kelompok 4 lebih rendah dan berbeda nyata dibandingkan kelompok 2 yang diberi pakan tinggi lemak, namun penghambatan absorbsi lemak yang terjadi pada kelompok 4 masih lebih rendah dibandingkan dengan kelompok 3 yang diberi orlistat. Berdasarkan data tersebut, kuning telur IgY antilipase memiliki kemampuan untuk menghambat aktivitas enzim lipase pankreas kelinci dan berpotensi sebagai antiobesitas baru. Penurunan aktivitas penghambatan kuning telur IgY antilipase pada uji in vivo kemungkinan disebabkan oleh rusaknya sebagian aktivitas IgY antilipase oleh enzim-enzim proteolitik di saluran cerna seperti pepsin, tripsin, dan kimotripsin. Jaradat dan Marquardt (2000) serta Carlender (2002) mengatakan pemberian IgY dalam kuning telur mampu mempertahankan aktivitas IgY terhadap digesti pepsin dan tripsin karena efek protektif dan buffering yang dimiliki kuning telur. Meskipun demikian, enzim-enzim proteolitik ini tetap menurunkan aktivitas IgY karena sebagian IgY akan dipecah menjadi fragmen Fab, Fab2, dan Fc. Fragmen Fab, Fab2 meskipun tetap memiliki aktivitas, aktivitasnya

31 tetap lebih rendah dibandingkan IgY utuh. Sebagian besar IgY antilipase kemungkinan telah dipecah oleh enzim-enzim proteolitik saluran cerna sehingga dosis kuning telur IgY antilipase harus ditingkatkan untuk mempertahankan konsentrasi optimum IgY antilipase terhadap enzim-enzim proteolitik saluran cerna.

5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Imunisasi ayam petelur dengan enzim lipase pankreas babi berhasil dilakukan dan menghasilkan antibodi yang spesifik terhadap lipase pankreas babi dalam jumlah tinggi di dalam serum dan kuning telur. IgY antilipase yang berhasil dipurifikasi dengan konsentrasi 30.1 ± 6.3 mg/mL kuning telur dan terdiri. IgY antilipase terbukti dapat menghambat kerja enzim lipase pankreas babi secara in vitro dan memiliki daya inhibisi yang sama dengan orlistat. Pada uji in vivo, kuning telur yang mengandung IgY antilipase memiliki kemampuan untuk menghambat aktivitas enzim lipase pankreas kelinci namun aktivitas penghambatannya masih di bawah orlistat.

Saran Perlu dilakukan isolasi IgY dari berbagai tempat di saluran pencernaan, mulai dari lambung, usus halus, usus besar, sampai feses untuk dapat mengetahui tingkat degradasi IgY di sepanjang saluran pencernaan. Selain itu perlu dilakukan penelitian dimana kuning telur IgY antilipase diberikan bersamaan dengan putih telur. Dengan pemberian bersamaan dengan putih telur, proses degradasi IgY antilipase oleh enzim-enzim proteolitik dapat diminimalisir karena protein tinggi dalam putih telur yang akan terlebih dahalu didegradasi. Dengan demikian aktivitas IgY antilipase diharapkan dapat meningkat.

32

DAFTAR PUSTAKA Akita EM., Nakai S. 1994. Immunoglobulin from egg yolk: isolation and purification. J Food Sci 57: 629-634. Balai Penelitian dan Pengembangan Kesehatan (Balitbangkes). 2008. Laporan Nasional Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) tahun 2007. Jakarta : Departemen Kesehatan RI. hlm. 48-53. Birari RB, Bhutani KK. 2007. Pancreatic lipase inhibitors from natural source: Unexplored potential. Drug Discov Today.12(19/20): 879:889. [BPS] Badan Statistik Nasional. 2010. Penduduk Menurut Kelompok Umur dan Jenis Kelamin [internet]. [diacu 2012 Mei 10]. Tersedia dari: http://dds.bps.go.id/eng/aboutus.php?sp=1. Carlender D. 2002. Avian IgY Antibody. In Vitro and In Vivo [disertasi]. Comprehensive Summaries of Uppsala Disertations from Faculty of Medicine 119. ACTA Universitatis Uppsala, Center Texa A&M University Kingsville. Carriere F, Grandval P, Gregory PC, Renou C, Henniges F, Struckmeier SS, Laugier R. 2005. Does the Pancreas Really Produce Much More Lipase than Required for Fat Digestion. J Pancreas 6(3):206-215. Chalgoumi R, Beckers Y, Portetele D, Thewis A. 2009. Hen egg yolk antibodies (IgY), production and use for passive immunization against bacterial enteric infections in chicken: a review. Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 13(2): 295-308. Choi SJ, Hwang JM, Kim IL. 2003. A Calorimetric Microplate Assay for High Throughput Analysis of Lipase Activity. J.Biochem.Mol.Biol. 36(4): 417420. De Caro J, Boudouard M, Bonicel J, Guidoni A, Desnuelle P, Rovery M. 1981. Porcine Pancreatic Lipase: Completion of Primary Structure. BBA 671:129-138. Fatchiyah, Arumingtyas EL, Widyarti S, Rahayu S. Biologi Molekular: Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Penerbit Erlangga. Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA, Kuby J. 2003. Immunology. Ed ke-5. San Fransisco: W.H Freeman. Gomez JA, Colwell NS, Sasser T, Kumar VB. 1992. Mollecular clonning and characterization of rabbit pancreatic triglyceride lipase. Biochem Biophys Res Commun 188(3): 967-971. Guimarães MCC, Amaral LG, Rangel LBA, Silva IV, Matta CGF, MattaMFR. 2009. Growth inhibition of Staphylococcus aureusby chicken egg yolk antibodies.Arch. Immunol. Ther. Exp57: 377–382. Gurr IM, Harwood JL, Frayn KN. 2002. Lipid Biochemistry. Ed ke-5. Oxford: Blackwell Publishing. Gurtler M, Methner U, Kobilke H, Fehlhaber K. 2004. Effect of orally administered egg yolk antibodies on Salmonella Enteritidis contamination of hen’s eggs. J. Vet. Med. B. 51: 129-134. Guyton AC, Hall JE. 2006. Textbook of Medical Physiology 11th Edition. Philadelphia: El Savier Saunders.

33 Hadvary P, Lengsfeld H, Wolfer H. 1988. Inhibition of pancreatic lipase in vitro by covalent inhibitor tetrahydolipstatin. J. Biochem 256: 537-361. Hadvary P, Sidlerj W, Meister W, Vetter W, Wolfer H. 1990. The Lipase Inhibitor Tetrahydrolipstatin Binds Covalently to the Putative Active Site Serine of Pancreatic Lipase. J. Biochem 266(4): 2021-2027. Hatta H, Kim M, Yamamoto T. 1990. A novel isolation method for hen yolk antibody “IgY”. Agric. Biol. Chem. 54(10):2531-2535. Hertzel AV, Thompson BR, Wiczer BM, Bernlohr DA. 2008. Lipid metabolism in adipose tissue. Di dalam: Vance DE , Vance FE , editor. Biochemistry of Lipid, Lipoprotein and Membrane. Ed ke-4. London: El Sevier. Hopman WPM, Jansen JBMC, Rosenbusch G, Lamars CBHW. 1997. Effect of equimolar amount of long chain triglycerides and medium chain triglycerides on plasma cholecystkinin and gall bladder contraction. Am J Clin Nutr 39:356-359. Iswantini D, Darusman LK, Fitriyani A. 2010. Uji in vitro ekstrak air dan etanol dari buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur sebagai inhibitor aktivitas lipase pankreas. J. Sains dan Teknologi Indonesia 12: 15-20. Jaradat ZW, Marquardt R. 2000. Studies on the Stability of Chicken IgY in Different Sugar, Complex Carbohidrat, and Food Material. J. Food and Agri.Immunol. 12: 262-272. Jensius JC, Koch C. 1997. Antibodies packaged in eggs. In: Jonstone, A.P, Turner, M.W (ed.), Immunochemistry: A Practical Approach. 1st edn. Oxford: Oxford University Press. Kaya A, Adyn N, Topsever P, Filiz M, Ozturk A, Dagar A, Kilinic E, Ekmekcioglu C. 2004. Effecacy of sibutramine, orlistat and combination therapy on short term weight management in obese patient. Biomed Pharmaco 58: 582-587. Kurnia A. 2006. Produksi Antibodi Anti Aeromonas hydrophillia pada kuning telur dan serum ayam Single Comb Brown Leghorn [skripsi]. Bogor: Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Iswari RS, Manalu W. 2010. Biokimia dan Fisiologi Lipid. Bandung: KPD. Iqbal RZ, Hua HUS, Wen XC, Arijo AG. 2007. Adjuvant effect of saponin on animal immune response. J Zheijang Univ Sci B 8(3): 153-161. Li X, Nakano T, Sunwoo H, Paek BH, Chae HS, Sim JS. 1998. Effect of eggs and yolk weight on Yolk Antibody (IgY) production on laying chickens. Poul Sci 77:266-270. Lindell E, Weeks I. 1995. Antibody technology. Bios Bioscience Publisher Limited UK. Loeken MR, Roth TF. 1983. Analysis of maternal IgG subpopulation which are transported into chicken oocyte. Immunology 49(1): 21-28. Lowe ME, Rosenblum JL, and Strauss AW. 1989. Cloning and Characterization ofHuman Pancreatic Lipase cDNA. J. Biol.Chem264(33): 20042-20048. Lowe ME. 1997. Structure and Function of Pancreatic Lipase and Colipase. Annu Rev Nutr 17: 141-158. Melnikova I, Wages D. 2006. Antiobesity therapies. Nature Review Drug Discovery 5: 369-370.

34 Michael A, Meenatchisundaram S, Parameswari G, Subbraj T, Selvakumaran R, Ramalingam S. 2010. Chicken egg yolk antibodies (IgY) as an alternative to mammalian antibodies. Ind.J.of Scie. and Tech. 3(4): 468-474. Nicholls H. 2001. Roche reveals benefit of Xenical for type 2 diabetics. Tren. Endocriol Met 12:381. Nolan JK, Mine Y. 2004. Avian egg antibodies: basic and potential application. Avian and Poul.Biol.Rev. 15: 25-46. Peng QL, Marki HP, Hadvary P. 1992. Identification of the active-site serine in human pancreatic lipase by chemical modification with tetrahydrolipstatin. FEBS 299(1): 111-115. Pimentel J. 2008. Decreased Fat Absorbtion with an Anti-Lipase Antibody. US Patent No US 7,344,713 B1. Pi-Sunyer FX. 1993. Medical Hazard of Obesity. Ann Intern Med 119:655-661. Poetri ON, Soejoedono RD, Indrawati A, Wibawan IWT. 2008. Peran Antibodi Kuning Telur (IgY) Sebagai Opsonin untuk Pencegahan Serangan Mutan Streptococcus Serotipe D (Streptococcus sobrinus). Berk. Penel. Hayati 12: 129-134. Rahman S, Van Nguyen S, Icatlo FC, Umeda K, Kodama Y. 2013. Oral passive IgY-based immunotherapeutics: A novel solution for prevention and treatment of alimentary tract diseases. Human, Vaccine, and Immunotherapeutic 14: 1039-1048. Rose M.E, Orlans E, Buttress N. 1974. Immunoglobulin classes in the hen’s egg: their segregation in yolk and white. Eur. J. Immunol. 4: 521-523. Schade R, Staak C, Hendriksen C, Erhard M, Hugl H, Koch G, Larsson A, Pollman W, Regenmortel M, Rijke E, Spielmann H, Steinbusch H, Straughan D. 1996. The Production of Avian (Egg Yolk) Antibodies (IgY). ATLA 24: 925-936. Siagian RA. 2004. Indeks Glikemik Pangan: Cara Memilih Pangan yang Menyehatkan. Jakarta: Penebar Swadaya. Sun HX, Xie Y, Ye PY. 2009. Advance in saponin-based adjuvant. Vaccine 27: 1787-1796. [USDHHS]. United States Department of Health and Human Services. 2004. Prescription Medication for the Treatment of Obesity [internet]. [diacu 2012 Mei 12].Tersedia dari: http://win.niddk.nih.gov/publications/ prescription.htm#fdameds. Weibel K, Hadvary P, Hochuli E, Kupfer E, Lengsfeld H. 1987. Lipstatin, an inhibitor of pancreatic lipase, produced by Streptococcus toxytricini: Producing Organism, Fermentation, Isolation and Biological Activity. J of Antibiotics XL(8): 1086-1091. [WHO]. World Health Organization. 2010. Obesity and Overwight [internet]. [diacu 2012 Mei 10]. Tersedia dari: http://www.who.int/mediacentre/ factsheets/fs311/en/. Wibawan IWT, Murtini S, Soejodoeno RD, Mahardika IGNKM. 2009. Produksi IgY Antivirus Avian Influenza H5N1 dan Prospek Pemanfaatannya dalam Pengebalan Pasif. J. Veteriner 3: 118-124. Widjaja A, Suhartini M. 2008. Imunoglobulin Kuning Telur untuk Mencegah Karies. MI Kedokteran Gigi 23(2).

35 Wilson

K, Walker J. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemistry.7th ed. United Kingdom: Cambridge University. Yun WJ. 2010. Possible anti-obesity therapeutics from nature: A review. Phytochemistry 71: 1625-1640. Zhi J, Melia AT, Guerciolini R, Kinberg J, Hauptman JB, Patel IH. 1994. Retrospective population-based analysis of the dose response (fecal fat excretion) relationship of orlistat in obese/overweight volunteers. Clin Pharm Ther 56: 82-85.

36

LAMPIRAN

37 Lampiran 1 Analisis Karakteristik Enzim Lipase

(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/SummaryDisplay) Prediksi posisi beta-turn lipase pankreas

38

(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/SummaryDisplay) Prediksi asam amino di permukaan lipase pankreas

39

(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/SummaryDisplay) Prediksi hidrofilisitas asam amino lipase pankreas

40

(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/SummaryDisplay) Antigenesitas asam amino lipase pankreas

41 Lampiran 2 Perhitungan Konsentrasi Protein Enzim Lipase Nilai Absorbansi (λ=565 nm) 0,074 0,109 0,238 0,551 1,02 1,499

Konsentrasi Bovine IgG (mg/ml) 2,5 5 10 25 50 75

Konsentrasi Bovine IgG (µg/ml)

100

Kurva Standar

90 80 70 60 50 40 30

y = 50,711x - 1,5887 R² = 0,9991

20 10 0 0

0,2

0,4

0,6

0,8 Absorbsi

1

1,2

1,4

Rumus regresi y= 50,711x - 1,5887 digunakan untuk menghitung konsentrasi protein Sampel

Lipase total Lipase terlarut Lipase tidak terlarut Sampel Lipase total Lipase terlarut Lipase tidak terlarut

Nilai Absorbansi (λ=565 nm) 0,827 0,8 0,706

Konsentrasi protein (mg/ml) Lipase 0,05 mg/ml

Persentase Protein 80,70% 77,96% 22,99%

0,0403 0,0389 0,0115

Lipase 2,5 mg/ml 2,017 1,949 0,574

42 Lampiran 3 Pembuatan Reagensia SDS PAGE 1. SDS 10% (w/v) 10 gr SDS dilarutkan dalam 90 ml air, kemudian volumenya dijadikan 100 ml dengan air deionisasi. 2. Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 27,23 Tris 80 ml air deionisasi Atur pH menjadi 8,8 dengan HCl 6 N 3. Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 6 gr Tris 60 ml air deionisasi Atur pH menjad 6,8 dengan HCl 6 N 4. Sample buffer (SDS Reducing Buffer) 3,55 ml air deionisasi 1,25 ml 0,5 Tris-HCl, pH 6,8 2,5 ml gliserol 2 ml SDS 10% (w/v) 0,2 ml Bromophenol blue 0,5% (w/v) 200 µl -mercaptoethanol ditambahkan ke dalam 1000 µl sample buffer untuk membentuk sample buffer 5x. Sampel ditambahkan ke sample buffer 5x dengan perbandingan minimal 1 : 2. 5. Pewarna Comassie blue stock: Satu tablet Pasta GelTM blue R 80 ml air deionisasi 120 ml metanol Setelah dilarutkan, saring dengan kertas filter 6. Pewarna Comassie blue: Comassie blue stock 100 ml Air deionisasi 80 ml Asam asetat 20 ml

43 Lampiran 4 Perhitungan Bobot Molekul Enzim Lipase Bobot molekul lipase dapat dihitung dari persamaan regresi antara protein marker (penanda protein) dengan logaritma dari bobot molekul protein marker yang telah diketahui. Mobilitas relatif (Rf) protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein yang diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein dibandingkan dengan jarak migrasi tracking dye. Mobilitas relatif dapat dirumuskan dengan: Rf

=

Jarak Migrasi Protein Jarak Migrasi tracking dye

Tabel Bobot Molekul Protein Marker Jarak Migrasi Rf Protein 0,6 0,1 0,8 0,133333 1,5 0,25 1,8 0,3 2,6 0,433333

Jarak Migrasi tracking dye 6 6 6 6 6

BM (kDa) 100 80 60 50 40

Kurva Standar BM Marker Berat Molekul (kDa)

120 y = -39,75ln(x) + 4,4429 R² = 0,9795

100 80 60 40 20 0 0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Rf

Rumus regresi y= -39,75 ln(x) + 4,4429 selanjutnya digunakan untuk menghitung bobot molekul protein lipase Sampel Jarak Migrasi Jarak Migrasi Rf BM (kDa) tracking dye Protein T 6 1,9 0,316667 50,13775 LT 6 1,95 0,325 49,10522 LTT 6 3,8 0,633333 22,58515

44 Lampiran 5. Reagensia untuk ELISA 1. ELISA dilution buffer stock: 12,14 gr Tris 0,1 M 29,22 gr NaCl 0,5 M 0,372 gr Na2EDTA 1 mM 2. ELISA dilution buffer: 44,5 ml ELISA dilution buffer 1 gr susu skim 1,5 ml Triton 1,5 ml Tween 2,5 ml serum kelinci 3. ELISA washing buffer: 0,2 gr KCl 0,2 gr KH2PO4 500 µl Tween 1,15 gr Na2HPO4 37,5 gr NaCl Aquabidest sampai volume 1 liter 4. Substrat ABTS: ABTS stock : 0,28 gr ABTS dalam 10 ml air deionisasi H2O2 stock : 126 µl H2O2 (30 %) dalam 10 ml air deionisasi Pewarna ABTS : ABTS stock 200 µl H2O2 stock 200 µl Sitrat buffer: 10 ml Citric Acid 0,1 M 8,49 gr/400 ml 0,2 M Na2HPO4.2H2O 4,24 gr/400 ml pH 7,8

45

46 Lampiran 7. Perhitungan Bobot Molekul IgY Antilipase Tabel Bobot Molekul Protein Marker Jarak Migrasi Rf Protein 1,2 0,098039 2 0,163399 3 0,245098 4 0,326797 5,51 0,450163 7,05 0,57598 9,2 0,751634 10,4 0,849673 11,8 0,964052

Jarak Migrasi tracking dye 12,24 12,24 12,24 12,24 12,24 12,24 12,24 12,24 12,24

BM (kDa) 100 80 60 50 40 30 25 15 10

Berat Molekul (kDa)

Kurva Standar BM Marker 120 100 80 60 40 20 0

y = -38,26ln(x) + 9,4502 R² = 0,9941

0

0,2

0,4

0,6 Rf

0,8

1

1,2

Rumus regresi y= -38,26 ln(x) + 9,4502 selanjutnya digunakan untuk menghitung bobot molekul protein lipase Protein 1 Sampel Jarak Migrasi Jarak Migrasi Rf BM (kDa) tracking dye Protein IgY 1 12,24 3,17 0,258 61,2 IgY 2 12,24 3,15 0,257 61,3 IgY 3 12,24 3,15 0,257 61,3 IgY 4 12,24 3,14 0,256 61,5 Protein 2 Sampel IgY 1 IgY 2 IgY 3 IgY 4

Jarak Migrasi tracking dye 12,24 12,24 12,24 12,24

Jarak Migrasi Protein 8,01 7,99 8,02 8,05

Rf 0,654 0,652 0,655 0,657

BM (kDa) 26,9 26,9 26,9 26,9

47 Lampiran 8 Perhitungan Konsentrasi Protein IgY Antilipase Nilai Absorbansi (λ=565 nm) 0,074 0,109 0,238 0,551 1,02 1,499

Konsentrasi Bovine IgG (mg/ml) 2,5 5 10 25 50 75

Konsentrasi Bovine IgG (µg/ml)

100

Kurva Standar

90 80 70 60 50 40 30

y = 50,711x - 1,5887 R² = 0,9991

20 10 0 0

0,2

0,4

0,6

0,8 Absorbsi

1

1,2

1,4

Rumus regresi y= 50,711x - 1,5887 digunakan untuk menghitung konsentrasi protein IgY antilipase Sampel IgY 1 IgY 2 IgY 3 IgY 4 IgY kontrol

Nilai Absorbansi (λ=565 nm) 0,754 0,457 0,660 0,631 0,381

Konsentrasi Protein (mg/ml) 36,647 21,586 31,881 30,409 17,732

48 Lampiran 9. Penghitungan titer antibodi IgY kuning telur Pengenceran 1/4000 1/8000 1/16.000 1/32.000 1/64.000 1/128.000 1/256.000 1/512.000 1/1.024.000 1/2.048.000 1/4.096.000 Kontrol Titer

1,834 1,593 1,243 0,925 0,481 0,274 0,178 0,132 0,106 0,096 0,071 0,086 2.048.000

IgY antilipase 1,849 1,843 1,530 1,543 1,267 1,238 0,941 0,964 0,487 0,493 0,276 0,239 0,182 0,184 0,133 0,130 0,118 1,103 0,093 0,092 0,074 0,072 0,081 0,084 2.048.000 2.048.000

IgY kontrol 0,079 0,079 0,082 0,081 0,080 0,080 0,083 0,082 0,084 0,085 0,082 0,087 0,079 0,083 0,081 0,081 0,081 0,079 0,082 0,081 0,081 0,082 0,081 0,081 0

0

0,079 0,081 0,079 0,081 0,082 0,083 0,081 0,081 0,080 0,082 0,082 0,079 0

49

50 Persentase Penghambatan/inhibisi terhadap lipase: Aktivitas penghambatan = Lipase + Orlistat 1 2 3 71,07 71,48 66,72 64,76 68,24 63,46 52,57 61,28 55,57 42,30 48,84 42,02 40,37 43,04 35,33

ODkontrol- – ODsampel ODkontrol-

Lipase + IgY antilipase 1 2 3 67,20 67,23 62,09 63,16 64,76 54,80 54,50 56,88 50,51 49,12 54,10 47,94 42,39 47,14 39,19

Konsentrasi Orlistat (µg/ml)

log kons orlistat 12,5 6,25 3,125 1,5625 0,78125

Konsentrasi IgY antilipase dan kontrol (µg/ml) 10 5 2,5 1,25 0,625

x 100%

Lipase + IgY kontrol 1 2 3 15,64 11,59 29,07 16,48 26,82 29,07 6,48 17,93 25,90 14,55 23,80 27,53 16,32 23,65 26,76 Persentase inhibisi (%)

71,48 68,24 61,28 48,84 43,04

69,759 65,488 56,474 44,390 79,091 Persentase inhibisi (%)

log kons 3,69897 3,39794 3,09691 2,79588 2,49485

IgY antilipase 65,508 60,908 53,964 50,385 42,908

IgY kontrol 18,770 23,844 19,824 21,961 22,241

51 Lampiran 11. Kandungan nutrisi pakan Pakan Standar Indofeeed K-03 Super® Protein kasar 16% Lemak 5% Serat Kasar 13% Abu 9 % Protein 13% TBN 70% Ca 0,8% P 0,6% Komposisi Kuning telur Kadar air 50% Lemak 34%

52 Lampiran 12 Penghitungan kadar air feses pada uji in vivo Kadar air

=

w1 – w2 w1 – w0

x

100 %

dimana w0: bobot cawan w2: bobot cawan + sampel sesudah dikeringkan (gr) w1: bobot cawan + sampel sebelum dikeringkan (gr)w2: Sampel

wo (gr)

w1(gr)

w2(gr)

Kadar air (%)

N1-pre

13,619

15,120

14,656

69,079%

N2-pre

26,145

27,974

27,201

57,713%

N3-pre

19,817

21,428

20,870

65,320%

H1-pre

21,577

23,332

22,575

56,850%

H2-pre

21,823

23,632

22,709

48,961%

H3 pre

22,708

24,435

23,614

52,480%

O1-pre

17,608

19,299

18,547

55,550%

O2-pre

19,944

21,503

20,943

64,096%

O3-pre

13,157

14,751

14,064

56,870%

I1-pre

19,817

21,337

20,681

56,859%

I2-pre

18,242

20,080

19,141

48,960%

I3-pre

21,577

23,242

22,418

50,500%

N1-1

21,823

23,058

22,553

59,090%

N2-1

22,708

24,443

23,818

64,010%

N3-1

22,016

23,606

22,878

54,210%

H1-1

13,157

14,192

13,745

56,850%

H2-1

26,144

27,727

26,919

48,961%

H3-1

19,817

21,667

20,757

50,820%

O1-1

18,242

20,229

19,279

52,211%

O2-1

13,157

15,053

14,473

69,440%

O3-1

19,817

24,147

23,563

59,390%

I1-1

21,577

23,947

23,270

45,390%

I2-1

21,823

23,345

22,602

44,050%

I3-1

22,708

14,478

13,710

41,850%

N1-2

22,708

21,226

20,476

46,780%

N2-2

22,016

19,562

18,768

39,870%

N3-3

13,157

14,361

13,644

40,430%

H1-2

19,817

22,832

22,390

64,830%

H2-2

18,242

23,068

22,687

69,440%

H3-2

13,157

14,476

13,962

61,030%

O1-2

21,577

20,938

20,417

53,540%

O2-2

21,822

19,274

18,857

59,560%

O3-2

13,155

14,406

13,910

60,230%

I1-2

19,817

24,147

23,563

59,390%

I2-2

18,242

23,947

23,270

45,390%

I3-2 13,157 23,345 22,602 44,050% Ket: N: Pakan standar, H: Pakan hiperlipidemik, O: Pakan hiperlipidemik+orlistat, I: Pakan hiperlipidemik+kuning telur IgY antilipase

53 Lampiran 13 Penghitungan kadar lemak feses pada uji in vivo Kadar lemak

=

w1 – w2 w1 – w0

x

100 %

dimana w0 : bobot labu (gr) w1: bobot labu + sampel sebelum ekstraksi (gr) w2: bobot labu + residu minyak setelah ekstraksi (gr) Sampel

wo (gr)

w1(gr)

w2(gr)

Kadar lemak (%)

N1-pre

101,439

102,940

101,476

2,51%

N2-pre

105,058

106,668

105,101

2,64%

N3-pre

112,140

113,615

112,184

3,00%

H1-pre

118,706

120,160

118,790

5,82%

H2-pre

105,056

106,729

105,149

5,55%

H3 pre

101,439

102,996

101,526

5,59%

O1-pre

112,134

113,704

112,223

5,69%

O2-pre

118,701

120,222

118,774

4,85%

O3-pre

101,431

103,067

101,525

5,75%

I1-pre

105,050

106,570

105,090

2,64%

I2-pre

112,137

113,817

112,184

2,80%

I3-pre

118,703

120,535

118,758

2,98%

N1-1

101,418

103,174

101,462

2,51%

N2-1

105,039

106,995

105,091

2,64%

N3-1

112,140

113,862

112,182

2,45%

H1-1

118,706

120,270

118,746

2,51%

H2-1

112,137

113,592

112,176

2,64%

H3-1

118,703

120,087

118,735

2,35%

O1-1

101,418

103,251

101,504

4,69%

O2-1

105,039

106,323

105,163

9,61%

O3-1

112,140

113,223

112,203

5,84%

I1-1

118,706

120,099

118,768

4,44%

I2-1

105,058

106,400

105,101

3,19%

I3-1

112,140

113,630

112,208

4,56%

N1-2

118,706

120,009

118,738

2,51%

N2-2

105,056

106,449

105,093

2,64%

N3-3

101,439

102,843

101,474

2,45%

H1-2

112,329

113,618

112,366

2,84%

H2-2

121,439

122,653

121,476

2,98%

H3-2

123,443

125,386

123,497

2,75%

O1-2

123,735

125,058

123,798

4,76%

O2-2

118,706

120,030

118,780

5,55%

O3-2

105,058

106,645

105,137

4,95%

I1-2

112,140

113,738

112,198

3,65%

I2-2

101,439

102,932

101,504

4,35%

I3-2 121,330 122,679 121,378 3,54% Ket: N: Pakan standar, H: Pakan hiperlipidemik, O: Pakan hiperlipidemik+orlistat, I: Pakan hiperlipidemik+kuning telur IgY antilipase

54

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 29 November 1987 dari ayah Dr. Simson Tarigan dan ibu dr. Kartini Sembiring. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Negeri 4 Bogor dan diterima di Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Tahun 2009 penulis meraih gelar Sarjana Kedokteran Hewan (S.KH) dan pada tahun 2011 penulis menyelesaikan Program Pendidikan Dokter Hewan. Tahun 2011 penulis diterima di Program Studi Ilmu-Ilmu Faal dan Khasiat Obat, Sekolah Pascasarjana IPB dengan pembiayaan dari Beasiswa Unggulan DIKTI.