EEN IN VITRO STUDIE NAAR DE DRUKVERDELING IN HET METACARPOPHALANGEALE GEWRICHT GEDURENDE EEN GESIMULEERDE PAS IN STAP BIJ HET PAARD

EEN IN VITRO STUDIE NAAR DE DRUKVERDELING IN HET METACARPOPHALANGEALE GEWRICHT GEDURENDE EEN GESIMULEERDE PAS IN STAP BIJ HET PAARD. Marleen den Hartog

Juni 2008 Universiteit Utrecht Faculteit Diergeneeskunde Departement Gezondheidszorg Paard Onderzoekslijn Tissue Repair Drs. S.M. den Hartog Begeleiding: Dr. W. Back Dr. H. Brommer Prof. Dr. P.R. van Weeren

INHOUDSOPGAVE INHOUDSOPGAVE ....................................................................................................................2 VOORWOORD ...........................................................................................................................3 SUMMARY .................................................................................................................................4 SAMENVATTING........................................................................................................................5 INLEIDING..................................................................................................................................6 MATERIAAL EN METHODEN ....................................................................................................8 PAARDENBENEN .........................................................................................................................................8 RSSCAN ......................................................................................................................................................8 PRESSURE SENSITIVE FILM.......................................................................................................................10 DRUKBANK ................................................................................................................................................11 BEWEGING VAN HET PAARD IN VIVO .........................................................................................................13 POSITIES VAN HET BEEN ...........................................................................................................................15 GEWRICHTSHOEKEN .................................................................................................................................16 KRACHTEN ................................................................................................................................................20 MEETPUNTEN............................................................................................................................................21 CONTACTOPPERVLAK ...............................................................................................................................22 DATA-ANALYSE .........................................................................................................................................22 Coëfficiënt van Variatie.....................................................................................................................22 Mixed model analyse ........................................................................................................................22 Akaikes information criterion (AIC) .................................................................................................22 Correlatie ............................................................................................................................................22 RESULTATEN .......................................................................................................................... 33 DRUKPATROON ........................................................................................................................................ 23 CORRELATIES .......................................................................................................................................... 24 DISCUSSIE............................................................................................................................... 25 DANKWOORD.......................................................................................................................... 27 REFERENTIES ......................................................................................................................... 28 BIJLAGE 1: ARTIKEL .............................................................................................................. 33 BIJLAGE 2: FOTO RESULTATEN PAARD 1 T/M P8 OP POSITIE 1- 6 ................................... 40 BIJLAGE 3: PRESSURE SENSITIVE FILM IJKLIJN ................................................................ 41 BIJLAGE 4: HERHAALBAARHEIDS METING ......................................................................... 42 BIJLAGE 5: OVERZICHT VAN DE ABSOLUTE RESULTATEN............................................... 44 BIJLAGE 6: STATISTIEK; MIXED MODEL ANALYSIS.......................................................... 416

2

VOORWOORD Biomechanische invloeden spelen een belangrijke rol in de pathogenese van orthopedische problemen in de ondervoet van het paard (Palmer and Bertone 2006). Met name in de pathogenese van gewrichtsaandoeningen, zowel acute als chronische, wordt een belangrijke, primair initiërende rol toebedeeld aan het mechanisch milieu in het gewricht. In het kader van zowel het verder ontrafelen van de pathogenese als het instellen van therapeutische en preventieve maatregelen, is het van belang om exact te weten hoe het krachtenverloop in het paardenbeen is tijdens de voortbeweging. In het verleden is hier al veel onderzoek naar gedaan. Er is reeds gekeken hoe het van het paard beweegt (Back et al. 1995, 1996, Chateau et al. 2005, Clayton et al. 1998, Lanovaz et al. 1999), wat het effect is van spierkracht en ligamenten tijdens de beweging (Lawson et al. 2007) en hoe de hoef wordt neergezet (van Heel et al. 2005, Weller et al. 2006). Door Brama et al. (1999, 2001) is er in het kootgewricht gekeken naar de kraakbeenopbouw en de druk in het kootgewricht bij belasting tijdens verschillende gangen in de midstance. Van Heel et al. (2005) hebben het neerzetten van de hoef in draf in kaart gebracht. Echter welk effect de locomotie heeft op het krachtenverloop in het gewricht gedurende een complete pas is nog niet bekend, terwijl dit belangrijke informatie kan opleveren in het kader van een beter begrip van de ontwikkeling van gewrichtsaandoeningen. En aangezien het kootgewricht van het paard het belangrijkste gewricht is waar nogal eens problemen optreden, is ervoor gekozen om de belasting in het kootgewricht te bekijken tijdens een complete pas in stap. Uit bovenstaande volgt de volgende vraagstelling: ‘Wat is het relatieve drukverloop van de metacarpus III op phalanx I gedurende de normale beweging in stap van het voorbeen van het paard?’ Met acht kadaver paardenbenen, een pneumatische drukbank, een drukfilm, een computer en veel personele hulp is het drukverloop van MCIII op P1 gedurende de gehele belastingsfase van een pas gesimuleerd en het drukpatroon intra-articulair gemeten. Het drukpatroon dat wij hebben gevonden kon goed gerelateerd worden met eerdere resultaten gevonden door Brama, Brommer en van der Harst in kraakbeen en botstructuur (Brama et al. 1999, 2001, Brommer et al. 2003, 2005, van der Harst et al. 2005) en helpt wellicht bij het ontrafelen van de pathogenese van parasagittale stressfracturen van MCIII bij dravers (Riggs et al. 1999a, 1999b) en osteoarthrose (OA) in het kootgewricht (Pool 1996). In dit verslag zijn de materiaal en mehoden, de resultaten en de achterliggende gedachten van het onderzoek beschreven en bediscussieerd. Dit onderzoek is verwerkt tot een wetenschappelijk artikel dat in bijlage 1, achter in dit verslag, te lezen is. In de bijlagen zitten verder de meetresultaten en de grafieken.

3

SUMMARY Reasons for performing the study: The different biomechanical characteristics of articular cartilage in joints are supposed to be caused by topographical differences in loading (Brommer et al. 2003). In the metacarpophalangeal (MCP) joint under in vitro conditions Brama et al. (2001) observed a shift of the maximally loaded area from central to dorsal when mimicking walk, trot and canter. However, they only measured the midstance position. To further understand the development and spatial distribution of joint diseases such as osteoarthritis, insight in the loading pattern of articular cartilage during the complete stride is important. Objectives: To determine the loading pattern in the MCP joint in vitro while mimicking limb loading and joint angles as been reported at the walk. Methods: Eight left forelimbs from adult Dutch Warmblood horses (8.1±3.7 years) were transected transversely just distal to the deltoid tuberosity of the humerus. Limbs were positioned in a pneumatic loading device wich is outlined by a legally stamped loadcell and forces reported for the walk in vivo were simulated at six positions (P1-6). MCP joint angles were calculated from standardised digital pictures. The pressure distribution on the articular surface of P1 was measured at seven sites (S1-7) using intra- articularly placed pressure sensitive films (Fuji Prescale Film, Fuji Photo Film Co, USA). Assessment of film staining was performed by scanning and densitometric analysing (BioRad GS700 Imaging densitometer, GMI Inc, USA) using appropriate software (ImageJ, NIH, USA). Results: Pressures recorded after midstance (P4,5,6) are significantly (P<0.05) higher than those before (P1,2,3) and showed the biphasic loading pattern of the walk correlated with MCP joint angle (r= 0.153, P<0.05) and loading force (r= 0,267, P<0,05). Pressures measured at the beginning of the stance phase (P1) were comparable to those at the end (P6) for all sites, except for midway in the sagittal groove (S7). At S7 there was a linear increase in pressure during the entire stride. Medially (S4,5,6) the pressure distribution were significantly higher than laterally (S1,2,3) for dorsal (S1,4), central (S2,5) and palmar (S3,5) located sites (P<0.05). Potential relevance: Loading of the joint surface during the stride at walk grossly follows the joint angle and loading force, except for the central groove. Medially located sites are loaded more than laterally wich coincides with the locations where articular cartilage degeneration in the MCP joint is supposed to start (Brommer et al., 2003). The discrepancy between the loading of the central groove and the rest of the joint may result in large stress differences between these locations at the end of the stance phase, which may be related to the pathogenesis of stress fractures in the distal McIII.

4

SAMENVATTING Reden van de studie: Het verschil in biochemische structuur van het articulaire kraakbeen in gewrichten lijkt te komen door drukverschillen in het gewricht (Brommer et al. 2003). Brama et al. (2001) hebben een in vitro studie in het kootgewricht gedaan waarbij de krachten van de stap, draf, galop en het springen in midstance zijn gesimuleerd. Zij hebben hierbij een verschuiving gezien van het drukpatroon van centraal naar dorsaal op het proximale oppervlak van P1. Echter hebben zij enkel het been in de midstance positie gemeten. Om een beter inzicht te krijgen in de ontwikkeling en verspreiding van gewrichtsproblemen zoals osteoarthritis is het belangrijk om het drukpatroon gedurende de gehele pas te weten. Materiaal en Methoden: Acht linker kadaver voorbenen van volwassen KWPN paarden (8.1±3.7 jaar) zijn afgenomen net distaal van het deltoid tuberositas van de humerus. De benen zijn in 6 posities (P1-6) in een pneumatische drukbank geplaatst. Bij deze posities zijn krachten gegenereerd zoals bij het levende paard in stap. De hoek die het kootgewricht maakt is berekend vanuit gestandaardiseerde foto’ s. Het drukverloop op het articulaire oppervlak van P1 is gemeten met een intra-articulair geplaatste drukfilm (Pressure sensitive film; Fuji Prescale film, Fuji Photo Film Co, USA) en vergeleken aan de hand van 7 meetpunten (S1-7). Na inscannen van de drukfilm door een densitometer (Biorad GS700 Imaging densitometer, GMI, Inc, USA) is de film geanalyseerd met behulp van geschikte software (ImageJ, NIH, USA). Resultaten: De druk gemeten na de midstance (P4,5,6) zijn significant (P < 0.05) hoger dan de druk gemeten voor de midstance (P1,2,3). Allen laten het biphasische drukpatroon van de stap zien. Dit is gecorreleerd met de gewrichtshoek (r= 0.153, P< 0.05) en de krachten op het been (r= 0.267, P< 0.05). De druk gemeten aan het begin van de sta-fase (P1) is vergelijkbaar met de druk gemeten aan het einde van de sta-fase (P6). Echter de druk gemeten op meetpunt 7 wijkt hiervan af. Op dit meetpunt is er gedurende de gehele sta-fase een lineaire stijging in de drukbelasting op de sagittaalgroeve. Mediaal (S4,5,6) is de druk significant hoger dan lateraal (S1,2,3), voor zowel dorsaal (S1,4), centraal (S2,5) en palmair (S3,6) gelegen meetpunten (P < 0.05). Klinische relevantie: Het drukpatroon op het gewrichtsoppervlak gedurende een pas in stap volgt het patroon van de krachten die op het been zijn gezet en de gewrichtshoek van het kootgewricht, behalve in de sagittaalgroeve. Mediaal is hoger belast dan lateraal wat overeenkomt met het verloop van kraakbeendegeneratie in het kootgewricht (Brommer et al. 2003). Het verschil in druk op de fovea en de sagittaalgroeve bij de tweede helft van de sta-fase is wellicht gerelateerd aan de pathogenesis van stressfracturen in de distale metacarpus.

5

INLEIDING Paardendierenartsen zien in de praktijk vaak klinische problemen in/om het kootgewricht zoals osteochondrose, osteoarthritis en verrekkingen en rupturen van het kogel-draagapparaat (Poole 1996, Stashak 2002). Er wordt beschreven dat de hoge incidentie van problemen in het kootgewricht mogelijk wordt veroorzaakt door de hoge ‘range of motion’ van het kootgewricht tijdens de beweging met een relatief klein oppervlak van P1 ten opzichte van de grootte van het paard. Sport- en wedstrijdpaarden lijken een grotere kans te hebben op problemen in het kootgewricht en van de structuren die het kootgewricht passief stabiliseren, zoals de tendo interosseus en de sesambeensfixatiebanden (McIllwraight et al. 1996, Kawcak et al. 2000). Zo ziet men problemen van de tendo interosseus bij paarden uit verschillende takken van sport (Murray et al. 2006). Maar niet alleen sportpaarden krijgen te maken met problemen in het kootgewricht. Osteoarthritis in het kootgewricht is ook bij een populatie wilde paarden gevonden (Cantley et al. 1999). Biomechanische invloeden spelen een belangrijke rol in de pathogenese van gewrichtsaandoeningen. Zowel bij acute problemen zoals de fissuren in MCIII en P1, als chronische, zoals OA wordt een belangrijke, primair initiërende rol toebedeeld aan het mechanisch milieu in het gewricht. Het verschil in belasting in de verschillende delen van het gewricht lijkt verantwoordelijk te zijn voor de verschillen in de biochemische samenstelling van het kraakbeen (Brama et al. 2001), het subcondrale bot, het trabeculaire bot (Van der Harst et al. 2005) en de biomechanische eigenschappen van het kraakbeen en het bot (Brommer et al. 2005a). Bovendien heeft de ontwikkeling van kraakbeendegeneratie over het gewrichtsoppervlak van P1 een typisch verloop dat verklaard kan worden uit de typische gewrichtsbiomechanica van het kootgewricht: de dorsale en mediale delen van het proximale articulaire oppervlak van P1 en het articulaire distale oppervlak van MCIII worden het eerst aangedaan (Brommer et al. 2003, Poole 1996). Later komt er ook op het centrale en palmaire deel van P1 kraakbeenschade (Brommer et al. 2004, Poole 1996). Brama et al. hebben gezien dat bij de midstance van het paard bij toenemende belasting (vanuit stap via draf naar galop en het landen na een sprong) het contactoppervlak van MCIII op P1 groter wordt en de plaats van de belasting verschuift van centraal naar proximodorsaal (Brama et al. 2001). Er wordt gedacht dat centraal van P1 het bot continue belast wordt bij een lage belasting en dat bij hogere snelheden er een piekbelasting optreedt op het dorsale deel van P1 (Poole 1996). Echter welk effect de locomotie heeft op het krachtenverloop in het gewricht gedurende een complete pas is nog niet bekend, terwijl dit belangrijke informatie kan opleveren in het kader van een beter begrip van de ontwikkeling van gewrichtsaandoeningen. Met behulp van kinematische studies is er reeds gekeken hoe een paard beweegt tijdens de verschillende gangen (Back et al. 1995a, b, c, 1996, 1997, Lanovaz et al. 1999, Khumsap et al. 2002). Met 3D analyse methoden in vitro en in vivo heeft men de bewegingsmogelijkheden van het carpaal gewricht, het kootgewricht en de interphalangeale gewrichten bekeken (Chateau et al. 2001 en 2002, Clayton et al. 2004, 2007). Kinetisch is er met behulp van een force plate gekeken naar de krachten van de hoef op de grond tijdens de verschillende gangen van het paard (Schrijver et al. 1978, Merkens et al. 1986 en 1993, Schamhardt et al. 1994, McLaughlin et al. 1996, Clayton et al. 1998). Door analyses van footscan beelden in combinatie met de force plate is er gekeken hoe een levend paard met een gemiddelde gang zijn hoef neerzet tijdens het verloop van de beweging (van Heel et al. 2004). De krachten in de metacarpus tijdens

6

de beweging zijn berekend (Merrit et al. 2006). Echter, hoe de belasting van het been zich weerspiegelt in de krachtenverdeling in het gewricht gedurende een complete pas is helaas nog niet bekend Dit onderzoek richt zich op de drukverdeling in het metacarpophalangeale gewricht tijdens de belastingsfase van het paard in stap. Het is een in vitro studie waarmee de beweging wordt gesimuleerd door het been in meerdere posities in een pneumatische drukbank te plaatsen. De krachten, zoals die in vivo opgewekt worden tijdens de locomotie, worden door de drukbank gegenereerd. In het metacarpophalangeale gewricht is er een drukfilm geplaatst waarmee een statische druk tussen de botten bij 6 posities van het been gedurende de belastingsfase intra-articulair is gemeten.

7

MATERIAAL EN METHODEN Paardenbenen Het onderzoek is gedaan bij acht kadaver-voorbenen van Nederlandse warmbloed paarden (allen KWPN). De paarden zijn geeuthanaseerd voor andere redenen dan problemen aan het bewegingsstelsel. De benen zijn van paarden aangeboden aan de afdeling pathologie bij de Universiteit Utrecht en er is op dierenkliniek Lingehoeve Diergeneeskunde aan eigenaren van geeuthanaseerde paarden toestemming gevraagd voor het gebruik van de benen voor onderzoek. Het been werd net distaal van de tuberositas deltoidea van de humerus en proximaal van de oorsprong van de extensor carpi radialis doorgezaagd. Zo blijven de belangrijke pezen van het distale paardenbeen intact. De benen zijn binnen enkele uren na de dood afgenomen en na afname ingevroren op 20°C voor minimaal een week en maximaal 2 maanden. Voor de metingen werden de benen 24 uur op kamertemperatuur gelegd om te ontdooien. Voor de metingen zijn alle benen gewogen en de lengte opgemeten. De lengte is bepaald tussen twee markers; Marker 2 op het distale einde van de metacarpus ter hoogte van de aanhechting van het laterale collaterale ligament van het kootgewricht en marker 4 op de proximale radius ter hoogte van de aanhechting van de collateraalband van het ellebooggewricht. Voor opening van het gewricht zijn er geen overvullingen te zien van het kootgewricht. Na de metingen is het kootgewricht geopend om te z macroscopisch zijn er geen grote pathologieën gevonden die de metingen kunnen beïnvloeden. Voor de metingen zijn de hoeven bekapt waarbij speciaal gelet is op het vlak maken van de ondervlakte van de hoef. RsScan In eerste instantie werd beoogd het dynamisch intra-articulair meten van drukpatronen te realiseren m.b.v. drukmeetplaatjes van RsScan. De drukmeetplaatjes worden humaan gebruikt om de druk onder de voet in de schoen te meten tijdens het lopen. Daarbij registreert een computer de druk die de drukmeetplaatjes registreren tijdens het lopen. Voor het onderzoek is de vorm van de drukmeetplaatjes aangepast aan het oppervlak van P1. Het meetplaatje bestaat uit 3 oppervlakten. De twee buitenste hadden een grootte van 6 bij 2 cm, passend op de mediale en laterale fovea van P1. Een middelste plaat ter grootte van 6 bij 1 cm was passend voor gebruik in de sagittale sulcus. Het inbrengen van de drukmeetplaatsjes geschiedde via twee dorsale snedes van 2 cm lang, horizontaal en evenwijdig aan het gewrichtsvlak net mediaal en lateraal van de dorsale strekpees. Een derde snede van 1 cm lang werd gemaakt axiaal en verticaal in het verlengde van de tenocyten in de strekpees. Met deze kleine snedes bleven de verschillende delen van het drukmeetplaatje op de juiste plaats liggen gedurende het meten (zie Figuur 1). De 250 sensoren per mm2 registreren een dynamische druk uitgedrukt in MPa. Via een bluetooth signaal worden de drukken op de drukmeetplaat draadloos geregistreerd door de computer. De meetresultaten worden weergegeven in een 2D en 3D kleurenpatroon. Dit is hetzelfde patroon zoals Todd et al. (2007) hebben verkregen met een intraarticulaire drukmeetplaat van Tekscan (Tekscan Inc, Boston, MA). Het kleurenpatroon kan worden omgezet tot een excelsheet met drukwaarden. Dit wordt weergegeven in een frame met de druk (in MPa) op iedere mm2 iedere 0.01 ms uit de gemeten tijd.

8

Voorafgaand aan iedere meting zou het drukmeetplaatje worden gecalibreerd met een vooraf bekend gewicht. Deze calibratie zorgde echter voor niet voldoende betrouwbare metingen. De absolute getallen uit de verkregen excelsheet moeten worden geïnterpreteerd als relatieve waarden ten opzichte van de waarden tijdens dezelfde meting, op een ander deel van het oppervlak van de drukmeetplaat.

Figuur 1: Been in pneumatische drukbank met RsScan drukmeetplaat in het kootgewricht tijdens de pilotmeting.

Figuur 2: Drukmeetplaat RsScan. Druksensoren zitten in de 3 ‘vingers’.

Zoals op bovenstaande foto (Figuur 1) te zien is passen de drukmeetplaatjes goed in het gewricht. Zij bleven daar ook zitten tijdens de metingen. Echter bij een kracht van 250 kg (2500 N), gegenereerd door de drukbank, wordt door de drukmeetplaatjes over het gehele gewrichtsoppervlak een maximaal bereik aangegeven (een roodkleuring over het gehele oppervlak). De excelsheet met drukwaarden konden niet worden weergegeven. RsScan had niet de capaciteit om de drukmeetplaatjes voor het door ons beoogde doel aan te passen, waardoor er geswitched is naar een ander meetsysteem.

9

Pressure sensitive film Een pressure sensitive film (Fuji Prescale Film) is een zeer dunne drukfilm van < 200 µm welke bestaat uit een polyester basis met een coating van vele microcapsules gevuld met een rode kleurstof. Door het breken van de microcapsules binnen een bepaalde drukrange komt de rode kleurstof vrij op de polyester basis. De kleurintensiteit op de polyester basis is een maat voor de druk. Om alle krachten in het gewricht te kunnen meten zijn twee type films gebruikt net zoals in een eerdere studie naar de drukbelasting in het kootgewricht (Brama et al. 2001). Een low range film (2,5 tot 10 MPa) en een medium range film (10-50 MPa) zijn tegelijk in het gewricht gebracht. De films zijn op elkaar gelegd en gesealed in een dunne, flexibele, polyethyleen film (boterhamzakje). Om waterdichtheid te verkrijgen is er een eenlaags dunne, doorzichtige tape aangebracht. Via een snede aan de dorsale zijde van het gewricht zijn de films ingebracht. Hierbij is opgelet geen kraakbeenschade te maken en de collateraalbanden van het kootgewricht intact te laten. Om de drukfilm in te brengen (figuur 3) werd het been door twee personen gebogen, de drukfilm door de derde persoon zo ver mogelijk in het gewricht aangebracht om vervolgens het been te strekken en aan hoef en carpus te trekken tot voldoende ruimte is verkregen. Zonder druk op het been te zetten werd het been daarna in de drukbank geplaatst. De drukbank drukt de ingestelde kracht op de humerus waardoor het been de positie en kracht ondervindt als in de in vivo situatie. Een overzichtsfoto van de drukfilm na de metingen is te vinden in bijlage 2.

Figuur 3a Figuur 3b Figuur 3 Drukfilm in het gewricht. Op figuur 3a is een extra opengesneden gewricht te zien met de drukfilm ervoor gehouden om te visualiseren hoe de drukfilm het gewricht in gaat. Bij figuur 3b zit de drukfilm in het gewricht zoals bij een meting.

De films zijn na de metingen ingescand met een densitometer scanner (BioRad GS700 Imaging densitometer, GMI Inc, USA) met een scan- reproduceerbaarheid van 100%. Met het programma ImageJ (NIH, USA) zijn de roodkleuringen omgezet in een waarde op een schaal van 1 tot 4000. De metingen zijn ingescand met een ijklijn welke de druk weergeeft horende bij bepaalde kleurintensiteiten (zie bijlage 3). De benodigde ijklijn is gemaakt met gebruikmaking van een pressure algometer (FDK 60, Wagner instruments, Greenwich USA). Er is met een boormachine een lineair toenemende kracht gezet tussen de 3 en 30 kg (30 en 300 N) om een druk te genereren

10

op een oppervlak van 5 mm2 tussen de 6 en 60 MPa (zie Figuur 4a). Het oppervlak van de pressure algometer (d= 6,49mm) is geplaatst in een roestvrij stalen mal, waarbij het uitgeboorde gat (d= 6,52mm) in een exacte hoek van 90° op de ondergrond stond (zie Figuur 4b, c). Deze drukte op een titanium stempel (d= 6,51 mm) met een oppervlakte van 5 mm2 en een diameter van 2,52mm. De stempel kon wrijvingsvrij in de mal, loodrecht, verticaal naar beneden worden bewogen. Het geheel drukte op een vlak oppervlak waarop de pressure sensitive films bevestigd waren.

Figuur 4a Figuur 4b Figuur 4c Figuur 4: De opstelling voor de productie van de pressure sensitive film- ijklijn. Fig 3a toont de gehele opstelling. Fig 3b toont de mal; aan de binnenzijde de verplaatsbare mal vrij bewegend ten opzichte van de buitenste mal. De uitgeschoven mal-delen naast elkaar gezet op fig. 3c.

Drukbank Het been werd onder een bepaalde uitgerekende hoek zoals in de in vivo situatie in een pneumatische drukbank geplaatst welke een lineaire kracht van 0- 4500 N kan genereren (zie Figuur 5). De ingestelde kracht drukte maximaal op het been nadat het kootgewricht maximaal in extensie was. Het duurde tussen de 5 en de 15sec om deze kracht op het been te plaatsen zonder een verdere doortreding in de kogel. In Figuur 5 is een schematische tekening weergegeven van de opstelling. De drukopbouw komt van een luchtdrukbron die continue een luchtdruk van 10 bar geeft. De luchtdruk in bar die de kop van de drukbank naar beneden drukt kan variabel worden ingesteld. Het been wordt geplaatst tussen de kop van de drukbank en de hoef-vastzethouder die aan de drukbank vastgeschroefd was. De drukbank kan druk leveren in een hoek door de drukrichting van de loadceld te veranderen. Achterop de drukbank kan de verplaatsing van de hoek (in graden) worden afgelezen.

11

Figuur 5: schematische weergave opstelling van de pneumatische drukbank. Alvorens te beginnen aan een set metingen, wordt het been 5 maal in de drukbank gezet in de stand en belast met de kracht behorend bij de midstance fase in vivo . Een pas ontdooid been moet namelijk eerst enige malen worden opgerekt om een normale configuratie van het onderbeen te verkrijgen. Door kracht op het been te plaatsen zullen de peesvezels iets uitgerekt worden en kan het been de juiste houding aannemen (Rooney 1991). De drukbank is geijkt met behulp van een geijkte loadcell tussen de kop van de drukbank en de humerus. Deze geeft de krachten (in kg) weer die op dat moment de sensoren in de loadcell indrukken of uit elkaar trekken. De geijkte loadcell is vooraf gecalibreerd. Dit is drie maal herhaald op drie achtereenvolgende dagen. In Figuur 6 is de gebruikte ijklijn weergegeven.

Kracht (Kg)

400

200

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Druk (Bar)

Figuur 6: IJklijn drukbank. De ingestelde druk is uitgezet tegen de kracht die daarbij is neergezet op de humerus.

12

De hoef werd neergezet in een hoef-vast-zet-houder om wegschieten uit de drukbank te voorkomen. Het been heeft bij iedere meting in evenwicht gestaan en heeft hierdoor ‘los’ in de hoef-vast-zet-houder gestaan. Het been is in verschillende posities in de drukbank geplaatst, daarbij telkens dezelfde volgorde aanhoudend. Deze volgorde is dezelfde volgorde van plaatsing van het been tijdens de beweging van het paard in vivo. Beweging van het paard in vivo De stap is een vier-takt gang, waarbij drie benen tegelijkertijd op de grond staan en zowel voor als achterbenen ongeveer hetzelfde krachtenpatroon vertonen in de GRF (Clayton et al. 2004). De stap bevat geen zweefmoment zoals in de draf. Doordat er twee voorbenen tegelijkertijd actief op de grond staan volgt er een ander krachtenpatroon in de stap dan in de draf. De stap bevat een dip in de piek van GRF-Fz (zie Figuur7). Het andere voorbeen zorgt op dat moment voor een extra ‘push off’. Er ontstaat een extra flexie in het kootgewricht en de kracht van dat been op de grond neemt af (GRF- Fz dip). De tweede piek in de GRF-Fz ontstaat doordat het het been nu het 'push-off- been' is geworden voor het andere voorbeen. De eerste GRF-Fz piek komt doordat het been belast wordt door de zwaartekracht van het lichaam. De hoek van het kootgewricht neemt hetzelfde patroon aan als het krachtenpatroon onder de hoef (Schrijver et al. 1978). De snelheid van de pas is erg belangrijk bij dit krachtenpatroon. Een langzame stap geeft een duidelijkere GRF-Fz- dip van de bodem reactie kracht dan bij een snelle pas in stap. Het andere voorbeen geeft hierbij de 'push-off' niet meer mee omdat de pas korter wordt bij een snellere stap (Khumsap et al. 2002). Het andere voorbeen staat dan niet meer gelijktijdig op de grond. Het krachtenpatroon zal dan hetzelfde patroon aannemen als in de draf waarbij naarmate het lichaam meer op dat been steunt de kracht op het been en de bodem toeneemt. Bij iedere pas zal de hoef bij het ‘initial ground contact’ (d.i.: het eerste contact van een deel van de hoef met de grond) mediaal, lateraal of in het midden worden geplaatst (van Heel et al. 2004). Het paard gaat de hoef in de volgende 10% van de belastings-fase volledig belasten en zoekt hierbij zijn evenwicht. Nadat de hoef op de grond staat komt het lichaam ‘over het been heen’. Wanneer de pijp verticaal staat, 90° tov de grond, is de midstance bereikt (Clayton et al. 1998). Op ongeveer 80% van de belastings-fase zal de hoef nog helemaal op de grond staan. Vervolgens komt de hoef van de grond waarbij de palmaire zijde eerst van de grond wordt opgenomen. De breakover-fase is de rotatie van de hoef in de periode tussen ‘heel- lift- off’ tot de hoef net geheel van de grond is opgenomen (Parks et al. 2003). Een paard dat in rust vierkant staat draagt 28-33% van zijn lichaamsgewicht op ieder voorbeen. Hierbij staat de pijp verticaal (Parks et al. 2003). In Figuur 7 staan de gekozen momenten waarbij de beweging is gesimuleerd: (Bron: Merkens et al. 1986) - 1: Eerste moment waarbij de hoef totaal vlak op de ondergrond staat; op16% in de tijd van de totale belastingsfase-fase - 2: Eerste maximale Fz; op 25% in de tijd van de totale belastings-fase - 3: Eerste dip in de Fz; op 40% van de totale belastings-fase - 4: Midstance: Fy= 0; op 51% in de tijd van de totale belastings-fase - 5: Tweede maximale Fz; op 65% in de tijd van de totale belastings-fase - 6: Laatste moment waarbij de hoef totaal vlak op de ondergrond staat; op 76% in de tijd van de totale belastings-fase

13

Figuur 7: Verticale (Fz) en horizontale (Fy) van de hoef op de grond gedurende de stap op 16% (1), 25% (2), 40% (3), 51% (4), 65% (5), 76% (6) van de belastings-fase.

14

Posities van het been De kinematische en kinetische gegevens, die zijn gebruikt uit andere onderzoeken, zijn allen afkomstig van volwassen Nederlandse warmbloed paarden (KWPN) met een schofthoogte van ongeveer 1.65m., en een gewicht van 550 kg. Er is gekozen voor deze artikelen vanwege de verschillen die zijn gevonden bij force plate analyses en kinematiek bij paarden met verschillen in morfologie, gewicht, en schofthoogte (Merkens et al. 1986, McLaughlin et al. 1996, Dequeuerce et al. 1997, Hof et al. 2001, Weishaupt et al. 2004). Deze factoren zijn zo veel mogelijk constant gehouden om het experiment zo goed mogelijk te standaardiseren. Tijdens de zwaaifase zijn de krachten op de metacarpus te verwaarlozen (Merrit et al. 2006). Daarom zijn alleen posities uit de belastings-fase gesimuleerd. De posities zijn zo gekozen dat de in ieder geval de belangrijke momenten tijdens de belastings-fase worden gemeten. De gebruikte benen voor het onderzoek zijn gecontroleerd op afwijkingen in conformatie, zoals toontreden of een franse stand, door de stand van het been te evalueren in een voor-achterwaarste opname van het in de drukband geplaatste been (zie Figuur 8).

Figuur 8: Voor-achterwaartse opname van de in de drukbank geplaatste benen. Er waren geen afwijkingen in de conformatie zichtbaar.

15

Gewrichtshoeken Bij de simulatie van de pas zijn de hoeken die de verschillende gewrichten in het paardenbeen gedurende die pas aannemen van belang. Welke hoeken er gedurende de pas in vivo worden aangenomen in de verschillende gewrichten in een ’gemiddeld’ Nederlands warmbloed paard is door Back et al. (1996) beschreven. In het onderzoek van Back et al. (1996) werden volwassen warmbloed paarden gebruikt van gemiddeld 540 kg en 161 cm stokmaat en werd de stap geëvalueerd met een snelheid van 1,6 m/s. Dezelfde parameters worden in dit onderzoek gebruikt waardoor de in vitro meetresultaten kunnen worden vergeleken met de reeds bekende in vivo gegevens. Back et al. (1996) vonden een een biologische variatie in de grootte van de gewrichtshoeken in schouder, elleboog, carpus en kootgewricht, echter ieder individueel dier vertoonde wel hetzelfde herhaalbare patroon bij iedere pas (Back et al. 1995, Degueuerence et al. 1997). Het patroon van de gewrichtshoeken dient in vitro dan ook gemeten te worden. Het schoudergewricht is in dit onderzoek niet van toepassing daar het been in de humerus is doorgezaagd. De hoek van het ellebooggewricht wordt bepaald door de vorm van het articulaire oppervlak tussen radius/ulna en humerus en de collateraal ligamenten. Hierbij wordt gedurende de belastings-fase een stabiele positie aangenomen (Dyce et al. 1996). In de drukbank kan deze stabiele positie worden verkregen door de humerus net distaal van de tuberositas deltoida af te zagen. Deze lengte staat in verhouding met de lengte van hoef tot kootgewricht waardoor een stabiele positie in de drukbank wordt verkregen. Bij verandering van de hoek van het ellebooggewricht wordt de lengte van de buigpezen veranderd, en daarmee de mate van doortreding van het kootgewricht (Riemersma et al. 1996a). Wanneer de hoef volledig op de grond is geplaatst wordt de carpus volledig gestrekt. Deze hoek zal hierbij niet veranderen. Wanneer het been stabiel in de drukbank staat zal de carpus deze gestrekte positie aannemen. De gewrichtshoeken tussen phalanx I, II en III zijn niet bij de metingen beïnvloedbaar. Deze gewrichtshoeken worden vooral bepaald door de conformatie van het been en de mate van doortreden in het kootgewricht. Het kootgewricht is een ‘high motion’ gewricht waarbij de verschillende krachten gedurende de pas de mate van doortreding bepalen. Gezien de verschillen in kootgewrichtsextensie gedurende de belastingsfase van de pas, is het noodzakelijk de gewrichtshoek van dit gewricht bij iedere meting te controleren. De hoek waaronder de metingen zijn verricht staat weergegeven in Figuur 9. Middels een digitale opname wordt de positie van het been in de drukbank tijdens de meting vastgelegd. Door aanbrengen van uitwendig palpabele visuele markers (punaise met een reflecterende sticker) kan met behulp van het programma ImageJ (NIH, USA) uit deze foto de gewrichtshoeken worden bepaald. De markers zijn geplaatst op de volgende plaatsen (Back et al. 1996): 1) Op het meest laterale deel van de kroonrand: d.i. het rotatiepunt van het hoefgewricht. 2) Distale eind metacarpus t.h.v. aanhechting van het laterale collaterale ligament van het kootgewricht. 3) Het proximale eind van de metacarpus t.h.v. aanhechting van de laterale collateraalband van de carpus 4) Proximale radius t.h.v. aanhechting collateraalband van het ellebooggewricht.

16

Gezien de conformiteit van deze markerplaatsen met het onderzoek van Back et al. (1996) zijn opnieuw de resultaten in vivo en in vitro goed te vergelijken zijn. Om gestandaardiseerde foto’s te verkrijgen is de fotocamera op een statief geplaatst op 6 meter afstand loodrecht staande op de drukbank en focussed op het centrum van de drukbank. Figuur 9: Zijdelingse digitale opname t.b.v. de bepaling van de hoek in het kootgewricht.

Onderstaand is een vergelijking te zien (Figuur 10) tussen de 6 in vitro posities van het been in de drukbank met de positie van het been in vivo op dezelfde momenten van de belastingsfase. Het paard op de foto is een 12 jarige KWPN merrie met een stokmaat van 1.64m

17

18

Figuur 10: In vitro gesimuleerde pas in vergelijking met de positie van het been in vivo gedurende de belastingsfase in stap (van boven naar beneden: P1-P6).

19

Krachten De kracht welke op de humerus uitgeoefend moet worden in de resp. posities P1-P6 is uitgerekend uit de horizontale (Fy) en verticale (Fz) component van de ‘ground reaction force’ (GRF) (Schrijver et al. 1978), waarbij de zwaartekracht van het been zelf van de verticale component is afgetrokken. De GRF van de belangrijkste posities gedurende de belastingsfase van de stap is onttrokken uit het artikel van Merkens et al. (1986). Gewenste GRF in relatie tot uit te oefening belasting op het been: Segment = deel van een been ∑ F = msegment asegment F= kracht m= massa a= versnelling Het been moet in balans staan waarbij: Fv= √ (GRFz - Gsegment )2 + (GRFy)2 Gsement = msegment + g Fv = kracht gegenereerd door de drukbank GRFz = verticale kracht van de hoef op de grond in vivo GRFy = horizontale kracht van de hoef op de grond in vivo g= gravitatieconstante: 9.81 msegment= gewicht van het been asegment = 0: Aanname dat het been staande in de drukbank stil staat en dus geen versnelling heeft ∑ F = msegment asegment = 0 Fz = GRFz - Gsegment GRFz , te destilleren uit de force plate gegevens van onderzoek Merkens et al. 1986. Gsegment = msegment g msegment= gewicht van het been Bepaling van de F vector (i.c. grootte en richting, zie tabel 1): Grootte kracht: Fv= √ Fy2 + Fz2 Richting kracht: Tan α = Fz / Fy Bij de berekening is de aanname gemaakt dat het been uit 1 segment bestaat. Bij de exacte berekening moet rekening gehouden worden met een andere weerstand van bot, pezen, ligamenten, gewrichtsoppervlakten, met de afstand en de hoek die wordt gemaakt. Voor ieder been zijn deze gegevens door de biologische variatie verschillend. Echter, de fout die hierdoor geïntroduceerd wordt, is relatief klein ten opzichte van de krachten die zijn gebruikt.

20

Tabel 1: Gebruikte GRF Stap: Snelheid: 1.6 m/s. Tijd in de sta- Kracht: Fz GRF (N) fase (%)

(Merkens et al. 1986) Kracht: Fy Kracht: GRF (N) GRF (N)

16% 25% 40% 51% 65% 76%

561 N 388 N 205 N 0N 358 N 550 N

2530 N 2970 N 2646 N 3520 N 3575 N 2750 N

2544 N 2995 N 2654 N 3456 N 3528 N 2753 N

Fy Hoek F vector GRF (°) 77° 83° 86° 90° 84° 79°

Meetpunten De gekozen meetpunten (S1-S7) ten behoeve van de bepaling van de drukverdeling op het kraakbeenoppervlak van het kootgewricht zijn vergelijkbaar met de meetpunten gebruikt door Brommer et al. (2003). De posities, alle op gewrichtsoppervlak van de proximale phalanx (P1) zijn weergegeven in Figuur 11. Hierdoor kan een goede evaluatie gedaan worden tussen de belasting op het gewrichtsoppervlak en het verloop van kraakbeendegeneratie in het kader van osteoarthrose (AO) in het kootgewricht zoals reeds is bepaald door Brommer et al. (2003 en 2004) . Dit zijn relatief vlakke delen van het gewricht. Aan de randen van het gewricht en op de overgang van de fovea naar de sagittaalgroeve vertoont het kraakbeenoppervlak een nogal sterke curvatuur. Dit kan op deze plaatsen gemakkelijk een relatief hoge druk en daarmee een hoge intensiteit van de roodkleuring geven op de pressure sensitive film resulterend in over-interpretatie van de werkelijke druk op het kraabeen op deze plaatsen. In dat opzicht is het dus belangrijk om geen metingen te doen op plaatsen met een sterke curvatuur. De ingescande drukfilm is vervolgens op ware grootte van het gewricht op het computerscherm ingesteld en gecontroleerd met behulp van de grootte van de ijklijn. Op het computerscherm is daarna een mal geplaatst die de zeven meetpunten aangeeft. Op deze plaatsen is daarna de kleurintensiteit van deze sites met een oppervlakte van 8 mm2 gemeten. Met behulp van de ijklijn en software (Excel) worden de kleurintensiteiten van beide typen drukfilm omgerekend tot een druk in MPa.

Figuur 11: Meetpunten S1-7 op dorsale oppervlak van P1

21

Contactoppervlak Het berekenen van het contactoppervlak is gedaan met behulp van de low range pressure sensitive film. Het belastte gedeelte boven de 2,5 MPa, welke de ondergrens is van de low range film, is met behulp van ImageJ in een rechthoek van standaard grootte geplaatst. ImageJ gaf het percentage belast oppervlak in het rechthoek aan. Hiermee kan een vergelijking worden gemaakt tussen de posities binnen een pas. De percentages mogen niet als absolute waardes worden gezien. Data-analyse Bij toetsing van het meetsysteem moet bij dit onderzoek rekening gehouden worden met meerdere factoren. Er zijn 8 benen in 6 posities geplaatst, waarbij 7 meetpunten zijn vergeleken.

Coëfficiënt van Variatie De reproduceerbaarheid van de metingen is berekend met de coëfficiënt of variatie (CV). Bij deze berekening wordt de standaarddeviatie uitgedrukt als percentage van het gemiddelde. Een waarde van < 10% geeft aan dat het een voldoende betrouwbaar meetsysteem is. De standaarddeviatie van de verschillende meetpunten S1-S7 en posities van het been P1-P6 wordt gedeeld door het gemiddelde bij dezelfde meetpunten en standen. Deze getallen worden bij elkaar opgeteld en gedeeld door het totale aantal meetpunten waarmee is gerekend.

Bron: Mead et al. 1993

CV = coëfficiënt of variatie σ = standaard deviatie van dezelfde meetpunten in verschillende posities bij verschillende benen. x = gemiddelde MPa van dezelfde meetpunten in verschillende posities bij verschillende benen. n = totaal aantal meetpunten

Mixed model analyse Een mixed model analyse is geschikt om data met meerdere variabelen te evalueren waarbij een of meer afhankelijke variabelen voorkomen. De verschillende data zijn met elkaar vergeleken zoals bij de ANOVA analyse met gebruikmaking van SPSS software. Bij dit onderzoek zijn de verschillende benen een onafhankelijke variabele en de meetpunten en posities van het been zijn afhankelijke variabelen waarbij in deze statistische analyse rekening is gehouden. Er is een significantieniveau van 0.05 gehanteerd.

Akaikes information criterion (AIC) De AIC is bepaald om de betrouwbaarheid van de vergelijking van data uit verschillende groepen weer te geven. Hoe lager de waarde, hoe beter de vergelijking. Het is een relatief getal waarbij absolute waarden op zichzelf staand geen betekenis hebben.

Correlatie Correlatie coëfficiënten zijn bepaald tussen de -1 en +1, rekening houdend met de afhankelijke variabelen ‘positie’ en ‘meetpunt’, en gebruik makend van SPSS software.

22

Resultaten De gebruikte paardenbenen zijn vergelijkbaar in lengte (71 cm ± 2.9), gewicht (12.5 kg ± 0.9) en leeftijd (8.1 jaar ±3.7). De ijklijn van de pressure sensitive film is 6 maal herhaald met een coëfficiënt of variatie (CV) van 7.8% voor de medium range film en een CV van 4,2% voor de low range film. De reproduceerbaarheid van het meetsysteem zoals wij die hebben gehanteerd bevat een CV van 8.7%.

Drukpatroon Figuur 12 geeft het drukpatroon weer op het articulaire oppervlak van P1 bij de zes gesimuleerde posities van de belastingsfase van de stap. Er is een duidelijk verschil te zien voor en na de midstance voor vooral het dorsale deel van P1 (S1,4) en centraal in de sagittale groeve (S7). De drukken gemeten na de midstance (P4,5,6) zijn significant (P < 0.05) hoger dan de druk gemeten voor de midstance (P1,2,3). Mediaal (S4,5,6) is de druk significant hoger dan lateraal (S1,2,3), voor zowel de dorsaal (S1,4), centraal (S2,5) en palmair (S3,6) gelegen meetpunten (P < 0.05). De druk gemeten op S1-6 volgt allen hetzelfde biphasische krachtenpatroon van het been gedurende de stap (figuur 13). De druk gemeten aan het begin van de belastingsfase (P1) is vergelijkbaar als de druk gemeten aan het einde van de belastings-fase (P6). Echter de druk gemeten op meetpunt S7 wijkt hiervan af (Figuur 13). Bij vijf van de acht paarden is er gedurende de gehele belastings-fase een lineaire stijging in de drukbelasting op de sagittaalgroeve. Bij de andere drie paarden wordt de sagittaalgroeve niet belast. Vanwege de intra-individuele variatie is er relatief hoge standaarddeviatie (SD) gevonden, vooral op meetpunt 7 na de midstance. Er is geen correlatie tussen de druk op meetpunt S7 en de gewrichtshoek van het kootgewricht.

23

Figuur 13: Gemiddelde druk in MPa op meetpunt 1 t/m 6 en meetpunt 7 uitgezet tegen de 6 posities van het been.

Correlaties De gewrichtshoeken van het kootgewricht, het contactoppervlak en de gemeten druk op S1-6 lieten allen het biphasische patroon zien gedurende de belastings-fase van de stap. De opgelegde krachten door de drukbank op de humerus hebben een significante correlatie met de gewrichtshoeken (r= 0.399, P< 0.05), het contactoppervlak (r= 0.490, P< 0.05) en de druk op meetpunt S1-6 (r= 0.267, P< 0.05). Er was geen correlatie tussen de druk op meetpunt S7 met de opgelegde krachten door de drukbank, de gewrichtshoek of het contactoppervlak.

24

DISCUSSIE De coëfficiënt van variatie van 8,7% geeft aan dat het complete meetsysteem voldoende reproduceerbaar is en de bevindingen betrouwbaar zijn (Blake et al. 1999, Mead et al. 1993). De gevonden drukpatronen vertegenwoordigen de in vivo situatie, maar er zijn beperkingen aan de studie. Zoals bij ieder onderzoek zat er enige variatie in de resultaten. Dit kan door enige factoren worden verklaard. Door het gebruik van dode paardenbenen zijn de energie en krachten verschillend van de krachten in vivo. Er is geen impact loading, geen versnelling of vertraging in het been en het dode weefsel heeft een andere weerstand. Met bovenstaande in gedachten is de controle en evaluatie van de mate van doortreden van het MCP gewricht erg belangrijk. De doortreding van het MCP gewricht is ook afhankelijk van de conformatie van het been, de hoek van het ellebooggewricht (Riemersma et al. 1996, Dyce et al. 2001) en de passieve weerstand van de buigpezen en het kogel-draag-apparaat (McIlwraith 2002). De invloed van actieve spieractie in de belastings-fase kunnen waarschijnlijk worden genegeerd, maar de pezen kunnen stress-relaxatie bij in vitro belasting vertonen (Riemersma et al. 1996, Rooney 1991). Om dit ‘overstrekken’ van het MCP gewricht te voorkomen is het been maar enkele sesconden per positie belast. Het been stond in iedere positie in balans en de gemeten gewrichtshoeken zijn vergelijkbaar met de gewrichtshoeken als gemeten in vivo (Back et al. 1996). De gewrichten zijn allen na de metingen geopend en lieten toen geen grove pathologien zien die de variatie kan hebben veroorzaakt. Bij het gebruik van de pressure sensitive films is er een meetfout geïntroduceerd. Deze meetfout is in een eerder onderzoek uitgebreid bediscussieerd (Brama et al. 2001). De microcapsules in de pressure sensitive film zullen breken wanneer er een bepaalde druk is bereikt. De kleurintensiteit geeft de kracht weer op een bepaald oppervlak. Echter druk is niet al.leen afhankelijk van samendrukkende krachten, maar kan ook worden veroorzaakt door schuifkrachten (Driscoll et al. 1994). Hierdoor kunnen de microcapsules wellicht eerder breken dan het been de doorgetreden positie heeft aangenomen zoals het been in vivo staat. Geconcludeerd, moet er op worden gelet dat bepaalde delen van het proximale oppervlak van P1 niet wordt over- geïnterpreteerd. De scan en calibratie procedure zoals beschreven in de materiaal en methoden begrenst de mate van variatie. Maar niet alleen de absolute druk waarden werden gemeten, maar er is ook gekeken naar het drukpatroon. De laatste mogelijke bron van variatie is de vertaling van een 3-dimensionaal gewrichtsoppervlak naar een 2-dimensionale weergave. Dit kan een vertekening geven van de krachten op grillige, kleine oppervlakten. Hier is rekening mee gehouden door het strategisch bepalen van de meetpunten, welke allen op relatief vlakke oppervlakten gelegen zijn. Ons onderzoek is een vervolg van een eerder gepubliceerd onderzoek over de drukverdeling in het MCP gewricht bij verschillende belastingen van het paardenbeen tijdens de midstance (Brama et al. 2001). De correlaties tussen de gegenereerde belasting, contact-oppervlakten en MCP gewrichtshoeken, zoals gevonden in ons onderzoek, zijn vergelijkbaar met de bevindingen in dat onderzoek. Bij het meten van verschillende posities gedurende de belastings-fase zijn twee patronen opgevallen. Ten eerste het verschil in belasting tussen het midden van de sagittaalgroeve (S7) en de fovea (S1-6). Bij vijf van de acht benen vonden we bij de sagittaalgroeve (S7) een lineaire verhoging van de druk vanaf de midstance tot het opnemen van het been, terwijl de druk weer afneemt op de fovea (S1-6) in lijn met de afname in de mate van doortreding van het been na de midstance (Back et al. 1996). Het verschil in belasting tussen de sagittaalkam en de fovea kan een rol spelen bij de pathogenesis van parasagittale stress fracturen van PP en/of MCIII. De spontane intra-articulaire stressfracturen worden gezien bij dravers (Riggs 2006). Deze fracturen worden veelal

25

voorgegaan door veranderingen in subchondraal bot en kraakbeen structuur van de mediale en laterale condylen van MCIII (Riggs et al. 1996, Boyde and Firth 2008). De drukgradiënt aan het einde van de belastings-fase zoals in dit onderzoek is getoond kan goed passen in de theorieën die zijn geassocieerd met beweging op hoge snelheid samengaande met the pathogenese van deze fracturen (Riggs et al. 1999, Riggs 2006). Het tweede opgevallen patroon gevonden bij dit onderzoek is het verschil tussen mediale en laterale belasting van de proximale phalanx. Dit is in lijn met de verspreiding van kraakbeendegeneratie over het articulaire oppervlak van P1 bij voortschreidende OA (Brommer et al.. 2003 en 2004, Cantley et al. 1999). Kraakbeendegeneratie begint altijd aan het mediale deel van het MCP gewricht en zal daarna naar lateraal verspreiden. De mediale en laterale verschillen kunnen ook worden gerelateerd aan het voorkomen van de osteochondrale fragmentatie op het proximale oppervlak van P1, welke meer voorkomt aan de mediale zijde, zowel aan de dorsale als palmaire deel van het gewricht (Hardy et al. 1987, Kawcak and McIllwraith 1994, Petterson and Ryden 1982, Whitton and Kannegieter 1994). En fracturen aan MCIII hebben een predispositie voor de mediale zijde (Riggs 2006). Uit dit onderzoek kan worden geconcludeerd dat de belasting van het proximale oppervlak van P1 grotendeels de gewrichtshoeken van het MCP gewricht en het GRF patroon volgt, behalve het midden van de sagittaalgroeve. Het verschil in deze belasting kan zorgen voor een grote stress gradiënt tussen de sagittaalgroeve en de fovea aan het einde van de belastings-fase. Dit, samen met de bevinding dat het gewricht mediaal zwaarder wordt belast dan lateraal, kan wellicht helpen in de verdere ontrafeling van de pathogenese van parasagittale stressfracturen van de P1/ MCIII en het proces van OA in het MCP gewricht als dit wordt gezien in het licht van eerder gevonden structurele veranderingen in articulair kraakbeen en subchondraal bot (Freeman 1980, Hayes et al. 2001, Palmer en Bertone 1996, Radin 1983, Radin et al. 1972). Verder onderzoek kan zich concentreren op het simuleren van andere gangen dan de stap en/ of het dynamisch meten van intra-articulaire drukpatronen.

26

DANKWOORD Zonder de hulp van velen zal dit onderzoek nooit zo zijn geslaagd zoals het verslag nu voor u ligt. Daarom wil ik graag de volgende mensen ontzettend bedanken. - Dr Wim Back, Dr. Harold Brommer en Prof. Dr Rene van Weeren: ontzettend bedankt voor het eerste idee waar de stage mee is begonnen, het meedenken gedurende het gehele onderzoek, het in contact brengen met mensen die mij verder konden helpen en de altijd heel snelle, duidelijke en kritische reacties bij ideeën, vragen en het vinden voor oplossingen bij gevonden problemen en de resultatenverwerking. - Drs. Mark van Manen: voor het meedenken voor oplossingen bij problemen, voor de hulp bij het bedenken van de ijklijn voor de pressure sensitive film, het gebruik van je programma om de drukmeetplaatjes weer te geven en de gezellige extra hand bij metingen. - Drs. Marianne Boom, Drs. P. de Heus, Anna Elgersma, Drs. Hendrike Vreeman, Drs. Kim de Jong, Drs. Suzanne Walstock en Drs. Margreet Lameris voor het gezellige extra handje hulp die ik niet had en het meedenken voor oplossingen bij problemen. - De hoefsmeden Gerben Bronkhorst, Jan de Zwaan, Guido en Rene: voor de technische hulp met de drukbank, de ijklijn, het bekappen van de paardenbenen en de koffie. - Anton Grendel: voor de technische hulp bij de drukbank, het maken van het meetsysteem voor de ijklijn en het zagen van de humerus van verschillende paardenbenen. - Drs. Gerco Bosch: voor de hulp om de drukbank gebruiksklaar te maken. - Dr. Wim Kersten en Drs. Sander Gussekloo: voor het meezoeken naar en de hulp bij het laten werken van de loadcell. - Lingehoeve Diergeneeskunde: voor het mogen ophalen van paardenbenen - Louis van den Boom en Johan van Amerongen: voor het mogen ophalen van paardenbenen bij de pathologie. - Drs. Janny de Grauw voor het meedenken bij de opzet van het onderzoek. - Dr. Chris van der Lest: voor de hulp bij de scanapparatuur en het meedenken bij de meetmethode voor een ijklijn van de pressure sensitive film. - Dr. Meike van Heel: voor de hulp bij het dynamische drukmeetplaatje en de force plate data uit een eigen eerder onderzoek met je uitleg hiervan. - Drs. Patricia de Cocq: voor het meedenken naar verbeteringen in de materiaal en methoden van het onderzoek. - Marloes Verboven en Birgit Rietbergen: voor het uitlenen van allerlei materialen en vooral het fototoestel. - Otto van de technische dienst: voor het maken van een schroef-systeem om de loadcell in de drukbank te kunnen plaatsen. - De medewerkers van de ICT: voor het installeren van het programma voor de RsScan drukmeetplaat op de computer. - RsScan: voor het leveren van een dynamisch drukmeetplaatje - Prof. Dr. Pieter Brama: voor de uitleg van de problemen die ik wellicht tegen zal kunnen komen. - Prof. Dr. Elwin Firth: voor de kritische beoordeling van de meetresultaten van P1-P3. - Rozemarieke Vollebregt: voor het beschikbaar stellen van een deel van de vriezer om benen in te bewaren. - Alle sterke dierverzorgers: voor de hulp bij het neerleggen van benen op de hoogste plank in de vriezer. - Jan van den Broek: voor de hulp bij de statistische resultatenverwerking. - Gerrit Aartsen voor het meedenken bij de meetmethode en de fotocamera. - Alexandra Klarenbeek: voor het lenen van je paard voor de foto s in figuur 10.

27

REFERENTIES -

Back, W., Schamhardt, H.C., Savelberg, H.H.C.M., Van den Bogert, A.J., Bruin, G., Hartman, W., Barneveld, A. (1995a) How the horse moves: 1. Significance of graphical representations of equine forelimb kinematics. Equine Vet. J., 27 (1): 31-38

-

Back, W., Schamhardt, H.C., Savelberg, H.H.C.M., Van den Bogert, A.J., Bruin, G., Hartman, W., Barneveld, A. (1995b) How the horse moves: 2. Significance of graphical representations of equine hindlimb kinematics. Equine Vet. J. 27 (1): 39-45

-

Back, W., Schamhardt, H.C., Hartman, W., Bruin, G., Barneveld, A. (1995c) Predictive value of foal kinematics for the locomotor performance of adult horses. Research in Veterinary Science 59: 6469

-

Back, W., Schamhardt, H.C., Barneveld, A. (1996) Are kinematics of the walk related to the locomotion of a warmblood horse at the trot? The Vet. Quart. 2 (18): 79-84

-

Back, W., Schamhardt, H.C., Barneveld, A. (1997) Kinematic comparison of the leading and trailing fore- and hindlimbs at the canter. Equine Vet. J. 23: 80-83

-

Blake, G.M., Wahner H.W., Fogelman I. (1999) Assessment of instrument performance: precision, installation of new equipment and radiation dose. In: The evaluation of osteoporosis: dual energy, nd X-ray absorptiometry and ultrasound in clinical practice, 2 ed. Ed: Blake, G.M., Wahner, H.W., and Fogelman I. Martin Dunitz Ltd, London: pp 147-157.

-

Brama, P.A.J., Tekoppele, J.M., Bank, R.A., Van Weeren, P.R., Barneveld, A. (1999) Influence of site and age on biochemical characteristics of the collagen network of equine articular cartilage. Am. J. Vet. Res. 60: 31-345

-

Brama, P.A.J., Tekoppele, J.M., Bank, R.A., Karssenberg, D., Barneveld, A. Van Weeren, P.R.

(2000) Topographical mapping of biochemical properties of articular cartilage in the equine fetlock joint. Equine Vet J, 32(1):19-26 -

Brama, P.A.J., Karssenberg, D., Barneveld, A., Van Weeren, P.R. (2001) Contact areas and pressure distribution in the equine fetlock joint under various loading conditions. Equine Vet J, 33(1) 26-32.

-

Brommer, H., Van Weeren, P.R., Brama, P.A.J., Barneveld, A. (2003) Quantification and agerelated distribution of articular degeneration in the equine fetlock joint. Equine Vet. J. 35: 697-701

-

Brommer, H., Brama, P.A.J., Barneveld, A., Van Weeren, P.R. (2004) Differences in the topographical distribution of articular cartilage degeneration between the equine metacarpophalangeal joint and metatarsophalangeal joint. Equine Vet J, 36, 506-510

-

Brommer, H., Brama, P.A.J., Laasanen, M.S., Helminen, H.J., Van Weeren, P.R., Jurvelin. J.S. (2005a) Functional adaptation of articular cartilage from birth to maturity under the influence of loading: biomechanical analysis. Equine Vet. J. 37(5): 462-467

-

Brommer, H., Laasanen, M.S., Brama, P.A.J., Van Weeren, P.R., Helminen, H.J., Jurvelin, J.S. (2005b) Functional consequences of cartilage degeneration in the equine metacarpophalangeal joint: quantitative assessment of cartilage stiffness. Equine Vet. J. 37(5): 462-467

-

Brommer, H., Laasanen, M.S., Brama, P.A.J., Van Weeren, P.R., Helminen, H.J., Jurvelin, J.S. (2006) In situ en ex vivo evaluation of an arthroscopic indentation instrument to estimate the health status of articular cartilage in the equine metacarpophalangeal joint. Vet Surg. 35 (3): 259-266

-

Burton-Wurster, N., Vernier-Singer, M., Farquhar, T., and Lust, G. (1993) Effect of compressive loading and unloading on the synthesis of total protein, proteoglycan, and fibronectin by canine cartilage explants. J. Orthop. Res. 11, 717-729.

28

-

Cantley, C.E.L., Firth, E.C., Delahunt, J.W., Pfeiffer, D.U., Thompson, K.G. (1999) Naturally occurring osteoarthritis in the metacarpophalangeal joints of wild horses. Equine Vet. J. 31(1): 7381

-

Chateau, H., Degueurce, C., Jerbi, H., Crevier-Denoix, N., Pourcelot, P., Audigie, F., PasquiBoutard, V., Denoix, J.M. (2001) Normal three-dimensional behaviour of the metacarpophalangeal joint and the effect of uneven foot bearing. Equine Vet. J. 33: 84-88

-

Chateau, H., Degueurce, C., Jerbi, H., Crevier-Denoix, N., Pourcelot, P., Audigie, F., PasquiBoutard, V., Denoix, J.M (2002) Three-dimensional kinematics of the equine interphalangeal joints: articular impact of asymmetrical bearing. Vet. Res. 33: 371-382

-

Chateau, H., Degueurce, C., Denoix, J.M. (2005) Three-dimensional kinematics of the equine distal forelimb: effects of a sharp turn at the walk. Equine Veterinary J., 37 (1) 12-18.

-

Clayton, H.M., Lanovaz, J.L., Schamhardt, H.C., Willemen, M.A., Colborne, G.R., (1998) Net joint moments and powers in the equine forelimb during the stance phase of the trot. Equine Vet. J. 30(5): 384-389

-

Clayton, H.M., Sha, D., Stick, J.A., Mullineaux, D.R. (2004) Three-dimensional carpal kinematics of trotting horses. Equine Vet. J .36(8): 671-676

-

Clayton, H.M. (2004) The dynamic horse, a biomechanical guide to equine movement and performance. Sport Horse Publications, USA

-

Clayton, H.M., Sha, D., Stick, J., Elvin, N. (2007) 3D kinematics of the equine metacarpophalangeal joint at walk and trot. Vet. Comp. Orthop. Traumatol. (2): 86-91

-

Dequeurce, C., Pourcelot, P., Audigie, F., Denoix, J.M., Geiger, D. (1997) Variability of the limb joint patterns of sound horses at trot. Equine vet. J. Suppl. 23, 89-92.

-

Driscoll, H.L., Christensen, J.C., and Tencer, A.F., (1994) Contact characteristics of the ankle joint. Part 1. The normal joint. J. Am. Pod. Med. Ass. 84, 491-498.

-

Dyce, K.M., Sack, W.O., Wensing, C.J.G. (1996) Textbook of veterinary anatomy. Saunders USA, 2de ed. p. 81, 579

-

Easton, K.L., Kawcak, C.E. (2007) Evaluation of increased subchondral bone density in areas of contact in the metacarpophalangeal joint during joint loading in horses. AJVR 68( 8): 816-812

-

Freeman, M.A.R. (1980): The pathogenesis of idiopathic (‘primary’) osteoarthrosis: a hypothesis. In: The aetiopathogenesis of osteoarthritis. Ed: Nuki, G. Pitman Medical, Tunbridge Wells: pp 90-92

-

Hardy, J., Maroux, M. and Breton, L. (1987) Prevalence and description of articular cartilage fragments of the fetlock joint in the Standardbred horse. Med Vet Quebec 17, 57-61

-

Hayes (Jr) D.W., Brower, R., and John, K.J. (2001) Articular cartilage. Anatomy, injury, and repair. Clin. Podiatr. Med. Surg. 18, 35-53

-

Hof, A. L. (2001) Scaled energetics of locomotion In: Equine Locomotion Ed: Back, W., Clayton, H., st 1 ed., Saunders, USA, pp 351-364

-

Kawcak, C.E. and McIlwraith C.W. (1994) Proximodorsal first phalanx osteochondral chip fragmentation in 336 horses. Equine vet. J. 26, 393-396.

-

Kawcak, C.E., McIllwraight, C.W., Norrdin, R.W., Park, R.D., Steyn, P.S. (2000) Clinical effects of

exercise on subchondral bone of carpal and metacarpophalangeal joints in horses. AJVR 61(10) 1252-1258 -

Khumsap, S., Clayton, H.M., Lanovaz, J.L., Bouchey, M. (2002) Effect of walking velocity on forelimb kinematics and kinetics. Equine Vet. J. Suppl 34: 325-329

29

-

Kidd, J.A., Fuller, C., Barr, A.R.S. (2001) Osteoarthritis in the horse. Equine Vet. Educ. 13: 160-168

-

McKinley, T.O., Rudert, M.J., Koos, D.C., Pederssen, D.R., Baer, T.E., Brown, T.D. (2006) Incongruity-dependent changes of contact stress rates in human cadaveric ankles. J. Orthop Trauma 20:732-738

-

Lanovaz, J.L., Clayton, H.M., Colborne, G.R., Schamhardt, H.C. (1999) Forelimb kinematics and net joint moments during the swing phase of the trot. Equine Vet. J. 30: 235-239

-

Lawson, S.E.M., Chateau, H., Pourcelot, P., Denoix, J.M., Crevier-Denoix, N. (2007) Sensitivity of an equine distal limb model to pertuberations in tendon paths, origins and insertions. Journal of Biomechanics, 40(11):2510-6

-

McIlwraith, C.W. (2002) Disaeses of joints, tendons, ligaments, and related structures In: Adam’ s th Lameness in horses. Ed: Stashak, T.S., Williams and Wilkins, Lippincort, USA, 5 ed., pp 459- 644

-

McLaughlin, R., Gaughan, J.K., Skaggs, C.L. (1996) Effects of subject velocity on ground reaction force measurements and stance times in clinically sound horses at the walk and trot. AJVR 57: 7-1 11

-

Mead, R., Curnow, R.N., and Hasted, A.M. (1993) Control of random variation. In: Statistical methods in agriculture and experimental biology. Ed: Mead, R., Curnow, R.N., and Hasted A.M. Chapman and Hall, London, pp 59-87

-

Merkens, H.W., Schamhardt, H.C., Hartman, W., Kersjes, A.W. (1986) Ground reaction force patterns of dutch warmblood horses at normal walk. Equine Vet. J. 18: 207-214

-

Merkens, H.W., Schamhardt, H.C., Van Osch, G.J.V.M., Hartman, W. (1993) Ground reaction patterns of dutch warmbloods at canter. Am. J. Vet. Res. 54: 670-674

-

Merrit, J.S., Burvill, C.R., Pandy, M.G., Davies, H.M.S. (2006) Determination of mechanical loading components of the equine metacarpus from measurements of strain during walking. Equine Vet. J. Suppl. 36: 440-444

-

Murray, R.C., Dyson, S.J., Tranquille, C., Adams, V. (2006) Association of type of sport and performance level with anatomical site of ortopaedic injury diagnosis. Equine Vet J Suppl. 36: 411416

-

Palmer, J.L., and Bertone A.L (1996) Joint biomechanics in the pathogenesis of traumatic arthritis. In: Joint disease in the Horse, Eds: C.W. McIlwraith and G.W. Trotter, Saunders, Philadelphia, pp. 40-70

-

Palmoski, M.J. and Brandt, K.D. (1981) Running inhibits the reversal of atrophic changes in canine knee cartilage after removal of a leg cast. Arthritis Rheum. 24, 1329-1337.

-

Parks, A. (2003) Foot balance, conformation and lameness. In: Ross, M.W., Dyson, S.J.; Diagnosis and management of lameness in the horse 2003. Saunders, USA. p. 250.

-

Petterson, H. and Ryden, G (1982) Avulsion fragments of the caudoproximal extremity of the first phalanx. Equine vet. J. 14, 333-335.

-

Poole, R.R. (1996) Pathologic manifestations of joint disease in the athletic horse. In: Joint disease in the horse. Ed: McIlwraith, C.W., Trotter, G.W., Saunders, Philadelphia, USA. pp 87-10

-

Radin, E.L. (1983) The relationship between biological and mechanical factors in the etiology of osteoarthritis. J. Rheumatol. 9, 20-21.

-

Radin, E.L., Paul, I.L., and Rose, R.M. (1972) Role of mechanical factors in the pathogenesis of primary osteoarthritis. The Lancet 4, 519-522.

30

-

Riemersma, D.J., Van den Bogert, A.J., Jansen, M.O., Schamhardt, H.C. (1996a) Influence of shoeing on ground reaction forces and tendon strains in the forelimbs of ponies. Equine Vet J (28) 126-132

-

Riemersma, D.J., Van den Bogert, A.J., Jansen, M.O., Schamhardt, H.C. (1996b) Tendon strain in the forelimbs as a function of gait and ground reactions and in vitro limb loading in ponies. Equine veterinary journal (28) 133-138.

-

Riggs, C.M. (2006) Tutorial article; osteochondral injury and joint disease in the athletic horse. Equine Veterinary Education, 18(2) 100-112

-

Riggs, C.M. (1999a) Aetiopathogenesis of parasagittal fractures of the distal condyles of the third metacarpal and third metatarsal bones- review of the literature. Equine Vet J 31 (2): 116-120.

-

Riggs, C.M., Whitehouse, G.H., Boyde, A. (1999b) Structural variation of the distal condyles of the third metacarpal and third metatarsal bones in the horse. Equine Vet J 31 (2): 130-139

-

Rikli, D.A., Honingmann, P., Babst, R., Cristalli, A., Morlock, M.M., Mittlemeier, T. (2007) Intraarticular pressure measurement in the radioulnocarpal joint using a novel sensor: in vitro and in vivo results. The journal of hand surgery 32 (1) 67-75

-

Rooney, J.R. (1991) Veterinary Review: Stress relaxation of the equine forelimb in vitro. Equine Veterinary Science (11) 75-76.

-

Sah, R.L., Kim, Y.L., Doong, J.H.Y., Grodzinsky, A.J., Plaas, A.H.K., and Sandy, J.D. (1989) Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J. Orthop. Res. 7, 619-636.

-

Sah, R.L., Grodzinsky, A.J., Plaas, A.H.K., and Sandy, J.D. (1992) Effects of static and dynamic compression on matrix metabolism in cartilage explants. In: Articular cartilage and osteoarthritis. Eds: Kuettner, K.E., Peyron, J.G., Schleyerbach, R., and Hascal, V.C. Raven, New York: pp 373392.

-

Schamhardt, H.C., Merkens, H.W. (1994) Objective determination of ground contact of equine limbs at the walk and trot: comparison between ground reaction forces, accelerometer data and kinematics. Equine Vet. J. Suppl 17: 75-79

-

Schrijver, H.F., Bartel, D.L., Langrana, N., Lowe, J.E. (1978) Locomotion in the horse: kinematics and external and internal forces in the normal equine digit in the walk and trot. Am. J. Vet. Res. 39:1728-1733.

-

Stashak, T.S. (2002) Lameness In: Adam’ s Lameness in horses. Ed: Williams and Wilkins, th Lippincort, USA, 5 ed., pp 645- 1080

-

Thomas, C.M., Fuller, C.J., Whittles, C.E., Sharif, M. (2007) Chondrocyte death by apoptosis is associated with cartilage matrix degradation. Osteoarthritis and cartilage 15: 27-34

-

Torzilli, P.A., Grigiene, R., Huang, C., Friedman, S.M., Doty S.B., Boskey, A.L., and Lust, G. (1997) Characterization of cartilage metabolic response to static and dynamic stress using a mechanical explant test system. J. Biomech. 30, 1-9.

-

Van der Harst, M., Brama, P.A.J., Van de Lest, C.H.A., Kiers, G.H., de Groot, J., Van Weeren, P.R. (2004) An integral biochemical analysis of the main constituents of articular cartilage, subchondral and trabecular bone. Osteoarthritis and cartilage 12: 752-761

-

Van der Harst, M., Van de Lest, C.H.A., de Groot, J., Kiers, G.H., Bramam, P.A.J., Van Weeren, P.R (2005) Study of cartilage and bone layers of the bearing surface of the equine metacarpophalangeal joint relative to different timescales of maturity. Equine Vet. J. 37(3): 200-206

-

Van Heel, M.C.V., Barneveld, A., Van Weeren, P.R., Back, W. (2004) Dynamic pressure measurements for the detailed study of hoof balance: the effect of trimming. Equine Vet. J. 36(8):778-82

31

-

Van Heel, M.C.V, Van Weeren, P.R., Back, W. (2005) Shoeing sound warmblood horses with a rolled-toe optimiles hoof-unrollment and lowers peak loading during breakover. Equine Veterinary Journal, 38(3):258-262

-

Weishaupt, M.A., Wiestner, T., Hogg, H.P., Jordan, P., Auer, J.A. (2004) Vertical ground reaction force-time histories of sound warmblood horses trotting a treadmill. The Vet. J. 168: 304-311

-

Weller, R., Pfau, T., Babbage, D., Brittin, E., May, S., Wilson, A.M. (2006) Reliability of conformational measeruments in the horse using a three-dimensional motion analysis system. Equine Veterinary Journal 38(7) 610-615

-

Whitton, R.C. and Kannegieter, N.J. (1994) Osteochondral fragmentation of the plantar/palmar proximal aspect of the proximal phalanx in racing horses. Austr. vet. J. 71, 18-321.

-

Wilson, A.M., McGuigan, M.P., Su, A., Van den Bogert, A.J. (2001) Horses damp their spring in their step. Nature 414 (6866): 895-9

-

Wu, J.Z., Herzog, W. (2006) Analysis of the mechanical behavior of chondrocytes in unconfined compression tests for cyclic loading. J. of Biomech. 39: 603-616

32

BIJLAGE 1: Artikel; submitted Equine Veterinary Journal Supplement, march 2009

IN VITRO EVALUATION OF METACARPOPHALANGEAL JOINT LOADING DURING SIMULATED WALK S. Marleen den Hartog, Willem Back*, Harold Brommer, P. René van Weeren Department of Equine Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, The Netherlands. KEYWORDS: Metacarpophalangeal joint; Joint loading pattern; Walk; Joint disease; Osteoarthritis; Fractures

*) Corresponding author: W. Back, DVM, PhD, Cert. Pract. RNVA (Equine Practice), Dipl. RNVA (Equine Surgery), Dipl. ECVS Department of Equine Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, Yalelaan 114, NL-3584 CM Utrecht, The Netherlands P: *31-30-2531350 F: *31-30-2537970 M: *31-6-51437700 E: [email protected]

Summary Reasons for performing study: Insight in the loading pattern of the articular cartilage surface during the complete stride is important as biomechanical factors play a pivotal role in the pathogenesis of joint trauma and osteoarthritis (OA). Objectives: To determine the loading pattern in the equine MCP articulation in vitro during simulated walk. Methods: Eight cadaveric limbs from adult Dutch Warmblood horses were loaded in a pneumatic loading device in six different positions (P1-P6). The pressure distribution on the articular surface of the proximal phalanx (PP) was measured at seven sites (S1-7) using intra-articularly placed pressure sensitive films. Assessment of film staining was performed by scanning and densitometric analysis. Results: Pressures recorded after mid-stance (P4, 5, 6) were significantly (P<0.05) higher than those before (P1, 2, 3) and showed the biphasic loading pattern of the walk. Pressures measured at the beginning of the stance phase (P1) were comparable to those at the end (P6) for all sites, except for the site halfway in the sagittal groove (S7). At S7, there was a linear increase in pressure during the progress of the stance phase of the

33

stride. Medially (S4, 5, 6) the pressure was significantly higher than laterally (S1, 2, 3) for the dorsal (S1, 4), central (S2, 5) and palmar (S3, 6) sites (P<0.05). Conclusions and potential relevance: The discrepancy between the loading of the central groove and the other parts of the joint, supposedly occurring in other, faster gaits too, may result in large stress differences between these locations at the end of the stance phase, which might be related to the pathogenesis of stress fractures in the distal third metacarpal bone (MCIII). The medial sites are loaded more than the lateral, which coincides with the subsequent locations where articular cartilage degeneration in the process of OA in the equine MCP joint is known to start. Introduction It is well accepted that regular loading of articular cartilage within physiological limits throughout life is necessary to maintain normal joint homeostasis and function (BurtonWurster et al. 1993, Sah et al. 1989 and 1992, Torzilli et al. 1997). However, mechanical influences have been reported to be a major initiating factor as well in the development of cartilage pathology (Freeman 1980, Hayes et al. 2001, Palmer and Bertone 1996, Radin 1983, Radin et al. 1972). Damage of articular cartilage will occur when the applied load exceeds the load absorbing capacity of the tissue. Once a particular threshold level has been passed, with ensuing substantial damage to the collagen network, the cartilage will no longer withstand normal forces acting upon it (Palmoski and Brandt 1981). This loss of biomechanical function leading to cartilage fissures and subchondral/trabecular bone micro-cracks in an acute insult or, in cases when overloading is more chronic in nature, to the development of osteoarthritis (OA) (Palmer and Bertone 1996, Pool 1996). In performance horses, the metacarpophalangeal (MCP) joint is most prone to overloading (Pool 1996). The MCP joint has a relatively small cartilage surface area and a large range of motion. These factors, together with its distal position in the appendicular skeleton, make the MCP joint susceptible to trauma and subsequent development of OA (Pool 1996). Mimicking loads as occurring during walk, trot, canter and landing after a jump results in an increased contact area and a shift of the loading from central to proximo-dorsal on the proximal phalanx (PP) during mid-stance (Brama et al. 2001), but MCP-joint loading was determined only at the mid-stance position. Knowledge of changes in the magnitude of loading at different sites within the joint during the normal stride may be helpful to better understand the pathogenesis of joint trauma and OA. The aim of the present study was to determine the loading pattern in the equine MCP joint in vitro using intra-articular pressure-sensitive films again, while mimicking limb loading and joint angles representative of the entire stance phase of a complete stride at the walk. It was hypothesised that the biphasic pattern of ground reaction forces seen at the walk (Merkens et al. 1986) would be reflected in the joint loading pattern and that there would be significant differences in loading of palmar and dorsal sites, but not of lateral and medial sites at a given limb position. Materials and methods Collection and preparation of specimens Eight cadaveric forelimbs of adult Dutch warmblood horses (mean age + SD = 8.1 ± 3.7 years) euthanized for reasons other than MCP joint disease, were collected. After euthanasia, the limbs were cut transversely just distal to the deltoid tuberosity of the

34

humerus and frozen at -20°C. Before performing the measurements, the limbs were thawed for 24hr at environmental temperature, followed by corrective trimming of the hooves by a farrier. The limbs were checked for morphological uniformity by determining the weight and the length (defined as the distance between the level of attachment of the lateral collateral ligament of the metacarpophalangeal joint on the distal MCIII and the level of attachment of the lateral collateral ligament of the cubital joint on the proximal radius). Placement of intra-articular pressure sensitive films and calibration procedure Low range (2,5 – 10 MPa) and medium range (10-50 MPa) films were used (Fuji Prescale Film, Fuji Photo Film Co, USA). The films were cut according to the size of the joint and mounted in a moisture proof envelope made of a polyethylene seal and onelayer transparent tape. A five cm horizontal incision was made through the skin and the extensor tendon into at the dorsal aspect of the MCP joint and the film was inserted taking care not to disrupt the collateral ligaments. Calibration of the films was performed using a pressure algometer (FDK 60, Wagner instruments, Greenwich USA), of which the tip was placed in a custom made template of stainless steel. In the centre, a hole was drilled, through which a titanium stamp with a surface area of 5 square mm and a diameter of 2.52 mm could move. One end of the stamp made contact with the pressure algometer, the other end made contact with the pressure sensitive film that was fixated on a smooth surface. A linear force was created between 30 and 300 N at a surface area of 5 square mm to generate a pressure between 6 and 60 MPa, using a hand-assisted drill. After the measurements were performed, the films were simultaneously scanned with the calibration curve using a densitometer scanner (BioRad GS700 Imaging densitometer, GMI Inc, USA). ImageJ software (ImageJ, NIH, USA) was used to convert the red-color-intensities into a linear scale. Limb positions and determination of limb loading force characteristics Kinetic and kinematic data from warmblood horses in walk, as described in previously performed in vivo studies, were used (Merkens et al. 1986, McLaughlin et al. 1996, Degueurce et al. 1997, Hof 2001, Weishaupt et al. 2004). Only positions at the stance phase were recorded as forces during the swing phase of the stride can be neglected (Merrit et al. 2006). The stance phase was divided in 6 sub-phases that included the moment of first full initial contact of the hoof with the ground floor (P1), the first peak of the vertical component (Fz) of the ground reaction force (GRF) (P2), the dip of Fz (P3), midstance (P4), the second peak of Fz (P5), and the last moment of full contact of the hoof before heel lift from the ground floor (P6). The forces that were used to load the limb in a pneumatic loading device were calculated using the following formula: Fv= √ (GRFz - Gsegment )2 + (GRFy )2 , in which: Fv = force to be generated by the pneumatic loading device GRFz = vertical component of the GFR GRFY = horizontal component of the GFR Gsement = msegment x g, in which: msegment = mass of the transected limb and g = gravitation constant: 9.81 m/s2

35

Calculation of the direction of the force (α) relative to the bottom place of the pneumatic loading device was performed by using the formula: Tan α = Fz / Fy. Determination of MCP joint angle Markers were placed at the following locations, according to Back et al. (1996): 1. on the coronary band at the lateral side of the limb, i.c. at the joint centre of rotation of the coffin joint, 2. at the level of attachment of the lateral collateral ligament of the MCP joint on the distal MCIII, 3. at the level of attachment of the lateral collateral ligament of the carpal joints on the proximal MCIII, and 4. at the level of attachment of the lateral collateral ligament of the cubital joint on the proximal radius. Joint angles were calculated from digital photographs (photocamera: Nikon Imaging, Nikon coolpix SQ, NL) and using ImageJ software (ImageJ, NIH, USA). The position of the camera was standardised, using a tripod that was placed perpendicular to the lateral side of the limb, at 6 m distance and focussed at the centre of the pneumatic loading device. Loading procedure The limbs were placed and loaded in a pneumatic loading device, fixing the hoof of the limb at the bottom plate. For each position (P1-6), the calculated load that was imposed on the limb was measured using a loadcell. Loading increased linearly in 5-15 seconds to the pre-set force. To test the reproducibility of the system, every position was measured six times in one limb. In the other limbs, a single measurement was performed for every position. After the measurements were performed, the joints were dissected for evaluation of gross pathology. Contact area The ratio of the area loaded > 2.5 MPa relative to the entire cartilage surface of PP was calculated using ImageJ software. Data analysis Quantitative data were obtained from seven sites of each 8 square mm in size on the articular surface of PP (S1-7) with the following locations (Figure 1): S1 - dorsolateral (halfway between the lateral edge of the sagittal groove and the lateral border of the articular surface, adjacent to the dorsal articular margin), S2 - centrolateral (halfway between the lateral edge of the sagittal groove and the lateral border of the articular surface and halfway between the dorsal and palmar articular margin, S3 - palmarolateral (halfway between the lateral edge of the sagittal groove and the lateral border of the articular surface, adjacent to the palmar articular margin), S4, S5, and S6 – the same as S1, S2, and S3, respectively, but located medially, S7 - the centre of the sagittal groove and halfway between the dorsal and palmar articular margins. These locations were marked on a custom made mold and stuck over the acquired images of the pressure sensitive films. Data were expressed as mean + SD in MPa. As the inserted film did not exactly cover the entire articular surface of PP, the contact areas were interpreted as relative data: the percentage of contact area relative to the entire cartilage surface of PP with a threshold > 2,5 MPa using the low-pressure film. The reproducibility of the entire measurement system was evaluated and the coefficient of variance (CV) was calculated (Blake et al. 1999; Mead et al. 1993). Statistical analysis

36

was performed using SPSS software (SPSS version 14.0.1, SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA) with a level of significance at p< 0.05. A Mixed Model Analysis was used to test site differences. Partial correlation coefficients were calculated between the forces on the limb, joint angles, contact areas, and loading of the several sites, respectively. In all analyses, dependency of the variables in relation to all positions (P1-6) and sites (S1-7) were taken into account. Results The mean + SD of the length of the limbs was 71.0 ± 2.9 cm, the mean + SD of the weight was 12.5 ± 0.9 kg. The limbs did not show any gross pathology of the MCP joint. The CV of the entire measurement system was 8.7 %. Pressure distribution on PP Pressures at S1-S6 all followed the biphasic GRF pattern of the limb during walk, pressures measured at the beginning of the stance phase (P1) were comparable to those at the end (P6) for all sites, except for the site in the sagittal groove (S7) (Figure 2). Pressures recorded after midstance (P4, 5, 6) were significantly (P<0.05) higher than those before (P1, 2, 3). The pressures measured medially (S4, 5, 6) were significantly higher than laterally (S1, 2, 3) for the dorsal (S1, 4), central (S2, 5) and palmar (S3, 6) sites (P<0.05). A distinct difference in the loading pattern was seen at the sagittal groove (S7) (Figure 2). In five out of eight limbs, a linear increase in pressure during the entire stride at S7 was recorded. In three out of eight limbs, no pressure was recorded at S7. There was a significant partial correlation between the force generated by the pneumatic loading device and MCP joint angles (r= 0.399, P< 0.05), the contact area (r= 0.490, P< 0.05) and loading at S1-S6 (r= 0.267, P< 0.05). At S7, no such significant correlation was found. Discussion A CV of 8.7 % is indicative of an adequate reproducibility of the entire measurement system (Blake et al. 1999, Mead et al. 1993), which indicates that the findings are reliable. It is felt that the pressure patterns found represent the in vivo situation reasonably well, but there are of course limitations to this in vitro study. Nevertheless, as in every study there was variation in the outcome to some extent, which could be caused by several factors. Energy and forces in vitro differ from forces in vivo as there is a change in tissue resistance and there is no impact loading with concurrent deceleration characteristics. In this respect, control and evaluation of the extent of MCP joint extension was a very important factor in the study. Extension of the MCP joint depends on the conformation of the limb, the angle of the elbow joint (Riemersma et al. 1996, Dyce 2001) and the passive resistance of the digital flexor tendons and the suspensory ligament (McIlwraith 2002). The role of an active muscle at the stance phase can probably be ignored, but tendons will undergo stress relaxation during in vitro limb loading (Riemersma et al. 1996, Rooney 1991). The limb was exposed to the imposed forces for only a few seconds per position in order to prevent significant ‘overstretching’ of the MCP joint during repetitive loading. For this reason the limb stood in shear balance in every position, and the recorded MCP joint angles were comparable to values recorded

37

in vivo (Back et al. 1996). The MCP joints did not show any gross pathology that might have caused extra variance due to biological influences could be limited. The use of a pressure-sensitive films introduced an error source, which has been extensively discussed before (Brama et al. 2001). The microcapsules of the pressuresensitive films will break when a certain pressure level is reached and the colour intensity is proportional to the force applied in a certain area. However, pressure is not only generated by compressive forces, but could also be caused by shear forces (Driscoll et al. 1994). Therefore the microcapsules may break before the limb has reached the extended position, as the limb normally will have in vivo. As a result, loading at particular sites of PP could be over-interpreted to some extent. The calibration and scanning procedure according to the technique described in the M & M section limits this type of variation. Moreover, not only the absolute values of loading of PP were measured, but the loading patterns across the entire surface were also evaluated. A final error source may the translation of the 3-dimensional architecture of the joint surface to a 2 dimensional image. The error that will be induced through distortion of the image with increasing joint surface curvature. By strategically allocating the sites of interest on the articular surface of PP, i.e. all sites with relatively little cartilage curvatures, this error source could also be managed. Our study follow on a previously published study about pressure distribution in the MCP joint during loading (Brama et al. 2001). The correlation between loading, contact areas and joint extension angles, as found in our study, was in concordance with that study. The sequential measuring the pressure distribution during several phases of the weight bearing part of the stride, two phenomena were noted. First, the difference in loading pattern at halfway the sagittal groove (S7) was compared to the loading distribution at the other sites of interest (S1-S6). In five of eight specimens, a linear increase of the pressure at the sagittal groove (S7) from mid-stance to the take-off was found, whereas pressure decreased at the other sites (S1-S6) once the mid-stance position had passed, which is in concordance with a decrease of MCP joint angle in vivo (Back et al.1996). The apparent sharp increase in loading gradient between continuous sites (S7vs S3/S6) might play a role in the pathogenesis of parasagittal stress fractures of PP and/or MCIII. Spontaneous intra-articular parasagittal stressfracture of MCIII are known in racehorses (Riggs 2006). These are often preceded by structural changes that include sclerosis of subchondral bone of the medial and lateral condyles of McIIII (Riggs 1996, Boyde and Firth 2008). The substantial pressure gradient at the end of the stance phase as demonstrated in the present study may well fit in the theories associated with high-speed motion that have been proposed on the pathogenesis of these fractures (Riggs 1999, Riggs 2006). The second phenomenon that emerges from this study, is the medial to lateral difference in loading of PP. This is in line with the spread of cartilage degeneration across the articular surface of PP with progressing OA (Brommer et al. 2003 and 2004, Cantley et al. 1999). Cartilage degeneration invariably starts at the medial compartment of the MCP joint and will then spread to the lateral part. The medial to lateral differences may also be related with the occurrence of osteochondral fragmentation at PP where the medial side is more frequently than the lateral side, both at the dorsal and palmar joint margin (Hardy et al. 1987, Kawcak and McIlwraith 1994, Petterson and Ryden 1982, Whitton and

38

Kannegieter 1994). Lastly, it is in agreement with the predominantly medial location of the McIII fractures alluded to above (Riggs 1996). It can be concluded that loading of the joint surface of PP grossly follows the joint angle and GRF patterns, except for the central groove. The discrepancy between the loading of the central groove and the other parts of the joint may result in a large stress gradient between these locations at the end of the stance phase. This, together with the finding that the joint is medially heavier loaded than laterally, may be of help in further unravelling the pathogenesis of parasagittal fractures of PP/MCIII and the process of OA in the MCP joint when interpreted in the light of previously found structural changes in articular cartilage and subchondral bone (Freeman 1980, Hayes et al. 2001, Palmer and Bertone 1996, Radin 1983, Radin et al. 1972). Further steps could mimic loads and limb positions in other gaits than the walk and/or measure joint loading pattern dynamically. Acknowledgements The authors would like to make a thank Drs. M.P.T. van Manen, Drs. M. Boom, Drs. P. de Heus, Dr. C.H.A. van de Lest and Anton Grendel for their assistance during the study.

39

BIJLAGE 2: Foto resultaten Paard 1 t/m P8 op positie 1- 6

Overzichtsfoto drukfilm metingen paard 1 t/m 8; de verschillende paardenbenen liggen onder elkaar (Limb 1-8), Gelegen van links naar rechts op positie 1 t/m 6 (P1-6). De bovenste rij is de low film, waaronder de medium film uit dezelfde meting is gelegd.

40

BIJLAGE 3: Pressure sensitive film ijklijn IJKLIJN LOW FILM 4.000

3.600 3.200

Kleurintensiteit

2.800

2.400 ijklijn 1 ijklijn 2

2.000

ijklijn 3 ijklijn 4

1.600

1.200

800

400

0 0

1

2

3

4

5

MPa

IJKLIJN MEDIUM FILM 4.000

3.600 3.200

kleurintensiteit

2.800

2.400 ijklijn 1 ijklijn 2

2.000

ijklijn 3 ijklijn 4

1.600

1.200

800 400

0 11.8

17.7

23.5

29.4

35.3

MPa

Excel Windows XP

41

BIJLAGE 4: Herhaalbaarheids meting Positie 1/ Meting Meetpunten 1

Positie 2/ Meting Meetpunten

Positie 3/ Meting Meetpunten

Positie 4/ Meting Meetpunten

1 6,5 2 14,8 3 11,4 4 5 16,1 6 7 26,4 1 1 8,1 2 15,6 3 10,6 4 3 5 19,5 6 33,1 7 29,1 1 1 6,1 2 11,2 3 10 4 5 17,8 6 11,8 7 31,3 1 1 10,5 2 22,4 3 14,9 4 4,9 5 23,2 6 27,6

2 7 14,1 10

3 6,4 10 10

4 4,2 10 10

5 4,8 13,2 10

6 5,4 12,8 10

15,6 17,9 24,6 2 6,7 13,9 11,1

13,1 17,5 15,7 3 7,5 13,1 10

11,5 23 16,9 4 4,3 11,9 10

13,8 17,8 16,4 5 8,8 13,5 10

15 19,6

14,4 16,7

15 13,5

16,1 23

11,5 17,6 18,1 6 9,1 12,7 10 3 15 21,7

21,2 2 3,7 12,1 10 2,6 15 22 23 2

18,1 3 6,5 9,6 10

19,3 4 4,3 12,3 10

23,3 5 5,1 10,1 10

19 6 6,3 14,1 10

13,7 14 16,6 3

13,2 11 22,6 4

13,9 12 20,3 5

15,4 15,9 21,4 6

11,8 17,7 10,4 6,4

7,5 ng 20,4 10 ng ng

13,5

9,5 21 11,2

9,1 18,4 10 3

22 25,5

21,9 24,6

16 16,9

19,4 22,6

17,8 27,7

7 41,6 27,7 27,2 19,3 26,2 23,4 1 2 3 4 5 6 1 9,6 11,4 6,2 8,3 9,3 9,8 2 14,3 23,1 22,6 18,7 24,6 21,8 3 9,9 12,8 10,5 10 10,2 10,7 4 5,1 3,1 4,4 5,3 5 19,6 19,7 23,8 21,9 23,8 21,1 6 19,5 16,7 19,1 22,7 26,7 21,8 7 37,9 27 29,2 30,6 31,4 26,7 1 2 3 4 5 6 Positie 6/ Meting Meetpunten 1 8,6 6,2 7,6 5,4 6 5,4 2 25,8 15,1 11,1 12,3 14,6 11,4 3 13,1 10,1 10 10 10 10 4 2,7 3,3 5 27,5 14,4 14,2 12,6 13,2 13,3 6 27,5 13,6 14,8 7,8 12,9 17,7 7 41,3 27,1 27,6 26,4 23,9 28,1 CV= 8,6 % Leeg vak= < 2.5 MPa; 10= >10 MPa low range + <10 MPa medium range film; ng= niet gemeten Positie 5/ Meting Meetpunten

42

Gewrichtshoeken metacarpophalangeaal gewricht Positie 1: 16% 2: 25% 3: 40% 4: 51% 5: 65% 6: 76%

Meting1 26.7 36.0 34.0 31.2 37.3 29.5

Meting 2 Meting 3 36.6 33.2 35.3 31.7 34.7 37.0 38.3 41.6 36.6 41.6 30.4

Meting 4 34.2 36.0 35.9 41.5 38.7 31.1

Meting 5 34.1 35.0 35.0 38.3 35.6 34.4

Meting 6 35.4 40.1 37.7 40.6 39.2 36.2

4

5

6

75,1 81,2 72,7

73 82,9 75,6 81,2 79,9 73,4

59,4 76,7 73,3 76,5 78,4 78,3

Relatief contact oppervlak >2,5 MPa Meting Positie 1 2 3 4 5 6

1

2

75 71,2 67,1 79,4 76,8 75,9

78 77,9 73,6 79,5 84,4 80,1

3 80,4 82,2 79,7 80,8 * 80,8 80,7

80,8 75,6

CV= 2.30 %

*Een leeg vak door een meetfout bij enkel de low film range- film.

Overzichtsfoto drukmeetplaatjes: van boven naar beneden Meting 1 t/m 6, van links naar rechts positie 1 t/m 6. De meest rode drukmeetplaatjes zijn van de low range film (2,5-10 MPa), de rij daaronder liggen de medium range film (10-50 MPa) uit dezelfde meting. Meting 4, positie 4, low film is geheel wit vanwege een verkeerde plaatsing van de drukfilm tijdens de meting waardoor deze blanco is gebleven.

43

BIJLAGE 5: Overzicht van de absolute resultaten (druk, gewrichtshoek en relatief contactoppervlak) geranschikt per been, positie en site

Excel Windows XP m ee tpunt 4; m e diaal/dorsaal

m eetpunt 1: lateraal/dorsaal 20

25

18 16

20

14 12

15

10

10

8 6

5

4 2

0

0

1

2

3

4

5

1

6

2

3

4

5

6

m eetpunt 5: m ediaal/centraal

m eetpunt 2: lateraal/centraal 25

25 20

20 15

15

10

10

5

5

0

0

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

6

m ee tpunt 6: m ediaal/palm air

m eetpunt 3: lateraal/palm air 30

20 18

25

16 14

20

12 15

10 8

10

6 4

5

2 0

0

1

2

3

4

5

1

6

2

3

4

5

6

m e e tpunt 7: ce ntraal/s agittaalk am 30 25 20 15 10 5 0 1

2

3

4

5

6

44

100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

KRACHT (Newton)

RELATIEVE GEM. OPPERVLAKTEN

OPPERVLAKTE GEWRICHTSOPPERVLAK / KRACHT OP BEEN

GEM. OPPERVLAKTE KRACHT OP BEEN

500 0 1

2

3

4

5

6

POSITIE BEEN (P1-6)

Relatieve contactoppervlak uitgezet tegen de krachten die op de humerus zijn gegenereerd door de drukbank op de 6 posities waarin het been is geplaatst.

GEWRICHTSHOEK

HOEK (in graden)

60 50 40 30 20 10 0 1

2

3

4

5

6

POSITIE BEEN (P1-6) Hoek kootgewricht op de 6 posities waarin het been is geplaatst

45

BIJLAGE 6: Statistiek; Mixed Model Analyse Vergelijking:

Positie:

Voor (P1-3) en na (P4-6) de midstance met elkaar vergeleken. Meetpunt: Dorsaal vergeleken met centraal en palmair als 1 groep Centraal vergeleken met dorsaal en palmair als 1 groep Palmair vergeleken met dorsaal en centraal als 1 groep Mediaal en lateraal vergeleken Meetpunt 1-6 vergeleken met meetpunt 7 Positie met Meetpunt: Meetpunten met posities vergeleken.

Gele kleuring: P- waarde < 0.05.

Positie Voor/na midstance

Voor/na midstance

meetpunt dorsaal

centraal

Voor/na Midstance

palmair

Voor/na midstance

lateraal/ mediaal

Voor/na midstance

MP1-6 vs MP7

AIC 1680 pos dorsaal pos x dorsaal

Significantie type III test fixed effects. (P-waarde)

Significantie estimates fixed effects (P-waarde)

0,000 0,034

0,016 0,106

0,872

0,872

1683 pos centraal pos x centraal

0,000 0,253

0,002 0,200

0,504

0,504

1684 pos palmair pos x palmair

0,000 0,335

0,033 0,743

0,616

0,616

1669 pos lat/med lat/med x pos

0,000 0,000

0,019 0,054

0,267

0,267

0,000

0,007

0,738

0,357

1962 pos MP1-6 vs MP7 pos x MP1-6 vs MP7 Uitgangswaarde AIC: 1896

0,321

0,321

SPSS 14.0.1

46