Bioveiligheid in het laboratorium

VLAAMS INTERUNIVERSITAIR INSTITUUT VOOR BIOTECHNOLOGIE

UNIVERSITEIT GENT

Universiteit Antwerpen

Bioveiligheid in het laboratorium 3de herziene editie

Bioveiligheid in het laboratorium 3e herziene editie, mei 2004 Uitgave van VIB, Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie Redactie: René Custers, regulatory affairs manager, VIB VIB Rijvisschestraat 120 9052 Zwijnaarde tel.: 09 244 66 11 fax.: 09 244 66 10 e-mail: [email protected] web: http://www.vib.be Verantwoordelijke uitgever: Jo Bury, VIB Rijvisschestraat 120 9052 Zwijnaarde Niets uit deze uitgave mag worden verveelvuldigd en/of openbaar gemaakt voor commerciële doeleinden. Voor educatieve doeleinden dient steeds de bron vermeld te worden. © Mei 2004

VOORWOORD Dit is de derde, herziene editie van het boekje ‘Bioveiligheid in het laboratorium’. In dit boekje vindt u alle informatie terug uit de eerste en tweede editie. Er zijn slechts lichte aanpassingen en aanvullingen gedaan, met name in de tekst over ontsmetting en inactivatie. Moderne biotechnologie is een belangrijke technologie in het huidige biologische en biomedische onderzoek. Duizenden onderzoekers in de levenswetenschappen gebruiken dagelijks micro-organismen, planten of dieren op zoek naar de antwoorden op relevante wetenschappelijke vragen. Het gebruik van genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s) neemt daarin toe. Het is de onderzoekswereld zelf die in het verleden gewezen heeft op het belang van het veilig werken met GGO’s. Vandaag zijn er heel wat wetgevingen en richtlijnen van toepassing op GGO’s die het doel hebben mens en milieu te beschermen. We willen het belang van het veilig en verantwoord werken met biologisch materiaal en GGO’s onderstrepen. Het behoort tot de maatschappelijke verantwoordelijkheid van de onderzoeker om de nodige veiligheidsregels na te leven. Daarnaast behoort het tot de verantwoordelijkheid van de onderzoeker om studenten, of andere mensen die nog weinig werkervaring hebben, op te leiden in de theoretische en praktische aspecten van de bioveiligheid. We hopen dat dit boekje, samen met praktische instructies en begeleiding, een nuttig werkinstrument blijkt om mensen op een veilige manier te verwelkomen in de fascinerende wereld van het biotechnologisch onderzoek.

Jo Bury en Rudy Dekeyser algemene directie VIB

Voorwoord

3

INHOUDSOPGAVE 1. INLEIDING . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 2. BIOVEILIGHEID

6

......................................................................................

3. INDELING IN RISICOKLASSEN EN RISICO-ANALYSE

9

.....................................

4. DE VERSPREIDING VAN ORGANISMEN IN HET LABORATORIUM

14

..................

5. INPERKING: EEN COMBINATIE VAN INFRASTRUCTUUR EN WERKVOORSCHRIFTEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 6. BESMETTING, ACCIDENTEN, ONTSMETTING EN INACTIVATIE

29

....................

7. WERKEN MET ENKELE VEELGEBRUIKTE LABORATORIUM-ORGANISMEN . . . . .35 8. REFERENTIES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 9. VERKLARENDE WOORDENLIJST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46

BIJLAGE 1: INPERKINGSVEREISTEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47 BIJLAGE 2: VIB RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN MET GGO’S

56

.........

BIJLAGE 3 : DE BIOLOGISCHE RISICOKLASSE VAN ENKELE RELEVANTE PATHOGENEN

64

...

BIJLAGE 4: LEESCOMMISSIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68 BIJLAGE 5: INFORMATIEBLAD

69

................................................................................

BIJLAGE 6: ZELFTOETS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70

4

Inhoudsopgave

1. INLEIDING In veel biotechnologisch en biomedisch onderzoek wordt gewerkt met biologisch materiaal. In steeds grotere mate wordt daarbij gebruik gemaakt van moderne moleculair biologische technieken zoals recombinant-DNA technologie. In dit boekje wordt een kort overzicht gegeven van de basisprincipes die van belang zijn voor het veilig werken met genetisch gemodificeerde en/of ziekteverwekkende organismen. Daarbij zijn drie typen van beschermende veiligheidsmaatregelen te onderscheiden: a. bescherming van de onderzoeker, b. bescherming van het experiment, en c. bescherming van mens en milieu De verschillende maatregelen zullen in dit boekje zowel worden uitgewerkt voor microorganismen als voor planten en dieren. Iedereen die in een laboratorium met deze organismen werkt moet de basisbegrippen van bioveiligheid kennen en er in de dagelijkse laboratoriumpraktijk naar handelen. Alleen op die manier kan een werksituatie worden gecreëerd die veilig is voor uzelf, voor de medemens en voor het milieu. Het veilig werken met biologisch materiaal wordt bovendien vereist vanuit twee typen van wetgeving die aan de basis liggen van de voorschriften zoals deze in dit boekje worden uitgewerkt: 1. De wetgeving voor de bescherming van de medewerker bij de uitvoering van zijn werk. 2. De milieuwetgeving voor het werken met genetisch gemodificeerde organismen. Voor beide bestaat een Europese wetgeving die in de nationale wetgeving is omgezet.

Figuur 1 : Het biohazard teken. Dit teken geeft aan dat er met biologisch risicohoudend materiaal wordt gewerkt (vanaf risicoklasse 2)

Inleiding

5

2. BIOVEILIGHEID Wat is bioveiligheid? De bioveiligheid van laboratoriumwerk staat centraal in dit boekje. Daarbij gaat het om de intrinsieke gevaren van levende organismen en hoe deze veilig te hanteren. Ook genetisch materiaal zoals ‘naakt’ DNA kan gevaarlijk zijn. Voordat werk met pathogene of genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s) in een laboratorium wordt gestart, moet stilgestaan worden bij de eigenschappen van die organismen en moeten waar nodig maatregelen worden getroffen om eventuele risico’s voor mens of milieu tot een minimum te beperken. …‘Safety first!’…

Welke gevaren? Biologisch materiaal en levende organismen zijn noch intrinsiek gevaarlijk, noch intrinsiek veilig. Eventueel gevaar hangt af van de eigenschappen van een organisme. Eigenschappen van organismen die gevaar inhouden, zijn de volgende: • Pathogeniteit De pathogeniteit geeft aan of een organisme - bijvoorbeeld een bacterie, virus, schimmel, of parasiet - in staat is een ziekte te veroorzaken bij een plant, dier of mens. Factoren zoals infectiedosis, virulentie en productie van toxines door de ziekteverwekker spelen een rol in de mate waarin het organisme in staat is een ziekte te veroorzaken. Infectiedosis Besmetting met één pathogeen betekent nog niet automatisch een infectie. De infectiedosis verschilt van pathogeen tot pathogeen. Hieronder volgen enkele voorbeelden van enkele voor de mens relevante infectiedosissen van pathogenen wanneer zij via hun natuurlijke verspreidingsweg verspreid worden: Pathogeen

Infectieuze dosis

adenovirus influenza virus tuberculose bacteriën typhus bacteriën

> 150 pfu (intranasaal) 790 pfu (nasopharyncheaal) 10 bacillen (inhalatie) 105 bacteriën (ingestie)

pfu = plaque forming units

Bron: Material Safety Data Sheets, Health Canada • Toxiciteit Toxiciteit is vergiftiging. De meeste stoffen zijn bij normaal gebruik niet in staat een vergiftiging te veroorzaken. De mate van toxiciteit wordt meestal aangegeven in een

6

VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

LD50 waarde voor vertebraten uitgedrukt in gewichtseenheden per kg lichaamsgewicht. De LD50 (LD staat voor: Lethal Dose) is de waarde waarbij blootstelling aan het agens tot gevolg heeft dat 50% van de blootgestelde proefdieren dood gaat. Als het gaat om levende organismen (voornamelijk bacteriën), dan gaat toxinevorming vaak gepaard met pathogeniteit. • Allergeniteit Allergeniteit is een niet-toxische, door het immuunsysteem gemedieerde, ongewenste reactie van het lichaam op een stof of agens. Immuunglobuline E (IgE) en mestcellen (cellen van het immuunsysteem die onder meer heparine produceren) spelen vaak een rol in de allergische reactie. Een allergische reactie kan zich onder meer uiten in huidirritaties, niezen, astmatische aanvallen, chronische longaandoeningen en kan soms zelfs leiden tot een levensbedreigende shock. Ter voorkoming van longen huidaandoeningen bij laboratoriumpersoneel dient de mogelijkheid van een allergische reactie mee in overweging genomen te worden en dient ernaar gestreefd te worden om rechtstreeks contact (inademen, huidcontact) van het personeel met allergene stoffen te vermijden.

• Verstoring van ecologische evenwichten Hier is het met name van belang om mogelijke verstoringen van ecologische evenwichten die verband houden met activiteiten met genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s) te bespreken. Verstoring van een ecologisch evenwicht zou kunnen gebeuren wanneer een GGO met een bepaalde eigenschap zich ongewenst naar het milieu verspreidt, of wanneer er vanuit dat organisme verspreiding plaatsheeft van genetisch materiaal naar andere organismen in het milieu. Aan de potentiële gevaren die verbonden zijn aan recombinant-DNA technologie en de risico-inschatting daarrond zal verderop in dit boekje dieper worden ingegaan. • Andere schadelijke effecten Soms zijn er ook andere ongewenste effecten die maken dat extra voorzichtigheid geboden is bij het hanteren van biologisch materiaal. Het is niet mogelijk een limitatieve lijst te maken van dergelijke effecten. Waar het echter om gaat is dat men stil moet staan bij de eigenschappen van materiaal voor ermee te gaan werken. Als belangrijkste categorie kunnen misschien de genen aangeduid worden die immuunmodulerende eigenschappen bezitten. Daarbij is echter lang niet elke immuunmodulatie schadelijk. Om uitsluitsel te geven over het gevaar moeten de eventuele effecten worden nagegaan en is vaak overleg aangewezen. Ter illustratie kan het voorbeeld gegeven worden van het werken met een vacciniavirus waarin een gen gekloneerd is dat voor immuunsuppressie zorgt. De immuunsuppressie zou ervoor kunnen zorgen dat het lichaam een mogelijke infectie met dat virus niet goed kan bestrijden. Infecties met vacciniavirus kunnen in uitzonderlijke gevallen leiden tot een dodelijke encephalitis. Bioveiligheid

7

Werken met ‘naakt’ DNA We worden in onze leefomgeving dagelijks geconfronteerd met DNA. In het laboratorium wordt vooral gewerkt met DNA in de vorm van plasmiden, gedigesteerd DNA, of primers. DNA op zich is ongevaarlijk. Maar toch is het werken met DNA niet altijd ongevaarlijk. Met name wanneer het DNA codeert voor een cellulair oncogen. Met een oncogen wordt in dit geval een ‘dominant transformerend’ gen bedoeld: een gen dat na incorporatie in het genoom de transformatie* van de cel als directe gevolg heeft. Transformatie – de omvorming naar een snel en oneindig delende cel - is de belangrijkste eerste stap in tumorvorming. Een prikaccident met dergelijk materiaal brengt een risico met zich mee. Medewerkers die met dit materiaal werken dienen zich bewust te zijn van het risico, dienen handschoenen te dragen en moeten het werken met scherpe voorwerpen tot een minimum beperken. Eenmaal dit DNA in een bacterie of een cel geïncorporeerd is, brengt het niet langer een verhoogd risico met zich mee. Tenzij de cel een packagingcel is waarin het oncogen door een virale vector kan worden opgenomen die het oncogen verder kan verspreiden. Oncogenen en virale vectoren Het kloneren van DNA dat codeert voor een dominant transformerend cellulair oncogen brengt met name een extra risico met zich mee wanneer het in een virale vector wordt gezet die in het genoom integreert. Daarbij wordt onderscheid gemaakt tussen amphotrope en ecotrope virale vectoren aangezien de laatste alleen muizencellen kunnen infecteren. Amphotrope vectoren kunnen ook mensen infecteren en brengen dus een hoger risico met zich mee dan ecotrope.

*zie verklarende woordenlijst

8


3. INDELING IN RISICOKLASSEN EN RISICO-ANALYSE Pathogene organismen Organismen worden ingedeeld in vier risicoklassen. Organismen die geen ziekten verwekken horen thuis in risicogroep 1. Ziekteverwekkers horen thuis in de groepen 2, 3 en 4, afhankelijk van de mate van ziekteverwekkendheid en de mate waarin therapieën beschikbaar zijn. Om een onderscheid aan te kunnen geven met de risicoklassen voor GGO’s wordt de risicoklasse van een natuurlijk pathogeen vaak aangeduid als de biologische risicogroep. Hieronder volgt een overzicht van de definities van de verschillende risicogroepen: Groep 1 Groep 2

Groep 3

Zeer onwaarschijnlijk dat het agens een ziekte veroorzaakt in mensen, dieren of planten. (micro-)organismen die bij de mens een ziekte kunnen verwekken en Humane een gevaar vormen voor de personen die er rechtstreeks mee in conpathogenen tact komen. Hun verspreiding in de gemeenschap is onwaarschijnlijk. Er bestaat meestal een profylaxis of een effectieve behandeling. (micro-)organismen die bij dieren een ziekte kunnen veroorzaken en Dierpathogenen die in verschillende mate één van de volgende eigenschappen bezitten: beperkte geografische belangrijkheid, overdracht naar andere zwakke of onbestaande species, afwezigheid van vectoren of dragers. Er is een beperkte economische en/of medische impact. Men beschikt meestal over profylactische middelen en/of over efficiënte behandelingen. (micro-)organismen die bij planten een ziekte kunnen veroorzaken, Fytopathogenen maar waarbij in geval van accidentele verspreiding in het Belgisch leefmilieu geen verhoogd risico voor epidemie bestaat. Het betreft overal voorkomende pathogenen waarvoor er profylactische of therapeutische middelen voorhanden zijn. De niet-inheemse of exotische fytopathogenen, (micro-)organismen die niet in staat zijn om in het Belgische leefmilieu te overleven vanwege de afwezigheid van targetplanten of vanwege ongunstige weersomstandigheden, behoren eveneens tot deze risicogroep. (micro-)organismen die bij de mens een ernstige ziekte kunnen verHumane wekken en een gevaar vormen voor de personen die er rechtstreeks pathogenen mee in contact komen. Er is een mogelijk risico voor verspreiding in de gemeenschap. Er bestaat meestal een profylaxis of een efficiënte behandeling (micro-)organismen die bij dieren een ernstige ziekte of een epizoötie Dierpathogenen kunnen veroozaken. Er kan een belangrijke overdracht tussen verschillende species optreden. Bepaalde van deze pathogene agentia vereisen het instellen van sanitaire reglementeringen voor de door de overheid van elk land in kwestie geïnventariseerde species. Er bestaan meestal medische en/of sanitaire profylaxen. (micro-)organismen die bij planten een ziekte kunnen veroorzaken die Fytopathogenen effect heeft op de economie of op het leefmilieu en waarvoor Indeling in risicoklassen en risico-analyse

9

Groep 4

Humane pathogenen

Dierpathogenen

Fytopathogene quarantaineorganismen

een behandeling ofwel zeer duur uitvalt, ofwel moeilijk toe te passen is, ofwel zelfs niet bestaat. Accidentele verspreiding van deze (micro-) organismen kan het risico op lokale epidimieën doen toenemen. Exotische stammen van fytopathogene (micro-)organismen die gewoonlijk voorkomen in het Belgische leefmilieu en niet opgenomen werden in de lijst van quarantaineorganismen maken eveneens deel uit van deze risicogroep. (micro-)organismen die bij de mens een ernstige ziekte kunnen verwekken en een ernstig gevaar vormen voor de personen die er rechtstreeks mee in contact komen. Er is een verhoogd risico voor verspreiding in de gemeenschap. Er bestaat meestal geen profylaxis of geen efficiënte behandeling. (micro-)organismen die bij dieren een uiterst ernstige panzoötie of epizoötie kunnen veroorzaken met een erg hoog sterftecijfer of met dramatische economische gevolgen voor de getroffen teeltstreken. Ofwel beschikt men niet over medische profylaxis, ofwel is één exclusieve sanitaire profylaxis mogelijk of verplicht Schadelijke (micro-)organismen waarvan het gebruik is onderworpen aan de maatregelen van federale besluiten inzake de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen. Belgische definities van de verschillende risicogroepen. De meeste definities zijn afgeleid van de WHO classificatie van infectieuze micro-organismen.

Naast de indeling van een pathogeen in een risicogroep is het altijd van belang te vermelden welke gastheer het pathogeen heeft. Infectieziekten zijn namelijk een wisselwerking tussen pathogeen en gastheer. Bepaalde pathogenen hebben een breed gastheerbereik, andere kunnen slechts één of enkele gastheren infecteren. Ook kan de biologische risicoklasse van een bepaald pathogeen dat zowel de mens als het dier kan infecteren, per gastheer verschillen. Zo is voor de mens de biologische risicoklasse van Herpes virus B klasse 3 en voor het dier klasse 2. Van de indeling van pathogenen in de biologische risicoklassen zijn lijsten gepubliceerd, waarin de biologische risicoklasse van de verschillende organismen kan worden opgezocht. In België zijn de volgende lijsten relevant: • hoofdstuk 5.51. aan Vlarem II (http://www.biosafety.be), en • bijlage 1 aan het Koninklijk Besluit van 4 augustus 1996 betreffende de bescherming van de werknemers tegen de risico’s bij blootstelling aan biologische agentia op het werk (alleen humaan pathogenen; Belgisch Staatsblad 01/10/1996). In bijlage 3 is de biologische risicogroep weergegeven van enkele relevante pathogenen. Opportunistische pathogenen zijn organismen die alleen een ziekte kunnen veroorzaken in mensen of dieren waarvan het immuunsysteem onvoldoende functioneert. Deze organismen worden ingedeeld in groep 1.

10


Aan het werken met niet-genetisch gemodificeerde klasse 1 organismen worden in de wetgeving geen eisen gesteld. Toch is het voor niet-genetisch gemodificeerde klasse 1 micro-organismen en cellen sterk aanbevolen om de basisprincipes van Veilige Microbiologische Technieken (VMT) te hanteren (zie hst 5). Het werken met klasse 2, 3 en 4 agentia mag alleen in speciaal daarvoor uitgeruste laboratoria.

Genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s) Recombinant-DNA technologie is niet meer uit moderne biologische en biomedische onderzoekslaboratoria weg te denken. Escherichia coli K12 is daarbij het werkpaard onder de laboratoriumorganismen en wordt door bijna iedereen gebruikt als middel om DNA te kloneren of tot expressie te brengen.

Definitie van een GGO GGO’s zijn organismen waarvan het genetisch materiaal is gewijzigd op een wijze die niet mogelijk is door voortplanting of natuurlijke recombinatie. Technieken die leiden tot de vorming van een GGO zijn in ieder geval: * recombinant DNA- en RNA- technieken waarbij gebruik wordt gemaakt van gastheer/vectorsystemen; * technieken waarbij genetisch materiaal dat buiten het organisme is geprepareerd, rechtstreeks in een organisme wordt gebracht, daaronder begrepen micro-injectie, macro-injectie en micro-encapsulatie; * celfusie- of hybridisatietechnieken waarbij levende cellen met nieuwe combinaties van genetisch materiaal worden gevormd die van nature niet voorkomen. De volgende technieken worden niet geacht te leiden tot genetische modificatie, op de voorwaarde dat bij de technieken geen gebruik gemaakt wordt van recombinant DNA moleculen of GGO’s: * in vitro bevruchting; * conjugatie, transductie, virale infectie, transformatie * polyploïde-inductie.

Uitzonderingen op de regels De volgende GGO’s zijn uitgezonderd van de regelgeving en vallen ook niet onder de richtlijnen in dit boekje op voorwaarde dat daarbij geen andere recombinant-nucleïnezuurmoleculen of GGO’s worden gebruikt dan die welke geproduceerd zijn door middel van één of meer van de hieronder genoemde technieken: * Mutagenese. * Celfusie (met inbegrip van protoplastfusie) van prokaryotische soorten die genetisch materiaal uitwisselen door middel van bekende fysiologische processen. * Celfusie (met inbegrip van protoplastfusie) van cellen van eukaryotische soorten, met inbegrip van de productie van hybridoma’s en de fusie van plantencellen.

Indeling in risicoklassen en risico-analyse

11

* Zelfklonering, dat wil zeggen het verwijderen van nucleïnezuursequenties uit een cel van een organisme, al dan niet gevolgd door de reïnsertie van dit nucleïnezuur of een deel daarvan (of een synthetisch equivalent) – eventueel na een aantal voorafgaande enzymatische of mechanische bewerkingen – in cellen van dezelfde soort of cellen van een fylogenetisch nauw verwante soort waarmee eerstgenoemde soort genetisch materiaal kan uitwisselen door middel van bekende fysiologische processen, voorzover het onwaarschijnlijk mag worden geacht dat het resulterende micro-organisme een ziekte kan verwekken bij mens, dier of plant. Bij zelfklonering mag gebruik worden gemaakt van recombinante vectoren waarvan het gebruik in combinatie met de betrokken microorganismen in de loop der tijd veilig is gebleken.

Recombinant-DNA GGO’s Inmiddels kan een groot aantal organismen genetisch gemodificeerd worden, bijvoorbeeld: bacteriën, gisten, schimmels, insecten (fruitvlieg), parasieten, nematoden, planten, kikkers of zoogdieren (muizen, ratten, konijnen, geiten, schapen, varkens, runderen). Bij genetische modificatie zijn altijd de volgende componenten betrokken: 1. Een gastheer (het te modificeren organisme); N.B. De term ‘gastheer’ heeft hier een andere betekenis dan in de context van pathogenen (zie verklarende woordenlijst)

2. Een donorsequentie (of insert), afkomstig uit een bepaald organisme (het donororganisme). Ook wordt steeds vaker gewerkt met een synthetisch vervaardigde sequentie. Deze sequentie kan ofwel van nature in een bepaald organisme voorkomen, ofwel volledig nieuw zijn. 3. En in veel, maar niet alle gevallen een (genetische) vector. Voor transformatie van bacteriën worden meestal plasmiden als vector gebruikt. In andere gevallen worden virussen of virale vectoren gebruikt. Voorbeelden van gevallen waarin geen genetische vector wordt gebruikt zijn de micro-injectie van DNA in de pronucleus van een bevruchte eicel, of de modificatie van een plant met behulp van het genenkanon. Afhankelijk van het gebruikte systeem zal een vector al dan niet aanwezig blijven in het uiteindelijke GGO.

De risico-analyse GGO’s zijn (net als niet-GGO’s) noch intrinsiek gevaarlijk, noch intrinsiek veilig. Daarom wordt per geval een risico-analyse uitgevoerd. De risico-analyse is een drietrapsproces waarin achtereenvolgens: 1. De eigenschappen van de gastheer, vector en donorsequenties die gevaar met zich meebrengen zoals pathogeniteit, toxiciteit, mogelijkheden tot verspreiding van het organisme en overdracht van genetisch materiaal worden geïdentificeerd. Dit leidt tot een eerste identificatie van het niveau van risico. 2. Vervolgens wordt vastgesteld welke maatregelen nodig zijn om het organisme veilig te kunnen hanteren. Daarbij wordt rekening gehouden met:

12


* * * 3.

De eigenschappen van het milieu dat aan het GGO zou kunnen worden blootgesteld. Het type en de schaal van de activiteit. Eventuele niet-standaard handelingen. Aan de hand van de uitkomst van de stappen 1 en 2 wordt dan de risicoklasse vastgesteld.

Net als bij pathogenen worden GGO’s ingedeeld in vier risicoklassen, en wel als volgt: Risicoklasse 1 GGO’s die geen of een verwaarloosbaar risico inhouden Risicoklasse 2 GGO’s die weinig risico inhouden

Risicoklasse 3 GGO’s die een matig risico inhouden Risicoklasse 4 GGO’s die veel risico inhouden

Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 1 voldoende is om zowel de mens als het milieu te beschermen Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 2 voldoende is om zowel de mens als het milieu te beschermen Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 3 voldoende is om zowel de mens als het milieu te beschermen Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 4 voldoende is om zowel de mens als het milieu te beschermen

De risicoklassen bepaald door de Europese richtlijn 98/81/EG betreffende het ingeperkt gebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen. Er is inmiddels al heel wat ervaring met de risico-analyse van GGO’s. Dit heeft geleid tot richtlijnen voor het indelen van GGO’s. Deze richtlijnen zijn weergegeven in bijlage 2. Ze zijn niet wettelijk bindend, maar het volgen van deze richtlijnen en de hierboven weergegeven principes voor de risico-analyse vergemakkelijken de implementatie van de wettelijke vereisten. Afhankelijk van het type en de schaal van de activiteit dient nog nagegaan te worden of er bijzondere aanvullende maatregelen nodig zijn of dat er maatregelen van het basisinperkingsniveau achterwege kunnen blijven. De vier inperkingsniveaus voor laboratoria, proefdierverblijven en serres zijn beschreven in bijlage 1. Hieronder wordt een vergelijking gemaakt tussen de indeling van pathogenen en GGO’s in risicoklassen en de bijbehorende basisinperkingsniveaus. Klasse Risicoklasse 1

Pathogenen Niet-pathogenen

GGO’s Geen of verwaarloosbaar risico

Risicoklasse 2 Risicoklasse 3 Risicoklasse 4

Zwak pathogenen Matig pathogenen Zware pathogenen

Weinig risico Matig risico Veel risico

Basisinperking Niveau 1 voor GGO’s, VMT voor niet-gemodificeerde micro-organismen of cellen* Niveau 2 Niveau 3 Niveau 4

* N.B.: niveau 1 omschrijft vereisten voor zowel de infrastructuur als werkvoorschriften, ook al zijn de eisen aan de infrastructuur zeer beperkt. VMT (Veilige Microbiologische Technieken) omschrijft alleen een werkwijze.

Indeling in risicoklassen en risico-analyse

13

4. DE VERSPREIDING VAN ORGANISMEN IN HET LABORATORIUM Natuurlijke besmettingswegen Pathogenen hebben elk hun eigen besmettingsweg via welke ze van het ene naar het andere organisme overgedragen worden. Hieronder volgen enkele belangrijke besmettingswegen: Besmettingsweg Huidcontact Via de lucht of via aërosolen Prikken (insecten, injectienaalden) Bloed-bloed contact Via wonden Via faecaal materiaal

voorbeeld schimmels mazelenvirus griepvirus malariaparasiet gele koorts parasiet HIV-virus hepatitis B virus Staphylococcen Typhus bacteriën Poliovirus

Al deze besmettingswegen kunnen, afhankelijk van het type werk dat gedaan wordt, in het laboratorium voorkomen. Bij organismen die zich via de lucht kunnen verspreiden, spelen kleine druppeltjes of druppelkernen een rol, maar kan verspreiding ook plaatsvinden via direct contact met bijvoorbeeld de handen, zakdoeken en kleren. contact druppeltjes druppelkernen druppels

contact

stof

secundaire reservoirs zakdoeken kleren beddegoed

contact

Figuur 2: Verspreiding van micro-organismen via de lucht

14


Verspreidingswegen Blootstelling van laboratoriummedewerkers aan organismen kan op verschillende manieren gebeuren. In principe kan elke open bron van organismen (bijv. een geopende petrischaal) een bron van verspreiding van deze organismen zijn. Nu zal een houder in de praktijk alleen geopend worden wanneer er geen besmetting van het materiaal in de houder kan plaatsvinden, dus bij een vlam, of in een veiligheidskabinet. De praktijk laat zien dat van de meeste laboratoriuminfecties de oorzaak onbekend is. In de gevallen dat de oorzaak wel bekend is gaat het om prikaccidenten, morsen, kapot glaswerk, met de mond pipetteren en om het bijten of krabben door een proefdier.

Aërosolen Binnen de verschillende verspreidingswegen verdienen aërosolen bijzondere aandacht. Aërosolen zijn zeer fijne vloeistofdruppeltjes die zich via de lucht kunnen verspreiden. Aërosolen ontstaan bijvoorbeeld bij het openen van flesjes met vloeistoffen waarop een natte stop zit, of bij vortexen, blenden, bij het leegblazen van een pipet of het uitgloeien van een natte entnaald. Aërosolvorming moet zoveel mogelijk worden vermeden. Bij werk met organismen die een bepaald gevaar inhouden (vanaf risicoklasse 2) moeten aërosolproducerende werkzaamheden zoveel mogelijk in een veiligheidskabinet worden uitgevoerd.

Gieten van vloeistof Vallende druppels Uitblazen van pipetten Openen van vochtige stoppen Centrifugeren van open buizen te warme entogen Figuur 3: aërosolproducerende handelingen

Ongewenste verspreiding van organismen of van genetisch materiaal Zoals hierboven duidelijk mag zijn geworden betekent de verspreiding van voor de mens gevaarlijke organismen een risico voor de medewerker (uzelf of uw collega’s). Wanneer verspreiding naar een medewerker mogelijk is, is ook verspreiding naar het milieu niet uitgesloten. Verspreiding van organismen of van genetisch materiaal naar het milieu toe is

De verspreiding van organismen in het laboratorium

15

vaak ongewenst omdat dit een risico met zich mee kan brengen in de zin van verspreiding van pathogeniteit, toxiciteit of verstoring van een ecologisch evenwicht. Dit geldt zeker voor de pathogenen en de GGO’s die in de risicoklassen 2, 3 en 4 thuishoren. Voor de organismen (en hun genetisch materiaal) die thuishoren in risicoklasse 1 - zij brengen geen of een verwaarloosbaar risico met zich mee - geldt ook dat de verspreiding van het organisme of van genetisch materiaal naar het milieu toe moet worden beperkt.

Bacteriën, gisten, schimmels Bacteriën zijn in veel gevallen in staat genetisch materiaal over te dragen. Zeker wanneer gewerkt wordt met vectoren die zelfoverdraagbaar zijn. Om te voorkomen dat genetisch materiaal makkelijk wordt overgedragen wordt daarom in de praktijk in de meeste gevallen gewerkt met vectoren die moeilijk of helemaal niet mobiliseerbaar zijn.

The plasmid contains genes that code for the sex piliproteins

sex pili

chromosome Single stand DNA is transferred through the pilus to the receiver

Figuur 4: Overdracht van een zelfoverdraagbaar plasmide door middel van conjugatie Zelfoverdraagbaarheid Natuurlijke plasmiden uit bacteriën bezitten soms de eigenschap om zichzelf over te kunnen dragen naar verwante bacteriën. Dit betekent dat zij de genen dragen die zorgen voor de aanmaak van de structuren (‘pilli’) waarmee de ene bacterie een verbinding legt met de andere bacterie. Het plasmide wordt dan door dit kanaal overgedragen. De frequentie van overdracht van zelfoverdraagbare plasmiden ligt ook relatief hoog (10-3 tot 10-5).

Dierlijke en menselijke cellen Dierlijke en menselijke cellen kunnen zich niet zomaar naar het milieu verspreiden. Nietbesmette cellen kunnen ook geen genetisch materiaal ongewenst naar het milieu overdragen. Dierlijke en menselijke cellen zijn ten dode opgeschreven wanneer zij aan een niet-

16


steriele omgeving worden blootgesteld. Een uitzondering wordt gevormd door cellen die van nature in een niet-steriele omgeving moeten overleven, zoals bijvoorbeeld vissen- of kikkereicellen. In het geval van niet-besmette cellen zijn de maatregelen die getroffen worden om de celkweek te beschermen ook voldoende om het milieu te beschermen. De overdracht van genetisch materiaal vanuit dierlijke en menselijke cellen naar de omgeving kan alleen wanneer de cellen besmet zijn met biologische agentia - bijv. virussen - die in staat zijn het genetisch materiaal te mobiliseren. De vraag of cellen al dan niet geïnfecteerd zijn is uit oogpunt van bioveiligheid belangrijk. Eventueel aanwezige virussen kunnen een gevaar vormen voor de medewerker of het milieu en maatregelen dienen daarop afgestemd te zijn. ‘Besmette’ dierlijke cellen en menselijke cellen Bij activiteiten met dierlijke cellen kan onderscheid gemaakt worden tussen primaire celculturen en ‘established cell lines’. Primaire celculturen worden gemaakt door een biopt van een dier of mens in cultuur te brengen. Vaak kan van dergelijke cellen niet op voorhand uitgesloten worden dat ze besmet zijn met een ziekteverwekker, bijv. een virus. Daarom dient met primaire cellen altijd enige voorzichtigheid te worden betracht. Established cell lines zijn culturen die al langer in kweek zijn en die geïmmortaliseerd zijn zodat ze oneindig blijven delen. Meestal is gekend of ze vrij zijn van ongewenste besmettingen. De immortalisatie van dergelijke cellen kan op verschillende manieren tot stand zijn gekomen: • spontaan (zoals bijv. bij NIH-3T3 cellen), • als gevolg van een natuurlijke virale infectie (bijv. HELA cellen, waarin enkele genen van het HPV virus aanwezig zijn), • of door de cellen te transfecteren met een factor die immortalisatie tot gevolg heeft. Bij het hanteren van viraal geïmmortaliseerde cellijnen in combinatie met vectoren waarin virale componenten aanwezig zijn, moet altijd nagegaan worden of het mogelijk is dat er viruspartikels gevormd worden. Als dat zo is dient de cellijn ingeschaald te worden in de risicoklasse van het betreffende virus.

Virussen Bij virussen kan onderscheid gemaakt worden tussen wild type virussen en virale vectoren (van virus afgeleide virale constructies). Het gebruik van virussen of virale vectoren impliceert ook altijd het gebruik van gastheercellen. Zonder gastheercellen geen vermenigvuldiging van het virus. In de praktijk komen er drie typen handelingen voor: (1) celkweek om virus te produceren, (2) het hanteren van virus bevattende supernatanten (voor kwaliteitscontrole, etc…) en (3) het transduceren van een te onderzoeken cellijn, proefdier of plant. Zeker in de virussupernatanten kan het virus in grote hoeveelheden en geconcentreerd aanwezig zijn. Voorzichtigheid bij het hanteren van de supernatanten is geboden. Na infectie van cellen, plant of proefdier hangt het gevaar af van de mogelijkheden van het virus of de virale vector om zich nog te kunnen vermenigvuldigen. Soms wordt gewerkt met replicatiedefectief virus, wat betekent dat het virus wel de cellen kan infecteren, maar


17

zich niet meer kan vermenigvuldigen. De verspreidings- en overlevingsmogelijkheden verschillen van virus tot virus. Sommige viruspartikels kunnen via de lucht verspreiden en kunnen soms buiten de gastheer lang overleven. Andere virussen, zoals bijvoorbeeld HIV, zijn buiten de gastheer zeer kwetsbaar. Plantenvirussen hebben soms een ‘vector’ nodig om zich te kunnen verspreiden: vaak een insect die het virus opzuigt en zo de verspreiding naar andere planten bewerkstelligt.

Transgene planten Transgene planten worden in-vitro gekweekt, in fytotrons/kweekcellen en in serres en ze lopen niet zomaar weg. Toch verdient de ongewenste verspreiding naar het milieu bijzondere aandacht. Zonder de juiste maatregelen kunnen pollen (stuifmeel) zich via de lucht of met behulp van insecten naar het milieu verspreiden. Of dit een reëel risico vormt hangt af van de vraag of de plant een zelfbevruchter is of een kruisbevruchter. Bij een strikte zelfbevruchter blijft de verspreiding van pollen immers zonder effect. In het geval van een kruisbevruchter is van belang na te gaan of er bloeiende verwante planten in het milieu voorkomen waarmee de plant zou kunnen hybridiseren (kruisbevruchten). Daarnaast kunnen zaden van transgene planten zich soms gemakkelijk ongewenst verspreiden. Zaden kunnen heel fijn of kleverig zijn en worden dan gemakkelijk meegenomen door een onderzoeker die een kweekcel of serre verlaat. pollen

zaad

stengelbasis

Figuur 5: de reproductieve delen van Brassica

Niet alleen pollen en zaden kunnen aanleiding geven tot de ongewenste verspreiding van genetisch materiaal van planten. Ook bepaalde plantendelen kunnen soms, afhankelijk van de plant, nog gemakkelijk uitgroeien tot een hele plant. Zo kan een takje van een wilg nog uitgroeien tot een hele boom en kan de stronk van kool nog wortel schieten. Dit betekent dat bij het hanteren van transgene planten of transgeen plantenmateriaal speciale aandacht moet worden besteed aan de mogelijke verspreiding van de delen van de plant die (nog) reproductief zijn. Indien er een reële kans bestaat dat de plant zich in het milieu kan vestigen of indien uitkruising naar (bloeiende) verwanten mogelijk is, dient reproductief plantenmateriaal eerst gedood te worden voordat het als afval wordt afgevoerd.

18


De verspreiding van transgene planten of transgeen plantenmateriaal Pollen

Zaden

Zandraket

In een serre is Arabidopsis een zelfbevruchter. De kans dat verspreiding van pollen een effect heeft is uitermate klein

Tabak

Zelfbevruchter. De kans dat verspreiding van pollen een effect heeft is uitermate klein. Zelfbevruchter. De kans dat verspreiding van pollen een effect heeft is uitermate klein. Insectbestuiver / zelfbevruchter. Bestuivende insecten moeten worden geweerd. Zelfbevruchter. De kans dat verspreiding van pollen een effect heeft is uitermate klein. Insectbestuiver / zelfbevruchter. Bestuivende insecten moeten worden geweerd. Windbestuiver. De verspreiding van stuifmeel vanuit een serre is ononwaarschijnlijk, zeker als ramen voorzien zijn van insectengaas. Zelfbevruchter. De kans dat verspreiding van pollen een effect heeft is uitermate klein.

De zaden zijn erg klein. Bij aanra- Alleen pollen en zaden. king springen de hauwen open en worden de zaden de lucht in geschoten. Speciale ‘aracons’ of andere gelijkwaardige middelen zijn nodig om de verspreiding tegen te gaan. Geen speciale opmerkingen Alleen pollen en zaden.

Rijst

Tomaat

Aardappel

Brassica

Maïs

Tarwe

Reproductieve delen

Geen speciale opmerkingen

Alleen pollen en zaden.


Alleen pollen en zaden.


De verspreiding van knollen moet ook worden tegengegaan.


De verspreiding van wortels en stronken moet ook worden tegengegaan. Alleen pollen en zaden.



De verspreiding van wortels en stronken moet ook worden tegengegaan.

Transgene dieren Bij transgene dieren moet voorkomen worden dat de dieren zich ongewenst verspreiden. Afhankelijk van het dier is dit gemakkelijk of soms moeilijker te voorkomen. Kleine knaagdieren zoals de muis dienen in degelijke kooien gehuisvest te worden en de dierverblijven dienen zo ontworpen te zijn dat ontsnapping niet zomaar mogelijk is. Bij toepassing van een genetisch gemodificeerd micro-organisme of een wildtype pathogeen in een dier dient per geval bepaald te worden op welke wijze het micro-organisme of het pathogeen zich zou kunnen verspreiden vanuit het proefdier en dienen de inperkende maatregelen daarop afgestemd te worden. Het kan dan soms nodig zijn de dieren in individueel geventileerde kooien te huisvesten en al het materiaal dat in aanraking is geweest met de dieren te ontsmetten. Bij gebruik van cellen of ander biologisch materiaal in dieren dient bijzondere aandacht besteed te worden aan de mogelijke aanwezigheid van pathogene virussen in dit materiaal. Sommige cellijnen zijn besmet met virussen. Zijn dergelijke virussen aanwezig, dan dienen de inperkende maatregelen aangepast te worden indien de mogelijkheid bestaat dat het virus zich verspreidt.


19

5. INPERKING: EEN COMBINATIE VAN INFRASTRUCTUUR EN WERKVOORSCHRIFTEN Aan de vier risicoklassen voor activiteiten met pathogene of genetisch gemodificeerde organismen zijn vier basisinperkingsniveaus gekoppeld. Inperking van de gevaren wordt bereikt door de toepassing van een combinatie van maatregelen van infrastructuur en het hanteren van speciale werkvoorschriften. Inperking van gevaren = Infrastructuur + werkvoorschriften

Wanden, deuren, veiligheidskabinet, werkoppervlakken, etc…

Niet eten, drinken of roken, handen wassen, etc…

Elke trede in de inperkingsniveaus (bijv. van niveau 1 naar 2, of van 2 naar 3) voegt een aantal eisen toe aan de eisen aan infrastructuur en werkvoorschriften van het voorgaande niveau. Niet alleen voor laboratoria zijn deze inperkingsniveaus gedefinieerd, ook voor serres, proefdierverblijven en grootschalige procesinstallaties zijn de verschillende niveaus van inperking uitgeschreven. Een overzicht van de eisen aan de inperkingsniveaus van laboratoria, serres en proefdierverblijven zijn te vinden in de bijlagen aan dit boekje. De eisen voor procesinstallaties zijn op te vragen bij de bioveligheidsverantwoordelijke en terug te vinden op www.biosafety.be.

ventilation

sink laboratory coat

closed door

desinfection of benches

Figuur 6: inperking in een laboratorium

20


Inperking aan de bron Zoals bij elke activiteit die een risico kan inhouden, dient een risico zoveel mogelijk bij de bron te worden aangepakt. Dit betekent onder meer dat wanneer hetzelfde bereikt kan worden met een organisme, gastheer of vector die minder risico’s met zich mee brengt, dit altijd de voorkeur heeft. Om inperking aan de bron te realiseren moet de onderzoeker indien mogelijk: • een ingeperkte laboratoriumstam nemen in plaats van een wild type stam; • een niet- mobiliseerbare vector gebruiken in plaats van een zelfoverdraagbare; • een replicatiedefectief virus of virale vector gebruiken in plaats van een replicatiecompetent virus.

Fysische inperking Bij fysische inperking gaat het om alle fysieke maatregelen die genomen worden om een organisme van de buitenwereld af te schermen (en omgekeerd). Dit begint met de houder waarin het organisme zich bevindt maar daarnaast gaat het om een laboratoriumconstructie met een vloer, wanden en een plafond, en deuren en ramen die dicht kunnen. Ook gaat het om werkoppervlakken die geschikt zijn voor het werken met de betreffende pathogenen of GGO’s. Om te kunnen werken met micro-organismen moeten de werkoppervlakken glad zijn afgewerkt en goed ontsmet kunnen worden. Een wasbak moet aanwezig zijn om na de werkzaamheden de handen te kunnen wassen. Voor de hogere inperkingsniveaus 2, 3 en 4 worden er afhankelijk van het risico van de activiteit fysieke maatregelen toegevoegd aan het basisniveau zoals bijvoorbeeld: • veiligheidskabinet (klasse I, II of III) • onderdruk in het lokaal • een sas (sluis) • een douche • HEPA-filtering van de afgevoerde lucht • speciale bekers en apparatuur om de verspreiding van aërosolen tegen te gaan • gasdichtheid van het lokaal om het met een gas te kunnen ontsmetten • etc… Een overzicht van de fysische inperkingseisen is opgenomen in de bijlage 1.

Veiligheidskabinetten Een veiligheidskabinet is een belangrijke vorm van fysische inperking. In feite wordt hiermee een veilige werkplaats in een laboratorium gecreëerd. Veiligheidskabinetten zijn in eerste instantie ontworpen met het oog op de bescherming van de medewerker en in tweede instantie met het oog op de bescherming van het milieu. Er wordt een onderscheid gemaakt in drie klassen: I, II en III. Een klasse I veiligheidskabinet is een afzuigkast, waarbij de afgezogen lucht over een HEPA-filter wordt geleid. Dit kabinet geeft alleen bescherming aan de medewerker, maar niet aan het experiment. Inperking: een combinatie van infrastructuur en werkvoorschriften

21

A B C D

front opening sash exhaust HEPA exhaust plenum

Room air Contaminated air HEPA-filtered air

Figuur 7: Veiligheidskabinet klasse I

Klasse II Een veiligheidskabinet van klasse II (een ‘downflow’kast) beschermt zowel de medewerker, het experiment, als het leefmilieu. Deze kasten hebben een neerwaartse laminaire luchtstroom. Van dit type kabinet bestaan er heel veel verschillende uitvoeringen.

A B C D E F

front opening sash exhaust HEPA filter rear plenum supply HEPA filter blower


Figuur 8: Veiligheidskabinet klasse II

De goede werking van een klasse II veiligheidskabinet De bescherming die een veiligheidskabinet van klasse II aan de medewerker, het experiment en het milieu geeft, staat of valt met de goede werking van het kabinet. Hiervoor is het noodzakelijk dat de luchtstromen in het kabinet zo min mogelijk verstoord worden. Dit betekent het volgende:

22


Richtlijnen voor het correct gebruik van een veiligheidskabinet van klasse II 1.

Bereid een experiment terdege voor en verzamel alle benodigde spullen vooraleer te starten;

2.

Laat het kabinet 10 minuten draaien vooraleer met het experiment te starten;

3.

Ontsmet het werkoppervlak en de luchtaanzuigroosters met een desinfectans (bijvoorbeeld 70% alcohol);

4.

Zet alleen de noodzakelijke spullen in het kabinet;

5.

Zet nooit materialen op de luchtaanzuigroosters aan weerszijden van het werkoppervlak;

6.

Werk van links naar rechts of omgekeerd, maar zorg in ieder geval voor een ‘schone’ kant en een ‘vuile’ kant (met kleine houder voor biologisch besmet afval zoals pipetpunten);

7.

Maak rustige, beheerste bewegingen om de luchtstromen zo min mogelijk te verstoren;

8.

Werk diep genoeg in het kabinet, niet er half buiten;

9.

Werk nooit met een bunzenbrander, omdat deze de luchtstroom te veel verstoort, maar gebruik wegwerp-entnaalden voor het overenten.

10. Ontsmet na het experiment de materialen (aan de buitenzijde) voordat deze uit het kabinet worden verwijderd; 11. Ontsmet het werkoppervlak en de luchtaanzuigroosters; 12. Laat het kabinet na het experiment nog minimaal 5 minuten in werking. 13. Sluit de opening van het kabinet af.

Inperking: een combinatie van infrastructuur en werkvoorschriften

23

Klasse III Een veiligheidskabinet van klasse III geeft een optimale bescherming aan zowel medewerker als milieu, maar geeft een iets minder goede bescherming aan het experiment vanwege het ontbreken van de neerwaartse luchtstroom in het kabinet. De klasse III kast is volledig afgesloten en manipulaties in het kabinet geschieden via afgesloten rubber manchetten. Materiaal wordt in de kast gebracht via doorgeefautoclaaf of een kleine goederensas.

A

B C D E

Room air Contaminated air

glove ports with O-ring for attaching armlenght gloves to cabinet sash exhaust HEPA filter supply HEPA filter double-ended autoclave or pass-through box

HEPA-filtered air

Figuur 9: Veiligheidskabinet klasse III

veiligheidskabinet Klasse I Klasse II Klasse III

medewerker goed goed uitstekend

Bescherming milieu goed goed uitstekend

experiment slecht goed goed

Horizontale laminaire flowkasten en crossflowkasten In laboratoria waar met dierlijke cellen of met in-vitro plantenkweek wordt gewerkt, wordt veel gebruik gemaakt van horizontale laminaire flow- en crossflowkasten. Dit zijn kasten waarin een steriele luchtstroom horizontaal of verticaal de kast in wordt geblazen maar waar de ‘vuile’ lucht de laboratoriumruimte in wordt geblazen. Dit betekent dat de medewerker in de luchtstroom zit. Dergelijke kasten geven dus geen enkele bescherming aan de medewerker en ook niet aan het milieu. Het zijn dus geen ‘veiligheidskabinetten’ en het gebruik ervan moet in de meeste gevallen afgeraden worden. Dergelijke kasten kunnen niet gebruikt worden voor werk dat een risico voor de medewerker of voor het milieu inhoudt. Het gebruik van dergelijke kasten is uitzonderlijk toegestaan zolang er niet gewerkt wordt met open bronnen van GGO’s of met pathogenen, zoals bijvoorbeeld open petrischalen met gemodificeerde of pathogene bacteriën of geopende erlenmeyers met bacteriekweken.

24



Figuur 10:

laminaire flowkast

A B C D

front opening sash supply HEPA filter blower

horizonale laminaire flowkast

HEPA filters HEPA staat voor ‘High Efficiency Particulate Air’ filter. Dit is een filter waarin een matrix vele keren opgevouwen zit zodat een heel groot oppervlak teruggebracht wordt tot een relatief klein volume. Een HEPA filter kan met zeer grote efficiëntie deeltjes afvangen: slechts maximaal 0.03% van de deeltjes met een doorsnee van 0.3 micrometer mogen door het filter passeren. De eigenschappen van de filter zijn zodanig dat zowel de deeltjes die groter zijn als de deeltjes die kleiner zijn dan 0.3 micrometer, met een grotere efficiëntie worden afgevangen. De werkzaamheid van HEPA filters De HEPA filters in veiligheidskabinetten dienen jaarlijks door specialisten gecontroleerd te worden op hun werkzaamheid, en zonodig vervangen.

Werkvoorschriften Fysieke maatregelen alleen zijn niet voldoende om een veilige werksituatie te creëren. Het gaat juist om de combinatie met een speciale werkwijze. Dit betekent dat voor elk niveau ook specifieke werkvoorschriften zijn uitgeschreven.

Basiswerkvoorschriften: Veilige Microbiologische Technieken Voor het basisinperkingsniveau vormen de werkvoorschriften de belangrijkste bijdrage aan de inperking. Deze basisvoorschriften vormen de principes van “Veilige Microbiologische Technieken” (VMT). Iedereen die in een laboratorium met micro-organismen en cellen werkt moet deze voorschriften tot de dagelijkse routine maken.


25

Veilige Microbiologische Technieken: 1. Deuren en ramen zijn gesloten tijdens de werkzaamheden. 2.

Tijdens het werk wordt een laboratoriumjas gedragen.

3.

Eten, drinken, roken en de opslag van eet- en drinkwaren in het laboratorium zijn verboden.

4.

Draag geen sieraden of horloges en houdt de handen schoon en de nagels kort.

5.

Na het morsen van GGO’s wordt direct ontsmet. • Neem vloeistoffen op met tissues of papier en gooi dit in de bak voor biologisch afval. • Ontsmet met 70% alcohol het oppervlak waarop gemorst is. Alternatieven zijn detol of decontamine. Gebruik hiervoor een tissue of papier. • Was de handen na afloop.

6.

Het ontstaan en verspreiden van aërosolen wordt geminimaliseerd. • Centrifugeer alleen met dichte buizen. • Voorkom dat doppen van buizen nat zijn. • Gloei natte entnaalden op de juiste manier uit; d.w.z. eerst de steel en dan pas het entoog. • Laat entnaalden eerst afkoelen voor ze weer in cultuurvloeistof te steken. • Druk pipetten niet met kracht leeg, maar laat ze leeglopen. • Giet vloeistoffen geleidelijk (en nooit van grote hoogte) uit.

7.

Met de mond pipetteren is verboden. • Gebruik altijd een pipetteerballon of een mechanische pipet. • Voor kleine hoeveelheden wordt een mechanische micropipet gebruikt.

8.

Gebruikte materialen worden ontsmet voordat ze worden gewassen of hergebruikt. • Dit kan door ze te autoclaveren of door ze in gevalideerde ontsmettende vloeistof te dompelen.

9.

Biologisch afval wordt geïnactiveerd. • Deponeer hiertoe het afval in de verzamelbak voor biologisch afval. Dit moet worden afgevoerd naar de autoclaaf of naar een verbrandingsoven die geschikt is voor de verbranding van ziekenhuisafval.

10. De handen worden gewassen voordat het laboratorium wordt verlaten. • Gebruik hierbij desinfecterende zeep.

26


Naast het hanteren van deze basiswerkvoorschriften zijn ook belangrijk: 1. Het bijhouden van een gedetailleerd labjournaal, waarin per dag beschreven wordt met welk biologisch materiaal u heeft gewerkt en welke handelingen u heeft verricht; 2. Het controleren van het biologisch materiaal waarmee gewerkt wordt. Wanneer materiaal van collega-onderzoekers wordt verkregen dient eerst gecontroleerd te worden dat het inderdaad om het bedoelde materiaal gaat (stamcontrole, controle (van restrictiepatronen) van vectoren), en bovendien dienen ook de eigen stammen regelmatig gecontroleerd te worden. Een alternatief is om regelmatig vanuit een schone stock te werken of stammen regelmatig opnieuw in te kopen. Elk eenvoudig laboratorium waarin de VMT-werkwijze wordt toegepast, voldoet aan het inperkingsniveau 1. Het laboratorium hoeft niet meer dan de simpele basisvoorzieningen te hebben als een vloer, wanden, plafond, glad afgewerkte, goed te reinigen werkoppervlakken en een wasbak. Voor de inperkingsniveaus 2, 3 en 4 worden aan de basisvoorschriften eisen toegevoegd zoals bijvoorbeeld: • • • • •

Tijdens de uitvoering van de werkzaamheden worden handschoenen gedragen. Toegang tot de werkruimte is voorbehouden aan bevoegden. Er is een controleprogramma voor insecten en knaagdieren. Inactivering van de effluenten van wasbakken en douches. Specifieke maatregelen om de vorming van aërosolen tegen te gaan, bijvoorbeeld het uitvoeren van mogelijks aërosolproducerende handelingen in een veiligheidskabinet. • Ontsmetting van kleren vooraleer men de inperkingszone verlaat. • etc… Een overzicht van de eisen aan de inperkingsniveaus 1 t/m 4 is gegeven in de bijlage 1.

Het gebruik van handschoenen Er bestaan veel misverstanden over het gebruik van handschoenen en in veel gevallen geven handschoenen een vals gevoel van veiligheid. Voor risicoklasse 1 activiteiten is het gebruik van handschoenen niet vereist. De toepassing van de Veilige Microbiologische Technieken is voldoende om veilig te werken. Zelf voor risicoklasse 2 activiteiten zijn handschoenen geen standaardvereiste. Handschoenen moeten wel gebruikt worden in het geval dat huidcontact met het biologisch materiaal een gevaar betekent, of wanneer prikof snijaccidenten kunnen gebeuren, bijvoorbeeld wanneer gewerkt wordt met scalpels of injectienaalden in combinatie met biologisch risicovol materiaal. Handschoenen worden ook vaak gebruikt om de besmetting van onderzoeksmateriaal met micro-organismen, DNA of RNA dat op je handen zit te voorkomen. Je moet echter niet vergeten dat dit materiaal net zo goed op de handschoenen kan zitten, vooral als ze gedurende langere tijd worden gedragen en wanneer ze in contact zijn geweest met allerlei materiaal.


27

Dus als handschoenen worden gebruikt moet altijd rekening worden gehouden met het volgende: • draag handschoenen alleen wanneer het echt nodig is, dus enkel wanneer er een reëel gevaar bestaat dat jij of het experiment besmet raken. • Draag de handschoenen alleen wanneer je daadwerkelijk het experiment uitvoert, en niet wanneer je allerlei ander materiaal hanteert zoals gesloten houders, of wanneer je in je labjournaal schrijft. • Als je handschoenen draagt, vervang ze dan regelmatig.

Beperkte toegang Vanaf risicoklasse 2 geldt voor de toegang tot het laboratorium een wettelijke beperking. Deze houdt in dat alleen het personeel toegang heeft tot het laboratorium dat voldoet aan specifieke toegangsvereisten. Om te voorkomen dat niet-toegelaten personeel toch in dat laboratorium kan geraken, dient de deur op slot te zijn als er niet in het laboratorium wordt gewerkt. En dat geldt zeker voor klasse 3 en 4 activiteiten. Personeel zou enkel de toelating mogen verkrijgen om klasse 2, 3 en 4 laboratoria binnen te gaan, wanneer zij voldoende kennis hebben van veilige werkpraktijken en wanneer zij alle specifieke veiligheidsprocedures voor het betreffende laboratorium kennen en weten hoe deze in de praktijk toe te passen. Er moet altijd een up-to-date register of lijst zijn van de mensen die toegang hebben tot het laboratorium. Om de onopgemerkte toegang tot klasse 2, maar vooral ook klasse 3 en 4 laboratoria te verhinderen verdient het aanbeveling deze laboratoria niet dicht bij de in- of uitgang van een verdieping of gebouw te plaatsen.

28


6. BESMETTING, ACCIDENTEN, ONTSMETTING EN INACTIVATIE Een besmetting is gauw gebeurd. Er kan gemorst worden bij het overgieten van vloeistof of er kunnen een paar druppels wegspatten. Het is zaak een besmetting direct ongedaan te maken. Ook andere ongelukjes zoals het stukvallen van een glazen houder, een prikaccident met een naald of een snijwond van een mes of scalpel zitten in een klein hoekje. Bij elke besmetting of elk ongeluk is blootstelling aan het organisme het gevolg. Dit is niet meteen een direct gevaar wanneer het om onschadelijke organismen gaat. Toch dient ook dan een besmetting opgeruimd te worden. Gebeurt dit niet, dan betekent dit dat resten van micro-organismen zich in het laboratorium ophopen en zo een potentiële bron van besmetting vormen voor het werk van anderen. Er kan echter ook sprake zijn van ongelukjes met organismen die ofwel direct voor de mede-werker (alle humane pathogenen), ofwel voor het leefmilieu (GGO’s en pathogenen van risicoklasse 2, 3 en 4) een risico inhouden. Dan is het zeker zaak gemorst materiaal snel op te ruimen en oppervlakken te ontsmetten. Het morsen op niet-intacte huid of het morsen van bijvoorbeeld pathogeen-virusconcentraat op de intacte blote huid mag niet onopgemerkt voorbijgaan.

Voorkoming Het is zaak om ongelukjes zoveel mogelijk te voorkomen. Dit kan alleen door voorzichtig en doordacht te werken. Experimenten dienen zorgvuldig van tevoren te worden gepland, materialen van tevoren verzameld en na afloop dient alles weer te worden opgeruimd. Slordigheid is de belangrijkste oorzaak van ongelukjes. Scalpels niet rond laten slingeren, maar opbergen in een veilige houder. Op injectiespuiten de naalden niet herkappen, maar de naalden deponeren in een speciaal daarvoor voorziene container.

Melding Het is zaak om accidenten waarbij medewerkers aan gevaarlijke menselijke pathogenen zijn blootgesteld te melden. En niet alleen wanneer het bloed eruit spuit. Ook wanneer er een kleine kans op besmetting is geweest, of wanneer er twijfels zijn over de karakterisatie van het materiaal (denk aan niet-getest humaan bloed) moet een melding gedaan worden. De verantwoordelijke personen voor de bioveiligheid en/of de interne dienst voor preventie en bescherming en indien nodig ook de arbeidsgeneesheer en de verzekeringsdienst (in verband met de eventuele terugbetaling van dure geneesmiddelen) dienen op de hoogte te worden gesteld. Na het ongeluk dienen meteen passende maatregelen te worden genomen. Antivirale geneesmiddelen moeten bijvoorbeeld waar nodig kort na de besmetting worden ingenomen.

Besmetting, accidenten, ontsmetting en inactivatie

29

Handelen na prikof snijaccident Bij een prikof snijaccident, of een spat in het oog of op de mucose met materiaal dat infectieus is voor de mens moet het volgende worden gedaan: 1. De wonde laten bloeden. 2. Uitwassen. 3. Ontsmetten. 4. Eventuele verdere verzorging. 5. Noteren in het EHBO register. Afhankelijk van het type agens waaraan men is blootgesteld dienen eventueel aanvullende maatregelen te worden genomen. Bij opname van ongekarakteriseerd menselijk bloed dient bijvoorbeeld bepaald te worden of er besmetting geweest is met Hepatitis B, Hepatitis C of HIV en moet bepaald worden hoe dit te bestrijden.

Ontsmetting van werkoppervlakken en dergelijke Voor de ontsmetting van materialen en werkoppervlakken zijn verschillende middelen beschikbaar die elk hun eigen werkingsmechanisme hebben. Globaal bekeken zijn er twee algemene werkingsmechanismen: (1) door de lipide membraan van het micro-organisme aan te tasten met als gevolg dat de celinhoud vrij komt; (2) door eiwitten en enzymen noodzakelijk voor de overleving van het micro-organisme aan te tasten. Ethanol, quaternaire ammoniumzouten, en oppervlakte-actieve stoffen (zoals detergenten en zepen) hanteren de eerste werkingsmethode. Sterk oxiderende stoffen zoals chloor of waterstofperoxide hanteren de tweede methode. Phenolen zoals lysol werken door zowel eiwitten als de lipide membraan te vernietigen. Wat meer informatie over een aantal specifieke ontsmettingsmiddelen: • Alcohol Alcoholen zijn effectief tegen vegetatieve bacteria, schimmels en virussen met een lipide membraan, maar niet tegen sporen. De werkzaamheid tegen non-lipide virussen is sterk variabel. Het moet als een 70% oplossing gebruikt worden. Mengsels met andere agentia zijn effectiever dan alcohol alleen, bijvoorbeeld 70% alcohol met 100g formaldehyde per liter of alcohol met 2g/liter chlorine. N.B.: de ontaarde alcohol die in laboratoria wordt gebruikt is giftig. Ook alcoholoplossingen vergaan en daarom dienen ze minimaal één keer per maand ververst te worden. • Natrium hypochloriet (bleekwater) Het vrijkomende chlorine werkt sterk oxiderend en is effectief tegen alle typen van micro-organismen. Natrium hypochloriet moet toegepast worden in een concentratie

30


van 20 ml/l tot 100ml/l afhankelijk van de vraag of het gaat om ‘vuile condities’ (vb. een 1 op 10 oplossing van bleekwater). Oplossingen met chlorine vergaan snel. Om er zeker van te zijn dat ze goed werken dienen de oplossingen één keer per week ververst te worden. • Formaldehyde Formaldehyde is een gas dat werkzaam is tegen alle micro-organismen, mits gebruikt bij een temperatuur hoger dan 20°C en een luchtvochtigheid van ten minste 70%. Het is geschikt voor het ontsmetten van vloeistoffen en voor de decontaminatie van veiligheidskabinetten of van hele ruimten via verneveling. N.B.: formaldehyde is een vermoed carcinogeen. Bovendien is het irriterend en mag het niet worden ingeademd. Formaldehyde wordt alleen in uitzonderlijke gevallen gebruikt wanneer een lokaal of een veiligheidskabinet in zijn geheel ontsmet moet worden, bijvoorbeeld een luchtdicht L3 laboratorium waar een besmetting heeft plaatsgevonden of een luchtdicht proefdierverblijf waar gevaarlijke micro-organismen op de vloeren en wanden kunnen zitten. Ontsmetting met formaldehyde is een tijdrovende en gevaarlijke onderneming die alleen door specialisten veilig kan worden uitgevoerd. Overleg met de preventiedienst is daarom aangewezen alvorens op te starten. • Waterstofperoxide Net als hypochloriet werkt dit tegen alle typen van micro-organismen vanwege zijn oxiderende werking. Het wordt gebruikt als een oplossing van 6%. Het is niet geschikt voor gebruik op aluminium, koper, zink of brons. • Moderne breedspectrum ontsmettingsmiddelen Er zijn vandaag veel verschillende moderne breedspectrum ontsmettingsmiddelen op de markt. De meeste bevatten een combinatie van stoffen met verschillende werkingsmechanismen tegen micro-organismen. Ze kunnen oxiderende stoffen bevatten, quaternaire ammoniumzouten, oppervlakte-actieve en andere stoffen. Deze middelen kunnen voor ontsmetting gebruikt worden op voorwaarde dat ze gevalideerd zijn voor de microorganismen waarmee je werkt. Raadpleeg niet alleen de gebruiksaanwijzing van deze middelen, maar controleer ook welke werkzame stoffen in welke concentratie aanwezig zijn, en welke werkingsmechanismen vertegenwoordigd zijn in het middel. Ontsmetting, zeker als het gaat om de ontsmetting van oppervlakken, geschiedt nooit voor de volle 100%. Ontsmetting leidt slechts tot een sterke reductie van het aantal kiemen (bij goede ontsmetting van een bacteriële besmetting om en nabij de 90%, virale besmetting is meestal beter te verwijderen). Ook is het zo dat bij het gebruik van ontsmettingsmiddelen de lijken van de micro-organismen en het vuil vaak achterblijven. Daarom is het van belang dat bij de (wekelijkse) schoonmaak van de ruimten de werkoppervlakken, vloeren en deurknoppen worden afgenomen met warm water en zeep. Twee keer ontsmetten leidt dus eigenlijk pas tot een echt goede ontsmetting.


31

De werkzaamheid van verschillende ontsmettingsmiddelen schimmels bacteriën Alcohol Hypochloriet Formaldehyde Peroxide * boven de 40 °C

+ +++ +

+++ +++ +++ +++

mycobacteria

sporen

+++ ++ +++ ++

++ +++* ++

lipide virussen + + + +

non-lipide virussen V + + +

V = variabel

Inactivatie De doding van biologisch materiaal is vaak niet eenvoudig. Bacteriesporen zijn bijvoorbeeld resistent tegen temperaturen van 100°C. Autoclaveren is dan aangewezen: verhitting van water onder druk bij 121°C gedurende 20 minuten. Soms worden ook temperaturen van 134°C gehanteerd. De doding van micro-organismen is zeer goed, op de voorwaarde dat de hete stoom overal goed bij kan. Luchtzakken zijn een bekend probleem. Dierlijke cellen zijn soms in staat in een luchtzak de autoclavering levend te doorstaan. Het beladen van een autoclaaf dient daarom zorgvuldig te gebeuren en deksels dienen losgedraaid te worden. Autoclavering is de aangewezen methode om bacteriën, gisten en schimmels te doden. Voor andere organismen zoals cellen van planten en dieren en soms ook van virussen zijn eenvoudiger alternatieven beschikbaar. Verhitting tot 80°C of de blootstelling aan een zeepoplossing zijn vaak voldoende om de cellen te doden. Het is van belang om na te gaan of de toe te passen methode een gevalideerde methode is: dat wil zeggen dat nagegaan moet worden dat de doding effectief is. Inactivatie geeft een veel betere doding dan ontsmetting: een juist uitgevoerde inactivatie geeft een doding van 100%. Vaak wordt voor de doding van vloeistoffen met bacteriën gebruik gemaakt van Natrium hypochloriet. Daarbij moet opgelet worden dat de finale concentratie chlorine in de oplossing voldoende is om de bacteriën te doden (20-100ml/l). Opgemerkt moet worden dat autoclavering nog altijd een veel milieuvriendelijker methode van inactivatie is. De vloeistoffen met chloor worden in de praktijk (te) vaak door de gootsteen gegooid. Er mogen in principe geen stoffen in het bedrijfsafvalwater terechtkomen die de werking van een afvalwaterzuiveringsstation negatief zouden kunnen beïnvloeden. Voor een goede doding van micro-organismen is ook belangrijk dat het ontsmettingsmiddel voldoende lang in contact is met de micro-organismen. Over het algemeen geldt dat een blootstelling van 15 tot 30 minuten vereist is.

32


De aangewezen ontsmetting en inactivatiemethode voor enkele relevante organismen

E.coli Lactobacillus Salmonella Aspergillus Adenovirus Influenzavirus HIV Vaccinia

Ontsmetting 1% 2% NaOCI glutaraldehyd x x x x x x x x x x x x x x x x

70% ethanol x x x

x x

Inactivatie Formal- natte hitte droge hitte Verhitdehyd 121 °C, 20’ 160 °C, 60’ ting 60 °C x x x x x x x x x x x x x x, 30’ x, 30’ x x**

* geldt alleen voor kleine volumina serum ** alleen voor heat-labile antigen vaccinia

Biologisch afval Biologisch afval moet afgevoerd worden. Een belangrijk onderscheid moet gemaakt worden tussen biologisch afval dat geïnactiveerd is voordat het wordt afgevoerd en biologisch afval dat niet geïnactiveerd is voordat het wordt afgevoerd. Deze laatste categorie moet als risicohoudend medisch afval worden beschouwd en afgevoerd worden naar een vuilverbrandingsinstallatie die geschikt is voor de verbranding van risicohoudend medisch afval. Onder biologisch afval wordt verstaan: Wel: • alle genetisch gewijzigd en/of pathogeen biologisch materiaal: celculturen, culturen van micro-organismen, weefsel, bloed…. • typisch labo-afval van organische aard: gels……… • alle mogelijks biologisch besmet materiaal: handschoenen, doekjes of papier, wegwerp kweekrecipiënten, pipetten, …. • en alle zaken die niet noodzakelijk besmet zijn, maar die niet in een gewone vuilzak mogen worden geworpen omdat ze scherp zijn, of er vies uitzien (beenderen, bloed,…) Niet: • radio-actief besmet afval (dit dient apart te worden afgevoerd).

Hoe met biologisch afval om te gaan Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen vast (en pasteus) en vloeibaar biologisch afval. Afhankelijk van de vragen of het afval geïnactiveerd is en/of chemisch verontreinigd, wordt het biologisch afval op de volgende manier ingedeeld:


33

Soort afval Vast/pasteus Vast/pasteus Vast/pasteus Vloeibaar Vloeibaar Vloeibaar

Geïnactiveerd Chemisch verontreinigd + + + + of + + + + of -

Bestemming => restafval => chemisch afval => risicohoudend medisch afval => bedrijfsafvalwater => chemisch afval => risicohoudend medisch afval

Risicohoudend medisch afval (RMA) wordt verzameld in speciale gele containers die geschikt zijn voor het transport van dit afval. Eenmaal gesloten, kunnen deze containers niet meer geopend worden. Ze zijn bovendien zo stevig dat het vallen van hoogtes geen probleem vormt. Deze speciale RMA containers moeten op regelmatige basis door een erkende vervoerder afgevoerd worden naar een vuilverbrandingsoven die geschikt is voor de verbranding van ziekenhuisafval. De volgende richtlijnen gelden voor de tijdelijke opslag van de containers, voor afvoer naar de vuilverbranding: - maximaal 2 maanden, bij een maximale temperatuur van 4 °C; - maximaal 2 weken, bij een maximale temperatuur van 20 °C - maximaal 1 week, indien de temperatuur van de opslagruimte boven de 20 °C uit kan komen.

Biologisch afval afkomstig uit proefdierverblijven Het afval afkomstig uit proefdierverblijven behoort tot dezelfde categorieën als hierboven aangegeven. Transgene laboratoriumdieren zoals ratten en muizen moeten worden gedood en in een RMA container worden afgevoerd naar de vuilverbranding. Het beddingmateriaal en de uitwerpselen van deze transgene dieren hoeven niet als GGO-afval te worden beschouwd. Dit kan afgevoerd worden als restafval of GFT, zonder het vantevoren te inactiveren. Het wordt echter anders wanneer het gaat om materiaal van dieren die behandeld zijn met genetisch gemodificeerde en/of pathogene micro-organismen. De gebruikte micro-organismen kunnen dan het beddingmateriaal en de uitwerpselen besmetten. Voor de met micro-organismen behandelde dieren geldt hetzelfde als voor de transgene dieren: ze moeten worden gedood en als RMA worden afgevoerd. Al het beddingmateriaal en de uitwerpselen moeten verzameld worden en geïnactiveerd. Dit kan ofwel in-huis worden gedaan, of het materiaal wordt verzameld in RMA containers en afgevoerd naar de vuilverbranding.

Afval van planten Er moet ook voorzichtig worden omgegaan met afval van transgene planten. Alle bloemen (die stuifmeel bevatten), zaden, en – afhankelijk van de plantensoort – de reproductieve delen (zie hst 4 van dit boekje) moeten worden verzameld en geïnactiveerd. Er zijn verschillende mogelijkheden om dit materiaal te doden: sterilisatie is de meest rigoreuze methode, maar ook eenvoudiger methoden kunnen soms volstaan, zoals het verhakselen van materiaal. Ook stomen is voor plantaardig materiaal en voor grond die in contact is gekomen met transgeen plantenmateriaal, een uiterst geschikte methode van inactivatie. Al het niet-reproductief materiaal kan worden gecomposteerd (nat of droog) en kan na de compostering worden afgevoerd als restafval of tuinafval. Wanneer planten zijn geïnfecteerd of behandeld met genetisch gemodificeerde en/of pathogene micro-organismen dan moeten ze als geheel worden geïnactiveerd, zowel als de grond en ander materiaal dat mogelijks besmet is. 34


7. WERKEN MET ENKELE VEELGEBRUIKTE LABORATORIUMORGANISMEN Werken met genetisch gemodificeerde Escherichia coli en met fagen Inschaling Genetisch gemodificeerde E.coli K12, B en C stammen en alle fagen kunnen onder L1 omstandigheden (zie bijlage 1) gehanteerd worden op de voorwaarde dat: • de gebruikte vectoren niet zelfoverdraagbaar zijn • de gekloneerde genen geen schadelijke genproducten aanmaken (bijv. een toxine), of niet tot expressie komen Deze K12, B en C stammen zijn geattenueerde (verzwakte) laboratoriumstammen die ten opzichte van de wildtype E.coli stammen biologisch ingeperkt zijn en niet langer pathogeen zijn. Hieronder zijn enkele inschalingen gegeven, waarbij ter illustratie is aangegeven volgens welke inschalingsregel uit bijlage 2 deze inschaling tot stand is gekomen. Omdat deze inschalingen uitgaan van onschadelijke inserts is uit bijlage 2 het subartikel steeds e of j (afhankelijk van de vraag of het insert al gekarakteriseerd is). Het spreekt voor zich dat het insert sterk medebepalend is voor de inschaling. Dit betekent dat in het geval met inserts gewerkt wordt die niet-onschadelijk zijn, bijvoorbeeld wanneer het insert codeert voor de productie van een toxine, een ander subartikel van toepassing wordt en dan gaat de inschaling minimaal één trede omhoog. * uitgaande van onschadelijke inserts, schadelijke inserts verhogen de risicoklasse

Stam

vectoren

Behorend tot E. coli K12, B of C Behorend tot E. coli K12, B of C Overige E. coli stammen

Niet-zelfoverdraagbare L1 vectoren (tra-) zelfoverdraagbare vectoren (tra+)

inschaling*

Inschalingsregel** 1.e of j

L2

2.e of j

Niet-zelfoverdraagbare L2 vectoren (tra-)

3.e of j

Opmerkingen bijna alle gebruikte coli systemen vallen hieronder een voorbeeld is sommige miniTn5 systemen er moet vanuit worden gegaan dat deze stammen nog pathogeen zijn

** het gaat hierbij om de uit de schema’s in bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel

Werken met enkele veelgebruikte laboratoriumorganismen

35

Laboratoriumvoorzieningen In veel gevallen wordt met E.coli K12, B of C stammen gewerkt in combinatie met nietzelfoverdraagbare vectoren en dan is een eenvoudig L1 laboratorium met basisvoorzieningen voldoende. Vanzelfsprekend moeten de werkoppervlakken goed ontsmet kunnen worden. Open handelingen met E. coli kunnen op een bench gebeuren, mits de vorming van aërosolen geminimaliseerd wordt (zie VMT voorschriften). Enten en dergelijke kunnen bij een vlam. Een alternatief voor het werken met open bronnen op de bench is om deze handelingen in een veiligheidskabinet uit te voeren. De voorschriften van Veilige Microbiologische Technieken dienen te worden nageleefd.

Afval Alle vaste materialen (voedingsbodems) en alle vloeistoffen die gemodificeerde coli’s bevatten en alle met coli’s besmette materialen dienen geïnactiveerd of ontsmet te worden. Er mag geen levende coli in het huishoudelijk afval terechtkomen. Zorg daarom voor afvalbakken die duidelijk gemarkeerd zijn voor biologisch afval. Vloeistoffen dienen geautoclaveerd te worden voordat ze door de gootsteen verdwijnen. Een alternatief is inactivatie met hypochloriet, maar dit is een minder milieuvriendelijk alternatief. Een uitzondering op deze regel zijn E.coli K12 stammen die een vector dragen die niet mobiliseerbaar (mob-) en goed gekarakteriseerd is, een gen dragen dat goed gekarakteriseerd is (herkomst, grootte, genproduct, functie, etc…) en bovendien een genproduct aanmaken dat volstrekt onschadelijk is. In dat geval is inactivering niet nodig. Dit behoort echter tot de uitzonderingsgevallen die in een researchsetting nauwelijks voorkomen. Bovendien is een expliciete en specifieke toelating vereist die bevestigt dat inactivatie niet nodig is.

Bijzonderheden Met enige regelmaat (2x per jaar) dienen de gebruikte stammen gecontroleerd te worden (stamcontrole). Een alternatief is om regelmatig opnieuw te starten vanuit een schone cultuurstock.

Een praktisch voorbeeld Om de bepaling van de risicoklasse en de inperkingsmaatregelen te illustreren en tevens aan te geven hoe dit boekje kan worden gebruikt worden hieronder enkele concrete praktijkvoorbeelden van risico-inschattingen uitgewerkt.

Een voorbeeld van de bepaling van de inschaling in de praktijk 1. De klonering van een chymosine-gen in pUC18 met E. coli stam JM109 als gastheer, waarbij alleen kleinschalige standaardlaboratoriumhandelingen zullen worden uitgevoerd Stap 1: Is de combinatie van gastheer en vector geschikt voor risicoklasse 1? Daarvoor moet eerst nagegaan worden of de gebruikte E.coli stam geschikt is voor risicoklasse 1. Alle E. coli 36


K12, B of C-stammen zijn geschikt voor risicoklasse 1 en dus is het voldoende om in catalogi, bij de leveranciers, of in stammendatabases (bijv. ATCC of DSMZ) na te gaan of JM109 tot deze stammen behoort. Het antwoord is in dit geval: ja, JM109 is een E.coli K12. Daarna moet nagegaan worden of de vector geschikt is voor risicoklasse 1. PUC18 is een goed gekarakteriseerde vector zonder schadelijke eigenschappen die bovendien niet-zelfoverdraagbaar is. De vector is geschikt voor risicoklasse 1. (Een gedetailleerde beschrijving van de eisen aan vectoren is te vinden in bijlage 2 aan deze brochure, in hst A. Ook is daar te vinden wat ´goed gekarakteriseerd´ inhoudt). De gastheer-vector combinatie zijn dus geschikt voor risicoklasse 1. Stap 2: Nu kan in bijlage 2 het bijbehorende inschalingsartikel worden opgezocht. In dit geval is uit hst A van bijlage 2, in de ‘eerste richting’ de categorie 1 van toepassing (gastheer-vectorsysteem voldoen immers aan de criteria voor indeling in risicoklasse 1). Maar voor de inschaling dient eerst nog het risico van het insert ingeschat te worden. Stap 3: In dit geval wordt gewerkt met een stukje erfelijk materiaal uit rund dat verantwoordelijk is voor de productie van chymosine, een eiwit dat zorgt voor de stremming van kaas. Het is in dit geval goed gekarakteriseerd, is geen toxine, heeft niets te maken met virussen of met pathogeniteit, en is ook niet op een andere wijze schadelijk. Dus is uit hst A van bijlage 2, in de ‘tweede richting’, categorie j van toepassing, hetgeen een eerste identificatie van het inschalingsniveau oplevert: L1 Stap 4: Zijn er nog bijzonderheden in verband met: (1) het milieu dat zou kunnen worden blootgesteld, (2) het type en de schaal van de activiteit, en (3) eventuele niet-standaard handelingen. In dit geval worden er bijvoorbeeld alleen kleinschalige, reguliere handelingen gedaan zoals: transformatie, kleinschalige kweek in erlenmeyers, centrifugatie, eiwitisolatie, gelelectroforese. Een activiteit wordt pas als grootschalig gezien als het gaat om grote kweekvolumes in een productiefaciliteit. Toch vereisen ook kleine fermentoren vaak bijzondere aandacht als het gaat om afdichting en fysische inperking van de down-stream processing. Er zijn in dit geval geen bijzondere handelingen die ofwel een extra risico met zich meebrengen ofwel een bijzondere vorm van additionele inperking vereisen. De finale inschaling komt daarom neer op het hanteren van de standaard L1-voorschriften. Hierover kan het volgende in dit boekje worden teruggevonden: • L1-inperkingseisen: bijlage 1 van dit boekje • Gedetailleerde VMT-basisvoorschriften: hst 5 van dit boekje • Hoe te ontsmetten en te inactiveren: hst 6 van dit boekje Een mogelijke variatie op dit voorbeeld: 1a. De klonering van het chymosine gen in een zelfoverdraagbaar plasmide in E. coli JM109 en het aanbrengen van de gemodificeerde bacteriën op een kunststof matrix waarbij niet vermeden kan worden dat aërosolen ontstaan. In dit geval verandert de inhoud van stap 2: de vector voldoet niet aan de eisen voor risicoklasse 1. Dit betekent dat van hst A, bijlage 2, in de ‘eerste richting’ nu categorie 2 van toepassing wordt. Het genproduct is nog steeds goed gekend en niet schadelijk, dus blijft in de ‘tweede richting’ j van toepassing, wat een L2 inschaling oplevert. Er wordt bovendien een bijzondere aërosolproducerende handeling uitgevoerd. Hiervoor is een additionele inperkende maatregel nodig, bovenop de standaard L2 voorschriften: er moet een veiligheidskabinet van klasse II aanwezig zijn waarin de aërosolproducerende handeling wordt uitgevoerd. Finaal wordt de inschaling dus L2 mét gebruik van veiligheidskabinet klasse II. Hierover kan het volgende in dit boekje worden teruggevonden: Werken met enkele veelgebruikte laboratoriumorganismen

37

• L2-inperkingseisen: bijlage 1 van dit boekje • Beschrijving hoe te handelen in een veiligheidskabinet: hst 5 van dit boekje • Hoe te ontsmetten en te inactiveren: hst 6 van dit boekje Zijn er gevallen aan te wijzen waarin er bijzondere aandacht nodig is voor eventueel extra te nemen maatregelen? Hieronder volgen enkele voorbeelden: 1. Het ontstaan en de verspreiding van aërosolen kan niet worden geminimaliseerd (dit is het voorbeeld hierboven beschreven onder 1a). Het gebruik van een veiligheidskabinet van klasse II is dan al gauw noodzakelijk. 2. GGO´s of pathogenen worden in een niet-destructieve meting gedurende langere tijd open en bloot gehanteerd. Als de organismen gevaarlijk zijn, dient nagegaan te worden of ze zich zouden kunnen verspreiden. Zo ja, dan dienen in veel gevallen de ruimte en de medewerker extra beschermd te zijn (bijv. onderdruk en HEPA-filtering op afgevoerde lucht en/of handschoenen en gelaatsbescherming). 3. GGO´s of pathogenen worden in fermentoren gehanteerd en in een downstream-proces opgezuiverd. Sommige fermentoren zijn dichter dan andere en dit geldt zeker ook voor downstream-procesapparatuur. Bij organismen van klasse 2 en hoger dient er bijvoorbeeld ook een hydrofoob absoluut filter of een HEPA-filter aanwezig te zijn op de fermentorgasafvoer. 4. GGO´s of pathogenen worden in of op een plant of proefdier gebracht. Er dient per geval zorgvuldig te worden nagegaan of verspreiding naar het milieu van het GGO of het pathogen moet worden tegengegaan. De maatregelen hangen sterk af van plant tot plant en van dier tot dier. Vaak bepaalt de toedieningswijze of en hoe een micro-organisme zich kan verspreiden. Wat te doen bij twijfel over de inschaling of eventueel toe te passen maatregelen? In achtereenvolgende stappen, indien de voorgaande stap geen uitsluitsel heeft gegeven: 1. Zoek eventueel ontbrekende informatie op om een betere inschatting te kunnen maken. 2. Raadpleeg uw hiërarchische overste. 3. Raadpleeg uw groepsleider. 4. Win eventueel advies in bij interne experts op het terrein van bioveiligheid (zie bijlage 5 van dit boekje), of win anders eventueel extern advies in bij de sectie bioveiligheid en biotechnologie van het WIV (http://www.biosafety.be).

Werken met niet-pathogene genetisch gemodificeerde gisten Inschaling Niet-pathogene genetisch gemodificeerde gisten zoals Saccharomyces cerevisiae, Schizo-saccharomyces pombe en Pichia pastoris kunnen allemaal onder L1 condities gehanteerd worden op voorwaarde dat er geen genen in zijn gekloneerd die gevaarlijke producten aanmaken. De in laboratoria gebruikte stammen van gist zijn allemaal op de één of andere wijze deficiënt en hebben een speciaal voedingsmedium nodig waaraan een bepaalde essentiële stof is toegevoegd. Vaak gaat het om aminozuurdeficiënties.

38


Laboratoriumvoorzieningen Dezelfde standaard laboratoriumvoorzieningen als voor E.coli zijn voldoende. Het verdient echter aanbeveling open handelingen met gisten uit te voeren in een veiligheidskabinet. Gisten kunnen gedurende lange tijd in de lucht overleven en kunnen op deze wijze allerlei kweken besmetten. Daarnaast is er bij gesensibiliseerde mensen kans op een allergische reactie na blootstelling aan gist of zijn sporen. Daarom wordt gistwerk vaak in een apart lokaal gedaan.

Afval Op dezelfde manier als voor E. coli dient alle afval dat genetisch gemodificeerde gisten bevat geïnactiveerd of ontsmet te worden.

Bijzonderheden Ook hier geldt dat bij het kloneren van een gen dat codeert voor een schadelijk genproduct zoals een toxine, de risicoklasse omhoog gaat en dat alle bijbehorende maatregelen moeten worden opgetrokken naar dat niveau.

Werken met genetisch gemodificeerde cellijnen Inschaling De inschaling van dierlijke of menselijke cellijnen is niet eenvoudig. De bepalende factor is of de cellen schadelijke biologische agentia kunnen produceren, en dan met name virussen. Ten eerste dient een onderscheid te worden gemaakt tussen primaire cellen en ‘established cell lines’. De minimum inschaling van primaire cellen is L2. Bij established cell lines moet vastgesteld worden of ze eventueel een virus zouden kunnen produceren. Daarbij moet rekening gehouden worden met virale sequenties die in de vector aanwezig zijn. Enkele voorbeelden: Cellijn

Virale sequenties in cellijn

Vector (dient slechts als voorbeeld)

Inschaling*

Inschalingsregel**

Opmerking

Primaire muizencellijn

onbekend

niet relevant

L2

-

NIH-3T3

geen

SV40ori vector

L1

4, e of j

HELA

E6E7 genen SV40ori vector uit HPV

L1

4, e of j

Inschaling kan pas omlaag als aangetoond is dat de cellen geen schadelijke biologische agentia produceren kans op vorming van virus is nul combinatie virale sequenties in cellijn en vector kan geen virus opleveren


39

293

E1 en stuk E4 uit adenovirus

E1 gedeleteerde adenovirale vector

EBV geïm- cellen bevat- niet relevant mortaliseerde ten compleet lymfocyten EBV virus

L2

8, e of j

L2

-

recombinatie tussen sequenties in cellijn en vector kan replicatie competente virusdeeltjes geven de inschaling van de cellen volgt de inschaling van het virus dat erin aanwezig is

* uitgaande van onschadelijke inserts, schadelijke inserts verhogen de risicoklasse! ** het gaat hierbij om de uit de schema’s in bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel

Laboratoriumvoorzieningen De benodigde laboratoriumvoorzieningen variëren naargelang de inschaling. Eenvoudige L1 laboratoria voldoen voor cellen zoals NIH-3T3. In de praktijk is het zo dat voor het enten en opgroeien van dergelijke cellen goed uitgeruste celkweeklaboratoria worden gebruikt die qua inrichting veel meer zijn dan een L1 laboratorium. Er is meestal een veiligheidskabinet klasse II aanwezig om bij de open handelingen met de cellen de cellen te beschermen tegen infecties van buitenaf. In plaats van een veiligheidskabinet klasse II wordt vaak gebruik gemaakt van een horizontale laminaire flowkast. Een dergelijke kast is geschikt voor L1 activiteiten met celkweken. Voor cellen die een L2 inschaling vereisen, is een horizontale laminaire flowkast niet geschikt. In dat geval is alleen een veiligheidskabinet van klasse II geschikt om zowel de medewerker, het milieu en de celkweek te beschermen. De eisen van L2 in vergelijking met die van L1 zijn vooral strenger voor wat betreft de toegang tot het laboratorium en de uitvoering van werkzaamheden waarbij aërosolen gevormd kunnen worden.

Afval Al het biologisch afval van genetisch gemodificeerde cellen dient te worden geïnactiveerd. Er is echter een onderscheid tussen de celkweken van L1 niveau en die van L2 niveau. Voor celculturen van L1 niveau is het voldoende om ze bloot te stellen aan een zeepoplossing en vervolgens door de gootsteen te spoelen. Ook besmette materialen kunnen op deze manier behandeld worden. Voor celculturen op L2 niveau dienen meer rigoureuze maatregelen te worden genomen om ervan verzekerd te zijn dat ook mogelijke schadelijke biologische agentia gedood zijn. Autoclaveren is daarvoor de meest aangewezen methode.

Bijzonderheden Werk nooit met autologe cellen. Zeker wanneer daar groeifactoren of oncogenen in gekloneerd zouden worden bestaat het gevaar dat een besmetting leidt tot ongewenste gevolgen. De cellen worden immers niet door het immuunsysteem als vreemd herkend.

40


Werken met genetisch gemodificeerde virussen of virale vectoren Inschaling De indeling van genetisch gemodificeerde virussen in risicoklassen volgt in het algemeen de biologische risicoklassen van de virussen (zie bijlage 5.51.8 aan Vlarem II, www.biosafety.be), tenzij het insert zorgt voor een verhoging van het risico. In dat geval dient de inschaling hoger uit te vallen dan de biologische risicoklasse van het virus. Het gebruik van virussen en virale vectoren kan niet los gezien worden van het gebruik van cellijnen. En dit betekent dat ook hier gekeken moet worden naar de combinatie van virussequenties in de vector en in de cellijn. Bij de productie van replicatiedefectieve viruspartikels wordt gebruik gemaakt van cellijnen die de ontbrekende virale sequenties bezitten die nodig zijn om viruspartikels gevormd te krijgen. Pas wanneer er in dergelijke systemen geen kans bestaat op vorming van replicatiecompetente partikels kan de inschaling een trede omlaag. Packaging Virale sequenties cellijn in cellijn

Vector (dient als voorbeeld)

Inschaling*

Inschalingsregel**

Opmerking

L2

8 e of j

combinatie virale sequenties in cellijn en vector kunnen resulteren i/d formatie van een replicatie-competent virus kans op vorming van replicatie competente virusdeeltjes is nul

293

E1 gen en stuk van E1 gedeleteerde E4 gen uit adenovirale adenovirus vector

PER.C6

E1 gen van adenovirus

E1 gedeleteerde L1 adenovirale vector zonder sequentieoverlap

9 e of j

PA317

gag-pol-env van retrovirale vector L2 amfotroop muizen- zonder gag-polretrovirus env genen

8 e of j

Y-CRE

gag-pol en env retrovirale genen van ecotroop vector zonder muizen-retrovirus als gag-pol-env twee gescheiden genen constructen

L1

7 e of j

Phoenixampho

E1/E4 van adeno- retrovirale vector L2 virus, largeT van zonder gag-polSV40, en episomaal env genen gag-pol en env genen van amfotroopmuizen retrovirus

8 e of j

kans op vorming van RCR’s is klein, maar niet nul. Er is vaak nog wat sequentieoverlap kans op vorming van RCR’s is kleiner dan bij PA317 en bovendien is het virus ecotroop dus kan het de mens niet infecteren kans op vorming van RCR’s kleiner dan bij PA317, maar door episomale aanwezigheid van gag-pol en env in meerdere kopieën is de kans op vorming van RCR’s niet nul

* uitgaande van onschadelijke inserts, schadelijke inserts verhogen de risicoklasse! ** het gaat hierbij om de uit de schema’s in bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel Werken met enkele veelgebruikte laboratoriumorganismen

41

Laboratoriumvoorzieningen Voor het opgroeien van adenovirale of muizenretrovirale partikels, of ze nu replicatiedefectief zijn of niet, is een laboratorium met inperkingsniveau 2 aangewezen. Bovendien is een veiligheidskabinet van klasse II nodig, een horizontale laminaire flowkast geeft onvoldoende bescherming aan de medewerker en het milieu. Strikte toegangsregels gelden voor de toegang tot de ruimte.

Afval Al het vast, vloeibaar en besmet materiaal dient geïnactiveerd of ontsmet te worden voordat het wordt weggegooid of hergebruikt. Autoclaveren is hiervoor de aangewezen methode, of afvoeren van het materiaal in speciale biohazardafvalcontainers naar een vuilverbranding die geschikt is voor de verbranding van ziekenhuisafval.

Bijzonderheden Werkzaamheden met de verschillende virale vectoren kunnen niet gelijktijdig in eenzelfde ruimte, laat staan in eenzelfde veiligheidskabinet worden uitgevoerd. Na beëindiging van werkzaamheden met een bepaald virus dienen de werkoppervlakken en het veiligheidskabinet te worden opgeruimd en ontsmet voordat het wordt vrijgegeven voor werkzaamheden met een ander virus. In het bovenstaande wordt uitgegaan van onschadelijke inserts. Bij het gebruik van virale vectoren, zeker wanneer het gaat om vectoren die hun erfelijk materiaal in het genoom van de cel inbouwen, moet extra opgepast worden met bijvoorbeeld het gebruik van dominant cellulaire oncogenen. De inschaling gaat dan een klasse omhoog. Ook genen voor sommige immuunmodulerende eiwitten kunnen in virale vectoren als schadelijk worden aangemerkt. Een risicoklasse 3 inschaling is in sommige gevallen nodig en daarvoor gelden strikte inperkingsvoorzieningen en werkvoorschriften die in de praktijk nogal wat met zich meebrengen. Er zijn steeds meer systemen voor de productie van virale vectoren waarbij het partikel dat geproduceerd wordt bestaat uit componenten afkomstig van verschillende virussen. Het meest bekende voorbeeld is de pseudotypering van retrovirale vectoren met het VSV-G eiwit. Dergelijke combinaties van virale componenten verdienen bijzondere aandacht. Gastheerspecificiteit kan veranderen, bijvoorbeeld van niet-infectieus voor de mens naar wel-infectieus voor de mens. De risicoklasse dient aangepast te worden aan het actuele risico.

42


Werken met genetisch gemodificeerde Agrobacterium Inschaling Over het algemeen wordt gewerkt met A. tumefaciens stammen die ‘disarmed’ zijn, dat wil zeggen dat ze niet langer oncogeen zijn. Ze veroorzaken geen ‘crown galls’ meer. Deze stammen vallen in risicoklasse 1. Dit geldt niet voor wildtype stammen of voor A. rhizogenes. Stam

vectoren

Inschaling*

Disarmed A. tumefaciens stammen Not disarmed A. tumefaciens stammen A. rhizogenes

Binaire en andere plant transformatie vectoren Binaire en andere plant transformatie vectoren Binaire en andere plant transformatie vectoren

L1

L2

L2

Inschalings- Opmerkingen regel** 1 e of j de stammen zijn biologisch ingeperkt ten opzichte van de wildtype stammen 3 e of j deze stammen zijn pathogeen 3 e of j

deze stammen zijn pathogeen

* uitgaande van onschadelijke inserts ** het gaat hierbij om de uit bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel

Laboratoriumvoorzieningen Standaard L1 laboratoriumvoorzieningen volstaan voor disarmed A. tumefaciens stammen. Dezelfde regels kunnen gevolgd worden voor E. coli K12. Voor de niet-disarmed tumefaciens of A. rhizogenes stammen volstaat een standaard L2 laboratorium. In geval van L2 werkzaamheden waarbij de vorming van aërosolen niet kan worden vermeden, dient een veiligheidskabinet klasse II aanwezig te zijn.

Afval Al het materiaal, vast of vloeibaar, dient ontsmet te worden net als voor E. coli. Autoclaveren is daarvoor de meest aangewezen methode.

Bijzonderheden Vaak worden kleine, recent getransformeerde plantjes overgezet op verse media. Deze plantjes zijn (nog) niet vrij van A. tumefaciens. Meestal wordt dit gedaan in horizontale laminaire en crossflowkasten. Dit is toegestaan zolang er niet gewerkt wordt met echte open bronnen van Agrobacterium.


43

Werken met transgene planten Bij het werken met transgene planten kunnen de volgende vuistregels gehanteerd worden: 1. Kweek in fytotrons of kweekcellen: • Kweekcellen moeten dicht zijn en mogen niet direct op de buitenlucht openen. • Plantenmateriaal moet geautoclaveerd worden voordat het als restafval wordt afgevoerd (in het geval het nog niet vrij is van genetisch gemodificeerde Agrobacterium tumefaciens). • De verspreiding van zaden moet worden tegengegaan en reproductieve delen van planten moeten geïnactiveerd worden voordat ze als afval worden afgevoerd. 2. Kweek in serres: • Bij gebruik van bloeiende insectenbestuivers moeten openingen voorzien zijn van insectengaas en mag de serre niet direct op de buitenlucht openen (er moet een sas zijn); bij gebruik van bloeiende zelfbevruchters, apomicten of windbestuivers hoeft er geen insectengaas op de openingen en is een sas niet echt nodig. • Ook hier geldt dat de verspreiding van zaden tegengegaan moet worden. Zaden moeten zorgvuldig worden verzameld. Grond die zaden kan bevatten mag pas na inactivering worden afgevoerd als afval. Reproductieve delen van planten moeten geïnactiveerd worden voordat ze als afval worden afgevoerd.

44


8. REFERENTIES Begrip voor Veilige Microbiologische Techniek; theoretische inleiding voor de practische cursus, Commissie ad hoc recombinant-DNA werkzaamheden, 1987 Veilig werken met micro-organismen en cellen in laboratoria en werkruimten; theorie en praktijk; concept, oktober 1997; Nederlandse Vereniging voor Microbiologie. Laboratory Biosafety Manual, second edition, WHO, Geneva, 1993 Leidraad voor een Handboek GGO ingeperkt gebruik, BVF-platform, 2001 Richtlijn 90/219/EEG, zoals gewijzigd door richtlijn 98/81/EEG Vlarem I en II, rubriek 51 Biosafety cabinets, CDC, Atlanta, USA http://www.biosafety.be http://www.hc-sc.qc.ca/hpb/lcdc/biosafty/msds/index.html http://www.ebsa.be http://www.cdc.gov/od/ohs

Referenties

45

9. VERKLARENDE WOORDENLIJST Aërosol: minuscule vloeistofdruppeltjes die zich door de lucht kunnen verplaatsen Amfotroop: in staat om zowel muize- als humane cellen te infecteren Biologisch agens: in zijn wettelijke definitie betekent dit ziekteverwekker (zie welzijnswetgeving) Donorsequentie: het stukje erfelijk materiaal dat uit een bepaald organisme – de donor – wordt overgebracht naar een ander organisme, ook wel insert genaamd. In veel gevallen is echter geen sprake meer van het overbrengen van een sequentie uit een ‘donor’, maar wordt een stuk erfelijk materiaal synthetisch aangemaakt Ecotroop: enkel in staat om muizecellen te infecteren Gastheer: (1) in de context van natuurlijke pathogenen betekent gastheer het organisme dat van nature door de ziekteverwekker wordt geïnfecteerd, (2) in de context van genetische modificatie betekent gastheer het te modificeren organisme: het organisme waarin het nieuwe stukje erfelijk materiaal wordt ondergebracht. HEPA: High Efficiency Particulate Air (filter) Pathogeniteit: ziekteverwekkendheid Reproductief: in staat uit te groeien tot een zelfstandig functionerend organisme Toxiciteit: vergiftiging Transductie: staat in feite gelijk aan virale infectie. Wordt in de praktijk vooral gebruikt om de infectie van bacteriën door fagen en om de infectie van cellen door een virale vector aan te duiden Transformatie: (1) in de context van tumoren betekent transformatie de omvorming van een normale cel naar een oneindig delende tumorcel, (2) transformatie wordt in de genetische modificatie ook als algemene term gebruikt om het proces van genetische modificatie aan te duiden (transformeren is dan gelijk aan genetisch modificeren). Vector: letterlijk betekent dit ‘drager’ (1) in het kader van genetische modificatie is dit het plasmide, cosmide, artificial chromosome of ander genetisch element dat de genetische modificatie – het insert – draagt en binnenbrengt in het te modificeren organisme, (2) in de context van virale infectie van planten duidt het begrip vector het organisme aan dat zorgdraagt voor de overdracht van het virus van de ene naar de andere plant. In sommige gevallen zijn dit bladluizen. Virale vector: een van een wild-type virus afgeleide virale constructie dat een vreemd DNA-fragment kan opnemen of in zich heeft en zich ofwel autonoom kan gedragen, indien hij de sequenties bezit die nodig zijn voor zijn verspreiding van cel tot cel, ofwel defectief, indien hij één of meer sequenties mist voor zijn verspreiding.

46

Verklarende woordenlijst

BIJLAGE 1: INPERKINGSVEREISTEN In deze bijlage zijn de wettelijk vereiste Belgische inperkingseisen gegeven voor laboratoria, proefdierverblijven en serres. De vereisten voor ziekenhuiskamers en grootschalige procesapparatuur zijn niet weergegeven, maar kunnen teruggevonden worden op www.biosafety.be. Ook de vereisten voor zogenoemde quarantaine-organismen zijn niet weergegeven. Wanneer je wilt werken met een pathogeen dat voorkomt op de lijsten van quarantaine-organismen van het FAVV, moet je bij hen navragen welke vereisten gelden om met deze organismen te mogen werken.

Belgische inperkingseisen voor L1-L4 laboratoria voor werk met pathogenen en/of genetisch gewijzigde organismen 1. Inrichting en technische vereisten Maatregelen

Inperkingsniveau L2 L3 niet vereist vereist

2

het laboratorium is gescheiden van andere werkzones in hetzelfde gebouw of is in een afzonderlijk gebouw gelegen toegang tot het laboratorium via sas

L1 niet vereist

niet vereist

niet vereist

3 4 5

Vergrendelbare toegangsdeur(en) zelfsluitende toegangsdeur(en) vaste ramen

niet vereist niet vereist niet vereist

6

luchtdicht lokaal dat decontaminatie niet vereist met een gas mogelijk maakt meubelen zijn dusdanig ontworpen dat niet vereist een controleprogramma voor insecten en knaagdieren vergemakkelijkt wordt kijkvenster of gelijkwaardig systeem dat niet vereist toelaat te zien wie zich in het lokaal bevindt was- en decontaminatievoorzieningen vereist (wasbakken) voor het personeel

1

7

8

9

10 wasbakken met niet-manuele bediening niet vereist 11 kapstokken of kleedkamer voor aanbevolen beschermende kledij 12 toevoerbuizen voor vloeistoffen niet vereist voorzien van een terugvloeibeveiliging 13 oppervlakken bestand tegen zuren, vereist (werktafel) basen, organische oplosmiddelen, waterondoordringbaar en gemakkelijk schoon te maken 14 autonoom electrisch systeem bij panne niet vereist

L4 vereist

vereist, of als alternatief vereist enkel toegang via L2 vereist vereist vereist optioneel vereist vereist niet vereist, maar aanvereist vereist (en onbreekbaar) bevolen om te sluiten tijdens de proefneming niet vereist vereist vereist aanbevolen

vereist

vereist

optioneel

aanbevolen

vereist

vereist (wasbakken)

optioneel vereist

vereist (wasbakken in vereist (wasbakken en het sas of nabij de douche, deze laatste met uitgang) chemische besprenkeling in geval van gebruik van isolerend pak dat onder positieve luchtdruk staat) vereist vereist vereist vereist

niet vereist

aanbevolen

vereist

vereist (werktafel)

vereist (werktafel, vloer)

vereist (werktafel, vloer, muren, zoldering)

niet vereist

aanbevolen

vereist

Inperkingsvereisten

47

Maatregelen 15 brandalarmsysteem (onder voorbehoud van plaatselijke reglementering inzake brand) 16 interfoon, telefoon of elk ander systeem waarmee communicatie buiten de inperkingszone mogelijk is VENTILATIE 17 luchttoevoersysteem gescheiden van de aangrenzende lokalen 18 luchtafvoersysteem gescheiden van de aangrenzende lokalen 19 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem onderling verbonden om accidentele overdruk te vermijden 20 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem afsluitbaar door middel van kleppen 21 onderdruk in de gecontroleerde zone ten opzichte van de druk in de omliggende zones 22 HEPA-filtratie van de lucht1

23 systeem dat toelaat filters te vervangen en daarbij besmetting te vermijden 24 HEPA-gefilterde lucht mag opnieuw in omloop gebracht worden 25 specifieke maatregelen om dusdanig te ventileren dat daardoor de luchtbesmetting tot een minimum herleid wordt 1

2

L1 niet vereist

Inperkingsniveau L2 L3 niet vereist vereist

niet vereist

niet vereist

vereist

vereist (niet manuele bediening)

niet vereist

niet vereist

aanbevolen

vereist

niet vereist

niet vereist

aanbevolen

vereist

niet vereist

niet vereist

vereist

vereist

niet vereist

niet vereist

vereist

vereist

niet vereist

niet vereist

vereist (controle- en alarmsystemen)

vereist (controle- en alarmsystemen)

niet vereist

niet vereist

vereist (bij de afvoer)

-

-

vereist

vereist (bij de toevoer en dubbele filtratie bij de afvoer) vereist

-

-

optioneel

niet toegelaten

optioneel

optioneel

vereist2

vereist

L4 vereist

Bij gebruik van virussen die niet tegengehouden worden door een HEPA-filter zijn speciale maatregelen vereist voor de uit het laboratorium afgevoerde lucht. De kennisgever moet deze maatregelen specificeren in het bioveiligheidsdossier, en de bevoegde instantie moet deze maatregelen in de toelating bepalen.

2. Veiligheidsuitrusting Maatregelen 26 microbiologische veiligheidskast/isolatieruimte

27 autoclaaf 28 doorgeefautoclaaf 29 centrifuge in de ingeperkte zone

30 vacuümgenerator voorzien van een HEPA-filter 3

48

L1 niet vereist

indien autoclaaf, dan op de site niet vereist niet vereist

niet vereist

Inperkingsniveau L2 L3 optioneel (klasse I of II) vereist (klasse I of II)

in het gebouw niet vereist vereist; niet vereist indien lekvrije buizen worden gebruikt niet vereist

L4 vereist (klasse III; indien klasse II, isolerend pak dat onder positieve luchtdruk staat) in het laboratorium of in het laboratorium aangrenzende lokalen3 optioneel vereist vereist vereist

aanbevolen

vereist

In dit geval zijn gevalideerde procedures nodig, die een equivalent niveau van bescherming bieden, voor de veilige overbrenging van materiaal naar een autoclaaf gesitueerd buiten het laboratorium.


3. Werkvoorschriften en beheer van afval Maatregelen

Inperkingsniveau L1

31 beperkte toegang 32 vermelding op de deur: a: biorisicoteken b: coördinaten van de verantwoordelijke c: inperkingsniveau d: aard van het biologisch risico e: lijst van de toegelaten personen f: criteria voor toegang tot de inperkingszone 33 laboratorium met eigen specifieke uitrusting 34 beschermende kleding

35 ontsmetting van kleding vooraleer ze de inperkingszone verlaat 36 handschoenen 37 ademhalingsmasker 38 gelaatsbescherming (ogen/slijmvliezen) 39 fysische inperking van levensvatbare microorganismen (gesloten systeem) 40 vorming van spatten of aërosolvorming 41 specifieke maatregelen (inclusief uitrusting) om vorming van spatten of verspreiding van aërosols tegen te gaan 42 mechanische pipettering 43 drinken, eten, roken, gebruik van cosmetica, manipulatie van contactlenzen en opslag van voedsel voor menselijke consumptie is verboden 44 beschikken over geschikte registers 45 toezicht op controlemaatregelen en veiligheidsuitrusting 46 nota voor gebruiksaanwijzing van doeltreffende ontsmettingsmiddelen 47 ontsmettingsmiddelen in de hevels 48 opleiding van het personeel 49 schriftelijke instructies inzake procedures met betrekking tot bioveiligheid 50 doeltreffende controle van vectoren (bv. om de aanwezigheid van insecten of knaagdieren op te sporen) 51 rondlopen van dieren 52 in geval van manipulatie van zoöpathogenen, periode waarbinnen elk contact van het personeel met het(de) gastheerdier(en) moet worden vermeden AFVAL EN/OF BIOLOGISCHE RESIDU’S 53 gevalideerde inactivering van biologisch afval en/of biologische residu’s volgens een geschikte methode vóór verwijdering 54 gevalideerde inactivering van besmet materiaal (glaswerk, enz.) volgens een geschikte methode vóór het schoonmaken, hergebruiken of vernietigen 55 gevalideerde inactivering van de effluenten van de wasbakken en douches volgens een geschikte methode vóór eindafvoer 4

L2

L3

L4

aanbevolen aanbevolen (b, c)

vereist vereist(a, b, c)

vereist (en controle) vereist (a, b, c, d, e, f)

vereist (en controle) vereist (a, b, c, d, e, f)

niet vereist vereist


niet vereist

niet vereist

niet vereist niet vereist niet vereist aanbevolen

optioneel niet vereist optioneel vereist

vereist optioneel vereist vereist

vereist vereist vereist vereist

minimaliseren niet vereist

minimaliseren aanbevolen

beletten vereist

beletten vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

niet vereist vereist vereist


aanbevolen vereist vereist

vereist vereist vereist

niet vereist

aanbevolen

vereist

vereist

verboden niet vereist

verboden niet vereist

verboden 4 aanbevolen

verboden 4 vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

niet vereist

niet vereist

optioneel

vereist

vereist vereist vereist (en specifiek voor vereist (en specifiek voor de inperkingszone) + de inperkingszone) optioneel geschikt schoeisel volledige omkleding inclusief schoeisel bij binnen- en buiten gaan aanbevolen vereist

De bevoegde instantie bepaalt de periode in de toelating. Inperkingsvereisten

49

Belgische inperkingseisen voor A1-A4 proefdierverblijven 1. Inrichting en technische vereisten Maatregelen 1

Inperkingsniveau A1

A2

A3

A4

niet vereist

vereist

vereist

vereist

niet vereist

aanbevolen

vereist

vereist niet vereist niet vereist

vereist vereist niet vereist, maar aanbevolen om te sluiten tijdens de proefneming optioneel


vereist (met drie compartimenten) vereist vereist vereist (en onbreekbaar)

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

aanbevolen

vereist

vereist

2

het animalarium is gescheiden van de andere werkzones in hetzelfde gebouw of is in een afzonderlijk gebouw gelegen toegang via sas

3 4 5

vergrendelbare toegangsdeur(en) zelfsluitende toegangsdeur(en) vaste ramen

6

luchtdicht lokaal dat decontaminatie met niet vereist een gas mogelijk maakt gebouw dusdanig ontworpen dat aanbevolen accidentele ontsnapping van dieren vermeden wordt kijkvenster of gelijkwaardig systeem dat toeaanbevolen laat te zien wie zich in het lokaal bevindt was- en decontaminatie-voorzieningen vereist (wasbakken) voor het personeel

7

8 9

vereist (wasbakken)

vereist (wasbakken vereist (wasbakken en nabij de uitgang of in douche, deze laatste het sas, een douche met chemische besproeiing is aanbevolen) in geval een isolerend pak dat onder positieve luchtdruk staat) vereist vereist vereist vereist

10 wasbakken met niet-manuele bediening niet vereist aanbevolen 11 kapstokken of kleedkamer voor vereist vereist beschermende kleding 12 toevoerbuizen voor vloeistoffen voorzien niet vereist niet vereist aanbevolen vereist van een terugvloeibeveiliging 13 afzonderlijke ruimte voor opslaan van aanbevolen vereist vereist vereist propere kooien, voeder en strooisel 14 oppervlakken waterondoordringbaar, vereist (kooien, vereist (kooien, vereist (kooien, vereist (kooien, gemakkelijk schoon te maken en bestand werkoppervlakken) werkoppervlakken en vloer) werkoppervlakken, vloer werkoppervlakken, vloer tegen ontsmettingsmiddelen muren, zoldering) muren, zoldering) 15 wasplaats voor kooien vereist vereist vereist vereist 16 autonoom elektrisch systeem bij panne niet vereist niet vereist aanbevolen vereist 17 brandalarmsysteem (onder voorbehoud van niet vereist niet vereist vereist vereist plaatselijke reglementering inzake brand) 18 interfoon, telefoon of elk ander systeem niet vereist niet vereist vereist vereist (niet-manuele waarmee communicatie buiten de bediening) inperkingszone mogelijk is VENTILATIE 19 luchttoevoersysteem gescheiden van niet vereist niet vereist aanbevolen vereist de aangrenzende lokalen 20 luchtafvoersysteem gescheiden van de niet vereist optioneel aanbevolen vereist aangrenzende lokalen 21 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem niet vereist optioneel vereist vereist onderling verbonden om accidentele overdruk te vermijden 22 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem niet vereist optioneel vereist vereist afsluitbaar door middel van kleppen 23 onderdruk in de gecontroleerde zone niet vereist optioneel vereist (controle en vereist (controle en alarmsystemen) alarmsystemen) ten opzichte van de druk in de omliggende zones

50


Maatregelen

Inperkingsniveau A1 5

24 HEPA-filtratie van de lucht

25 systeem dat toelaat filters te vervangen en daarbij besmetting te vermijden 26 HEPA-gefilterde lucht mag opnieuw in omloop gebracht worden 27 specifieke maatregelen om dusdanig te ventileren dat daardoor de luchtbesmetting tot een minimum herleid wordt 5

6

A2

A3

A4

niet vereist

optioneel

vereist (bij de afvoer)

-

-

vereist

vereist (bij de toevoer en dubbele filtratie bij de afvoer) vereist

-

-

optioneel

verboden

optioneel

optioneel

vereist6

vereist6

Bij gebruik van virussen die niet weerhouden worden door een HEPA-filter zijn speciale maatregelen vereist voor de uit het laboratorium afgevoerde lucht De kennisgever moet deze maatregelen speciferen in het bioveiligheidsdossier, en de overheid bepaalt deze maatregelen in de toelating.

2. Veiligheidsuitrusting Maatregelen

Inperkingsniveau A1

7

A2

A3

28 Microbiologische veiligheidskast

niet vereist

optioneel (klasse I of II) optioneel (klasse I of II)

29 dieren ondergebracht in kooien of in een gelijkwaardige geschikte inperking (omheinde ruimte, aquarium, enz) 30 isolatoren voorzien van HEPA-filtratie 31 autoclaaf

optioneel

optioneel

optioneel

niet vereist op de site

optioneel in het gebouw

32 doorgeefautoclaaf 33 fumigatiesysteem of ontsmettingsbad

niet vereist niet vereist

niet vereist aanbevolen

vereist in het animalarium of aangrenzende lokalen7 aanbevolen vereist

A4 optioneel (klasse III of klasse II met isolerend pak dat onder positieve luchtdruk staat) optioneel

vereist in het animalarium vereist vereist

In dit geval zijn gevalideerde procedures nodig, die een equivalent niveau van bescherming bieden, voor de veilige overbrenging van materiaal naar een autoclaaf gesitueerd buiten het animalarium.

Inperkingsvereisten

51

3. Werkvoorschriften en afvalbeheer Maatregelen

52

Inperkingsniveau A1

A2

A3

A4

34 beperkte toegang 35 vermelding op de deur: biorisicoteken, inperkingsniveau, aard van het biologisch risico, coördinaten van de verantwoordelijke, lijst van de toegelaten personen, criteria voor toegang tot de inperkingszone 36 animalarium met eigen specifieke uitrusting 37 beschermende kleding, specifiek voor de inperkingszone

vereist vereist, behalve biorisicoteken

vereist vereist

vereist (en controle) vereist

vereist (en controle) vereist


aanbevolen vereist

vereist vereist + optioneel geschikt schoeisel

38 ontsmetting van kleding vooraleer de inperkingszone te verlaten 39 handschoenen 40 ademhalingsmasker 41 gelaatsbescherming (ogen/slijmvliezen) 42 vorming van spatten en aërosols 43 specifieke maatregelen (inclusief uitrusting) om vorming van spatten en verspreiding van aërosols te controleren 44 mechanische pipettering 45 verboden te drinken, te eten en te roken, cosmetica te gebruiken, contactlenzen te manipuleren, of etenswaren bestemd voor menselijke consumptie op te slaan 46 register(s) waarop alle handelingen vermeld worden (binnenbrengen en buitenbrengen van proefdieren, inoculatie van GGM’s enz.) 47 nazicht van controlemaatregelen en veiligheidsuitrusting 48 nota met gebruiksaanwijzing voor doeltreffende ontsmettingsmiddelen 49 ontsmettingsmiddelen in de hevels 50 opleiding van het personeel 51 schriftelijke instructies van procedures voor bioveiligheid 52 doeltreffende controle van vectoren (bv. voor detectie van de aanwezigheid van insecten en knaagdieren) 53 isolatie van proefdieren gebruikt bij de proefneming 54 in geval van manipulatie van zoöpathogenen, periode waarbinnen elk contact van het personeel met het(de) gastheerdier(en) vermeden moet worden AFVAL EN/OF BIOLOGISCHE RESIDU’S 55 gevalideerde inactivering van biologisch afval en/of biologische residu’s (besmette kadavers, uitwerpselen*, strooisel*,...) volgens een geschikte methode vóór verwijdering 56 gevalideerde inactivering van besmet materiaal* (glaswaren, kooien, enz...) volgens een geschikte methode voor het schoonmaken, hergebruiken of vernietigen 57 gevalideerde inactivering van effluenten van wasbakken en douches volgens een geschikte methode vóór eindafvoer

niet vereist

niet vereist

vereist

vereist vereist volledige omkleding bij binnen- en buitengaan, inclusief schoeisel vereist

optioneel niet vereist niet vereist minimaliseren niet vereist

aanbevolen optioneel optioneel minimaliseren aanbevolen

vereist optioneel optioneel vermijden vereist

vereist vereist vereist vermijden vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist


aanbevolen vereist vereist



aanbevolen

vereist

vereist

vereist

vereist niet vereist

vereist (afzonderlijk lokaal) niet vereist

vereist (afzonderlijk lokaal) aanbevolen8

vereist (afzonderlijk lokaal) vereist8

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

vereist

niet vereist

niet vereist

aanbevolen

vereist


8 *

De bevoegde instantie bepaalt de periode in de toelating faeces van transgene dieren hoeven niet te worden geinactiveerd.

Belgische vereisten voor G1-G3 kweekcellen en serres G4-vereisten zijn in de Belgische wetgeving niet gedefinieerd.

1. Inrichting en technische vereisten Maatregelen 1 2

3 4

de serre is een permanente constructie9 kanten van de serre: zone in beton of van plantengroei gezuiverd over een breedte van 1,5m rondom de kas beveiligde omheining gangpaden

5

toegang via een afzonderlijke ruimte waarvan de twee deuren een gekoppelde vergrendeling hebben 6 vergrendelbare toegangsdeur(en) 7 constructie10 bestand tegen schokken 8 constructie9 waterbestendig en gemakkelijk schoon te maken 9 vaste ramen 10 hermetische constructie9 die decontaminatie met een gas mogelijk maakt 11 decontaminatie-voorzieningen voor het personeel

12 wasbakken met niet-manuele bediening 13 toevoerbuizen voor vloeistoffen voorzien van een terugvloeibeveiliging 14 oppervlakken bestand tegen zuren of basen, organische oplosmiddelen en ontsmettingsmiddelen 15 waterondoordringbare vloer 16 maatregelen met betrekking tot de afvloeiing van verontreinigd water 17 autonoom elektrisch systeem bij panne 18 brandalarmsysteem (onder voorbehoud van plaatselijke reglementering inzake brand) 19 interfoon, telefoon of elk ander systeem waarmee communicatie buiten de inperkingszone mogelijk is VENTILATIE 20 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem onderling verbonden om accidentele overdruk te vermijden 21 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem afsluitbaar door middel van kleppen 22 onderdruk in de gecontroleerde zone ten opzichte van de druk in de omliggende zones 23 HEPA-filtratie van de lucht12 24 systeem dat toelaat filters te vervangen en daarbij besmetting te vermijden 9

10 11 12

Inperkingsniveau G1 niet vereist niet vereist

G2 vereist vereist

G3 vereist vereist

niet vereist gestabiliseerde grond niet vereist

niet vereist hard materiaal

vereist hard materiaal

optioneel

vereist

niet vereist niet vereist niet vereist

vereist aanbevolen aanbevolen

vereist aanbevolen vereist



vereist vereist

vereist (wasbakken)

vereist (wasbakken)



vereist (wasbakken in de luchtsluis of nabij de uitgang), douche in voorkomend geval) vereist aanbevolen

niet vereist

aanbevolen

vereist

niet vereist optioneel

aanbevolen afvloeiing beperken11

vereist afvloeiing beletten


niet vereist optioneel

vereist vereist

niet vereist

optioneel

vereist

niet vereist

optioneel

vereist

niet vereist

optioneel

vereist

niet vereist

niet vereist

optioneel

niet vereist -

niet vereist -

vereist (bij de toe- en afvoer) vereist

De serre moet een duurzame constructie zijn met een naadloze waterdichte bekleding, gelegen op een plek waarvan het talud van die aard is dat de instroming van oppervlaktewater wordt voorkomen en voorzien van zelfsluitende, vergrendelbare deuren. Onder constructie worden de wanden, het dak en de vloer verstaan. Als transmissie via de grond mogelijk is. In geval van gebruik van virussen die niet weerhouden worden door een HEPA-filter zijn speciale maatregelen van toepassing op de uit het laboratorium afgevoerde lucht.

Inperkingsvereisten

53

2. Veiligheidsuitrusting Maatregelen 25 autoclaaf 26 doorgeefautoclaaf 27 fumigatiekamer of immersietank voor transfer van levend materiaal

Inperkingsniveau G1 op de site niet vereist niet vereist

G2 in het gebouw niet vereist niet vereist

G3 in de serre optioneel optioneel

3. Werkvoorschriften en beheer van afval Maatregelen 28 29 30 31

beperkte toegang signalisatie van het biologisch risico specifieke uitrusting beschermende kleding

32 ontsmetting van de kleding vooraleer de inperkingszone te verlaten 33 handschoenen 34 overschoenen of ontsmettingsbad voor schoenen 35 vorming van spatten en aërosols 36 specifieke maatregelen (inclusief uitrusting) om vorming van spatten te beperken en verspreiding van aërosols tegen te gaan 37 mechanische pipettering 38 verboden te drinken, te eten en te roken, cosmetica te gebruiken, contactlenzen te manipuleren, of etenswaren bestemd voor menselijke consumptie op te slaan 39 register(s) waarop alle handelingen vermeld worden (binnenbrengen en buitenbrengen van planten, inoculatie van GGM’s enz.) 40 nazicht van controlemaatregelen en veiligheidsuitrusting 41 nota met gebruiksaanwijzing voor doeltreffende ontsmettingsmiddelen 42 opleiding van het personeel 43 schriftelijke instructies van procedures voor bioveiligheid 44 rondlopen van dieren 45 maatregelen ter bestrijding van ongewenste organismen zoals insecten en andere arthropoden, knaagdieren, … 46 zichzelf verspreidende organismen: - transport binnen de inrichting tussen de inperkingszones - vermelding op het register - decontaminatie van containers voor transport 47 maatregelen met betrekking tot afvloeiing van besmet water AFVAL EN/OF BIOLOGISCHE RESIDU’S 48 gevalideerde inactivering van biologisch afval en/of biologische residu’s (besmette planten, besmette substraten, …) volgens een geschikte methode vóór verwijdering 14

54

Als transmissie via de grond mogelijk is.


Inperkingsniveau G1 vereist niet vereist niet vereist vereist

G2 vereist vereist niet vereist vereist

niet vereist

niet vereist

G3 vereist (en controle) vereist vereist vereist (en specifiek voor de inperkingszone) vereist

niet vereist niet vereist minimaliseren niet vereist

optioneel optioneel minimaliseren aanbevolen

optioneel optioneel beletten vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist

vereist

vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist vereist

vereist vereist verboden vereist



container, optioneel

container

dubbele container

niet vereist niet vereist optioneel

aanbevolen vereist afvloeiing minimaliseren14

vereist vereist afvloeiing beletten

vereist

vereist

vereist

Maatregelen 49 gevalideerde inactivering van besmet materiaal (glaswerk enz.) volgens een geschikte methode vóór reiniging, hergebruik en/of vernietiging 50 inactivering van de effluenten van wasbakken en douches volgens een geschikte methode vóór eindafvoer

Inperkingsniveau G1 vereist

G2 vereist

G3 vereist

niet vereist

niet vereist

optioneel

Inperkingsvereisten

55

BIJLAGE 2: VIB RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN MET GGO’S Situering Deze richtlijnen hebben tot doel hulp te bieden bij de vaststelling van de benodigde inperkingsniveaus bij activiteiten met genetisch gemodificeerde organismen. In deze bijlage wordt onderscheid gemaakt tussen activiteiten met micro-organismen en cellen (hst. A), activiteiten met planten (hst. B) en activiteiten met dieren (hst. C). De transformatie van planten met behulp van Agrobacterium stammen wordt ingeschaald als een activiteit met het micro-organisme.

Gebruik van deze richtlijnen Deze richtlijnen bieden met name hulp bij de inschatting van de benodigde inperkingsmaatregelen voor activiteiten met micro-organismen en cellen (hst A van deze richtlijnen). In dit hoofdstuk A staat een beschrijving hoe de inschalingsschema’s te gebruiken. Daarnaast zijn de benodigde definities van toxines en de eisen aan gastheren en vectoren voor risicoklasse 1 weergegeven. Indien het gaat om activiteiten met transgene planten, dan geeft hst. B een leidraad. Activiteiten met transgene dieren en vooral activiteiten waarin het gebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen of cellen gecombineerd wordt met dieren zijn niet eenvoudig in te schalen. Hst C geeft hierin een leidraad. Er zijn natuurlijk gevallen waarin deze richtlijnen niet voorzien. In een dergelijk geval is het voor advies raadzaam contact op te nemen met de bioveiligheidsexperten intern en extern zoals weergegeven in bijlage 5 van dit boekje.

Bronnen De richtlijnen zijn afgeleid van de Richtlijnen van de Nederlandse Commissie Genetische Modificatie (COGEM) voor zover die toepasbaar zijn in België. Daarnaast is gebruik gemaakt van de inschalingsvoorschriften zoals deze zijn opgenomen in de bijlagen bij hoofdstuk 5.51 van Vlarem II.

HST A. RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN MET GENETISCH GEMODIFICEERDE MICRO-ORGANISMEN EN CELLEN Inschalingsregels Op de volgende pagina’s zijn schema’s weergegeven waarin een eerste identificatie van het inperkingsniveau kan worden afgeleid. Zoals aangegeven in hoofdstuk 3 en in het voorbeeld in hoofdstuk 7, dient daarna nog gekomen te worden tot een finale vaststelling van de benodigde maatregelen waarbij rekening gehouden wordt met (1) de eigenschappen van het milieu dat aan het GGO zou kunnen worden blootgesteld, (2) het type en de schaal van de activiteit, en (3) eventuele niet-standaard handelingen. Het inschalingsschema is in vier stukken verdeeld: • Deel A1: Activiteiten met gastheer/vectorsystemen die al dan niet voldoen aan risicoklasse 1 en activiteiten met niet virale pathogene gastheren.

56


• Deel A2: Activiteiten met animale cellen zonder virale vectoren en activiteiten met baculovirussen. • Deel A3: Activiteiten met animale cellen in combinatie met virussen of virale vectoren. • Deel A4: Activiteiten met plantencellen. De schema’s werken als volgt: Eerst worden de vier deelschema’s in de ‘eerste richting’ langsgelopen en wordt bepaald welk type van gastheer en vector van toepassing is. In tweede instantie wordt in de ‘tweede richting’ bepaald of het gaat om activiteiten met ongekarakteriseerd of gekarakteriseerd genetisch materiaal. In derde instantie wordt dan binnen de van toepassing zijnde categorie (gekarakteriseerd of ongekarakteriseerd) bepaald welk type van insertie van toepassing is. In het geval van ongekarakteriseerd genetisch materiaal is het een keuze tussen een van de categorieën a t/m e, in het geval van gekarakteriseerd genetisch materiaal is het een keuze tussen de categorieën f t/m j. Uit de combinatie van de van toepassing zijnde categorie van gastheer/vector en van toepassing zijnde categorie van insert kan dan de inschaling worden afgelezen.

Definitie van klassen van toxines a. Een toxine van klasse T-3 is een toxine met een LD50 voor vertebraten van minder dan 100 nanogram per kg lichaamsgewicht; b. Een toxine van klasse T-2 is een toxine met een LD50 voor vertebraten van 100 nanogram tot 1 microgram per kg lichaamsgewicht; c. Een toxine van klasse T-1 is een toxine met een LD50 voor vertebraten van 1 tot 100 microgram per kg lichaamsgewicht;

Eisen aan gastheer/vector systemen voor indeling in risicoklasse I Eisen voor kleinschalige laboratoriumhandelingen (kleinschalig is <100 liter effectief kweekvolume) 1. De gastheer is niet pathogeen. 2. De gastheer is vrij van gekende biologische agentia die potentieel schadelijk zijn. 3. De vector is goed gekarakteriseerd, dit wil zeggen: het type vector moet gedefinieerd zijn (plasmide, cosmide, minichromosoom, etc.), grootte moet gekend zijn, functie en herkomst van structurele genen en merkergenen moet gekend zijn, evenals restrictiesites, en replicon. Commercieel verkrijgbare vectoren zijn in het algemeen goed gekarakteriseerd. 4. De vector mag geen schadelijke gevolgen hebben (geen virulentie- en toxinebepalende elementen overbrengen). 5. De omvang van de vector is zoveel mogelijk beperkt tot die elementen die noodzakelijk zijn. 6. De vector mag de stabiliteit van het GGO in het milieu niet doen toenemen. 7. De vector moet moeilijk te mobiliseren zijn (Tra-). 8. De vector mag geen resistentiemerkers overdragen naar micro-organismen die deze niet van nature opnemen, indien dergelijke opname het gebruik van geneesmiddelen ter bestrijding van ziekteverwekkers in gevaar brengt.

Risicogroepen (biologische riscioklassen) Met organismen van risicogroep 4, 3 en 2 wordt bedoeld organismen die respectievelijk ingedeeld zijn in de pathogeniteitsklassen 4, 3 en 2 als weergegeven in bijlage 5.51 van Vlarem II.

VIB Richtlijnen voor inschaling van activiteiten met GGO’s

57

Activiteiten waarbij gekarakteriseerd genetisch materiaal is toegevoegd

Activiteiten waarbij ongekarakteriseerd genetisch materiaal is toegevoegd

a. De donor produceert een toxine van respectievelijk klasse

1

58

T3 T2 T1 b. De donor is een voor eukaryote cellen Risicogroep 4 infectieus virus van respectievelijk Risicogroep 3 Risicogroep 2 c. De donor is een defect voor eukaryote Risicogroep 4 cellen infectieus virus van Risicogroep 3 respectievelijk: Risicogroep 2 d. De donor is een niet-viraal pathogeen Risicogroep 4 van respectievelijk Risicogroep 3 Risicogroep 2 e. De donor is een organisme van risicogroep 1, of een plant of een dier

3. Activiteiten in pathogene gastheren, virale pathogenen uitgezonderd. De gastheer is een pathogeen van respectievelijk risicogroep 4, 3, 2

2. Activiteiten in een gastheer/vectorsysteem dat niet voldoet aan de criteria voor indeling in risicoklasse 1

eerste richting

1. Activiteiten in een gastheer/vectorsysteem die voldoen aan de criteria voor indeling in risicoklasse 1

tweede richting

A1: Activiteiten met gastheer/vectorsystemen die al dan niet voldoen aan risicoklasse 1 en activiteiten met niet-virale pathogene gastheren

L4 L3 L2 L3 L2 L1 L2 L1 L1 L3 L2 L1 L1

L4 L4 L3 L4 L3 L2 L2 L2 L2 L3 L2 L2 L2

Resp: L4, L4, L4: Resp : L4, L4, L4 Resp: L4, L3, L3 Resp: L4, L4, L4 Resp: L4, L3, L3 Resp: L4, L3, L2 Resp: L4, L3, L3 Resp: L4, L3. L2 Resp: L4, L3, L2 Resp: L4, L4, L4 Resp: L4, L3, L3 Resp: L4, L3, L2 Resp: L4, L3, L2

L4 L4 L3 L4 L3 L2

Resp: L4, L4, L4 Resp: L4, L4, L4 Resp: L4, L3, L3 Resp: L4, L4, L4 Resp: L4, L3, L3 Resp: L4, L3, L2

L2 L2 L2

Resp: L4, L3, L3 Resp: L4, L3, L2 Resp: L4, L3, L2

L2 of L3

Resp: L4, L3, L2

L2

Resp: L4, L3, L2

f. De sequentie bevat genetische inforT3 L4 matie die codeert voor een toxine van T2 L3 respectievelijk klasse T1 L2 g. De sequentie bevat genetische infor- Risicogroep 4 L3 matie voor de vorming van een voor Risicogroep 3 L2 eukaryotische cellen infectieus virus, Risicogroep 2 L1 van respectievelijk: h. De sequentie bevat genetische infor- Risicogroep 4 L2 matie voor de vorming van een defect, Risicogroep 3 L1 voor eukaryotische cellen infectieus Risicogroep 2 L1 virus, van respectievelijk: i. De sequentie bevat genetische informatie L1 of L2 die codeert voor een schadelijk genproduct, anders dan in f1. j. De sequentie bevat geen genetische informatie L1 die codeert voor een schadelijk genproduct.

De vraag wat een schadelijk genproduct is, is een van de moeilijkste vragen voor de inschaling. Virulentiegenen kunnen een voorbeeld zijn van een schadelijk genproduct. De uiteindelijke indeling hangt af van het vermoede effect van het genproduct in het gebruikte gastheerorganisme.





6. De virale vector is, of is afgeleid van, een biologisch nietingeperkt baculovirus dat door de vervaardiging evenmin wordt ingeperkt

5. De virale vector is, of is afgeleid van, een baculo-virus dat biologisch ingeperkt is of dat door de vervaardiging ingeperkt wordt

eerste richting

4. Activiteiten in animale cellen waarbij geen virale vector wordt gebruikt

tweede richting

A2: Activiteiten met animale cellen zonder virale vectoren en met baculovirussen

T3 T2 T1 b. De donor is, of is afgeleid van, een voor Risicogroep 4 eukaryote cellen infectieus virus van Risicogroep 3 respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en Risicogroep 2 aanwezigheid van het genetisch materiaal van de donor in de gastheer kan leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes c. De donor is, of is afgeleid van, een defect Risicogroep 4 voor eukaryote cellen infectieus virus van Risicogroep 3 respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en Risicogroep 2 aanwezigheid van het genetisch materiaal van de donor in de gastheer kan niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes d. De donor is een niet-viraal pathogeen Risicogroep 4 van respectievelijk Risicogroep 3 Risicogroep 2 e. De donor is een organisme van biologische risicoklasse 1, of een plant of een dier

L1 L1 L1 L4 L3 L2

L2 L1 L1 L4 L3 L2

L3 L2 L2 L4 L3 L2

L3 L2 L1

L2 L2 L1

L3 L2 L2

L3 L2 L1 L1

L2 L2 L1 L1

L3 L2 L2 L2

f. De sequentie bevat genetische informatie T3 die codeert voor een toxine van T2 respectievelijk klasse T1 g. De sequentie bevat genetische informatie Risicogroep 4 voor de vorming van een voor Risicogroep 3 eukaryotische cellen infectieus virus, van Risicogroep 2 respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2 en aanwezigheid van het genetisch materiaal van de donor in de gastheer kan leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes h. De sequentie bevat genetische informatie Risicogroep 4 voor de vorming van een defect, voor Risicogroep 3 eukaryotische cellen infectieus virus, van Risicogroep 2 respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en aanwezigheid van het genetisch materiaal van de donor in de gastheer kan niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes: i. De sequentie bevat genetische informatie die codeert voor een schadelijk genproduct, anders dan in f. j. De sequentie bevat geen genetische informatie die codeert voor een schadelijk genproduct

L1 L1 L1 L4 L3 L2

L2 L1 L1 L4 L3 L2

L3 L2 L2 L4 L3 L2

L3 L2 L1

L2 L2 L1

L3 L2 L2

L1

L1

L2

L1

L1

L2


59

8. De virale vector is een mensof dierpathogeen autonoom replicerend infectieus virus van respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2 of een daarvan afgeleid defect virus en de mogelijkheid dat autonoom replicerende virusdeeltjes gevormd worden bestaat

9. De virale vector is, of is afgeleid van, een satelliet-virus, of is een defect virus afgeleid van een mensof dierpathogeen van respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2 ; de mogelijkheid dat autonoom replicerende virusdeeltjes gevormd worden bestaat niet

Activiteiten waarbij ongekarakteriseerd genetisch materiaal is toegevoegd Activiteiten waarbij gekarakteriseerd genetisch materiaal is toegevoegd

L2 L2 L2 L4 L3 L2

Resp. L4, L4, L4 Resp. L4, L4, L3 Resp. L4, L4, L3 Resp. L4, L4, L4 Resp. L4, L3, L3 Resp. L4, L3, L2


Risicogroep 4 Risicogroep 3 Risicogroep 2

L3 L2 L1

Resp. L4, L3, L3 Resp. L4, L3, L2 Resp. L4, L3, L2



L3 L2 L1 L1

Resp. L4, L3, L3 Resp. L4, L3, L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L4, L3, L2

Resp. L3, L3, L3 Resp. L3, L2, L2 Resp. L3, L2, L1 Resp. L3, L2, L1

T3 T2 T1 Risicogroep 4 Risicogroep 3 Risicogroep 2

L2 L2 L2 L4 L3 L2




L3 L2 L1



L2

Resp. L4, L3, L2

Resp. L3, L2, L2

L1

Resp. L4, L3, L2

Resp. L3, L2, L1

eerste richting


60


7. De virale vector is een compleet of defect ecotroop muizenretrovirus

tweede richting

A3: Activiteiten met animale cellen in combinatie met virussen of virale vectoren

b. De donor is, of is afgeleid van, een voor eukaryote cellen infectieus virus van respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en aanwezigheid van het genetisch materiaal van de donor in de gastheer kan leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes c. De donor is, of is afgeleid van, een defect voor eukaryote cellen infectieus virus van respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en aanwezigheid van het genetisch materiaal van de donor in de gastheer kan niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes d. De donor is een niet-viraal pathogeen van respectievelijk e. De donor is een organisme van biologische risicoklasse 1, of een plant of een dier f. De sequentie bevat genetische informatie die codeert voor een toxine van respectievelijk klasse g. De sequentie bevat genetische informatie voor de vorming van een voor eukaryotische cellen infectieus virus, van respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2 en aanwezigheid van het genetisch materiaal van de donor in de gastheer kan leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes h. De sequentie bevat genetische informatie voor de vorming van een defect, voor eukaryotische cellen infectieus virus, van respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en aanwezigheid van het genetisch materiaal van de donor in de gastheer kan niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes: i. De sequentie bevat genetische informatie die codeert voor een schadelijk genproduct, anders dan in f. j. De sequentie bevat geen genetische informatie die codeert voor een schadelijk genproduct



11. De virale vector is, of is afgeleid van, een plantenvirus en is niet biologisch ingeperkt

eerste richting



10. De virale vector is, of is afgeleid van, een plantenvirus en is biologisch ingeperkt.

tweede richting

A4: Activiteiten in plantencellen


L2 L1 L1 L4 L3 L2

L3 L2 L2 L4 L3 L2


L1 L1 L1

L2 L2 L2


L1 L1 L1 L1

L2 L2 L2 L2

f. De sequentie bevat genetische informatie die T3 codeert voor een toxine van respectievelijk T2 klasse T1 g. De sequentie bevat genetische informatie Risicogroep 4 voor de vorming van een voor eukaryotische Risicogroep 3 cellen infectieus virus, van respectievelijk Risicogroep 2 risicogroep 4, 3 of 2 en aanwezigheid van het genetisch materiaal van de donor in de gastheer kan leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes

L2 L1 L1 L4 L3 L2

L3 L2 L2 L4 L3 L2

h. De sequentie bevat genetische informatie Risicogroep 4 voor de vorming van een defect, voor Risicogroep 3 eukaryotische cellen infectieus virus, van Risicogroep 2 respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en aanwezigheid van het genetisch materiaal van de donor in de gastheer kan niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes: i. De sequentie bevat genetische informatie die codeert voor een schadelijk genproduct, anders dan in f. j. De sequentie bevat geen genetische informatie die codeert voor een schadelijk genproduct

L1 L1 L1

L2 L2 L2

L1

L2

L1

L2

b. De donor is, of is afgeleid van, een voor eukaryote cellen infectieus virus van respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en aanwezigheid van het genetisch materiaal van de donor in de gastheer kan leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes c. De donor is, of is afgeleid van, een defect voor eukaryote cellen infectieus virus van respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en aanwezigheid van het genetisch materiaal van de donor in de gastheer kan niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes d. De donor is een niet-viraal pathogeen van respectievelijk e. De donor is een organisme van risicogroep 1, of een plant of een dier


61

HST B.

RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN IN SERRES MET PLANTEN DIE TRANSGEEN ZIJN OF GENETISCH GEMODIFICEERDE MICRO-ORGANISMEN DRAGEN

Niveau G1: • De steriele of gesteriliseerde planten. • De strikt autogame planten (zelfbevruchters). • De planten die niet in staat zijn om in het ecosysteem te overleven (zoals banaan). • De planten die in het ecosysteem geen interfertiele soorten hebben (zoals banaan). • De planten die door een virus van biologische risicoklasse 2, door een genetisch gemodificeerd virus van biologische risicoklasse 1 of 2 of door een virale vector van biologische risicoklasse 1 of 2 zijn geïnfecteerd, of die een viraal genoom van biologische risicoklasse 1 of 2 vertonen. • De planten die drager zijn van een zichzelf niet verspreidend fytopathogeen van biologische risicoklasse 1 of 2. Niveau G2: • De allogame (kruisbevruchters) of autogame (zelfbevruchters), anemofiele (windbestuivers) of entomofiele (insectenbestuivers) planten. • De planten waarvan de volledige ontwikkelingscyclus enkel kan plaatsvinden in het ecosysteem en waarvan de zaden een lange overlevingsduur hebben (naargelang het geval en de verworven ervaring). • De planten die door een virus van biologische risicoklasse 3, door een virale vector van biologische risicoklasse 3 zijn geïnfecteerd of die een viraal genoom van biologische risicoklasse 3 vertonen. • De planten die drager zijn van een zichzelf verspreidend fytopathogeen of van een GGO van biologische risicoklasse 2 of van een fytopathogeen of van een GGO van biologische risicoklasse 3. Niveau G3: • De planten die gelijkaardige eigenschappen hebben als degene die beschreven zijn in niveau 2 en die, hetzij een gevaarlijk vreemd gen (dat bijvoorbeeld voor een toxine codeert), hetzij een virus van biologische risicoklasse 4, hetzij een viraal genoom van biologische risicoklasse 4 hebben gekregen. • De planten die onderworpen zijn aan eerste proeven van overdracht van genen, die afkomstig zijn van een voor de mens of het milieu gevaarlijk pathogeen organisme en waarvan de risico’s niet bekend zijn. • De planten die drager zijn van een fytopathogeen of van een GGO van biologische risicoklasse 4. Niveau G4: • De planten die een virus van biologische risicoklasse 4 hebben gekregen, dat een bijzonder hoog gevaar vertegenwoordigt voor het milieu (of waarvoor een nultolerantie vereist is) of een gen bevat dat verantwoordelijk is voor de synthese van voor de mens of het dier bijzonder gevaarlijke stoffen. • De planten die drager zijn van een fytopathogeen of een GGO van biologische risicoklasse 4, dat een bijzonder groot gevaar vertegenwoordigt voor het milieu (of waarvoor een nultolerantie vereist is). • De planten die vreemde genen bevatten, afkomstig van een voor de mens, het dier of het milieu bijzonder gevaarlijk pathogeen organisme en waarvan de risico’s niet bekend zijn.

62


HST C.

RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN IN DIERVERBLIJVEN MET DIEREN DIE TRANSGEEN ZIJN OF GENETISCH GEMODIFICEERDE MICRO-ORGANISMEN OF CELLEN DRAGEN

Niveau A1: • de zichzelf niet verspreidende dieren (varkens, schapen, runderen) die een vreemd DNA-fragment in hun genoom hebben opgenomen zonder de hulp van een virale vector; • de zichzelf niet verspreidende dieren die drager zijn van GGO’s van risicoklasse 1. Niveau A2: • de zichzelf verspreidende dieren (kleine knaagdieren, konijnen, insecten, vissen) die een vreemd DNAfragment hebben opgenomen, zonder de hulp van een virale vector; • de zichzelf verspreidende dieren die drager zijn van een GGO van risicoklasse 1 of 2. Opmerkingen De inschaling van activiteiten met dieren die genetisch gemodificeerde micro-organismen (GGM’s) of cellen dragen is gecompliceerder dan de inschaling van genetisch gemodificeerde micro-organismen op zich. Dit komt omdat bij activiteiten in dierverblijven niet alleen de risicoklasse van het GGM van belang is, ook de specifieke combinatie proefdier/micro-organisme, de wijze van toediening en de mogelijke verspreiding van het micro-organismen naar het milieu spelen een zeer belangrijke rol. Bij werkzaamheden met GGM’s in een laboratorium wordt het micro-organisme altijd gehanteerd in een gesloten houder, en wanneer deze houder geopend wordt en de kans daarbij bestaat dat micro-organismen zich verspreiden (bijv. via aërosolen), gebeurt dit veelal in een veiligheidskabinet (klasse 2 en hoger). Het proefdier kan niet gezien worden als een gesloten houder. Dit betekent dat voor elke combinatie proefdier/micro-organisme zorgvuldig bepaald moet worden of eventueel bijzondere maatregelen nodig zijn om verspreiding van het micro-organisme tegen te gaan. Deze bijzondere maatregelen zijn in de beschrijving van de inperkingsniveaus A1 t/m A4 aangeduid met “aanbevolen” of “optioneel”. Een voorbeeld: een genetisch gemodificeerd adenovirus van risicoklasse 2 moet in een laboratorium onder standaard L2-condities worden gehanteerd. Wanneer dit virus in de longen van een muis wordt toegediend in de vorm van een aërosol, zijn standaard A2 condities niet voldoende om verspreiding van het virus tegen te gaan. Er zal een veiligheidskabinet aanwezig moeten zijn voor de toediening van het virus, de muizen moeten gehuisvest worden in speciale filtertopkooien, en al het afval (faeces, urine, bedding, etc.) moet geïnactiveerd worden. Wanneer het niet om een muis zou gaan, maar om een varken, zijn weer andere maatregelen nodig omdat een varken niet in een filtertopkooi gehuisvest kan worden. Het verblijf in zijn geheel moet dan de benodigde inperking geven. Dit betekent dat er een sas zal moeten zijn, onderdruk, de ruimte zal moeten geschikt zijn om te kunnen worden gefumigeerd, medewerkers zullen speciale beschermende kleding moeten dragen die na de werkzaamheden in de sas achterblijft en er zullen speciale voorzieningen moeten getroffen worden voor de inactivatie van faeces en urine (gesloten opvangsysteem gekoppeld aan een installatie voor inactivatie).


63

BIJLAGE 3: DE BIOLOGISCHE RISICOKLASSE VAN ENKELE RELEVANTE PATHOGENEN In deze bijlage zijn de biologische risicoklassen weergegeven van enkele relevante pathogenen. Deze lijst is een verkorte versie van de bijlage 5.51.8 van Vlarem II. Enkel de meest relevant geachte pathogenen zijn op deze lijst weergegeven. Wordt er gewerkt met een ander pathogeen dat niet op deze lijst voorkomt, dan kunnen de lijsten van Vlarem geraadpleegd worden. Komt het pathogeen ook daar niet op voor, dan dient u contact op te nemen met de interne of externe deskundigen (zie bijlage 4), of met de Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie van het WIV (http://www.biosafety.be). M = biologische risicoklasse voor mensen D = biologische risicoklasse voor dieren P = biologische risicoklasse voor planten OP = opportunistisch pathogeen (*) = vertonen een beperkt infectierisico, omdat ze niet overdraagbaar zijn via de lucht + = virus waarvan het biologisch risico afhangt van het gastheer-dier LET OP!: dit is een verkorte lijst. De volledige lijst is terug te vinden in Vlarem, rubriek 51, en op www.biosafety.be

Mens en dierpathogenen: bacteriën en aanverwanten M 3 OP

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3

64

D 3 OP 2 2 2 2 2 3

2 2 3 2 2 2 2

2 2

2 2 2 2 3 3

Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus lentimorbus Bacillus popiliae Bacillus sphaericus Bacillus thuringiensis Bordetella avium Bordetella bronchiseptica Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Campylobacter coli Campylobacter fetus subsp. fetus Campylobacter fetus subsp. venerealis Campylobacter jejuni Campylobacter spp. Chlamydia pneumoniae Clostridium botulinum Clostridium tetani Enterobacter spp. Enterococcus faecalis Escherichia coli (uitgezonderd niet pathogene stammen) Helicobacter hepaticus Helicobacter pylori Klebsiella mobilis (Enterobacter aerogenes) Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Klebsiella spp. Listeria ivanovii Listeria monocytogenes Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis Mycobacterium bovis (behalve de stam BCG) Mycobacterium leprae


M 3 2 2 2 2 2 2 2

D 3

2 2 2 2 2 3 (*) 2 2 3 (*) 2 2 2

3 2 3

2 2

2 2 2 2 2 3

2 3 3 2

3 2

2 2 2 2 2 3

2 2 2 3

Mycobacterium tuberculosis Neisseira gonorrhoeae Neisseira meningitidis Neisseira spp. Pseudomonas aeruginosa Salmonella Abortusequi Salmonella Abortusovis Salmonella choleraesuis (enterica) subsp. arizonae Salmonella Dublin Salmonella Enteritidis Salmonella Gallinarum Salmonella Paratyphi A,B,C Salmonella Pullorum Salmonella Typhi Salmonella Typhimurium Shigella boydii Shigella dysenteriae (Type I) Shigella flexneri Shigella sonnei Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptobacillus moniliformis Streptococcus agalactiae Streptococcus dysgalactiae Streptococcus equi Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus spp. Streptococcus suis Streptococcus uberis Vibrio cholerae (El Tor inbegrepen) Yersinia pestis

Mens en dierpathogene virussen M

D 2

2 4 3 4 4 4

2

+ + + 3 3 2 2 2 3

3 3

2

4 4

4 4

3 3 3 3

+ + 3 3 4 3 3 3 2 2 2 2

2 2 2 3

2

2 2

3 2

2

3 2

2 2 2 2 2

Adenoviridae Animal adenoviruses Human adenoviruses African swine fever virus Arenaviridae Flexal virus Junin virus Lassa virus Machupo virus Equine arteritis Simian haemorrhagic fever virus Astroviridae Astroviruses Baculoviridae Invertebrate baculoviruses Birnaviridae Drosophila X virus Infectious pancreatic necrosis virus Bunyaviridae California encephalitis virus Hantaan virus (Korean haemorrhagic fever) Filoviridae Ebola virus Marburg virus Flaviviridae Dengue virus 1-4 Japanese encephalitis virus Yellow fever virus Hepatitis C virus Border disease virus Bovine diarrhoea virus Hog cholera virus Herpesviridae Avian herpesvirus 1 (ILT) Marek’s disease Bovine herpesvirus 1 Bovine herpesvirus 2 Bovine herpesvirus 3 Bovine herpesvirus 4 Chimpanzee herpesvirus (pongine herpesvirus 1) Cytomegalovirus (Human herpesvirus 5) Cytomegaloviruses of mouse, guinea pig and rat Epstein-Bar virus (EBV, Human herpesvirus 4) Herpes virus B Orthomyxoviridae Avian influenza virus A-Fowl plague Equine influenza virus 1 (H7N7) and 2 (H3N8) Influenza viruses (Types A, B & C) Papovaviridae Animal papillomaviruses Human papillomaviruses (HPV) Bovine polyomavirus (BPoV) Monkey (SV40, SA-12, STMV, LPV) Paramyxoviridae Measles virus Mumps virus

M 2

D 2 2 2

2 2 2 2

3 2

2

2 2 3 2 2 4 4

2 3 2 3 2 3 3 3 2 + 2

2 2

2 2 2

2

2 3 3 2 3 2 3 3

3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 3 3

Parainfluenza viruses types 1-4 Parvoviridae Adeno-associated viruses AAV Canine parvovirus (CPV) Human parvovirus (B 19) Picornaviridae Coxsackieviruses Polioviruses Swine vesicular disease virus Bovine rhinoviruses (types 1-3) Human rhinoviruses Poxviridae Entomopoxviruses Fowlpox virus Other avipoxviruses Camelpox virus Cowpox virus Horsepox virus Monkeypox virus Rabbitpox virus-variant of vaccinia Vaccinia virus Variola (major & minor)virus White pox (Variola virus) Swinepox virus Reoviridae (ortho)reoviruses Human rotaviruses Mouse rotaviruses (EDIM, epizootic diarrhoea of infant mice) Rat rotavirus Retroviridae Avian leucosis viruses (ALV) Avian sarcoma viruses (Rous sarcoma virus, RSV) Bovine foamy virus Bovine immunodeficiency virus (BIV) Equine infectious anemia virus Feline immunodeficiency virus (FIV) Feline sarcoma virus (FeSV) Human immunodeficiency viruses (HIV) types 1 & 2 Human T-cell lymphotropic viruses (HTLV) types 1 & 2 Leukomogenic murine oncovirus (Murine lymphosarcoma virus:MuLV) Lymphosarcoma viruses of nonhuman primates Monkey mammary tumor viruses (MPTV) Murine mammary tumor viruses (MMTV) Murine sarcoma viruses (MuSV) Porcine sarcoma virus Rat lymphosarcoma virus (Rat LSA) Reticuloendotheliosis viruses (REV) Simian foamy virus Simian immunodeficiency viruses (SIV) Simian sarcoma viruses (SSV)

De biologische risicoklasse van enkele relevante pathogenen

65

M

D

3 2

3 3

2 2 2

+ 2

3 3

M Rhabdoviridae Rabies virus Vesicular stomatitis virus (VSV) Togaviridae Semliki Forest virus Sindbis virus Rubella virus Not classified Blood-borne hepatitis viruses not identified yet Borna diseases virus

D

3 3 3 3 3 3 3

Unrelated agents connected with Bovine spongiform encephalopathy (BSE) Chronic wasting disease of deer Creutzfeldt–Jakob disease Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome Kuru Mink encephalopathy Scrapie

Mens en dierpathogene schimmels M 2 2 OP OP OP 2

D 2 2 OP 2 OP OP 2

Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus nidulans Aspergillus parasiticus Aspergillus terreus Aspergillus versicolor Candida albicans

M 2 3 OP OP

D 2 2 2 OP 2 2 2

Cryptococcus neoformans Fusarium coccophilum Penicillium marneffei Pneumocystis carinii Rhizomucor pusillus Rhizopus cohnii Rhizopus microspous

LET OP!: dit is een verkorte lijst. De volledige lijst is terug te vinden in Vlarem, rubriek 51, en op www.biosafety.be

Mens en dierpathogene parasieten M

3 3 2 3 2 2 2 3 3 2 2

D 3 3 3 3 3 3 3

3

3

3

M Eimeria acervulina Eimeria burnetti Eimeria maxima Eimeria necratix Eimeria spp. Leishmania brasiliensis Leishmania donovani Leishmania ethiopica Leishmania major Leishmania mexicana Leishmania peruviana Leishmania spp. Leishmania tropica Plasmodium falciparum Plasmodium spp. (bij mensen en apen) Pneumocystis carinii Theileria annulata

2

D 3 2 2 3 2 3 3

2 3 3 3

3 3

3 3 3 2

Theileria hirei Theileria mutans Theileria ovis Theileria parva Theileria taurotragi Toxoplasma gondii Trichomonas foetus Trichomonas vaginalis Trypanosoma brucei brucei Trypanosoma brucei gambiense Trypanosoma brucei rhodesiense Trypanosoma congolense Trypanosoma cruzi Trypanosoma equiperdum Trypanosoma evansi Trypanosoma vivax

Fytopathogenen N.B.: Hieronder is de pathogeniteit van enkele fytopathogenen aangeduid. Sommige fytopathogenen zijn bovendien onderworpen aan bepalingen van de federale besluiten voor de bestrijding van voor planten of plantaardige producten schadelijke organismen (quarantaineregels).

66


Fytopathogene virussen P 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 3 2 2 2 2 2 2

Alfalfa mosaic virus Apple chlorotic leaf spot virus Apple mosaic virus Apple stem grooving virus Barley yellow mosaic virus Beet western yellows virus Carnation ringspot virus Cucumber mosaic virus Hop american latent virus Hop mosaic virus Lettuce mosaic virus Maize dwarf mosaic virus Melon necrotic spot virus Papaya ringspot virus Pea early-browning virus Potato leafroll virus Potato virus A

P 2 2 2 2 2 2 2 3 2 3 2 3 2 2 2 3 3

Potato virus M Potato virus S Potato virus X Potato virus Y Tobacco mosaic virus Tobacco necrosis virus Tobacco rattle virus Tobacco streak virus Tobacco stunt virus Tomato bushy stunt virus Tomato mosaic virus Tomato yellow leaf curf virus Tulip breaking virus Turnip crinkle virus Turnip mosaic virus Wheat dwarf virus Wheat spindle steak mosaic virus

LET OP!: dit is een verkorte lijst. De volledige lijst is terug te vinden in Vlarem, rubriek 51, en op www.biosafety.be

Fytopathogene bacteriën en aanverwanten P 2 2 2 2 2 3 3 2 2

Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rubi Agrobacterium tumefaciens Erwinia carotovora subsp. betavasculorum Erwinia chrysanthemi pv. chrysanthemi Erwinia salicis Erwinia tracheiphila Pseudomonas cichorii Pseudomonas fluorescens

P 3 3 2 2 3 2 3

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola Pseudomonas syringae pv. pisi Pseudomonas syringae subsp. syringae Rhodococcus fascians Xanthomonas campestris pv. aberrans Xanthomonas campestris pv. alfalfae Xanthomonas populi

P 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 3 2 3

Mucor circinelloides Mucor piriformis Mucor racemosus Mucor strictus Penicillium corymbiferum Penicillium cyclopium Penicillium digitatum Penicillium expansum Penicillium italicum Phytophthora infestans Phytophthora megasperma Rhizoctonia carotae Rhizoctonia fragariae Rhizoctonia tuliparum Rhizopus arrhizus Rhizopus stolonifer Sclerophthora macrospora Sclerospora graminicola Sclerotinia minor Sclerotinia trifoliorum Septoria apiicola Septoria azaleae Septoria chrysanthemella Septoria lactucae Septoria lycopersici var. lycopersici

Fytopathogene schimmels P 2 3 2 2 3 2 2 2 2 3 2 2 3 2 2 2 3 2 3 3 3 3 2 2 2

Alternaria dauci Alternaria solani Botrytis allii Botrytis elliptica Botrytis fabae Botrytis hyacynthi Botrytis tulipae Cladosporium phlei Cladosporium variabile Claviceps gigantea Claviceps purpurea Fusarium arthrosporioides Fusarium coeruleum Fusarium culmorum Fusarium graminum Fusarium oxysporum f. sp. betae Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Fusarium oxysporum f. sp. pisi Fusarium oxysporum f. sp. trifolii Fusarium solani f. sp. cucurbitae Fusarium solani f. sp. phaseoli Fusarium solani f. sp. pisi Glomerella cingulata (anamorph Colletotrichum gloeosporioides) Glomerella graminicola (anamorph Colletotrichum graminicola) Glomerella tucamanensis (anamorph Colletotrichum falcatum)

Fytopathogene parasieten P 3

Heterodera glycines

De biologische risicoklasse van enkele relevante pathogenen

67

BIJLAGE 4: LEESCOMMISSIE Hierbij betuigen wij onze dank aan onderstaande personen die bij de totstandkoming van eerdere versies van dit boekje nuttige commentaren hebben geleverd. Ann Van Gysel, communicatiemanager VIB Bernadette Van Vaerenbergh, WIV, Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie Greet Van Eetvelde, milieucoördinator, Universiteit Gent Huub Schellekens, Klankbordcommissie VIB, Universiteit Utrecht Kim De Rijck, Mieke Van Lijsebettens, VIB departement Planten Systeembiologie, Universiteit Gent Hilde Revets, VIB departement Moleculaire en Cellulaire Interacties Peter Brouckaert, VIB departement voor Moleculair Biomedisch Onderzoek, Universiteit Gent Thierry Vandendriessche, VIB departement Transgene Technologie en Gentherapie, KULeuven Wim Van de Ven, VIB departement Menselijke Erfelijkheid, KULeuven Hubert Backhovens, VIB departement Moleculaire Genetica, UA

68

Leescommissie

BIJLAGE 5: INFORMATIEBLAD Namen en coördinaten van verantwoordelijken Deze lijst dient als overzicht van de voor uw afdeling geldende contactpersonen inzake (bio)veiligheid. Contactpersonen verschillen vaak per afdeling. Vul de onderstaande gegevens zelf in en zorg dat u ze in het labo bij de hand heeft.

Naam

Telefoon

Overige

Noodnummer Laboratoriumverantwoordelijke EHBOverantwoordelijke Locatie EHBO verzorgingskast Coördinator bioveiligheid Contactpersoon Preventiedienst Arbeidsgeneesheer Contactpersoon afval Regulatory Affairs Manager VIB

René Custers

09 244 66 11

[email protected]

Als u algemene vragen heeft over inschalingen of te nemen maatregelen, raadpleeg dan eerst uw hiërarchische overste, en indien dit geen uitsluitsel geeft achtereenvolgens uw groepsleider, interne bioveiligheidsexpert of externe bioveiligheidsexpert.

Informatieblad

69

BIJLAGE 6: ZELFTOETS

70

Vraag 1:

Wat is de definitie van een genetisch gemodificeerd organisme?

Vraag 2:

Hoeveel biologische risicoklassen bestaan er voor de indeling van ziekteverwekkende organismen?

Vraag 3:

Noem drie gevaren die verbonden kunnen zijn met levende en/of gemodificeerde organismen.

Vraag 4:

Tot welke risicogroep (of biologische risicoklasse) behoort wild type E.coli?

Vraag 5:

Tot welke risicogroep (of biologische risicoklasse) behoren E.coli K12 stammen?

Vraag 6:

Beschrijf de verschillende stappen van de risicoanalyse voor GGO’s

Vraag 7:

Wat is een aerosol?

Vraag 8:

Op welke wijze kan de combinatie van een geïmmortaliseerde cellijn met een virale vector aanleiding geven tot de ongewenste verspreiding van genetisch gemodificeerd materiaal?

Vraag 9:

Noem vier belangrijke fysieke inperkingsmaatregelen.

Vraag 10:

Juist of niet juist: risicoklasse 1 GGO’s mogen na het experiment gewoon via de wasbak geloosd worden.

Vraag 11:

Welke van de volgende ontsmettingsmiddelen werkt niet tegen sporen? (1) chloor, (2) formaldehyde, of (3) ethanol.

Vraag 12:

Juist of niet juist: besmette materialen die worden hergebruikt hoeven alleen gewassen te worden. Ze hoeven niet te worden ontsmet.

Vraag 13:

Wat moet je doen als je genetisch gemodificeerde bacteria op een laboratoriumtafel hebt gemorst?

Vraag 14:

Noem vijf belangrijke werkvoorschriften voor het werken in een veiligheidskabinet van klasse II.


Zelftoets

71

Belangrijke werkvoorschriften zijn:(1) Sluit de deur van het L2 laboratorium (2) laat het veiligheidskabinet 10 minuten draaien alvorens te beginnen (3) ontsmet het werkblad en de luchtafzuigroosters van het kabinet alvorens te beginnen (4) zet alleen strikt noodzakelijke materialen in het kabinet, (5) zet geen materialen op de luchtafzuigroosters, (6) werk diep genoeg in het kabinet, (7) beweeg rustig om de luchtstroom zo min mogelijk te verstoren, (8) ontsmet het werkblad en de luchtroosters na het experiment (9) laat het kabinet nog 5 minuten draaien na het experiment, (10) vul het logboek van het kabinet in (naam, datum, gebruikt biologisch materiaal, teken af dat je het kabinet ontsmet hebt)

Vraag 14:

De gemorste bacteriën moeten met tissues worden verwijderd die vervolgens in het biologisch besmet afval worden gegooid. De werktafel moet vervolgens grondig worden ontsmet met tissues die gedrenkt zijn in een ontsmettingsmiddel, bijvoorbeeld ethanol.

Vraag 13:

Niet juist: Potentieel besmette materialen moeten eerst ontsmet worden (dmv sterilisatie of een andere gevalideerde methode) voordat ze worden gewassen.

Vraag 12:

Ethanol werkt niet tegen bacteriële sporen. Dus als je bijv met Lactococcen werkt moet je een ander ontsmettingsmiddel gebruiken.

Vraag 11:

Niet juist, ook risicoklasse I GGO’s moeten geïnactiveerd worden. Er zijn slechts enkele uitzonderingen mogelijk waarvoor je de expliciete toelating nodig hebt van de bevoegde overheid.

Vraag 10:

voorbeelden zijn: gesloten ramen en deuren, goed ontsmetbare werktafels, een veiligheidskabinet van klasse II, onderdruk, een sas, HEPA gefilterde luchtafvoer, etc.

Vraag 9:

Een geïmmortaliseerde cellijn kan soms virussequenties bevatten (bv HELA cellen bevatten de E6E7 genen van HPV) die tesamen met de virussequenties aanwezig in de vector aanleiding kan geven tot de vorming van infectieuze viruspartikels.

Vraag 8:

Een aerosol bestaat uit zeer fijne vloeistofdruppeltjes die zich via de lucht verspreiden. De druppeltjes kunnen levensvatbare micro-organismen bevatten en op die manier zorgdragen voor de verspreiding van deze organismen naar de omgeving.

Vraag 7:

(1) Lijst alle potentiele gevaren op verbonden aan de gastheer, insert en vector. (2) Hiermee bepaal je een eerste idée van de risicoklasse (3) Identificeer vanuit deze risicoklasse de benodige inperkingsmaatregelen, rekening houdend met het omringende milieu, het type en de schaal van de activiteit, en eventuele niet-standaard handelingen. (4) Bepaal de definitieve risicoklasse.

Vraag 6:

E.coli K12 stammen zijn geattenueerd (kreupel gemaakt) en zijn niet langer in staat ziekte te veroorzaken. Daarom behoren ze tot risicogroep 1.

Vraag 5:

Wild type E.coli behoort tot risicogroep 2 en kan dus ziekte veroorzaken.

Vraag 4:

Onder andere: ziekteverwekkendheid, giftigheid, of verstoring van ecologische evenwichten.

Vraag 3:

Er zijn vier biologische risicoklassen (1 tot 4). Klasse 1 organismen kunnen geen ziekten veroorzaken, klasse 2, 3 en 4 organismen wel.

Vraag 2:

Een genetisch gewijzigd organisme is een organisme waarvan het genetisch materiaal is gewijzigd op een wijze die niet mogelijk is door middel van voortplanting of natuurlijke recombinatie.

Vraag 1:

ANTWOORDEN

Bioveiligheid in het laboratorium

Recommend Documents