Mendelova univerzita v Brn Agronomická fakulta Ústav molekulární biologie a radiobiologie
Cytokininy ve vývoji Arabidopsis p i nízkých intenzitách sv tla Bakalá ská práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
doc. RNDr. B etislav Brzobohatý, Csc.
Irena Neumannová
Brno 2010
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem záv re nou práci na téma „Cytokininy ve vývoji Arabidopsis p i nízkých intenzitách sv tla“ vypracovala samostatn a použila jen pramen , které cituji a uvádím v p iloženém seznamu literatury.
Dne…………. Podpis studenta…………..
POD KOVÁNÍ
Cht la bych pod kovat doc. RNDr. B etislavu Brzobohatému, Csc., vedoucímu mé bakalá ské práce a Mgr. Alen Rekové za odborné vedení, cenné rady a za pomoc p i laboratorní práci.
ABSTRAKT Cílem bakalá ské práce bylo zpracování p ehledu hormonální kontroly odpov di rostlin k nízkým intenzitám sv tla, biosyntézy a metabolismu cytokinin , jejich funkce a signalizace v rostlinách. Cytokininy jsou fytohormony, které ovliv ují adu r stových a vývojových proces , jako je nap . bun né d lení, regenerace orgán , apikální dominance a zpomalení stárnutí. Za r zných sv telných podmínek mají cytokininy odlišný vliv na r st a vývoj rostlin. Praktická ást bakalá ské práce je v nována vlivu interakce cytokinin a nízké intenzity sv tla na fotomorfogenezi klí ních rostlin Arabidopsis thaliana. Délky hypokotyl byly m eny u jedenáctidenních klí ních rostlin kontrolní linie a mutantních crf liní p stovaných na médiu s nebo bez p ídavku cytokininu trans-zeatinu. U crf mutantních linií bylo pozorováno prodlužování hypokotyl v p ítomnosti trans-zeatinu v podobném rozsahu jako u kontrolních rostlin, CRF se tedy pravd podobn neú astní prodlužování hypokotyl .
Klí ová slova: Arabidopsis, cytokininy, hypokotyl, sv tlo
ABSTRACT The aim of the bachleor thesis was to review hormonal regulation of plant response to decreased light intensities, cytokinin biosynthesis, metabolism, functions and signalling in plants. Cytokinins are phytohormons, which affect the number of growth and development processes, e.g. cell division, organ regeneration, apical dominance and leaf senescence. Under different light conditions the effect of cytokinins on plant growth and development is dissimilar. The practical part of the thesis was focused on the effect of cytokinins and decreased light intensity on photomorphogenesis of Arabidopsis thaliana seedlings. The length of hypocotyls was measured for 11 day old seedlings of control and crf loss-offunction mutants cultivated on media with or without cytokinin trans-zeatin. The hypocotyl elongation in the control and mutant seedlings was comparable on the media supplemented with trans-zeatin implicating that CRFs do not seem to participace in hypokotyl elongation.
Key words: Arabidopsis, cytokinins, hypocotyl, light
OBSAH 1 POUŽITÉ ZKRATKY................................................................................................... 9 2 ÚVOD.......................................................................................................................... 12 3 LITERÁRNÍ P EHLED ............................................................................................. 14 3.1 R stové regulátory................................................................................................. 14 3.1.1 Cytokininy ..................................................................................................... 14 3.1.1.1 Historie.................................................................................................... 14 3.1.1.2 Rozd lení ................................................................................................ 15 3.1.1.3 Funkce..................................................................................................... 18 3.1.1.4 Biosyntéza............................................................................................... 19 3.1.1.5 Metabolismus.......................................................................................... 21 3.1.1.6 Transport................................................................................................. 22 3.2 Cytokininová signalizace....................................................................................... 22 3.3 Faktory odpov di na cytokininy ............................................................................ 25 3.4 Sv tlo..................................................................................................................... 25 3.4.1 Dopad spolup sobení sv tla a fytohormon na morfogenezi rostlin ............ 27 3.5 Arabidopsis thaliana ............................................................................................. 29 4 METODIKA ................................................................................................................ 30 4.1 Rostlinný materiál ................................................................................................. 30 4.2 Podmínky kultivace rostlin.................................................................................... 30 4.3 Kontrola homogenity sv tla .................................................................................. 31 4.4 M ení délek hypokotyl ....................................................................................... 32 4.5 Kvantitativní (Q) RT-PCR .................................................................................... 33 4.5.1 Sb r materiálu ................................................................................................ 33 4.5.2 Izolace RNA .................................................................................................. 33 4.5.3 M ení koncentrace RNA a výpo et istoty .................................................. 34
4.5.4 Reverzní transkripce ...................................................................................... 34 4.5.5 Kvantitativní (Q) PCR ................................................................................... 35 5 VÝSLEDKY A DISKUSE .......................................................................................... 37 5.1 Vliv homogenity intenzity sv tla a exogenních cytokinin
na dlouživý r st
hypokotyl Arabidopsis thaliana ................................................................................ 37 5.2 Vliv mutací v genech CRF na dlouživý r st hypokotyl Arabidopsis thaliana.... 39 5.2.1 Výb r vhodné koncentrace cytokininu .......................................................... 39 5.2.2 Prodlužování hypokotyl
klí ních rostlin kultivovaných na tZ p i nízké
intenzit sv tla ........................................................................................................ 41 5.3 Srovnání citlivosti CSD v i cytokinin m p i standardní a snížené intenzit sv tla............................................................................................................................ 43 6 ZÁV R ........................................................................................................................ 46 7 POUŽITÁ LITERATURA .......................................................................................... 47 8 SEZNAM OBRÁZK ................................................................................................. 54 9 SEZNAM TABULEK ................................................................................................. 54 10 P ÍLOHY .................................................................................................................. 55
1 POUŽITÉ ZKRATKY ADP
adenosindifosfát
AGI
The Arabidopsis genome initiative
AHK
Arabidopsis histidin kinasa
AHP
Arabidopsis histidin obsahující fosfotransferový protein
AMP
adenosinmonofosfát
AP2/ERF
t ída transkrip ních faktor
ARR
Arabidopsis regulátor odpov di
ARR5
molekulární marker pro cytokininy
Asp
aspartát
ATP
adenosintrifosfát
BA
benzyladenin
cDNA
komplementární DNA
CK
cytokinin
CKX
cytokinonoxidasa/dehyrogenasa
CRF
faktory odpov di na cytokininy
crf
genová rodina CRF
CRY
kryptochrom
CSD
cytokinin signální dráha
cZ
cis-zeatin
dATP
deoxyadenosintrifosfát
dCTP
deoxycytosintrifosfát
dd
redestilovaná voda
DEPC
0,05% diethylpyrokarbonát
dGTP
deoxyguanintrifosfát
DH
délka hypokotylu v milimetrech
DMAPP
dimetylalyldifosfát
DMSO
dimethylsulfoxid
DNA
deoxyribonukleová kyselina
dNTP
sm s deoxynukleotidtrifosfát
dsDNA
dvou et zcová DNA
DTT
dithiotreitol
dTTP
deoxythymintrifosfát
DZ
dihydrozeatin
ERF
etylen odpov dné faktory
FAD
flavin adenin dinukleotid
FSB
first strand buffer
His
histidin
HK
histidin kinasa
HMBDP
hydroxymethyldifostátbutenyl
HPT
histidin fosfotransferový protein
iP
isopentenyladenin
iPMP
isopentenyladenosin-5'-monofosfát
iPRDP
isopentenyribosid-5´-difosfát
iPRTD
isopentenyribosid-5´-trifosfát
IPT
isopentenyltransferasa
kLux
kilolux
LT
labaratorní teplota
mT
meta-topolin
memT
meta-methoxytopolin
meoT
ortho-methoxytopolin
MEP
methylerythritolfosfátová cesta
MS
Murashige and Skoog médium
MVA
mevalonová cesta
n
haploidní sada chromozom
oT
ortho-topolin
P450
cytochrom monioxydasa
PCR
polymerázová et zová reakce
PHR
amino terminální fotolyasa
PHY
fytochrom
Pr
fytochrom absorbující zá ení o vlnové délce 660 nm
Pfr
fytochrom absorbující zá ení o vlnové délce 730 nm
Q-PCR
kvantitativní PCR
RH
délka hypokotylu v relativních hodnotách
RR
regulátor odpov di
RT
reverzní transkripce
RTP
primer pro reverzní traskriptasu
SE
standardní chyba
SS II
reverzní transkriptasa Superscript II
tRNA
transferová ribonukleová kyselina
tRNA-IPT
isopentenyltransferasa-tRNA
TSC
dvou-komponentní systém
tZ
trans-zeatin
UBQ10
referen ní gen, exprimující se ve všech pletivech stejn
2 ÚVOD R st je jedním z nejcharakteristi t jších projev života organism , tedy i rostlin. Rozumí se jím nevratná kvantitativní zm na spojená s funkcemi živé hmoty, zv tšování objemu a hmotnosti nových bun k. R st je t sn spjat s diferenciací, tj. se zm nami struktury, s utvá ením jednotlivých pletiv a orgán rostlinného t la. Diferenciací se obecn
rozumí rozlišování p vodních d livých (meristematických) pletiv ve
specializovaná, nabývání rozdílné struktury a funkcí a vytvá ení uspo ádanosti rostlinného t la (Machá ková, 1998). R st a diferenciace se prolínají v asové ose individuálního vývoje organismu, jde tedy o komplexní zm ny probíhající v konkrétním organismu od jeho vzniku do jeho zániku (Machá ková, 1998). Rostliny rostou za ur itých podmínek. Faktory, které ovliv ují r st jsou rozd leny na vn jší a vnit ní. Mezi vn jší faktory se adí teplota, sv tlo, zne išt né prost edí, dostupnost vody a živin. K vnit ním faktor m pat í zejména p irozené r stové regulátory. R stovými regulátory jsou obecn
nazývány látky, které regulují r stové
a vývojové procesy u rostlin. Tyto látky lze rozd lit do dvou skupin, na p irozené (nativní) a um lé (syntetické). Mezi r stové regulátory se adí rostlinné hormony (fytohormony) cytokininy, auxiny, gibereliny, ethylen a kyselina abscisová. Každý z fytohormon ovliv uje n kolik asto odlišných proces a naopak, týž proces bývá ovlivn n v tším po tem r zných látek (Machá ková, 1998). Cytokininy byly objeveny prof. Fredem Skoogem v 50. letech 20. století p i rozvoji technik rostlinných tká ových kultur na University of Wisconsin, USA. V rostlinách se vyskytují bu jako volné látky, nebo jsou sou ástí molekuly tRNA. Po chemické stránce jsou to substituované deriváty adeninu. Podle postranního et zce, který se p ipojuje v poloze N6, se d lí na isoprenoidní a aromatické. V rostlinách se ast ji vyskytují cytokininy isoprenoidní. Cytokininy hrají d ležitou roli v procesech r stu a vývoje rostlin. Mezi jejich nejd ležit jší funkce pat í stimulace bun ného d lení a v tvení, dále odnožování rostlin, iniciace r stu adventivních pupen (potla ení apikální dominance), oddálení stárnutí pletiv (potla ení senescence), klí ení semen a mnoho dalších (Mok a Mok 1994; Khodakavskaya a kol., 2005; Li a kol., 1992). Také bylo zjišt no, že cytokininy 12
p sobí na fyziologické procesy a na vývoj v interakci s ostatními fytohormony, zejména auxinem (McGaw a kol., 1988; Moubayidin a kol., 2009; Pernisová a kol., 2009).
Cílem mé bakalá ské práce bylo seznámení se s problematikou hormonální kontroly odpov di rostlin k nízkým intenzitám sv tla metodou kvantitativní RT-PCR. Literární p ehled je v nován hormonální kontrole odpov di rostlin k nízkým intenzitám sv tla, biosyntéze a metabolismu cytokinin , jejich funkci, signální dráze a kone n vnímání sv tla rostlinami. Praktická ást zahrnuje vyhodnocení vlivu cytokinin na fenotypové a molekulární odpov di k nízkým intenzitám sv tla u modelové rostliny Arabidopsis thaliana.
13
3 LITERÁRNÍ P EHLED
3.1 R stové regulátory Nativní r stové regulátory si rostlina vytvá í sama. Jsou ozna ovány fytohormony. Syntetické r stové regulátory nejsou sou ástí metabolismu rostlin. V obou p ípadech p sobí na r st rostlin bu
povzbudiv (stimulátory) nebo brzdiv
(inhibitory) (Procházka a kol., 2006). Jedná se o organické slou eniny, které jsou po syntéze v jedné
ásti rostliny transportovány do jiné její
ásti a ve velmi malé
koncentraci zp sobují fyziologickou reakci. O objev a po áte ní výzkum fytohormon
se nejvíce zasloužila holandská
fyziologická škola F. W. Wenta, ameri ané F. Skoog a K. V. Thimann a další chemici a botanici. K objevu fytohormon p isp la i eská botanická škola profesor Bohumila N mce a Rudolfa Dostála (Procházka a Šebánek, 1997). Historicky se rozlišuje p t základních skupin endogenních r stových regulátor , které jsou považovány za fytohormony. Jsou to cytokininy, gibereliny, auxiny, kyseliny abscisová a ehtylen. Mezi r stové regulátory jsou dále azeny i brassinosteroidy a kyseliny jasmonová. Cytokininy, gibereliny a auxiny p sobí p evážn stimula n , naproti tomu kyselina abscisová a ethylen p sobí inhibi n (Procházka a kol., 2006). Mimo skupiny existují v rostlinách další látky regulující r st, které nejsou azeny mezi fytohormony, nebo
jsou ú inné ve vyšších koncentracích. Pat í sem zejména
polyaminy, oligosacharidy a skupina fenolických látek (Machá ková, 1998).
3.1.1 Cytokininy
3.1.1.1 Historie Objev cytokinin
vycházel z poznatk
rakouského rostlinného fyziologa
G. Haberlandta, který roku 1913 prokázal, že z floému difundují látky indukující r st (meristemizaci) parenchymatického pletiva bramborových hlíz (Kamínek, 1997). Na po átku padesátých let dvacátého století byly testovány a hledány látky, které by mohly ovliv ovat bun né d lení – cytokinezi. Tyto látky byly proto pojmenovány cytokininy
14
(CK). Od jejich objevu bylo prokázáno, že mají vliv na mnoho jiných fyziologických a vývojových proces . V letech 1940 a 1950 pracovní skupina prof. Freda Skooga na University of Wisconsin, USA, vyvinula citlivý biotest založený na stimulaci bun ného d lení v explantované stonkové d eni tabáku. D e tabáku byla kultivována na médiu obsahující minerální látky, sacharózu, n které vitamíny a auxin. Bu ky d e ového parenchymu se d lily pouze po p idání látek s cytokininovou aktivitou (Jablonski a Skoog, 1954). Testováním r zných biologických materiál byl vytipován bohatý zdroj cytokinin (Miller a kol., 1956). Autoklávovaná DNA spermií sled m la silný podp rný ú inek na bun né d lení (Taiz a Zeiger, 2002; Amasino, 2005; Miller a kol., 1955; Miyawaki, 2004). Rozborem této autoklávované DNA byla v laborato i prof. Skooga identifikována slou enina 6-furfurylaminopurin, nazvaná kinetin (Taiz a Zeiger, 2002). I když nebylo prokázáno, že je kinetin p irozený cytokinin, byly jeho pomocí definovány biologické funkce a fyziologické ú inky cytokinin . V p ítomnosti auxinu cytokininy stimulují množení bun k. Kinetin je velmi ú inná látka, ale pozd ji se zjistilo, že se v rostlinách p irozen nevyskytuje, ale jedná se o odpadní látku tepelné degradace DNA (Miller a kol., 1956). V šedesátých letech byla objevena látka, která m la podobné ú inky a strukturu jako kinetin. Tato látka byla izolována z endospermu nedozrálých obilek kuku ice (Zea mays) a byla pojmenována zeatin - trans-6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino) purin. Je nejhojn ji se vyskytujícím cytokininem ve vyšších rostlinách a stejn jako v p ípad kinetinu jde o derivát adeninu (Letham, 1973). Díky dvojné vazb na postranním et zci se m že zeatin vyskytovat ve dvou konfiguracích, cis a trans. Ve vyšších rostlinách se vyskytují ob formy zeatinu.
3.1.1.2 Rozd lení V sou asné dob je známo více než padesát p irozených cytokinin . Cytokininy jsou rozd lovány podle n kolika hledisek. Dle p vodu na nativní a syntetické, dle charakteru postranního et zce na isoprenoidní a aromatické. Nativní cytokininy jsou deriváty aminopurinu, které nesou postranní et zec v poloze N6. Pat í mezi n transzeatin, isopentenyladenin, dihydrozeatin a topoliny. K syntetickým se adí kinetin, benzyladenin a thidiazuron. Isoprenoidní cytokininy nesou v poloze N6 p tiuhlíkatý
15
isoprenoidní substituent (postranní et zec). Do této skupiny se adí isopentenyladenin (iP), trans-zeatin (tZ), cis-zeatin (cZ) a dihyrozeatin (DZ) (obr. 1A). Cytokininy typu tZ jsou zastoupeny nap .: v kuku ici, rýži a cizrn . Aromatické cytokininy, nesoucí aromatický postranní et zec, jako jsou ortho-topolin (oT), meta-topolin (mT), jejich methoxy deriváty ortho-methoxytopolin (meoT) a meta-methoxytopolin (memT) a benzyladenin (BA) jsou pouze v n kterých rostlinných druzích, nap . v topolu (obr. 1B) (Sakakibara, 2006). Cytokininy se v rostlinách vyskytují ve form volných molekul, které nejsou kovalentn vázány k jiným makromolekulám. Je to velké množství derivát ribotid , ribosid a volných bází nebo jsou sou ástí n kterých molekul transferové ribonukleové kyseliny (tRNA). Pokud je cytokinin sou ástí tRNA, nachází se vždy vedle 3´-konce antikodonu (Kamínek, 1997). Hormonáln
aktivní formu cytokinin
reprezentují
p evážn volné báze, jejichž ú inek je podstatn vyšší v porovnání s ostatními formami cytokinin (Letham a kol., 1983; Yamada a kol., 2001). K výraznému poklesu aktivity nebo její úplné ztrát m že dojít modifikací adeninového kruhu, nebo zm nou po tu atom
uhlíku v postranním
et zci. Cytokininy, které se vyskytují v rostlinách
nejhojn ji – zeatiny, obsahují p tiuhlíkatý isoprenoidní postranní et zec s dvojnou vazbou v poloze C-2 (Kamínek, 1992).
A
Isoprenoidní CK
16
B
Aromatické CK
Obr. 1 Struktura isoprenoidních a aromatických cytokinin (Sakakibara, 2006).
V pr b hu studia vztahu mezi strukturou a aktivitou cytokinin byly objeveny látky, které p sobí jako antagonisté cytokinin . Tyto látky se nazývají anticytokininy a jsou cenným nástrojem pro studium mechanismu ú ink
jak endogenních, tak
i exogenních cytokinin . Ú inné anticytokininy jsou r zné pyrolové a pyrazolové deriváty s modifikovaným postranním et zcem (Machá ková, 1998; Spíchal, 2008).
Obr. 2 Struktura PI-55 anticytokininu (Spíchal a kol., 2008).
17
3.1.1.3 Funkce Po objevení cytokinin
bylo zjišt no, že mají vliv na mnoho vývojových,
biochemických, metabolických a fyziologických proces
v interakci s ostatními
fytohormony. Jedna z nejd ležit jších funkcí je regulace a stimulace bun ného d lení a pr b h bun ného cyklu. Mezi další funkce pat í stimulace v tvení a odnožování rostlin, iniciace r stu adventivních pupen , oddálení stárnutí pletiv, regenerace a diferenciace, stimulace klí ení. Ovliv ují také pohyb živin, diferenciaci chloroplast , zesilují sílu sinku, podílí se na p ekonávání stresu a stimulaci transpirace (Mok a Mok, 2001). Bun né d lení Stimulace bun ného d lení je hlavním ú inkem cytokinin . Vysoké koncentrace cytokini se nachází ve všech meristematických a intenzivn se d lících pletivech. Cytokininy ovliv ují n které reakce v bun ném cyklu, mají vliv na replikaci DNA ve fázi S mitózy tak, že zkracují replikony, urychlují p epis DNA a synchronizují bun né d lení v pletivech (Machá ková, 1998; Khodakavskaya a kol., 2005). Regenerace orgán Cytokininy mají klí ové postavení v regenera ních procesech in vitro i in vivo. Mohou p sobit samostatn v n kterých fázích kultivace nebo v kombinaci s jinými fytohormony. Nej ast ji se cytokininy používají v kombinaci s auxinem p i regenera ních procesech in vitro. Pom r koncentrací t chto dvou fyohormon rozhoduje o tom, jakým sm rem bude regenerace probíhat. Jejich vyrovnaný pom r povede v tšinou k tvorb nediferencovaného pletiva - kalusu, nadbytek cytokinin vyvolá regeneraci prýt
a naopak nadbytek auxin
regeneraci ko en . Postupnými
zm nami média m žeme tedy dosáhnout regenerace celé rostliny (Machá ková, 1998). Apikální dominance Cytokininy potla ují apikální dominanci, p sobí tedy jako antagonisté auxinu. Aplikace cytokinin stimuluje v tvení rostlin, r st i zakládání pupen . Zpomalení stárnutí Stárnutí rostliny za íná ztrátou schopnosti bu ky d lit se. Listy rychle ztrácejí chlorofyl a žloutnou, nastává rozklad nukleových kyselin i protein , dochází
18
k degradaci ástí bu ky. Aplikace cytokinin tyto procesy stárnutí výrazn zpomalují (Taiz a Zeiger, 2002; Khodakavskaya a kol., 2005). Podpora pohybu živin Cytokininy ovliv ují pohyb živin do list z jiných ástí rostliny. Tento pohyb lze pozorovat
s využitím
radioaktivn
zna ených
živin,
jako
jsou
cukry
nebo
aminokyseliny. Tímto zp sobem byl prokázán transport živin a jejich akumulace v pletivech ošet ených cytokininy. P edpokládá se, že cytokinin zp sobuje mobilizaci živin tím, že vytvo í nový vztah zdroj – sink. Živiny se pohybují ve floému z místa produkce nebo skladování (zdroj) na místo využití (sink) (Taiz a Zeiger, 2002).
3.1.1.4 Biosyntéza Prvním a klí ovým krokem v biosyntéze cytokinin je p enos isopentenylové skupiny z dimetylalyl difosfátu (DMAPP) na adenosin. Enzym, který katalyzuje tuto reakci, se nazývá adenosinfosfát – isopentenyltransferasa (IPT), a byl poprvé zjišt n v bun né hlence Dictyostelium discoideum (Sakakibara, 2006 ). Následn byl v p dní bakterii Agrobacterium tumefaciens nalezen gen ipt, který tento enzym kóduje (Barry a Rogers, 1984). Geny kódující IPT byly identifikovány také u vyšších rostlin, a to u Arabidopsis thaliana, petunie a chmele. U Arabidopsis bylo nalezeno dev t IPT gen , z toho sedm (AtIPT1, AtIPT3 až AtIPT8) je za len no do biosyntézy cytokinin de novo (Kakimoto, 2001; Sakakibara, 2006). Rostlinná IPT katalyzuje p enos isopentenylové skupiny z DMAPP preferen n
na adenosintrifosfát (ATP) nebo adenosindifosfát
(ADP) za vzniku isopentenylribosid-5´-trifosfát difosfát
(iPRTP) a isopentenylribosid-5´-
(iPRDP). Bakteriální IPT naopak využívá adenosinmonofosfát (AMP) za
produkce isopentenylribosid-5´-monofosfát (iPRMP). Biosyntéza cytokinin de novo m že probíhat mevalonovou cestou (MVA), to se týká preferen n cZ, nebo methylerythritol fosfátovou cestou (MEP) – preferen n v p ípad iP a tZ (obr. 3). Prvním krokem biosyntézy isoprenoidních cytokinin je N-prenylace adenosin 5´-fosfát , ADP nebo ATP katalyzovaná IPT. Ze vzniklých iPRDP nebo iPRTP mohou být odšt peny pomoci enzym fosfátové skupiny a ribosa za vzniku biologicky aktivních cytokinin – volných bází, iP, tZ a DZ (obr. 3) (Sakakibara, 2006).
19
Obr. 3 Schéma biosyntézy a metabolismu cytokinin Biosyntéza cytokinin
(Sakakibara, 2006).
probíhá dv ma cestami, MEP a MVA. Prvním krokem je
p ipojení isopentenylové skupiny z DMAPP na ATP, nebo ADT (u rostlin), na AMP (u bakterií) pomocí enzymu IPT. Ze vzniklých ribosid fosfát
vznikají volné báze
cytokinin . Tyto volné báze jsou dále metabolizovány enzymy: cytokininoxidasou (CKX), zeatin cis-trans isomerasou (5), O-glukosyltransferasou (ZOGT), -glukosidasou ( Glc) a CK N-glukosyltransferasou (CK-N-GT).
U vyšších rostlin jsou dv možné cesty biosyntézy tZ. Závislá a nezávislá na iP. U dráhy závislé na iP je syntéza tZ katalyzována cytochromem monooxydasou P450 (P450).
Další
dva
enzymy,
CYP735A1
a CYP735A2,
byly
identifikovány
u Arabidopsis. V dráze nezávislé na iP se p edpokládá, že tZ je produkován p ímo IPT za ú asti neznámého hydroxylovaného prekurzoru, který je pravd podobn odvozen od MVA cesty (Sakakibara, 2006). Jinou cestou biosyntézy isoprenoidních cytokinin
je tRNA prenylace
katalyzována adenosinfosfát - isopentenyltransferasou-tRNA (tRNA-IPT) (Nobusada 20
a Sakakibara, 2009). Cytokinin vzniká na úrovni polynukleotidu p enesením isopentenylového et zce odvozeného od mevalonátu na adenylový zbytek v tRNA. Isopentenyladenosin je v tšinou dále modifikován hydroxylací terminální metylové skupiny za vzniku cis-zeatinu. Takto modifikovaná tRNA je potenciálním zdrojem cytokininu, který se m že uvolnit p i její metabolické degradaci (obr. 3) (Skoog a Armstrong, 1970). Jde o nep ímou cestu biosyntézy cytokinin .
3.1.1.5 Metabolismus Metabolismus cytokinin zahrnuje procesy N-glukosylaci purinu a konjugaci alaninu v poloze N9, O-glykosylaci a acetylaci postranního et zce, redukci dvojné vazby postranního et zce a jeho odšt pení. B hem metabolismu dochází k p em nám cytokinin
na formy s odlišnými
vlastnostmi. Vzájemné p em ny katalyzují r zné enzymy. Podobn jako u auxin a giberelin mohou vznikat konjugáty, p edevším glykosidy, které jsou dále využívány pro transport nebo ukládány do rezervních orgán . Glukosylace v polohách N7 a N9 p edstavuje nevratnou cestu fyziologické inaktivace cytokinin , protože narozdíl od O- a N3-glykosid nejsou N7- a N9-glukosidy št peny enzymem -glukosidasou (Brzobohatý a kol., 1993). O-glykosidy se vyzna ují vysokou biologickou aktivitou, naproti tomu N7- a N9-glukosidy jsou biologicky neaktivní. Hlavní a v n kterých rostlinách
výlu nou
cestou
inaktivace
cytokinin
je
jejich
degradace
cytokinonoxidasou/dehyrogenasou (CKX) (obr. 3) (Cedzich a kol., 2008). Tento enzym, obsažený
v mnoha
rostlinných
pletivech,
katalyzuje
odšt pení
nenasyceného
postranního et zce. Cytokininy s nasyceným postranním et zcem nebo aromatickým postranním et zcem v poloze N6 a O-glykosidy všech cytokinin
jsou odolné v i
oxidaci (McGaw a Horgan, 1985). Aktivita CKX je závislá na koncentraci cytokinin v bu ce. K jejímu zvýšení dochází po aplikaci exogenních cytokinin (Kamínek a Armstrong 1990). V genomu Arabidopsis bylo identifikováno sedm gen , pat ících do malé genové rodiny, kódujících CKX (AtCKX1 – AtCKX7) (Schmüllingen a kol., 2003; Werner a kol., 2006; Taiz a Zeiger, 2002).
21
3.1.1.6 Transport Vzhledem k tomu, že se cytokininy vyskytují jako složka n kterých molekul tRNA, mohou být syntetizovány v každé bu ce, by
jen v omezeném množství.
Nejvyšší obsah cytokinin i jejich tvorba de novo byly zjišt ny p evážn v ko enech, zejména v jejich vrcholové ásti (Torrey, 1976). Apikální meristém ko ene je hlavním místem biosyntézy cytokinin
(Sakakibara, 2006). Odtud jsou tranportovány
symplasticky xylémem do nadzemních ástí, p edevším do lodyh a list . Dnes je již známo, že cytokininy jsou syntetizovány a p sobí v r zných místech rostlinného t la (Sakakibara, 2006). Pro p íjem cytokinin rostlinnými bu kami je rozhodující jejich molekulární forma. Velmi dob e jsou p ijímány lipofilní cytokininové báze, zatímco pro polární glykosidy a zejména ribotidy nejsou rostlinné membrány permeabilní. Ribotidy a O-glykosidy však mohou být metabolicky p em n ny, a tak p edstavují metabolickou zásobu cytokinin v bu ce (Kamínek, 1997).
3.2 Cytokininová signalizace P enos cytokininového signálu u rostlin se uskute uje prost ednictvím vícestup ového dvou-komponentního systému [cytokinin signální dráha (CSD)]. Tento model byl vytvo en na základ podobnosti s dvou-komponentním systémem (TCS) u bakterií, u nichž zprost edkovává adu odpov dí na podn ty z prost edí. Mezi tyto odpov di se adí osmoregulace nebo chemotaxe. Práv u bakterií byl tento systém stanoven jako p evládající signaliza ní mechanismus. U bakterií je TCS tvo en ze dvou funk ních prvk : senzorové histidin kinasy (HK), obvykle jde o trans-membránový protein, a regulátoru odpov di (RR) (obr. 4A). HK p ijímá podn t a autofosforyluje histidinový (His) zbytek HK domény. Signál je dál p edáván p enosem fosfátu na aspartátový zbytek (Asp) p ijíma ové domény RR, p i emž je zahájena odpov a Kieber, 2008; Horák a Lexa, 2003; Taiz a Zeiger, 2002).
22
(To
Obr. 4 Dvou-komponentní systém u bakterií a Arabidopsis (Taiz a Zeiger, 2002). U bakterií je tvo en dv ma jednotkami, senzor histidin kinasou a regulátorem odpov di (A). U Arabidopsis obsahuje navíc His fosfo-transferový protein (B).
U eukaryot, tedy i modelové rostliny Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), se p enos fosfátu z HK na RR d je prost ednictvím vícestup ové His
Asp
His
Asp
fosforylace, které se ú astní další len: His fosfo-transferový protein (HPT) (obr. 4B). Funk ní prvky CSD u Arabidopsis jsou kódovány multigenovými rodinami. P i studiu genomu Arabisopsis bylo celkem objeveno 17 protein podobných histidin kinasam, pat í mezi n mimo jiné ethylenové a cytokininové receptory (Horák a Lexa, 2003; Urao a kol., 2000). Histidin kinasy Arabidopsis (AHK), konkrétn
AHK4/CRE1,
AHK2, AHK3, jsou hybridní kinasy podobné HK TCS bakterií. Jde o cytokininové receptory. Tyto t i trans-membránové hybridní kinasy jsou tvo eny cytokinin-vazebnou doménou ozna ovanou CHASE doména (cyklasa / His kinasa-asociující extracelulární podn ty) a cytoplazmatickou His transmiterovou a p ijíma ovou doménou. Další genová rodina kóduje His fosfotransferové proteiny Arabidopsis (AHP). AHP1-AHP5 mohou být lokalizovány v cytoplazm
i jádru (Hwang a Sheen, 2001). Nesou
konzervovaný His zbytek, který se ú astní p enosu fosfátu z AHK na ARR, a tím zprost edkovávají cytokininovou signalizaci. AHP6 se vyzna uje substitucí na His zbytku a nazývá se pseudo HPT, p sobí jako negativní regulátor cytikoninové signalizace. Jiná genová rodina kóduje regulátory odpov di Arabidopsis (ARR), které jsou lokalizovány v jád e. Dv hlavní skupiny ARR jsou ozna ovány jako typ-A ARR a typ-B ARR. Typ-A ARR, negativní regulátory primární odpov di na cytokininy, mají krátkou C-terminální doménu. Typ-B ARR, pozitivní regulátory odpov di na 23
cytokininy, se vyzna ují tím, že jejich C-konec nese DNA-vazebnou a transaktiva ní doménu, která ídí transkripci cytokinin aktivovaných gen . Mezi n spadají i ARR typu-A. Nedávno byli identifikováni noví lenové cytokininové signalizace, kte í byli pojmenováni faktory odpov di na cytokininy (CRF) (Rashotte, 2006). Role dvoukomponentního systému v cytokininové signalizaci u Arabidopsis byla objasn na studiemi in vitro v heterologních kvasinkových a bakteriálních systémech a dále v protoplastech Arabidopsis (Kakimoto, 2003; To a Kieber, 2008; Horák a Lexa, 2003; Taiz a Zeiger, 2002; Chang a Stewart, 1998).
Obr 5 Model cytokininové signalizace. (To a Kieber, 2008) Cytokinin se naváže na transmembránové receptory AHK2, AHK3 nebo CRE1/AHK4, ímž se aktivuje vícestup ová fosforylace. Po vazb cytokininu na cytokinin vazebnou doménu dochází k autofosforylaci His zbytku His kinasové domény. Dále dochází k p enosu fosfátu prost ednictvím Asp zbytku na p ijíma ovou His doménu AHP, které se nachází v cytoplazm . Fosfát m že být p enesen z cytoplazmy do jádra na Asp p ijíma ovou doménu
ARR typu-A respektive
typu-B prost ednictvím AHP.
ARR typu-A
zp tnovazebn negativn regulují cytokininovou signální dráhu (CSD). Fosforylace ARR typu-B indukuje transkripci specifických gen (cytokinin ízené geny), kam spadají i ARR typu-A a CRF (To a Kieber, 2008).
24
3.3 Faktory odpov di na cytokininy Faktory odpov di na ú inek cytokinin
jsou považovány za nové
leny
cytokininové signální dráhy. U Arabidopsis jsou kódovány šesti lennou genovou rodinou (CRF1 – CRF6).
adí se do t ídy transkrip ních faktor APETALA2 / faktor
odpov di na etylen (AP2/ERF), jejichž genová exprese se zvyšuje v odpov di na ú inek cytokinin , p i emž dochází k jejich akumulaci v jád e. P emíst ní z cytoplazmy do jádra je závislé na fosforylaci zprost edkované AHK, AHP, nikoliv však na ARR. Ovšem spolu s ARR typu-B sou asn regulují transkripci gen , jejichž exprese je ízena cytokininy. Pat í sem geny, které ídí vývoj prýt a kotyledon , deetiolizaci, rozvoj list ,
diferenciaci
cév
v ko enech,
senescenci
a cytokininovou
homeostázu.
Fyziologickými studiemi na mutantních liniích bylo prokázáno, že CRF ídí vývoj embryí, kotyledon a list . U jednoduchých mutant byl pozorován jen nepatrný defekt (redukce r stu a d lení bun k) ve vývoji kotyledon (d ložních list ) i pravých list . U vícenásobných mutant byl defekt n kolikanásobn rozsáhlejší (Rashotte, 2006; To a Kieber, 2008).
3.4 Sv tlo Kvalita, množství a sm r dopadajícího sv tla p edstavují jeden z nejd ležit jších faktor
životního prost edí ovliv ujících r st a vývoj rostlin, u kterých vyvolává
n kolik typ odezvy. Na jednostranné ozá ení reagují rostliny usm rn ným r stem ke zdroji zá ení – tento jev nazýváme fototropismus. Další jev, p i kterém rostliny rozeznávají délku dne a noci, fotoperiodismus, má rozhodující význam p i regulaci ady vývojových proces u rostlin. Ostatní odezvy rostlin na dopadající zá ení zahrnujeme pod názvem fotomorfogeneze (Machá ková a Krekule, 1998). Fotomorfogeneze je biologický proces, jehož výsledkem jsou r stové a morfologické zm ny zp sobené sv tlem (Procházka a kol., 2006). Aby mohly rostliny na sv telné zá ení reagovat, musí být schopny signál p ijmout, zpracovat a p enést na bun nou úrove . Pro p íjem signál zá ení je rostlina vybavena specifickými receptory. Rostliny reagují na zá ení jen ur itých vlnových délek. Nejaktivn jší oblasti spektra zá ení, které nejvíce ovliv ují r st a vývoj rostlin, je oblast erveného zá ení, zejména vlnové délky 660 nm ( ervená – red) a 730 nm (vzdálená ervená – far-red), a zá ení modré spektrální oblasti 380-450 nm (modrá – 25
blue). R stov aktivní je asto i oblast tzv. UV-B-zá ení v rozmezí vlnových délek 280-320 nm. Nejlépe prostudovaný je fotoreceptor pro ervené zá ení – fytochrom (Machá ková a Krekule, 1998; Chory a kol., 1995) Nativní fytochrom je chromoprotein, který se vyskytuje jako dimer složený ze dvou stejných podjednotek. Každá podjednotka má dv složky: pigment absorbující sv tlo zvaný chromofor a polypeptidový
et zec zvaný apoprotein. Ve vyšších
rostlinách je chromofor lineární tetrapyrol zvaný fytochromobilin, který je kovalentn vázán na protein. Apoprotein a chromofor dohromady tvo í holoprotein (Taiz a Zeiger, 2002). Fytochrom se v rostlinách vyskytuje ve dvou konforma ních formách, které vratn p echázejí z jedné formy na druhou (obr. 6). Tuto p em nu zjistil v roce 1952 Borthwick se svými spolupracovníky p i klí ení nažek salátu. První neaktivní forma, která je syntetizována v rostlinách, absorbuje
ervené sv tlo s maximální vlnovou
délkou 660 nm a ozna uje se Pr nebo také jako forma cis. Druhá forma ozna ovaná jako Pfr neboli trans forma je biologicky aktivní, ale i labiln jší a absorbuje dlouhovlnné ervené sv tlo s optimální vlnovou délkou 730 nm. Ve vratných reakcích je ervené sv tlo absorbováno fytochromem Pr a zp sobuje jeho p em nu na Pfr, který absorbuje dlouhovlnné ervené zá ení a jeho p sobením se m ní na Pr (Šetlík a kol.).
Obr. 6 Schéma fotoreverzibilního p echodu mezi formami Pr a Pfr fytochromu (http://www.vesmir.cz/clanek/biologicke-hodiny-u-rostlin).
Další výzkum fytochromu ukázal, že existují dv
r zné t ídy fytochromu
s r znými vlastnostmi. Tyto t ídy byly ozna eny fytochrom I a fytochrom II. Typ I je ast jší v etiolovaných rostlinách a po ozá ení se rychle rozkládá. Fytochrom II je hojn jší v zelených rostlinách a na sv tle je pom rn stabilní.
26
Pomocí metod molekulární biologie byly rozší eny poznatky o typech fytochrom
a jejich genetický podklad. Geny pro fytochrom kódují malou rodinu
fotoreceptor nazývanou PHY. Existují t i hlavní fytochromy phyA, phyB a phyC, které jsou kódovány geny PHYA, PHYB a PHYC. U Arabidopsis bylo sekvenováno a charakterizováno p t fytochrom kódujících gen
(PHYA – PHYE) (Franklin
a Whitelam, 2005). V mnoha p ípadech interaguje
ervené zá ení s modrým. Zá ení modré
spektrální oblasti ovliv uje zejména fototropismus, regulaci dlouživého r stu stonku a otevírání pr duch list . U rostlin p stovaných ve tm krátkodobé ozá ení modrou spektrální oblastí tém
i v erveném sv tle vyvolá okamžitou redukci rychlosti
dloužení stonku (Machá ková a Krekule, 1998). Fotoreceptory, které zprost edkovávají tyto sv telné regulace ve vývoji a r stu rostlin, ozna ujeme kryptochromy. Kryptochromy jsou strukturáln podobné fotolyasám, což jsou flavoproteiny, a to navzdory tomu, že kryptochrom nemá žádnou fotolyasovou aktivitu. V tšina kryptochrom je složena ze dvou domén: amino terminální fotolyasy (PHR) a oblast karboxy terminální domény. Na oblast PHR se váží dva chromofory, které absorbují sv tlo. Jeden chromofor je flavin adenin dinukleotid (FAD) a druhý je pterin (Lin a Todo, 2005). První kryptochromy byly identifikovány u Arabidopsis. Fotoreceptorová rodina kryptochrom u Arabidopsis se skládá ze dvou len , CRY1 a CRY2 (Kleiner a kol., 1999). Jsou to p evážn jaderné proteiny, které regulují genovou expresi (Lin a Todo, 2005).
3.4.1 Dopad spolup sobení sv tla a fytohormon na morfogenezi rostlin Skotomorfogenezí
i etiolací je ozna ován r st rostlin ve tm , dochází
k prodlužování hypokotylu, apikální meristém je chrán ný tzv. apikálním há kem a d ložní listy (kotyledony) nejsou rozvinuté, nejsou p ítomny chloroplasty a neprobíhá fotosyntéza. Po sv telném impulsu nastává de-etiolace, je zahájena fotomorfogeneze. Dochází k potla ení prodlužování hypokotylu, otvírání apikálního há ku, rozvoji kotyledon , tvorb chloroplast a zahájení fotosyntézy (Vandenbussche a kol., 2005). Na klí ních rostlinách Arabidopsis p stovaných ve tm
byly pozorovány
podobné odpov di na cytokininy, jaké jsou vyvolávány v reakci na sv tlo, tedy zahájení 27
de-etiolace (Chory a kol., 1994; Lochmanová a kol., 2008). Dosud není zcela známo, na jaké úrovni spolu sv tlo a cytokininy interagují. Dlouhou dobu byla v nována pozornost p edevším vlivu kvality sv tla na fotomorfogenezi rostlin. Nicmén i kvantita sv tla zde má své významné postavení. Chory a kol. (1994) a Su a Howell (1995) pozorovali, že cytokininy potla ují prodlužování hypokotyl klí ních rostlin Arabidopsis rostoucích ve tm , tento vliv je zprost edkován cytokinin indukovanou produkcí ethylenu (Cary a kol.,1995). Cytokininy stimulují jeho produkci u klí ních rostlin Arabidopsis dokonce již svou submikromolární koncentrací. Ne zcela jasný je vliv cytokinin hypokotyl
na prodlužování
na sv tle. Smets a kol. (2005) pozorovali cytokininy zp sobené
prodlužování hypokotyl na sv tle, pokud je zabrán no p sobení ethylenu, nebo je blokovaný transport auxin . Ethylen na sv tle zp sobuje významné prodlužování hypokotyl
(Smalle a kol., 1997), stejn
p sobí i auxiny (Romano a kol., 1995).
Cytokininy interagují s ehtylenovou signální dráhou a podmín n zvyšují biosyntézu ethylenu a auxin (Smets a kol., 2005). Jak již bylo zmín no v kapitole 3.4, jeden z nejd ležit jších environmentálních faktor
pro rostliny je sv tlo, jeho dostate ná dostupnost. V p írod
p edstavuje
zastín ní jednak zm nu v kvalit sv tla, kdy se m ní pom r red / far-red ve prosp ch far-red. A dále pokles sv telné intenzity zahrnující ervené i modré sv tlo, jenž má p ímý vliv na fotosyntézu a fotomorfogenezi. Rostliny se snaží uniknout zastín ní adaptací svého fenotypu takovým zp sobem, aby získaly co nejvíce sv tla. Na t chto morfogenetických zm nách se podílí ada fytohormon . Auxiny, ethylen a gibereliny, se podílí zejména na re-orientaci list
(Vandenbussche a kol., 2003). Regulace
prodlužování
auxiny,
hypokotylu
se
ú astní
cytokininy,
ethylen,
gibereliny
a brassinosteroidy. Hypokotyl (embryonální stonek) je velmi plastický orgán, siln ovliv ován nejen fytohormony, ale i vn jšími faktory jako jsou sv tlo, teplota a gravitace (Vandenbussche a kol., 2005; Vandenbussche a kol., 2007). Vandenbussche a kol. (2007) popsali ethylenem nebo jeho prekursorem 1-aminocyklopropan-1-karboxylovou kyselinou (ACC) regulované prodlužování hypokotyl p i snížené sv telné intenzit , závislé p edevším na modrém sv tle a bazální hladin giberelin , ale p esto nezprost edkované gibereliny. Gibereliny jsou hlavn r stové stimulátory.
28
3.5 Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (husení ek rolní) je drobná dvoud ložná kvetoucí bylina z eledi Brasicaceae. Je to jednoletý efemerní druh, tvo ící p ízemní listovou r žici a obvykle jednu v tvící se lodyhu vysokou 5 – 30 cm, která nese hroznovité kv tenství s drobnými bílými kv ty. Plodem je šešule obsahující mnoho drobných hn dých semen. Arabidopsis nemá zásadní agronomický význam, ale používá se jako modelový organismus pro základní výzkum v oblasti genetiky a molekulární biologie pro identifikaci gen a ur ení jejích funkcí (Nature 408, 2000). Jako modelová rostlina se používá pro své vyhovující vlastnosti. První významnou vlastností je krátká vegeta ní doba (6 týdn ), b hem které vytvo í velké množství semen. Pro molekulární genetiku je d ležitý malý genom s p ti chromozomy (n = 5) (Bedná a kol., 2008). Arabidopsis má nejlépe prostudovaný a nejmenší genom ze všech rostlin, který byl osekvenován koncem roku 2000. Na výzkumu genomu Arabidopsis se intenzivn pracovalo sou asn
v mnoha zemích, od roku 1990. Tento projekt zahrnoval jak
sekvenování genomu, tak studium funkce všech gen a jejich hlavních interakcí. Roku 1996 bylo založeno konsorcium AGI (angl. The Arabidopsis genome initiative), sdružující laborato e z Evropy, Japonska a USA (Ond ej a kol., 1999). Díky tomuto projektu byl ur en po et gen . Celkový obsah gen v genomu Arabidopsis p esahuje 25 000, které kódují r zné druhy protein (www.arabidopsis.org).
29
4 METODIKA
4.1 Rostlinný materiál Pro vlastní experimentální práci byla použita semena Arabidopsis thaliana (L.) Heynh ekotypu Col-0 (divoký kmen) a semena mutantních linií crf (crf1, crf2, crf5; crf2,5; crf3,5; crf1,2,5; crf2,3,6) (T-DNA inzerce v genech kódujících jednotlivé CRF na pozadí Col-0 zp sobující ztrátu funkce genu – loss-of-function mutation). Semena jednoduchých, dvojných a trojných crf mutant
nám poskytl Aeron M. Rashotte
(Rashotte a kol., 2006). Celkem bylo použito sedm crf mutantních linií.
4.2 Podmínky kultivace rostlin Semena Arabidopsis byla nejprve povrchov vysterilizována v 75% etanolu po dobu 5 – 7 minut a následn vyseta v biohazard-boxu (Aura vertical S.D.4, Bioair instrument) na tvercové Petriho misky (12,5 cm x 12,5 cm) na živné 1x Murashige a Skoogovo médium (Duchefa) s 1,2% agarem (Duchefa) (pH média bylo upraveno na hodnotu 5,7 – 5,8 za p ídavku 1M roztoku KOH p ed autoklávováním) (tab. 1). Po sterilizaci byla média vychlazena na teplotu cca 55°C a p ed nalitím na misky obohacena o dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma) (rozpoušt dlo cytokininu), respektive o tZ (Olchemim) v požadovaných koncentracích (tab. 1). Na každou misku bylo vyseto p ibližn
patnáct semen Arabidopsis v jedné ad , pro zajišt ní stejné vzdálenosti
klí ních rostlin od sv telného zdroje. Po vysetí byly misky oblepeny polopropustnou náplastí Medipor, ímž se dosáhlo zachování sterility uvnit misky a také zabrán ní nekontrolovanému hromad ní metabolit , p edevším ethylenu. P ipravené misky byly nechány t i dny v lednici, aby došlo k nabobtnání, indukci a synchronizaci klí ení semen, k tzv. vernalizaci. Po t ech dnech byly misky vertikáln
umíst ny do
kultiva ního boxu Percival CU36L5 (Percival Scientific). Klí ní rostliny byly kultivovány po dobu jedenácti dn p i dvou sv telných podmínkách: nízké intenzit sv tla 20 mol.m-2.s-1, standardní 100 mol.m-2.s-1 a režimu dlouhého dne (16 hod / 21°C sv tlo; 8 hod /19°C tma).
30
Tab. 1 Složení kultiva ního média. Navážky jednotlivých složek média jsou uvedeny v gramech, pop ípad mikrolitrech na 1l destilované vody. MS (Murashige and Skoog medium) (Duchefa)
4,4 g
MES (Morpholinoethane sulfonic acid) (Serva)
0,6 g
1 M KOH
1250 l
1,2% Plant agar (Duchefa)
12 g
DMSO (Dimetylsulfoxid) (Sigma)
20 l
50 mM tZ (trans-zeatin) (Olchemin)
20 l
4.3 Kontrola homogenity sv tla Cílem tohoto experimentu bylo ov ení homogenity sv tla dopadajícího na klí ní rostliny kultivované na vertikáln
umíst ných miskách v kultiva ním boxu.
Kultiva ní box byl osazen fluorescen ními lampami firmy Philips (TL-D 18W/33-640, studené bílé sv tlo). Semena divokého kmene (Col-0) byla paraleln vyseta na MS medium obohacené o DMSO (1.10-4% v/v) respektive 1 M tZ. Intenzita sv tla byla m ena Luxmetrem (PU 550, Metra Blansko a.s.) pro t icet bod na polici, na kterou byly misky umíst ny. Každá nam ená hodnota odpovídá konkrétní misce umíst né na polici (obr. 7). idlo p ístroje bylo b hem m ení umíst no ve výšce rostoucích klí ních rostlin. Hodnoty získané z m ení v kiloluxech (kLux) byly p evedeny na mol.m-2.s-1 vynásobením hodnoty v luxech koeficientem 0,0135, dle doporu ení spole nosti Apogee
instruments
inc.
(www.apogee-inst.com/conv_lux.html)
(p íloha
4).
Jedenáctidenní klí ní rostliny byly zdokumentovány fotoaparátem Olympus SP-350 a délky hypokotyl Posouzení úrovn
vyhodnoceny v softwarovém programu Analysis (Olympus). homogenity sv tla dopadajícího na klí ní rostliny vycházelo
ze srovnání délek hypokotyl na jednotlivých miskách.
31
Obr. 7 Schéma umíst ní misek v kultiva ním boxu.
ísla ve schématu ozna ují
polohy jednotlivých misek na polici. Na levé polovin byly misky s DMSO, na pravé s tZ.
4.4 M ení délek hypokotyl Pro hodnocení délek hypokotyl klí ních rostlin Arabidopsis byly provedeny dv sady experiment . Každou sadu reprezentovala t i biologická opakování, pro každé z nich byla vypo tena pr m rná hodnota. Kone ným výsledkem je pr m r ze všech t í opakování. Klí ní rostliny byly kultivovány p i nízké sv telné intenzit na MS médiu s p ídavkem DMSO respektive tZ. V první sad byla použita koncentra ní ada tZ (10nM, 100nM, 1 M, 5 M a 10 M). Nam ené délky hypokotyl zdokumentovaných klí ních rostlin vysetých semen p ti mutantních linií Arabidopsis (crf5; crf2,5; crf3,5; crf1,2,5; crf2,3,6) byly srovnány s kontrolní liníí Col-0. V druhé sad
byly klí ní
rostliny kultivovány pouze na DMSO a 1 M tZ. Celkem zde bylo použito sedm mutant , p edchozích p t mutant
a navíc mutanti crf1, crf2. Statisticky významné
rozdíly byly stanoveny t-testem (P = 0.05).
32
4.5 Kvantitativní (Q) RT-PCR 4.5.1 Sb r materiálu Po jedenácti dnech kultivace byly klí ní rostliny, jejichž semena byla vyseta na MS medium s DMSO, p eneseny z pevného média do tekutého MS média s obsahem DMSO respektive 1 M tZ. Kultivace probíhala paraleln p i nízké i standardní sv telné intenzit . V tekutém médiu byly klí ní rostliny inkubovány dv hodiny na t epa ce (Infors AG CH-4103 Botmingen) p i nastavených otá kách 160 RPM/min. Po inkubaci byl rostlinný materiál o navážce 100 mg zamražen v tekutém dusíku.
4.5.2 Izolace RNA Po zamražení byl každý vzorek homogenizován v tekutém dusíku a následn lyzován p idáním 1 ml TRIzol reagent (Invitrogen) na 100 mg pletiva. Lyzace vzork probíhala 5 minut p i laboratorní teplot (LT). Poté bylo p idáno 0,2 ml chloroformu. Vzorky byly d kladn prot epány a inkubovány 2 – 3 minuty p i LT a následn centrifugovány (12 000 x g, 15 minut, 4°C) v p edem vychlazené centrifuze (Avanti J-30I, Beckman Coulter). Centrifugací došlo k odd lení supernatantu – vodné fáze RNA od sedimentu s DNA, proteiny, zbytky pletiv a organických rozpoušt del. Vodná fáze byla p enesena do nové zkumavky a bylo k ní p idáno 0,5 ml isopropylalkoholu. Sm s byla prot epána a inkubována 10 minut p i LT a následn centrifugována (12 000 x g, 15 minut, 4°C). Vysrážený RNA pelet byl rozpušt n v 1 ml 75% etanolu a op t centrifugován (12 000 x g, 5 minut, 4°C), vysušen a rozpušt n ve vod
ošet ené 0,05% diethylpyrokarbonátem (DEPC). Následn
byla ke každému
vzorku p idána TurboDNasa (Ambion), která rozložila p ípadnou zbytkovou DNA ve vzorku. DNasa št pila 30 minut p i 37°C a následn byla inaktivována 10 minut p i 65°C. Inkubace probíhala v termoblo cích (Dri-block DB 3, Dri-block DB 2D, Techne).
33
4.5.3 M ení koncentrace RNA a výpo et istoty Pro m ení koncentrace byla použita 80x z ed ná RNA v redestilované (dd) vod . Koncentrace byla vypo tena dle vzorce:
c( g/ l) = (A260 . 40 . 80) / 1000
A260
hodnota absorbance p i vlnové délce 260 nm
40
p epo tový koeficient
80
koeficient ed ní
M ení absorbance probíhalo na spektrometru (Specord S300 UV VIS) p i dvou vlnových délkách, 260 nm a 280 nm. Podílem hodnot nam ených p i t chto dvou vlnových délkách byla stanovena istota RNA. Pokud se hodnota pohybovala v rozmezí 1,8 – 2,1, RNA byla považována za istou (tab. 9).
4.5.4 Reverzní transkripce Reverzní transkripce (RT) je proces, p i kterém dochází k p episu RNA do komplementární DNA (cDNA) metodou polymerázové et zové reakce (PCR). Do reakce byla použita RNA, ke které byly postupn p edp ipravené bezprost edn
p idány 2 reak ní sm si
p ed pipetováním. Jako první byla p idána sm s
redestilované vody a oligo(dT) RTP (primery pro reverzní transkripci) primer . Druhá sm s obsahovala first strand buffer (FSB), sm s deoxyribonukleosidtrifosfát (dNTP) (sm s dATP, dCTP, dGTP a dTTP), dithiotreitol (DTT) a reverzní transkriptasu Superscript II (SSII) (Invitrogen) (tab. 2C). Reverzní transkripce probíhala v termocykleru (MJ Research PTC-200 Peltier thermal cycler) s navoleným
ty
krokovým programem (tab. 2B). V prvním kroku byla sm s RNA, RTP a vody zah áta na 70°C po dobo 10 minut. V druhém kroku, který trval 30 sekund, byla reak ní sm s zchlazena na 4°C a v tomto okamžiku byly p idány zbývající složky reakce (druhá sm s). Reverzní transkripce probíhala 52 minut p i teplot 42°C. V posledním kroku probíhala inaktivace transkriptasy 15 minut p i 70°C.
34
Tab. 2 Reak ní podmínky a složení reakce RT. Sekvence použitého primeru oligo(dT) RTP (A). Program RT (B). Objemy složek reakce uvedené v mikrolitrech na jednu reakci. Celkový objem reak ní sm si ve zkumavce byl 20 l (C). A Sekvence primeru oligo (dT) 5´- CGT TCG ACG GTA CCT ACG TTT TTT TTT TTT TTT TT-3´
B Krok reverzní transkripce
Teplota
as
Denaturace
70°C
10 min
P idání druhé reak ní sm si
4°C
30 s
Nasedání primer + prodlužování DNA et zce
42°C
52 min
Inaktivace transkripce
70°C
15 min
C dd voda
10 M RTP
10mM dNTP
0,1 M DTT
5x FSB
SS II
RNA
9.7
1
1
2
4
0.3
2
4.5.5 Kvantitativní (Q) PCR Kvantitativní PCR (Q-PCR) je založena na klasické PCR. Umož uje detekci a kvantifikaci DNA b hem každého cyklu reakce. Hlavní podmínkou je p ítomnost fluorescen ního barviva, které se váže na dvou et zcovou DNA (dsDNA). Množství PCR produktu je úm rné fluorescen ní aktivit barviva. Pro vlastní reakci byla k cDNA p idána sm s reak ních látek obsahující Blue Buffer (Top-Bio), dNTP, Taq polymerasu 1.1 (Top-Bio), SybrGreen I (fluorescen ní barvi ka) (Molecular Probes), levý a pravý primer syntetizovaných gen
a dd voda (tab. 3C). PCR probíhala na cykleru
RotorGene6000 (Corbett Research). Pro každý biologický vzorek byla provedena dv technická opakování. Relativní hladina transkriptu ARR5, molekulární marker pro cytokininy, (Huang a kol., 2009; D’Agostino a kol., 2000) je vyjád ena podílem expresí cílového genu ARR5 a referen ního genu UBQ10.
35
Tab.3 Reak ní podmínky a složení PCR reakce. Sekvence použitých primer (A). Program PCR (B). Objemy složek v mikrolitrech na jednu reak ní sm s. Celkový objem sm si ve zkumavce byl 25 l (C). A Gen
Název primeru
UBQ10
ARR5
Sekvence primeru
fUBQ10
5´-AAC GGG AAA GAC GAT TAC -3´
rUBQ10
5´- ACA AGA TGA AGG GTC GAC -3´
fARR5
5´-GCT GAT AGA ACC AAG ACT GA -3´
rARR5
5´-CTT CCA AAA TAA CAC ACC AC-3´
B UBQ10 Krok PCR
ARR5
Teplota
as
Teplota
as
Po áte ní denaturace
94°C
1 min
94°C
1 min
Denaturace
94°C
15 s
94°C
35 s
Nasedání primer
60°C
20 s
56°C
35 s
Prodlužování DNA et zce
72°C
20 s
Denaturace nespecifických produkt
82°C
15 s
72°C
35 s
Záv re né prodlužování DNA et zce
72°C
1 min
72°C
2 min
Po et cykl
33
C dd voda
10x buffer
10mM dNTP
10x SG
Taq Pol
Primery
cDNA
13
2,5
1
0,8
0,7
1+1
5
36
5 VÝSLEDKY A DISKUSE
5.1 Vliv homogenity intenzity sv tla a exogenních cytokinin
na
dlouživý r st hypokotyl Arabidopsis thaliana Prvním experimentálním úkolem v mé bakalá ské práci bylo ov ení homogenity sv tla dopadajícího na klí ní rostliny Arabidopsis rostoucí na Petriho miskách umíst ných vertikáln v kultiva ním boxu. V kultiva ním boxu byla nastavena požadovaná intenzita sv tla: 20 mol.m-2.s-1. Z t iceti nam ených hodnot sv telné intenzity na jednu polici (tab. 4B), které se pohybovaly v rozmezí 12 – 24
mol.m-2.s-1, byla vypo tena pr m rná hodnota
18 mol.m-2.s-1. Pro levou polovinu police s miskami s DMSO byla vypo tena pr m rná hodnota 19 mol.m-2.s-1 a pro pravou polovinu s miskami s tZ 17 mol.m-2.s-1. Klí ní rostliny Arabidopsis Col-0 byly za této sv telné podmínky a režimu dlouhého dne kultivovány jedenáct dn a poté zdokumentovány. Pr m rné hodnoty nam ených délek hypokotyl pro každou misku jsou uvedeny v tabulce . 4C a p íloze 2, 3. I p es uvedené rozdíly v intenzitách sv tla dopadajících na jednotlivé misky nebyly mezi hypokotyly klí ních rostlin p stovaných na r zných miskách se stejným složením média zjišt ny statisticky významné rozdíly v jejich délce. Naopak byly pozorovány o ekávané statisticky významné rozdíly v prodlužování hypokotyl mezi klí ními rostlinami kultivovanými na miskách s p ídavkem DMSO a tZ. Tento výsledek nám ukázal, že prodlužování hypokotyl podmín né zvýšenou hladinou cytokinin p i nízké sv telné intenzit (Reková, nepublikované výsledky) je robustní jev, který není statisticky významn ovlivn n uvedenou nehomogenitou dopadajícího sv tla na klí ní rostliny. Pro tento typ experiment lze považovat sv tlo za homogenní.
37
Tab. 4 Umíst ní misek na polici, intenzita sv tla a délka hypokotyl klí ních rostlin Col-0. Ozna ení misek a jejich umíst ním v boxu (A). Intenzita sv tla v mol.m-2.s-1 nam ená pro jednotlivé misky (B). Délky hypokotyl Col-0 v milimetrech (C). Hodnoty jsou pr m rem ze dvou biologických opakování. Pro každé opakování bylo použito p ibližn deset klí ních rostlin.
A
tZ (1 M)
DMSO ozna ení misek
1
4
7
10
13
13
10
7
4
1
2
5
8
11
14
14
11
8
5
2
3
6
9
12
15
15
12
9
6
3
24
24
22
22
22
22
21
20
20
21
23
19
17
14
14
12
12
13
13
24
18
16
15
15
15
14
12
14
14
18
2.8
2.5
2.5
2.4
2.3
4.2
4.2
4.2
4.2
4.6
2.4
2.4
2.4
2.3
2.3
4.3
4.3
3.9
4.0
2.9
2.9
2.7
2.6
2.7
2.6
4.3
4.6
4.3
4.5
4.7
B intenzita sv tla
C délka hypokotylu
Obr. 8 Délky hypokotyl Col-0 p i r zné sv telné intenzit sv tla.
38
Obr. 9 Fenotyp klí ních rostlin Col-0 na DMSO (vlevo) a 1 M tZ (vpravo). Klí ní rostliny byly kultivovány 11 dn p i sv telné intenzit 18 mol.m-2.s-1 a režimu dlouhého dne.
5.2 Vliv mutací v genech CRF na dlouživý r st hypokotyl Arabidopsis thaliana CRF byly p ed nedávnem objeveny a za azeny mezi proteiny CSD u Arabidopsis (To a Kieber, 2008). Výsledky Rekové (nepublikovaná data) potvrzují ú ast ostatních
len
CSD (AHK, AHP a ARR rodin protein ) u Arabidopsis
v prodlužování hypokotyl p i nízké intenzit sv tla a zvýšené hladin cytokinin . Na základ t chto pozorování jsme provedli stejný experiment s crf mutanty za ú elem potvrzení nebo vyvrácení ú asti CRF v prodlužování hypokotyl za výše zmín ných podmínek.
5.2.1 Výb r vhodné koncentrace cytokininu Pro tento experiment byla použita Col-0 a crf mutantní linie. Klí ní rostliny byly kultivované na DMSO a na koncentra ní ad tZ (10nM, 100nM, 1 M, 5 M a 10 M) p i sv telné intenzit
18 µmol.m-2.s-1. Nam ené délky hypokotyl
v tabulce . 5 a graficky znázorn ny na obrázku . 10.
39
jsou uvedeny
Tab. 5 Délky hypokotyl Col-0 a crf mutantních linií. Tabulka obsahuje délky hypokotyl v milimetrech (DH) a standardní chyby (SE). Hodnoty jsou pr m rem ze t í biologických opakování. Pro každou linii bylo použito p ibližn dvacet klí ních rostlin v každém opakování. Rostliny byly kultivovány p i sv telné intenzit 18 µmol.m-2.s-1.
Col-0
crf5
crf2,5
DH
SE
DH
SE
DH
SE
DMSO
2,21
0,076
2,12
0,022
2,13
0,031
10nM tZ
3,04
0,289
2,47
0,161
2,68
0,048
100nM tZ
2,70
0,116
2,46
0,012
2,84
0,014
1 M tZ
3,04
0,162
2,92
0,001
3,41
0,084
5 M tZ
3,27
0,041
3,05
0,099
3,50
0,041
10 M tZ
3,55
0,141
3,33
0,011
3,51
0,019
crf3,5 DMSO 10nM tZ 100nM tZ 1 M tZ 5 M tZ 10 M tZ
crf1,2,5
crf2,3,6
DH
SE
DH
SE
DH
SE
2,13 2,25 2,53 3,53 3,69 3,53
0,007 0,041 0,015 0,036 0,008 0,096
1,91 2,31 2,41 2,61 2,88 2,88
0,005 0,083 0,024 0,056 0,003 0,007
2,08 2,52 2,71 3,10 3,30 3,43
0,093 0,028 0,043 0,022 0,055 0,067
Obr. 10 Délky hypokotyl
Col-0 a crf mutantních linií. Srovnání délek
hypokotyl v milimetrech. Klí ní rostliny byly kultivovány jedenáct dn na MS médiu s p ídavkem DMSO, nebo tZ v r zných koncentracích (10nM, 100nM, 1µM, 5µM, 40
10µM). Chybové úse ky znázor ují standardní chybu. Rostliny byly kultivovány p i sv telné intenzit 18 µmol.m-2.s-1.
Se zvyšující se koncentrací tZ docházelo i k nár stu délky hypokotyl . Od 1 M koncentrace bylo u v tšiny testovaných linií pozorováno výrazn jší prodlužování hypokotyl . Z koncentra ní ady tZ byla tedy pro další experiment vybrána tato koncentrace.
5.2.2 Prodlužování hypokotyl
klí ních rostlin kultivovaných na tZ p i nízké
intenzit sv tla Klí ní rostliny kontrolní linie Col-0 a crf mutant byly kultivovány na DMSO a 1 M tZ. Krom crf mutantních linií, které byly použity v p edchozím experimentu, byly vysety další dv linie jednoduchých mutant crf1 a crf2. Hypokotyly klí ních rostlin Col-0 i crf mutant na tZ byly statisticky významn delší ve srovnání s vlastními kontrolami, tedy klí ními rostlinami kultivovanými na DMSO (tab. 6) (obr. 11). Tyto výsledky potvrdily již pozorovaný fenomén (Reková, nepublikované výsledky), že cytokininy podmi ují prodlužování hypokotyl p i nízké intenzit sv tla. Prodlužování hypokotyl
crf mutant
na tZ se statisticky významn nelišilo od Col-0. Z tohoto
výsledku lze tedy soudit, že CRF proteiny se na rozdíl od ostatních
len
CSD
u Arabidopsis neú astní prodlužování hypokotyl p i nízké intenzit sv tla, které je závislé na zvýšené hladin cytokinin (obr. 12).
41
Tab. 6 Délky hypokotyl Col-0 a crf mutantních linií na DMSO a 1 M tZ. Délky hypokotyl jsou uvedeny v milimetrech (DH) se standardními chybami (SE). Hodnoty jsou pr m rem ze t í biologických opakování. Na jedno biologické opakování bylo použito p ibližn dvacet p t klí ních rostlin. Rostliny byly kultivovány p i sv telné intenzit 18 µmol.m-2.s-1.
Col-0 DMSO 1 M tZ
crf1
crf2
crf5
DH
SE
DH
SE
DH
SE
DH
SE
2,57 4,08
0,0452 0,0427
2,19 3,69
0,016 0,087
2,33 3,43
0,0475 0,0613
2,55 3,78
0,0400 0,0300
crf2,5
crf3,5
crf1,2,5
crf 2,3,6
DH
SE
DH
SE
DH
SE
DH
SE
DMSO
2,51
0,0243
2,34
0,0242
2,46
0,0237
2,53
0,0307
1 M tZ
4,03
0,0788
3,34
0,0547
3,96
0,0631
3,80
0,0360
Obr. 11 Délky hypokotyl Col-0 a crf mutantních linií. Hodnoty jsou uvedeny v milimetrech. Klí ní rostliny byly kultivovány jedenáct dn na MS médiu s p ídavkem DMSO nebo 1 M tZ p i nízké intenzit sv tla. Chybové úse ky znázor ují standardní chybu.
42
Tab. 7 Prodlužování hypokotyl Col-0 a crf mutantních linií na tZ vyjád ené v relativních hodnotách. RH = relativní hodnota, SE = standardní chyba.
Col-0
crf 1
crf 2
crf 5
crf 2,5
crf 3,5
crf 1,2,5
crf 2,3,6
RH
1.58
1.68
1.47
1.48
1.60
1.43
1.61
1.50
SE
0.0323
0.0414
0.0398
0.0260
0.0348
0.0277
0.0298
0.0230
Obr. 12 Prodlužování hypokotyl
crf mutantních linií na tZ vyjád ené
v relativních hodnotách a vztažené v i Col-0. Chybové úse ky znázor ují standardní chybu.
5.3 Srovnání citlivosti CSD v
i cytokinin m p i standardní a snížené
intenzit sv tla Pro srovnání citlivosti CSD v i cytokinin m p i standardní a snížené intenzit sv tla bylo využito stanovení hladin transkriptu genu ARR5, který pat í ke skupin gen primární odpov di cytokinin . Pro normalizaci výsledk byl použit transkript genu UBG10. Hladiny transkriptu genu ARR5 u jedenáctidenních klí ních rostlin Col-0 ošet ených 1µM tZ po dobu dvou hodin byly statisticky významn zvýšené v porovnání s klí ními rostlinami ošet enými pouze DMSO (1.10-4% v/v) (kontrolní rostliny) na
43
obou intenzitách sv tla, standardní i nízké. Samotná zm na v citlivosti CSD v i cytokinin m p i snížení intenzity sv tla tedy nem že vysv tlit jednoduchým zp sobem výše dokumentovanou kvalitativn rozdílnou r stovou odpov
hypokotyl v odpov di
na p ítomnost cytokinin p i nízké a standardní intenzit sv tla (Reková, nepublikované výsledky). Objasn ní mechanismu stimulace dlouživého r stu hypokotyl p i nízké intenzit sv tla bude vyžadovat další r stové a molekulární experimenty.
Tab.8 Relativní hodnoty transkriptu. Hladiny transkript
ARR5 genu jsou
vyjád ené v relativních hodnotách a normalizované na referen ní gen UBQ10 (ARR5/UBQ10), (SE) = standardní chyba.
ARR5/UBQ10
SE
standardní intenzita
DMSO
0.0283
0.0023
tZ
0.1621
0.0061
nízká intenzita
DMSO
0.0135
0.0025
tZ
0.1261
0.0113
44
Obr. 13 Relativní hladiny transkriptu ARR5. Jedenáctidenní klí ní rostliny byly ošet eny DMSO a 1 M tZ a kultivované p i standardní i nízké intenzit sv tla.
Tab. 9 Koncentrace a istota RNA. 100 mol.m-2.s-1
A260
A280
c ( g/ l)
istota
DMSO
0,473
0,235
1,51
2,01
0,409
0,200
0,76
2,05
A260
A280
c ( g/ l)
istota
DMSO
0,248
0,126
0,70
1,97
1 M tZ
0,300
0,163
0,96
1,84
1 M tZ -2
20 mol.m .s
-1
45
6 ZÁV R Teoretická
ást bakalá ské práce byla zam ena na vypracování literárního
p ehledu v oblastech hormonální kontroly odpov di rostlin k nízkým intenzitám sv tla, metabolismu a signální dráze fytohormonu cytokininu a kone n percepce sv tla. V rámci experimentální ásti bylo nejprve prokázáno, že homogenita nízké intenzity sv tla 18 mol.m-2.s-1 použitá pro kultivaci klí ních rostlin v námi použitých kultiva ních boxech je vhodná a dostate ná pro provedení vlastních experiment . Praktická ást byla následn v nována fyziologickým a molekulárním experiment m, ve kterých byl sledován vliv interakce sv tla a cytokininu tZ na délku hypokotyl a hladinu transkriptu cytokininového molekulárního markeru – genu ARR5. P i nízké sv telné intenzit 18 mol.m-2.s-1 a po p idání 1 µM tZ do kultiva ního média bylo pozorováno o ekávané statisticky významné prodloužení hypokotyl klí ních rostlin Arabidopsis na mediu s tZ. Velmi podobné prodlužování bylo detekováno jak u kontrolních klí ních rostlin Col-0, tak u crf mutantních linií. Na základ t chto výsledk je možné konstatovat, že CRF proteiny se pravd podobn neú astní prodlužování hypokotyl za výše uvedených kultiva ních podmínek. Na molekulární úrovni byla pro ob sv telné intenzity pozorována statisticky významn zvýšená hladina transkriptu genu ARR5 u jedenáctidenních klí ních rostlin Col-0 po ošet ení 1 µM tZ. Vzhledem k tomu, že zm na v citlivosti CSD v i cytokinin m byla pozorována pro ob sv telné intenzity v porovnatelném rozsahu, bude pro objasn ní mechanismu fyziologického jevu stimulace prodlužování hypokotyl podmín né zvýšenou hladinou cytokinin p i nízké intenzit sv tla nezbytné provést další, p edevším expresní studie.
46
7 POUŽITÁ LITERATURA AKIYOSHI, D.E., KLEE, H., AMASINO, R.M., NESTLER, E.W. and GORDON, M.P. (1984): T-DNA of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci.Vol. 81. p. 5994-5998 ARABIDOPSIS GENOME INITIATIVE (2000): Analysis of the genome sequence of the flowering plant. Arabidopsis thaliana. Nature.Vol. 408. p. 796–815. AMASINO, R., (2005). 1955: kinetin arrives. The 50th anniversary of a new plant hormone. Plant physiol. Vol. 138. p. 1177-1184 BARRY, G.F., ROGERS, S.G., FRALEY, R.T. and BRAND, L. (1984): Identification for a cloned cytokinin biosysthetic gene. Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 81. p. 47764780 BEDNÁ , J., KUCIEL, J. and VYHNÁNEK, T. (2008): Genetika. Mendelova zem d lská a lesnická univerzita.Dotisk Brno. s. 4-8. ISBN 978-80-7157-862-8 BRZOBOHATÝ, B., MOORE, I., KRISTOFFERSEN, P., BAKO, L., CAMPOS, N., SCHELL, J. and PALME, K. (1993): Release of active cytokinin by a
-
glukosidase localized to the maize root meristem. Science.Vol. 262. p. 10511054 CARRY, A.J., LIU, W. and HOWELL, S.H. (1995): cytokinin action is coupled to ethylene in its effects on the inhibition of root and hypocotyl elongation in Arabidopsis thaliana seedlings. Plan Physiol. Vol. 107. p. 1075-1082 CASHMRE, A.R., JARILLO, J.A., WU, Y.-L., and LIU, D. (1999). Cryptochromes: Blue light receptors for plants and animals. Science. Vol. 284. p. 760–765 CEDZIK, A., STRANSKY, H., SCHULTZ, B. and FROMMER, W.B. (2008): Characterization of cytokinin and adenin transport in Arabidopsis cell cultures. Plant Physiol. Vol. 148. p. 1857-1867 D´AGOSTINO, I.B., DERUÉRE. J. and KIEBER, J.J. (2000): Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin. Plant Physiol. Vol. 124. p. 1706-1717 FRANKLIN, K.A. and WHITELAM, G.C. (2004): Phytochromes and shade-avoidance responses in plants. Annals of Botany. Vol. 96. p. 196-175
47
HORÁK, J. and LEXA, M. (2003): Dvoukomponentní systémy: Regulátory odpov di a p enos signálu u Arabidopsis thaliana. Biologické listy. Vol 67. p. 297-317 HUANG, L., YANG, S., ZHANG, S., LIU, M., LAI, J., QI, Y., SHI, S., WANG, J., WANG Y., XIE, Q. and YANG, CH. (2009): The Arabidopsis SUMO E3 ligase AtMMS21, a homologue of NSE2/MMS21, regulates cell proliferation in the root. The Plant Journal. Vol. 60. p. 666-678 HWANG, I. and SHEEN, J. (2001): Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature. Vol. 413. p. 383-389 CHANG, C. and STEWART, R.C. (1998): The Two-Component systém. Regulation of diverse signaling pathways in prokaryotes and eukaryotes. Plant Physiol. Vol.117. p. 723-731 CHORY, J., REINECKE, D., SIM, S., WASHBURN, T. and BRENNER, M. (1994): A role for cytokinins in de-etiolation in Arabidopsis. Plant Physiol. Vol. 104. p. 339-347 CHORY, J., COOK, R.K., DIXON, R., ELICH, T., LI, H.M., LOPEZ, E., MOCHIZUKI, N., NAGPAL, P., PEPPER, A., POOLE, D. and REED, J. (1995): Signal-transduction pathways controlling light-regulated development in Arabidopsis. Phil. Trans. Vol. 350. p.59-65 JABLONSKI, JH. and SKOOG, F. (1954): Cell enlargement and cell divisoun in excised Tobacco pith tissue. Physiol. Plant. Vol. 7. p. 16-24 KAMÍNEK, M. and ARMSRONG, D.J. (1990): Genotypic variations in cytokinin oxidase from Phaseolus callus cultures. Plant Physiol. Vol. 93. p. 1530-1538 KAMÍNEK, M. (1992): Progress in cytokinin research. Trends biotechnol. Vol. 10. p. 159-164 KAMÍNEK, M. (1997): Cytokininy, in: PROCHÁZKA, S., ŠEBÁNEK, J.et al.: Regulátory rostlinné r stu. Academia Praha. 5, s. 63-76. ISBN 80-200-0597-8 KAKIMOTO, T., (2001): Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate:ATP/ADP isopentenyltrasferases. Plant Cell Physiol. Vol. 42. p. 677-685
48
KAKIMOTO, T. (2003): Perception and signal transduction of cytokinins. Annu. Rev. Plant Biol. Vol. 54. p. 605-627 KHODAKOVSKAYA, M., LI, Y. VA KOVÁ, R., MALBECK J. and McAVOY, R. (2005): Effects of cor15a-IPT gene expression on leaf senescece in transgenic Petunia x hybrida and Dendranthema x gradiflorum. Journal of Experimental Botany. Vol.56. p. 1165-1175 KLEINER, O., KIRCHER, S., HARTER, K. and BATSCHAUER, A. (1999): Nuclear localization of the Arabidopsis blue light receptor cryptochrome 2. The Plant Journal. Vol. 19 (3). p. 289-296 LETHAM, D.S. (1973): Cytokinins from Zea mays. Phytochemistra. Vol. 13. p. 24452455 LETHAM, D.S., PALNI, L.M.S., TAO, G-Q., GOLLNOW, B.I. and BATES, C.M. (1983): Regulators of cell division in plant tissues XXIX. The activities of cytokinin glukosides and alanine conjugates in cytokinin bioassays. J. Plant Growth Regl. Vol. 2. p. 103-115 LI, Y., HAGEN, G. and GUIFOYLE, T.J. (1992): Altered morphology in transgenic tobacco plants that overproduce cytokinins in specific tissues and organs. Developmental Biology. Vol. 153. p. 386-395 LIN, CH. and TODO, T. (2005): The cryptochromes. Genome Biology. Vol 6. p. 220.1220.9 LISCUM, E., HODGSON, D.W. and CAMPBELL, T.J. (2003): Blue light signaling through the cryptochromes and phototropins. So that´s what the blues is all about. Plant Physiol. Vol. 13. p. 1429-1436 LOCHMANOVÁ, G., ZDRÁHAL, Z., KONE NÁ, H., KOUKALOVÁ, Š., MALBECK, J., SOU EK, P., VÁLKOVÁ, M., KIRAN, N.S. and BRZOBHATÝ, B. (2008): cytokinin-induced photomorphogenesis in darkgrown Arabidopsis: a proteomic analysis. Journal of Experimental Botany. Vol. 59. p. 3705-3719 MACHÁ KOVÁ, I. (1998): R st a vývoj: R stové regulátory, v: PROCHÁZKA, S. a kol.: Fyziologie rostlin. Praha Academia. Kap. 8, s. 226-284. ISBN 80-2000586-2
49
MACHÁ KOVÁ, I. a KREKULE, J. (1998): R st a vývoj: Zá ení. v: PROCHÁZKA, S. a kol. : Fyziologie rostlin. Praha Academia. Kap. 9, s. 286-306. ISBN 80-2000586-2 MACHÁ KOVÁ, I. a KREKULE, J. (1996): Biologické hodiny u rostlin. Vesmír 75 [online]
[cit.
23.
b ezen
2010]
Dostupné
na
internetu:
http://www.vesmir.cz/clanek/biologicke-hodiny-u-rostlin McGAW, B.A. and HORGAN, R. (1985): Cytokinin metabolism and the control of cytokinin activity. Biol. Plant. Vol. 27. p. 180-187 McGAW, B.A., HORGAN, R., WUNLLEMS, J.K., SCHILPEROORT, R.A. (1988): Mass spectrometric quantitation of cytokinins in tobacco crown-gall tumours induced by mutated octopine Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens. Planta. Vol. 176. p. 230-234 MILLER, C.O., SKOOG, F.,VON SALTZA, M.H. and STRONG, F. (1955): Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid. J. Am. Chem Soc. Vol. 77. p. 1392-1334 MILLER, C.O., SKOOG, F., OKUMURA, F.S., VON SALTZA, M.H. and STRONG, F.M. (1955): Structure and synthesis of kinetin. J Am Chem Soc. Vol. 78. p. 2662–2663. MILLER, C.O., SKOOG, F., OKUMURA, F., STRONG., F.M. and VON SALTZA, M. (1956): Isolation, structure and synthesis of kinetin, a substance promoting cell division. J. Am. Chem. Soc. Vol. 78. p. 1375-1380 MIYAWAKI, K., MATSUMOTO-KITANO, M and KAKIMOTO, T. (2004): Expression
of
cytokinin
biosynthetic
isopentenyltransferase
genes
in
Arabidopsis: tissue specifity and regulation by auxin, cytokinin, adn nitrate. Plant J. Vol. 37. p. 128-138 MOK, D.W.S. and Mok, M.C. (1994): Cytokinin and plant development-An overview. in: MOK, D.W.S. and MOK, C.M. Cytokinins: Chemistry, Activity and function. CRC Press. p. 155-166. ISBN 0-8493-6252-0 MOK, D.W.S. and MOK, M.C. (2001): Cytokinin metabolism and action. Annu Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. Vol. 52. p. 89-118
50
MOUBAYIDIN, L., DI MAMBRO, R. and SABATINI, S. (2009): Cytokinin-auxin crosstalk. Trends in Plant Science. Vol. 14. p. 557-562 NOBUSADA, T.K. and SAKAKIBARA, H. (2009): Molecular basis for cytokinin biosynthesis. Phytochemistry. Vol. 70. p. 444-449 OND EJ, M., RAKOUSKÝ, S. and KOCÁBEK, T. (1999): Husení ek jako modelová rostlina. O em vypráví genom Arabidopsis thaliana. Vesmír. ro . 78. s. 256258 PERNISOVA, M., KLÍMA, P., HORÁK, J., VÁLKOVÁ, M., MALBECK, J., SOU EK, P., REICHMAN, P., HOYEROVÁ, K., DUBOVÁ, J., FRIML, J., ZAŽÍMALOVÁ, E. and HEJÁTKO, J. (2009): Cytokinins modulate auxininduced organogenesis in plants via regulation of the auxin efflux. PNAS. Vol. 106. p. 3609-3614 PROCHÁZKA, S. a ŠEBÁNEK, J. (1997): Úvod, v: PROCHÁZKA, S., ŠEBÁNEK, J.a kol.: Regulátory rostlinné r stu. Praha Academia. Kap. 1, s. 17. ISBN 80200-0597-8 PROCHÁZKA, S., ŠEBÁNEK, J., GLOSER, J. a SLADKÝ, Z. (2006): Botanika: Morfologie
a
fyziologie
rostlin.
Mendelova
zem d lská
a
lesnická
univerzita.Dotisk Brno. s. 184-212. ISBN 80-7157-870-3 RASHOTTE, A.M., MASON, M.G., HUTCHISON, C.E., FERNANDO, F.J., SCHALLER, G.E. and KIEBER, J.J. (2006): A subset of Arabidopsis AP2 transcription factors mediates cytokinin responses in concert with a twocomponent pathway. PNAS. Vol.103. p. 11081-11085 ROMANO, C.P., ROBSON, P.R., SMITH, H., ESTELLE, M. and KLEE, H. (1995): Transgene-mediated auxin overproduction in Arabidopsis: hypocotyl elongation phenotype and interactions with the hy6-1 hypocotyl elongation and axr1 auxinresistant mutants. Plant Mol. Biol. Vol. 27. p. 1071-1083 ROUNSLEY, S.D., GLIDEK, A., SUTTON, G., ADAMS, M.D., SOMERRVILLE, C.R., VENTER, J.C., and KERLAVAGE, A.R. (1996) The construction of Arabidopsis EST assemblies: A new resource to facilitate gene identification. Plant Physiol. Vol. 112. p. 1177–1183.
51
SÁDLO, J. (1999): Efeméry – život na Záho ov loži. Husení ek rolní v p írod . Vesmír. ro . 78. s. 254-256 SAKAKIBARA, H. (2006): Cytokinins: Activity, biosynthesis, and translocation. Annu. Rev. Plant Biol. Vol. 57. p. 431-449 SCHMÜLLING, T., WERNER. T., RIEFLER, M., KRUPKOVA, E., BARTRINA, Y. and
MANNS,
I.
(2003):
Structure
and
function
of
cytokinin
oxidase/dehydrogenase genes of maize, rice, Arabidopsis and other species. J Plant Res. Vol. 116. p. 241-252 SKOOG, F. and ARMSTRONG, D.J. (1970): Cytokinins. Annu. Rev. Plant Physiol. Vol. 21 p. 359-384 SMALLE, J., HAEGMAN, M., KUREPA, J., VAN MONTAGU, M. and VAN DER STRAETEN, D. (1997): Ethylene can stimulate Arabidopsis hypocotyl elongation in the light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Plant Biology. Vol. 94. p. 2756-2761 SMETS, R., LE, J., PRINSEN, E., VERBELEN, J.P. and VAN ONCKELEN, H.A. (2004): Cytokinin-induced hypocotyl elongation in light-grown Arabidopsis plants with inhibited ethylene action or indolo-3-acetic acid transport. Planta. Vol. 221. p. 39-41 SPÍCHAL, L., WERNER, T., POPA, I., RIEFLER, M., SCHMÜLLING, T. and STRNAD, M. (2008): The purine derivate PI-55 blocks cytokinin action via receptor inhibition. FEBS journal. Vol. 276. p. 244-253 SU, W. and HOWELL, S.H. (1995): The effects of cytokinin and light on hypocotyl elongation are independent and additive. Plant Physiol. Vol. 108. p. 1423-1430 ŠETLÍK, I., SEIDLOVÁ, F. a ŠANTR
EK, J.: Fyziologie rostlin: 11.Ontogeneze I:
Vegetativní fáze, fotomorfogeneze [online] [cit. 24. únor 2010] Dostupné na internetu: http://kfr.prf.jcu.cz/download/lectures/KFR220/KFR220_S11.pdf. TAIZ, L and ZEIGER, E. (2002): Plant Physiology. Third Edition, Sinauer Associates, Sunderland USA, ISBN 0-87893-823-0 TO, J.P.C. and KIEBER, J.J. (2008): Cytokinin signaling: two-components and more. Trends in Plant Science. Vol.13. p. 85-92
52
TORREY, J.G. (1976): Root hormones and plnt growth. Annu. Rev. Plant Physiol. Vol. 27. p. 435-459 URAO, T., YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K. and SHINOZAKI, K. (2000): Twocomponent systems in plant signal transduction. Trends Plant Sci. Vol. 5. p. 6774 VANDENBUSSCHE, F., VRIEZEN, W.H., SMALLE, J., LAARHOVEN, L.J.J., HARREN, F.J.M. and VAN DER STRAETEN, D. (2003): Ethylene and auxin control the Arabidopsis response to decreased light intensity. Plant Physiol. Vol. 133. p. 517-527 VANDENBUSSCHE, F.,VERBELEN, J.P. and VAN DER STRAETEN, D. (2005): Of light and length: regulation of hypokotyl growth in Arabidopsis. BioEssays. Vol. 27. p. 275-284 VANDENBUSSCHE, F., VANCOMPERNOLLE, B., RIEU, I., AHMAD, M., PHILLIPS, A., MORITZ, T., HEDDEN, P. and VAN DER STRAETEN, D. (2007): Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. Vol. 58. p. 42694281 WEINIG, C. (2002): Phytochrome photoreceptors mediate plasticity to light quality in flowers of the Brassicaceae. Journal of Botany. Vol. 89. p. 230-235 WERNER, T., KÖLLMER, I., BARTRINA, I., HOLST, K. and SCHMÜLLING, T. (2006): New insights into the biology of cytokinin degradation. Plant Biol. Vol. 8. p. 371-381 YAMADA, H., SUZUKI, T., TERADA, K., TAKEI, K., ISHIKAWA, K., MIWA, K., YAMASHINO, T. and MIZUNO, T. (2001): The Arabidopsis AHK4 histidine kinase is a cytokinin-binding receptor that transduces cytokinin signals across the memnrane. Plant Cell Physiol. Vol. 42. p. 1017-1023 www. arabidopsis.org DOCUMENTATION FOR THE TAIR GENE MODEL AND EXON CONFIDENCE RANKING SYSTÉM [online] [cit. 25. duben 2010] Dostupné
na
internetu:
ftp://ftp.arabidopsis.org/home/tair/Genes/TAIR9_genome_release/Gene_Confid ence.pdf
53
8 SEZNAM OBRÁZK Obr. 1
Struktura isoprenoidních a aromatických cytokinin
Obr. 2
Struktura PI-55 anticytokininu
Obr. 3
Schéma biosyntézy a metabolismu cytokinin
Obr. 4
Dvou-komponentní systém u bakterií a Arabidopsis
Obr. 5
Model cytokininové signalizace
Obr. 6
Schéma fotoreverzibilního p echodu mezi formami Pr a Pfr fytochromu
Obr. 7
Schéma umíst ní misek v kultiva ním boxu
Obr. 8
Délky hypokotyl Col-0 p i r zné sv telné intenzit sv tla
Obr. 9
Fenotyp klí ních rosltin Col-0 na DMSO a 1 M tZ
Obr. 10
Délky hypokotyl Col-0 a crf mutantních linií
Obr. 11
Délky hypokotyl Col-0 a crf mutantních linií
Obr. 12
Prodlužování hypokotyl crf mutantních linií na tZ
Obr. 13
Relativní hladiny transkriptu ARR5
9 SEZNAM TABULEK Tab. 1
Složení kultiva ního média
Tab. 2
Reak ní podmínky a složení reakce RT
Tab. 3
Reak ní podmínky a složení PCR reakce
Tab. 4
Umíst ní misek na polici, intenzita sv tla a délky hypokotyl klí ních rostlin Col-0
Tab. 5
Délky hypokotyl Col-0 a crf mutantních linií
Tab. 6
Délky hypokotyl Col-0 a crf mutantních linií na DMSO a 1 M tZ
Tab. 7
Prodlužování hypokotyl Col-0 a crf mutantních linií na tZ
Tab. 8
Relativní hodnoty transkriptu
Tab. 9
Koncentrace a istota RNA
54
10 P ÍLOHY P íloha 1: Klí ní rostliny Col-0 a crf mutantních linií. Klí ní rostliny Col-0 na DMSO (D) a 1 M tZ (tZ) (A). Klí ní rostliny jednoduchých mutant (C), dvojných mutant (B) a trojných mutant (D).
A
B
2mm
Col-0 D
Col-0 tZ
crf 2,5 D
55
crf 2,5 tZ
crf 3,5 D
crf 3,5 tZ
C
crf 1 D
crf 1 tZ
crf 2 D
crf 2 tZ
crf 5 D
crf 5 tZ
D
2mm
crf 1,2,5 D
crf 1,2,5 tZ
crf 2,3,6 D
56
crf 2,3,6 tZ
P íloha 2: Délky hypokotylu Col-0 a intenzita sv tla. Tabulka obsahuje délky hypokotyl v milimetrech (DH), standardní chyby (SE) a nam enou intenzitou sv tla (IS). Hodnoty jsou pr m rem ze dvou biologických opakování. Pro každé biologické opakování bylo použito p ibližn deset klí ních rostlin.
tZ
DMSO miska
DH
SE
IS
DH
SE
IS
1
2,77
0,2433
23,9
4,59
0,4177
20,9
2
2,39
0,1567
23,0
2,87
0,1417
23,6
3
2,93
0,2786
18,2
4,63
0,3672
17,8
4
2,51
0,2233
23,5
4,20
0,4375
19,9
5
2,43
0,1699
18,8
4,09
0,2955
12,9
6
2,74
0,2294
16,1
4,54
0,3416
13,9
7
2,47
0,2173
22,4
4,17
0,2615
20,3
8
2,37
0,1707
16,6
3,93
0,3559
12,6
9
2,61
0,2817
14,9
4,25
0,4311
14,4
10
2,43
0,2151
21,8
4,20
0,3383
20,5
11
2,33
0,2069
13,8
4,30
0,3346
12,4
12
2,68
0,2204
15,3
4,59
0,4287
12,0
13
2,26
0,1366
21,8
4,22
0,3006
21,8
14
2,32
0,1948
13,5
4,31
0,3259
12,2
15
2,56
0,2170
15,0
4,28
0,2928
13,9
57
P íloha 3: Délky hypokotyl Col-0 na DMSO a tZ p i 18 mol.m-2.s-1. Délky hypokotyl jsou v milimetrech. Chybové úse ky znázor ují st ední chybu.
P íloha 4: P evodní koeficienty (www.apogee-inst.com/conv_lux.html).
! " #
%$&'
! " #
%$:; : 5&
% ( $)" *+, #.
/'
% ( $)" *+, #.
:; : <&
0 . % .123 (" . #123 #1) 4 .
5
0 . % .123 (" . #123 #1) 4 .
:; :
0 . % .6 3 7 ( #6 8+9 #.0
/
0 . % .6 3 7 ( #6 8+9 #.0
:; : '
0 + )% =, # ( " 0 + )% ? =, # ( " . > 2- % ( % % ?; =, " . (@ . > 2- % ( %% ; =, " . (@ = 63 2 4 ::: = 63 2 4 :5; ::: ? ) ) :5; ::: ? ::: A &' ; ::: @ ) :5::: A :@ : 5& ;
Mikromol za sekundu na metr tvere ní (µmol.m-2 .s-1). Tento termín je založen na po tu foton v ur ité vlnové délce za jednotku asu (s) na jednotku plochy (m2), d lený Avogadrovou konstantou (6,022 x 10 23mol -1 ). Používá se b žn k popisu PAR v 400-700 nm vlnové pásmo.
58
