CHLAMYDIA TRACHOMATIS LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA A INTERPRETACE

CHLAMYDIA TRACHOMATIS LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA A INTERPRETACE Mgr. Jana Kolářová, Ph.D. Laboratoře Mikrochem a.s. Olomouc

Chlamydia trachomatis

• gramnegativní bakterie intracelulárně parazitující na hostitelské buňce (ATP) – epitelové buňky urogenitálního traktu, dýchacího ústrojí, spojivek,… • elementární tělísko ↔ retikulární tělísko infekční forma metabolicky aktivní, dělení

Beatty WL, Morrison RP, Byrne GI. Persistent chlamydiae: from cell culture to a paradigm for chlamydial pathogenesis. Microbiol Rev 1994; 58: 686–699. http://www.remedia.cz/Archiv-rocniku/Rocnik-2010/5-2010/Chlamydia-pneumoniae-na-ceste-od-respiracniho-patogenu-k-extrapulmonalnim-onemocnenim/e-Oa-XgXq.magarticle.aspx

EPIDEMIOLOGIE výlučně lidský patogen SÉROTYP ONEMOCNĚNÍ

PŘENOS

A, B, Ba, C

přímý kontakt, tropy a subtropy kontaminované ruce, předměty, voda, hmyz

TRACHOM

D, Da, E, OKULOGENITÁLNÍ F, G, H, I, CHLAMYDIÓZA, Ia, J, K U NOVOROZENCŮ KONJUKTIVITIDA A PNEUMONIE L1, L2, L2a, L3

pohlavní styk

VÝSKYT

celosvětově

perinatální přenos

LYMPHOGRANULOMA pohlavní styk VENEREUM

hl. rozvojové země tropů, zřídka Evropa a Severní Amerika

TRACHOM Chronická keratokonjuktivitida vedoucí k ložiskovým nekrózám a jizvám na spojivce. Oční víčko se stáčí a řasy při mrkání poškozují rohovku. Dochází k jejímu zakalení a za 20 – 30 let ke slepotě.

•

http://www.svetloprosvet.cz/cs/jak-pomahame/podporovane-projekty/trachom/

http://homestdtestkit.org/what-is-chlamydia/

LYMPHOGRANULOMA VENEREUM • Postižení lymfatických uzlin • U neléčených pacientů - destruktivní zánět s následným zjizvením ve tkáni genitálu a konečníku, píštěle, elefantiáza genitálu

•

http://www.skinsight.com/adult/lymphogranulomaVenereumLGV.htm

OKULOGENITÁLNÍ CHLAMYDIÓZA • C. trachomatis – nejčastější sexuálně přenosný bakteriální patogen světa • Často asymptomaticky či s mírnými příznaky riziko: 1) přenos horizontální i vertikální 2) neléčená chlamydióza může u žen vést k poškození reprodukčních orgánů → sterilita, mimoděložní těhotenství,…

PŘÍZNAKY MUŽI

ŽENY

NOVOROZENCI

uretritida

cervicitida

inkluzní konjuktivitida

prostatitida

endometritida

pneumonie

epididymitida

salpingitida

rinofaringitida

proktitida

periadnexitida

mesotitida

perihepatitida: Fitz-Hughův-Curtisův sy.

perihepatitida: Fitz-Hughův-Curtisův sy.

vulvovaginitida

artritida: Raynaudův syndrom infekční artritida reaktivní postinfekční artr.

artritida: Raynaudův syndrom infekční artritida reaktivní postinfekční artr.

inkluzní konjuktivitida

inkluzní konjuktivitida uretritida proktitida

INDIKACE K VYŠETŘENÍ • • • • • •

Pacienti s výše uvedenými příznaky Sexuální partneři Rodiče infikovaných novorozenců Osoby s poruchou plodnosti Dárci spermatu Vzhledem k tomu, že infekce probíhá často bezpříznakově a může vést k trvalým následkům (sterilita) doporučuje CDC každoroční test na Chlamydii trachomatis všem sexuálně aktivním ženám ve věku do 25-ti let, starším ženám s rizikovým faktorem (které mají nového sexuálního partnera, nebo více sexuálních partnerů) a všem těhotným ženám.

DIAGNOSTIKA V NAŠÍ LABORATOŘI • PŘÍMÝ PRŮKAZ: speciální odběrové soupravy – lze vyžádat v naší laboratoři

imunofluorescence PCR genová sonda (Přerov) • NEPŘÍMÝ PRŮKAZ: ELISA imunoblot

IMUNOFLUORESCENCE ODBĚR A TRANSPORT DO LABORATOŘE: Stěr z cervixu, popř. výtěr z uretry Při odběrech z pohlavního ústrojí je nutno použít techniku dvou tamponů (prvním odstranit hlen, druhým provést abrazi epiteliálních buněk). Je třeba použít speciální podložní sklíčka vhodná pro imunofluorescenci a nátěr po zaschnutí fixovat přelitím 96% etanolem. Uchovávat do doby transportu v ledničce (max. 1 den), popř. zamrazit (více než den). Potřebné komponenty dodáváme.

IMUNOFLUORESCENCE V laboratoři se na sklíčko se vzorkem aplikují monoklonální protilátky konjugované s fluoresceinem (BIO RAD). Ty reagují s MOMP (major outer membrane protein) C. trachomatis. Fluorescenční mikroskop: Hledáme minimálně 10 elementárních tělísek - typická velikost, tvar a záření (barva). Toto vyšetření je vhodné pro akutní infekci. Při chronických infekcích již nemusí být elementární tělíska v místech odběru zachycena. Oproti PCR je imunofluorescence: - méně citlivá - nelze použít moč + levnější

PCR ODBĚR A TRANSPORT DO LABORATOŘE: Stěr z cervixu: • odstraníme přebytečný hlen z osy cervixu a z okolí ektocervixu pomocí tamponu • vnoříme kartáček 1-1,5 cm do osy cervixu tak, aby se zadní štětičky kartáčku dotýkaly ektocervixu • kartáčkem 3x otočíme proti směru hodinových ručiček • kartáček do cervikálního kanálu nezasunujeme úplně • kartáček vložíme na dno přepravní zkumavky, nesmí se dotknout vnějších stěn přepravní zkumavky ani žádného jiného předmětu • část tyčinky kartáčku, která vyčnívá ze zkumavky, ohneme o hranu zkumavky a zlomíme u vyznačené rýhy • zkumavku pečlivě uzavřeme víčkem u těhotných žen (nepoužívat cervikální kartáček!) • odstraníme přebytečný hlen z osy cervixu a z okolí ektocervixu pomocí jednoho ze dvou dodaných dakronových tamponů • vnoříme další tampon do endocervikálního kanálu a 5x s ním otočíme o 180 °, pokaždé změníme směr otáčení • setřeme důkladně celou oblast transformační zóny • opatrně vyjmeme tampon, vyvarujeme se kontaktu s vaginální sliznicí • tampon vložíme na dno přepravní zkumavky, odlomíme násadku u označené rýhy a bezpečně zkumavku uzavřeme

PCR ODBĚR A TRANSPORT DO LABORATOŘE: Výtěr z uretry: • (hlavně muži) • Při infekci ženského urogenitálního traktu je často vhodné k vyšetření odeslat výtěr cervixu spolu s výtěrem uretry. • Obecně odběr uretrálních vzorků se provádí dakronovým tamponem šroubovitým vsunutím do hloubky 3-4 cm. Moč: Průkaz v moči je účinnou neinvazivní formou detekce chlamydií u mužů i žen, ale při chronických infekcích je zatížen rizikem falešné negativity z důvodu často velmi nízké koncentrace v tomto materiálu (chlamydie se při kolonizaci uretry mohou, ale nemusí do moči uvolňovat). Na vyšetření se odebírá prvních 15-30 ml moče (není nutná ranní moč, ale 1-2 hodiny před odběrem nemočit), vzorek se do vyšetření uchovává v chladu (+4 °C) přípustné až 3 dny; při delším uchování je možné moč zamrazit. Ejakulát • Pro stanovení chlamydiové kontaminace spermatu je třeba vyšetřit min. 200 μl ejakulátu. Při odběru vzorků je třeba vždy dodržovat zásady sterility, vložit je do zkumavky bez transportního média a uchovat nebo transportovat při +4 °C do 24 h. V případě delšího uchovávání zamrazit na -20 °C. Oko: • Je-li přítomen hnis nebo exudát, jemně očistit místo odběru vatovým tamponem. Poté vytřít dakronovým (nylonovým) tampónem malého objemu na plastové tyčince 2 až 3 tahy dolní a pak horní spojivku. Tampon vsunout-zalomit do prázdné sterilní zkumavky – uzavřít. Pozor, na transport tampónu nelze použít žádné transportní půdy, pouze prázdná zkumavka, jinak dojde ke znehodnocení vzorku!!! Transport do laboratoře: co nejdříve do laboratoře (do 6 hodin), při chlazení 4-8 °C: 3 dny

PCR METODA: RT-PCR (real-time polymerase chain reaction) • Simultánní detekce genomové a plasmidové DNA Chlamydia trachomatis metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) a měření nárůstu koncentrace amplifikačního produktu v průběhu PCR pomocí fluorescenčně značené sondy. • Detekce je cílená na multikopiovou sekvenci kryptického plasmidu umožňující vysokou sensitivitu vyšetření a zároveň na sekvenci genu kódujícího bakteriální 16S RNA jedinečnou pro Chlamydia trachomatis umožňující vysokou specificitu reakce. Referenční hodnoty: • negativní = nepotvrzení přítomnosti nukleové kyseliny Chlamydia trachomatis • pozitivní = potvrzení přítomnosti nukleové kyseliny Chlamydia trachomatis Test prokazuje viabilní i neviabilní baktérie, proto pozitivní nález nemusí vždy znamenat přítomnost viabilního patogenu a floridní infekce, protože prokázaná DNA může pocházet z již rozpadlých mikrobiálních agens vlivem předchozí ATB terapie nebo z období perzistující chronické infekce. PCR je vysoce citlivá a specifická metoda, která je obecně až o 20-30% citlivější než všechny dosud používané diagnostické metody.

ELISA, IMUNOBLOT ODBĚR A TRANSPORT DO LABORATOŘE: 5ml srážlivé krve, chladit

V LABORATOŘI: Z krve se získá sérum, které se vyšetřuje na přítomnost IgA a IgG protilátek proti Chlamydia trachomatis. 1) Metodou ELISA (TestLine) Stanovuje protilátky proti MOMP. 2) Metodou Imunoblot (ALL.DIAG S.A.) Stanovuje protilátky proti více antigenům. → Větší citlivost, konfirmace sporných výsledků. 4 rekombinantní antigeny (MOMP, OMP2, HSP60, MIP).

ELISA - INTERPRETACE IgA

IgG hodnocení

-

-

Negativní výsledek. Pozor – falešná negativita v příliš časné fázi infekce.

+ ++

-

Počínající infekce.

+/+

+

Dříve prodělaná infekce. Začínající reinfekce. Žádáme o druhý vzorek k posouzení dynamiky protilátkové odpovědi.

++

+

Nedávno proběhlá nebo probíhající infekce. Opakující se infekce. Chronická infekce (potvrzení chronicity opakovaným vyšetřením za 3 měsíce, popř. imunoblot, nutné klinické příznaky).

-

+

Anamnestické protilátky po dříve prodělané infekci.

Labor. nálezy je nutno vždy hodnotit s přihlédnutím k anamnéze a klinickému stavu pacienta.

IMUNOBLOT - INTERPRETACE

antigen

IgG

IgA

MOMP (major outer membrane protein)

6

6

OMP2 (outer membrane protein 2)

2

3

HSP60 (heat shock protein 60)

1

3

MIP

3

3

(macrophage infectivity potentiator)

Na základě klinických hodnocení a matematické analýzy bylo vypracováno bodové hodnocení testu. celkový počet bodů

hodnocení

≤3

negativní

4-5

hraniční

≥6

pozitivní

Protilátky proti HSP60 mohou být interpretovány jako ukazatel závažnosti nebo chronicity infekce.

ELISA, IMUNOBLOT ÚSKALÍ INTERPRETACE • Možnost zkřížené reakce s jinými druhy chlamydií (C. pneumoniae, C.psittaci). • Na počátku infekce nejsou protilátky ještě vytvořeny. → Lépe přímý průkaz. • Protilátky IgA dlouho přetrvávají. → Interpretace je omezena v rozlišení akutní infekce, rekurence, reinfekce, perzistence. • Laboratorní nálezy je nutno vždy hodnotit s přihlédnutím k anamnéze a klinickému stavu pacienta.

TERAPIE MAKROLIDY TETRACYKLINY FLUOROCHINOLONY 3. - 4. generace Při potvrzené nebo velmi suspektní infekci C. trachomatis by měl být současně léčen sexuální partner. U potvrzené infekce novorozence je nutná léčba i rodičů.

TERAPIE Doporučený postup Společnosti infekčního lékařství České lékařské společnosti J. E. Purkyně zdroj: http://www.infekce.cz/DopChlam12.htm Diagnóza

Potvrzení diagnózy

Terapie

Lymphogranuloma venereum NAAT z moči, uretry (LGV)

doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 21 dní nebo klaritromycin 1000 mg/d p.o. (2x/d) 21 dní

Negonokoková uretritida (NGU) u muže

kultivačně negativní leukocyturie NAAT z moči, uretry

azitromycin 1 g p.o. jednorázově nebo doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo ofloxacin 800 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo levofloxacin 1 g/d (2x/d) 7-14 dní

Epididymitida

kultivačně negativní leukocyturie, pyurie NAAT v moči nebo z uretry

doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7-14 dní nebo levofloxacin 1 g/d (2x/d) 7-14 dní u podezření na smíšené infekce kombinace se širokospektrými antibiotiky (např. ceftriaxon, metronidazol)

Proktitida

NAAT v moči nebo z uretry, z rekta

doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7-14 dní levofloxacin 1 g/d (2x/d) 7-14 dní

Cervicitida

NAAT z moči nebo stěru z cervixu

azitromycin 1 g p.o. jednorázově nebo doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo ofloxacin 800 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo levofloxacin 1 g/d (2x/d) 7-14 dní

Uretritida u ženy

NAAT z moči nebo stěru z cervixu, z uretry

azitromycin 1 g p.o. jednorázově nebo doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo ofloxacin 800 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo levofloxacin 1 g/d (2x/d) 7-14 dní

Salpingitida (PID)

NAAT v moči nebo z cervikálního stěru

doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo ofloxacin 800 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní nebo levofloxacin 1 g/d (2x/d) 7-14 dní

nebo

Diagnóza

Potvrzení diagnózy

Terapie

Konjunktivitida dospělých

polymorfonukleární leukocyty mikroskopicky ze stěru, NAAT, detekce Ag

azitromycin 1 g p.o. jednorázově nebo doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní u inkluzní formy léčba 14-21 dní

Konjunktivitida novorozenců polymorfonukleární leukocyty mikroskopicky ze stěru, NAAT, detekce Ag

klaritromycin 15 mg/kg/d p.o. (2x/d) 10 dní nebo azitromycin 1. den: 10 mg/kg/den p.o., další 4 dny 5 mg/kg/den léčba rodičů

Pneumonie novorozenců

klaritromycin 15 mg/kg/d p.o. (2x/d) 10 dní nebo azitromycin 1. den: 10 mg/kg/den p.o., další 4 dny 5 mg/kg/den léčba rodičů

RTG plic, NAAT nazofaryngeální stěr, MIF IgM sérologie

Terapie chronických infekcí s možným podílem na imunitně mediované reakci evokované chlamydiemi: Diagnóza Astma s potvrzenou nebo velmi suspektní akutní chlamydiovou infekcí

Potvrzení diagnózy RTG plic, NAAT sputum, nazofaryngeální stěr

Terapie doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 14-21 dní nebo azitromycin 1,5 g/d p.o. (1x/d) 5 dní (u dětí 1. den: 10 mg/kg/d p.o., další 4 dny: 5 mg/kg/d p.o. (1x/d) nebo klaritromycin 1 g/d p.o (2x/d) 10 dní (u dětí 15 mg/kg/d p.o. [2x/d]) 10 dní nebo levofloxacin 500 mg/d i.v. nebo p.o. (1x/d) 7-14 dní nebo moxifloxacin 400 mg/d p.o. (1x/d) 10 dní

Astma bez chlamydiové infekce

antibiotika nejsou indikována

Ateroskleróza a následné stavy

antibiotika nejsou indikována

Chronické neurologické nemoci s potvrzenou nebo suspektní akutní chlamydiovou infekcí

NAAT nazofaryngeální stěr, z mozkomíšního moku

Chronické neuropsychické nemocí (roztroušená skleróza, Alzheimerova nemoc, demence asociovaná s HIV infekcí, mentální nemoci atd.)

Reaktivní artritida

doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7-14 dní nebo azitromycin 1,5 g/d p.o. (1x/d) 5 dní (u dětí 1. den: 10 mg/kg/d p.o., další 4 dny: 5 mg/kg/d p.o. [1x/d]) nebo klaritromycin 1 g/d p.o (2x/d) 7-10 dní (u dětí 15 mg/kg/d p.o. [2x/d]) 10 dní nebo levofloxacin 500 mg/d i.v. nebo p.o. (1x/d) 7-14 dní nebo moxifloxacin 400 mg/d p.o. (1x/d) 7-10 dní antibiotika nejsou indikována

sérologie, NAAT ze synoviální tekutiny

azitromycin 1 g p.o. jednorázově nebo doxycyklin 200 mg/d p.o. (2x/d) 7 dní; dlouhodobá terapie antibiotiky není indikována!

Terapie gravidních žen U gravidních je doporučena u nongonoroické uretritidy terapie azitromycin jednorázově 1 g. Možnost je také amoxicilinem 500 mg 3× denně po dobu 7-10 dní. Doxycyklin a fluorované chinolony jsou v těhotenství kontraindikovány. Alternativní léčba by mohla být klindamycinem, který má pouze částečný profit u mužů s negonokokovou uretritidou (NGU), ale má větší efekt u těhotných i netěhotných žen. Prenatální screening s terapií a s následným bezrizikovým chováním je v 90% úspěšný v prevenci perinatální infekce novorozence.

ZÁVĚR • V ČR jsou infekce C. trachomatis způsobeny sérotypy, které vedou k okulogenitální chlamydióze a k infekcím novorozenců.

• Infekce C. trachomatis probíhají často asymptomaticky, což má za následek neléčení a další přenos infekce.

ZÁVĚR • PŘÍMÝ PRŮKAZ INFEKCE je vhodný především v časné fázi infekce. PCR je citlivější metodou. Imunofluorescence je levnější metodou. • NEPŘÍMÝ PRŮKAZ – detekce protilátek proti C. trachomatis je vhodná, pokud infekce probíhá již delší dobu (min. 3-4 týdny), nebo jde o infekci chronickou. ELISA je levnější metodou. Lépe ukazuje dynamiku Ab odpovědi. Imunoblot je citlivější a přesnější metodou (4 rekominantní Ag x 1 Ag u ELISA). Interpretace je omezena v rozlišení akutní infekce, rekurence, reinfekce, perzistence. Laboratotní nálezy je nutno vždy hodnotit s přihlédnutím k anamnéze a klinickému stavu pacienta.

ZÁVĚR • Dobře provedený odběr (správná technika odběru, vhodná odběrová souprava) a dodržení podmínek skladování a transportu je předpokladem pro správný výsledek laboratorního vyšetření. • LÉČBA: MAKROLIDY, TETRACYKLINY a FLUOROCHINOLONY 3. - 4. generace. Je vhodné vyšetřit a léčit i sexuální partnery nemocných a rodiče infikovaných novorozenců.

DĚKUJI ZA POZORNOST