CMV-IgA-ELA Test PKS medac Enzymoimunologický test se systémem kontroly pipetování (SKP) na průkaz protilátek IgA proti cytomegalovirus (CMV)
Český
0123
112-PKS-VPCZ/080305
VÝROBCE: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Fehlandtstraße 3 D-20354 Hamburg
MARKETING: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstrasse 6 D-22880 Wedel Tel.: Fax:
++49-4103-8006-0 ++49-4103-8006-359
DISTRIBUCE/ADRESA PRO PŘÍJEM OBJEDNÁVEK: ASCO-MED, spol. s.r.o. Pod Cihelnou 23 161 00 Praha 6 Tel.: ++420-2-333135 78, 79, 80 Fax: ++420-2-333135 82
112-PKS-VPCZ/080305
CMV-IgA-ELA Test PKS medac Enzymoimunologický test se systémem kontroly pipetování (SKP) na průkaz protilátek IgA proti cytomegalovirus (CMV) Katalogové číslo: 112-PKS POUZE PRO DIAGNOSTICKÉ POUŽITÍ IN VITRO
ÚVOD Cytomegalovirus (CMV) patří do skupiny lidských patogenních herpetických vírů, které obsahují dvouprovazcový genom DNA. Pro tyhle viry je typické, že po proběhnutí primární infekce mohou zůstat latentně v organizmu. V důsledku toho může za určitých podmínek dojít k reaktivaci viru. Infekce cytomegalovirem probíhají u imunokompetentních osob obyčejně nenápadně. U imunosupresivních osob (např. pacienti po transplantaci, lidé infikovaní virem HIV, tumoroví pacienti nebo novorozenci) se však pozorují závažně symptomy nejrůznějšího druhu. Obyvlášť důležitý je CMV jako častý agens prenatálních infekcí. Tyto infekce mohou způsobit závažné poškození dítěte, přičemž nelze vyloučit pozdní poruchy také u dětí narozených bez symptomů. Specifické protilátky IgA proti CMV byli detekovány v sérech pacientů po transplantaci orgánů a korelovali s nálezem specifických protilátek IgM proti CMV. Protilátky IgA proti CMV mohou být z toho důvodu považovány za markry akutních infekcií. Kombinace detekce specifických protilátek IgA proti CMV společně s průkazem antigenu a průkazem specifických protilátek IgM proti CMV vedla u pacientů po transplantaci orgánů ke zvýšení specifity diagnózy infekce CMV.
112-PKS-VPCZ/080305
1
Kromě
CMV-IgA-ELA Test PKS medac katalogové číslo: 112-PKS, na 96 stanovení
nabízíme kromě jiného následující produkty: CMV-IgM-ELA Test PKS medac katalogové číslo: 110-PKS na 96 stanovení, CMV-IgG-ELISA PKS medac katalogové číslo: 115-Q-PKS na 96 stanovení, CMV-IgG-ELA Test PKS medac katalogové číslo: 115-PKS na 96 stanovení, CMV-IgG-ELA Test PKS medac katalogové číslo: 116-PKS na 5 x 96 stanovení.
2
112-PKS-VPCZ/080305
Princip testu
Mikrotitrační deštička je pokryta protihumánním IgA.
Frakce IgA ze vzorek séra se váže na mikrotitrační deštičku.
Protilátky proti anti-CMV-IgA se vážou na peroxidázou konjugované CMV-IgA-ELA (AG = antigen, P = peroxidáza).
Inkubace se substrátem TMB (*). Reakce se zastaví přidáním kyseliny sírové. Absorpce se odčítá foto-metricky.
Výhody testu )
Žádné nespecifické reakce a žádné falešně pozitivní výsledky způsobené revmatoidními faktory.
)
Nedochází k blokování protilátek IgA vysokým titrem IgG.
)
Systém kontroly pipetování umožňuje vizuálně sledovat krok pipetování, při kterém dochází ke změnám barev.
)
Lámací proužky s mikrojamkami umožňují efektivní využití testu.
)
Testy lze automatizovat pro otevřené zařízení ELISA.
112-PKS-VPCZ/080305
každý
3
OBSAH SOURAVY Katalogové číslo: 112-PKS 1.
MTP Mikrotitrační destička: 12 proužků po 8 jamkách (s desikantem v hliníkovém vakuovém balení), lámací proužky, dno tvaru písmena U, pokrytá kozími protilátkami proti IgA, BSA, a indikátorem pH, připravena k použití.
2.
CONTROL Negativní kontrola: 2 lahvičky s obsahem každá po 0,75 ml, lidské sérum, připravena k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClin 300 a gentamycin sulfát.
3.
CONTROL + Pozitivní kontrola: 2 lahvičky s obsahem každá po 0,75 ml, lidské sérum, připravena k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClin 300 a gentamycin sulfát.
4.
WB Promývací roztok: 1 lahvička s obsahem 100 ml, PBS/Tween (10 x), pH 7,2 - 7,4,obsahuje ProClin 300.
5.
VIR-DIL Roztok na ředění vzorků: 1 láhev s obsahem 110 ml, PBS/Tween/BSA, pH 7,2 - 7,4, připraven k použití, obsahuje ProClin 300.
6.
ANTIGEN CMV-IgA-ELA (enzymem označený antigen): 4 lahvičky každá s obsahem po 5,0 ml, lyofilizovaný, zbarvený žlutě, obsahuje FKS, konjugovaný HRP.
7.
TMB Substrát TMB: 1 lahvička s obsahem 10 ml, připravena k použití.
8.
4
STOP Roztok na zastavení reakce: 2 lahvičky s obsahem každá po 14 ml, 0,5 M kyselina sírová (H2SO4), připraven k použití.
112-PKS-VPCZ/080305
1.
SKLADOVÁNÍ A STABILITA
MATERIÁL/REAGENCIE Zkušební souprava
STAV SKLADOVÁNÍ neotevřená 2...8°C
Mikrotitrační destička
otevřená
Kontroly Promývací roztok Roztok na ředění vzorků CMV-IgA-ELA Substrát TMB Roztok na zastavení reakce
2...8°C v sáčku s desikantem otevřené 2...8°C Zředěný 2...8°C otevřený 2...8°C rozpuštěný 2...8°C otevřený 2...8°C otevřený 2...8°C
STABILITA do uplynutí použitelnosti 6 týdnů 6 týdnů 6 týdnů 6 týdnů 5 dní 6 týdnů do uplynutí použitelnosti
Nepoužívejte reagencie po uplynutí data jejich použitelnosti. 2.
DALŠÍ
POŽADOVANÉ REAGENCIE
A MATERIÁLY
2.1. Aqua ad iniectabilia (H2O bidest.). Použití pouze deionizované vody může negativně ovlivnit výsledek testu. 2.2. Mikropipety pro potřebné objemy. 2.3. Čisté skleněné nádoby promývacího roztoku.
na
ředění
2.4. Vhodné zařízení na promývání mikrotitračních destiček multikanálová pipeta nebo promývačka na testy ELISA).
(např.
2.5. Inkubátor pro 37 2.6. Fotometr na 620 - 650 nm. 3.
o
nebo
nádoby
z umělé
hmoty
C.
mikrotitrační
destičky
s filtry
na
450
nm
a
PŘÍPRAVA REAGENCIÍ
Před zahájením testu vytemperujte všechny teplotu, aby nedocházelo ke kondenzaci.
komponenty
na
pokojovou
Stanovte požadovaný počet mikrotitračních jamek.
112-PKS-VPCZ/080305
5
3.1. Mikrotitrační destička Hliníkový sáček se musí spolu s desikantem po každém otevření opět pevně uzavřít. Skladování a životnost nepoužitých mikrotitračních jamek je uvedená v tabulce číslo 1. Pokyn: Jamky mikrotitrační deštičky mají slabě zelený odstín. Rovněž se objevující zeleno-hnědé skvrny v jamkách jsou způsobené zpracováním deštičky a nemají negativní vliv na provedení a výsledek testu. 3.2. Promývací roztok Zmíchejte jednu objemovou část koncentrátu promývacího roztoku (10 x) s devíti částmi aqua ad iniectabilia (např. 50 ml koncentrátu roztoku (10 x) s 450 ml aqua ad iniectabilia). Na 8 jamek budete potřebovat 10 ml zředěného roztoku promývacího roztoku. Krystaly v promývacím roztoku (10 x) se musí rozpustit zahřáním (max. na 37°C) nebo promícháním při pokojové teplotě. 3.3. CMV-IgA-ELA Lyofilizát zřeďte s 5,0 ml roztoku na ředění vzorků. Uzavřená lahvička se musí lehce potřást, aby se částice z uzávěru dostali do roztoku. Po rozpuštění je CMV-IgA-ELA zbarvený žlutě a hotový k použití. Reagencie jednoho testu (mikrotitrační destička, kontroly, CMVIgA-ELA) se nesmí zaměňovat s reagenciemi jiných šarží. Oproti tomu se roztok na ředění vzorků, promývací roztok, substrát TMB a roztok na zastavení reakce u všech virologických testů firmy medac mohou principiálně zaměňovat. Reagencie jiných výrobců se obecně v tomto testu nesmí používat. Pouze při přesném dodržení pracovních předpisů obdržíte validní a reprodukovatelné výsledky. 4.
VZORKY
4.1. Test je vhodný pro
vzorky
séra.
4.2. Před testem není potřebné provádět žádnou úpravu séra např. deaktivaci. Testované vzorky séra však nesmí být kontaminované mikroorganismami ani nesmí obsahovat lidské erytrocyty.
6
112-PKS-VPCZ/080305
4.3. Séra rozřeďte v poměru 1 : 100 roztokem na ředění vzorek. Pro určení titru se vzorky mohou dále libovolně ředit. 5.A. PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU 5.1. Otevřete obal mikrotitrační deštičky a vyberte požadovaný počet mikrotitračních proužků (viz 3.1.). Mikrotitrační promývat.
deštičky
jsou
připraveny
k
použití
a
nemusí
se
5.2. Jamku A1 nechte prázdnou (viz 6.A.) pro určení pozadí. Do jamek na destičce napipetujte 50 µl zředěných vzorek, v duplikátech negativní kontrolu a pozitivní kontrolu. Po napipetování se vzorky (neutrální nebo bazické kapaliny) v jamkách zbarví modře. Pokud se roztok v některé jamce nezbarví, znamená to, že do ni nebyl napipetován vzorek nebo kontroly. V případě potřeby se může mikrotitrační deštička před zpracováním ponechat ve vlhké komoře maximálně 30 minut při pokojové teplotě nebo při 2 - 8 °C maximálně po dobu 60 minut. 5.3. Inkubujte deštičku 60 minut (± 5 minuty) při 37 komora nebo inkubační fólie).
o
C (± 1
o
C) (vlhká
5.4. Rozpusťte CMV-IgA-ELA (viz 3.3). 5.5. Po inkubaci promyjte každou mikrotitrační jamku třikrát 200 µl promývacího roztoku. Po dobu promývaní dbejte na to, aby se jamky pořádně naplnily. Po promytí vyklepete mikrotitrační deštičku na filtračním papíru. Jamky nenechte vyschnout! Pokračujte v práci okamžitě ! 5.6. Do každé žlutě).
jamky
napipetujte
(kromě
A1)
CMV-IgA-ELA
(zbarvený
Při manuálním zpracování testu napipetuje do každé jamky 50 µl konjugátu. Upozornění: Při práci na automatizovaných přístrojích je potřebné naprogramovat 60 µl pro každou jamku, protože v inkubačních komorách těchto zařízení dochází k intenzivnímu vypařování. V rámci validace testu pro automatické zpracování se ukázalo, že tento test je v podstatě vhodný také pro automatické zpracování. 112-PKS-VPCZ/080305
7
Nicméně doporučujeme verifikovat jeho kompatibilitu s přístrojem, na kterém se bude pracovat." o
5.7. Znovu inkubujte 60 minut (± 5 minuty) při 37 komora nebo inkubační fólie).
C (± 1
o
C) (vlhká
5.8. Po inkubaci promyjte mikrotitrační jamky znovu (viz 5.5). 5.9. Do všech jamek (včetně A1) přidejte 50 µl substrátu TMB a inkubujte 30 minut (± 2 minuty) ve tmě při teplotě 37 °C (± 1 oC) (vlhká komora nebo inkubační fólie). Pozitivní vzorky se zbarví modře. 5.10.Přidáním 100 µl roztoku na zastavení reakce do každé jamky (včetně A1) se reakce zastaví. Modré zbarvení vzorek se změní na žluté. Před fotometrickým měřením vyčistěte ze spodu mikrotitrační deštičku a zkontrolujte, zda-li v jamkách nejsou žádné bublinky vzduchu. Odečtení je nutno zastavení reakce.
provádět
během
15
minut
po
přidání
roztoku
na
5.B. TABULKA ZNÁZORŇUJÍCÍ PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU
Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky
Prázdná jamka (A1)
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Vzorky
-
50 µl -
50 µl -
50 µl
Inkubujte 60 minut při teplotě 37 °C, 3 x promyjte 200 µl promývacího roztoku. CMV-IgA-ELA
-
50/60 µl *)
50/60 µl *)
50/60 µl
*)
Inkubujte 60 minut při teplotě 37 °C, 3 x promyjte 200 µl promývacího roztoku. Substrát TMB
50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Inkubujte ve tmě 30 minut při teplotě 37 °C. Roztok na zastavení 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl reakce Fotometrické odečtení optické density při 450 nm (ref. vln. Délka 620650 nm). *) manuální/automatický postup (viz 5.6.)
8
112-PKS-VPCZ/080305
6.A. HODNOCENÍ TESTU (VALIDITA) *
Fotometrické vyhodnocení se provází při (referenční vlnová délka 620 - 650 nm).
vlnové
délce
*
Od všech hodnot OD
*
Kritéria validity Střední hodnota OD negativní kontroly musí být < 0,150. Střední hodnota OD pozitivní kontroly musí být > 0,600.
450
nm
odečtěte OD pozadí (A1 jamka).
Pokud kriteriá validity najsou splnena, musí se test opakovat. *
Cut-off = Střední hodnota OD negativní kontroly + 0,140
*
Šedá zóna = cut-off ± 10 %.
6.B. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ *
Vzorky s hodnotami OD pod spodní hranicí šedé zóny se hodnotí jako NEGATIVNÍ.
*
Vzorky s HRANIČNÍ.
*
Tyhle séra se musí opět zkontrolovat po 14 dnech s nověodebraným vzorkem, aby se zjistil pohyb titru.
*
Vzorky s hodnotami OD nad horní hranicí šedé zóny se hodnotí jako POZITIVNÍ.
*
Výsledky testu se musí interpretovat vždycky společně s klinickým obrazem pacienta a dalšími diagnostickými parametry.
*
Bylo sledovaných 59 potenciálně křížově reaktivních sér. Žádné z nich nebylo reaktivní v testu IgA.
*
Velmi vysoké hodnoty lipidů výsledky zkreslit. Vysoké hodnoty hemoglobinu a testu.
hodnotami
OD
v oblasti
šedé
mohou
se
hodnotí
v jednotlivých
bilirubinu
112-PKS-VPCZ/080305
zóny
neovlivňují
jako
společně
případech výsledky
9
7.
CHARAKTERISTICKÉ VLASTNOSTI TESTU Při diagnostické evaluaci jsme charakteristické vlastnosti testu.
zjistili
následující
7.A. SPECIFITA Z celkově 300 sér od dárců krve bylo testem CMV-IgA-ELA Test PKS medac 296 sér detekovaných jako negativní. Zbývající čtyři séra – tři z nich hraniční a jedno slabě pozitivní v testu IgA – ukazovali všechny vysoké titry CMV-IgG, jedno sérum dokonce pozitivní CMV-IgM. V jiném porovnávacím referenčním testu bylo z těch samých 300 sér 284 negativních, 2 hraničních a 14 pozitivních. 7.B. CITLIVOST Z celkově 105 sér, které byli uvedeným referenčním testem určené jako CMV-IgA pozitivní, detekoval test CMV-IgA-ELA PKS medac 101 sér jako pozitivní, 2 jako hraniční a 2 jako negativní. To odpovědá relativní citlivosti 96,2 %.
7.C. PŘESNOST Vzorky
Variace intraassay Vzorky Variace interassay (n = 24) (n=11) střední OD SP CV (%) střední OD SP CV (%) NK NK 0,047 0,007 14 0,044 0,005 12 SP SP 0,341 0,014 4 0,276 0,034 12 PK PK 1,601 0,047 3 1,391 0,119 9 Č. 1 Č. 1 0,047 0,009 12 0,052 0,008 16 Č. 2 Č. 2 0,223 0,010 5 0,201 0,020 10 Č. 3 Č. 3 2,473 0,052 2 2,184 0,187 9 NK = negativní kontrola; SP = slabě pozitivní kontrola (není obsáhnutá v soupravě); PK = pozitivní kontrola
10
112-PKS-VPCZ/080305
VŠEOBECNÉ RADY TÝKAJÍCI SE MANIPULACE *
Aby se předešlo vzájemné kontaminaci jednotlivých nezaměňujte lahvičky a jejich šroubové uzávěry.
reagencií,
*
Reagencie je potřebné ihned po použití uzavřít, k jejich vypařování a mikrobiální kontaminaci.
*
Po skončení testu se musí reagencie uložit tak, jak je uvedené v pokynech, aby se zachovala jejich garantovaná životnost.
*
Aby se předešlo záměně reagencií různých testovacích systémů nebo šarží, musí se všechny komponenty jednoho setu po použití skladovat spolu v původním balení (viz také 3.).
aby
nedošlo
INFORMACE TÝKAJÍCI SE BEZPEČNOSTI A OCHRANY ZDRAVÍ *
Je nevyhnutné dodržovat místní předpisy týkající se bezpečnosti práce.
*
Reagenty lidského původu použité při výrobě tyto soupravy byli testované a bylo zjištěno, že nejsou infikované HBsAg, HIV 1/2 a HCV. Přece důrazně doporučujeme, aby všechen zvířecí materiál byl při manipulaci považován za možný zdroj nákazy a podle toho se přijali příslušná bezpečnostní opatření.
RADY TÝKAJÍCÍ SE LIKVIDACIE Zbytky chemikálií a preparátů jsou všeobecně považovány za speciální odpad. Likvidace tohoto druhu odpadu se řídí národními a regionálními zákony a předpisy. Obraťte se na orgány místní správy nebo na organizace zabývající se odpady, které vám podají informace, jak tyhle nebezpečné odpady likvidovat. Datum vydání: 08.03.2005
112-PKS-VPCZ/080305
11
LITERATURA Braun, W., Hehr, B., Rabenau, H., Doerr, H. W.: Serologische Diagnostik der Zytomegalie bei immunsupprimierten Patienten. AIDSForschung (AIFO), sešit 11, 634-638, (1987). Braun, W., Weber, B., Moell, U., Hamann, A. and Doerr, H. W.: Immunoglobulin A a M patterns to human cytomegalovirus during recurrent infection in patients with AIDS using a modified Western blot. J. Virological Methods, č. 43, 65-67, (1993). Delacroix, D. L.: The human immunoglobulin A system, its vascular cempartment. Thesis European Medical Press, (1985). Doerr, H. W., Rentschler, M., Schleifer, G.: Serologic detection of active infections with human herpes viruses (CMV, EBV, HSV, VZV): diagnostic potential of IgA class and IgG subclass-specific antibodies. Infection č. 15, 93-98, (1987). Engelhard, D., Weinberg, M., Or, R., Shaked, O., Naparstek, E., Haikin, H., Slavin, S., Sarov, I.: Immunoglobulins A, G a M to cytomegalovirus during recurrent infection of recipients of allogenic bone marrow transplantation. Journal Infect. Disease, č. 163, 628-630, (1991). Levy, E., Margalith, M., Sarov, B., Sarov, I., Rinaldo, C. R., Detels, R., Phair, J., Kaslow, R., Ginzburg H. and Saah, A. J.: Cytomegalovirus IgG and IgA serum antibodies in a study of HIV infection and HIV related diseases in hemosexual men. J. Med. Virol., č. 35, 174-179, (1991). Linde, G. A., Hammarström, L., Persson, M. A. et. al., Virus-specific antibody activity of different subclasses of immunoglobulins G a A in cytomegalovirus infections. Infect. Immun., Nr. 42, 237-244, (1983). Merlino, C., Angeretti, A., Segoloni, G. P., Giacchino, F., Rossetti, M. and Negro Ponzi, A.: CMV-specific polymeric and monemeric IgA antibodies in serum of renal transplant patients. Panminerva Med., sv. 33, č. 4, 173-179, (1991). Nielsen, L. N. , Sorensen, I., Andersen, H.K.: Kinetics of specific immunoglobulins M, E, A and G in congenital primary and secondary cytomegalovirus infection studied by antibody-captured enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol., č. 26, 654-661, (1988).
12
112-PKS-VPCZ/080305
Porath, A., Hanuka, N., Keynam, A. and Sarov, I.: Virus-specific IgG, IgM a IgA antibodies in cytomegalovirus mononucleosis patients as determined by immunoblotting technique. J. Med. Virol., č. 22, 223230, (1987). Rautenberg, P., Fischer, L., Tönnies, R., Franke, D.: Evaluation of a novel immunoglobulin A capture enzyme immunoassay for diagnosis of cytemegalovirus infection in renal and heart transplant recipients. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16, 653-659, (1997). Sarov I., Sinqueira-Linhares, M., Chardonnet, Y., Levy, E., Aymard, M., Bosshard, S., Nord, E., Revillard, J.P.: Detection of specific IgA antibodies in serum of kidney transplant patients with recurrent cytomegalovirus infection. Intervirology, č. 15, 228-234, (1981). Sarov, I., Haikin, H.: Human cytomegalovirus specific IgA antibodies detected by immunoperoxidase assay in serum of patients with cytomegalovirus infections. J. Virological Methods, č. 6, 161-169, (1983). Strand, O. A., Hoddewick, G. M.: The diagnostic significance of specific serum IgA detection in cytemegalovirus infections. Arch. Virol., č. 82, 173-180, (1984). Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder, U. and Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate between primary and recurrent or long-term human cytemegalovirus infections in pregnant women. Poster presented at the 6th International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA, (1997). Torfason, E.G., Källänder C. and Halonen, P.: Solid-phase radioimmunoassay of serum IgG, IgM a IgA antibody to cytemegalovirus. J. Med. Virol., č. 7, 85-96, (1981). Weber, B., Hamann, A., Ritt, B., Rabenau, H., Braun, W., and Doerr, H.W.: Comparison of shell viral culture and serology for the diagnosis of human cytomegalovirus infection in neonates and immunocompremised subjects. Clin. Investig. č. 70, 503-507, (1992). Weber, B., Klinghardt, U., Lux, A., Braun, W., Rabenau H. and Doerr, H. W.: Detection of neutralizing antibodies against human cytomegalovirus: influence of strain variation. J. Med. Virol., č. 40, 28-34, (1993).
112-PKS-VPCZ/080305
13
