PERANCANGAN PEPTIDA SIKLIS SEBAGAI INHIBITOR POTENSIAL UNTUK ENZIM NS3-NS2B PROTEASE VIRUS DENGUE SECARA IN SILICO MELALUI MOLECULAR DOCKING

PERANCANGAN PEPTIDA SIKLIS SEBAGAI INHIBITOR POTENSIAL UNTUK ENZIM NS3-NS2B PROTEASE VIRUS DENGUE SECARA IN SILICO MELALUI MOLECULAR DOCKING

SAMIRA 0305030573

UNIVERSITAS INDONESIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM DEPARTEMEN KIMIA DEPOK

2009

Perencanaan peptida..., Samira, FMIPA UI, 2009

PERANCANGAN PEPTIDA SIKLIS SEBAGAI INHIBITOR POTENSIAL UNTUK ENZIM NS3-NS2B PROTEASE VIRUS DENGUE SECARA IN SILICO MELALUI MOLECULAR DOCKING Skripsi diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

SAMIRA 0305030573

UNIVERSITAS INDONESIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM DEPARTEMEN KIMIA DEPOK

2009


SKRIPSI

: PERANCANGAN PEPTIDA SIKLIS SEBAGAI INHIBITOR POTENSIAL UNTUK ENZIM NS3-NS2B PROTEASE VIRUS DENGUE SECARA IN SILICO MELALUI MOLECULAR DOCKING

NAMA

: SAMIRA

NPM

: 0305030573

SKRIPSI INI TELAH DIPERIKSA DAN DISETUJUI DEPOK, 7 JULI 2009

PROF. DR. USMAN SUMO FRIEND TAMBUNAN, M.Sc PEMBIMBING

Tanggal lulus ujian sarjana : ........................................................................................... Penguji I

: Prof. Dr. Soleh Kosela,.M.Sc...............................................................

Penguji II

: Dra. Sri Handayani,.M.Biomed............................................................

Penguji III

: Dr. Amarila Malik, Apt,.M.Si.............................................................



KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kepada kehadirat Allah SWT yang senantiasa memberikan berkah dan kenikmatan dalam kehidupan penulis. Alhamdulillah berkat rahmat dan karuniaNya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi sebagai syarat menempuh ujian akhir Sarjana di Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia. Penulis mempersembahkan karya ini untuk keluarga, terutama mama dan aba atas ketulusan, kesabaran, dan kasih sayang yang luar biasa indah sehingga mengantarkan penulis sampai pada jenjang ini. Juga kepada adikadik tersayang Usama, Fatma, dan Abdu. Sungguh kalian menjadi inspirasi utama dan pembangkit semangat penulis. Semoga apa yang telah penulis lakukan dapat memberikan kebanggaan bagi keluarga. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Usman Sumo F.T., M.Sc selaku pembimbing yang telah membimbing penulis dengan penuh kesabaran, kebapakan, dan perhatian. Terima kasih atas kepercayaan yang diberikan.

Terima kasih telah menjadi dosen, bapak, dan partner yang

membuka lebih luas cakrawala penulis mengenai hidup. Pada kesempatan ini pula, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesarnya kepada: 1. Dr. Ridla Bakri selaku Ketua Departemen Kimia FMIPA UI

i


2. Ir. Widyastuti Samadi, M.Si selaku Koordinator Pendidikan sekaligus Pembimbing Akademik penulis yang selalu menebarkan aura bahagia 3. Dra. Tresye Utari, M.Si selaku Koordinator Penelitian 4. Prof. Dr. Sumi Hudoyono, PWS selaku Kepala KBI Biokimia 5. Seluruh dosen departemen kimia yang telah mentransfer ilmunya, Bu Widajanti Wibowo, Bu Siswati, Pak Riwandi, Bu Endang, Pak Badjri, Pak Sholeh, Bu Yani, Pak Jar, dan semua yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Semoga senantiasa mendapat rahmat dan keberkahan dariNya 6. Teman-teman seperjuangan dan seruangan, Ramdhan, Danang, dan terutama Ronggo yang telah bersama-sama menghempas kerikil selama penelitian 7. Teman-teman penelitian terutama Lusi, Dita, Melina, Lu’lu, Purnama, dan Lila, juga Yusni, Farouq, Santi, Alti, Norma, Ana, Lumita, Rilian, Mutia, Alex, Cicil, Destya, Nuhi, Ria 8. Sahabat-sahabat terbaik, Shabrina, Sepit, Gayatri, Anggi, Meta, Camel, Syarif, Hani, Elly, Agung 9. Catherine Farmasi 2005 dan Sutarto Fisika 2003 untuk diskusidiskusinya serta Emil untuk software HyperChem Pro-nya 10. Teman-teman hebat Kimia 2005, 2006, 2007, 2004, 2003, 2002, Kimia Terapan 2006, dan 2007

ii


11. Ka Irwan yang baik hati, mba Fitri, mba Ina, mba Cucu, mba Indri, mba Ati, mba Ema, mba Tri, mas Hadi, pak Marji, babe Tris, pak Kiri atas segala kebaikannya 12. Teman-teman HMDK 2007, BEM FMIPA 2008, MICEL+2008, Tossaka3rd, dan Dancesport UI atas segala kenangan indahnya 13. Seluruh pihak yang membantu penulis dalam penyelesaian skripsi. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan masyarakat. Amin.

Penulis

2009

iii


ABSTRAK

Demam berdarah, penyakit yang disebabkan oleh infeksi virus dengue, telah menjadi masalah kesehatan yang utama di negara tropis dan subtropis. Hingga saat ini belum tersedia vaksin atau pengobatan yang efektif. Pada penelitian ini dilakukan studi in silico untuk merancang ligan peptida siklis yang dapat berperan sebagai inhibitor potensial untuk enzim NS3-NS2B protease virus dengue sehingga diharapkan dapat menghambat replikasi virus tersebut dalam tubuh. Struktur tiga dimensi enzim diperoleh dari Protein Data Bank. Analisis terhadap binding site dan sekuens asam amino substrat pada sisi pemotongan enzim menghasilkan tujuh buah rancangan ligan siklopentapeptida yang disiklisasi melalui ikatan disulfida sistein lalu dimodelkan ke dalam bentuk tiga dimensi. Optimasi geometri dan minimasi energi dilakukan untuk menghilangkan bad contact. Analisis kekuatan afinitas ligan terhadap enzim melalui molecular docking menunjukkan bahwa ketujuh ligan tersebut memiliki afinitas dan potensi inhibisi yang lebih baik dari ligan standar Bz-Nle-K-R-R-H. Hasil terbaik ditunjukkan oleh ligan KRK dengan energi ikatan -8,39 kkal/mol dan Ki 0,707 μM. Analisis interaksi kompleks enzim-ligan menunjukkan bahwa terdapat 16 contact residu dan sembilan residu asam amino enzim yang membentuk ikatan hidrogen dengan ligan serta terjadi kesesuaian konformasi ligan terhadap binding site enzim.

iv


Kata kunci: inhibitor, molecular docking, NS3-NS2B protease, peptida, virus dengue Xiii + 108 hlm; gbr 15.; lamp 11.; tab 7 Bibliografi: 38 (1983-2009)

v


DAFTAR ISI

Halaman KATA PENGANTAR.................................................................................... i ABSTRAK.................................................................................................... iv DAFTAR ISI................................................................................................. vi DAFTAR GAMBAR...................................................................................... x DAFTAR TABEL........................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN................................................................................... xiii BAB I.

PENDAHULUAN........................................................................... 1 1.1 Latar Belakang....................................................................... 1 1.2 Tujuan ................................................................................... 4

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA................................................................... 5 2.1 Demam Berdarah................................................................... 5 2.2 Virus Dengue ......................................................................... 6 2.2.1 Pemetaan Genom Virus ………………………………………. 7 2.2.2 Daur Hidup Virus Dengue..................................................... 9 2.3 Enzim..................................................................................... 10 2.4 Inhibitor Enzim....................................................................... 13 2.5 Protease................................................................................. 14 2.5.1NS3 Protease......................................................................... 15 2.5.2Mekanisme Proteolisis........................................................... 16 2.6 Drug Design........................................................................... 18

vi


2.6.1Pengertian............................................................................. 18 2.6.2Peptida Dalam Drug Design.................................................. 19 2.7 Bioinformatika........................................................................ 20 2.7.1Definisi dan Ruang Lingkup................................................... 20 2.7.2Database............................................................................... 21 2.7.3Protein Data Bank................................................................. 22 2.8 Molecular Modelling............................................................... 23 2.9 Molecular Docking................................................................. 25 BAB III. METODE PENELITIAN................................................................. 29 3.1 Pencarian Data PDB Struktur Tiga Dimensi Enzim NS3 Protease Virus Dengue.......................................................... 29 3.2 Visualisasi Sisi Aktif dan Binding Site Enzim NS3-NS2B Protease................................................................................ 29 3.2.1Sisi Aktif dan Kofaktor Enzim................................................ 29 3.2.2Binding Site Enzim................................................................. 30 3.3 Penentuan Sekuens Asam Amino Peptida sebagai Inhibitor.. 30 3.4 Perancangan Struktur Tiga Dimensi Peptida Siklis Sebagai Ligan.................................................................................... 30 3.5 Optimasi Geometri dan Minimisasi Energi Struktur Tiga Dimensi Peptida Siklis dan Enzim NS3-NS2B Protease................... 31 3.6 Penentuan Nilai Log P dan Berat Molekul Peptida Siklis....... 32 3.7 Docking.................................................................................. 32 3.8 Analisis Docking..................................................................... 33

vii


3.8.1Penentuan Konformasi Kompleks Protein-Ligan Hasil Docking.............................................................................. 33

BAB IV.

3.8.2Energi Ikatan dan Konstanta Inhibisi (Ki).............................

33

3.8.3Ikatan Hidrogen....................................................................

33

3.8.4Contact Residu....................................................................

34

3.8.5Konformasi Ligan Terhadap Binding Site............................

34

HASIL DAN PEMBAHASAN...................................................... 35 4.1 Pencarian Data PDB Struktur Tiga Dimensi Enzim NS3 Protease Virus Dengue.......................................................... 35 4.2 Visualisasi Sisi Aktif dan Binding Site Enzim NS3-NS2B Protease............................................................................. 36 4.2.1Sisi Aktif dan Kofaktor Enzim.............................................. 36 4.2.2Binding Site Enzim.............................................................. 37 4.3 Penentuan Sekuens Asam Amino Peptida sebagai Inhibitor.. 39 4.4 Perancangan Struktur Tiga Dimensi Peptida Siklis Sebagai Ligan................................................................................... 41 4.5 Optimasi Geometri dan Minimisasi Energi Struktur Tiga Dimensi Peptida Siklis dan Enzim NS3-NS2B Protease.................. 42 4.6 Penentuan Nilai Log P dan Berat Molekul Peptida Siklis....... 43 4.7 Docking................................................................................... 45 4.8 Analisis Docking...................................................................... 46 4.8.1Penentuan Konformasi Kompleks Protein-Ligan Hasil Docking................................................................................ 46

viii


4.8.2Energi Ikatan dan Konstanta Inhibisi (Ki)............................ 46 4.8.3Ikatan Hidrogen................................................................... 49 4.8.4Contact Residu.................................................................... 52 4.8.5Konformasi Ligan Terhadap Binding Site........................... 55 BAB V.

KESIMPULAN DAN SARAN........................................................ 59 5.1 Kesimpulan............................................................................ 59 5.2 Saran...................................................................................... 60

DAFTAR PUSTAKA..................................................................................... 61 LAMPIRAN................................................................................................... 65

ix


DAFTAR GAMBAR

Gambar 1.

Daerah dengan risiko infeksi virus dengue........................... 2

Gambar 2.

Partikel virus dengue............................................................ 6

Gambar 3.

Pemetaan genome dari virus dengue..................................

Gambar 4.

Skema replikasi virus dengue............................................... 10

Gambar 5.

Skema perbandingan energi bebas reaksi tanpa dan dengan

8

enzim...................................................................................

12

Gambar 6.

Skema persamaan reaksi inhibitor reversible......................

14

Gambar 7.

NS3 protease dengan kofaktor NS2B..................................

15

Gambar 8 . Mekanisme proteolisis NS3 protease................................... 16 Gambar 9.

Molecular docking antara ligan dan protein.........................

26

Gambar 10. Visualisasi permukaan enzim NS3 protease berdasarkan spektrum potensial elektrostatiknya.....................................

37

Gambar 11. Rancangan peptida siklis.....................................................

40

Gambar 12. Residu asam amino enzim NS3-NS2B protease yang membentuk ikatan hidrogen dengan ligan KRK.................... 51 Gambar 13. Contact residu asam amino enzim NS3-NS2B protease terhadap ligan standar dan ligan KRK................................... 53 Gambar 14. Konformasi ligan standar (hijau) dan ligan KRK (jingga) pada binding site enzim NS3-NS2B protease................................ 55

x


Gambar 15. Orientasi dan konformasi ligan KRK terhadap binding site enzim NS3-NS2B protease............................................................. 56

xi


DAFTAR TABEL

Tabel 1.

Kelebihan dan kekurangan peptida sebagai drug................

20

Tabel 2.

Sisi pemotongan sekuens asam amino substrat oleh NS3-NS2B protease................................................................................ 38

Tabel 3.

Nilai log P dan berat molekul peptida siklis........................... 43

Tabel 4.

Energi hasil docking.............................................................. 47

Tabel 5.

Energi hasil docking.............................................................. 47

Tabel 6.

Residu asam amino enzim NS3-NS2B protease yang membentuk ikatan hidrogen dengan ligan standar dan KRK.. 50

Tabel 7.

Residu asam amino enzim NS3-NS2B protease yang berinteraksi dengan ligan standar dan KRK........................ 52

xii


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Data Fisikokimia Residu Asam Amino Sisi Aktif NS3 Protease...............................................................................

63

Lampiran 2. Posisi Sisi Aktif dan kofaktor NS3 Protease......................... 64 Lampiran 3. Struktur Asam Amino Arginin dan Lisin................................ 65 Lampiran 4. Daftar Official Codes Dua Puluh Asam Amino.....................

66

Lampiran 5. Struktur dua dimensi ligan standar Bz-Nle-K-R-R-H............

67

Lampiran 6. Struktur tiga dimensi ligan hasil optimasi geometri dan minimisasi energi.................................................................. 68 Lampiran 7. Struktur enzim NS3-NS2B hasil optimasi geometri dan minimisasi energi.................................................................

70

Lampiran 8. Clustering histogram hasil docking…………………………..

71

Lampiran 9. Data energi hasil docking…………………………………….

82

Lampiran 10. Bagan kerja penelitian…...................................................... 105 Lampiran 11. Hubungan antara nilai RMSD dengan perbandingan struktur................................................................................ 106

xiii


BAB I PENDAHULUAN 1.1

Latar Belakang

Penyakit yang disebabkan oleh infeksi virus dengue telah menjadi masalah kesehatan yang utama di dunia, terutama di Asia, Afrika, dan Amerika. Infeksi ini telah menjadi endemik di lebih dari 100 negara. World Health Organization memperkirakan terjadi 100 juta kasus tiap tahun dan sebanyak 2,5 miliar orang atau 40% dari populasi dunia berisiko terjangkit infeksi virus ini (Monath, et al., 1994). Penyebaran virus dengue meningkat secara signifikan dalam beberapa tahun terakhir karena terjadinya ekspansi vektor nyamuk Aedes aegypti mulai dari Asia Tenggara hingga ke Pasifik Barat dan Amerika (Melino, et al., 2007). Epidemi infeksi virus dengue juga disebabkan oleh banyaknya arus migrasi yang terjadi ke daerah endemik, ledakan populasi dan kurang sadarnya masyarakat akan kebersihan lingkungan (www.ivi.org, 2 Februari 2009, 17.15 WIB). Selama kurun waktu 1985-2004, jumlah kasus infeksi virus dengue di Indonesia menempati urutan kedua terbesar di dunia setelah Thailand (www.who.intr/, di akses 31 Januari 2009, 22.10 WIB). Penyakit infeksi virus dengue memiliki tiga jenis tingkatan mulai dari demam ringan yang dikenal dengan dengue fever (DF), demam disertai trombositopenia dan pendarahan yang biasa dikenal dengan demam

1


2

berdarah/dengue haemorrhagic fever (DHF) hingga gejala demam yang disertai shock atau dengue shock syndrome (DSS) yang sering berujung pada kematian (Rico-Hesse, et al., 2003).

Gambar 1. Daerah dengan risiko infeksi virus dengue Sumber : http://gamapserver.who.int/mapLibrary/

Virus dengue termasuk ke dalam genus Flavivirus dan famili Flaviviridae yang merupakan virus RNA berantai tunggal dengan strand positif (http://athena.bioc.uvic.ca, diakses 1 Juni 2009, 20.00 WIB). Virus ini memiliki empat serotype yaitu DEN1, DEN2, DEN3, dan DEN4 sehingga seseorang bisa terinfeksi lebih dari satu kali (Lindenbach, 2001). Menurut teori antibody-dependent enhancement (ADE), infeksi sekunder virus dengan serotype yang berbeda dengan infeksi primer, dapat meningkatkan


3

patogenesitas

atau

tingkat

keparahan

penyakit

terhadap

pasien

(Raekiansyah, et al., 2004). Pengobatan yang efektif terhadap infeksi virus dengue belum tersedia walaupun beberapa kandidat vaksin baik monovalen maupun tetravalen yang berasal dari virus yang dilemahkan sedang dikembangkan di beberapa institusi seperti National Institute of Health dan Universitas Mahidol (WHO, 2006). Pengobatan yang dilakukan saat ini hanya untuk mengurangi gejala sakit dan mengurangi risiko kematian (Suroso & Umar 1999). Oleh karena itu, dibutuhkan suatu pengobatan yang bersifat antiviral. Dewasa ini perkembangan ilmu virulogi dan biologi molekuler telah memberikan informasi mengenai mekanisme molekuler dari daur replikasi virus dengue. Setiap tahapannya, mulai dari infeksi sel inang hingga perakitan partikel virus baru, dapat menjadi target dalam pengembangan molekul inhibitor (drug design) yang dapat menghambat aktivitas enzimenzim yang berperan vital dalam replikasi virus dengue seperti enzim protease, RdRP, metiltransferase dan helikase (Kirsten, 2008). Sebelumnya para peneliti melakukan eksperimen in vitro secara trialand-error melalui screening bahan-bahan alami untuk menemukan molekul yang dapat berperan sebagai inhibitor. Namun cara seperti ini dinilai kurang efisien karena menghabiskan banyak waktu dan tenaga. Kini dengan teknik komputasi, pengembangan molekul inhibitor dapat dilakukan secara in silico (computer-aided drug design) sehingga pengujian eksperimental secara in vitro menjadi lebih rasional dan efisien (Kirsten, 2008).


4

Salah satu metode yang dapat digunakan adalah molecular docking yang dapat memprediksikan orientasi ikatan antara kandidat inhibitor (drug) dengan enzim target sehingga dapat diketahui afinitas dari rancangan inhibitor tersebut. Untuk melakukan molecular docking, hal utama yang dibutuhkan adalah struktur tiga dimensi dari inhibitor dan enzim target yang dapat diperoleh dari database maupun melalui teknik molecular modelling (Lucientes, 2004). Akhir-akhir ini molekul peptida telah dikembangkan dalam drug design karena walaupun memiliki kestabilan yang rendah, peptida memiliki aktivitas dan spesifitas yang tinggi, toksisitas yang rendah serta relatif tidak terakumulasi dalam tubuh (Sehgal, 2006).

1.2

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk merancang peptida siklis yang dapat berperan sebagai inhibitor potensial bagi enzim NS3-NS2B protease virus dengue melalui studi in silico dengan metode molecular docking.


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Demam Berdarah

Penyakit demam berdarah atau dengue haemorrhagic fever (DHF) adalah penyakit infeksi akut yang ditemukan di daerah tropis dan subtropis. Penyakit ini disebabkan oleh infeksi virus dengue yang penyebarannya ditularkan melalui gigitan nyamuk Aedes aegypti, A. albopictus, A. polynesiensis dan beberapa spesies A. scuttellarisa. Di Indonesia, penularannya adalah melalui nyamuk betina A. aegypti dan A. albopictus (Purnami, et.al. 2005). Kedua jenis nyamuk ini hidup dalam keadaan yang panas dan lembab dan terdapat hampir di seluruh daerah di Indonesia, kecuali di tempat-tempat dengan ketinggian lebih dari 1000 meter di atas permukaan laut (Wahono et al. 2004; www.cdc.gov, diakses 2 Juni 2009, 15.10 WIB). Demam berdarah telah berkembang sejak lama di dunia, pertama kali dikenali pada tahun 1779 di Kairo. Wabah demam berdarah dengue di Indonesia yang menyebabkan banyak kematian terjadi untuk pertama kalinya pada tahun 1968 di kota Jakarta dan Surabaya, akan tetapi konfirmasi virologisnya baru didapatkan pada tahun 1972. Sejak saat itu penyakit ini menyebar ke berbagai daerah, sehingga sampai tahun 1980 penyebarannya

5


6

mencakup seluruh propinsi di Indonesia kecuali Timor-Timur dan menimbulkan kejadian luar biasa (KLB) (Suroso 1983).

2.2

Virus Dengue

Virus dengue termasuk ke dalam genus Flavivirus dan famili Flaviviridae yang merupakan virus RNA berantai tunggal dengan strand positif. Bentuk morfologinya adalah bola dengan diameter 40-60 nm (http://athena.bioc.uvic.ca, di akses 1 Juni 2009, 20.00 WIB).

Gambar 2. Partikel virus dengue Sumber: http://www.rapidmicrobiology.com/news/

Virus dengue memiliki empat serotype yang dilabeli dengan DEN1, DEN2, DEN3, dan DEN4 yang klasifikasinya didasarkan pada jenis antibodi yang dihasilkan di dalam tubuh manusia setelah terinfeksi. Keempat


7

serotype ini memiliki morfologi dan genom yang sama tetapi menunjukkan antigen yang berbeda sehingga seseorang bisa terinfeksi virus ini lebih dari satu kali karena tidak adanya proteksi silang yang lengkap (Lindenbach, 2001).

2.2.1 Pemetaan Genom Virus

Genom RNA virus dengue merupakan satu untaian open reading frame (ORF) yang mengandung 10.723 nukleotida dan mengkode satu poliprotein yang tediri dari 3.391 residu asam amino yang terbagi atas tiga protein sruktural C, prM, dan E serta tujuh protein nonstruktural NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, dan NS5 (Irie et al., 1989). Pada ujung-ujung ORF terdapat kode 5’UTR dan 3’UTR yang berperan penting dalam proses inisiasi dan regulasi pada proses translasi, transkripsi dan replikasi virus (Chiu, et al., 2005). Tidak seperti mRNA selular, pada ujung 3’ RNA virus dengue tidak ditemui adanya poly-adenilate (poly-A) tail. Virion virus terdiri dari protein E (envelope) yang berperan dalam penempelan virus ke reseptor inang, dan protein prM (premembran) yang merupakan glikoprotein struktural. Sedangkan protein C (capsid) membentuk struktur ikosahedral dan mengikat genom RNA virus (Melino, et al., 2007). Ketujuh protein nonstruktural memiliki peran vital dalam siklus replikasi virus. Glikoprotein NS1 terbentuk di permukaan sel inang saat infeksi dan berperan dalam replikasi RNA virus, sedangkan NS2A, NS4A, dan NS4B


8

merupakan protein hidrofobik yang membantu proses replikasi di retikulum endoplasma (RE). Sintesis RNA virus dibantu oleh enzim RNA-dependent RNA polymerase yang terdapat pada protein NS5. Pemotongan unit-unit fungsional dari untaian poliprotein hasil translasi dikatalisis oleh enzim serin protease yang terdapat pada protein NS3 yang pada prosesnya dibantu oleh NS2B sebagai kofaktor (www.pdb.org/moleculeofthemonth/Denguevirus/, 29 Januari 2009, 16.30 WIB).

Gambar 3. Pemetaan genome dari virus dengue Sumber: Melino, et al., 2007


9

2.2.2 Daur Hidup Virus Dengue

Siklus normal infeksi virus dengue umumnya adalah manusia-nyamukmanusia. Virus dengue bertransmisi melalui kelenjar saliva nyamuk Aedes aegypti betina ketika nyamuk ini menghisap darah manusia yang telah terinfeksi virus dengue. Virus dengue kemudian menjalani replikasi dalam tubuh nyamuk dalam masa inkubasi 8 – 10 hari. Lalu setelah bereplikasi, dapat menginfeksikan dirinya lagi ke manusia lain melalui antikoagulan yang terdapat dalam saliva nyamuk ketika menghisap darah manusia tersebut (Melino, et al., 2007). Proses infeksi virus dimulai ketika terjadi interaksi antara protein E virus dengan reseptor permukaan sel inang. Interaksi ini menyebabkan terjadinya perubahan konformasi struktur virus sehingga memicu masuknya materi genetik RNA ke dalam sel inang. Karena termasuk strand positif, maka RNA virus dapat langsung mengalami translasi dan mensintesis polipeptida pendek. Translasi ini kemudian dilanjutkan di RE sehingga menghasilkan satu untaian poliprotein yang akan diproses menjadi unit-unit protein fungsional bagi virus. Pemotongan pada sisi NS1-NS2A langsung terjadi setelah poliprotein terbentuk oleh protease yang belum teridentifikasi yang terdapat pada RE. Selanjutnya terjadi pemotongan pada konjugasi CprM, prM-E, E-NS1, dan NS4A-NS4B oleh enzim peptidase RE inang, dan pemotongan pada NS2A-NS2B, NS2B-NS3, NS3-NS4A, dan NS4B-NS5 oleh enzim protease virus (Melino, et al., 2007).


10

RNA virus mengalami replikasi dan mensintesis RNA negatif yang kemudian menjadi template untuk sintesis RNA positif virus. RNA hasil replikasi ini lalu berasosiasi dengan protein C hasil translasi membentuk virion immature di permukaan RE. Virion lalu bergerak menuju badan golgi untuk maturasi sehingga membentuk virion yang fungsional dalam jumlah banyak dan menyebabkan sel inang lisis (Melino, et al., 2007).

Gambar 4. Skema replikasi virus dengue Sumber: Karin dan Franz, 2006

2.3 Enzim

Enzim merupakan makromolekul yang dapat mempercepat reaksi kimia tanpa ikut bereaksi. Karena di sintesis di dalam sel makhluk hidup,


11

enzim disebut juga biokatalisator. Di luar molekul katalitik RNA, semua enzim adalah protein yang sebagian besar berbentuk globular dengan berat molekul sekitar 12.000 hingga satu juta g/mol. Dalam aktivitas katalitiknya, beberapa enzim membutuhkan komponen tambahan yang disebut kofaktor. Kofaktor ini dapat berupa ion anorganik seperti Mg2+, Fe2+, dan Zn2+ atau berupa molekul organik (Lehninger, 2004). Enzim diklasifikasikan dalam enam kelompok, yaitu oksireduktase, transferase, hidrolase, liase, isomerase, dan ligase. Tiap enzim memiliki sisi aktif dan sisi ikatan yang berbeda. Pada permukaan sisi aktif terdapat residu asam amino yang dapat berikatan dengan substrat sehingga enzim memiliki sifat selektif dan spesifik. Emil Fischer (1894) merumuskan bahwa sisi aktif enzim merupakan komplementer dari substratnya seperti gembok dan kuncinya yang dikenal dengan teori lock and key. Reaksi enzimatik secara sederhana dapat dituliskan sebagai berikut:

E+S

ES

EP

E+P

dimana E, S, dan P adalah enzim, substrat, dan produk sedangkan ES dan EP adalah keadaan transisi kompleks enzim dengan substrat dan produk (Lehninger, 2004). Terdapat beberapa cara kerja enzim untuk menurunkan energi bebasnya, antara lain: •

Menurunkan energi aktivasi dengan menciptakan keadaan yang dapat

menstabilkan keadaan transisi enzim-substrat


12

•

Mengurangi energi keadaan transisi tanpa mengubah konformasi

substrat dengan cara mendistribusikan muatan •

Memberikan mekanisme reaksi alternatif

•

Mengurangi perubahan entropi yang terjadi dengan cara

menempatkan substrat pada orientasi yang tepat (Fersht, 1985) Dengan adanya enzim, energi yang dibutuhkan untuk mencapai keadaan transisi menjadi lebih kecil sehingga reaksi berlangsung lebih cepat.

Gambar 5. Skema perbandingan energi bebas reaksi tanpa dan dengan enzim Sumber : Lehninger, 2004

Kerja enzim dipengaruhi antara lain oleh pH, temperatur, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim serta inhibitor.


13

Struktur dan fungsi enzim dipengaruhi oleh interaksi nonkovalen yang terdiri atas ikatan hidrogen, ikatan ionik, interaksi van der Waals, dan interaksi hidrofobik. Walaupun masing-masing interaksi tersebut bersifat lemah namun akumulasi dari keempat jenis interaksi lemah ini memberikan kontribusi yang signifikan terhadap kestabilan struktur tiga dimensi dan aktivitas katalitik enzim (Lehninger, 2004).

2.4

Inhibitor Enzim

Inhibitor enzim adalah molekul yang dapat menganggu sifat katalitik enzim atau menurunkan/menghilangkan aktivitas katalitiknya. Berdasarkan sifatnya, inhibitor enzim terbagi menjadi inhibitor reversible dan irreversible. 1.

Inhibitor reversible Inhibitor reversible berikatan dengan enzim melalui interaksi

nonkovalen seperti ikatan hidrogen, ikatan ionik dan interaksi hidrofobik. Inhibitor ini membentuk kompleks EI (inhibitor-enzim) tetapi tidak mengalami katalisis sehingga dapat menurunkan efisiensi aktivitas enzim. Ada tiga jenis inhibitor reversible, yaitu: ¾

Inhibitor kompetitif (Gambar 6a)

¾

Inhibitor nonkompetitif (Gambar 6b)

¾

Inhibitor campuran (Gambar 6c)


14

(c)

(a)

(b)

Gambar 6. Skema persamaan reaksi inhibitor reversible Sumber : Lehninger, 2004

2.

Inhibitor irreversible Inhibitor ini dapat membentuk ikatan kovalen dengan enzim atau

merusak residu gugus fungsional yang vital bagi aktivitas enzim sehingga enzim menjadi inaktif. Reaksi yang terjadi dapat berupa ikatan antara gugus nukleofilik enzim, seperti hidroksil dan sulfhidril pada residu serin, sistein, threonin atau tirosin, dengan gugus elektrofilik inhibitor (Lundblad, R. L., 2004).

2.5

Protease

Protease merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan kovalen peptida sehingga menghasilkan ujung N dan C yang bebas. Protease disebut juga proteinase atau peptidase. Menurut gugus fungsional pada sisi aktifnya, protease terbagi menjadi empat kelompok, yaitu serin


15

protease, sistein protease, aspartat protease, dan metallo protease (http://www.oswego.edu/, 2 Juni 2009, 14.40 WIB).

2.5.1 NS3 Protease

NS3 protease pada virus dengue termasuk dalam famili serin protease yang terdiri dari 184 residu asam amino pada terminal N. Studi terhadap sekuens virus menunjukkan bahwa sisi aktif NS3 protease terdiri atas tiga asam amino fungsional yaitu His51, Asp75, dan Ser135. Aktivitas katalitik NS3 protease dibantu oleh kofaktor NS2B. Konjugasi NS3-NS2B berperan dalam pemotongan prekursor poliprotein pada NS2A⁄ NS2B, NS2B⁄ NS3, NS3⁄NS4A, dan NS4B⁄NS5, serta pada sisi pemotongan internal protein C, NS2A, NS3, dan NS4A (Brinkworth, 1999).

NS2B

Gambar 7. NS3 protease dengan kofaktor NS2B Sumber : Melino, et al., 2007


16

2.5.2 Mekanisme Proteolisis

Mekanisme proteolisis NS3 protease menuruti mekanisme serin protease yang menggunakan gugus serin untuk menghidrolisis ikatan peptida substrat. Mekanisme serin protease terdiri atas dua langkah, yakni serangan nukleofilik gugus hidroksil serin dan serangan nukleofilik molekul air. Kedua langkah ini diaktivasi oleh basa yang berasal dari gugus imidazol histidin (Bruce, et al., 2002).

Gambar 8 . Mekanisme proteolisis NS3 protease Sumber : http://www.oswego.edu/


17

Dari Gambar 8, pada tahap (a) pasangan elektron bebas pada atom N gugus imidazol histidin mengabstraksi atom hidrogen pada gugus hidroksil serin sehingga serin menjadi nukleofil kuat dan dapat menyerang atom C karbonil substrat. Gugus imidazol histidin yang telah terprotonasi lalu distabilkan oleh aspartat (Asp75). Pada (b) terbentuk keadaan transisi tetrahedral serta gugus N substrat yang terprotonasi oleh histidin sehingga ikatan dengan C karbonil terlepas dan menghasilkan keadaan transisi asil (c). Histidin kemudian berperan lagi sebagai basa yang membuat molekul air menjadi nukleofil dan menyebabkan gugus OH- dari air bereaksi dengan residu C karbonil sehingga terbentuk suatu keadaan transisi tetrahedral. Pada tahap (d) histidin kembali berperan sebagai asam yang memprotonasi gugus hidroksil serin sehingga terjadi transfer elektron dan menghasilkan produk hasil pemecahan substrat dan enzim kembali ke bentuk bebasnya (e) (Alberts, et al., 2002). NS3 protease mengenali substratnya pada residu yang bersifat basa yang terletak di posisi P1 dan P2 (Jun Li, et al., 2005). Merujuk pada metode Schecter dan Berger, huruf P digunakan untuk menandai substrat sedangkan huruf S digunakan untuk menandai subsite pada protease yang berinteraksi dengan substrat tersebut. Posisi P1, P2,..., Pn menunjukkan residu substrat pada N terminal setelah sisi pemotongan enzim sedangkan P1’, P2’,...,Pn’ menunjukkan residu pada C terminal setelah sisi pemotongan enzim. Secara berurutan keduanya bereaksi dengan subsite S1, S2,...,Sn dan S1’, S2’,...,S3’


18

pada protease (Sutarto, 2008). Sisi pemotongan ikatan peptida terletak diantara P1-P1’. Agar dapat bereaksi dan terjadi interaksi enzim-substrat, harus ada kesesuaian antara bentuk, ukuran dan interaksi yang terjadi antara binding pocket sisi aktif enzim dengan rantai samping substrat. Misalnya pada chymotrypsin yang memiliki binding pocket yang hanya dapat berinteraksi dengan gugus hidrofobik rantai samping substrat (James, et al., 1980). Inhibisi terhadap enzim NS3 protease dapat menyebabkan terhambatnya aktivitas enzimatiknya sehingga poliprotein yang terbentuk dari translasi RNA menjadi tidak dapat dipotong-potong dan poliprotein tetap berada dalam bentuk satu untai panjang yang utuh. Akibatnya proteinprotein lain yang vital bagi keberlangsungan replikasi virus dengue tidak dapat terbentuk.

2.6

Drug Design

2.6.1 Pengertian

Drug design adalah suatu metode perancangan obat (drug) yang didasarkan pada analisis biologis dan fisik dari targetnya. Targetnya merupakan molekul-molekul atau bagian dari makromolekul yang berperan vital dalam proses metabolik dari kondisi patologis seseorang akibat penyakit yang disebabkan oleh mikroba patogen. Umumnya drug ini dirancang untuk menginhibisi atau menghentikan aktivitas makromolekul tersebut dengan


19

cara membentuk ikatan terhadap sisi aktif dari molekul-molekul tersebut sehingga molekul drug berperan sebagai inhibitor. Hal yang harus dipertimbangkan dalam merancang inhibitor sebagai drug, antara lain adalah spesifisitas dan potensi inhibisinya. Spesifitas dan potensi inhibisi yang tinggi akan mengurangi efek samping dan tingkat toksisitasnya (Gubernator K, 1998). Perancangan drug dapat dilakukan secara komputasional atau in silico. Sebelum teknologi informasi berkembang pesat, metode yang digunakan untuk menemukan inhibitor yang tepat adalah dengan melakukan screening berbagai komponen lalu mengujikannya ke enzim target secara trial-and-error. Tetapi kini, dengan mengetahui sisi aktif dan struktur tiga dimensi enzim target, secara in silico dapat diprediksikan molekul yang dapat berperan sebagai inhibitor sehingga proses screening dan pengujian secara eksperimental menjadi lebih rasional dan efisien. Metode yang dapat digunakan antara lain mencakup molecular modeling, molecular mechanics, molecular dynamics, ab initio quantum chemistry, dan density functional theory (Scapin, 2006).

2.6.2 Peptida Dalam Drug Design

Peptida merupakan gabungan beberapa asam amino (2 - 50 residu) yang terbentuk secara kovalen melalui ikatan amida (ikatan peptida). Ikatan peptida ini terjadi akibat reaksi kondensasi hilangnya molekul air yang


20

berasal dari gugus karboksil satu asam amino dan gugus amino asam amino lain (Lehninger, 2004). Akhir-akhir ini peptida telah dikembangkan dalam drug design. Peptida dapat disintesis melalui metode rekombinan atau modifikasi senyawa dari produk alami. Walaupun molekul peptida memiliki kestabilan yang rendah tetapi peptida lebih disukai karena peptida memiliki aktivitas dan spesifitas yang tinggi.

Tabel 1. Kelebihan dan kekurangan peptida sebagai drug Kelebihan

Kekurangan

aktivitas tinggi

kurang stabil

spesifisitas tinggi cenderung tidak terakumulasi dalam tubuh

mudah terdegradasi oleh protease proses sintesis membutuhkan biaya yang tinggi

toksisitas rendah

bioavailabilitas oral rendah

efisiensi tinggi

harus disintesis dalam jumlah besar

tidak ada drug-drug interaction Sumber : (Sehgal, 2006)

2.7

Bioinformatika

2.7.1 Definisi dan Ruang Lingkup

Bioinformatika dapat didefinisikan sebagai aplikasi dari alat komputasi dan analisis untuk menangkap dan menginterpretasikan data-data biologi.


21

Ilmu ini merupakan ilmu baru yang merangkup berbagai disiplin ilmu termasuk ilmu komputer, matematika, fisika , biologi dan ilmu kedokteran yang kesemuanya saling menunjang dan saling bermanfaat satu sama lainnya (Utama, 2003). Bioinformatika menjadi penting karena perkembangan teknologi informasi dan peningkatan ilmu komputer, khususnya pada bidang biologi molekuler, menjadikan bioinformatika sebagai ilmu yang membuka sudut pandang baru dalam menyelesaikan persoalan biologi molekuler (Baxevanis dan Ouellette, 2005). Kemajuan bioinformatika sangat berperan dalam kemajuan bidang ilmu virulogi. Dalam hal pengklasifikasian virus misalnya, sebelumnya peneliti harus melihat morfologi virus secara akurat dengan menggunakan mikroskop elektron yang sangat mahal. Selain itu, peneliti juga harus mengisolasi dan mendapatkan virus itu sendiri. Tetapi kini dengan kemajuan bioinformatika, teknik isolasi dan sekuensing DNA/RNA, identifikasi berbagai virus dapat dilakukan dengan cara membandingkan genom virus dengan database seperti Genbank, EMBL (European Molecular Biology Laboratory) dan DDBJ (DNA Data Bank of Japan) (Utama, 2003).

2.7.2 Database

Database adalah kumpulan data yang diatur sedemikian rupa untuk memudahkan penggunanya. Pada database bioinformatika, data yang diatur


22

merupakan data sekuen DNA atau protein yang didapat melalui percobaan laboratorium yang biasanya disimpan dalam file komputer. Setiap file dari suatu sekuen berisi informasi mengenai asal organisme, nama sekuen, dan juga nomor akses yang digunakan untuk mengidentifikasi sekuen tersebut (Mount, 2004). Dalam analisis bioinformatika, keberadaan database merupakan syarat utama. Database DNA yang utama adalah GenBank di Amerika Serikat, sedangkan database untuk protein dapat ditemukan di SWISS-PROT, Protein Information Resource (PIR) dan Protein Data Bank (PDB) (Baxevanis dan Ouellette, 2005).

2.7.3 Protein Data Bank

Database struktural menyimpan data mengenai struktur protein. Sumber primer untuk data struktur protein adalah Protein Data Bank (PDB) yang tersedia pada URL http://www.pdb.org/ . Ini adalah arsip data struktural tunggal tingkat dunia yang dibuat oleh Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RSCB), di Universitas New Jersey di Rutgers (Westhead, et al., 2001). Mesin pencarian yang terspesialisasi disediakan oleh grup database struktur makromolekul pada institut bioinformatika eropa (EBI) dengan alamat http://msd.ebi.ac.uk dan juga oleh kolaborasi riset untuk bioinformatika struktural (RCSB) dengan alamat http://www.rcsb.org/pdb. Kedua alat ini


23

dapat digunakan untuk mengambil data struktur pada format PDB (Westhead, et al., 2001). PDB merupakan data yang berisi koleksi struktur tiga dimensi protein, DNA dan molekul kompleks lainnya yang telah dipublikasikan dan ditentukan secara eksperimen dengan menggunakan X-ray crystallography atau NMR spectroscopy. Pada X-ray crystallography, sinar-X dipancarkan kepada kristal yang mengandung jutaan salinan suatu molekul. Sinar-X kemudian akan didifraksikan oleh kristal dan membentuk suatu pola yang bila dianalisis secara matematis akan menunjukkan posisi tiap atom dalam molekul. NMR spectroscopy menggunakan molekul dalam larutan dan akan memperlihatkan orientasi atom dalam medan magnetik (Baxevanis dan Ouellette, 2005). Format PDB merupakan format yang dapat dimengerti baik oleh komputer maupun manusia (machine-human-readable), dimana di dalam format ini ditampilkan informasi tentang sumber, sekuens, struktur sekunder dan juga koordinat tiga dimensi protein (Baxevanis dan Ouellette, 2005).

2.8

Molecular Modelling

Molecular modelling merupakan suatu metode untuk merancang dan menganalisis struktur dan sifat-sifat molekul tertentu dengan mengunakan teknik kimia komputasional dan teknik visualisasi grafis yang bertujuan untuk menyediakan struktur geometri tiga dimensi yang sesuai dengan parameter kondisi yang telah ditentukan. Molecular modelling merupakan gabungan


24

dari data empiris dan teknik komputasional untuk menirukan dan memodelkan perilaku molekul sehingga dapat digunakan untuk mempelajari sistem molekular tertentu (Leach, 2001). Salah satu aspek penting dalam molecular modelling adalah mekanika molekular yang menggunakan prinsip mekanika Newtonian untuk menjelaskan karakter fisika dari suatu model. Mekanika molekular mengabaikan gerak elektron sehingga sistem yang sebelumnya merupakan sistem kuantum menjadi sistem klasik sehingga sistem menjadi lebih sederhana. Sistem ini memodelkan atom-atom sebagai bola yang terhubung satu sama lain oleh pegas. Dengan demikian energi total (disebut force field) molekul dapat ditentukan oleh hukum Hooke yang secara umum dinyatakan sebagai:

ET = Estr + Ebend + Etor + Eoop + Evdw + Eelec

dimana ET adalah energi total molekul, Estr adalah energi bond streching, Ebend energi angle bending, Etor energi torsional, Eoop energi out-of-plane, Evdw energi van der Waals dan Eelec adalah energi elektrostatik (Sutarto, 2008). Energi total molekul berhubungan dengan energi internal sistem atau energi potensial. Molekul berada dalam keadaan atau konformasi paling stabil ketika energi potensialnya mencapai nilai paling minimum. Keadaan ini mempengaruhi karakter molekul dalam peranannya pada proses kimia dan


25

biologi. Dalam molecular modelling, energi potensial molekul dapat di minimisasi dengan menggunakan teknik minimisasi energi seperti steepest descent dan conjugate gradient (Leach, 2001). Parameter-parameter yang berhubungan dengan energi total molekul disebut juga sebagai force field. Terdapat beberapa macam force field yang penggunaannya disesuaikan dengan molekulnya, seperti MM+ untuk molekul organik dan AMBER untuk peptida, protein dan DNA (Hypercube Inc., 2002).

2.9

Molecular Docking

Molecular docking merupakan suatu teknik yang digunakan untuk mempelajari interaksi yang terjadi dari suatu kompleks molekul. Molecular docking dapat memprediksikan orientasi dari suatu molekul ke molekul yang lain ketika berikatan membentuk kompleks yang stabil. Terdapat dua aspek penting dalam molecular docking, yaitu fungsi scoring dan penggunaan algoritma (Funkhouser, 2007). Fungsi scoring dapat memperkirakan afinitas ikatan antara makromolekul dengan ligan (molekul kecil yang memiliki afinitas terhadap makromolekul). Identifikasi ini didasarkan pada beberapa teori seperti teori energi bebas Gibbs. Nilai energi bebas Gibbs yang kecil menunjukkan bahwa konformasi yang terbentuk adalah stabil, sedangkan nilai energi bebas Gibbs yang besar menunjukkan tidak stabilnya kompleks yang


26

terbentuk. Sedangkan penggunaan algoritma berperan dalam penentuan konformasi (docking pose) yang paling stabil (favourable) dari pembentukan kompleks (Funkhouser, 2007).

Ligan

Protein

Kompleks

Gambar 9. Molecular docking antara ligan dan protein Sumber : Taufer, et al., 2004

Berdasarkan interaksi yang terjadi, terdapat beberapa jenis molecular docking, yaitu: 1.

Docking protein-protein

2.

Docking ligan-protein

3.

Docking ligan-DNA

Saat ini molecular docking banyak diaplikasikan di dalam drug design untuk memprediksikan orientasi ikatan antara kandidat molekul drug dengan protein target sehingga dapat diketahui afinitas dari molekul drug tersebut.


27

Untuk melakukan molecular docking, hal pertama yang dibutuhkan adalah struktur tiga dimensi dari ligan (drug) dan protein target. Struktur tiga dimensi ligan dapat dimodelkan dengan menggunakan teknik molecular modelling sedangkan struktur tiga dimensi protein target dapat ditentukan secara empiris dengan menggunakan teknik NMR spectroscopy dan X-ray crytallography yang terdapat pada database Protein Data Bank dan secara in silico dengan teknik homology modelling (Lucientes, 2004). Ada beberapa software untuk molecular docking, antara lain: -

AutoDock (http://www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock/)

-

FlexX (http://www.biosolveit.de/FlexX/)

-

Dock (http://www.cmpharm.ucsf.edu/kuntz/dock.html)

-

Gold (http://www.ccdc.cam.ac.uk/products/life_sciences/gold/)

Software Autodock adalah yang paling direkomendasikan karena banyak digunakan oleh peneliti dan dipublikasikan di jurnal-jurnal internasional (Meiler, 2009).


BAB III METODE PENELITIAN

3.1

Pencarian Data PDB Struktur Tiga Dimensi Enzim NS3-NS2B Protease Virus Dengue

Data PDB struktur tiga dimensi enzim NS3-NS2B protease virus dengue dapat di unduh dari database PDB yang ada di Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank melalui alamat situs http://www.rcsb.org/pdb/ dengan menggunakan perangkat komputer yang terhubung dengan internet. Sistem operasi yang digunakan adalah Microsoft Windows XP dengan browser Mozilla Firefox 2.0.

3.2

Visualisasi Sisi Aktif dan Binding Site Enzim NS3-NS2B Protease

3.2.1 Sisi Aktif dan Kofaktor Enzim

Struktur tiga dimensi enzim divisualisasikan dengan software PyMol Viewer untuk melihat lokasi sisi aktif dan kofaktornya. Input yang dimasukkan adalah data PDB enzim NS3-NS2B protease dalam format .pdb.

29


30

3.2.2 Binding Site Enzim

Permukaan enzim divisualisasikan dengan menggunakan software ViewerLite 4.0 untuk melihat bentuk binding site enzim. Visualisasi didasarkan pada spektrum potensial elektrostatiknya.

3.3

Penentuan Sekuens Asam Amino Peptida sebagai Inhibitor

Penentuan sekuens asam amino peptida didasarkan pada sekuens asam amino substrat alami enzim NS3-NS2B protease dan hasil analisis binding site sisi aktif enzim. Peptida dirancang dalam bentuk siklis melalui ikatan disulfida dari asam amino sistein. Dalam penelitian ini digunakan peptida dengan sekuens asam amino Bz-Nle-K-R-R-H sebagai standar.

3.4

Perancangan Struktur Tiga Dimensi Peptida Siklis Sebagai Ligan

Sekuens asam amino peptida siklis yang telah dirancang lalu dimodelkan ke dalam struktur tiga dimensi. Pemodelan ini dilakukan dengan menggunakan software HyperChem Pro 8.0. Struktur peptida siklis tersebut dibuat dalam bentuk zwitter ionnya.


31

3.5

Optimasi Geometri dan Minimisasi Energi Struktur Tiga Dimensi Peptida Siklis dan Enzim NS3-NS2B Protease

Optimasi geometri dan minimisasi energi struktur tiga dimensi peptida siklis dilakukan menggunakan software HyperChem Pro 8.0 yang dijalankan pada single computer Intel Pentium Dual Core. Algoritma yang digunakan adalah conjugate gradient Polak-Ribiere dengan batas maksimum konvergensi gradien RMS 0,01 kcal/Å mol dan parameter molecular mechanics force field AMBER2. Proses optimasi geometri dan minimasi energi struktur tiga dimensi enzim NS3-NS2B protease sama seperti pada peptida siklis. Namun algoritma dan batas konvergensi yang digunakan berbeda. Proses ini dilakukan melalui dua tahap, pertama dengan menggunakan algoritma steepest descent dengan batas maksimum konvergensi gradien RMS 0,1 kcal/Å mol dan jumlah step sebanyak 1000 cycles. Kemudian dilanjutkan dengan algoritma conjugate gradient Polak-Ribiere dengan batas maksimum konvergensi gradien RMS 0,1 kcal/Å mol. Dengan algoritma yang kedua ini, proses dilakukan hingga sistem mencapai konvergensi. Parameter molecular mechanics force field yang digunakan adalah AMBER2 dan file input dalam format .pdb.


32

3.6

Penentuan Nilai Log P dan Berat Molekul Peptida Siklis

Nilai log P dan berat molekul struktur tiga dimensi peptida siklis ditentukan dengan menggunakan fitur QSAR Properties yang terdapat pada software HyperChem Pro 8.0..

3.7

Docking

Proses docking diawali dengan preparasi file docking yang dilakukan dengan menggunakan program AutoDock Tools yang terdapat dalam software AutoDock 4.0. Baik molekul peptida siklis (untuk kemudian disebut ligan) maupun enzim, kepada keduanya ditambahkan hidrogen polar dan muatan Gasteiger sedangkan hidrogen nonpolarnya di merge. File ligan dan enzim disimpan dalam format .pdbqt untuk kemudian digunakan dalam preparasi parameter grid. Dimensi grid box yang digunakan adalah 60 x 60 x 60 dengan grid spacing 0,375 Ǻ. Kalkulasi docking dijalankan dengan parameter algoritma Lamarckian Genetic Algorithm (LGA) dengan ukuran populasi 150, evaluasi energi sebanyak 10 juta dan pengulangan (search runs) sebanyak 100 kali dengan batas standar deviasi (RMSD) sebesar 1,5 Ǻ. Parameter ini disimpan dalam format .gpf dan .dpf sebagai file yang akan digunakan untuk menjalankan proses docking. Proses docking dijalankan dengan menggunakan software AutoDock 4.0.


33

3.8

Analisis Docking

3.8.1 Penentuan Konformasi Kompleks Enzim-Ligan Hasil Docking

Hasil kalkulasi docking dilihat pada output dalam format notepad. Penentuan konformasi protein-ligan hasil docking dilakukan dengan memilih konformasi ligan yang memiliki energi ikatan yang paling rendah dari kelompok (cluster) dengan jumlah populasi terbesar dengan batas standar deviasi 1,5 Å.

3.8.2 Energi Ikatan dan Konstanta Inhibisi (Ki)

Energi ikatan dan konstanta inhibisi hasil docking dilihat pada output dalam format notepad. Kompleks enzim-ligan yang dipilih adalah kompleks yang memiliki nilai energi ikatan dan konstanta inhibisi terkecil untuk kemudian dilakukan analisis lebih lanjut.

3.8.3 Ikatan Hidrogen

Ikatan hidrogen yang terjadi pada kompleks enzim-ligan terbaik hasil docking diidentifikasi dengan menggunakan software ViewerLite 4.0 dengan file input dalam format .pdb.


34

3.8.4 Contact Residu

Contact residu kompleks enzim-ligan hasil docking diidentifikasi dengan menggunakan software UCSF Chimera dan kemudian dilakukan visualisasi dengan menggunakan software ViewerLite 4.0.

3.8.5 Konformasi Ligan Terhadap Binding Site

Visualisasi konformasi ligan terhadap binding site enzim dilakukan dengan menggunakan software ViewerLite 4.0. Visualisasi permukaan enzim didasarkan pada spektrum potensial elektrostatiknya.


35

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pencarian Data PDB Struktur Tiga Dimensi Enzim NS3-NS2B Protease Virus Dengue

Pencarian struktur tiga dimensi enzim NS3 protease virus dengue dilakukan pada database Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank yang dapat diakses bebas melalui internet dengan alamat http://www.rcsb.org/pdb/. Database ini berisi data dalam format PDB yang sesuai sebagai input dalam tahap molecular docking. Untuk mendapatkan data PDB, dibutuhkan kode PDB dari enzim tersebut. Pencarian kode PDB enzim dilakukan dengan memasukkan kata kunci yang terkait dengan enzim NS3-NS2B protease virus dengue pada kolom search tampilan awal website. Hasilnya didapatkan empat struktur enzim dengan kode PDB 1BEF, 1DF9, 2QID dan 2FOM. Kode yang dipilih adalah 2FOM karena struktur tiga dimensi enzim NS3 protease dari kode 2FOM ini berasosiasi dengan kofaktor NS2B sedangkan tiga kode lainnya tidak. Jika struktur NS3 protease tidak berasosiasi dengan kofaktornya, dikhawatirkan akan berpengaruh terhadap konformasi atau folding akhir enzim sehingga mempengaruhi aktivitas katalitik enzim serta hasil dari molecular docking. Data PDB dari 2FOM menyebutkan bahwa struktur tiga dimensi kristal enzim


36

ini ditentukan dengan metode X-ray crystallography dan dipublikasikan pada tahun 2006. Enzim yang dikristalkan berasal dari virus dengue dengan serotype DEN2.

4.2 Visualisasi Sisi Aktif dan Binding Site Enzim NS3-NS2B Protease 4.2.1 Sisi Aktif dan Kofaktor Enzim

Struktur tiga dimensi enzim dengan kode 2FOM kemudian divisualisasikan dengan software PyMol Viewer untuk melihat lokasi sisi aktif dan kofaktornya. Studi terhadap sekuens virus dengue menunjukkan bahwa sisi aktif enzim NS3-NS2B protease terdiri atas tiga asam amino fungsional yaitu His51, Asp75, dan Ser135 (Brinkworth, 1999). Ketiga residu asam amino ini sama-sama bersifat polar dan hidrofilik (Lampiran 1). Dari hasil visualisasi terlihat bahwa residu sisi aktif terletak di permukaaan enzim dan berada relatif jauh dari kofaktor (Lampiran 2). Dalam struktur tersier protein atau enzim, residu asam amino yang bersifat hidrofilik terdapat di bagian eksterior (permukaan) sedangkan residu hidrofobik umumnya terdapat di bagian interior protein (Lehninger, 2004). Lokasi sisi aktif yang relatif jauh dari kofaktor mengindikasikan bahwa kofaktor NS2B tidak berperan langsung terhadap reaksi katalitik enzim seperti yang terjadi pada kofaktor logam, yang umumnya berada pada sisi aktif enzim dan ikut serta membentuk ikatan dengan substrat. Walaupun mekanisme molekular peran NS2B terhadap aktivitas katalitik enzim belum


37

diketahui secara pasti, namun studi terhadap kinetika reaksi enzimatis NS3 protease menunjukkan bahwa kehadiran kofaktor NS2B berperan penting terhadap aktivitas katalitik enzim (Melino, 2007). Berdasarkan letaknya, kofaktor NS2B mungkin berperan untuk menginduksi konformasi aktif dari enzim NS3 protease.

4.2.2 Binding Site Enzim

Visualisasi permukaan enzim dilakukan dengan menggunakan software ViewerLite 4.0. untuk melihat kecenderungan dan bentuk binding site sisi aktif enzim. Warna permukaan pada gambar menunjukkan kecenderungan potensial elektrostatik dari residu asam amino enzim.

Gambar 10. Visualisasi permukaan enzim NS3 protease berdasarkan spektrum potensial elektrostatiknya


38

Residu netral pada Gambar 10 ditunjukkan dengan warna putih, residu bermuatan positif berwarna biru dan residu bermuatan negatif berwarna merah. Hasil visualisasi menunjukkan bahwa enzim memiliki binding site yang spesifik di daerah sisi aktifnya (lingkaran kuning). Binding site di sekitar Asp75 dan Ser135 bermuatan negatif sehingga lebih menyukai residu substrat yang memiliki gugus positif. Daerah di dekat residu Asp75 dan Ser135 juga memiliki binding pocket spesifik yang memliki bentuk seperti celah yang relatif sempit, dalam, dan bermuatan negatif (ditunjukkan dengan kotak biru) sehingga bentuk ini sesuai untuk rantai samping substrat yang memiliki rantai cukup panjang dan bermuatan positif seperti arginin dan lisin (Lampiran 3). Hal tersebut sesuai dengan sisi pemotongan sekuens asam amino substrat oleh NS3-NS2B protease serotype DEN2 yang dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Sisi pemotongan sekuens asam amino substrat oleh NS3-NS2B protease DEN2

Protein C

NS2A/NS2B

NS2B/NS3

NS3/NS4A

NS4B/NS5

Urutan

97-104

1342-1349

1472-1479

2090-2097

2488-2495

Sekuens

RRRR|SAGV

SKKR|SWPL

KKQR|AGVL

AGRK|SLTL

NTRR|GTGN

Sumber : Melino, et al., 2007


39

Sisi pemotongan ditandai oleh simbol | dan residu P1 substrat ditandai dengan huruf tebal. Dari tabel di atas terlihat bahwa P1 substrat merupakan asam amino dengan gugus positif yaitu arginin (R) dan lisin (K).

4.3 Penentuan Sekuens Asam Amino Peptida sebagai Inhibitor

Penentuan sekuens asam amino peptida didasarkan pada hasil analisis sekuens asam amino substrat alami enzim NS3 protease dan binding pocket sisi aktifnya, yakni residu yang cocok untuk P1 adalah asam amino arginin dan lisin. Sedangkan untuk P2, residu yang lebih disukai secara berurutan adalah Arg > Thr > Gln/Asn/Lys dan untuk P3 adalah Lys > Arg > Asn (Jun Li, et al., 2005). Oleh karena itu sekuens peptida yang akan dirancang merupakan kombinasi dari asam amino tersebut. Kekurangan utama peptida adalah kestabilannya yang rendah, dan untuk meningkatkan kestabilannya maka dilakukan siklisasi melalui pembentukan ikatan disulfida. Siklisasi tidak dilakukan dengan membentuk ikatan peptida pada ujung-ujung C dan N terminal karena siklisasi dengan ikatan disulfida memberikan kestabilan yang lebih baik. Siklisasi melalui ikatan disulfida dapat meningkatkan interaksi hidrofobik peptida dan mengurangi interaksi hidrogen dengan pelarut (air) sehingga meningkatkan total entropi dan kestabilan peptida. Peptida juga dapat terdegradasi oleh enzim-enzim protease yang ada pada tubuh. Oleh sebab itu jumlah sekuens dalam rancangan peptida


40

sebagai inhibitor ini dibuat seminimal mungkin namun tidak terlalu sterik ketika disiklisasi. Binghe et al (2005) menyatakan bahwa peptida siklis dengan ukuran kecil akan lebih stabil dan tahan terhadap aktivitas enzimatik dari cairan lumen di perut dan duodenum sedangkan peptida lurus dengan ukuran besar akan mengalami proteolisis. Berdasarkan pertimbangan-pertimbangan di atas, maka didapat rancangan sekuens siklopentapeptida yang terdiri dari dua sistein dan tiga asam amino lain sebagai berikut:

Gambar 11. Rancangan peptida siklis

Huruf-huruf pada sekuens di atas mewakili residu asam amino dengan ketentuan R untuk arginin, K untuk lisin, G untuk glisin, T untuk threonin, dan C untuk sistein (Lampiran 4). Ikatan disulfida yang terbentuk dari dua sistein terminal dinotasikan dengan -S—S-. Urutan sekuens dimulai dari gugus N terminal ke gugus C terminal, dari kiri ke kanan. Untuk selanjutnya,


41

penyebutan peptida siklis hanya pada tiga asam amino selain sistein, misalnya KRR, GRR dan seterusnya. Dalam penelitian ini digunakan peptida dengan sekuens asam amino Bz-Nle-K-R-R-H sebagai standar (Zheng Yin, 2005). Peptida standar ini akan mendapatkan perlakuan yang sama seperti pada peptida siklis. Struktur dua dimensi ligan ini dapat dilihat pada Lampiran 5.

4.4 Perancangan Struktur Tiga Dimensi Peptida Siklis Sebagai Ligan

Perancangan struktur tiga dimensi peptida siklis dilakukan dengan menggunakan software HyperChem Pro 8.0. Perancangan ini dilakukan untuk mempersiapkan struktur tiga dimensi peptida siklis sebagai ligan yang akan digunakan dalam molecular docking. Peptida dimodelkan dalam bentuk zwitter ion. Pemodelan zwitter ion tidak hanya dilakukan terhadap N dan C terminal tetapi juga gugus-gugus pada rantai samping peptida. Hal ini dikarenakan di dalam darah dan jaringan lain dalam tubuh serta pada pH fisiologis (7,4), gugus karboksilat asam amino akan terdeprotonasi membentuk R-COO- sedangkan gugus aminonya terprotonasi membentuk –NH3+ (Murray, et al., 2003). Selain itu pemodelan zwitter ion juga bertujuan agar gugus-gugus peptida dapat berinteraksi dengan residu asam amino dari enzim yang terdeprotonasi atau terprotonasi.


42

4.5 Optimasi Geometri dan Minimisasi Energi Struktur Tiga Dimensi Peptida Siklis dan Enzim NS3-NS2B Protease

Proses optimasi geometri dan minimisasi energi dilakukan dengan menggunakan software HyperChem Pro 8.0. Sebelum proses dijalankan, ada beberapa parameter yang harus dipilih antara lain force field, algoritma dan batas konvergensi. Proses dilakukan menggunakan sistem mekanika molekular dengan force field AMBER yang sesuai untuk peptida, protein dan DNA. Penggunaan dua macam algoritma pada optimasi dan minimisasi energi struktur tiga dimensi enzim bertujuan agar proses berjalan lebih cepat dan efisien karena enzim NS3-NS2B protease merupakan makromolekul dengan jumlah atom besar. Walaupun struktur tiga dimensi enzim didapatkan dari Protein Data Bank, harus tetap dilakukan optimasi dan minimisasi energi karena proses kristalisasi enzim atau protein lain untuk penentuan struktur tiga dimensi dalam Protein Data Bank dilakukan dalam kondisi vakum sehingga hasil pencitraan kristal oleh X-ray crystallography adalah ketika protein ditempatkan dalam kondisi vakum yang menyebabkan terjadinya pergeseran-pergeseran panjang dan sudut ikatan pada struktur tiga dimensinya. Hasil optimasi geometri dan minimisasi energi dapat dilihat pada Lampiran 6 dan Lampiran 7. Dengan dilakukannya proses ini diharapkan dapat menghilangkan bad contact dari struktur, yaitu interaksi yang bersifat


43

tidak rasional yang muncul pada sistem molekular dengan mengacu pada keadaan riil suatu sistem tertentu sehingga akan didapatkan geometri struktur yang sesuai atau mendekati keadaan yang sebenarnya di alam. Proses ini menggunakan persamaan matematis untuk menentukan kombinasi terbaik dari panjang ikatan, sudut ikatan serta sudut dihedral yang menghasilkan energi terendah. Hal ini memungkinkan struktur geometri peptida siklis mencapai keadaan sistem dengan energi yang paling minimum sehingga didapatkan konformasi struktur yang paling stabil.

4.6 Penentuan Nilai Log P dan Berat Molekul Peptida Siklis

Menurut Lipinsky’s Rule of Five rancangan drug yang baik antara lain memiliki berat molekul sekitar 500 g/mol serta memiliki nilai log P antara -0,4 hingga +5,6. Nilai log P merupakan koefisien partisi yang dirumuskan sebagai rasio konsentrasi suatu molekul dalam oktanol dan air. Estimasi nilai log P peptida siklis dilakukan dengan software HyperChem Pro 8.0 pada menu QSAR Properties.

Tabel 3. Nilai log P dan berat molekul peptida siklis No

Ligan

Mr (g/mol)

log P

1

ligan KRR

665,85

-0,54

2

ligan GRR

593,72

-0,4

3

ligan RGR

593,72

-0,4


44

Tabel 3 (lanjutan)

4

ligan RTR

637,77

-0,24

5

ligan TRR

637,77

-0,24

6

ligan KRK

637,84

-0,73

7

ligan RRK

665,85

-0,54

8

ligan standar

662,86

-2,07

Nilai log P ini berhubungan dengan hidrofobisitas molekul drug. Semakin besar nilai log P, semakin hidrofobik molekul tersebut. Dari Tabel 3 terlihat bahwa rancangan peptida siklis memiliki nilai log P yang negatif (antara -0,73 dan -0,24) yang menandakan bahwa peptida tersebut bersifat cukup hidrofilik sehingga sesuai dengan binding site enzim yang juga bersifat hidrofilik. Dalam transportasinya di dalam tubuh, peptida siklis sebagai molekul drug ini tidak boleh terlalu hidrofobik karena dapat tertahan di lapisan lipid bilayer tersebut. Molekul drug yang terlalu hidrofobik cenderung memiliki toksisitas yang lebih besar karena akan tertahan lebih lama dan terdistribusi lebih luas di dalam tubuh sehingga selektifitas ikatan terhadap enzim target menjadi berkurang. Nilai log P yang terlalu negatif juga tidak disarankan karena jika peptida terlalu hidrofilik maka tidak dapat melewati lapisan lipid bilayer.


45

4.7 Docking

Jenis docking yang dilakukan dalam penelitian ini adalah semi fleksibel sehingga derajat torsional ligan dibuat fleksibel sedangkan enzimnya dibuat rigid karena jika keduanya dibuat fleksibel, proses docking dapat memakan waktu berbulan-bulan untuk satu perhitungan dengan processor komputer Pentium 4. Proses docking dimulai dengan menjalankan program AutoGrid4 yang telah terintegrasi dalam software AutoDock 4.0 dengan memasukkan parameter grid yang telah disimpan sebagai input. Parameter grid berfungsi sebagai perintah terhadap program AutoGrid4 mengenai bagian enzim yang menjadi reseptor ligan saat docking, lokasi yang akan masuk dalam perhitungan serta peta elektrosatik masing-masing atom dari ligan. Dimensi grid box yang digunakan harus cukup besar agar ligan dapat berotasi secara bebas. Hasil yang didapat dari AutoGrid4 berupa MAP file yang berfungsi sebagai supporting file untuk menjalankan docking. Penggunaan algoritma Lamarckian Genetic Algorithm (LGA) dalam docking lebih direkomendasikan karena merupakan hibridisasi dari algoritma Local Search dan Genetic Algorithm. Nilai evaluasi energi dan search runs yang dipakai berpengaruh terhadap lamanya durasi docking dan nilai energi hasil docking. Jumlah search runs merupakan banyaknya pengulangan atau replikasi docking yang dilakukan. Pada penelitian ini dilakukan 100 kali pengulangan sehingga diharapkan dapat meningkatkan tingkat kepercayaan terhadap hasil docking.


46

4.8 Analisis Docking 4.8.1 Penentuan Konformasi Kompleks Enzim-Ligan Hasil Docking

Penentuan konformasi enzim-ligan hasil docking dilakukan dengan memilih konformasi ligan yang memiliki energi ikatan yang paling rendah dari kelompok (cluster) dengan jumlah populasi terbesar dengan batas standar deviasi 1,5 Å. Hasil kalkulasi docking dapat dilihat dalam format notepad. Dari data clustering histogram, didapatkan bahwa semua rancangan ligan memiliki konformasi yang terkonvergensi, artinya dari 100 kali pengulangan docking yang dilakukan, terdapat pengulangan konformasi kompleks terhadap binding site sehingga konformasi ini dianggap yang lebih disukai (favourable). Akan tetapi hal ini tidak terjadi pada ligan standar. Hal ini dapat disebabkan oleh besarnya derajat torsional ligan standar (34 buah) sehingga ligan memiliki kemungkinan konformasi yang lebih banyak dan tidak terkonvergensi pada satu binding site (Lampiran 8).

4.8.2 Energi Ikatan dan Konstanta Inhibisi (Ki)

Kestabilan dan kekuatan interaksi nonkovalen pada kompleks enzimligan dapat dilihat dari besarnya energi ikatan yang terbentuk. Energi ikatan berasal dari energi bebas yang dilepaskan saat interaksi pada kompleks enzim-ligan terbentuk. Dari hasil docking, didapatkan data-data energi sebagai berikut.


47

Tabel 4. Energi hasil docking Ligan

Standar

KRK

RGR

RTR

Energi ikatan (kkal/mol)

-6,14

-8,39

-7,35

-7,06

Konstanta inhibisi, Ki (μM)

31,54

0,707

4,12

6,66

Energi docking (kkal/mol) Energi intermolekuler (kkal/mol)

-14,33

-13,59

-10,94

-11,15

-11,63

-11,32

-10,18

-9,98

-2,7

-2,27

-0,76

-1,17

6,86

4,39

2,74

3,29

34

18

15

17

Energi internal (kkal/mol) Energi bebas torsional (kkal/mol) Jumlah derajat torsional ligan

Tabel 5. Energi hasil docking Ligan

GRR

KRR

RRK

TRR

Energi ikatan (kkal/mol)

-7,04

-7,01

-6,83

-6,15

6,96

7,32

9,83

30,9

Energi docking (kkal/mol) Energi intermolekuler (kkal/mol)

-10,81

-11,72

-11,81

-10,37

-8,51

-10,16

-8,73

-8,85

Energi internal (kkal/mol) Energi bebas torsional (kkal/mol) Jumlah derajat torsional ligan

-2,3

-1,56

-3,08

-1,52

2,74

4,12

4,12

3,29

15

20

19

16

Konstanta inhibisi, Ki (μM)

Data menunjukkan bahwa semua ligan uji memiliki nilai energi ikatan yang lebih kecil dari ligan standar. Ligan KRK memiliki energi ikatan paling


48

rendah yaitu sebesar -8,39 kkal/mol dengan perbedaan nilai yang cukup signifikan dibandingkan ligan lainnya. Hal ini mengindikasikan bahwa ikatan yang terjadi antara enzim NS3-NS2B protease dengan ligan KRK adalah yang paling kuat dan stabil. Energi ikatan ini merupakan salah satu sumber energi bebas yang digunakan oleh enzim untuk menurunkan energi aktivasi dalam reaksi katalitik. Semakin negatif nilai energi ikatan maka interaksi yang terjadi semakin kuat dan lebih disukai. Tingginya energi ikatan pada ligan standar (sebesar -6,14 kkal/mol) dapat disebabkan oleh banyaknya jumlah derajat torsional (rotatable bonds) yang dimiliki sehingga meningkatkan energi bebas torsional dan menurunkan afinitas ikatannya. Hal ini juga terlihat dari konstanta inhibisi (Ki) ligan standar yang memiliki nilai paling besar dibandingkan ligan yang lain (31,54 μM). Ki atau disebut juga konstanta disosiasi dapat memberikan gambaran mengenai afinitas antara ligan dengan enzim. Ki dirumuskan sebagai berikut: E

+

L Ki

EL =

[E] [L] [EL]

dengan E adalah enzim, L adalah ligan dan EL adalah kompleks enzim-ligan. Semakin kecil nilai Ki, maka kesetimbangan reaksi cenderung ke arah pembentukan kompleks. Kompleks enzim-ligan dikatakan memiliki afinitas ikatan yang baik jika memiliki nilai Ki pada skala mikromolar. Data hasil docking menunjukkan bahwa semua ligan memiliki estimasi nilai Ki pada


49

skala ini. Nilai Ki terkecil dimiliki oleh ligan KRK yakni mencapai 0,707 μM yang berarti ligan KRK memiliki afinitas ikatan paling besar terhadap enzim dan membentuk kompleks enzim-ligan yang paling stabil (Lampiran 9). Dari data pada Tabel 4 dan Tabel 5 diketahui bahwa hubungan antara nilai energi ikatan (∆Go) dengan Ki adalah berbanding lurus dan nilainya mengikuti persamaan termodinamik yang dirumuskan sebagai: ∆Go = - RT ln Ki Semua ligan memiliki nilai energi internal yang negatif dan relatif kecil yang menandakan bahwa konformasi ligan yang terbentuk pada kompleks enzim-ligan berada pada konformasi yang paling stabil (favourable). Untuk selanjutnya, ligan KRK akan dianalisis lebih lanjut dengan pembanding ligan standar untuk mengetahui apa yang menyebabkan ligan KRK memiliki energi ikatan dan afinitas yang lebih baik dari ligan standar.

4.8.3 Ikatan Hidrogen

Ikatan hidrogen yang terjadi pada kompleks enzim-ligan standar dan enzim-ligan KRK diidentifikasi dengan menggunakan software ViewerLite 4.0. Kriteria terjadinya ikatan hidrogen ini adalah jika jarak antara hidrogen dengan atom elektronegatif berada dalam rentang 2,5 – 3,5 Å (Bazan and Fletterick, 1989). Residu asam amino enzim yang membentuk ikatan hidrogen dengan ligan standar dan KRK dapat dilihat pada Tabel 6 dengan


50

ketentuan residu yang membentuk ikatan hidrogen ditandai dengan simbol check list (√).

Tabel 6. Residu asam amino enzim NS3-NS2B protease yang membentuk ikatan hidrogen dengan ligan standar dan KRK Residu

Ligan Standar

Ligan KRK

Ile36

√

√

His51

√

√

Val52

√

Lys73

√

√

Asp75

√

Leu128

√

Phe130

√

√

Ser131

√

√

Pro132

√

√

Asn152

√

√

(residu yang diberi huruf tebal merupakan residu sisi aktif enzim NS3-NS2B)

Ligan KRK membentuk sembilan ikatan hidrogen dengan residu asam amino enzim sedangkan ligan standar hanya membentuk delapan ikatan. Hal tersebut menjadi salah satu faktor yang menyebabkan ligan KRK memiliki energi ikatan lebih kecil (-8.39 kkal/mol) dibandingkan dengan ligan standar (-6.14 kkal/mol). Ikatan hidrogen ini memberikan kontribusi terhadap afinitas ligan terhadap enzim karena terjadinya interaksi elektrostatik antara atom


51

oksigen atau nitrogen ligan dengan atom hidrogen residu asam amino enzim atau sebaliknya.

Gambar 12. Residu asam amino enzim NS3-NS2B protease yang membentuk ikatan hidrogen dengan ligan KRK

Pada Gambar 12, ligan KRK ditunjukkan dengan stick berwarna jingga, residu enzim yang membentuk ikatan hidrogen dengan ligan ditunjukkan dengan stick abu-abu, residu sisi aktif aktif ditunjukkan dengan ball-and-stick dan ikatan hidrogen yang terbentuk ditunjukkan dengan garis putus-putus berwarna hijau. Ligan KRK membentuk ikatan hidrogen dengan residu sisi aktif enzim His51 dan Asp75 serta konformasinya menutupi binding site enzim sehingga ligan KRK diajukan dapat berperan sebagai


52

inhibitor kompetitif potensial yang dapat berikatan dengan binding site enzim dan menganggu aktivitas sisi aktif enzim NS3-NS2B protease.

4.8.4 Contact Residu

Adanya interaksi nonkovalen antara enzim dan ligan dapat meningkatkan afinitas ligan terhadap enzim. Oleh karena itu perlu diketahui residu-residu enzim yang berinteraksi dengan ligan (contact residu). Contact residu kompleks enzim-ligan hasil docking diidentifikasi dengan menggunakan software UCSF Chimera. Fitur pada software ini dapat memberikan informasi mengenai atom ligan dan residu enzim yang membentuk interaksi nonkovalen dan kemudian dilakukan visualisasi dengan menggunakan software ViewerLite 4.0.

Tabel 7. Residu asam amino enzim NS3-NS2B protease yang berinteraksi dengan ligan standar dan KRK Residu

Ligan Standar

Ligan KRK

Ile36

√

√

Trp50

√

His51

√

√

Val52

√

√

Arg54 Lys73

√ √

Lys74 Asp75

√ √

√

√


53

Tabel 7 (lanjutan) Leu128

√

√

Phe130

√

√

Ser131

√

√

Pro132

√

√

Ser135

√

√

Tyr150

√

Gly151

√

Asn152

√

√

Gly153

√

√

Val154 √ √ (residu yang diberi huruf tebal merupakan residu sisi aktif enzim NS3-NS2B)

Asp75

Asp75 His51

His51

Ser135

Tyr150

(a)

Ser135

(b)

Gambar 13. Contact residu asam amino enzim NS3-NS2B protease terhadap ligan standar (a) dan ligan KRK (b). Contact residu ditunjukkan dengan stick abu-abu dan residu sisi aktif ditunjukkan dengan balland-stick.


54

Ketiga residu sisi aktif enzim NS3-NS2B protease (His51, Asp75, dan Ser135) memiliki contact residu terhadap kedua ligan yang menandakan bahwa terjadi interaksi nonkovalen antara kedua ligan dengan sisi aktif enzim. Dari Tabel 6 diketahui bahwa residu sisi aktif Ser135 tidak membentuk ikatan hidrogen dengan kedua ligan tetapi interaksi yang terjadi (Tabel 7) dapat mempengaruhi aktivitas gugus hidroksil Ser135 yang bertindak sebagai gugus aktif reaksi katalitik NS3-NS2B protease. Selain itu, interaksi (ikatan hidrogen dan interaksi nonkovalen lain) antara kedua ligan terhadap residu His51 dan Asp75 dapat mempengaruhi proses transfer elektron pada gugus karboksil Asp75 dan atom N pada gugus imidazol His51 sehingga mengurangi kemampuan His51 untuk mengaktivasi serangan nukleofilik gugus hidroksil Ser135 terhadap gugus karbonil substrat dan berakibat pada terganggunya aktivitas katalitik sisi aktif enzim. Ligan KRK berinteraksi dengan residu Tyr150 enzim dan hal ini tidak terjadi pada ligan standar (Gambar 13). Elektron π pada gugus aromatik Tyr150 dapat berinteraksi dengan dengan rantai samping residu arginin ligan KRK yang memiliki ikatan π terkonjugasi sehingga terbentuk interaksi π-π. Dari Tabel 7 terlihat bahwa jumlah contact residu terhadap ligan KRK lebih besar (16 residu) dibandingkan dengan ligan standar (15 residu). Hal ini memberikan kontribusi terhadap lebih kecilnya energi ikatan yang terbentuk oleh ligan KRK dibandingkan dengan ligan standar. Banyaknya jumlah contact residu juga dapat meningkatkan afinitas ikatan ligan yang ditunjukkan dengan nilai Ki ligan KRK yang sangat kecil (0,707 μM).


55

4.8.5 Konformasi Ligan Terhadap Binding Site

Visualisasi konformasi ligan terhadap binding site enzim dilakukan dengan menggunakan software ViewerLite 4.0 berdasarkan spektrum potensial elektrostatiknya.

b

a

c

Gambar 14. Konformasi ligan standar (hijau) dan ligan KRK (jingga) pada binding site enzim NS3-NS2B protease

Hasil docking menunjukkan bahwa baik ligan standar maupun ligan KRK, keduanya memiliki bentuk dan konformasi struktur yang sesuai dengan binding site enzim seperti yang terlihat pada Gambar 14. Residu rantai samping kedua ligan (residu arginin dan lisin) tepat bersesuaian dengan binding pocket (a) dan (b), seperti yang telah diperkirakan sebelumnya.


56

Asp75

(b)

(d)

His51 (c) Ser135 (a)

Gambar 15. Orientasi dan konformasi ligan KRK terhadap binding site enzim NS3-NS2B protease

Kompleks enzim-ligan KRK hasil docking menunjukkan bahwa ketiga rantai samping ligan KRK bersesuaian dengan binding pocket enzim NS3NS2B protease. Rantai samping residu arginin ligan KRK yang berantai panjang dan bermuatan positif berada di binding pocket (a) yang memiliki bentuk yang sempit, curam, dan bermuatan negatif (ditunjukkan dengan warna merah pada permukaan binding pocket). Begitupun dengan residu lisin ligan KRK yang konformasinya berada di binding pocket (b) yang terletak di sekitar residu Asp75. Adanya perbedaan muatan binding site dengan rantai samping residu ligan KRK ini memungkinkan terjadinya interaksi elektrostatik antara residu binding site dengan gugus –NH3+ residu arginin


57

dan lisin ligan KRK sehingga meningkatkan afinitas interaksi dan stabilitas kompleks enzim-ligan. Tidak hanya rantai samping ligan pada binding pocket, backbone ligan KRK yang melintang di permukaan sekitar residu His51 dan Asp75 juga bersesuaian dengan binding site enzim yang berbentuk seperti pelana kuda. Hal ini secara keseluruhan menunjukkan bahwa konformasi ligan KRK bersesuaian dengan binding site enzim NS3-NS2B protease dan sesuai dengan teori lock-and-key sehingga ligan KRK dapat bertindak sebagai inhibitor potensial yang dapat menginhibisi aktivitas katalitik enzim NS3NS2B protease virus dengue dengan energi ikatan sebesar -8,39 kkal/mol dan konstanta inhibisi sebesar 0,707 μM.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1

Kesimpulan

Dari penelitian in silico ini didapatkan rancangan tujuh buah ligan peptida siklis yang terdiri dari sekuens asam amino KRR, GRR, RGR, RTR, TRR, KRK dan RRK. Penentuan sekuens asam amino didasarkan pada sekuens asam amino substrat alami pada sisi pemotongan enzim NS3-NS2B protease dan kesesuaian dengan binding site sisi aktif enzim. Siklisasi melalui pembentukan ikatan disulfida pada N dan C terminal peptida dilakukan untuk meningkatkan kestabilan peptida. Optimasi geometri dan minimasi energi bertujuan untuk menghilangkan bad contact pada struktur tiga dimensi enzim dan rancangan ligan peptida siklis. Estimasi nilai log P dengan software HyperChem Pro 8.0 dilakukan untuk mengetahui hidrofobisitas ligan peptida siklis. Estimasi nilai log P semua ligan menunjukkan nilai negatif yang berarti bahwa ligan peptida siklis bersifat cukup hidrofilik. Molecular docking bertujuan untuk memprediksikan kekuatan afinitas ligan terhadap enzim. Hasil molecular docking menunjukkan bahwa ketujuh ligan peptida siklis tersebut memiliki afinitas dan potensi inhibisi yang lebih baik daripada ligan standar Bz-Nle-K-R-R-H dengan hasil terbaik adalah

59


60

ligan KRK dengan energi ikatan -8,39 kkal/mol dan Ki 0,707 μM. Analisis terhadap interaksi kompleks enzim-ligan KRK menujukkan bahwa terdapat 16 contact residu asam amino enzim terhadap ligan KRK, sembilan residu yang membentuk ikatan hidrogen dan terdapat kesesuaian konformasi ligan KRK dengan binding site enzim NS3-NS2B protease sehingga ligan peptida siklis KRK dapat bertindak sebagai inhibitor potensial bagi enzim NS3-NS2B protease dengan afinitas yang paling baik.

5.2

Saran Perlu dilakukan simulasi molecular dynamic untuk mempelajari

pengaruh pelarut terhadap afinitas ligan peptida siklis pada binding site enzim dengan memodelkan bentuk terhidrasi kompleks enzim-ligan peptida.


61

DAFTAR PUSTAKA

Baxevanis, A.D., Oulette, B. F. F. 2001. Bioinformatics A Practical Guide to the Analysis of Genes and Protein 2nd Edition. Wiley Interscience: USA Brinkworth, R. I.; Fairlie, D. P.; Leung, D.; Young, P. R. 1999. Homology Model of the Dengue 2 Virus NS3 Protease: Putative Interactions with Both Substrate and NS2B Cofactor. J. Gen. Virol., 80, 1167–1177. Chambers, T.J., Hahn CS, Galler R & Rice CM. 1990. Flavivirus Genome Organization, Expression, and Replication. Annu. Rev. Microbiol., 44, 649–688. Chambers, T.J. & Monath, T.P. 2003. The Flaviviruses : Structure, Replication and Evolution. Elsevier Academic Press : California , USA Chiu WW, Kinney RM & Dreher TW .2005. Control of Translation by the 5and 3-Terminal Regions of the Dengue Virus Genome. J. Virol. 79, 8303–8315. Claverie, J. Michael, Notredame. 2003. Bioinformatics for Dummies. Wiley Publishing Inc:New York Fersht, Alan. 1985.. Enzyme Structure and Mechanism. San Francisco: W.H. Freeman. pp. 50–2 Funkhouser, Thomas. 2007. Lecture : Protein-Ligand Docking Methods. Princeton University


62

Gubernator K, Böhm HJ (1998). Structure-Based Ligand Design, Methods and Principles in Medicinal Chemistry. Weinheim: Wiley-VCH. Hsu JT, Wang HC, Chen GW, Shih SR. 2006. Antiviral Drug Discovery Targeting To Viral Proteases. 12(11):1301–14. Hypercube, Inc. 2002. HyperChem Release 7 for Windows. Publication HC70-00-01-00 James et al . 1980. Specificity Pocket of Chymotrypsin. J. Mol. Biol. 144:4388 Katzenmeier, Gerd. Inhibition of the NS2B-NS3 Protease – Towards A Causative Therapy for Dengue Virus Diseases. Dengue Bulletin – Vol 28, 2004 Kirsten, Guido. 2008. Concept of Pharmacophores and Their Application in Computer Aided Drug Design. ICS UNIDO Workshop.Trieste, Italy Larson, Richard S. 2006. Methods In Molecular Biology:Bioinformatics and Drug Discovery. Humana Press Inc. Totowa, New Jersey. Leach, A. R. 2001. Molecular Modelling: Principles and Applications. Lehninger. 2004. Biochemistry 4 Edition. Li J, Lim SP, Beer D, Patel V, Wen D, et al. 2005. Functional Profiling of Recombinant NS3 Proteases From All Four Serotypes of Dengue Virus Using Tetrapeptide and Octapeptide Substrate Libraries. J. Biol. Chem., 280, 28766–28774.


63

Lindenbach BD & Rice CM . 2007. Flaviviridae: The Viruses and Their Replication: In Fundamental Virology (Knipe DM & Howley PM, eds), pp. 991 1041. Lippincott Lucientes, Maria Teresa Gil. 2004. Protein Docking and Interactions Modeling Melino, Sonia & Paci, Maurizio. 2007. Progress for Dengue Virus Diseases Towards The NS2B–NS3pro Inhibition for A Therapeutic-Based Approach. FEBS Jour.,: 2986-3002 Monath, T. P., 1994. Dengue: The Risk to Developed and Developing Countries. USA 91: 2395–2400. Murray, Robert K., Daryl K. Granner, MD., Joe C. Peter A. 2003. Harper’s Illustrated Biochemistry. McGraw-Hill Companies, Inc. United States of America Othman, Rozana, et al. Docking of Noncompetitive Inhibitors into Dengue Virus Type 2 Protease: Understanding the Interactions with Allosteric Binding Sites. J. Chem. Inf. Model., 2008, 48 (8), 1582-1591 Raekiansyah, Muhareva., Sudiro, T Mirawati. 2004. Genetic Variation Among Dengue Virus that Possibly Correlate with Pathogenesis. Med. J. Ind., 13:190-4 Scapin, G. 2006. Structural Biology and Drug Discovery. Curr. Pharm. 12 (17): 2087–97. Sehgal, Anil. 2006. New Applications in Discovery, Manufacturing, and Therapeutics. Tracy Beaudoin


64

Sutarto. 2008. Analisis Mutasi Protease HIV-1 (kode DY1)dan Pengaruhnya pada Resistensi Virus Terhadap Saquinavir Menggunakan Metode Perhitungan Mekanika Kuantum dan Molecular Dynamics Simulations. Universitas Indonesia Utama, Andi. 2003. Aplikasi Bioinformatika dalam Virologi. IlmuKomputer.com Wang, Binghe., Siahaan, Teruna, Soltero, Richard. 2005. Drug Delivery: Principles and Applications. John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.Lundblad R. L. 2004. Chemical Reagents for Protein Modification. CRC Press Inc Yu Zhong, Chen. Lecture 5: Drug Design Methods Ligand-Protein Docking (Part I). National University of Singapore www.pdb.org/moleculeofthemonth/Denguevirus/, 29 Januari 2009, 16.30 WIB www.who.intr/, di akses 31 Januari 2009, 22.10 WIB www.ivi.org, 2 Februari 2009, 17.15 WIB http://athena.bioc.uvic.ca, diakses 1 Juni 2009, 20.00 WIB www.cdc.gov, diakses 2 Juni 2009, 15.10 WIB http://www.oswego.edu/, 2 Juni 2009, 14.40 WIB


65

Lampiran 1. Data Fisikokimia Residu Asam Amino Sisi Aktif NS3 Protease

His51

Asp75

Ser135

kepolaran

polar

polar

polar

muatan pada pH=7

(+)

(-)

netral

pI

7,59

2,77

5,68

hydropathy index

-3,2

-3,5

-0,8


66

Lampiran 2. Posisi Sisi Aktif dan Kofaktor NS3 Protease

Keterangan : residu sisi aktif enzim ditunjukkan dengan stick berwarna ungu sedangkan kofaktor NS2B ditunjukkan dengan pita berwarna merah


67

Lampiran 3. Struktur Asam Amino Lisin dan Arginin


68

Lampiran 4. Daftar Official Codes Dua Puluh Asam Amino

No

Nama asam amino

Kode tiga huruf

Kode satu huruf

1

Alanin

Ala

A

2

Arginin

Arg

R

3

Asparagin

Asn

N

4

Asam Aspartat

Asp

D

5

Sistein

Cys

C

6

Asam Glutamat

Glu

E

7

Glutamin

Gln

Q

8

Glisin

Gly

G

9

Histidin

His

H

10

Isoleusin

Ile

I

11

Leusin

Leu

L

12

Lisin

Lys

K

13

Metionin

Met

M

14

Fenilalanin

Phe

F

15

Prolin

Pro

P

16

Serin

Ser

S

17

Treonin

Thr

T

18

Triptofan

Trp

W

19

Tirosin

Tyr

Y

20

Valin

Val

V


69

Lampiran 5. Struktur Dua Dimensi Ligan Standar Bz-Nle-K-R-R-H


70

Lampiran 6. Struktur Tiga Dimensi Ligan Hasil Optimasi Geometri dan Minimisasi Energi


71

Lampiran 6 (lanjutan)


72

Lampiran 7. Struktur Enzim NS3-NS2B Hasil Optimasi Geometri dan Minimisasi Energi


73

Lampiran 8. Clustering Histogram Hasil Docking 8.1

Ligan Standar

____________________________________________________________________ Number of distinct conformational clusters found = 100, Using an rmsd-tolerance of 1.5 A

out of 100 runs,

CLUSTERING HISTOGRAM _______________________________________________________________________ | | | | | Clus | Lowest | Run | Mean | Num | Histogram -ter | Binding | | Binding | in | Rank | Energy | | Energy | Clus| 5 10 15 20 25 30 _____|___________|_____|___________|_____|____:____|____:____|____:____ 1 | -6.14 | 70 | -6.14 | 1 |# 2 | -5.71 | 62 | -5.71 | 1 |# 3 | -5.53 | 94 | -5.53 | 1 |# 4 | -5.50 | 95 | -5.50 | 1 |# 5 | -5.48 | 35 | -5.48 | 1 |# 6 | -5.12 | 56 | -5.12 | 1 |# 7 | -5.09 | 52 | -5.09 | 1 |# 8 | -4.94 | 60 | -4.94 | 1 |# 9 | -4.79 | 40 | -4.79 | 1 |# 10 | -4.54 | 7 | -4.54 | 1 |# 11 | -4.54 | 12 | -4.54 | 1 |# 12 | -4.53 | 99 | -4.53 | 1 |# 13 | -4.41 | 42 | -4.41 | 1 |# 14 | -4.03 | 13 | -4.03 | 1 |# 15 | -3.87 | 67 | -3.87 | 1 |# 16 | -3.79 | 74 | -3.79 | 1 |# 17 | -3.74 | 39 | -3.74 | 1 |# 18 | -3.72 | 63 | -3.72 | 1 |# 19 | -3.61 | 48 | -3.61 | 1 |# 20 | -3.59 | 75 | -3.59 | 1 |# 21 | -3.55 | 21 | -3.55 | 1 |# 22 | -3.53 | 3 | -3.53 | 1 |# 23 | -3.51 | 31 | -3.51 | 1 |# 24 | -3.47 | 92 | -3.47 | 1 |# 25 | -3.46 | 69 | -3.46 | 1 |# 26 | -3.43 | 53 | -3.43 | 1 |# 27 | -3.42 | 51 | -3.42 | 1 |# 28 | -3.42 | 17 | -3.42 | 1 |# 29 | -3.40 | 77 | -3.40 | 1 |# 30 | -3.38 | 36 | -3.38 | 1 |# 31 | -3.26 | 37 | -3.26 | 1 |# 32 | -3.11 | 88 | -3.11 | 1 |# 33 | -3.10 | 10 | -3.10 | 1 |# 34 | -3.05 | 1 | -3.05 | 1 |# 35 | -3.04 | 76 | -3.04 | 1 |# 36 | -2.97 | 24 | -2.97 | 1 |# 37 | -2.94 | 2 | -2.94 | 1 |# 38 | -2.93 | 16 | -2.93 | 1 |# 39 | -2.92 | 18 | -2.92 | 1 |# 40 | -2.90 | 83 | -2.90 | 1 |# 41 | -2.86 | 89 | -2.86 | 1 |# 42 | -2.84 | 57 | -2.84 | 1 |# 43 | -2.83 | 5 | -2.83 | 1 |# 44 | -2.80 | 11 | -2.80 | 1 |# 45 | -2.80 | 55 | -2.80 | 1 |# 46 | -2.77 | 47 | -2.77 | 1 |# 47 | -2.76 | 25 | -2.76 | 1 |# 48 | -2.73 | 54 | -2.73 | 1 |# 49 | -2.70 | 87 | -2.70 | 1 |# 50 | -2.68 | 23 | -2.68 | 1 |#


35

74

51 | -2.65 | 28 | -2.65 | 1 |# 52 | -2.63 | 84 | -2.63 | 1 |# 53 | -2.54 | 98 | -2.54 | 1 |# 54 | -2.44 | 61 | -2.44 | 1 |# 55 | -2.32 | 65 | -2.32 | 1 |# 56 | -2.31 | 20 | -2.31 | 1 |# 57 | -2.28 | 59 | -2.28 | 1 |# 58 | -2.27 | 97 | -2.27 | 1 |# 59 | -2.11 | 45 | -2.11 | 1 |# 60 | -2.01 | 72 | -2.01 | 1 |# 61 | -1.94 | 44 | -1.94 | 1 |# 62 | -1.86 | 100 | -1.86 | 1 |# 63 | -1.78 | 34 | -1.78 | 1 |# 64 | -1.77 | 19 | -1.77 | 1 |# 65 | -1.76 | 41 | -1.76 | 1 |# 66 | -1.72 | 4 | -1.72 | 1 |# 67 | -1.69 | 85 | -1.69 | 1 |# 68 | -1.62 | 26 | -1.62 | 1 |# 69 | -1.61 | 86 | -1.61 | 1 |# 70 | -1.60 | 30 | -1.60 | 1 |# 71 | -1.57 | 79 | -1.57 | 1 |# 72 | -1.50 | 73 | -1.50 | 1 |# 73 | -1.48 | 49 | -1.48 | 1 |# 74 | -1.45 | 58 | -1.45 | 1 |# 75 | -1.44 | 27 | -1.44 | 1 |# 76 | -1.43 | 50 | -1.43 | 1 |# 77 | -1.43 | 64 | -1.43 | 1 |# 78 | -1.40 | 80 | -1.40 | 1 |# 79 | -1.29 | 91 | -1.29 | 1 |# 80 | -1.20 | 22 | -1.20 | 1 |# 81 | -1.17 | 78 | -1.17 | 1 |# 82 | -1.14 | 68 | -1.14 | 1 |# 83 | -1.10 | 29 | -1.10 | 1 |# 84 | -1.09 | 66 | -1.09 | 1 |# 85 | -1.06 | 90 | -1.06 | 1 |# 86 | -1.04 | 32 | -1.04 | 1 |# 87 | -0.98 | 14 | -0.98 | 1 |# 88 | -0.95 | 15 | -0.95 | 1 |# 89 | -0.88 | 82 | -0.88 | 1 |# 90 | -0.81 | 93 | -0.81 | 1 |# 91 | -0.71 | 81 | -0.71 | 1 |# 92 | -0.70 | 43 | -0.70 | 1 |# 93 | -0.66 | 33 | -0.66 | 1 |# 94 | -0.50 | 6 | -0.50 | 1 |# 95 | -0.40 | 9 | -0.40 | 1 |# 96 | -0.38 | 71 | -0.38 | 1 |# 97 | -0.38 | 96 | -0.38 | 1 |# 98 | -0.32 | 38 | -0.32 | 1 |# 99 | -0.06 | 46 | -0.06 | 1 |# 100 | +0.08 | 8 | +0.08 | 1 |# _____|___________|_____|___________|_____|__________________________

8.2 Ligan KRR ________________________________________________________________________________ Number of distinct conformational clusters found = 80, Using an rmsd-tolerance of 1.5 A

out of 100 runs,

CLUSTERING HISTOGRAM ________________________________________________________________________________ | | | | | Clus | Lowest | Run | Mean | Num | Histogram -ter | Binding | | Binding | in | Rank | Energy | | Energy | Clus| 5 10 15 20 25 30 35 _____|___________|_____|___________|_____|____:____|____:____|____:____|____:___ 1 | -7.01 | 82 | -6.22 | 8 |########


75

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |

-6.86 -6.72 -6.13 -5.98 -5.95 -5.94 -5.68 -5.57 -5.54 -5.48 -5.39 -5.33 -5.26 -5.21 -5.19 -5.18 -5.16 -5.10 -5.06 -4.99 -4.99 -4.98 -4.96 -4.93 -4.92 -4.86 -4.84 -4.79 -4.77 -4.70 -4.66 -4.61 -4.59 -4.58 -4.54 -4.52 -4.51 -4.45 -4.44 -4.43 -4.40 -4.37 -4.36 -4.36 -4.33 -4.25 -4.25 -4.24 -4.23 -4.23 -4.23 -4.21 -4.21 -4.20 -4.09 -4.06 -3.97 -3.97 -3.92 -3.85 -3.80 -3.74 -3.66 -3.57 -3.51 -3.51 -3.49 -3.48

| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |

81 47 74 72 13 68 33 90 12 57 59 86 84 54 3 28 62 85 31 37 48 18 94 58 67 55 29 11 53 78 4 16 56 51 97 77 91 44 50 49 65 2 36 71 26 95 43 80 22 25 21 35 98 40 92 17 87 32 7 63 27 10 46 99 38 5 96 76

| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |

-6.32 -6.27 -5.98 -5.65 -5.95 -5.89 -5.68 -5.57 -5.54 -5.48 -5.39 -4.73 -5.21 -5.21 -5.03 -5.18 -5.16 -5.10 -5.06 -4.99 -4.99 -4.98 -4.96 -4.93 -4.92 -4.86 -4.84 -4.79 -4.77 -4.70 -4.66 -4.61 -4.59 -4.58 -4.22 -4.52 -4.51 -4.45 -4.44 -4.43 -4.40 -4.32 -4.36 -4.36 -4.33 -4.25 -4.25 -4.24 -4.23 -4.23 -4.23 -4.21 -4.21 -4.20 -4.09 -4.06 -3.97 -3.97 -3.92 -3.85 -3.80 -3.74 -3.66 -3.57 -3.51 -3.51 -3.49 -3.48

| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |

2 4 3 2 1 2 1 1 1 1 1 2 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

|## |#### |### |## |# |## |# |# |# |# |# |## |## |# |## |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |## |# |# |# |# |# |# |## |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |# |#


76

70 | -3.44 | 1 | -3.44 | 1 |# 71 | -3.42 | 83 | -3.42 | 1 |# 72 | -3.38 | 45 | -3.38 | 1 |# 73 | -3.36 | 42 | -3.36 | 1 |# 74 | -3.35 | 88 | -3.35 | 1 |# 75 | -3.17 | 69 | -3.17 | 1 |# 76 | -3.15 | 89 | -3.15 | 1 |# 77 | -3.13 | 79 | -3.13 | 1 |# 78 | -3.09 | 8 | -3.09 | 1 |# 79 | -3.05 | 100 | -3.05 | 1 |# 80 | -3.03 | 6 | -3.03 | 1 |# _____|___________|_____|___________|_____|______________________________________

8.3 Ligan GRR Number of distinct conformational clusters found = 61, Using an rmsd-tolerance of 1.5 A

out of 100 runs,

CLUSTERING HISTOGRAM ___________________________________________________________________________ | | | | | Clus | Lowest | Run | Mean | Num | Histogram -ter | Binding | | Binding | in | Rank | Energy | | Energy | Clus| 5 10 15 20 25 30 35 _____|___________|_____|___________|_____|____:____|____:____|____:____|____:___ 1 | -8.12 | 81 | -7.70 | 4 |#### 2 | -7.94 | 1 | -7.42 | 4 |#### 3 | -7.58 | 20 | -6.95 | 5 |##### 4 | -7.56 | 56 | -6.73 | 3 |### 5 | -7.53 | 99 | -7.53 | 1 |# 6 | -7.50 | 79 | -7.50 | 1 |# 7 | -7.31 | 42 | -7.01 | 4 |#### 8 | -7.15 | 67 | -7.15 | 1 |# 9 | -7.07 | 92 | -6.91 | 2 |## 10 | -7.04 | 66 | -6.42 | 6 |###### 11 | -6.98 | 41 | -6.98 | 1 |# 12 | -6.89 | 25 | -6.21 | 3 |### 13 | -6.88 | 49 | -6.59 | 2 |## 14 | -6.87 | 60 | -6.55 | 2 |## 15 | -6.84 | 13 | -6.42 | 3 |### 16 | -6.82 | 36 | -6.67 | 3 |### 17 | -6.56 | 2 | -6.56 | 1 |# 18 | -6.48 | 68 | -6.48 | 1 |# 19 | -6.45 | 96 | -6.36 | 2 |## 20 | -6.42 | 23 | -6.42 | 1 |# 21 | -6.41 | 8 | -6.41 | 1 |# 22 | -6.38 | 53 | -6.07 | 2 |## 23 | -6.32 | 98 | -5.53 | 2 |## 24 | -6.23 | 85 | -6.23 | 1 |# 25 | -6.22 | 78 | -6.20 | 2 |## 26 | -6.19 | 46 | -6.19 | 1 |# 27 | -6.07 | 83 | -6.07 | 1 |# 28 | -6.06 | 97 | -6.06 | 1 |# 29 | -6.02 | 33 | -6.02 | 1 |# 30 | -6.00 | 95 | -6.00 | 1 |# 31 | -5.98 | 21 | -5.65 | 3 |### 32 | -5.96 | 12 | -5.96 | 1 |# 33 | -5.82 | 35 | -5.82 | 1 |# 34 | -5.81 | 47 | -5.81 | 1 |# 35 | -5.80 | 18 | -5.80 | 1 |# 36 | -5.78 | 9 | -5.78 | 1 |# 37 | -5.78 | 4 | -5.78 | 1 |# 38 | -5.58 | 71 | -5.36 | 2 |## 39 | -5.58 | 58 | -5.52 | 2 |## 40 | -5.53 | 52 | -5.53 | 1 |# 41 | -5.46 | 74 | -5.46 | 1 |#


77

42 | -5.46 | 5 | -5.46 | 1 |# 43 | -5.44 | 7 | -5.44 | 1 |# 44 | -5.34 | 91 | -5.34 | 1 |# 45 | -5.32 | 34 | -5.32 | 1 |# 46 | -5.26 | 3 | -5.23 | 2 |## 47 | -5.20 | 72 | -5.20 | 1 |# 48 | -5.19 | 54 | -5.19 | 1 |# 49 | -5.18 | 51 | -5.18 | 1 |# 50 | -5.18 | 31 | -5.18 | 1 |# 51 | -5.18 | 15 | -5.18 | 1 |# 52 | -5.14 | 62 | -5.14 | 1 |# 53 | -5.09 | 11 | -5.09 | 1 |# 54 | -5.01 | 24 | -5.01 | 1 |# 55 | -4.93 | 89 | -4.93 | 1 |# 56 | -4.91 | 86 | -4.91 | 1 |# 57 | -4.90 | 82 | -4.90 | 1 |# 58 | -4.90 | 19 | -4.90 | 1 |# 59 | -4.88 | 59 | -4.88 | 1 |# 60 | -4.79 | 32 | -4.75 | 2 |## 61 | -4.45 | 88 | -4.45 | 1 |# _____|___________|_____|___________|_____|______________________________________

8.4 Ligan RGR ________________________________________________________________________________ Number of distinct conformational clusters found = 53, Using an rmsd-tolerance of 1.5 A

out of 100 runs,

CLUSTERING HISTOGRAM ________________________________________________________________________________ | | | | | Clus | Lowest | Run | Mean | Num | Histogram -ter | Binding | | Binding | in | Rank | Energy | | Energy | Clus| 5 10 15 20 25 30 35 _____|___________|_____|___________|_____|____:____|____:____|____:____|____:___ 1 | -7.50 | 90 | -6.59 | 2 |## 2 | -7.35 | 89 | -6.82 | 9 |######### 3 | -7.16 | 19 | -6.59 | 5 |##### 4 | -7.08 | 82 | -6.67 | 4 |#### 5 | -6.86 | 99 | -6.35 | 4 |#### 6 | -6.86 | 50 | -6.86 | 1 |# 7 | -6.85 | 79 | -6.85 | 1 |# 8 | -6.61 | 1 | -6.15 | 3 |### 9 | -6.58 | 91 | -6.08 | 3 |### 10 | -6.58 | 17 | -6.58 | 1 |# 11 | -6.42 | 42 | -6.21 | 3 |### 12 | -6.39 | 68 | -6.01 | 6 |###### 13 | -6.37 | 98 | -6.37 | 1 |# 14 | -6.35 | 40 | -6.35 | 1 |# 15 | -6.31 | 5 | -5.87 | 4 |#### 16 | -6.30 | 41 | -6.13 | 5 |##### 17 | -6.27 | 2 | -5.87 | 3 |### 18 | -6.19 | 80 | -6.19 | 1 |# 19 | -6.16 | 61 | -6.16 | 1 |# 20 | -6.14 | 30 | -5.85 | 3 |### 21 | -6.08 | 81 | -6.08 | 1 |# 22 | -6.03 | 32 | -6.03 | 1 |# 23 | -6.01 | 57 | -5.25 | 2 |## 24 | -6.00 | 22 | -5.23 | 4 |#### 25 | -5.94 | 44 | -5.94 | 1 |# 26 | -5.93 | 45 | -5.93 | 1 |# 27 | -5.86 | 8 | -5.86 | 1 |# 28 | -5.82 | 60 | -5.82 | 1 |# 29 | -5.77 | 16 | -5.77 | 1 |# 30 | -5.60 | 69 | -5.54 | 3 |### 31 | -5.50 | 72 | -5.50 | 1 |#


78

32 | -5.47 | 46 | -5.47 | 1 |# 33 | -5.46 | 92 | -5.46 | 1 |# 34 | -5.40 | 14 | -5.40 | 1 |# 35 | -5.37 | 59 | -5.37 | 1 |# 36 | -5.37 | 3 | -5.37 | 1 |# 37 | -5.34 | 6 | -5.34 | 1 |# 38 | -5.33 | 52 | -5.33 | 1 |# 39 | -5.27 | 53 | -5.27 | 1 |# 40 | -5.23 | 38 | -5.23 | 1 |# 41 | -5.22 | 74 | -5.22 | 1 |# 42 | -5.07 | 18 | -5.07 | 1 |# 43 | -5.04 | 12 | -5.04 | 1 |# 44 | -4.92 | 25 | -4.92 | 1 |# 45 | -4.89 | 54 | -4.89 | 1 |# 46 | -4.88 | 67 | -4.88 | 1 |# 47 | -4.86 | 31 | -4.86 | 1 |# 48 | -4.78 | 62 | -4.78 | 1 |# 49 | -4.78 | 95 | -4.78 | 1 |# 50 | -4.63 | 35 | -4.63 | 1 |# 51 | -4.57 | 56 | -4.57 | 1 |# 52 | -4.53 | 9 | -4.53 | 1 |# 53 | -4.29 | 51 | -4.29 | 1 |# _____|___________|_____|___________|_____|______________________________________

8.5 Ligan RTR ________________________________________________________________________________ Number of distinct conformational clusters found = 77, Using an rmsd-tolerance of 1.5 A

out of 100 runs,

CLUSTERING HISTOGRAM ________________________________________________________________________________ | | | | | Clus | Lowest | Run | Mean | Num | Histogram -ter | Binding | | Binding | in | Rank | Energy | | Energy | Clus| 5 10 15 20 25 30 35 _____|___________|_____|___________|_____|____:____|____:____|____:____|____:___ 1 | -7.69 | 26 | -7.24 | 2 |## 2 | -7.06 | 59 | -6.56 | 3 |### 3 | -6.86 | 35 | -6.41 | 2 |## 4 | -6.82 | 45 | -6.30 | 3 |### 5 | -6.39 | 20 | -6.39 | 1 |# 6 | -6.34 | 76 | -6.34 | 1 |# 7 | -6.30 | 4 | -6.30 | 1 |# 8 | -6.27 | 31 | -5.33 | 3 |### 9 | -6.26 | 52 | -6.15 | 2 |## 10 | -6.23 | 62 | -5.85 | 3 |### 11 | -6.22 | 61 | -6.22 | 1 |# 12 | -6.21 | 1 | -6.21 | 1 |# 13 | -6.14 | 54 | -6.14 | 1 |# 14 | -6.02 | 55 | -6.02 | 1 |# 15 | -5.95 | 84 | -5.95 | 1 |# 16 | -5.94 | 11 | -5.69 | 2 |## 17 | -5.90 | 9 | -5.90 | 1 |# 18 | -5.90 | 19 | -5.90 | 1 |# 19 | -5.89 | 95 | -5.54 | 2 |## 20 | -5.78 | 70 | -5.27 | 3 |### 21 | -5.78 | 86 | -5.78 | 1 |# 22 | -5.73 | 56 | -5.73 | 1 |# 23 | -5.67 | 53 | -5.67 | 1 |# 24 | -5.64 | 25 | -5.26 | 3 |### 25 | -5.62 | 73 | -5.62 | 1 |# 26 | -5.62 | 15 | -5.62 | 1 |# 27 | -5.61 | 72 | -4.85 | 2 |## 28 | -5.60 | 75 | -5.60 | 1 |# 29 | -5.58 | 94 | -5.58 | 1 |#


79

30 | -5.45 | 51 | -5.45 | 1 |# 31 | -5.39 | 27 | -5.39 | 1 |# 32 | -5.38 | 18 | -5.38 | 1 |# 33 | -5.38 | 68 | -5.38 | 1 |# 34 | -5.34 | 10 | -5.17 | 2 |## 35 | -5.18 | 49 | -5.18 | 1 |# 36 | -5.17 | 60 | -5.16 | 2 |## 37 | -5.17 | 34 | -5.17 | 1 |# 38 | -5.09 | 32 | -5.00 | 2 |## 39 | -5.08 | 85 | -5.08 | 1 |# 40 | -5.04 | 13 | -5.04 | 1 |# 41 | -5.01 | 87 | -5.01 | 1 |# 42 | -5.01 | 17 | -5.01 | 1 |# 43 | -4.95 | 80 | -4.70 | 2 |## 44 | -4.94 | 23 | -4.80 | 2 |## 45 | -4.92 | 24 | -4.92 | 1 |# 46 | -4.85 | 78 | -4.85 | 1 |# 47 | -4.82 | 74 | -4.82 | 1 |# 48 | -4.81 | 28 | -4.81 | 1 |# 49 | -4.75 | 50 | -4.75 | 1 |# 50 | -4.75 | 64 | -4.75 | 1 |# 51 | -4.72 | 100 | -4.72 | 1 |# 52 | -4.66 | 39 | -4.66 | 1 |# 53 | -4.65 | 81 | -4.65 | 1 |# 54 | -4.62 | 41 | -4.62 | 1 |# 55 | -4.62 | 22 | -4.62 | 1 |# 56 | -4.61 | 33 | -4.61 | 1 |# 57 | -4.52 | 46 | -4.52 | 1 |# 58 | -4.50 | 14 | -4.50 | 1 |# 59 | -4.49 | 91 | -4.49 | 1 |# 60 | -4.46 | 96 | -4.46 | 1 |# 61 | -4.40 | 29 | -4.40 | 1 |# 62 | -4.33 | 36 | -4.33 | 1 |# 63 | -4.23 | 67 | -4.23 | 1 |# 64 | -4.21 | 65 | -4.21 | 1 |# 65 | -4.20 | 63 | -4.20 | 1 |# 66 | -4.17 | 43 | -4.17 | 1 |# 67 | -4.16 | 83 | -4.16 | 1 |# 68 | -4.15 | 88 | -4.15 | 1 |# 69 | -4.13 | 90 | -4.13 | 1 |# 70 | -4.06 | 66 | -4.06 | 1 |# 71 | -3.88 | 40 | -3.88 | 1 |# 72 | -3.84 | 5 | -3.84 | 1 |# 73 | -3.83 | 7 | -3.83 | 1 |# 74 | -3.77 | 97 | -3.77 | 1 |# 75 | -3.74 | 82 | -3.74 | 1 |# 76 | -3.58 | 16 | -3.58 | 1 |# 77 | -3.58 | 79 | -3.58 | 1 |# _____|___________|_____|___________|_____|______________________________________

8.6 Ligan TRR Number of distinct conformational clusters found = 68, Using an rmsd-tolerance of 1.5 A

out of 100 runs,

CLUSTERING HISTOGRAM ________________________________________________________________________________ | | | | | Clus | Lowest | Run | Mean | Num | Histogram -ter | Binding | | Binding | in | Rank | Energy | | Energy | Clus| 5 10 15 20 25 30 35 _____|___________|_____|___________|_____|____:____|____:____|____:____|____:___ 1 | -7.08 | 11 | -6.24 | 4 |#### 2 | -6.88 | 25 | -6.85 | 2 |## 3 | -6.61 | 32 | -6.44 | 2 |## 4 | -6.34 | 61 | -5.81 | 4 |####


80

5 | -6.33 | 92 | -5.95 | 3 |### 6 | -6.29 | 98 | -6.21 | 2 |## 7 | -6.25 | 22 | -5.94 | 3 |### 8 | -6.19 | 75 | -5.87 | 2 |## 9 | -6.15 | 76 | -5.72 | 5 |##### 10 | -6.00 | 29 | -6.00 | 1 |# 11 | -5.95 | 66 | -5.86 | 2 |## 12 | -5.94 | 10 | -5.94 | 1 |# 13 | -5.92 | 58 | -5.50 | 2 |## 14 | -5.91 | 27 | -5.81 | 2 |## 15 | -5.86 | 37 | -5.64 | 2 |## 16 | -5.85 | 46 | -5.51 | 3 |### 17 | -5.77 | 63 | -5.77 | 1 |# 18 | -5.77 | 34 | -5.77 | 1 |# 19 | -5.72 | 47 | -5.61 | 2 |## 20 | -5.66 | 69 | -5.66 | 1 |# 21 | -5.66 | 71 | -5.27 | 2 |## 22 | -5.64 | 57 | -5.64 | 1 |# 23 | -5.63 | 94 | -5.54 | 2 |## 24 | -5.39 | 17 | -5.39 | 1 |# 25 | -5.35 | 30 | -5.26 | 3 |### 26 | -5.33 | 38 | -5.33 | 1 |# 27 | -5.33 | 40 | -5.22 | 2 |## 28 | -5.26 | 33 | -5.26 | 1 |# 29 | -5.24 | 89 | -5.24 | 1 |# 30 | -5.23 | 24 | -5.23 | 1 |# 31 | -5.19 | 77 | -5.19 | 1 |# 32 | -5.13 | 81 | -5.13 | 1 |# 33 | -5.12 | 90 | -5.12 | 1 |# 34 | -5.10 | 82 | -5.10 | 1 |# 35 | -5.09 | 39 | -4.72 | 2 |## 36 | -5.02 | 45 | -5.02 | 1 |# 37 | -4.94 | 65 | -4.94 | 1 |# 38 | -4.91 | 70 | -4.91 | 1 |# 39 | -4.91 | 73 | -4.91 | 1 |# 40 | -4.90 | 20 | -4.90 | 1 |# 41 | -4.82 | 88 | -4.82 | 1 |# 42 | -4.79 | 3 | -4.79 | 1 |# 43 | -4.77 | 55 | -4.77 | 1 |# 44 | -4.77 | 12 | -4.77 | 1 |# 45 | -4.77 | 7 | -4.77 | 1 |# 46 | -4.75 | 43 | -4.75 | 1 |# 47 | -4.75 | 78 | -4.75 | 1 |# 48 | -4.71 | 60 | -4.71 | 1 |# 49 | -4.69 | 6 | -4.69 | 1 |# 50 | -4.66 | 13 | -4.66 | 1 |# 51 | -4.66 | 85 | -4.47 | 2 |## 52 | -4.66 | 49 | -4.66 | 1 |# 53 | -4.62 | 83 | -4.62 | 1 |# 54 | -4.50 | 14 | -4.50 | 1 |# 55 | -4.50 | 87 | -4.50 | 1 |# 56 | -4.45 | 51 | -4.45 | 1 |# 57 | -4.42 | 41 | -4.42 | 1 |# 58 | -4.30 | 36 | -4.30 | 1 |# 59 | -4.25 | 48 | -4.25 | 1 |# 60 | -4.24 | 84 | -4.24 | 1 |# 61 | -4.19 | 31 | -4.19 | 1 |# 62 | -4.18 | 64 | -4.18 | 1 |# 63 | -4.02 | 99 | -4.02 | 1 |# 64 | -3.99 | 97 | -3.99 | 1 |# 65 | -3.97 | 79 | -3.97 | 1 |# 66 | -3.96 | 8 | -3.96 | 1 |# 67 | -3.67 | 86 | -3.67 | 1 |# 68 | -3.66 | 26 | -3.66 | 1 |# _____|___________|_____|___________|_____|______________________________________


81

8.7 Ligan KRK Number of distinct conformational clusters found = 85, Using an rmsd-tolerance of 1.5 A

out of 100 runs,

CLUSTERING HISTOGRAM _________________________________________________ | | | | | Clus | Lowest | Run | Mean | Num | Histogram -ter | Binding | | Binding | in | Rank | Energy | | Energy | Clus| 5 10 15 20 25 30 35 _____|___________|_____|___________|_____|____:____|____:____|____:____|____:___ 1 | -8.39 | 47 | -7.07 | 6 |###### 2 | -7.58 | 20 | -7.58 | 1 |# 3 | -6.96 | 74 | -6.05 | 2 |## 4 | -6.83 | 81 | -6.83 | 1 |# 5 | -6.62 | 6 | -6.62 | 1 |# 6 | -6.42 | 28 | -6.42 | 1 |# 7 | -6.40 | 32 | -6.40 | 1 |# 8 | -6.32 | 84 | -6.32 | 1 |# 9 | -6.28 | 83 | -6.28 | 1 |# 10 | -6.25 | 61 | -6.25 | 1 |# 11 | -6.19 | 90 | -5.66 | 2 |## 12 | -6.15 | 92 | -6.13 | 2 |## 13 | -6.14 | 37 | -6.00 | 2 |## 14 | -6.09 | 3 | -6.09 | 1 |# 15 | -5.91 | 69 | -5.91 | 1 |# 16 | -5.88 | 88 | -5.88 | 1 |# 17 | -5.85 | 1 | -5.85 | 1 |# 18 | -5.84 | 18 | -5.40 | 3 |### 19 | -5.81 | 86 | -5.81 | 1 |# 20 | -5.79 | 51 | -5.79 | 1 |# 21 | -5.70 | 22 | -5.70 | 1 |# 22 | -5.68 | 91 | -5.68 | 1 |# 23 | -5.62 | 60 | -5.62 | 1 |# 24 | -5.57 | 43 | -5.57 | 1 |# 25 | -5.41 | 55 | -5.41 | 1 |# 26 | -5.38 | 67 | -5.38 | 1 |# 27 | -5.35 | 54 | -5.35 | 1 |# 28 | -5.30 | 52 | -5.30 | 1 |# 29 | -5.27 | 13 | -5.00 | 2 |## 30 | -5.26 | 41 | -5.26 | 1 |# 31 | -5.18 | 97 | -5.08 | 2 |## 32 | -5.15 | 16 | -5.15 | 1 |# 33 | -5.14 | 7 | -5.14 | 1 |# 34 | -5.13 | 17 | -5.13 | 1 |# 35 | -5.13 | 38 | -5.08 | 2 |## 36 | -5.12 | 12 | -5.12 | 1 |# 37 | -5.12 | 99 | -5.12 | 1 |# 38 | -5.05 | 34 | -5.05 | 1 |# 39 | -4.96 | 9 | -4.96 | 1 |# 40 | -4.95 | 93 | -4.95 | 1 |# 41 | -4.81 | 5 | -4.81 | 1 |# 42 | -4.80 | 35 | -4.80 | 1 |# 43 | -4.78 | 23 | -4.78 | 1 |# 44 | -4.72 | 15 | -4.72 | 1 |# 45 | -4.71 | 58 | -4.71 | 1 |# 46 | -4.69 | 66 | -4.69 | 1 |# 47 | -4.64 | 100 | -4.64 | 1 |# 48 | -4.50 | 77 | -4.50 | 1 |# 49 | -4.49 | 85 | -4.49 | 1 |# 50 | -4.49 | 65 | -4.49 | 1 |# 51 | -4.47 | 56 | -4.47 | 1 |# 52 | -4.45 | 21 | -4.45 | 1 |# 53 | -4.43 | 45 | -4.24 | 2 |## 54 | -4.40 | 53 | -4.40 | 1 |# 55 | -4.39 | 94 | -4.39 | 1 |#


82

56 | -4.38 | 8 | -4.38 | 1 |# 57 | -4.32 | 79 | -4.32 | 1 |# 58 | -4.32 | 98 | -4.32 | 1 |# 59 | -4.32 | 27 | -4.32 | 1 |# 60 | -4.31 | 70 | -4.31 | 1 |# 61 | -4.30 | 48 | -4.30 | 1 |# 62 | -4.28 | 57 | -4.28 | 1 |# 63 | -4.24 | 25 | -4.24 | 1 |# 64 | -4.16 | 4 | -4.16 | 1 |# 65 | -4.16 | 62 | -4.16 | 1 |# 66 | -4.15 | 50 | -4.15 | 1 |# 67 | -4.12 | 29 | -4.12 | 1 |# 68 | -4.11 | 95 | -4.11 | 1 |# 69 | -4.07 | 11 | -4.07 | 1 |# 70 | -4.07 | 49 | -4.07 | 1 |# 71 | -4.02 | 71 | -4.02 | 1 |# 72 | -3.97 | 89 | -3.97 | 1 |# 73 | -3.96 | 76 | -3.96 | 1 |# 74 | -3.95 | 63 | -3.95 | 1 |# 75 | -3.84 | 31 | -3.84 | 1 |# 76 | -3.77 | 59 | -3.77 | 1 |# 77 | -3.76 | 40 | -3.76 | 1 |# 78 | -3.76 | 75 | -3.76 | 1 |# 79 | -3.75 | 87 | -3.75 | 1 |# 80 | -3.75 | 26 | -3.75 | 1 |# 81 | -3.67 | 46 | -3.67 | 1 |# 82 | -3.21 | 96 | -3.21 | 1 |# 83 | -3.07 | 73 | -3.07 | 1 |# 84 | -2.88 | 44 | -2.88 | 1 |# 85 | -2.85 | 78 | -2.85 | 1 |# _____|___________|_____|___________|_____|______________________________________

8.8 Ligan RRK Number of distinct conformational clusters found = 80, Using an rmsd-tolerance of 1.5 A

out of 100 runs,

CLUSTERING HISTOGRAM ________________________________________________________________________________ | | | | | Clus | Lowest | Run | Mean | Num | Histogram -ter | Binding | | Binding | in | Rank | Energy | | Energy | Clus| 5 10 15 20 25 30 35 _____|___________|_____|___________|_____|____:____|____:____|____:____|____:___ 1 | -7.48 | 12 | -7.48 | 1 |# 2 | -7.38 | 15 | -7.24 | 2 |## 3 | -6.90 | 11 | -6.90 | 1 |# 4 | -6.85 | 18 | -6.85 | 1 |# 5 | -6.83 | 83 | -6.31 | 6 |###### 6 | -6.48 | 68 | -6.48 | 1 |# 7 | -6.46 | 37 | -5.99 | 3 |### 8 | -6.45 | 40 | -6.45 | 1 |# 9 | -6.42 | 86 | -6.12 | 2 |## 10 | -6.34 | 52 | -6.09 | 2 |## 11 | -6.24 | 56 | -6.24 | 1 |# 12 | -6.22 | 28 | -6.02 | 2 |## 13 | -6.19 | 1 | -6.14 | 2 |## 14 | -6.16 | 98 | -6.16 | 1 |# 15 | -6.14 | 41 | -5.61 | 2 |## 16 | -6.05 | 75 | -5.96 | 2 |## 17 | -6.02 | 22 | -6.02 | 1 |# 18 | -5.95 | 34 | -5.95 | 1 |# 19 | -5.93 | 71 | -5.93 | 1 |# 20 | -5.83 | 85 | -5.83 | 1 |# 21 | -5.70 | 8 | -5.70 | 1 |# 22 | -5.68 | 69 | -5.68 | 1 |#


83

23 | -5.60 | 9 | -5.60 | 1 |# 24 | -5.58 | 4 | -5.58 | 1 |# 25 | -5.58 | 88 | -5.58 | 1 |# 26 | -5.56 | 99 | -5.56 | 1 |# 27 | -5.53 | 31 | -5.53 | 1 |# 28 | -5.50 | 45 | -5.50 | 1 |# 29 | -5.50 | 77 | -5.37 | 3 |### 30 | -5.48 | 26 | -5.48 | 1 |# 31 | -5.47 | 39 | -5.47 | 1 |# 32 | -5.42 | 70 | -5.05 | 2 |## 33 | -5.41 | 55 | -5.41 | 1 |# 34 | -5.41 | 14 | -5.41 | 1 |# 35 | -5.40 | 78 | -5.40 | 1 |# 36 | -5.37 | 59 | -5.37 | 1 |# 37 | -5.35 | 19 | -5.35 | 1 |# 38 | -5.31 | 87 | -5.31 | 1 |# 39 | -5.31 | 76 | -5.31 | 1 |# 40 | -5.29 | 100 | -5.26 | 2 |## 41 | -5.27 | 29 | -5.27 | 1 |# 42 | -5.24 | 2 | -5.24 | 1 |# 43 | -5.14 | 74 | -4.68 | 2 |## 44 | -5.11 | 13 | -5.11 | 1 |# 45 | -5.07 | 91 | -5.07 | 1 |# 46 | -5.05 | 54 | -5.05 | 1 |# 47 | -5.00 | 3 | -5.00 | 1 |# 48 | -4.97 | 93 | -4.97 | 1 |# 49 | -4.94 | 63 | -4.94 | 1 |# 50 | -4.89 | 67 | -4.89 | 1 |# 51 | -4.84 | 17 | -4.84 | 1 |# 52 | -4.82 | 82 | -4.68 | 2 |## 53 | -4.81 | 49 | -4.81 | 1 |# 54 | -4.79 | 81 | -4.79 | 1 |# 55 | -4.68 | 92 | -4.68 | 1 |# 56 | -4.57 | 43 | -4.57 | 1 |# 57 | -4.53 | 90 | -4.53 | 1 |# 58 | -4.38 | 16 | -4.38 | 1 |# 59 | -4.33 | 10 | -4.33 | 1 |# 60 | -4.33 | 33 | -4.33 | 1 |# 61 | -4.30 | 96 | -4.30 | 1 |# 62 | -4.28 | 84 | -4.28 | 1 |# 63 | -4.26 | 42 | -4.26 | 1 |# 64 | -4.24 | 36 | -4.24 | 1 |# 65 | -4.18 | 6 | -4.18 | 1 |# 66 | -4.18 | 58 | -4.18 | 1 |# 67 | -4.17 | 60 | -4.17 | 1 |# 68 | -4.16 | 89 | -4.16 | 1 |# 69 | -4.11 | 53 | -4.11 | 1 |# 70 | -4.11 | 25 | -4.11 | 1 |# 71 | -4.10 | 30 | -4.10 | 1 |# 72 | -4.10 | 57 | -4.10 | 1 |# 73 | -4.02 | 21 | -4.02 | 1 |# 74 | -3.97 | 35 | -3.97 | 1 |# 75 | -3.95 | 48 | -3.95 | 1 |# 76 | -3.91 | 32 | -3.91 | 1 |# 77 | -3.86 | 20 | -3.86 | 1 |# 78 | -3.71 | 95 | -3.71 | 1 |# 79 | -3.61 | 72 | -3.61 | 1 |# 80 | -3.60 | 79 | -3.60 | 1 |# _____|___________|_____|___________|_____|______________________________________


84

Lampiran 9. Data Energi Hasil Docking

9.1 Ligan Standar Keeping original residue number (specified in the input PDBQ file) for outputting. MODEL 70 USER Run = 70 USER Cluster Rank = 1 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 19.094 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.14 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 31.54 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -11.63 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -9.95 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.68 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.70 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +6.86 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -1.33 kcal/mol USER MODEL 62 USER Run = 62 USER Cluster Rank = 2 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 21.454 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -5.71 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 64.78 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -11.65 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -9.76 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.89 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.26 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +6.86 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -1.33 kcal/mol USER MODEL 94 USER Run = 94 USER Cluster Rank = 3 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 21.345 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -5.53 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 88.96 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -9.50 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -8.22 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.29 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -4.21 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +6.86 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -1.33 kcal/mol USER USER MODEL 95 USER Run = 95 USER Cluster Rank = 4


85

USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER

Number of conformations in this cluster = 1 RMSD from reference structure Estimated Free Energy of Binding Estimated Inhibition Constant, Ki K] (1) Final Intermolecular Energy vdW + Hbond + desolv Energy Electrostatic Energy (2) Final Total Internal Energy (3) Torsional Free Energy (4) Unbound System's Energy

= 23.464 A = =

= = = = = =

-5.50 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] 92.46 uM (micromolar) [Temperature =

-10.42 -9.33 -1.09 -3.27 +6.86 -1.33

kcal/mol kcal/mol kcal/mol kcal/mol kcal/mol kcal/mol

35 Run = 35 Cluster Rank = 5 Number of conformations in this cluster = 1 RMSD from reference structure Estimated Free Energy of Binding Estimated Inhibition Constant, Ki K] (1) Final Intermolecular Energy vdW + Hbond + desolv Energy Electrostatic Energy (2) Final Total Internal Energy (3) Torsional Free Energy (4) Unbound System's Energy

= 22.130 A = =

= = = = = =


-10.32 -8.41 -1.91 -3.36 +6.86 -1.33



= 21.104 A = =


= = = = = =

-10.20 -9.04 -1.16 -3.11 +6.86 -1.33



= 20.284 A = =


= = = = = =

-10.85 -9.85 -1.00 -2.43 +6.86 -1.33



86

USER MODEL 60 USER Run = 60 USER Cluster Rank = 8 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 19.222 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -4.94 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 238.64 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -9.66 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -8.61 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.04 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.48 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +6.86 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -1.33 kcal/mol USER MODEL 40 USER Run = 40 USER Cluster Rank = 9 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 20.524 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -4.79 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 309.67 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -9.02 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.83 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.19 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.96 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +6.86 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -1.33 kcal/mol USER MODEL 7 USER Run = 7 USER Cluster Rank = 10 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 20.156 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -4.54 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 470.79 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -9.75 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -8.79 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -0.96 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.98 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +6.86 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -1.33 kcal/mol USER

9.2 Ligan KRR LOWEST ENERGY DOCKED CONFORMATION from EACH CLUSTER Keeping original residue number (specified in the input PDBQ file) for outputting. MODEL USER USER USER USER USER

82 Run = 82 Cluster Rank = 1 Number of conformations in this cluster = 8 RMSD from reference structure

= 21.447 A


87

USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER

Estimated Free Energy of Binding Estimated Inhibition Constant, Ki K] (1) Final Intermolecular Energy vdW + Hbond + desolv Energy Electrostatic Energy (2) Final Total Internal Energy (3) Torsional Free Energy (4) Unbound System's Energy

= =

= = = = = =


-10.16 -8.08 -2.08 -1.56 +4.12 -0.60



= 18.939 A = =

= = = = = =


-10.05 -7.21 -2.84 -1.53 +4.12 -0.60



= 21.544 A = =

= = = = = =


-10.15 -8.37 -1.78 -1.29 +4.12 -0.60



= 21.841 A = =


= = = = = =

-9.76 -7.07 -2.69 -1.08 +4.12 -0.60


72 Run = 72


88

USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER

Cluster Rank = 5 Number of conformations in this cluster = 2 RMSD from reference structure Estimated Free Energy of Binding Estimated Inhibition Constant, Ki K] (1) Final Intermolecular Energy vdW + Hbond + desolv Energy Electrostatic Energy (2) Final Total Internal Energy (3) Torsional Free Energy (4) Unbound System's Energy

= 20.606 A = =

= = = = = =


-10.30 -7.79 -2.51 -0.40 +4.12 -0.60



= 21.801 A = =


= = = = = =

-8.94 -7.55 -1.39 -1.72 +4.12 -0.60



= 20.780 A = =


= = = = = =

-8.62 -7.35 -1.27 -2.04 +4.12 -0.60


33 Run = 33 Cluster Rank = 8 Number of conformations in this cluster = 1 RMSD from reference structure Estimated Free Energy of Binding Estimated Inhibition Constant, Ki K] (1) Final Intermolecular Energy vdW + Hbond + desolv Energy Electrostatic Energy (2) Final Total Internal Energy (3) Torsional Free Energy

= 22.680 A = =


= = = = =

-9.68 -8.03 -1.66 -0.72 +4.12

kcal/mol kcal/mol kcal/mol kcal/mol kcal/mol


89

USER (4) Unbound System's Energy = -0.60 kcal/mol USER MODEL 90 USER Run = 90 USER Cluster Rank = 9 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 21.452 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -5.57 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 82.82 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -9.45 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -8.02 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.44 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -0.83 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.12 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.60 kcal/mol USER MODEL 12 USER Run = 12 USER Cluster Rank = 10 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 20.272 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -5.54 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 87.47 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -7.88 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.39 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.49 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.37 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.12 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.60 kcal/mol

9.3 Ligan GRR LOWEST ENERGY DOCKED CONFORMATION from EACH CLUSTER Keeping original residue number (specified in the input PDBQ file) for outputting. MODEL 81 USER Run = 81 USER Cluster Rank = 1 USER Number of conformations in this cluster = 4 USER USER RMSD from reference structure = 22.144 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -8.12 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 1.11 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.17 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.10 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.07 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.73 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +2.74 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -1.03 kcal/mol


90

MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER


= 22.308 A = =


= = = = = =

-8.34 -7.19 -1.15 -3.38 +2.74 -1.03



= 20.966 A = =

= = = = = =


-10.28 -8.41 -1.86 -1.08 +2.74 -1.03



= 21.800 A = =


= = = = = =

-8.20 -7.06 -1.14 -3.13 +2.74 -1.03


99 Run = 99 Cluster Rank = 5 Number of conformations in this cluster = 1 RMSD from reference structure Estimated Free Energy of Binding Estimated Inhibition Constant, Ki K] (1) Final Intermolecular Energy vdW + Hbond + desolv Energy Electrostatic Energy

= 23.171 A = =


= = =

-8.16 kcal/mol -6.75 kcal/mol -1.41 kcal/mol


91

USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15

(2) Final Total Internal Energy (3) Torsional Free Energy (4) Unbound System's Energy

= = =

-3.15 kcal/mol +2.74 kcal/mol -1.03 kcal/mol


= 19.850 A = =


= = = = = =

-7.91 -7.00 -0.91 -3.37 +2.74 -1.03



= 21.997 A = =


= = = = = =

-7.93 -6.45 -1.48 -3.16 +2.74 -1.03



= 22.002 A = =


= = = = = =

-7.27 -6.07 -1.20 -3.65 +2.74 -1.03


92 Run = 92 Cluster Rank = 9 Number of conformations in this cluster = 2 RMSD from reference structure Estimated Free Energy of Binding Estimated Inhibition Constant, Ki K]

= 19.252 A = =



92

USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.66 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.25 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.41 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.18 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +2.74 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -1.03 kcal/mol USER MODEL 66 USER Run = 66 USER Cluster Rank = 10 USER Number of conformations in this cluster = 6 USER USER RMSD from reference structure = 18.394 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -7.04 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 6.96 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.51 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.56 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -0.95 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.30 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +2.74 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -1.03 kcal/mol

9.4 Ligan RGR

LOWEST ENERGY DOCKED CONFORMATION from EACH CLUSTER Keeping original residue number (specified in the input PDBQ file) for outputting. MODEL 90 USER Run = 90 USER Cluster Rank = 1 USER Number of conformations in this cluster = 2 USER USER RMSD from reference structure = 21.400 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -7.50 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 3.20 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.61 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.47 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.14 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.48 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +2.74 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.84 kcal/mol USER MODEL 89 USER Run = 89 USER Cluster Rank = 2 USER Number of conformations in this cluster = 9 USER USER RMSD from reference structure = 20.933 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -7.35 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 4.12 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -10.18 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.85 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -2.33 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -0.76 kcal/mol


93

USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER

(3) Torsional Free Energy (4) Unbound System's Energy

= =

+2.74 kcal/mol -0.84 kcal/mol


= 20.333 A = =


= = = = = =

-8.06 -7.04 -1.02 -2.69 +2.74 -0.84



= 19.309 A = =


= = = = = =

-8.66 -7.29 -1.37 -2.01 +2.74 -0.84



= 19.248 A = =


= = = = = =

-8.56 -6.91 -1.65 -1.88 +2.74 -0.84



= 20.285 A = =



94

USER (1) Final Intermolecular Energy = -9.75 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.92 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.83 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -0.70 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +2.74 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.84 kcal/mol USER MODEL 79 USER Run = 79 USER Cluster Rank = 7 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 21.439 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.85 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 9.60 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.12 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.21 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -0.91 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.32 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +2.74 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.84 kcal/mol USER MODEL 1 USER Run = 1 USER Cluster Rank = 8 USER Number of conformations in this cluster = 3 USER USER RMSD from reference structure = 22.714 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.61 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 14.40 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -7.25 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.22 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.03 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.95 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +2.74 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.84 kcal/mol USER MODEL 91 USER Run = 91 USER Cluster Rank = 9 USER Number of conformations in this cluster = 3 USER USER RMSD from reference structure = 21.049 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.58 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 15.07 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.24 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.23 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -2.01 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -1.93 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +2.74 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.84 kcal/mol USER MODEL 17 USER Run = 17 USER Cluster Rank = 10 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 20.532 A USER


95

USER Estimated Free Energy of Binding USER Estimated Inhibition Constant, Ki 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy USER vdW + Hbond + desolv Energy USER Electrostatic Energy USER (2) Final Total Internal Energy USER (3) Torsional Free Energy USER (4) Unbound System's Energy

= =


= = = = = =

-7.08 -5.31 -1.78 -3.08 +2.74 -0.84


9.5 Ligan RTR LOWEST ENERGY DOCKED CONFORMATION from EACH CLUSTER Keeping original residue number (specified in the input PDBQ file) for outputting. MODEL 26 USER Run = 26 USER Cluster Rank = 1 USER Number of conformations in this cluster = 2 USER USER RMSD from reference structure = 23.466 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -7.69 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 2.31 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -10.06 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -8.35 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.71 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -1.72 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.79 kcal/mol USER MODEL 59 USER Run = 59 USER Cluster Rank = 2 USER Number of conformations in this cluster = 3 USER USER RMSD from reference structure = 22.148 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -7.06 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 6.66 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -9.98 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -8.32 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.66 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -1.17 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.79 kcal/mol USER MODEL 35 USER Run = 35 USER Cluster Rank = 3 USER Number of conformations in this cluster = 2 USER USER RMSD from reference structure = 17.414 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.86 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 9.38 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.04 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.70 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.33 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.91 kcal/mol


96

USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER

(3) Torsional Free Energy (4) Unbound System's Energy

= =

+3.29 kcal/mol -0.79 kcal/mol


= 20.368 A = =


= = = = = =

-8.44 -7.27 -1.17 -2.47 +3.29 -0.79



= 21.583 A = =


= = = = = =

-7.15 -6.48 -0.67 -3.33 +3.29 -0.79



= 19.552 A = =


= = = = = =

-7.66 -6.74 -0.92 -2.77 +3.29 -0.79



= 21.274 A = =



97

USER (1) Final Intermolecular Energy = -7.49 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.55 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -0.94 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.90 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.79 kcal/mol USER MODEL 31 USER Run = 31 USER Cluster Rank = 8 USER Number of conformations in this cluster = 3 USER USER RMSD from reference structure = 21.139 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.27 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 25.18 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.85 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.46 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.39 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -1.51 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.79 kcal/mol USER MODEL 52 USER Run = 52 USER Cluster Rank = 9 USER Number of conformations in this cluster = 2 USER USER RMSD from reference structure = 18.053 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.26 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 25.82 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.02 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.22 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -0.80 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.33 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.79 kcal/mol USER MODEL 62 USER Run = 62 USER Cluster Rank = 10 USER Number of conformations in this cluster = 3 USER USER RMSD from reference structure = 22.118 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.23 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 27.32 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -6.96 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.70 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -0.27 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.35 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.79 kcal/mol

9.6 Ligan TRR LOWEST ENERGY DOCKED CONFORMATION from EACH CLUSTER Keeping original residue number (specified in the input PDBQ file) for outputting.


98

MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER


= 20.116 A = =


= = = = = =

-9.11 -7.86 -1.26 -2.19 +3.29 -0.93



= 22.117 A = =


= = = = = =

-8.09 -7.22 -0.87 -3.01 +3.29 -0.93



= 18.845 A = =


= = = = = =

-7.92 -6.90 -1.02 -2.91 +3.29 -0.93


61 Run = 61 Cluster Rank = 4 Number of conformations in this cluster = 4 RMSD from reference structure Estimated Free Energy of Binding Estimated Inhibition Constant, Ki K] (1) Final Intermolecular Energy vdW + Hbond + desolv Energy

= 21.306 A = =


= =

-7.06 kcal/mol -6.14 kcal/mol


99

USER Electrostatic Energy = -0.92 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.50 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.93 kcal/mol USER MODEL 92 USER Run = 92 USER Cluster Rank = 5 USER Number of conformations in this cluster = 3 USER USER RMSD from reference structure = 19.643 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.33 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 22.93 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.08 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.16 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -0.92 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.46 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.93 kcal/mol USER MODEL 98 USER Run = 98 USER Cluster Rank = 6 USER Number of conformations in this cluster = 2 USER USER RMSD from reference structure = 21.850 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.29 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 24.37 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -7.13 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.34 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -0.79 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.38 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.93 kcal/mol USER MODEL 22 USER Run = 22 USER Cluster Rank = 7 USER Number of conformations in this cluster = 3 USER USER RMSD from reference structure = 19.138 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.25 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 26.03 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -7.87 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.26 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.62 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.60 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.93 kcal/mol USER MODEL 75 USER Run = 75 USER Cluster Rank = 8 USER Number of conformations in this cluster = 2 USER USER RMSD from reference structure = 20.372 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.19 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)]


100

USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 28.81 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -7.22 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.15 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.07 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.19 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.93 kcal/mol USER MODEL 76 USER Run = 76 USER Cluster Rank = 9 USER Number of conformations in this cluster = 5 USER USER RMSD from reference structure = 18.898 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.15 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 30.90 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.85 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.93 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -0.92 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -1.52 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.93 kcal/mol USER MODEL 29 USER Run = 29 USER Cluster Rank = 10 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 18.667 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.00 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 39.92 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -7.09 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.44 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -0.66 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.13 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +3.29 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.93 kcal/mol

9.7 Ligan KRK LOWEST ENERGY DOCKED CONFORMATION from EACH CLUSTER Keeping original residue number (specified in the input PDBQ file) for outputting. MODEL 47 USER Run = 47 USER Cluster Rank = 1 USER Number of conformations in this cluster = 6 USER USER RMSD from reference structure = 21.220 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -8.39 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 707.25 nM (nanomolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -11.32 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -9.31 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -2.00 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.27 kcal/mol


101

USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER

(3) Torsional Free Energy = +4.39 kcal/mol (4) Unbound System's Energy = -0.80 kcal/mol 20 Run = 20 Cluster Rank = 2 Number of conformations in this cluster = 1 RMSD from reference structure Estimated Free Energy of Binding Estimated Inhibition Constant, Ki K] (1) Final Intermolecular Energy vdW + Hbond + desolv Energy Electrostatic Energy (2) Final Total Internal Energy (3) Torsional Free Energy (4) Unbound System's Energy

= 23.176 A = =

= = = = = =


-11.23 -8.98 -2.25 -1.54 +4.39 -0.80



= 20.292 A = =

= = = = = =


-11.19 -9.16 -2.03 -0.97 +4.39 -0.80



= 21.222 A = =


= = = = = =

-9.27 -7.26 -2.01 -2.75 +4.39 -0.80


6 Run = 6 Cluster Rank = 5 Number of conformations in this cluster = 1 RMSD from reference structure Estimated Free Energy of Binding Estimated Inhibition Constant, Ki K] (1) Final Intermolecular Energy

= 23.022 A = =


=

-8.64 kcal/mol


102

USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.16 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.48 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.18 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.39 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.80 kcal/mol USER MODEL 28 USER Run = 28 USER Cluster Rank = 6 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 19.990 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.42 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 19.70 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.96 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.62 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.34 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.65 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.39 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.80 kcal/mol USER MODEL 32 USER Run = 32 USER Cluster Rank = 7 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 21.592 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.40 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 20.26 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -9.04 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.45 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.59 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.55 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.39 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.80 kcal/mol USER MODEL 84 USER Run = 84 USER Cluster Rank = 8 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 21.459 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.32 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 23.40 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -9.40 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.89 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.51 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -2.11 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.39 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.80 kcal/mol USER MODEL 83 USER Run = 83 USER Cluster Rank = 9 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 19.665 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.28 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)]


103

USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 24.79 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.48 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.45 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.03 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.00 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.39 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.80 kcal/mol USER MODEL 61 USER Run = 61 USER Cluster Rank = 10 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 22.954 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.25 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 26.24 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -10.58 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -8.90 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.68 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -0.86 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.39 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.80 kcal/mol USER

9.8 Ligan RRK LOWEST ENERGY DOCKED CONFORMATION from EACH CLUSTER Keeping original residue number (specified in the input PDBQ file) for outputting. MODEL 12 USER Run = 12 USER Cluster Rank = 1 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 16.046 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -7.48 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 3.28 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -9.43 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.11 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -2.32 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.03 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.12 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.86 kcal/mol USER MODEL 15 USER Run = 15 USER Cluster Rank = 2 USER Number of conformations in this cluster = 2 USER USER RMSD from reference structure = 15.812 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -7.38 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 3.86 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -9.48 kcal/mol


104

USER USER USER USER USER USER

vdW + Hbond + desolv Energy Electrostatic Energy (2) Final Total Internal Energy (3) Torsional Free Energy (4) Unbound System's Energy

= = = = =

-7.54 -1.94 -2.88 +4.12 -0.86

kcal/mol kcal/mol kcal/mol kcal/mol kcal/mol

MODEL 11 USER Run = 11 USER Cluster Rank = 3 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 17.991 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.90 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 8.71 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.70 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -7.51 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.19 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.17 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.12 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.86 kcal/mol USER MODEL 18 USER Run = 18 USER Cluster Rank = 4 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 14.453 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.85 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 9.58 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.41 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.79 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.61 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.41 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.12 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.86 kcal/mol USER MODEL 83 USER Run = 83 USER Cluster Rank = 5 USER Number of conformations in this cluster = 6 USER USER RMSD from reference structure = 17.766 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.83 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 9.83 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -8.73 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.36 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -2.37 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.08 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.12 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.86 kcal/mol USER MODEL 68 USER Run = 68 USER Cluster Rank = 6 USER Number of conformations in this cluster = 1 USER USER RMSD from reference structure = 18.623 A USER


105

USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER USER USER USER USER USER USER 298.15 USER USER USER USER USER USER USER USER MODEL USER USER

Estimated Free Energy of Binding Estimated Inhibition Constant, Ki K] (1) Final Intermolecular Energy vdW + Hbond + desolv Energy Electrostatic Energy (2) Final Total Internal Energy (3) Torsional Free Energy (4) Unbound System's Energy

= =


= = = = = =

-8.75 -6.96 -1.79 -2.71 +4.12 -0.86



= 17.264 A = =


= = = = = =

-8.60 -6.53 -2.07 -2.83 +4.12 -0.86



= 17.143 A = =


= = = = = =

-8.08 -5.81 -2.27 -3.34 +4.12 -0.86



= 17.879 A = =


= = = = = =

-8.79 -7.31 -1.48 -2.60 +4.12 -0.86


52 Run = 52 Cluster Rank = 10


106

USER Number of conformations in this cluster = 2 USER USER RMSD from reference structure = 19.085 A USER USER Estimated Free Energy of Binding = -6.34 kcal/mol [=(1)+(2)+(3)-(4)] USER Estimated Inhibition Constant, Ki = 22.52 uM (micromolar) [Temperature = 298.15 K] USER USER (1) Final Intermolecular Energy = -7.57 kcal/mol USER vdW + Hbond + desolv Energy = -6.16 kcal/mol USER Electrostatic Energy = -1.41 kcal/mol USER (2) Final Total Internal Energy = -3.74 kcal/mol USER (3) Torsional Free Energy = +4.12 kcal/mol USER (4) Unbound System's Energy = -0.86 kcal/mol


107

Lampiran 10. Bagan Kerja Penelitian

Pencarian Data PDB Struktur Tiga Dimensi Enzim NS3-NS2B Protease Virus Dengue

Visualisasi Letak Sisi Aktif dan Kofaktor

Analisis Binding Site dan Residu

Enzim NS3-NS2B Protease

Substrat Enzim NS3-NS2B Protease

Penentuan Sekuens Asam Amino Peptida sebagai Inhibitor

Perancangan Struktur Tiga Dimensi Peptida Siklis Sebagai Ligan

Optimasi Geometri dan Minimisasi Energi

Optimasi Geometri dan Minimisasi Energi

Struktur Tiga Dimensi Peptida Siklis

Struktur Tiga Dimensi Enzim NS3-NS2B

Penentuan Nilai Log P Peptida Siklis

Preparasi File Docking

Docking

Analisis Docking

Energi Ikatan dan Konstanta

Ikatan

Contact

Konformasi Ligan

Hidrogen

Residu

Terhadap Binding Site


108

Lampiran 11. Hubungan antara Nilai RMSD dengan Perbandingan Struktur RMSD (Ǻ)

Structure Comparison Comment

> 12

Completely unrelated

7.0

Dubius relationship

5.0

May be structurally related

4.0

Good structural relationship

2.0

Closely related

1.5

Very close related

0.8

Differences are not obvious

0.4

Essentially indistinguishable

(Sumber : Baxevanis dan Ouellette, 2005)


PERANCANGAN PEPTIDA SIKLIS SEBAGAI INHIBITOR POTENSIAL UNTUK ENZIM NS3-NS2B PROTEASE VIRUS DENGUE SECARA IN SILICO MELALUI MOLECULAR DOCKING

Recommend Documents