Bioaugmentációs eljárások biológiai monitoringja

SZENT ISTVÁN EGYETEM

DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS

Bioaugmentációs eljárások biológiai monitoringja

Atzél Béla

GÖDÖLLŐ 2008

A doktori iskola

megnevezése: tudományága: mb. vezetője:

Környezettudományi Doktori Iskola Környezettudomány Dr. Barczi Attila Ph.D.
















































Szent István Egyetem, Mezőgazdaság és Környezettudományi Kar Környezet- és Tájgazdálkodási Intézet Természetvédelmi és Tájökológiai Tanszék témavezető:

Dr. Kriszt Balázs Ph.D.
















































Szent István Egyetem, Mezőgazdaság és Környezettudományi Kar Környezet- és Tájgazdálkodási Intézet Környezetvédelmi és Környezetbiztonsági Tanszék

...........................................................

...........................................................

Az iskolavezető jóváhagyása

A témavezető jóváhagyása

2

TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS

5

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

8 8 10 10 11 13 15 18 18 18 21 22 22 24 24 25 27 27 28 29 30 31 32

2.1. Szénhidrogének a környezetben 2.2. Szénhidrogén vegyületek biológiai lebontása 2.2.1. A biodegradáció fogalma 2.2.2. Szerves anyagok biodegradálhatósága 2.2.3 Szénhidrogén-bontó mikroszervezetek 2.2.4. A biodegradációs eljárások csoportosítása 2.3. Biológiai monitoring 2.3.1. A monitoring vizsgálati tárgya 2.3.2. Az élő környezet monitoringja, biomonitoring 2.3.3. Polimeráz láncreakció (PCR) 

































































































































































































2.3.4. Mikroszervezetek környezeti kimutatása 2.4. Mikroszervezetek faj szerinti besorolása 2.4.1. Mikroszervezetek morfológiai vizsgálata 2.4.2. Mikroszervezetek identifikálása 2.4.3. Mikroszervezetek kockázati szint szerinti besorolása 2.5. A Chryseobacterium nemzetség 2.6. A Pseudomonas aeruginosa jelentősége 2.6.1. azonosítására használatos módszerek 






































3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1. Bioaugmentációs célra használt törzsgyűjtemény bemutatása 3.1.1. A törzsgyűjtemény származása 3.1.2. A törzsgyűjtemény ismert tulajdonságai 3.2. Bioaugmentációs célra használt törzsek 16S rRNS gén szekvencia vizsgálata 3.2.1. DNS izolálás tiszta tenyészetből 3.2.2. PCR reakció 3.2.3. DNS szekvencia analízis 3.2.4. Szekvencia hasonlóság elemzés 3.3. Új baktériumfaj leírásához szükséges vizsgálatok 3.3.1. Filogenetikai vizsgálatok 3.3.2. Fenotípusos vizsgálatok 3.3.3. Elektronmikroszkópos felvétel készítése 3.3.4. Sejtmembrán-zsírsav analízis 3.3.5. Respiratórikus kinon analízis 3.3.6. Poláris lipidek vizsgálta 3.3.7. Guanin-citozin arány vizsgálata 3.3.8. DNS-DNS hibribizáció 3.4. PCR alapú módszer fejlesztése a CHB-20p. törzs környezeti monitoringjához 3.4.1. Fajspecifikus primerek tervezése 3.4.2. DNS izolálás talajmintákból 3.4.3. Nested PCR 3.4.4. Nested PCR módszer érzékenységének tesztelése

36 36 36 37 37 37 37 38 38 38 38 39 40 40 41 41 41 42 42 42 42 42 43 3

3.5. Pseudomonas aeruginosa identifikálása fenotípusos módszerekkel 3.5.1. Magyar Szabvány által előírt módszer (MSZ 21470-77:1988) azonosítás ACGM agaros módszerrel 3.5.2. 3.5.3. API 20NE teszt 3.6. Pseudomonas aeruginosa identifikálása molekuláris biológiai módszerekkel 3.6.1. Exotoxin A gén kimutatása PCR technikával (ETA módszer) 3.6.2. 16S rDNS fajspecifikus génszakaszának kimutatása PCR technikával (PA-SS módszer) 3.6.3. Részleges/teljes 16S rDNS szekvencia analízis 
























4. EREDMÉNYEK 4.1 Bioaugmentációs célra használt törzsek identifikálása 4.1.1. A CHB-15p. jelzésű törzs taxonómiai besorolása 4.1.2. A CHB-20p. jelzésű törzs taxonómiai besorolása 4.1.3. Az AK-35 jelzésű törzs taxonómiai besorolása 4.1.4. Az AK-37 jelzésű törzs taxonómiai besorolása 4.1.5. Az AK-40 jelzésű törzs taxonómiai besorolása 4.2 A CHB-20p., mint új baktériumfaj részletes identifikációs vizsgálata 4.2.1 Filogenetikai jellemzés 4.2.2 Morfológiai jellemzés 4.2.3 Fiziológiai és fenotípusos jellemzés 4.2.4 Enzimatikus jellemzés 4.2.5 Kemotaxonómiai jellemzés 4.2.6 DNS-DNS hibridizáció 4.2.7 Új baktériumfaj bemutatása 4.3. CHB-20p. törzs fajspecifikus kimutatása környezeti mintából, DNS amplifikációs módszerrel 4.4. Pseudomonas aeruginosa környezeti detektálására alkalmas módszerek kritikai összehasonlítása 4.4.1. Azonosítás Magyar Szabvány (MSZ 21470-77:1988) szerint 4.4.2. Azonosítás Acetamid-Cetrimid-Glycerol-Mannitol (ACGM) agaron 4.4.3. Azonosítás API 20NE biokémiai fingerprinting módszerrel 4.4.4. Azonosítás ETA-PCR módszerrel 4.4.5. Azonosítás PA-SS PCR módszerrel 4.4.6. Identifikáció 16S rDNS szekvencia-analízissel 4.4.7. A vizsgált azonosítási módszerek eredményeinek összevetése

44 44 45 45 45 45 46 47 48 48 48 48 49 50 50 52 52 55 56 58 58 60 60 62 63 63 64 65 67 69 70 70

5. 6.

KÖVETKEZTETÉSEK, JAVASLATOK ÖSSZEFOGLALÁS

74 77

7.

ENGLISH SUMMARY

81

Mellékletek:

-1. sz. MELLÉKLET: IRODALOMJEGYZÉK Köszönetnyilvánítás

4

1. BEVEZETÉS A hazai környezetvédelmi gyakorlat egyik leggyakoribb kihívása a földtani közeg szénhidrogén-szennyezettségek felderítése és megszüntetése. Magyarországon számos káreset került feltárásra, ahol szennyezőforrásként üzemanyag-töltőllomások, régi fűtőolaj tárolók, valamint kőolaj illetve földgáz termékvezetékek szerepeltek. Amennyiben műszakilag kivitelezhető, szénhidrogén szennyezettségek esetén a szakma gyakran választ megoldásként valamilyen biológiai kármentesítési módszert, hiszen ez „költségtakarékos, környezetbarát és biztonságos”. Ám ezeknek a kritériumoknak megfelelni, ráadásul jó hatékonysági szinten, csak jól megválasztott, egyedileg a kárhelyhez tervezett technológiával, valamint megfelelő kémiai- és biológiai monitoringgal lehet. A bioremediációs technológiák tervezése több részből tevődik össze, mely részfeladatok különböző képzettségű szakemberek bevonását igénylik. Meg kell tervezni a felhasznált biológiai ágens (oltóanyag) eljuttatását a kívánt helyre, ill. érintkeztetését a szennyezett közeggel. Szükséges gondoskodni a szennyezett közegben a megfelelő biodegradációs körülmények folyamatos jelenlétéről is. E mellet pedig, az egyik legfontosabb ilyen feladat az oltóanyag összetételének tudatos megtervezése. Az ilyen fajta tudatos oltóanyag használatot bioaugmentációnak hívja a szaknyelv, mely fogalom több kritériumot is támaszt annál, mint a tudatos tervezés. Szükséges még a felhasznált mikroszervezetek részletes biodegradációs képességének ismerete, faj szintű identifikációja, valamint nem patogén mivoltuk igazolása,

Az első tulajdonság a lehető leghatékonyabb

szennyezőanyag-lebontást, a második és a harmadik pedig az eljárás biológiai biztonságát szolgálja. Eme elvárások teljesülését azonban nem elég a tervezés szintjén vizsgálni, annak megfelelő ellenőrzéséről is gondoskodni kell. Ezt a célt szolgálja a bioaugmentációs eljárások biológiai monitoringja, mely a felhasznált mikroszervezetek megtelepedésének, populációjuk változásának vizsgálatát jelenti a szennyezett közegben, ezen kívül magába foglalja az esetlegesen a kárhelyen megjelenő fakultatív patogén fajok megfelelő kontrollját is. A fakultatív patogén baktériumok megjelenésének kockázata különösen nagy a szénhidrogénnel szennyezett területeken, ugyanis nagy számban vannak köztük, melyek hatékonyan tudják az ilyen szennyezőanyagokat kizárólagos szénforrásként hasznosítani. Ezáltal a kárhelyen felszaporodhatnak, mely környezetegészségügyi kockázatot jelent a kármentesítésben résztvevő dolgozók, valamint a környező lakosság számára.

5

Doktori kutatási témámban három célkitűzést fogalmaztam meg: -Bioaugmentációs célra felhasznált baktérium törzsgyűjtemény fenotípusos identifikálási eredményeinek felülvizsgálata 16S rRNS gén szekvencia hasonlóság elemzés alapján. -A bioaugmentációs célra felhasznált törzsgyűjtemény egyik tagjának (CHB-20p) biológiai monitoringjára alkalmas, fajspecifikus molekuláris genetikai módszer fejlesztése. - A



biológiai monitoringjára alkalmas azonosítási módszerek






































összehasonlító kritikai elemzése, mely a bioaugmentációs eljárások biológiai biztonságának viszonylatában az egyik leggyakrabban felmerülő, fakultatív humán-patogén baktérium.

A magyarországi joggyakorlatban a környezetvédelmi célú biológiai készítmények felhasználását a 16/2002. (IV. 10.) EüM rendelet szabályozza. Ez vonatkozik a bioaugmentációs célra használt oltóanyagokra is. A rendelet előírja többek között a készítményben található mikroszervezetek legalább faj szintű megnevezését. Egy ilyen termék hatósági engedélyeztetéséhez tehát szükség van a felhasználandó baktériumok megbízható identifikációjára, a faj szerinti besorolás hitelességének felelőssége pedig az engedély kérelmezőjét terheli. Egy

ilyen

előkészítésében

bioaugmentációs vettem én

is

készítmény

részt,

(törzsgyűjtemény)

mely korábban

már

engedélyeztetésének

rendelkezett

az

Országos

Környezetegészségügyi Intézet által kiadott felhasználási engedéllyel, ám később a jogszabályok változása miatt szükség volt ennek megújítására. A törzseket korábban már faj szinten identifikálták hagyományos, tenyésztéses eljárásokon alapuló fenotípusos módszerekkel. Feltűnt, hogy a gyűjtemény egyik tagjának két lehetséges faji besorolása is volt, mely az alkalmazott identifikációs módszer bizonytalanságára utalt. Ezen kívül a korábbi felhasználási engedély kiadása óta a baktériumok rendszertana jelentősen átalakult, valamint a fajmeghatározás módszertana és eszköztára is jelentős fejlődésen ment keresztül. A bemutatott előzmények együttesen indokolták a törzsek korábbi identifikációs eredményeinek felülvizsgálatát, melyet munkám első célkitűzésének állítottam. A baktériumok környezeti kimutatására használt fenotípusos, vagy DNS alapú módszerek alkalmazhatóságával szemben sok kérdés merül fel. Második célkitűzésemnek állítottam egy olyan fajspecifikus molekuláris genetikai módszer kifejlesztését, mely alkalmas lehet az általam vizsgált törzsgyűjteményt egyik tagjának, a CHB-20p érzékeny környezeti kimutatására. A célkitűzés megvalósulása esetén a CHB-20p törzzsel végzett bioaugmentáció biológiai monitoringja előtt új távlatok nyílhatnak. 6

A

fakultatív

szénhidrogénnel

patogén

baktériumok

szennyezett

területeken,

megjelenésére mivel

az

fokozottan

ilyen

közegben

számítani jól

kell

megtalálják

életfeltételeiket. Bioaugmentációs eljárások esetén - különösen vízbázisok, ill. azok védőterületein - ezért szükséges ezeknek az egészségügyi kockázatot hordozó biológiai ágenseknek a monitoringja. Az ilyen fajok környezeti-, klinikai- ill. élelmiszeripari kimutatásánál is kiemelt fontosságú a vizsgálati módszer gyorsasága valamint megbízhatósága. Harmadik célkitűzésemnek megfelelően ezért elvégeztem néhány P. aeruginosa azonosítási módszer összehasonlító vizsgálatát. Öt vizsgálati módszer eredményeinek egybehangzóságát vizsgáltam 43 db környezeti mintából származó


























izolátumon (ld. 1. sz. ábra).

SZÉNHIDROGÉNEKKEL SZENNYEZETT TALAJMINTÁK

Aszparaginos dúsítás (42ºC) Növekedés cetrimid agaron (37ºC) 43 KÖRNYEZETI IZOLÁTUM

Fenotípusos módszerek

MSZ 21470-77:1988

ACGM agar

Molekuláris biológiai módszerek ETA PCR

PA-SS

API 20NE

AZONOSÍTÁSI EREDMÉNYEK EGYBEHANGZÓSÁGA

1. sz. ábra:


























környezeti kimutatására alkalmazott módszerek összehasonlítása

Teszteltem a vonatkozó Magyar Szabvány (MSZ 21470-77:1988) által előírt, az ACGM (acetamid-cetrimid-glicerol-mannitol) agaros, valamint az API 20NE módszert, mint fenotípusos módszereket, valamint két PCR alapú, fajspecifikus molekuláris biológiai technikát. Kísérleteim célja volt a két módszercsoport (fenotípusos és molekuláris biológiai) alkalmazhatóságának összehasonlítása, az előnyök és korlátozó tényezők feltárása. Doktori értekezésemben bemutatott eredményeimet, és ezekből fogalmazott téziseimet saját laboratóriumi kísérletek beállításával és értékelésével bizonyítottam, ill. támasztottam alá.

7

2. 2.1.

IRODALMI ÁTTEKINTÉS

Szénhidrogének a környezetben Szénhidrogén szennyezések közül a kőolajok és kőolajtermékek által okozott talajvíz- és

talajszennyezések a leggyakoribbak közé tartoznak. Magyarországon a rendkívüli, különösen káros és nagy mennyiségű szennyezések több mint fele ezektől az anyagoktól származik. Tekintettel a széles körű ipari, mezőgazdasági és lakossági felhasználásra, megjelenésükre vizeinkben csaknem mindenütt számíthatunk, különösen, ha a pontszerű szennyezések mellett figyelembe vesszük a szállítás és a tárolás közbeni szóródás lehetőségét is (BARÓTFI, 2000). Összetételét tekintve a kőolaj (nyersolaj) különböző szerkezetű és molekulatömegű, nyílt szénláncú (alifás), ezen belül egyenes szénláncú, pl. normál (n-) paraffinok, elágazó szénláncú, pl. izo (i-) paraffinok, gyűrűs szénláncú (aliciklikus), pl. ciklo (c-) paraffinok és aromás gyűrűt tartalmazó (pl. a monoaromás benzol, toluol, etil-benzol, xilolok), valamint a több aromás gyűrűt magába foglaló poliaromás szénhidrogének (pl. benz(a)pirén) elegye. Ezen kívül nitrogén, oxigén és kéntartalmú vegyületek mellett egyes esetekben fém komponensek is előfordulhatnak benne. A lehetséges kőolajalkotó vegyületek száma több millióra tehető (SZABÓ, 1989). A különféle kőolaj-ipari termékek, mint többféle szénhidrogén vegyületek elegyei, önmagukban nem különösen mérgezőek, ugyanakkor erősen toxikusak lehetnek az egyes alkotó elemek, a termékekhez kevert adalékanyagok (pl. MTBE, ETBE, TAME, stb.), a lebomlási termékek, ill. azok a szennyeződések, amelyek az előírásszerű használat során keveredhetnek a kőolaj származékokba. A kőolajtermékek közül a gazolin, a benzin, a középpárlatok, a kenőolajok és a különböző tiszta anyagok, mint pl. a metil-terc-butiléter (MTBE) okozhatnak nagyobb mértékű talaj- és talajvíz-szennyezést. A folyékony gőzök, gázok ugyanis a beszivárgás előtt jórészt elpárolognak, a nehéz olajok és a bitumen pedig csak igen kis mértékben tudnak beszívódni a talajba, sok esetben impregnálják azt. A talaj és talajvíz szennyeződése gyakran előfordul a kőolaj kitermelése, feldolgozása, a kőolaj és az egyes termékek szállítása, szakszerűtlen tárolása folyamán. A káros hatás függ a környezetbe jutott szennyezőanyag mennyiségétől, tulajdonságaitól és a környezeti feltételektől (talajadottságok, talajvíz mélysége, csapadék mennyisége, éghajlati, időjárási tényezők). Az ásványolaj és származékainak vizeink minőségére gyakorolt káros hatása sokirányú. Már kis

koncentrációban





és
























Jellegzetes

szagukról

oldott

állapotban

is

megkülönböztethetők az egyes termékek. A tiszta normál paraffinok szagukról alig ismerhetők fel; az illékonyabb homológok, mint a n-heptán, n-oktán és n-nonán inkább kellemes gyümölcsszerű 8

szaggal rendelkeznek, a magasabb forrpontúak pedig szintén szagtalanok. A tipikus „benzinszagot” túlnyomóan az izoparaffinok, naftének és az aromás összetevők adják. Tehát az egyes kőolajok és termékek szagküszöb értékei – az előforduló szagrontók arányairól függően – egymástól több nagyságrendben is eltérnek. A szénhidrogének mérgezőek a vízi életközösségekre. A mérgező hatás is különböző, nagymértékben függ a vízben való oldhatóságtól (BARÓTFI, 2000).

A szénhidrogének környezetkárosító hatásai között leggyakrabban az alábbiak szerepelnek: A talajból, talajvízből kipárolgó szénhidrogének -

a levegő oxigénjével tűz- ill. robbanásveszélyes elegyet alkothatnak,

-

bőrön át felszívódva daganatos betegségek indukálói lehetnek (pl. BTEX – vegyületek: benzol, toluol etil-benzol, xilol; pentán, hexán, ciklohexán, metilciklohexán, n-heptán, izo-oktán, stb.),

-

gőzüket belélegezve a véráramba kerülnek, mely által akut toxikus reakciót, májkárosodást vagy teratogén hatást válthatnak ki.

A talajba, talajvízbe beszivárgó szénhidrogének -

hosszabb - rövidebb ideig perzisztálnak és terjednek a talajban, a közeg hidraulikus vezetőképessége, szerves anyag és agyagásvány tartalma, valamint mikrobiológiai aktivitása függvényében,

-

apoláros jellegük miatt a kapillárisokból a vizet, levegőt kiszorítják, emiatt azok az

oxidatív

folyamatok

gátlódnak,

amelyek

a

talajok

biodegradációs

öntisztulásához vezetnek, -

hatásukra gátlást szenvedhetnek a biológiai anyagkörforgalmi rendszerek, így pl.: a cellulóz-, fehérje és kitinbontó mikroszervezetek száma és aktivitása csökken a talajban (),

-

az aromás és PAH vegyületek toxikusak, mutagének és karcinogének lehetnek,

-

potenciális élő- és talajvízszennyezők, a talajvízbe kerülve, azzal szétterjedve (migrálva) a szennyezőforrástól távolabb is kifejthetik környezetkárosító hatásukat (WALKER et al., 1975; NYER, 1993; WILSON & JONES, 1993; SZOBOSZLAY et al., 2002).

9

Magyarországon a 10/2000. (VI. 2.) KöM-EüM-FVM-KHVM együttes rendelet környezeti szempontból kockázatosnak határozza meg a következő szénhidrogén és szénhidrogénekből származtatható vegyületeket: -Alifás szénhidrogének, C5-C40 (TPH) -Benzol és alkilbenzolok (BTEX vegyületek) -Fenolok -Policiklikus aromás szénhidrogének (PAH) -Halogénezett aromás szénhidrogének -Halogénezett alifás szénhidrogének -Klórfenolok -Poliklórozott bifenilek (PCB) -Poliklórozott-dibenzo-dioxinok és dibenzo-furánok (PCDD/F) -Bizonyos növényvédőszerek.

2.2.

Szénhidrogén vegyületek biológiai lebontása

2.2.1. A biodegradáció fogalma Biodegradáció

alatt

a

mikroszervezetek

biokémiai

anyagcsere-folyamatain

keresztül

megvalósuló, lebontási (katabolitikus) ill. átalakítási (transzformációs) folyamatokat értjük. (SZOBOSZLAY et al., 1995; TÖRÖK et al., 1996). Energetikai szempontból a biodegradáció olyan elektronátadási folyamat, melyben a szerves anyagok táp- és energiaforrásként hasznosulhatnak, az oxidációjukból nyert energia pedig a sejtek felépítéséhez és azok fennmaradásához járul hozzá. Az elektronátadáshoz és az anyagcseréhez azonban szükség van terminális (végső) elektron-akceptorra is, mely az elektront fogadja (NÉMETH, 2004). Szerves szennyezőanyagok biodegradációja során maga a szennyezőanyag szolgál elektron donorként. Ilyen szennyezőanyagok esetén az aerob respiráció a leggyorsabb degradációs lépés, mely során a bontást aerob mikroorganizmusok végzik, és a végtermék CO2, H2O és biomassza. Fakultatív anaerob mikroorganizmusok képesek O2-t felhasználni elektron-akceptorként, ha az jelen van, vagy képesek alternatív elektron-akceptort is használni, illetve fermentálni is. Ilyen alternatív elektron-akceptorok a nitrát, szulfát, redukált vas, mangán; CO2 és szerves anyag, melyek felhasználásra kerülnek, ha nincs jelen oxigén. Oxigén hiányában az obligát anaerobok kerülnek túlsúlyba. A biodegradáció sebessége anaerob körülmények között viszonylag lassú, a bomlástermékek egyszerű szerves savak, CO2, H2O, CH4, H2, N2 és biomassza (sejtanyag) (NÉMETH, 2003). A szénhidrogének biodegradációjának ismerete 10

nem újdonság, több mint száz éve megfigyelték már ennek a vegyületcsoportnak a természetes lebomlását (MIYOSHI, 1895). A témakör mégis mind a mai napig sok titkot és tudományos kihívást rejt. Szénhidrogén szennyezettségek elhárítása esetén hatékony megoldás lehet a biodegradáció. A folyamatot környezetbarátnak tartják, hiszen optimális körülmények között a szennyezőanyag tényleges megsemmisülésére lehet számítani, a végtermékek között pedig veszélytelen anyagok szerepelnek (CO2 és H2O). Ezzel szemben a fizikai vagy kémiai kármentesítési eljárások a szennyező anyag fő tömegét csak más közegbe (oldószer, abszorbens, levegő, szennyvíz) helyezik át, melyeknek további kezelése szükséges, ezzel növelve a szükséges műveletek számát. Problémát jelent még ezen kívül a technológia során keletkező hulladék, ill. veszélyes hulladék (SIMON, 1999). Az eddigi tudományos megfigyelések szénhidrogének anaerob degradációja esetében kivétel nélkül rendkívül lassú lebontásról számoltak be (MAIER, 2000). A leghatékonyabb szénhidrogénbontó enzimek ugyanis az oxigenázok, melyek működése kizárólag oxigén jelenlétében lehetséges. Több monoaromás és poliaromás vegyület biodegradációja végbemehet anaerob körülmények között, de ilyen esetekben a lebontás hatékonysága és sebessége csak töredéke az aerob biodegradációnál tapasztaltaknak (ARMON











, 2000; ATLAS, 1981; BREGNARD

, 1996;











FENCHEL & FINALAY, 1995; FREIJER, 1996; HICKEY, 1995; LEAHY & COLWELL, 1990; ROFFEY, 1994; SONG








., 1990; STROO, 1992; YAMANE











, 1999). Betonfelületek

bitumen szigetelésének természetes lebomlását vizsgálva például a bontási intenzitás anaerob körülmények között csupán 0,3-0,6 g/m2/év, aerob viszonyok mellett viszont 27-55 g/m2/év értéket mutatott (WOLF & BACHOFEN, 1991), ami 45-183-szoros különbséget jelent. Más tanulmányokban is legalább 50-70-szeres intenzitás különbségről számolnak be (ATLAS, 1981).

2.2.2. Szerves anyagok biodegradálhatósága A biodegradálhatóság szerves vegyületek biológiai bonthatóságát jelenti, amely a környezetbe kerülésük és a














való kölcsönhatásuk eredményeképpen nyilvánul meg. A

egy



























szerves molekula komplexitásának csökkentését, vagy teljes lebontását, mineralizációját jelenti, melynek mértékét és sebességét a szerves vegyület biodegradálhatósága és a környezet biodegradáló képessége együttesen szabja meg. Egy szerves vegyület lebonthatóságát fizikai-kémiai tulajdonságai alapvetően meghatározzák. A vegyi anyagok lehetnek könnyen vagy nehezen bidegradálható, valamint

, azaz nem















biodegradálható vegyületek. A lebonthatóságot a bontáshoz szükséges idővel, ill.





























vel, 11

valamint a





























val lehet jellemezni. Az 1. és 2. sz. táblázat vízi















ökoszisztémában folyó biodegradáció elsőrendű sebességi állandóit és a felezési időket mutatják könnyen és nehezen bontható anyagokra (Európai Tanács, 1996). Egy szerves molekula biodegradálhatósága egyértelmű összefüggésbe hozható illékonyságával, vízoldhatóságával,

polaritásával,

illetve














ával

















































).

A

biodegradálhatóság és a Kow összefüggését vegyülettípusonként eltérő egyenletekkel lehet leírni. A 



(Quantitative Structure–Activity Relationship = a vegyi anyag szerkezetének és aktivitásának





mennyiségi összefüggése) lehetővé teszi, hogy egy vegyi anyag biodegradálhatóságának mértékét kísérletek nélkül, pusztán a molekula szerkezete és ismert bonthatóságú vegyületekkel való összehasonlítása alapján, modellezés segítségével jellemezzük. A lebonthatóságot mérni is lehet, ún.

biodegradálhatósági

tesztekkel,

melyeket

standard

körülmények

között,

ismert

mikroorganizmusokkal, vagy kontrollált mikrobaközösségekkel (szennyvíziszap, talaj) végeznek. A biodegradálhatósági tesztek mérési végpontja lehet a vegyi anyag mennyiségének csökkenése, vagy a bontó közösség aktivitása, sejtszáma, légzése, általános, vagy specifikus enzimaktivitásai. A szennyezőanyagok biodegradálhatóságának nagy szerepe van a vegyi anyag környezeti kockázatában. A kockázat mértéke a biodegradálhatósággal fordítottan arányos: minél inkább lebontható egy szennyezőanyag, annál rövidebb ideig lesz jelen a környezetben és fejti ki káros hatását. A biodegradálhatóság csak a környezettel kölcsönhatásban értelmezhető, ahol a folyik. A 2. sz. táblázat a talajban és vízi üledékben érvényes felezési időket mutatja



























a biodegradálhatóság és vegyi anyag szilárd–víz fázis közötti megoszlási hányadosa ( 



)

függvényében. Minél inkább hidrofób a vegyület, annál jobban kötődik a talaj (üledék) szilárd frakciójához, tehát annál kevesebb lesz a vizes fázisban biológiailag hozzáférhető állapotban. Emiatt a sebességi állandó ezeknél a vegyi anyagoknál nagyobb. A környezeti paraméterek (hőmérséklet, pH, redoxviszonyok, stb.) és főleg a mikrobiota összetétele, állapota és működőképessége nagyban befolyásolja a biodegradálhatóságot. A környezet ökoszisztémája képes alkalmazkodni, hozzászokni,

ként elfogadni és













hasznosítani a környezetbe kikerülő vegyi anyagokat még akkor is, ha azok természetidegen anyagok, ún.



















ok. A környezet

















s képessége mögött a környezetbe kikerült




vegyi anyagok (szennyezőanyagok) által kikényszerített evolúciós folyamatok állnak, a mikrobiota genetikai

és

biokémiai

potenciáljának

növekedése.

Környezetünkben

a

legintenzívebb

biodegradáció a szennyvizekben, a talajban és a felszíni vizekben folyik (GRUIZ, 2001). A































gondolkodás jegyében, a biodegradálható természetes anyagok és

termékek gyártása és használata (papír, fa, stb.) ajánlott vagy, ha a termék speciális igényeinek ezek nem tudnak megfelelni, akkor














































, vagy





















használata. A

peszticidek esetében is meg kell találni a kompromisszumot a hatás érdekében szükséges 12


























és a környezet általános terhelését csökkentő biodegradálhatóság között. (Európai

Tanács, 1996) A biodegradálhatóság a sebességi állandó és a felezési idő közötti összefüggést a következő egyenlet adja meg:

kbiodegradáció, talaj= ln 2/ DT50 biodegradáció, talaj (DT: felezési diő) 1. sz. táblázat: Vízi ökoszisztémákban mért felezési idők biodegradációs tesztek alapján, a Kp (vegyi anyag szilárd–víz fázis közötti megoszlási hányadosa) függvényében (GRUIZ, 2001). biodegradálhatóság: teszteredmény Könnyen biodegradálható

4,7

10-2

Felezési idő (nap) 15

Könnyen, de nem 10 napon belül biodegradálható

1,4

10-2

50

Nehezen biodegradálható

4,7

10-3

150

Nem biodegradálható

Sebességi állandó (1/nap)

0

∞

2. sz. táblázat: Talajban és vízi üledékben mért felezési idők biodegradációs tesztek alapján, a Kp (vegyi anyag szilárd–víz fázis közötti megoszlási hányadosa) függvényében (GRUIZ, 2001).

Kp ( lit/kg) ≤ 100 > 100 ≤ 1000 > 1000 ≤ 10 000 stb.

Felezési idő talajban = DT50 biodegradáció, talaj (nap) Könnyen Könnyen, de > 10 Nehezen biobiodegradálható nap biodegradálható degradálható 30 90 300 300 900 3000 3000 9000 30 000 stb. stb. stb.

2.2.3. Szénhidrogén-bontó mikroszervezetek Régóta ismer tény, hogy bizonyos mikroszervezetek képesek a szénhidrogének lebontására, azok hasznosítására kizárólagos szénforrásként, ill. energiaforrásként (DAVIS, 1967). Nem egészen húsz évvel később már egyes szerzők a n-alkán, c-alkán, aromás és gáznemű szénhidrogének mikrobiológiai lebontásáról számolnak be, valamint vizsgálták a kőolajszármazékok sorsát a talajban és talajvízben, és a gyakorlati alkalmazások lehetőségeit (ATLAS, 1984). Egy szénhidrogén-bontó mikrobát két alapvető tulajdonság határoz meg: membrán-kötött, szénhidrogén-specifikus oxigenáz enzime, valamint a sejt és a vízoldhatatlan vegyület közötti kapcsolat kialakításának mechanizmusa (ROSENBERG & RON 1996). Ezen kívül azonban még több körülmény együttes megléte szükséges ahhoz, hogy ezek a vegyületek egy mikroszervezet anyagcseréjében szén-, ill. energia forrásként szerepeljenek (ld. 3. sz. táblázat). 13

3. sz. táblázat: Kőolajszármazékok biodegradációjához szükséges feltételek (ROSENBERG & RON, 1996) A. Mikroszervezet 1. Szénhidrogén-oxidáló enzim 2. Szénhidrogén molekulához tapadó képesség 3. Emulgeáló képesség 4. Deszorpciós mechanizmus szénhidrogénből B. Víz C. Oxigén D. Foszfor E. Hasznosítható nitrogén-forrás

A nyers és a finomított kőolaj világszerte óriási méretű felhasználása, valamint a termékek sokfélesége miatt a szénhidrogének ma már egy fontos osztályát képezik a mikrobiális oxidáció potenciális szubsztrátjainak. Nem meglepő ezért, hogy szénhidrogén-oxidáló mikroszervezetek, a természetes szárazföldi és a vizes élőhelyek számtalan változatában, akár hévízforrásokban is fellelhetőek (BAZYLINSKI











, 1989). Több tanulmány is rámutat az olajjal szennyezett

területeken szénhidrogén-oxidálók magasabb arányára a teljes mikrobapopulációhoz képest. Eddig viszont nem sikerült összefüggést kimutatni a biodegradáló baktériumok száma, és a szennyezettség mértéke között (WALKER & COLWELL, 1976). Számos baktérium- és gombafaj képes szénhidrogén vegyületek lebontására. A folyamat specifitása összefügg a molekuláris oxigén szénhidrogénbe való beépítésére mutatkozó genetikai hajlammal, valamint néhány reakcióval, mely közti bomlástermékek keletkezéséhez vezet. Ezek a közti bomlástermékek később a sejtek számára hasznos energianyeréssel járó anyagcsere folyamatokban hasznosulhatnak. A különleges genetikai képesség az oxigenáz enzim vegyületspecifikusságában,

valamint

a

biodegradációhoz

szükséges

enzimaktivitás

indukálásának

képességében expresszálódik. A fenti szempontok alapján az elmúlt évtizedekben szénhidrogénbontónak írták le a 4. sz. táblázatban feltüntetett mikroszervezeteket (ROSENBERG & RON, 1996; ASHOK et al., 1995; HARWATI et al., 2007; VOVERIENË et al., 2002; JOHNSON & HILL, 2003).

14

4. sz. táblázat: Gyakori szénhidrogén-bontó mikroszervezetek rendszertani csoportjai Taxon

Taxon





































































































































































































































































































































































































































































































































































































































Értekezésemben részletesen foglalkozom a





nemzetséggel a 2.5 és a 4.2






















fejezetben. A genusz tagjainak szénhidrogén-bontó képességéről ma még nem sokat tud a tudomány. A szakirodalom részletes tanulmányozása után mindössze egy olyan publikációt találtam, melyben egy faj szinten azonosítatlan






























. izolátum metil-terc-butil-éter

bontó képességéről számolnak be a szerzők (ZHANG et al., 2007).

2.2.4. A biodegradációs eljárások csoportosítása A

gyakorlati

kármentesítések

során

alkalmazott

biodegradációs

eljárásokat

a

mikroszervezetek használata szerint két fő csoportra oszthatjuk. Az egyik fő csoportba a definiálatlan faji összetételű és tulajdonságú mikroszervezetekkel végzett technológiák tartoznak, amelyek további három alcsoportba sorolhatók: spontán biodegradáció vagy öntisztulás, támogatott spontán biodegradáció és (ösztönös) talaj-, ill. talajvíz-oltás (SZOBOSZLAY











,

2002). A spontán biodegradáció (öntisztulás) során a szennyezett közegben megjelenő szénforráshoz alkalmazkodva (adaptálódva) a kárhelyen meglévő mikroszervezetek közül azok szaporodnak fel, amelyek képesek a szénhidrogén vegyületek hasznosítására. (McCLURE et al., 1989; NÜßLEIN et al., 1992; VAN DER MEER et al., 1998; WEBER et al., 1994). A szennyezés lassan és rossz hatásfokkal, magas koncentráció esetén pedig egyáltalán nem degradálódik. A folyamat végén gyakran nagy koncentrációjú (szennyezettségi határértéket 15

meghaladó) szénhidrogén vegyület marad a kárhelyen. Ez legtöbbször arra vezethető vissza, hogy a helyben lévő (bennszülött) mikroba populáció tagjai nem képesek a szennyező szénhidrogén vegyületek

teljes

spektrumát

lebontani,

abból

csak

a

számukra

viszonylag

könnyen

hasznosíthatóakat alakítják át. Ezen kívül limitáló tényezővé válhat (kimerül) a talaj ill. a felszín alatti víz szénhidrogén degradációhoz elengedhetetlen nitrogén-, foszfor-, káliumforrása (N, P, K) ill. elektron akceptor (pl. O2, NO3-, SO42-, CO2, Fe3+) szolgáltató képessége. A támogatott spontán biodegradációs eljárásokkal (biostimuláció) a talaj/talajvíz adott szénhidrogén bontó (CH-bontó) mikroszervezeteit tápanyag (N, P, K), nedvesség és főként oxigén vagy más, sejtlégzést támogató, fent említett elektron megkötő (redukálódó) anyagokat juttatnak a rendszerbe (BEDARD, 2003). Az oxigént nemcsak levegő áramoltatással vagy nyeletésével, hanem más anyagok pl. H2O2 (hidrogén-peroxid)-nak a közegbe keverésével szokták pótolni. Ez utóbbi esetében semmi biztosíték sincs arra, hogy a H2O2 a közegben kémiailag nem reagál az ott lévő szennyező anyagokkal vagy túlméretezett adagolás esetén nem tizedeli meg éppen a szénhidrogén bontó mikroba populációt. Különösen kevert (többkomponensű) szennyezések esetén a H2O2 hatására, sok, részlegesen oxidált (átalakult) szerves vegyület keletkezhet, mind a szennyező anyagokból, mind a talaj adott szerves anyagából (humusz), amelyek egymással vagy a kiindulási anyagokkal reagálva ökotoxikológiailag kockázatos, időlegesen vagy véglegesen ellenőrizhetetlen és nehezen befolyásolható helyzetet teremthetnek a kárhelyen. Az (ösztönös) talaj- ill. talajvíz oltás során az adott kárhely mikroszervezetei közül „kiemelik” (pl. egy maréknyi szennyezett „föld”-del vagy laboratóriumi táptalajokon) azokat, amelyektől szénhidrogén-bontást várnak, majd lombikokban, tartályokban (fermentorokban) felszaporítják és visszajuttatják őket a talajba vagy talajvízbe (talaj-oltás vagy inokulálás), anélkül, hogy a mikroszervezetek tulajdonságait ténylegesen ismernék. A oltás vagy inokulálás azt jelenti, hogy valamilyen alkalmas technológiával, általában 105 – 1010 /ml élő sejtszámban mikroszervezeteket tartalmazó szuszpenziót (inokulumot vagy oltóanyagot) juttatnak a kezelendő közegbe. Az (ösztönös) talaj-oltás során a tápanyag, a nedvesség és oxigén kiegészítést is rendszeresen alkalmazzák (SZOBOSZLAY











, 2002).

Általában a támogatott spontán biodegradáció és a talaj- ill. talajvíz-oltások során gyakran ajánlanak, ill. alkalmaznak a szénhidrogén vegyületek biológiai elérhetőségét megnövelő szintetikus felületaktív anyagokat, detergenseket, amelyek emulgeálják („oldatba viszik”) az apoláros, hidrofób vegyületeket. Ezek az anyagok többnyire szintetikus termékek és egyáltalán nem bizonyítottak környezetbarát tulajdonságaik, ill. a konkrét kárhelyeken való eredményes alkalmazhatóságuk.

A

biodegradáció

során

a

mikroszervezetek

is

szintetizálnak

ún.

16

biodetergenseket, amelyek segítik őket a szénhidrogén vegyületekhez való hozzáférésükben (SZOBOSZLAY











, 2002).

A biodegradációs eljárások másik fő csoportját a faj-szinten azonosított (identifikált), ismert tulajdonságokkal rendelkező, a kárhelyről vagy laboratóriumi törzsgyűjteményből származó mikroszervezeteket alkalmazó módszerek alkotják. Ezeket (tudatos) talaj- ill. talajvíz-oltásnak vagy bioaugmentációnak nevezik (MAYOTTE et al., 1996; DYBAS et al., 1998; WITT et al., 1999; ELLIS et al., 2000; SALANITRO et al., 2000; DYBAS et al., 2002; MAJOR et al., 2002; BEDARD, 2003; DA SILVA & ALVAREZ, 2004; QUAN et al., 2004). A felhasznált baktériumok lehetnek a kárhely szempontjából autochton, vagy allochton vadtípusú törzsek, vagy genetikailag módosított szervezetek (VAUTERIN et al., 1991). Bioaugmentáció az esetében megvan az esélye annak, hogy a talajba/talajvízbe juttatott, ismert tulajdonságú (pl. nem patogén, ismert szénhidrogén bontási spektrumú, szennyező anyag tűrésű), nagy számú (106-108 élő sejt/g kezelt talaj) mikroszervezet viszonylag gyorsan és hatékonyan, sok esetben a helyi mikrobiota szénhidrogén bontó fajait háttérbe szorítva, elvégezze a kárhelyen a kívánt eredményű biodegradációt. A sikeres bioaugmentáció azonban nagymértékben függ a beoltott baktériumok viselkedésétől az új környezetben. Ezért az első kritérium a törzsek túlélése és megmaradása. A szaporodási rátájuk alacsonyabb lehet, mint mesterséges körülmények között, emellett még pédául különböző protozoák táplálékául is szolgálhatnak, ami tovább csökkenti a bevitt fajok sűrűségét (GOLDSTEIN et al., 1985;

WATANABE at al., 1998). A sikeres

bioaugmentáció másik kritériuma az inokulum megfelelő aktivitása. Több szerző szerint is, a célzott szennyezőanyag degradációjának csökkenése sok esetben az egyéb alternatív tápanyag források jelenlétének tudható be (BLUMENROTH et al., 1998; GOLDSTEIN et al., 1985; McCLURE et al., 1989; McCLURE et al., 1991; SCHMIDT et al., 1985; SCHWINDOLL et al., 1988). Fentiek miatt technológiai szempontból nagyon fontos a kárhely, a szennyezés összetételének, a használt mikroszervezetek származásának, tulajdonságainak a pontos ismerete. Emellett lényeges az oltás hatékonyságának a helyszíni nyomon követése a kármentesítés során (pl. a szénhidrogénbontó mikrobák számának és összetételének alakulása, a talajlégzés aktivitása, a szénhidrogén tartalom mennyiségi és minőségi változása), ill. az esetleges pótlólagos intézkedések megtétele (pl. a kiegészítő tápanyagok pótlása, a nedvességtartalom és az oxigén ellátottság javítása, a közeg újraoltása). A biodegradációs eljárások gyakran elérik a talajvíz-táblát is. Az









módszerek esetében a

leszivárgó csapadékvíz, a felszínen szétpermetezéssel, a talajba drénekkel vagy nyelető kutakkal visszavezetett talajvíz közvetve vagy közvetlenül a talajvíz-táblába juttathatja a szénhidrogénbontásra képes, helyben meglévő mikroszervezeteket. 17

Ezekben az esetekben, önmagában a nyeletett vízben megjelenő oxigén többlet is stimulálhatja a kétfázisú talajrendszer mikrobiális életét. Egyes vizsgálatok szerint pl. a 13-14 oC hőmérsékletű talajvíz kitermelése, majd kilevegőztetéssel (sztrippeléssel) való tisztítása után a visszanyeletett vízben az oxigén koncentrációja 5-10-szerese is lehet az eredeti talajvízének. Bizonyos esetekben, ha ezt a szennyezett talajvíz mikrobákra gyakorolt toxikus, gátló hatása már megengedi, oltóanyagot, tápanyagokat, levegőt vagy „oxigénképző” vegyületeket (pl. H2O2) is juttatnak a talajvíz táblába (SZOBOSZLAY et al., 2002).

2.3. Biológiai monitoring 2.3.1. A monitoring vizsgálat tárgya A felszín alatti környezetbe került szennyezőanyagok a talajban vagy a földtani közegben okoznak szennyezettséget, illetve a terjedési folyamatok által a felszín alatti és felszíni vizeket, a környezeti levegőt és az élő környezetet is veszélyeztethetik, károsíthatják. Ennélfogva a lehetséges szennyezőanyag terjedési útvonalak már a tényfeltárás kockázat felmérési fázisában felvett elméleti kockázati modell megalkotásakor kijelölik a monitoring során vizsgálandó környezeti eleme(ke)t, a monitoring vizsgálatok tágabb értelemben vett tárgyát. Az élettelen környezeti elemek (víz, levegő, földtani közeg) esetében a monitoring célja az alábbiak vizsgálata lehet: •

a szennyezőanyag koncentráció térbeli eloszlása,

•

a szennyezőanyag koncentrációjának időbeli változása,

•

a változásokat előidéző, illetve a változásokból eredően fellépő folyamatok mértékének és időbeli alakulásának nyomon követése (pl. bomlás- és anyagcseretermékek mérése, szorpció, hígulás, ioncsere, stb.),

•

a folyamatok értékelése alapján prognózisok készítése.

Az élő környezet monitoringja ezen túlmenően tartalmazhatja a szennyezettség élővilágra gyakorolt hatásának és a hatás változásának bemutatását és értékelését is (NÉMETH, 2003).

2.3.2. Az élő környezet monitoringja, biomonitoring A környezetvédelmi gyakorlatban a biomonitoringot is használják a szennyezettség tényének megállapítására, illetve a szennyezés terjedésének vizsgálatára, de hazánkban ez az eljárás még nem 18

elterjedt. A biomonitoring célja a környezet állapotának megfigyelése és a környezet minőségének jellemzése. A biomonitoring segítségével a kockázatfelmérés során a felállított modell ellenőrizhető. A kémiai analitikával szemben a biológiai módszerekkel végzett vizsgálatokkal a tényfeltárás során figyelmen kívül hagyott (ismeretlen vagy régi eredetű) vagy együttesen előforduló kockázatos anyagok hatását is lehet mérni, megfigyelni. A laboratóriumi ökotoxikológiai tesztek a biomonitoring vizsgálatok legelterjedtebb módjai, amely vizsgálatok során a szennyezett területről származó talajminták extraktumaival, illetve közvetlen vízmintákkal végeznek hatásvizsgálatot a tesztorganizmusokon. Léteznek csak egy faj, vagy több faj egyedeit vizsgáló tesztek, és olyan vizsgálatok is, amelyek egy táplálkozási lánc egyes tagjait és a lánc egészét ért káros hatások becslésére alkalmasak (laboratóriumi, vagy terepi mikro-, mezo- vagy makrokozmosz tesztek). A terepi vizsgálatok esetén elképzelhető, hogy laboratóriumi körülmények között fenntartott kiválasztott fajok egyedeit, vagy a területen élő honos fajokat vizsgálják. A terepi vizsgálatok során vizsgálhatják a közösség összetételét és működését (kor eloszlás, egyedszám, egyedsűrűség, egészségi állapot, szaporodási ráta, stb.), valamint az életközösség genetikai jellegzetességeit (rezisztens fajok, genetikai jellemzők), a bioakkumulációt, biodegradációt és biomarkereket is. A biokoncentráció/biomagnifikáció monitorozásához az egyes élőlények, illetve táplálkozási láncok egymást követő tagjainak szöveteiben, vagy a kiválasztott testnedvekben felhalmozódott szennyezőanyag koncentrációt kell rendszeresen méréssel meghatározni. A biomarkerek monitoringja olyan jelző molekulák vizsgálatát jelenti, melyek környezeti hatásra jelennek meg válaszként a vizsgált szervezetben. A szennyezettség hatása az ökoszisztéma egyes tagjainak vagy részének tesztelése során nyert információkból, az ökoszisztéma egészére vonatkoztatott extrapoláció eredményéből ítélhető meg. A vizsgálat időtartamát tekintve akut, szubkrónikus és krónikus teszteket lehet megkülönböztetni. A biomonitoring vizsgálatokban előszeretettel alkalmaznak indikátorfajokat. A bioindikátor fajok egyes csoportjai a viselkedés, kor eloszlás megváltozásával jelzik a megváltozott környezeti körülményeket, míg mások olyan rezisztens fajok, melyek szennyeződés esetén előnybe kerülnek a többi fajjal szemben. Használhatók még bioindikátorként olyan fajok is, melyek sejtjeik szennyezőanyag-koncentrációjának

változásával

(biokoncentráció)

tükrözik

a

biológiai

hozzáférhetőség megváltozást, valamint olyanok, melyek nagy érzékenységüknél fogva elpusztulásukkal korai figyelmeztetőül szolgálnak.

19

Az ökológiai vizsgálatok során azonban tisztában kell lenni a korlátokkal. Például a szennyezőanyagnak tartósan kitett populáció tűréshatára jóval nagyobb a laboratóriumi körülmények között élő, illetve a szennyeződés által sohasem terhelt populációk toleranciájánál. Különösen igaz ez a toxikus nehézfémek esetén, mivel egyes fajok egyedeinél kialakulhat olyan szelekció,

mely kisebb

mértékű

szennyezőanyag

felvételt

eredményez,

vagy nagyobb

szennyezőanyag felvétel mellett is normális növekedés és szaporodás tapasztalható (NÉMETH, 2003).

Más definíció szerint környezet-monitoring céljára alkalmazott biológiai módszerek összességét értik biomonitoring alatt. Alapulhat egyetlen tesztorganizmust vagy életközösséget alkalmazó teszten, ilyenkor a környezeti mintát a laboratóriumba szállítás után vizsgálják. Alapulhat helyszíni, ún.









biológiai vizsgálatokon (GRUIZ, 2001).

Aktív biomonitoring során a kiválasztott fajok izoláltan és kontrolláltan felnevelt egyedeit helyezik a környezetbe, míg passzív biomonitoring esetén, a területen élő fajokat vizsgálják. Így: 1. a közösség összetételét és működését: fajösszetétel, fajsűrűség, érzékeny fajok kihalása, tápláléklánc, a teljes ökoszisztéma anyag- és energiaforgalma; 2. az életközösség genetikai jellegzetességeit: rezisztens fajok megjelenése, genetikai jellemzők, DNS ujjlenyomatok; 3. a bioakkumulációt; 4. a biodegradációt; 5. biomarkereket: stressz-fehérjék, metallotionein, citokróm P450.

A biomonitoring előszeretettel alkalmaz bioindikátor fajokat: 1. őrző fajok: a vizsgált területre telepített, nagy érzékenységű fajok, amelyek elpusztulásukkal korai figyelmeztetőül szolgálnak; 2. detektor fajok: a vizsgált területen élő fajok, amelyeknek szennyezőanyag hatására megváltozik a viselkedésük, koreloszlásuk, esetleg elpusztulnak; 3. kiaknázó fajok: rezisztens fajok, amelyek szennyeződés esetén előnybe kerülnek a többi fajjal szemben. 4. akkumuláló fajok: felveszik és akkumulálják a szennyezőanyagot olyan mennyiségben, hogy a kémiai analízissel kimutathatóvá válik (GRUIZ, 2001). 20

Bioremediációs eljárások során a biológiai monitoring általában a kárhely mikroba populációjának változásainak vizsgálatát jelenti, beleértve felhasznált mikroszervezetek nyomon követését,

visszaizolálhatóságát,

valamint

az

esetleges

fakultatív

patogén

baktériumok

kontrollálását.

2.3.3. Polimeráz láncreakció (PCR) A polimeráz láncreakció (PCR:












































) elve 1983 áprilisában, az észak-

kaliforniai Kary Banks Mullis elméjében született meg,. A módszer elvét, egy gyakorlati eredmény bemutatásán keresztül, 1985-ben közölte le a















magazinban (SAIKI et al., 1985.) Ettől az

időponttól a PCR által, egy egyszerű elven alapuló, de zseniális technikával bővült a molekuláris biológia eszköztára. Ez a ciklikus, in vitro, enzimkatalizált, DNS-szintetizáló eljárás lehetőséget teremtett arra, hogy kimutatható szintre növeljék a vizsgálni kívánt DNS-szakaszt mennyiségét, lényegében megszüntetve így a DNS vizsgálatok mennyiségi korlátait. A módszer alkalmas a környezetben csak kis mennyiségben jelenlévő DNS amplifikálására, mely érzékeny detektálást tesz lehetővé. Például 100 db





















sejt kimutatása hagyományos módszerekkel, 1

g talajmintából nehézségeket okozhat. A 100 sejt egy bizonyos génjének ~106 nagyságrendben való amplifikálása azonban nagyban megkönnyíti a kimutatást (MAIER et al., 2000). A PCR egy viszonylag egyszerű enzimatikus reakciót jelent, mely DNS polimeráz enzimet használ a target DNS másolására, 25-30 cikluson keresztül. A célszekvencia minden ciklus alatt duplikálódik, mely a DNS mennyiség exponenciális növekedéséhez vezet. Elméletileg egy 25 ciklusból álló reakció végén a kópiák száma 225, de a gyakorlatban csak kb. 106-szoros növekedéssel lehet számolni, ugyanis az amplifikáció hatékonysága nem tökéletes. Az amplifikáció végtermékét (amplikon, PCR termék) általában agaróz gél elektroforézis módszerrel teszik láthatóvá, az amplikon méretét standard DNS molekulákhoz (DNS marker, „DNS létra”) hasonlítva lehet megbecsülni (MAIER et al., 2000). Az új módszer alkalmazásának következtében a publikációk száma e témában exponenciálisan növekedett. 1989-ben a PCR „motorja”, a „ 






























DNS-polimeráz enzim, elnyerte a Science magazin

” címét. E módszer kiemelkedő jelentőségének köszönhetően, Mullis 1993-ban

kémiai Nobel Díjat kapott. Jelenleg az élettudományok szinte minden ágában, több mint kétszázezer tudományos közleményben alkalmazták az alapeljárásnak mintegy százféle speciális változataként ezt a technikát (DEZSŐ & NAGY, 2005).

21









































A szokványos PCR reakció általában három lépésből áll. Az első lépés a denaturáció, mely során a kettős szálú target- vagy templát DNS (dsDNS) két egy szálú molekulává (ssDNS) válik szét. A reakcióhoz két kiválasztott, rövid, egy szálú DNS molekulát, azaz primereket adnak, melyeket hagyományos úton szintetizálnak. A primerek oligonukleotid szekvenciák, melyek bázissorrendje komplementer a target ssDNS-hez, így azzal hibridizálnak, feltapadnak, meghatározva ezzel az amplifikálódó régiót. Az egyik primert forward primernek, a másikat reverz primernek hívják. Az elnevezés egyszerűen meghatározza, hogy az ssDNS molekula melyik szálára tapadnak fel. A második lépés a primer feltapadás, mely a primerek hibridizációját jelenti a megfelelő célszekvenciához. A harmadik lépés az extenzió, ahol a DNS polimeráz enzim komplementer szálat szintetizál az eredeti ssDNS-hez, a reakcióközegben lévő szabad nukleotid molekulák felhasználásával, a feltapadt primerektől elindulva. A ciklus végén az eredmény két kettős szálú DNS molekula lesz, mely az eredeti dsDNS-sel teljesen megegyezik. A ciklusok ismétlése PCR amplifikációban exponenciálisan növeli az eredeti molekula másolatainak számát. Minden PCR ciklus kulcsa, hogy mindhárom lépés meghatározott hőmérsékleten és specifikus időintervallumban történjen. A megfelelő kópiaszám elérése érdekében a ciklusok általában 25-30szor ismétlődnek. Ezek a ciklusok automatizált thermocycler (PCR készülék) berendezésben történnek. A hőmérséklet a reakció kritikus eleme. A denaturációs ciklus nagyobb hőmérsékleten történik, mint a DNS olvadáspontja. A legtöbb PCR reakcióban ez 94˚C 1-1,5 percig, mely garantálja a DNS molekula teljes denaturációját. A primer feltapadás alacsonyabb, általában 50-70 ˚C hőmérsékleten történik, 1 percig. Előfordulhat a primer feltapadása olyan szekvenciához, mely hasonlít a helyes célszekvenciához, de néhány hibás bázist is tartalmaz. Ilyenkor helytelen, ún. nem specifikus amplifikációról beszélünk, mely fals-pozitív reakciót eredményez. Minél magasabb a feltapadási hőmérséklet (Ta), annál specifikusabb a feltapadás, így a nem specifikus amplifikáció mértéke nagyban csökkenthető. Mindemellett a Ta növelésével a PCR érzékenysége csökken. Az extenziós lépés alapvető feltétele a polimeráz enzim, ilyen a Taq polimeráz, mely a templátnak megfelelően nukleotidokat köt a primerekhez. Az enzimet eredetileg a











termofil baktériumból nyerték ki. A


















nagy hőstabilitása (akár 98˚C) lehetővé teszi a

több cikluson keresztül történő alkalmazását (MAIER et al., 2000).















































A specifikus DNS szekvencia sikeres amplifikációjának kritikus feltétele a primerek szekvenciájának megválasztása. Mint a génpróbák esetében is, a primer szekvenciára ismert DNS 22

szakaszokból lehet következtetni. A primer átfogó kiválasztását mindig a kutatás célja határozza meg. Ha egy fajra, vagy nemzetségre specifikus DNS szakasz detektálása szükséges, akkor kizárólag az unikális szakaszok megfelelőek az ennek megfelelő primerek tervezéséhez. Például az
























baktériumban a

gén kódolja egy külső membrán-fehérje termelődését, és






gén szekvenciájára tervezett primerek alkalmasak az





















specifikus kimutatására

(JOSEPHSON et al., 1991). Egyes vizsgálatok ellenben olyan primereket igényelnek, melyek az eubaktériumokban

konzervált

szekvenciára

lettek

tervezve.

Konzervált/konzervatív

szekvenciáknak nevezik azokat a régiókat, melyek több baktériumfajban is hasonlóak vagy teljesen megegyeznek. Néhány konzervatív szekvencia pedig univerzális, vagyis egy nemzetségen belül minden fajban megtalálható. Például a gyakori ( 










) tervezett primerek minden



















(nitrogén fixáló) gén konzervált szekvenciájára faj detektálására alkalmasak. Más univerzális

szekvenciák, mint a 16S rDNS (16S riboszómális RNS-t kódoló gén) viszont minden eddig ismert baktérium fajból kimutathatók. Mindezek ismeretében érthető, hogy a kísérlet célja mennyire meghatározza a célszekvenciát, amelyhez a primereket tervezni kell. A legtöbb primer általában 17-30 bp hosszú, a két primer közti távolság a templát DNS molekulán pedig néhány 100 és néhány 1000 bp között alakul. A két primer közti távolság határozza meg az amplikon hosszát. Gél elektroforézissel, DNS markert alkalmazva hasonlítják össze a PCR termék elméleti hosszát az amplifikált szakasz valós méretével. Az amplifikált termék származásának további megerősítése génpróbákkal történhet, mely a PCR alapú kimutatás érzékenységét tovább növeli. Szintén alapvető követelmény, hogy a primerek tartalmazzanak olyan szekvenciákat, melyek megkülönböztetik őket egymástól, ezzel biztosítva, hogy különböző helyen tapadjanak fel a kromoszómán belül. Ha a primerek komplementer szekvenciákat tartalmaznak, akkor primer dimereket képezve egymással is hibridizálódhatnak. A legtöbb primernél ajánlott a magas (>50%) guanin-citozin (G-C) arány, mely a primer magasabb olvadási hőmérsékletét (Tm) eredményezi. A G-C párok ugyanis három hidrogén híddal kapcsolódnak egymáshoz, míg az adenin-timin (A-T) pároknál csak két ilyen kötés létesül (MAIER et al., 2000). Egy primer olvadási hőmérsékletének (Tm) kalkulálására a következő általános formula létezik: Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC. Ily módon a Tm alakulása közvetlenül függ a primer hosszától és nukleotid összetételétől. A feltapadási hőmérsékletet (Ta) általában célszerű 5˚C-al a primerpár alacsonyabb Tm értéke alá helyezni (INNIS & GELFAND, 1990).

23













































































Mint már az előző fejezetben szó volt róla, megfelelően tervezett primerekkel lehetséges a vizsgálandó gén kimutatása ( 





gén a













MARLOWE és munkatársainak (1997) munkája, akik 






génre specifikus primreket alkalmaztak

tengervízből történő kimutatására. TSAI és mtsai (1993) az







fajok esetében). Másik hasonló példa lehet






gén (β-D-glucoronidáz







enzim termelődését kódoló gén) egy szakaszának amplifikálásához tervezetek primereket, szennyvízből és szennyvíz-iszapból történő














kimutatásra.

Mint az korábban szintén szerepelt már, a PCR alkalmas az eubaktériumokban konzervált, univerzális 16S riboszómális RNS génszekvenciájának detektálására is. A nevezett szekvencia külső régiói nagyon konzerváltak, míg a belső régiók egyedi fajbélyeget tartalmazhatnak egy bizonyos baktériumra nézve. Ezek a szekvenciák felhasználhatóak filogenetikai vizsgálatokhoz, melyek lehetővé teszik egy izolátum identifikálását. A 16S rDNS szekvencia-analízis vizsgálat módszerének elterjedése nagy áttörést hozott a filogenetikai kutatásokban, mivel a módszer alkalmas környezeti minták teljes DNS állományának vizsgálatára, a baktériumok szeparált tenyésztése nélkül is (MAIER et al., 2000).
















































Ahol a kimutatni kívánt DNS nagyon kis mennyiségben van jelen, ott szükség lehet a PCR technikák érzékenységének felerősítésére. Erre alkalmas speciális technika a nested (beágyazásos) PCR. Számos munkában alkalmaznak nested PCR-t, a kimutatási módszer érzékenységének növelésére. A módszer két amplifikációs reakcióból áll, ahol a második reakció templátja az első reakció amplifikációs terméke. A második PCR két indítószekvenciája az első PCR során amplifikálódott termék szekvenciáján belül helyezkedik el. A második amplifikációs lépésben használnak csoportspecifikus indítószekvenciákat (primereket) (LEE indítószekvenciákat is (ALBANESE

























1994), és univerzális

1996).

A termékek méretét tekintve, az első amplifikálás alatt felszaporított nagyobb DNS fragmentről a második lépésben egy kisebb, bennfoglalt szakaszt amplifikálnak (NAWA et al., 1993). Baktériumok környezeti kimutatásánál ez azt jelenti, hogy első lépésben felszaporítanak egy olyan általánosabb DNS szakaszt, amely minden baktériumban megtalálható. Ehhez univerzális primereket (ún. konszenzus primerpárt) használnak, amelyet a 16S rDNS univerzális régióira terveztek. Ezek a külső primerek. A második lépésben a felszaporított fragmentről, a belső, specifikus primerpár segítségével amplifikálnak egy, a kimutatni kívánt baktériumfajra egyedien jellemző DNS szakaszt. 24

A módszer nagyobb érzékenységével együtt jár, az esetleges DNS kontaminációk (a feldolgozandó minta ill. a vizsgálati eszközök DNS kontaminációja) miatt bekövetkező fals pozitív reakciók kockázata.

2.3.4. Mikroszervezetek környezeti kimutatása Környezetvédelmi kármentesítési eljárások biológiai monitoringjának kivitelezéséhez elengedhetetlenül fontosak a megbízható és gyors baktérium-kimutatási módszerek. Egyrészt az adott eljárás biológiai biztonságának szempontjából fontos a fakultatív patogén mikroszervezetek populációit monitorozni a kárhely környezetében. Másrészt bioremediációs eljárások esetén a felhasznált mikroszervezet jelenlétét, életképességét, hatékonyságát is szükséges vizsgálni. A molekuláris biológiai vizsgáló módszerek idestova másfél évtizede állnak a mikrobiológiai alap- és alkalmazott kutatás homlokterében. Noha e módszerek javarészt már elfogadásra találtak a klinikai mikrobiológia rutin gyakorlatában is, a közegészségügyi, ill. környezeti mikrobiológia területén a molekuláris alapú módszerek bevezetésének csak csírái lelhetőek fel. Ennek hátterében a szabványosított módszerek hiánya mellett a szakma jelenlegi idegenkedése húzódik meg. A leggyakrabban felmerülő kritikai észrevételek a szabványosítás hiányán kívül a drága infrastruktúrát, eszközöket, a vizsgálati költségeket, illetve az ez irányú szakképzettséggel rendelkező szakemberek hiányát jelölik meg. A fent felsorolt, részben jogos kifogások mellett számos érv szól a molekuláris gyorsdiagnosztikai eszközök bevezetése mellett. Amellett, hogy a környezeti mikrobiológiai területén számos új, többek között EU szabvány látott napvilágot, szemléletükben ezek sem haladják meg a múlt század 70’ évei mikrobiológiájának színvonalát. Figyelembe véve a környezetkémiában ugyanezen idő alatt bekövetkezett robbanásszerű metodikai fejlődést, ez a lemaradás mára már nem tartható. A jelenleg alkalmazott, főképp jogszabályban meghatározott módszerek viszonylagos lassúsága kritikus helyzetben (árvíz, vízjárványok, vízellátó rendszert érintő balesetek stb.) gyakran okoz komoly problémákat, melyeknek nem egyszer komoly költségvonzata is lehet. A klasszikus fenotípusos, tenyésztésen alapuló meghatározásoknak az időigényességen kívül számos más buktatója is van. A szelektív táptalajokon történő tenyésztés és ezt követő azonosítás sikere jelentősen függ a mikroba aktuális fiziológiai állapotától, amelyet pl. az ivóvíz klórozása is torzíthat. Ezért mindenképpen indokoltnak tűnik a molekuláris alapú vizsgáló módszerek legalább részbeni bevezetése. A magyar jogi szabályozás előírja a felhasználható mikrobiológiai vizsgálati módszerek pontos körét. Azonban lehetőséget nyújt – az egyenértékűség meghatározott módon történő igazolása 25

mellett – alternatív vizsgálati módszerek használatára is. Az alkalmazható molekuláris vizsgálati módszerek körét az 5. sz. táblázatban, a teljesség igénye nélkül, előnyeiket és hátrányaikat kiemelve mutatom be.

5. sz. táblázat: Baktériumok környezeti kimutatásában néhány alternatívan alkalmazható módszer (KOVÁCS, 2006 nyomán) Módszer

Ribotípizálás

Leírás A hasított genomiális DNS hibridizálása rRNS-specifikus próbákkal; elkülöníti a fajokat

Előnyök

Hátrányok

Kiváló reprodukálhatóság

Komplikált, drága és munkaigényes

Pulsed-field elektroforézis (PFGE)

A genomi DNS „ujjlenyomat” vizsgálata ritkán hasító restrikciós enzimekkel történő kezelés utáni elektroforézissel

Rendkívül érzékeny a genetikai különbségekre Kiváló reprodukálhatóság

Denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE)

A PCR termékek szétválasztása olvadáspontjuk alapján; a fajok elkülöníthetőek

Izolátumokkal dolgozhatunk

Repetitív DNS szekvenciák (repPCR)

PCR hosszheterogenitás (LHPCR) Terminális – fragment-hossz polimorfizmus (T-RFLP)

Palindromatikus DNSszakaszok felszaporítása (PCR) és elektroforetikus elemzése; a fajok elkülöníthetőek A PCR termék hossza alapján elkülöníti a gazda-specifikus genetikai markereket A PCR termék specifikus hasítását követő elektroforézis. Csak a fluoreszcensen jelölt végű fragmentet detektálják

Egyszerű és gyors

Esetenként túl érzékeny (faj alatti kategóriák is elkülönülnek). Hosszú kivitelezési idő, adatbázis kiépítése szükséges Viszonylag friss fejlesztés. Eszköz és munkaigényes. A szimultán vizsgálható minták száma csekélyebb. Figyelembe kell venni a reprodukálhatóságot. Jelentős adatbázis kell kiépíteni. A variabilitás növeli az adatbázis nagyságát.

Nem igényel tenyésztést és adatbázist

Drága készülék, körülményes kivitelezhetőség.

Nem igényel tenyésztést

Drága készülék, körülményes kivitelezhetőség

A molekuláris biológiai történetében a legnagyobb áttörést tagadhatatlanul a PCR (polimeráz láncreakció) felfedezése okozta. Alkalmazásával lehetővé vált, hogy a vizsgált genetikai állomány tetszőleges szakaszát több milliószorosára szaporíthassuk. A módszer bevezetésének hozadéka a baktérium kimutatáson kívül a mikrobiális taxonómia és identifikáció területén is óriási jelentőségű (KOVÁCS, 2006). PCR alkalmazása igen elterjedt az orvosi diagnosztikában, genetikai betegségek kimutatásában, fertőzést okozó, patogén mikroorganizmusok detektálásában, igazságügyi orvosi vizsgálatoknál. A PCR alkalmazása környezeti mintákban azonban némi nehézségekbe ütközik, mert a DNS 26

polimerázt kémiailag és fizikailag egyaránt gátolják a talaj komponensei, mint pl. talajkolloid szemcsék, amelyek egyrészt fizikailag gátolják a DNS és primer kapcsolódását, valamint stabilizálják a primer-dimer kapcsolatot. Szervetlen és szerves anyagok egyaránt kifejthetnek kémiai gátló hatás, pl. vastartalmú vegyületek, huminsavak. Ezért a reakció kivitelezéséhez nagyon tiszta DNS-re van szükség, és a mérés kvantitatívvá tételéhez speciális módszer szükséges. Kevés minta esetén nem jól reprodukálható az eredmény. A módszer hátránya ezen felül még, hogy mivel a DNS target keverékben van jelen, ezért eltérő lehet az amplifikációs hatékonysága (PEPPER & DOWD, 2002).

2.4. Mikroszervezetek faj szerinti besorolása 2.4.1. Mikroszervezetek morfológiai vizsgálata Egy ismeretlen mikroba jellemzésének fontos feltétele a sejt morfológiai sajátságainak ismerete. A klasszikus morfológia szerint a sejt alakja lehet kokkusz, bacillus, vibrió, spirillum, spirohéta vagy szabálytalan alak. A sejtekhez esetenként különböző függelékek is kapcsolódnak. Ilyenek a mikroba sejtek konjugációjában szerepet játszó pílusok, a glikokalix burok, vagy a taxonómiai szempontból jelentős flagellumok. Flagelláltság szempontjából egy mikroba sejt lehet atrich (nincs flagellum), monotrich (1 végen 1 db), amfitrich (2 végen 1-1 db), lofotrich (1 végen több db), lofoamfitrich (2 végen több-több db), vagy peritrich (sok, nemcsak a sejtpólusokon). A flagellumok megfigyelésére, típizálására a fénymikroszkóp már nem nyújt biztos támpontotehhez 8000-10000-szeres nagyítás, azaz elektronmikroszkópos vizsgálat szükséges. A direkt elektronmikroszkópos vizsgálat elsődleges gátja a biológiai anyag kis sűrűségében keresendő. A képalkotásra használt elektronnyaláb gyenge interakciója a vizsgálatot nehézzé teszi, a felvétel gyenge kontrasztú és rossz felbontású lesz. Ennek áthidalására már a hatvanas években kifejlesztették a napjainkban is használt negatív és pozitív sejtfestési eljárást. A pozitív festés a festékmolekula és a vizsgálandó minta között kialakuló kémiai kötésen alapul. A folyamat időigényes, fixálási-posztfixálási lépéseket, beágyazást igényel, ami akár két-három napot is igénybe vesz. A baktériumok flagellumának vizsgálatára ezért a negatív festési eljárás terjedt el, amely akár 1 óra múlva értékelhető eredményhez vezet. Ebben 1%-os uranil-acetáttal kezelik a gridre rögzített baktérium sejteket. A nehézfém sója stabilizálja a mintát, és erős denzitású kéregként borítja a sejtfal struktúrákat, melyek transzparens alakzatként tűnnek elő az elektronmikroszkópos felvételeken. Napjainkban ezt az eljárást sikeresen használják gyorstesztekben (HAZELTON & GELDERBLOM, 2003). A technika egyik hasznos alkalmazását a 2. sz. ábrán látható morfológiai

27

összehasonlító vizsgálat szemlélteti, mellyel egy gyanús postai küldemény






























(antrax, a lépfene kórokozója) szennyezettségét lehetett eldönteni.

2. sz. ábra. A: Negatívan festett 




























sejtek (nincs flagellum); B: Negatívan festett




sejtek (jól kivehető flagellumok); Lépték=2.5 µm.

2.4.2. Mikroszervezetek identifikálása A helyes kórházi diagnosztikának, fertőzések kezelésének valamint egy járvány-terjedés nyomon követésének alapvető feltétele a mikroszervezetek pontos és megbízható identifikálása, beleértve a baktériumok és patogének detektálását. A baktérium identifikáció széles felhasználási területei ismertek, ilyenek a törvényszéki, a bűnügyi, a bioterrorizmus fenyegetettség és a környezeti, környezetvédelmi alkalmazások. Mikroszervezetek faj szintű identifikálására többféle módszer létezik. Léteznek hagyományos, fenotípusos bélyegek meghatározásán alapuló módszerek, melyen a hagyományos baktérium taxonómia alapjai nyugszanak. Ilyenek például a Gram-festés, a növekedési- és biokémiai tesztek. Ezeknek a módszereknek két fő hátránya van. Egyrészt csak olyan mikroszervezetek vizsgálatát teszik lehetővé, melyek













körülmények között tenyészthetők. Ezek a szervezetek viszont a

talaj teljes mikroflórájában gyakran nem érik el 1%-os arányt sem (MAIER et al., 2000). Másrészt egyes törzsek olyan biokémiai karakterisztikát mutathatnak, melynek profilja nem egyezik egyetlen ismert faj, vagy nemzetség hasonló tulajdonságaival. Napjainkban egyre inkább elterjedtek, a valamilyen genetikai bélyeg kimutatását célzó, molekuláris biológiai módszerek. A legelterjedtebb a 16S riboszómális RNS-t (rRNS) kódoló 28

gén bázis-sorrendjének meghatározása szekvencia analízissel. Ezt a módszert ma már széleskörűen használják baktériumok identifikálására és taxonómiai vizsgálatok kivitelezésére (CHOI et al., 1996; CLARRIDGE, 2004; MUNSON et al., 2004; PETTI et al., 2005; SCHMALENBERGER et al., 2001). A bakteriális eredetű 16S rRNS jellegét tekintve nagyon konzervatív, különböző fajok esetében is akár 95-96%-os homológiát mutathat. Tartalmaz azonban általában kilenc „hipervariábilis régiót” mely jelentős eltéréseket mutat különböző baktérium fajok között, ezáltal alkalmas faj szintű identifikációra (VAN DE PEER et al., 1996). Baktériumok esetében egy fajhoz tartozónak nevezzük azokat az egyedeket, melyeknek teljes DNS állományuk egymással 70%-nál nagyobb homológiát mutat.

2.4.3. Mikroszervezetek kockázati szint szerinti besorolása Több intézmény is, köztük az Európai Tanács (Európai Tanács, 2000), és az Egészségügyi Világszervezet (World Health Organization, 2004), a mikroorganizmusokat és a velük kapcsolatos termékeket a szállításuknál és kezelésüknél megkövetelendő biológiai biztonsági szintjük (biosafety level, BSL) szerint osztályozta, és az általuk képviselt kockázat szerint rizikó csoportba sorolta azokat. Eszerint a besorolás szerint: 1-es rizikócsoport (nincs, vagy csak kis mértékű az egyéni- és közösségi kockázat): Biológiai hatóanyagok, melyek ismereteink szerint nem, vagy csak igen kis mértékű potenciális kockázatot jelentenek a velük foglalkozó személyekre és a környezetre. 2-es rizikócsoport (mérsékelt egyéni-, alacsony közösségi kockázat): Biológiai hatóanyagok, amelyek mérsékelt potenciális kockázatot jelentenek a személyekre (laboratóriumi, technológiai dolgozók) és a környezetre nézve. A laboratóriumi expozíció ritkán okoz fertőzéseket, és létezik ellenük hatékony megelőzés, védekezés. 3-es rizikócsoport (magas egyéni-, alacsony közösségi kockázat): Biológiai hatóanyagok, amelyek potenciálisan komoly, vagy életveszélyes betegségeket okozhatnak. Ezek a hatóanyagok a levegővel is terjedhetnek, de létezik ellenük hatékony megelőzés, védekezés. 4-es rizikócsoport (magas egyéni- és közösségi kockázat): Veszélyes és különleges biológiai hatóanyagok, amelyek a legnagyobb kockázatot jelentik a személyekre és a környezetre nézve. Általában halálos fertőzést okoznak, és jelenleg nem ismernek ellenük hatékony megelőzési, védekezési módszert.

29

Megjegyzések: - Nincsenek benne az osztályozásban azok az állat- és növénypatogének, melyek emberre vonatkozó hatását nem ismerik. -A genetikailag módosított organizmusokat nem veszik figyelembe. -Az osztályozott baktériumok emberre kifejtett hatását egészséges személyekre kell érteni. -Nem tartoznak értelemszerűen az 1-es rizikócsoportba azok a baktériumok, melyeket nem osztályoztak a 2-es, 3-es és 4-es csoportba. -Amikor egész nemzetséget említenek, abba értelemszerűen nem tartoznak bele a nem patogén fajok és törzsek. -Ha egy törzs legyengül, vagy elveszíti a virulencia génjét, akkor is úgy kell kezelni, mint azt az osztályozás az eredeti törzsnél megköveteli. Például ha egy ilyen törzset egy terméként, vagy profilaktikus, ill. terápiás termék részeként használnak.

2.5. A Chryseobacterium nemzetség A genetikai és kemotaxonómiai módszerek gyors fejlődésének következtében a prokarióták hagyományos klasszifikációja nagyban átrendeződött, és ez a folyamat még napjainkban is tart. Így született meg 1994-ben a (1994) a













































































































































































) külön












nevet adták, típus fajként pedig a








-ot jelölték meg.










nemzetségbe sorolták, melynek a 



és






































nemzetség öt, helytelenül klasszifikált tagját (









nemzetség is, amikor VANDAMME és munkatársai





Azóta a genusban leírt fajok száma jelentősen bővült, jelen értekezés írásának idején a 



nemzetség 24 validált fajt számlál, melyek száma a megjelenésig várhatóan


















tovább nő majd. A fajok név szerint: (VANDAMME










2005a)










(ZHOU


















2007)

















& HALPERN, 2007) 2007)








1994)















































































, 2005)

(WEON




































(TAI










., 1994)






















2006)




























































(KIM




































2006)

(DE BEER




.,








(DE BEER


























(SHIMOMURA






(PARK







(VANDAMME










(VANEECHOUTTE










2003)






2007)

















(HANTSIS-ZACHAROV









































., 1994)











(BEHRENDT 


















, 2006)

















(KÄMPFER



., 1994)

















, 2007)












2005)



















2006)





























(QUAN



(VANDAMME





















(GALLEGO









(VANDAMME







(PARK








(YOUNG



2003)










































(SHEN





2007)



(VANDAMME













(HUGO





2005)








2006)





























































































(YOON










., 1994)







































, 2005) and

, 2006). 30

A


























fajok ubikviter jellegűek, jelenlétüket kimutatták már felszíni- és felszín

alatti vizekben, ivóvízben, talajban, élelmiszerekben (tej, hús, hal) és klinikai mintákban is (VANDAMME et al., 1994; JOOSTE & HUGO, 1999; HUGO et al., 2003; KÄMPFER et al., 2003; LI et al., 2003; PAVLOV et al., 2004; GALLEGO et al. 2006). Az irodalmi adatok eddig egyik leírt faj esetében sem számolnak be szénhidrogén-bontó képességről.

2.6. A Pseudomonas aeruginosa jelentősége A

P.

aeruginosa

biodegradációs

jelentőséget

az

a

képessége

adja,

hogy

a

környezetszennyező anyagok igen széles skáláját képes lebontani, így alifás, aromás és poliaromás szénhidrogéneket is. Ez a széleskörű szénhidrogén bontó képesség is szerepet játszik abban, hogy a P. aeruginosa szénhidrogénnel szennyezett talajokban és talajvizekben az egyik leggyakrabban izolálható baktériumfaj (ATZÉL et al., 2008). Kármentesítéseknél a biológiai monitoring különösen fontos, hiszen a baktérium nagy csíraszámban elszaporodva kockázatot jelenthet a kármentesítésben dolgozókra és a környező lakosságra is (SZOBOSZLAY et al., 2004). A P. aeruginosa ubikviter mikroszervezet; megtalálható a talajban, a vizekben, a növényekben, állatokban és az emberben is. A talajban élősejt-száma általában nem éri el a fertőzési kockázat alsó szintjét (~100 sejt); a környezetből való kitenyészthetőségi gyakorisága alacsony (GROBE et al., 1995). Az USA-ban (Dél-Karolina) végzett vizsgálatok szerint a természetes állapotú, nem szennyezett talajok kb. 16%-ában fordul elő


























(FERGUSON et al.,

2001). Szennyvizekből gyakran kimutatható, emellett megtalálható mélyfúrású kutak vizében, desztillálókban, székletben, növényekben és élelmiszerekben. Előfordulására jellemző adatok: folyókban, patakokban 102-103/ml, víztározókban 101-102/ml, házi szennyvízben 101/ml valamint székletben 103-105/g sejtsűrűségben fordul elő (NÉMEDI et al., 1998). Tápanyagforrásként képes hasznosítani a galaktózt, glükózt, mannózt, xilózt, glicerolt, mannitolt, etanolt. A nitrátokat nitritté és nitrogénné redukálja, a glükózt pedig glükonsavra és 2-keto glükonsavra oxidálja (BÉLÁDI et al., 1983). A P. aeruginosa környezete iránt igénytelen, tápanyag szükséglete annyira minimális, hogy még a tiszta vízben is képes kolonizálódni. Ily módon az elpusztításához elegendő fertőtlenítőszer hiányában és megfelelően nedves környezetben könnyen elszaporodhat. A kórházi környezetben is a nedves helyek lehetnek kritikusak, mint például a párásítók, lélegeztető berendezések, szívók, csaptelepek, elhasználódott fertőtlenítő oldatok, fizioterápiás gyógymedencék stb. (KONKOLY THEGE, 2003).

31

Az Amerikai Egyesült Államok adatai szerint (CDC - Centers for Disease Controll and Prevention) a negyedik leggyakrabban izolált nozokomiális (kórházi) baktérium. Szinte vezető helyet foglal el az intenzív osztályokon előforduló fertőzések között: első helyen áll a légúti infekciókban (17,5%) a negyedik leggyakoribb kórokozó a húgyúti infekciókban, a harmadik leggyakoribb baktérium a sebfertőzésekben (10,9%) és a hatodik helyen áll a szepszisekben (JARVIS & MARTONE, 1992). Az USA-ban, Kanadában és Latin-Amerikában 1997-ben elvégzett SENTRY tanulmány szerint a



a harmadik leggyakoribb a vérből izolált kórokozók
























között (DIEKEMA et al., 1999). A


























egészségügyi jelentőségéhez hozzájárul, hogy ez

a faj meglehetősen ellenálló a kezeléssel szemben, ha fibrózus cisztában (CF) szenvedő betegek légútjaiban biofilmet képez (SUN YOON et al., 2006). Változatos mutációk összegzett hatására a betegség által teremtett légúti környezethez nyálka- és biofilm képzéssel könnyen adaptálódik (ERNST et al., 2006). A



identifikálása, éppen gyakori előfordulása miatt, ma már rutin eljárás. Ennek
























ellenére mind a klinikai, mind a környezeti izolátumok pontos, nagy biztonságú identifikálása nehézségeket okozhat. Az izolátumok gyakran mutatnak fenotípusos változékonyságot pigment termelésben, exo-poliszaharid termelésben (nyálkásság), és durva lipo-poliszaharid szintézisben (LYZCAK et al., 2002). A hagyományos tesztek és más fenotípusos fajmeghatározási módszerek ebből kifolyólag esetenként téves identifikációhoz vezethetnek (JOYANES et al., 2001, KISKA et al., 1996, QIN et al., 2003, SAIMAN et al., 2003, SHELLY et al., 2000).

2.6.1.








































azonosítására használatos módszerek

A baktérium kimutatására többféle módszer létezik a gyakorlatban, melyek alapelve szerint három csoportba sorolhatóak. Azonosítás fajspecifikus fenotípusos bélyegek alapján, biokémiai szubsztrátok bontása szerint, ill. molekuláris genetikai módszerekkel. (Doktori értekezésemben a fenotípusos és a biokémiai módszereket gyűjtőnéven „

nek hívom.) A

























































”-

legismertebb fajspecifikus jellemzője a cetrimid tolerancia és a magas

hőmérsékleten (37-42oC-os) való szaporodási képesség. Az első módszercsoport ennek a vizsgálatát használja fel, esetenként más tulajdonságok kimutatásával is kombinálva. A legrégebbi, és talán legismertebb módszer a


























kézikönyv 1981-es kiadásában

is leírt Acetamid-Cetrimid-Glycerol-Mannitol szelektív táptalajon (ACGM agar) történő tenyésztés (MOSSEL & INDACOCHEA, 1971.) A Német Vízminőségi Szabvány (DIN EN 12780:2002) első lépésben a vízminta membránfiltrációját, majd a szűrőmembrán inkubálását írja elő Merck CN agaron. A zöldes-kék 32

pyocianint termelő telepek tekinthetők azonnal


























-nak, a színtelenül fluoreszkáló

telepeket tovább oltják acetamid tápoldatba, amiben ammónia-termelést vizsgálnak az eredmény megerősítéseként. Ha a CN lemezen nem kékes-zöld, hanem vöröses-barna telepek nőnek, akkor azokat továbboltják nutrient agarra, majd az inkubáció után kinövő telepeken oxidáz-tesztet végeznek, és az oxidáz pozitív izolátumokat ismét tovább oltják King’s B táptalajra. A King’s B táptalajon felnövő fluoreszkáló telepeket ebben az esetben is tovább oltják acetamid tápoldatba, és ammónia-termelést vizsgálnak az eredmény megerősítéseként. A vizsgálatban pozitívnak talált telepek számlálása a szűrőpapíron adja a minta


























számát.

Az amerikai szabvány (APHA 9213 F) az Magyar Szabványhoz (MSZ 21470-77:1988) hasonlóan a vízminták hígításaival aszparaginos dúsítást ír elő, majd a kémcsövek UV fénnyel végzett, sötét szobában történő átvilágítása után a zöld fluoreszcenciát mutató tenyészeteket acetamid tápoldatba kell átoltani, és újra inkubálni. Az inkubációs idő alatt jelentkező lila színreakció


























jelenlétére utal az adott hígításban.

A Magyar Szabvány által előírt módszer (MSZ 21470-77:1988) három különböző tápközeget használ fel, három lépésben (aszparaginos dúsítás, cetrimiden tenyésztés, ammónia termelés acetamidból),

melyek hasonló fenotípusos tulajdonságokon alapulnak, mint a fent említett

módszerek. A különböző fenotípusos módszerek lényegesebb tulajdonságait a 6. sz. táblázatban foglaltuk össze. Bár ebben a fejezetben és a 6. sz. táblázatban négy módszer alapelvét, lépéseit tekintem át, munkám tárgyát ezekből csak két módszer képezte (ACGM agaros módszer; MSZ 21470-77:1988). A többi kimutatási eljárás részletes bemutatását az alapelvek hasonlósága, valamint a vizsgálathoz minimálisan szükséges inkubációs idők megismerése miatt tartottam fontosnak, melyek az 5. fejezet (Következtések, javaslatok) szerves részét képezik. Egy másik gyakran használt, biokémiai szubsztrátok bontásán alapuló gyors fajmeghatározási módszer az API 20NE (Biomérieux), mely 21 féle biokémiai reakció profiljából alkalmas Gramnegatív pálcák faj szintű meghatározására. A tesztben felhasznált próbák között a nitrát oxidációja, indol termelés, glükóz, arginin és urea anaerob bontása, ß-glükozidáz, proteáz és ß-galaktozidáz termelés, ezen kívül a glükóz, arabinóz, mannóz, mannitol, N-acetyl-glükózamin, maltóz, glükonát, kaprát, adipát, maláta, citrát és fenil-acetát bontása is szerepelnek. A szubsztrátok bontásából származó biokémiai profil összevetése a megfelelő adatbázissal adja az identifikáció eredményét. Főleg a klinikai gyakorlatban ma már széles körben elterjedt a molekuláris biológiai módszerek alkalmazása patogének fajmeghatározásakor. A legtöbb módszer a riboszómális RNS 16S alegységét kódoló gén univerzális primerekkel végzett PCR amplifikációját, majd szekvencia 33

analízisét, valamint az amplikon restrikciós mintázatának vizsgálatát veszi alapul (TANG et al., 1998, LU et al., 2000).

6. sz. táblázat: Fenotípusos fajmeghatározási módszerek Módszer

Lépés

ACGM agaros módszer

Magyar Szabvány MSZ 21470-77:1988

Német szabvány DIN EN 12780:2002

Amerikai szabvány APHA 9213 F

Táptalaj



-ra
























T

Idő

Színreakció vöröses barna

1.

acetamid-cetrimid-glicerolmannitol táptalaj

42OC

24h

1.

aszparaginos dúsító tápoldat

42OC

48h

O

2.

cetrimid agar

37 C

24h

zöldes-kék

3.

acetamid tápoldat

37OC

24h

vöröses barna

1.

CN táptalaj

36±2OC

44 ± 4h

zöldes-kék

2.

King's B táptalaj (ha szükséges)

36±2OC

≤5nap

fluoreszcencia

3.

acetamid tápoldat

36±2OC

44 ± 4h

vöröses barna

1.

aszparaginos tápoldat

35-37OC

24-48h

zöld fluoreszcencia UV fényben

2.

acetamid tápoldat

35-37OC

24-36h

vöröses barna

Σ Vizsgálati idő











































Létezik módszer, mely szintén a 16S rDNS V2 és V8 variábilis régióit célozva használ specifikus primereket. Ebben az esetben nem szükséges szekvenálás, illetve restrikciós fingerprinting, a megfelelő hosszúságú DNS szakasz amplifikációja már önmagában bizonyítéka a faji hovatartozásnak. Az eredmény drága szekvenáló berendezés és időigényes restrikciós vizsgálatok nélkül, egyszerű agaróz gélelektroforézissel vizsgálható (SPILKER et al., 2004). A módszert az egyszerűség kedvéért a továbbiakban PA-SS PCR technikának rövidítem. Vannak ismert génszakaszok, melyek fajspecifikusak


























tekintetében. Ezen

szakaszok amplifikálása specifikus primerekkel szintén megbízható és gyors fajmeghatározást tesz lehetővé. Gyakori módszer két membránfehérje gén, az az első a fluoreszcens



































és az





az utóbbi pedig



együttes vizsgálata, melyből
































-ra specifikus (DE VOS et

al., 1997). Másik ismert módszer a baktérium patogenitását okozó exotoxin A (ETA) fehérje termelődésért felelős gén jelenlétének vizsgálata, mely szintén egyedi tulajdonság. (GRAY et al., 1984; KHAN & CERNIGLIA, 1994; SONG et al., 2000). Érdekes, szakirodalomban ezt a módszert korábban két különböző szerzőcsoport (KHAN & CERNIGLIA, 1994; SONG et al., 2000) is leírta, ugyanazokat a primereket alkalmazva, ugyanarra az eredetileg leírt bázisszekvenciára és forrásra (GRAY et al., 1984) hivatkozva, mégis különböző eredményeket kaptak. PCR reakcióban ugyanazon primerpár 34

használatával más-más amplikon méretről (ld. 7. sz. táblázat) számolnak be. Az eltéréseket jelen doktori értekezésben korrigáltam, megfelelő vizsgálatokkal alátámasztottam. (Lásd: eredmények fejezetben.) A módszert az egyszerűség kedvéért a továbbiakban ETA PCR technikának rövidítem. Ezen kívül létezik nagy megbízhatóságú, ám komplikáltabb, összetett módszer, amely négy ismert fajspecifikus génszakasz, valamint a kizárólag


























-ra jellemző 16S rDNS

fajspecifikus szekvencia együttes jelenlétét vizsgálja multiplex módon, real-time PCR készülékben (QIN et al., 2003). A bemutatott genetikai módszerek néhány tulajdonságát a 7. sz. táblázatban mutatjuk be.

7. sz. táblázat: Molekuláris biológiai módszerek Primer SRV3-1 SRV3-2 gyrPA-398 gyrPA-620 VIC-1

Célszekvencia 16S rDNS 330-














































398-620














~200-bp

222-bp 520-bp

































PA-SS-R ETA-1































,

330-bp










Vizsgálat célja Baktérium identifikáció PCR-rel és szekvenálással












































































































Referencia LEE et al., 1996

fajspecifikus

QIN et al., 2003








fajspecifikus

DA SILVA FILHO et al., 1999, Wilson et al., 1999








fajspecifikus

DE VOS et al., 1997

fajspecifikus

SPILKER et al., 2004

fajspecifikus

KHAN & CERNIGLIA, 1994

fajspecifikus

SONG et al., 2000

PCR 16S rDNS V2 és V8 régiók















































ETA 1001-1398

956-bp








PCR 396-bp








PCR

ETA-2 ETA-1



PCR

OPR-2 PA-SS-F



PCR

VIC-2 OPR-1



Amplikon mérete

533

azonosítására






















ETA-2












ETA 1001-1398

367-bp








PCR

Bár ebben a fejezetben és a 7. sz. táblázatban hét módszer bemutatását végeztem el, munkám tárgyát ezekből csak két módszer képezte (PA-SS PCR; ETA PCR). A többi molekuláris genetikai eljárás áttekintését csak a rendelkezésre álló technikák széleskörűségének érzékeltetése céljából tartottam indokoltnak.

35

3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1.

Bioaugmentációs célra használt törzsgyűjtemény bemutatása

3.1.1. A törzsgyűjtemény származása Az Agruniver Holding Kft. tulajdonában áll egy 5 baktérium törzsből álló gyűjtemény, melyet évek óta használnak bioaugmentációs technológiák gyakorlati, terepi kivitelezésére. A törzseket mind olyan kárhelyekről származó talajmintákból izolálták, melyek huzamosabb ideje ki voltak téve jelentősebb szénhidrogén szennyezettségnek. A törzsek izolálása több lépcsős, szénhidrogén tartalmú tápközegben végzett szelekciós nyomáson keresztül történt (SZOBOSZLAY, 2003). A törzsek szelekciójának és izolálásának vázlatos lépéseit a 3. sz. ábrán mutatom be.

17 db talajminta szelekciós

nyomás

129 db szénhidrogén-bontó/toleráns izolátum

66 izolátum patogénekre szelektív táptalajon szaporodik

65 feltételezhetően nem patogén izolátum

bontási

kísérletek

23 izolátum 30%-nál nagyobb szénhidrogén-bontó képességgel

részletes

biodegradációs vizsgálatok

Bioaugmentációra alkalmas törzsgyűjtemény 5 nem patogén izolátum, ismert szénhidrogénbontó képességgel

3. sz. ábra: Bioaugmentációs célra alkalmas mikroszervezetek szelekciója 36

A törzsek szelekciójában, izolálásában, szénhidrogén-bontó képességük vizsgálatában én is részt vettem, de ezek az eredmények nem képezik a jelen doktori értekezés tárgyát. Mivel a törzsgyűjtemény vizsgálataim anyagát képezi, ezért annak ismert tulajdonságait az „Anyag és módszer” fejezetben mutatom be.

3.1.2. A törzsgyűjtemény ismert tulajdonságai A gyűjtemény tagjainak biodegradációs képességét, valamint egyéni n-alkán-bontó képességét már egy korábbi munka során meghatározták (SZOBOSZLAY, 2003). Akkor ezeket a törzseket, fenotípusos tulajdonságaik alapján, hagyományos módszerekkel faj szinten identifikálták. A törzsek néhány ismert tulajdonságát a 8. sz. táblázatban mutatom be. 8. sz. táblázat: Bioaugmentációs törzsgyűjtemény tagjainak néhány korábban meghatározott tulajdonsága Faj szintű besorolás (hagyományos identifikációs módszerek alapján)

Laborjelzés CHB-15p. CHB-20p. AK-35 AK-37 AK-40












































































































































































































































Biodegradációs képesség 81% 73% 55% 63% 58%

3.2. Bioaugmentációs célra használt törzsek 16S rRNS gén szekvencia vizsgálata Az izolátumok faj szintű identifikációját 16S rDNS részleges szekvencia analízis alapján végeztük a következők szerint.

3.2.1. DNS izolálás tiszta tenyészetből A DNS izolálást a törzsek tiszta tenyészeteinek felhasználásával, QBiogene (6540-400) FastDNA kittel végeztük a gyártó (QBiogene) instrukciói alapján.

3.2.2. PCR reakció A kívánt DNS szakasz amplifikációjához két, egyenként 20-bp hosszúságú primert, az BSF8/20-at

(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)

és

az

BSR1541/20-at

(5’-

AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’) használtunk. A PCR reakciót 0,2 ml térfogatú Eppendorf csövekben végeztük. A reakció keverékek összetétele a következő volt: 5,0 µl 10x PCR puffer 37

(Finnzymes F-511), 1,0 µl 10mM dNTP mix (Finnzymes F-560), 0,5 µl BSF8/20 (100pM), 0,5 µl BSR1541/20 (100 pM), 2 µl templát DNS, 1,0 µl polimeráz enzim (Finnzymes F-501 DyNAzyme II) és 40 µl nukleázmentes víz volt. A PCR reakciót az alábbi körülmények között végeztük: preinkubáció: 95°C-on 2 percig. 30 ciklus: denaturáció 94°C-on 1 percig, primer feltapadás 53°C-on 1 percig, DNS szintézis 72°C-on 2:30 percig ciklusonként. Az utolsó ciklus után 7 perc terminális extenzió következett 72°C-on. A PCR termékek értékelését horizontális agaróz-gél elektroforézissel végeztük, 1x TBE puffer közegben (1x TBE puffer: 10,8 g Tris, 10,5 g bórsav, 0,93 g EDTA-Na, 1000 ml desztillált vízben, pH 8,3), 1%-os agaróz gélen (1 g agaróz, 100 ml 1 x TBE puffer, 40 µl 1mg/ml-es ethidium-bromid oldat) és 100 mV-os feszültség mellett. A futtatott minták 10 µl DNS izolátumot és 2 µl STOP kék puffer oldatot (18,6 g EDTA, 20 g sarcosyl, 600 ml glicerin, 0,5 g brómfenolkék, 1000 ml desztillált víz) tartalmaztak.

3.2.3. Részleges/teljes 16S rDNS szekvencia analízis A közvetlen bázis szekvencia meghatározás Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied-Biosystem / Perkin-Elmer) alkalmazásával, ABI Prism 310 genetic analyzer készülékkel történt. Szekvenáló primernek az 519r (5' G(T/A)ATTACCGCGGC(T/G)GCTG 3') primert használtuk.

3.2.4. Szekvencia hasonlóság elemzés Az eredmény szekvenciákat az NCBI GenBank adatbázisához hasonlítottuk (NCBI GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ ) a BLAST algoritmus alapján (ALTSCHUL et al., 1997). Ha az adatbázisban található hasonló szekvencia, mely egy már leírt baktériumfaj 16S rDNS bázissorrendjére jellemző, és a vizsgált törzsünkkel mutatott homológia mértéke meghaladja a 98%ot, az esetben a vizsgált törzs ugyanahhoz a fajhoz tartozik.

3.3. Új baktériumfaj leírásához szükséges vizsgálatok 3.3.1. Filogenetikus vizsgálatok A 16S rRNS gén PCR amplifikációjához a BSF8/20 és BSR1541/20 univerzális primereket használtunk (WANG













2006), majd a PCR terméket GFX PCR DNA Gel Band PurificATION 38

Kit

(Amersham

Biosciences)

segítségével

izoláltuk.

A

16S

rDNS

bázissorrendjének

meghatározásához a szekvenáló templátként közvetlenül az amplikont használtuk. A szekvenáló PCR reakciót a szintén a BSF8/20 és a BSR1541/20 primerekkel végeztük (WANG











, 2006),

majd a szekvencia meghatározása ABI 3100 (Applied Biosístems) szekvenáló berendezésben történt. Az eredmény szekvenciákat az NCBI GenBank adatbázisához hasonlítottuk (NCBI, GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ ) többszörös szekvencia-hasonlóság elemzéssel a BLAST algoritmus alapján (ALTSCHUL et al., 1997). Az új faj rendszertani elhelyezéséhez filogenetikus törzsfát készítettünk a MEGA4 (TAMURA











, 2007) szoftver segítségével. A

szoftver három algoritmust vesz alapul a törzsfa generálásához. Két távolság alapú módszert, a „neighbour-joining” (nincs megfelelő magyar fordítás) (SAITOU & NEI, 1987), és a „minimumevolution” (RZHETSKY & NEI, 1992) algoritmus, és egy karakter alapú módszert, a „maximumparsimony”, vagyis „legnagyobb takarékosság” algoritmust (SWOFFORD, 1993). Az evolúciós távolságot JUKES és CANTOR (1969) módszere szerint kalkulálja.

3.3.2. Fenotípusos vizsgálatok A Gram reakciót GERHARDT és mtsai (1994) által leírtak szerint végeztük. A sejtmorfológiát 4 napos, 28 °C-on, TGE agaron inkubált tenyészeteken vizsgáltuk. A flexirubin típusú pigmenttermelődést KOH oldattal vizsgáltuk BERNARDET és mtsai (2002) leírása szerint. A kataláz teszt 3% (v/v) –os hidrogén peroxid oldat felhasználásával történt (BARROW & FELTHAM, 1993). Az oxidáz tesztet 1%-os



-aminometilalanin-oxalát oldattal végeztük (BARROW & FELTHAM,

1993). A keményítő hidrolízisét keményítő agaron (Difco) vizsgáltuk (BARROW & FELTHAM, 1993). Szénhidrátokból történő savtermelést BARROW és FELTHAM (1993) útmutatásai alapján végeztük. A növekedés hőmérsékleti tartományát és optimumát 7 napos tenyészeteken, nutrient táplevesben végeztük 5, 28, 30, 37 és 42 °C inkubációs hőmérséklet mellett (BARROW & FELTHAM, 1993). A pH (6,0-10,0; 0,5 léptékkel) és NaCl (0-5%; 0,5 %-os léptékkel) hatását a növekedésre nutrient tápoldatban végeztük (BARROW & FELTHAM, 1993). Az tápoldatok pH értékét CHERN és mtsai-nak (2004) leírása szerint állítottuk be. Standard protokollokat alkalmaztunk ureáz jelenlétének, fenilalanin-deamináz- és

-

galaktozidáz aktivitás, nitrát- és nitrit redukció, valamint keményítő, tirozin és Tween 80 hidrolízisének

tesztelésére

(BARROW

&

FELTHAM,

1993).

Különböző

szubsztrátok

szénforrásként történő hasznosítását, valamint enzimaktivitási vizsgálatokat API 20E, API 20NE és 39

API ZYM tesztekkel végeztük. A szénhidrátokból történő savképzést (L-arabinóz, fruktóz, laktóz, maltóz, mannitol, trehalóz és D-xilóz) BARROW & FELTHAM (1993) leírásai szerint végeztük.

3.3.3. Elektronmikroszkópos felvétel készítése A vizsgálatokhoz a CHB-20p, valamint referencia törzsként a LMG 13343T,




















DSMZ 14219T és










































































DSMZ 15235T törzseket 5ml TGE és

LB tápoldatokba oltottuk, majd 28 ºC-on 10 napig inkubáltuk, 220 rpm aeráció mellett. (A TGE tápleves összetétele: 5,0 g tripton; 2,5 g élsztőkivonat; 1,0 g glükóz; 1000 ml desztillált víz, pH=7,2; sterilezés autoklávban, 121 oC-on, 1 bar túlnyomáson, 20 percig.

Az LB tápleves

összetétele: 10,0 g tripton; 5,0 g élsztőkivonat; 10,0 g NaCl; 1000 ml desztillált víz, pH= 7,5; sterilezés autoklávban, 121 oC-on, 1 bar túlnyomáson, 20 percig.) A mintákból 1, 2, 5, 10 nap után 5-5 µl szuszpenziót carbon aktív rétegű formvar gridekre csöppentettünk. A negatív festési technikát BOZZOLA & RUSSELL (1991) szerint végeztük. A mintákat óvatosan beszárítottuk, majd a negatív festéshez 1% uranil-acetáttal kezeltük azokat. Az elkészítet preparátumokat Zeiss EM 910 elektronmikroszkóppal, 40kV gyorsító feszültségen vizsgáltuk. A képszerkesztéshez és analízishez a Soft Imaging System SIS pro 3.1 szoftverét használtuk.

3.3.4. Sejtmembrán-zsírsav analízis A CHB-20p. törzs sejtmembrán-zsírsav analízisét a DSMZ-vel (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) együttműködésben végeztük el a következők szerint. Agar-lemezre szélesztett sejttenyészetből felvett 40 mg biomasszából történt a zsírsav-metilészterek kinyerése szaponifikálással, metilációval és extrakcióval a MILLER (1982) valamint a KUYKENDALL és mtsai (1988) által leírtak szerint. A zsírsav-metil-észtereket Sherlock Microbial Identification System (MIS) használatával különítettük el, mely egy Agilent 9890N típusú gázkromatográfból, egy 5%-os fenil-metil szilikát kapilláris kolonnából (0,2 mm x 25 m), egy lángionizációs detektorból, egy Agilent 7683A típusú automata mintaadagolóból és egy MIDI (MIDI, Microbial ID, Newark, DE 19711 U.S.A.) adatbázissal ellátott számítógépből tevődik össze. A rendszer a gázkromatogram csúcsokat automatikusan integrálja, a MIS Standard Software (Microbial ID) pedig automatikusan hozzárendeli az adott zsírsavkomponens nevét valamint százalékos arányát. A gázkromatográfiás mérés paraméterei a következők voltak: nagy tisztaságú hidrogén, mint vivőgáz, 60 kPa kolonna nyomás, 2 µl bemért minta mennyiség, 1:100 kolonna split arány, 5 ml szeptum purge, 170-270°C kolonna-hőmérséklet 5°C/min hőváltozás mellett, 240°C 40

injektáló port hőmérséklet és 300°C detektor hőmérséklet (KÄMPFER & KROPPENSTEDT, 1996).

3.3.5. Respiratórikus kinon analízis A CHB-20p. törzs respiratórikus kinon és lipokinon analízisét DSMZ-vel (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) együttműködésben végeztük el a következők szerint. A respiratórikus lipokinonok elválasztása 100 mg fagyasztva szárított biomasszából, a respiratórikus kinonok elválasztása pedig metanol-hexán keverékkel történt a TINDALL (1990a; 1990b) által leírtak szerint. A respiratórikus lipokinonok (menakinonok és ubikinonok) osztályozása szilikagélen (Macherey-Nagel Art. NO. 805 023) kivitelezett vékonyréteg kromatográfiával történt, ahol oldószerként hexán : metil-terc-butiléter 9:1 arányú keveréke szolgált. A vékonyréteg lemezről eltávolításra kerültek a menakinonoknak és ubikinonoknak megfelelő UV elnyelő sávok, majd megtörtént ezek HPLC analízise. A mérést LDC Analytical (Thermo Separation Products) HPLC készülékhez kapcsolt reverz fázisú kolonnán (Macherey-Nagel, 2 mm x 125 mm, 3 µm, RP18) végeztük, eluánsként metanolt használtunk. A respiratórikus lipokinonokat 269 nm hullámhosszon detektáltuk.

3.3.6. Poláris lipidek vizsgálata A CHB-20p. törzs poláris lipidek tartalmának vizsgálatát a DSMZ-vel (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) együttműködésben végeztük el MINNIKIN és mtsai (1979) szerint.

3.3.7. Guanin-citozin arány vizsgálata A CHB-20p. törzs G+C (guanin+ citozin) tartalmának vizsgálatát a DSMZ-vel (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) együttműködésben végeztük el a következők szerint. A DNS-t enzimatikusan emésztettük nukleotid alkotókra, mely alkotókat reverz fázisú HPLC készüléken választottunk el MESBAH











, (1989) útmutatásai szerint. A készülék kalibrálása λ-

fág DNS-t (Sigma) használtunk referenciaként.

41

3.3.8. DNS-DNS hibribizáció CHB-20p. törzs DNS-DNS hibridizációját a DSMZ-vel (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) együttműködésben végeztük el a következők szerint. Referencia törzsként a filogenetikus törzsfán hozzá legközelebb álló





































(DSM 17710) típustörzsét használtuk. A DNS kinyerése a sejtből FRENCH nyomáscella (Thermo Spectronic) segítségével, a DNS tisztítása pedig hidroxi-apatites kromatográfiával történt CASHION és mtsai (1977) útmutatása szerint. A DNS-DNS hibridizáció Peltier-termosztátos 6x6 multicell changer egységgel, valamint szabályozott









hőmérséklet próbával (Varian) felszerelt,

Cary 100 Bio UV/VIS spektrofotométerrel történt, DE LEY és mtsai (1970) leírása alapján, figyelembe véve HUSS és mtsai (1983) módosításait.

3.4. PCR alapú módszer fejlesztése a CHB-20p. törzs környezeti monitoringjához 3.4.1. Fajspecifikus primerek tervezése A 3.2. alfejezetben leírt módon jutottunk hozzá a CHB-20p. törzs 16S rDNS szekvenciájához. A szekvencia ismeretében tervezetünk fajspecifikus primerpárt a gén V2 és V6 hipervariábilis régióira a Primer3 szoftver segítségével. A primerpár optimális feltapadási hőmérsékletét (Ta) Eppendorf Mastercycler ep grádiens PCR készülékben határoztuk meg.

3.4.2. DNS izolálás talajmintákból A talajminták teljes DNS készletét MOBIO PowerSoil DNA Kit (#12888-50) felhasználásával izoláltuk, a gyártó útmutatásai szerint.

3.4.3. Nested PCR A nested PCR módszer első lépésében univerzális primereket (BSF8/20 és BSR1541/20) használtunk, mely a talaj-baktériumpopuláció minden tagjának 16S rRNS génjét amplifikálja. A PCR reakciót 0,2 ml térfogatú Eppendorf csövekben végeztük. A reakció keverékek összetétele a következő volt: 5,0 µl 10x PCR puffer (Finnzymes F-511), 1,0 µl 10mM dNTP mix (Finnzymes F560), 0,5 µl BSF8/20 (100pM), 0,5 µl BSR1541/20 (100 pM), 2 µl templát DNS, 1,0 µl polimeráz enzim (Finnzymes F-501 DyNAzyme II) és 40 µl nukleázmentes víz.

42

A PCR reakciót az alábbi körülmények között végeztük: preinkubáció: 95°C-on 2 percig. 30 ciklus: denaturáció 94°C-on 1 percig, primer feltapadás 53°C-on 1 percig, DNS szintézis 72°C-on 2:30 percig ciklusonként. Az utolsó ciklus után 7 perc terminális extenzió következett 72°C-on. A nested PCR második lépésében az általunk (3.4.1. pontban leírtak szerint) tervezett, fajspecifikus primereket (KEV10 132/F és KEV10 1007/R) használtuk, melyek feltapadási helye az első lépésben amplifikált génszakaszon belül esik. DNS templátként az első reakciókeverék 2 µl-ét használtuk. A PCR reakciót 0,2 ml térfogatú Eppendorf csövekben végeztük. A reakció keverékek összetétele a következő volt: 5,0 µl 10x PCR puffer (Finnzymes F-511), 1,0 µl 10mM dNTP mix (Finnzymes F-560), 0,5 µl KEV10 132/F (5’- CAGATGGCATCATTTGATATTGAA - 3’) (100pM), 0,5 µl KEV10 1007/R (5’- GACAGGTCTGGAAACAGACCCTTC - 3’) (100 pM), 2 µl templát DNS, 1,0 µl polimeráz enzim (Finnzymes F-501 DyNAzyme II) és 40 µl nukleázmentes víz. A PCR reakciót az alábbi körülmények között végeztük: preinkubáció: 95°C-on 2 percig. 30 ciklus: denaturáció 94°C-on 1 percig, primer feltapadás 54°C-on 1 percig, DNS szintézis 72°C-on 2:30 percig ciklusonként. Az utolsó ciklus után 7 perc terminális extenzió következett 72°C-on. A PCR termékek értékelését horizontális agaróz-gél elektroforézissel végeztük, 1x TBE puffer közegben (1x TBE puffer: 10,8 g Tris, 10,5 g bórsav, 0,93 g EDTA-Na, 1000 ml desztillált vízben, pH 8,3), 1%-os agaróz gélen (1 g agaróz, 100 ml 1 x TBE puffer, 40 µl 1mg/ml-es ethidium-bromid oldat) és 100 mV-os feszültség mellett. A futtatott minták 10 µl DNS izolátumot és 2 µl STOP kék puffer oldatot (18,6 g EDTA, 20 g sarcosyl, 600 ml glicerin, 0,5 g brómfenolkék, 1000 ml desztillált víz) tartalmaztak.

3.4.4. Nested PCR módszer érzékenységének tesztelése A módszer érzékenységét, valamint alkalmasságát környezeti monitoring céljára













körülmények teszteltük. Mesterségesen, ismert élő-sejtszámban oltottunk be steril talajt a CHB-20p. baktériummal, majd az így nyert talajmintákon vizsgáltuk a nested PCR módszer érzékenységét, a 3.4.1., 3.4.2. és 3.4.3. pontban leírtak szerint. Az ismert CHB-20p. tartalmú talajmintákat a következők szerint készítettük: A CHB-20p. törzs 24 órás ferde agar tenyészetből készült szuszpenzió 1 ml-ével beoltottunk 250 ml Erlenmeyer lombikban lévő 50 ml TGE-5 tápoldatot (5,0 g tripton; 2,5 g élesztőkivonat; 5,0 g glükóz; 1000 ml desztillált víz, pH = 7,2; sterilezés autoklávban 121 oC-on, 1 bar túlnyomáson, 20 percig), és 72 órán keresztül 28 ± 2 oC-on rázógépen 200/perc fordulaton inkubáltuk. Az így kapott rázott tenyészetből sterilen mintát vettünk és határhígításos (MPN) módszerrel elvégeztük az inokulum 43

élő-sejtszámának meghatározását a vonatkozó Magyar Szabvány (MSZ 448/44-1990) előírásai alapján. Az így előállított tenyészet élő-sejtszáma minden esetben 1 x 109 – 1,5 x 109 CFU/ml tartományban mozgott, tehát jól reprezentálta a 109 CFU/ml nagyságrendi tartományt. A tenyészetből hígítási sort készítettünk (x101, x102… x109), majd a hígításai sor tagjainak 1-1 mlével beoltottunk 10-10 g nagy humusztartalmú, autoklávban sterilezett virágföldet. Ilyen módon 10 db talajmintát készítettünk elő, melyek mindegyike ismert nagyságrendi tartományban (100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 és 109 CFU/g) tartalmazta a CHB-20p. törzset.

3.5.

Pseudomonas aeruginosa azonosítása fenotípusos módszerekkel

3.5.1. Magyar Szabvány által előírt módszer (MSZ 21470-77:1988) 

A vizsgált környezeti mintákból hígítási sort készítünk, majd a hígítások 1-



































K2HPO4 1,0 g,

1 ml-ével beoltjuk a 4 ml aszparaginos tápoldatot (L-aszparagin 3,0 g,

MgSO4ּ7H2O 0,5 g, glicerin 10 ml, desztillált víz 1000 cm3, pH érték: 7,0; sterilezés autoklávban 121±5°C-on, 1 bar túlnyomáson 15 percig.) tartalmazó kémcsöveket. A beoltott aszparaginos dúsítókat 42±2˚C hőmérsékleten 48 óráig inkubáljuk. 


































Az inkubáció alatt szelektíven felszaporodott mikroszervezeteket a











Magyar Szabvány által javasolt receptúra szerint elkészített cetrimid-agar táptalaj (pepton zselatinból 20,0 g, K2SO4 10,0 g, MgCl2 1,4 g, cetrimid 0,3 g, glicerin 10 ml, fibrózus agar 13,0 g, desztillált víz 1000 ml, pH= 7,0 ± 0,2, sterilezés autoklávban 121°C-on, 1 bar túlnyomáson, 20 percig) felszínére szélesztjük, majd 24 órán át, 37°C-on inkubáljuk. 

























































Utolsó lépésben a kékeszöld elszíneződésű, diffúz

pigmentet termelő telepeket oltjuk acetamid tápoldatba (acetamid 1,0 g, NaCl 5,0 g, KH2PO4 2,0 g, MgSO4·7H2O 0,1 g, desztillált víz 1000 ml, pH: 6,8; 2 cm3, sterilezés autoklávban, 121˚C-on, 1 bar túlnyomáson, 10 percig). Az acetamid tápoldatot tartalmazó kémcsöveket újabb 24 órára, 37±1°Con inkubáljuk.


























jelenléte esetén a kémcsövekben az acetamid bontása során ammónia

keletkezik. Az ammónia-termelés Nessler-reagens hozzáadásával ellenőrizhető; amennyiben sárga, barna elszíneződést, és/vagy csapadékképződést tapasztalunk, megállapíthatjuk a


























faj

jelenlétét a vizsgált környezeti mintában. Amennyiben az aszparaginos dúsítók beoltása legalább három párhuzamos hígítási sorral történik, úgy a módszer MPN számítással


























szám

meghatározására is alkalmas. 44

3.5.2.



azonosítás ACGM agaros módszerrel
























Acetamid-Cetrimid-Glycerol-Mannitol (ACGM)

szelektív táptalaj: pepton 2 g,




















K2SO4 10 g, MgCl2 x 6H2O 1,4 g, cetrimid 0,3 g, glicerol 5 ml, D-mannitol 5 g, agar 15 g, desztillált víz 900 ml, pH 7,0 sterilezés autoklávban, 121˚C-on, 1 bar túlnyomáson, 20 percig. Sterilezés után amikor a táptalaj 50°C-ra hűlt, 10 g acetamidot és 12 mg fenol vörös indikátor hozzáadása szükséges 100ml desztillált vízben feloldva, baktériumszűrő membránon sterilezve. Ezen a táptalajon szaporodni képes 











, de csak a




















































































































































és a






ra jellemző tulajdonság a vöröses barna zónával övezett

növekedés 42°C–on (MOSSEL & INDACOCHEA, 1971).

3.5.3. API 20NE teszt Az API 20NE vizsgálatokat a gyártó (BioMérieux) útmutatásai alapján végeztük, majd az eredményeket az APILAB PLUS 3.3.3 szoftver segítségével értékeltük.

3.6.Pseudomonas aeruginosa azonosítása molekuláris biológiai módszerekkel 3.6.1. Exotoxin A gén kimutatása PCR technikával (ETA PCR módszer) 


















































A DNS izolálást QBiogene (6540-400) FastDNA kittel végeztük a gyártó (QBiogene) instrukciói alapján.









































A kívánt DNS szakasz amplifikációjához két, egyenként 24-bp hosszúságú primert, az ETA1-et (5’-GACAACGCCCTCAGCATCACCAGC-3’)

és

az

ETA2-t

(5’-

CGCTGGCCCATTCGCTCCAGCGCT-3’) használtunk. A PCR reakciót 0,2 ml térfogatú Eppendorf csövekben végeztük. A reakció keverékek összetétele a következő volt: 5,0 µl 10x PCR puffer (Finnzymes F-511), 1,0 µl 10mM dNTP mix (Finnzymes F-560), 0,5 µl ETA1 (100pM), 0,5 µl ETA2 (100 pM), 2 µl templát DNS, 1,0 µl polimeráz enzim (Finnzymes F-501 DyNAzyme II) és 40 µl nukleázmentes víz.

45

A PCR reakciót a következő körülmények között végeztük. Preinkubáció: 95°C-on 2 percig. 30 ciklus: denaturáció 94°C-on 1 percig, primer feltapadás 68°C-on 1 percig, DNS szintézis 72°C-on 1 percig ciklusonként. Az utolsó ciklus után 7 perc terminális extenzió következett 72°C-on. A PCR termékek értékelését horizontális agaróz-gél elektroforézissel végeztük, 1x TBE puffer közegben (1x TBE puffer: 10,8 g Tris, 10,5 g bórsav, 0,93 g EDTA-Na, 1000 ml desztillált vízben, pH 8,3), 1%-os agaróz gélen (1 g agaróz, 100 ml 1 x TBE puffer, 40 µl 1mg/ml-es ethidium-bromid oldat) és 100 mV-os feszültség mellett. A futtatott minták 10 µl DNS izolátumot és 2 µl STOP kék puffer oldatot (18,6 g EDTA, 20 g sarcosyl, 600 ml glicerin, 0,5 g brómfenolkék, 1000 ml desztillált víz) tartalmaztak.

























A PCR termék gélből történő visszaizolálása után (Amersham, GFX PCR DNA and gel band purification kit) PvuI enzimmel emésztettük (2,5 µl 10x puffer, 2,5 µl 10x BSA oldat, 1,0 µl PvuI. enzim, 19 µl DNS oldat) 2 órán át, 37°C-on, majd a keletkezett terméket újból agaróz gélen futattuk a korábban leírtak szerint.

3.6.2. 16S rDNS fajspecifikus génszakaszának kimutatása PCR technikával (PA-SS PCR módszer) 


















































A DNS izolálást QBiogene (6540-400) FastDNA kitttel végeztük a gyártó (QBiogene) instrukciói alapján.









































A kívánt DNS szakasz amplifikációjához az egyenként 19-bp hosszú PA-SS-F (5’GGGGGATCTTCGGACCTCA-3’)

és

a

PA-SS-R

(5’-TCCTTAGAGTGCCCACCCG-3’)

primereket használtuk. A reakció keverékek összetétele a következő volt: 5,0 µl 10x PCR puffer (Finnzymes F-511), 1,0 µl 10mM dNTP mix (Finnzymes F-560), 0,5 µl ETA1 (100pM), 0,5 µl ETA2 (100 pM), 2 µl templát DNS, 1,0 µl polimeráz enzim (Finnzymes F-501 DyNAzyme II) és 40 µl nukleázmentes víz. A PCR reakciót a következő körülmények között végeztük. Preinkubáció: 95°C-on 2 percig. 25 ciklus: denaturáció 94°C-on 25 másodpercig, primer feltapadás 58°C-on 40 másodpercig, DNS szintézis 72°C-on 40 másodpercig ciklusonként. Az utolsó ciklus után 1 perc terminális extenzió következett 72°C-on.

46

A PCR termékek értékelését horizontális agaróz-gél elektroforézissel végeztük, 1x TBE puffer közegben (1x TBE puffer: 10,8 g Tris, 10,5 g bórsav, 0,93 g EDTA-Na, 1000 ml desztillált vízben, pH 8,3), 1%-os agaróz gélen (1 g agaróz, 100 ml 1 x TBE puffer, 40 µl 1mg/ml-es ethidium-bromid oldat) és 100 mV-os feszültség mellett. A futtatott minták 10 µl DNS izolátumot és 2 µl STOP kék puffer oldatot (18,6 g EDTA, 20 g sarcosyl, 600 ml glicerin, 0,5 g brómfenolkék, 1000 ml desztillált víz) tartalmaztak.

3.6.3. Két

Részleges/teljes 16S rDNS szekvencia analízis univerzális

primert

(27f:

5'

GAGTTGATCCTGGTCAG

3’,

1525r:

5'

AGAAAGGAGGTGATCCAGCC 3') használtunk a 16S rDNS szekvenciák amplifikálásához (NIKOLAUSZ et al., 2004). A közvetlen bázis szekvencia meghatározás Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied-Biosystem / Perkin-Elmer) alkalmazásával, ABI Prism 310

genetic

analyzer

készülékkel

történt.

Szekvenáló

primernek

az

519r

(5'

G(T/A)ATTACCGCGGC(T/G)GCTG 3') primert használtuk. Az eredmény szekvenciákat az NCBI GenBank adatbázisához hasonlítottuk (NCBI GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ ) a BLAST algoritmus alapján (ALTSCHUL et al., 1997).

47

4. EREDMÉNYEK 4.1 Bioaugmentációs célra használt törzsek identifikálása 4.1.1. A CHB-15p. jelzésű törzs taxonómiai besorolása A 3.2. fejezetben leírtak szerint meghatároztuk a CHB-15p. törzs részleges 16S rDNS szekvenciáját (516 bp). A szekvenciát a 4. sz. ábrán mutatjuk be. CATGCTAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCT GCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCNNGATGCATGTTCTGGGGTGGAAAGTTTTTCG GTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGA GGGCGACCGGCCAATGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCA AGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCACCTGACGAAGCGCAAGTGACG GTAGTGGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTAC TGGGCGTAAAGAGCTCGTATGCGGTTGT

4. sz. ábra: A CHB-15p. törzs részleges (516 bp) 16S rDNS szekvenciája A szekvencia hasonlóság elemzése a GenBank adatbázisával 98%-os hasonlóságot mutatott 














































X-10 jelzésű törzsének hasonló szekvenciájával (GenBank accession

number: EU187499). A módszer irodalmi leírásai alapján kijelenthető, hogy a CHB-15p. jelzésű törzs a



































fajhoz tartozik. (Ezzel megdőlt az a korábbi eredmény, mely a CHB-15p.

baktériumot fenotípusos identifikációs módszerek alapján


















































-nek

határozta meg.)

4.1.2. A CHB-20p. jelzésű törzs taxonómiai besorolása A 3.2. fejezetben leírtak szerint meghatároztuk a CHB-20p. törzs részleges 16S rDNS szekvenciáját (1406 bp). A szekvenciát az 5. sz. ábrán mutatjuk be.

CGCTACCATGCAAGCCGAGCGGTAGAGGTCCTTCGGGACCTTGAGAGCGGCGCACGGGTGCGGAACACGTGTGCAACCTG CCTTTATCTGGGGGATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCCCATAATATATCAGATGGCATCATTTGATATTGAAAAC TCCGGTGGATAGAGATGGGCACGCGCAAGATTAGATAGTTGGTAGGGTAACGGCCTACCAAGTCGATGATCTTTAGGGGG CCTGAGAGGGTGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACA ATGGGTGAGAGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGAAGGACGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTGTACAGGGATAA ACCTTTCCACGTGTGGAAAGCTGAAGGTACTGTACGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGG AGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGGCCTGTAAGTCAGTGGTGAAATCTCATAGC TCAACTATGAAACTGCCATTGATACTGCAGGCCTTGAGTAGATTTGAAGTGGCTGGAATAAGTAGTGTAGCGGTGAAATG CATAGATATTACTTAGAACACCAATTGCGAAGGCAGGTCACTAAGATCTAACTGACGCTGATGGACGAAAGCGTGGGAGC GAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGCTAACTCGTTTTGGGCTTTCGGGCTCAGAGACTAAGCG AAAGTGATAAGTTAGCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGATTATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAGACTTAAATGGGAAATGACAGGTCTGGAAACAGACC CTTCTTCGGACATTTTCCAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAG CGCAACCCCTGTCACTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGGACTCTAGTGAGACTGCCTACGCAAGTAGAGAGGAAGGTGGGG ATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCTTGGGCCACACACGTAATACAATGGCCGGTACAGAGGGCAGCTACACAGC GATGTGATGCAAATCTCGAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGT AATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGTCTGGGGT ACCTGAAGTCGGTGACCGTAACAGGAGCTGCCTAGGGTAAAACAGG

5. sz. ábra: A CHB-20p. törzs részleges (1406 bp) 16S rDNS szekvenciája 48

A szekvencia hasonlóság elemzése a GenBank adatbázisával 97,1 %-os egyezőséget mutatott 



N4T jelzésű törzsének hasonló szekvenciájával (GenBank accession

































number: DQ336714), és 94-97 %-os hasonlóságot a


























nemzetség más tagjaival. Ez

a hasonlóság kevés a CHB-20p. faj szerinti besorolásához, a módszer irodalmi leírásai alapján az viszont kijelenthető, hogy a CHB-20p. jelzésű törzs nem tartozik sem a sem a













































































,










fajhoz, mint ahogy azt korábban fenotípusos identifikációs

módszerek alapján meghatározták. A CHB-20p. pontos fajmeghatározása további vizsgálatokat igényel, melyeket elvégeztünk, eredményeinket pedig a 4.2. fejezetben ismertetjük.

4.1.3. Az AK-35 jelzésű törzs taxonómiai besorolása A 3.2. fejezetben leírtak szerint meghatároztuk az AK-35 törzs részleges 16S rDNS szekvenciáját (1336 bp). A szekvenciát a 6. sz. ábrán mutatjuk be. GCGGTAAGGCCTTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGC CTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCAGGTTGCATGACTGGGTGGAAAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCC GCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACA CTGGGACTGAGACCGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGA CGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAGGACGGTACCTGCAGAAGAA GCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGTT CGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGGAAACCAGCAGCTCAACTGCTGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTG CAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGTCCTGGG CAGTAACTGACGCTGAGGAACGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGG CGCTAGGTGTGGGTTCCTTCCACGGAATCCGTGCCGTGCTAAGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGC TAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTAC CTGGTTTGAATATACCGGAAAGCTGCAGAGATGTGGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAG CTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTACTTATGTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTC GTAAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACA CATGCTACAATGGCCGTACAGAGGCTGCGAGACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGGATCGGG GTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGGAATACGTTCCGGGCCTTG TACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCTTAAC

6. sz. ábra: Az AK-35 törzs részleges (1336 bp) 16S rDNS szekvenciája A szekvencia hasonlóság elemzése a GenBank adatbázisával 98%-os hasonlóságot mutatott 





































Ri81 jelzésű törzsének hasonló szekvenciájával (GenBank accession

number: AM905948.1). A módszer irodalmi leírásai alapján kijelenthető, hogy az AK-35 jelzésű törzs a


























fajhoz tartozik. (Ez megerősíti a korábbi vizsgálatok eredményét, mely

fenotípusos identifikációs módszerek alapján az AK-35 jelzésű mikroszervezetet szintén
























-nak határozta meg.)

49

4.1.4. Az AK-37 jelzésű törzs taxonómiai besorolása A 3.2. fejezetben leírtak szerint meghatároztuk az AK-37 törzs részleges 16S rDNS szekvenciáját (1337 bp). A szekvenciát a 7. sz. ábrán mutatjuk be. CTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGT CTAATACCGGATATGACCTCGGGATGCATGTTCTGGGGTGGAAAGTTTCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTT GTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACAC GGCCCAGACTCCTCGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGAT GACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCACCCATGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGTGGAGAGAAGCACCGGCCAACTAC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTC GCGTCGTCTGTGAAATCCCGCAGCTAACGCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTCGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAA TTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTACTGCGCTG AGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTT TCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCCAACGCATTAACGCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGA ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATG TACGGACGATGCAGAGATGTGGTTTCCCTTGTGGCCGGTAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGACGTGATGTGGGGACTCGCAGGAGACTGCCG GGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGT CGGTACAGAGGGCTGGATACCGTAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGAC CCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGCCTTGTACCACCGCCCGT CACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGAGGGA

7. sz. ábra: Az AK-37 törzs részleges (1337 bp) 16S rDNS szekvenciája A szekvencia hasonlóság elemzése a GenBank adatbázisával 98%-os hasonlóságot mutatott 














































R04 jelzésű törzsének hasonló szekvenciájával (GenBank accession

number: AF459741.1). A módszer irodalmi leírásai alapján kijelenthető, hogy az AK-37 jelzésű törzs a



































fajhoz tartozik. (Ezzel megdőlt az a korábbi eredmény, mely az AK-37

jelzésű mikroszervezetet fenotípusos identifikációs módszerek alapján


























-nak

határozta meg.) 4.1.5. Az AK-40 jelzésű törzs taxonómiai besorolása A 3.2. fejezetben leírtak szerint meghatároztuk az AK-40 törzs részleges 16S rDNS szekvenciáját (1343 bp). A szekvenciát a 8. sz. ábrán mutatjuk be. CTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACT GGGTCTAATACCGGATATGACCTCTTGCTGCATGGTGAGGGGTGGAATTTTTCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCA GCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAG ACACGGCCCAGACCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAG GGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGAAAGTGACGGTACTCAGAAGAAGCACCGGCCAA CTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTT TGTCGCGTCGTCTGTGAAATCCCGCGCTAACTGCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTCGAGTACTGCAGGGGAGACT GGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGAGTACTGAC GCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTG GGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCCAACGCATAAGCCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAA AGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGA CATTACCGGCGACTGCAGAGATGTGGTTTCCCTTGTGGCCGGTAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGT GAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCGCAGGAGA CTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTAC AATGGTCGGTACAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAA CTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATAGTCCCGGGCCTTGTACACACC GCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGAGGGA

8. sz. ábra: Az AK-40 törzs részleges (1343 bp) 16S rDNS szekvenciája 50

A szekvencia hasonlóság elemzése a GenBank adatbázisával 98%-os hasonlóságot mutatott 

















DSM 42341 jelzésű törzsének hasonló szekvenciájával (GenBank

















accession number: X79288.1). A módszer irodalmi leírásai alapján kijelenthető, hogy az AK-40 jelzésű törzs a






















fajhoz tartozik. (Ez megerősíti a korábbi vizsgálatok eredményét,

mely fenotípusos identifikációs módszerek alapján az AK-40 jelzésű mikroszervezetet szintén




















-nak határozta meg.)

ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNY (A 4.1 fejezetben és alfejezeteiben bemutatott eredmények alapján): (1. tézis) Bioaugmentációs célra felhasznált törzsgyűjtemény tagjait korszerű, molekuláris genetikai módszerekkel (16S rRNS gén szekvencia alapján) faj szinten identifikáltuk, 3 törzs rendszertani besorolását megváltoztattuk.

51

4.2 A CHB-20p., mint új baktériumfaj részletes identifikációs vizsgálata 4.2.1. Filogenetikai jellemzés A 4.1. pontban bemutatott, bioaugmentációs célra használt törzsgyűjtemény tagjainak 16S rDNS szekvencia meghatározása után azt tapasztaltuk, hogy a CHB-20p. laborjelzésű baktériumtörzset a szekvencia alapján nem lehet egyetlen ma ismert baktériumfajhoz sem sorolni. A CHB-20p. törzs 16S rDNS szekvenciája a következő volt:

1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381

cgctaccatg cggaacacgt ccccataata acgcgcaaga cctgagaggg gcagtgagga acggccctat ctgaaggtac agggtgcaag cagtggtgaa gatttgaagt ccaattgcga gaacaggatt tcgggctcag atgaaactca atgatacgcg cttcttcgga aggttaagtc tctagtgaga cccttacgtc gatgtgatgc atgaagctgg ccttgtacac acaggagctg

caagccgagc gtgcaacctg tatcagatgg ttagatagtt tgatccccca atattggaca gggttgtaaa tgtacgaata cgttatccgg atctcatagc ggctggaata aggcaggtca agataccctg agactaagcg aaggaattga aggaacctta cattttccaa ctgcaacgag ctgcctacgc ttgggccaca aaatctcgaa aatcgctagt accgcccgtc cctagggtaa

ggtagaggtc cctttatctg catcatttga ggtagggtaa cactggtact atgggtgaga cttcttttgt agcaccggct atttattggg tcaactatga agtagtgtag ctaagatcta gtagtccacg aaagtgataa cgggggcccg ccaagactta ggtgctgcat cgcaacccct aagtagagag cacgtaatac agccggtctc aatcgcgcat aagccatgga aacagg

cttcgggacc ggggatagcc tattgaaaac cggcctacca gagacacgga gcctgatcca acagggataa aactccgtgc tttaaagggt aactgccatt cggtgaaatg actgacgctg ccgtaaacga gttagccacc cacaagcggt aatgggaaat ggttgtcgtc gtcactagtt gaaggtgggg aatggccggt agttcggatt cagccatggc agtctggggt

ttgagagcgg tttcgaaagg tccggtggat agtcgatgat ccagactcct gccatcccgc acctttccac cagcagccgc ccgtaggcgg gatactgcag catagatatt atggacgaaa tgctaactcg tggggagtac ggattatgtg gacaggtctg agctcgtgcc gctaccatta atgacgtcaa acagagggca ggagtctgca gcggtgaata acctgaagtc

cgcacgggtg aagattaata agagatgggc ctttaggggg acgggaggca gtgaaggacg gtgtggaaag ggtaatacgg gcctgtaagt gccttgagta acttagaaca gcgtgggagc ttttgggctt gttcgcaaga gtttaattcg gaaacagacc gtgaggtgtt agttgaggac atcatcacgg gctacacagc actcgactct cgttcccggg ggtgaccgta

Elvégeztem a fenti szekvencia összehasonlítását a GenBank-ban letétbe helyezett 16S rDNS szekvenciákkal a BLAST algoritmus alapján. A kapott eredményeket a 8. sz. táblázatban foglaltam össze. 



A BLAST eredményeiből kitűnik, hogy az izolátum egyértelműen besorolható a nemzetségbe. Pontos rendszertani besorolása a következő:




















Domén:












Törzs:





















Osztály:


















Rend:













;























Család:



































Nemzetség:



































52





















nemzetség többi tagjával

































"





 





























"

















$





























"

 











 





















 







!





















 



 









 



"































"







 



"









#





 '









































 

















"















 



"



"

















"





















"

!















"

!





!



 





















"



!











"

!



























"







 



 



 



 



 



 



 



 



 



 













 



 



 









 



 

"









"



"























 

"

!













#







 



  



    

 

















"







!













 













 



















         













 



   



 



 



     















  











































$

 

































































































 



















































    





  















 























 



 



 



 



  



 



 

 



 

 



 



  



"



"

"





 



 



 



 



 



 



 

 



#







 



 





   



















!









 

 



 

     



 

 





  

                

        





 















 



 





 

















 









!





 





 

















 







 





 

















 







 





 















 

















 







 















 

%

 

 







 







 







 







 







 





 

















 &

#





 



 







 















 #

&





N4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence partial 16S rRNA gene, strain NF 696 partial 16S rRNA gene, type strain DSM 19109T 16S ribosomal RNA gene, partial sequence partial 16S rRNA gene, type strain VR86T 16S ribosomal RNA gene, partial sequence strain H38 16S ribosomal RNA gene, partial sequence strain PSD1-4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence partial 16S rRNA gene, strain P 538/13 strain CC-H3-2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence strain LMG 4025 16S ribosomal RNA gene, partial sequence strain PSD1-4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence partial 16S rRNA gene, type strain DSM 19109T partial 16S rRNA gene, strain LMG 8337 strain K105 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 16S rRNA gene, strain LMG 18212 gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: Gsoil 183 16S rRNA gene, isolate B2 strain 10-60 16S ribosomal RNA, partial sequence partial 16S rRNA gene, strain CCUG 14555 partial 16S rRNA gene, strain LMG 8337 gene for 16S rRNA, partial sequence 16S rRNA gene, strain YIM 47657T partial 16S rRNA gene, type strain VP48 16S rRNA gene, strain LMG 13028 strain K105 16S ribosomal RNA gene, partial sequence partial 16S rRNA gene, type strain CC-TWGS1-8 partial 16S rRNA gene, type strain CC-H3-2 strain CC-H3-2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence strain 10-59 16S ribosomal RNA, partial sequence strain RB-02 16S ribosomal RNA gene, partial sequence strain AT1047 16S ribosomal RNA gene, partial sequence partial 16S rRNA gene, strain LMG 23089T strain CW-H 16S ribosomal RNA gene, partial sequence strain PHA 3-4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence strain R2A10-2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence strain IMCC3228 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 



















 











Találat - letétbe helyezett 16S rDNS szekvencia



DQ336714.1 AM423083.1 AM773820.1 EF554408.1 AM398648.1 AF531766.1 EF204450.1 AY883415.1 AM489611.1 AY315443.2 AY468448 AY883415 AM773820 AM232813.1 EF076759.1 AJ271010.1 AB245372.1 AJ309324.1 DQ314741.1 AM232812 AM232813 AB193101 AM421015 AM159183 AJ271009 EF076759 AJ843132 AJ715377 AY315443 DQ314742 EF077176 AY553294 AM040439 EU121860 AY883416 DQ256729 EF554366






GenBank azonosító



8. sz. táblázat: A CHB-20p. törzs 16S rDNS homológiája a

Homológia

97% 96% 96% 96% 96% 96% 96% 96% 96% 96% 96% 96% 96% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 95% 94% 94% 94% 94% 94%

publikáció megjelenés alatt publikáció megjelenés alatt

publikáció megjelenés alatt

publikáció megjelenés alatt

publikáció megjelenés alatt publikáció megjelenés alatt

publikáció megjelenés alatt

publikáció megjelenés alatt

publikáció megjelenés alatt

publikáció megjelenés alatt

53

Megszerkesztettük a CHB-20p. filogenetikus törzsfáját (ld. 9. sz. ábra). A törzsfa a CHB-20p. taxonómiai helyzetét mutatja a


























nemzetségen tagjaihoz, valamint néhány közeli

rokon nemzetséghez viszonyítva. A törzsfáról jól leolvasható, hogy a legközelebbi rokon fajnak a 



tekinthető.

































x

9. sz. ábra: 16S rRNS gén szekvencia alapján szerkesztett törzsfa, mely a CHB-20p. filogenetikai viszonyát mutatja a


























nemzetség többi tagjával, valamint más nemzetségek

reprezentatív képviselőivel. 54

A nemzetségbe való tartozás taxonómiailag vitathatatlan. A filogenetikai vizsgálatok eredményei felvetik annak a lehetőségét, hogy egy eddig még ismeretlen, le nem írt fajjal állunk szemben. Ahhoz, hogy egyértelműen kijelenthető legyen, a CHB-20p. esetében új fajról van szó, részletes fiziológiai, fenotípusos, enzimatikus, kemotaxonómiai valamint molekuláris genetikai jellemzést kellett adjunk a törzsről. A vizsgálatok eredményeit irodalmi adatok alapján minden esetben összevetettük a nemzetségen belül már leírt és publikált fajok hasonló tulajdonságaival. Ezen vizsgálataink eredményeit a követezőkben ismertetem.

4.2.2. Morfológiai jellemzés A CHB-20p. telepmorfológiáját tekintve, 4-6 mm átmérőjű, kerek, ép szélű, nyálkás felszínű, telepeket képez 48 órás tenyészetben, TGE agaron. Világossárga, flexirubin típusú pigmentet termel (ld. 10. sz. ábra).

Felxirubin pigment festődése 20% KOH hatására

Kerek, ép szélű, világossárga, nyálkás felszínű telepek

10. sz. ábra. A CHB-20p törzs telepmorfológiája TGE agaron, 72 órás tenyészetben.

Az elektronmikroszkópos vizsgálatok szerint a CHB-20p törzs pálcika alakú, 1-1,5 µm hosszú, 0,5-0,9 µm széles, flagellum nélküli sejteket képez mindkét vizsgált táptalajon (TGE, LB),. Ezekben a jellegekben a fiatal és idős tenyészetek nem mutattak különbségeket. Mivel egyik referenciaként használt Chryseobacterium típustörzs esetében sem találtunk flagellumra utaló jeleket (ld. 11. sz. ábra), azt a megállapítást tehetjük, hogy konvencionális táptalajokban

55

(TGE, LB) a Chryseobacterium genusz reprezentánsai csupasz, flagellum nélküli sejteket képeznek, mely tulajdonság kutatásaink szerint a genusz fontos taxonómiai bélyege.

A: CHB-20p, B: 

















DSMZ15235T, C:


















































DSMZ14219T and D:






LMG13343T

11. sz. ábra. A CHB-20p. és a


























referenciatörzsek sejtmorfológiájának

összehasonlítása. 4.2.3. Fiziológiai és fenotípusos jellemzés A kísérletek során megvizsgáltuk a CHB-20p. szaporodását MacConkey agaron és nutrient agaron 5 °C-on, 37 °C-on és 42 °C-on, továbbá nutrient táplevesben 5% NaCl jelenlétében, ureáz, β-galaktozidáz és fenilalanin-deamináz termelését, nitrát- és nitrit redukcióját, Tween 80 és keményítő hidrolízisét, indol és H2S termelését, savképzését L-arabinózból, fruktózból, glicerolból, 56

laktózból, maltózból, mannitolból, trehalózból és D-Xilózból, valamint DNS-ének guanin + citozin tartalmát. A vizsgálatok eredményét a 9. sz. táblázatban mutatom be. 9. sz. táblázat: A CHB-20p. törzs fenotípusos karakterisztikája összevetve a nemzetség más tagjaival 





























































































Faj/törzs: 1, CHB-20p. (saját kísérleti eredmények); 2, (Quan , 2007); 3, (n=2); 4, ; 5, C. indologenes (n=7); 6, ; 7, (n=2); 8, (Kämpfer , (n=11); 10, (Kim , 2005); 11, (Young , 2005); 12, C 2003); 9, (Shen , 2005); 13, (Shimomura , 2005); 14, (n=36; de Beer , (Park , 2006); 16, (Park , 2006); 17, (n=4; de Beer 2005); 15, , 2006); 18, (Gallego , 2006); 19, (Weon , 2006).





























































































































































































































































































































































































































+, Pozitív; W, gyenge pozitív; -, negatív; V, változó; D, késleltetett reakció; NA, nincs elérhető adat. Tulajdonság Pigment termelés Növekedés: MacConkey agar 5 °C 37 °C 42 °C

1

2

+

+

4

5

6

-

+ + -

+ + -

+ + -

+ -

+ + -

Indol termelés H2S termelés Savtermelés: L-arabinóz Fruktóz Glicerol Laktóz Maltóz Mannitol Trehalóz D-Xilóz DNS G+C tartalom (mol%)*

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

-

+ +

+ + -

+ -

-

+ -

+ -

+ -

+ + -

+ + -

+ -

+

-

-

-

-

+

-

V

-

-

-

-

+

-

-

NA

+ + -

+ -

-

+

-

+ -

-

+ -

-

-

NA

NA

-

-

-

NA

NA

NA

NA

+ -

NA

+

-

+ +

+ -

+ +

+ -

+ -

NA

+ +

NA

-

NA

NA

+

+

NA

NA

+

+ -

+ -

-

+ -

+ -

+ -

+ +

-

+ -

+ -

-

+ -

W

+ +

V

+ + +

-

+ + + + + +

+ -

-

+ -

+ + + + -

+

+ + -

+ -

+ -

+ + + + -

37.5

38.2

38.0

33.1

38.5

33.8

34.2

38.8

36.8

36.6

+ -

Növekedés nutrient agaron 5% NaCl jelenlétében Enzim aktivitás Ureáz β-Galaktozidáz + Nitrát redukció Nitrit redukció Fenilalanin-deamináz Tween 80 hidrolízis Keményítő hidrolízis

7

W

3

D

D

18

19

-

W

D

-

+ + -

+

-

-

+ +

NA

NA

+ +

NA

NA

-

+

V

NA

-

+

NA

NA

-

-

+ -

W

-

-

NA

-

NA

NA

+ + + + +

+ -

32.1

33.6

34.3

37.8

NA

-

W

D D

V

+ V

-

-

-

NA

NA

NA

NA

NA

+

NA

W

+ + +

+ -

NA

-

NA

NA

36.6

37.1

28.8

+

NA NA NA NA NA NA

NA NA NA NA NA NA

-

+

*DNS G + C tartalmak a típustörzsekre vonatkoznak.

Az eredményekből kitűnik, hogy a CHB-20p. több lényeges diagnosztikus fenotípusos tulajdonság tekintetében eltér a

















-től. Ezek a tulajdonságok: indol termelés, savképzés

laktózból, trehalózból és D-xilózból, valamint keményítő és Tween 80 hidrolízis.

57

4.2.4. Enzimatikus jellemzés A CHB-20p. törzs enzimatikus jellemzését API ZYM teszt (BioMérieux) segítségével végeztük el. A vizsgálatok eredményeit az 10. sz. táblázatban mutatom be. A vizsgálatok eredményiből jól látszik, hogy a CHB-20p. törzs enzimkészlete 2-Naftil-αDglukopiranozid termelést tekintve egyértelműen különbözik a hozzá filogenetikusan legközelebb álló

faj típustörzsétől (DSM 17710).

















10. sz. táblázat: A CHB-20p. törzs API ZYM profilja összevetve a nemzetség más tagjaival


























Faj/törzs: 1, CHB-20p. (saját kísérleti eredmények); 2, (Quan , 2007); 3, NTCT LMG 8329T; 5, NCTC10796T; 6, LMG 11432T; 4, LMG 13028T; 8, DSM 14219T; 9, LMG 18212T; 10, 4025T; 7, KCTC 12088T; 11, C. formosense LMG 18212T (Young , 2005); 12, ; 13, LMG 22846T (de Beer , 2005); 14, ; 15, ; 16, (Gallego , 2006); 17, (Weon , 2006). 3-10 (2005a). 12, 14, 15 oszlopok eredményei: Park (2006). oszlopok eredményei: Kim

















































































































































































































































































































































































































Minden minta pozitív eredményt adott a következő enzimek termelését tekintve: 2-naftilfoszfát (pH 8.5), 2-naftilcaprilát, L-leucil-2-naftilamid, L-valil-2 naftilamid, 2-naftilfoszfát (pH 5.4) és naftol-AS-BIfoszfát. Minden minta negatív eredményt adott a következő enzimek termelését tekintve: 6-Br-2-naftilαD-mannopiranozid és 6-Br-2-naftil-α-D-galaktopiranozid. +, Pozitív; W, gyenge pozitív; -, negatív; NA, nincs elérhető adat Szubsztrát 2-Naftil butirát 2-Naftil mirisztát L-Cisztil-2-naftilamid -Benzoil-DL-arginin-2-naftilamid -Glutaril-fenilalanin-2-naftilamid 6-Br-2-naftil-α-D-galaktopiranozid 2-Naftil-β-D-galaktopiranozid Naftol-AS-BI-βD-glukoronid 2-Naftil-αD-glukopiranozid 6-Br-2-naftil-βD-glukopiranozid 1-Naftil-N-acetil-βD-glukózaminid 2-Naftil-αL-fukopiranozidáz

1

2

3

+ + + -

+ -

- - - - + - - - - - - - - - - - + + + - + - - - - + - + - - + - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + - - - - - + + + + + + + + - - - - - - - -

NA

+ NA

4

5

6

7

8

9

10 11

+ + + + + -

12

13 14 15

16

17

+ + + + + -

W

+ + -

W

W

+

W

NA

+ + + + -

+ W

+ + + +

+ + + -

-

W

-

+

W

NA

NA

+ + -

W

NA

NA

+

4.2.5. Kemotaxonómiai jellemzés A kemotaxonómiai vizsgálatátok sejtmembrán zsírsav analízisre, a respiratórikus kinonok és respiratórikus lipokinonok, valamint a poláris lipidek analízisre terjedtek ki. A menakinonok közül az MK6 jelent meg többségben, az MK5 komponenst csak nyomokban sikerült kimutatnunk. A


























fajok mindegyikénél az MK6 egyedüli, vagy domináns

menakinonként szerepel. Egyedi tulajdonság azonban az MK5 jelenléte, melyet eddig egyetlen fajnál sem mutattak ki.

58

Poláris lipidek közül foszfatidil-etanolamin (PE), foszfatidil-glycerol (PG), difoszfatidilglycerol (DPG) és foszfatidil-szerin (PS) került kimutatásra, melyek jelenléte több Gram-negatív taxonban is jellemző tulajdonság. Más Chryseobacterium fajokhoz hasonlóan, a domináns zsírsav-metilészterek a CHB-20p esetében is az iso-C15:0 (32%) és az iso-C17:0 3-OH (10.4%) voltak, megerősítve ezzel a nemzetséghez való tartozást. Unikális tulajdonsága azonban, hogy a többi fajhoz képest kiugróan magas arányban tartalmazta a 3. számú főkomponenst (C16:1ω7c and/or iso-C15:0 2OH), mintegy 31,1% arányban. A 3. számú főkomponens 30% körüli jelenléte a CHB-20p törzsön kívül csak a C. caeni és a C. hispanicum esetében tapasztalható. Az összes többi fajból mindössze 10% körüli értékben mutatható ki. A CHB-20p. és a rokon fajok zsírsavösszetételének összehasonlítását a 11. sz. táblázatban mutatom be részletesen. 11. sz. táblázat: A CHB-20p törzs zsírsav összetétele összevetve a nemzetség más tagjaival
























Faj/törzs: 1, CHB-20p.; 2, ; 3, sp. nov. (n=1); 4, (n=1); 5, (n=11); 7, (n=5); 8, (n=45); 9, (n=1); 10, (n=1); 6, (n=1); 11, (n=2); 12, (n=7; de Beer , 2005); 13, (Kim , 2005a); 14, (Quan , 2007), 15, (Park , 2006); 16, (Park , 2006); 17, (n=4; de Beer , 2006); 18, (Gallego , (Weon , 2006). Források: Hugo (2003), Kämpfer (2003), Li (2003) 2006); 19, (2005). and Young





















































































































































































































































































































































































































































































































Az értékek átlag ± szórás formában vannak megadva. Tr, nyomokban (kevesebb, mint 1,0 %); ND, nincs adat. 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13 : 0 iso

3,47

1,0

Tr

3,6

2,8

Tr

Tr

Tr

Tr

ND

Tr

1,1±0,4

1,6

2,6

Tr

Tr

0,9±0,6

2,5

Tr

Unknown, 13.566

Tr

2,6

6,7

Tr

Tr

1,1±0,2

1,2±0,4

2,1±0,7

1,6

1,7

2,9±0,2

1,4±0,3

1,5

2,4

2,3

3,1

Tr

1,0

2,9

15 : 0 iso

31,96

26,4

35,4

52,2

58,5

34,6±2,0

35,4±2,9

34,3±4,9

32,3

29,4

35,0±0,7

41,8±1,4

51,2

39,7

41,8

36,1

38,3±5,0

26,1

40,0

15 : 0 iso 3OH

4,91

3,2

4,3

1,8

2,6

2,9±0,3

2,5±0,1

2,6±0,2

2,7

2,3

2,7±0,1

2,7±0,3

2,0

4,1

2,7

3,1

2,4±5,0

4,0

3,7

15 : 0 anteiso

3,61

4,3

Tr

2,1

3,2

Tr

Tr

Tr

Tr

5,9

Tr

1,7±0,7

1,0

Tr

1,9

1,1

2,7±1,9

3,6

Tr

16 : 0

3,75

13,5

1,3

1,5

1,3

Tr

1,3±0,4

Tr

1,6

1,0

1,2±0,2

1,1±0,4

1,8

Tr

1,4

1,8

1,1±0,2

2,4

Tr

16 : 0 3OH

3,64

6,7

2,6

Tr

Tr

1,2±0,2

1,1±0,1

1,0±0,2

1,4

Tr

1,0±0,1

1,3±0,4

Tr

1,3

1,3

Tr

1,3±0,3

4,4

ND

16 : 0 iso 3OH

ND

ND

1,4

1,1

Tr

ND

ND

ND

Tr

1,3

ND

Tr

Tr

Tr

Tr

Tr

Tr

ND

Tr

Unknown, ECL 16.580

Tr

ND

1,7

1,0

ND

1,6±0,1

1,7±0,1

1,7±0,2

1,3

1,3

1,5±0,1

1,2±0,2

1,0

1,0

1,5

1,4

1,2±0,2

1,9

ND

17 : 0 2OH

Tr

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

Tr

3,0

Tr

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

17 : 0 iso

ND

ND

0,8

2,3

2,0

Tr

1,6±0,6

Tr

1,0

Tr

Tr

Tr

3,0

Tr

Tr

1,1

1,2±0,2

ND

2,9

17 : 0 iso 3OH

10,41

9,8

22,4

10,9

14,1

20,1±1,2

21,8±0,3

19,2±1,8

16,8

14,0

16,3±0,1

15,4±1,8

15,7

19,6

17,7

18,8

16,2±3,1

17,6

21,9

17 : 1 iso

1,69

ND

8,9

4,3

4,8

22,9±1,9

20,2±3,9

24,2±3,1

27,1

25,6

24,8±0,4

19,7±2,3

7,6

11,9

14,6

15,8

18,7±2,8

1,3

11,7

31,07

32,4

13,8

6,5

8,4

12,1±1,3

11,8±0,8

11,1±1,3

9,2

11,2

11,5±0,3

9,1±0,9

8,5

12,4

9,7

11,2

10,8±1,3

26,7

11,0

Zsírsav




3. számú főkomponens

13 14 15 16

17

18 19

*Ismeretlen zsírsav; a számok egyenlő lánchosszúságot jelölnek *Főkomponensnek tekintettük azokat a zsírsavakat, melyeket gázkromatográf nem tudott elválasztani a Microbial Identification System (Microbial ID) szoftver segítségével. A 3. számú főkomponens C16:1ώ7c és / vagy iso-C15:0 2OH komponenseket tartalmaz.

59

4.2.6. DNS-DNS hibridizáció Ahhoz, hogy minden kétséget kizáróan kijelenthessük, hogy a CHB-20p. törzs esetében egy új baktériumfajról van szó, el kellet végezni a CHB-20p. teljes DNS készletének és a legközelebbi „rokona”, a

(DSM 17710) teljes DNS készletének hibridizációját. Ha a két DNS

















homológiája 70% alatti értéket mutat, akkor egyértelműen két külön fajról beszélhetünk. A vizsgáltat eredménye 47,2 %-os homológiát mutatott, ami alapján beigazolódott, hogy a CHB20p. egy eddig még leíratlan, új baktériumfaj, melynek a Chryseobacterium hungaricum nevet adtuk.

4.2.7. Az új baktériumfaj bemutatása Chryseobacterium hungaricum sp. nov. faj leírása 









































(hun.ga’.ri.cum. L. neut. adj. hungaricum from Hungary)

A sejtek aerob, lekerekített végű, nem motilis pálcák, melyek spórát nem termelnek, tápanyagban gazdag táptalajon (TGE, LB) flagellumot nem fejlesztenek. 48 órás tenyészetben a sejtek 1-1,5 x 0,5-0,9 µm méretűek. Gram-negatív baktérium, oxidáz- és kataláz pozitív. TGE és nutrient agaron jól szaporodik, de nem mutat növekedést MacConkey agaron. Kerek, ép szélű telepeket képez, melyek 48 órás inkubáció után nyálkás felszínűvé válnak. Világossárga, flexirubin típusú pigmentet termel. Hőmérséklet igényét tekintve mezofil baktérium, 5-37 °C között képes szaporodni, hőmérséklet optimuma 28 és 30 °C között van. Szaporodásra 6,010,0 pH tartományban képes, pH optimuma 6,5 és 7,5 érték között van. 5% NaCl koncentráció mellett a sejtek nem szaporodnak. Sejtfalában az iso-C15:0 és a C16:1ώ7c/iso-C15:0 2OH zsírsavak vannak jelen legnagyobb arányban. Respiratórikus menakinonok tekintetében az MK-6 dominál, MK-5-öt csak kisebb mennyiségben tartalmaz. A genomiális DNS guanin+citozin tartalma 37,5 mol%. L-arabinózból, fruktózból, glicerolból, maltózból és mannitolból savat nem képez, míg laktóz, trehalóz és D-xilóz hidrolízise esetén savtermelést mutat. Szénforrásként hasznosítani a következő szubsztrátokat képes: glükóz, mannóz és maltóz. Nem képes szénforrásként hasznosítani: arabinóz, mannitol, N-acetil-glukózamin, glukonát, kaprát, adipát, almasav, citrát és fenil-acetát. Indol-termelése és β-glukozidáz aktivitása pozitív, ureáz aktivitása negatív. Nitrátot és nitritet nem redukálja. Az új fajt már saját nevén szerepeltethetjük a


























nemzetség megújult törzsfáján

(ld. 12. sz. ábra).

60

12. sz. ábra: A


























nemzetség megújult filogenetikus törzsfája

ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNY (A 4.2 fejezetben és alfejezeteiben bemutatott eredmények alapján): (2. tézis) A vizsgált törzsgyűjtemény egyik tagja (CHB-20p) filogenetikailag a Chryseobacterium nemzetséghez tartozik, de a nemzetség eddig leírt tagjaitól több lényeges tulajdonságban is elkülönül. Elvégeztük az eddig még ismeretlen, új faj leírását, melynek a Chryseobacterium hungaricum nevet adtuk. Az eredményeket nemzetközi publikációban adtuk közre (SZOBOSZLAY et al., 2008).

61

4.3.

A CHB-20p. törzs fajspecifikus kimutatása környezeti mintából, DNS amplifikációs

módszerrel A




















CHB-20p. 16S RNS génjének V2 és V6 hipervariábilis




















régiójára (a 3.4. fejezetben leírt módon) a következő fajspecifikus primerpárt terveztük: 5’- CAGATGGCATCATTTGATATTGAA - 3’ (24 bp)

-KEV10 132/F

-KEV10 1007/R 5’- GACAGGTCTGGAAACAGACCCTTC - 3’ (24 bp) A primerpár fajspecifikusságát először virtuálisan ellenőriztük. A BLAST módszert alkalmazva összevetettük a primerek szekvenciáit a GenBank adatbázisával. Eredményként azt kaptuk, hogy a két primer szekvenciája együttesen nem található meg az adatbázis egyik szekvenciájában sem. Majd a specifikusságot ellenőriztük a nemzetségen belüli rokon fajokon ( LMG 13343T, 

































































LMG 13343T,










































DSMZ 14219T és






DSMZ 15235T) végzett kontroll PCR reakciókkal. A kontroll reakciók egyikében



sem tapasztaltunk amplifikációt, mely a primerpár specifikusságát támasztja alá. 

genomiális DNS-t használva templátként, valamint a fent leírt primerek



















használatával, 54 ºC primer-feltapadási hőmérséklet (Ta) mellett egy 831-bp hosszúságú amplikont kaptunk 30 ciklusos, standard PCR reakció esetén. A baktérium nagy érzékenységű környezeti kimutatására a nested-PCR módszert találtuk a legalkalmasabbnak. A fajspecifikus PCR reakciót a BSF8/20 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’) és a BSR1541/20 (5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’) univerzális primerek használatával kombinálva
















körülmények között lehetővé vált a





















érzékeny detektálása

talajból. A módszer érzékenységét szemlélteti, hogy a CHB-20p. törzset legalacsonyabb élő sejtszámban (~100 CFU/g) tartalmazó talajmintából is sikeres PCR amplifikációt kaptunk az általunk tervezett primerekkel (ld. 13. sz. ábra).

ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNY (A 4.3 fejezetben bemutatott eredmények alapján): (3. tézis) A Chryseobacterium hungaricum faj „in vitro” fajspecifikus kimutatására alkalmas PCR alapú, gyors, megbízható és érzékeny módszert fejlesztettük,

fajspecifikus

primerek

tervezésével,

és

azok

nested-PCR

reakcióban való alkalmazásával. A módszer „in vivo” biológiai monitoring célokra való felhasználása további teszteléseket igényel. 62

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

900 bp 800 bp 500 bp

831 bp

1: 100 CFU/g; 2: 101 CFU/g; 3: 102 CFU/g; 4: 103 CFU/g; 5: 104 CFU/g; 6: 105 CFU/g; 7: 106 CFU/g; 8: 107 CFU/g; 9: 108 CFU/g; 10: 109 CFU/g. 11, 12, 13, 14: oltatlan talaj (negatív kontroll); 15, 16: pozitív kontroll; GeneRuler Ladder Mix (Fermentas); 18, 19: pozitív kontroll.

13. sz. ábra. CHB-20pT,






















kimutatása talajból nested PCR




















módszerrel

4.4.

Pseudomonas aeruginosa környezeti mintából való kimutatására alkalmas módszerek

kritikai összehasonlítása Annak érdekében, hogy általunk választott öt


























azonosítási módszert össze tudjuk

hasonlítani megbízhatóság, idő- és költséghatékonyság szempontjából, 43 db, szénhidrogénnel szennyezett talajokból származó (saját gyűjtésű) környezeti izolátumot, és egy referencia törzset ( 
























ATCC 27853) vetettünk alá, már korábban publikált vizsgálati eljárásoknak (MOSSEL

& INDACOCHEA, 1971; SPILKER et al., 2004; KHAN & CERNIGLIA, 1994). A környezeti izolátumok szelekciójának egyetlen kritériuma az volt, hogy a talajminta aszparaginos dúsítása után cetrimid agaron növekedést mutatassanak (tehát a vizsgált törzsek nem feltétlenül a


























fajhoz tartoznak). Az így nyert izolátumokon végeztük a módszerek összehasonlítását. A referencia törzs minden módszerrel a várható pozitív eredményt adta. A többi izolátum identifikálási eredményei azonban szórást mutattak.

4.4.1. Azonosítás Magyar Szabvány (MSZ 21470-77:1988) szerint A Magyar Szabvány alkalmazásával a 43 környezeti izolátumból 28-at azonosítottunk
























-nak, míg 15 izolátum negatív eredményt adott. (ld. 12. sz. táblázat).

63



12. sz. táblázat:
























azonosítás eredményei az MSZ 21470-77:1988 útmutatásai szerint

Törzs

Növekedés MSZ által előírt cetrimid agaron 37oC-on

Zöld pigment termelése cetrimid agaron

Ammónia termelése acetamid tápoldatban 37oC-on

MSZ 21470-77:1988 szerint P. aeruginosa

ATCC 27853 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20 P21 P22 P23 P24 P25 P26 P28 P29 P30 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 P39 P40 P41 P42 P43 P44 P45 P46

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + +/+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + +/+ + + + + + + +/+ + + + + + + + + + + + + + + + + + +/+ + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

A negatív eredményt mutató izolátumok közül kettő (P15 és p16) a másik négy vizsgálati módszerrel pozitív eredményt adott (ld. 4.4.2.-4.4.6. fejezetekben).

4.4.2. Azonosítás Acetamid-Cetrimid-Glycerol-Mannitol (ACGM) agaron A 43 környezeti izolátum ACGM szelektív táptalajon való tesztelésekor 28 bizonyult


























nak, míg a maradék 15 nem mutatott növekedést (ld. 13. sz. táblázat). Említésre méltó,

hogy a 15 negatív izolátumból 2 (P37 és P42) pozitív eredményt hozott a másik négy vizsgálati módszerrel tesztelve (ld. 4.4.1. és 4.4.2.-4.4.6. fejezetekben).

64



azonosítás eredményei ACGM szelektív táptalajon



13. sz. táblázat:

























Törzs

Növekedés 42oC-on

Vöröses barna zóna

Identifikáció a The Prokaryotes útmutatása szerint

ATCC 27853 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20 P21 P22 P23 P24 P25 P26 P28 P29 P30 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 P39 P40 P41 P42 P43 P44 P45 P46

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

4.4.3. Azonosítás API 20NE biokémiai fingerprinting módszerrel Az API 20NE vizsgálatok (ld. 3.5.3. fejezet) értékelését APILAB PLUS szoftver segítségével végeztük. A szoftver a teszt eredményeit hasonlítja az adatbázisában szereplő típustörzsek adataihoz. Egy izolátum faji hovatartozását a szoftver különböző konfidencia-szinteken képes megállapítani. Vizsgálatainkban azokat az izolátumokat tekintettük pozitívnak, melyeket a szoftver 




































vagy

szinten határozott meg







































































nak. Ezen

kritériumok alapján 30 izolátum bizonyult pozitívnak, 13 izolátum pedig más gram-negatív fajként került meghatározásra (ld. 14. sz. táblázat). Egy izolátumot (P32) a szoftver 



























konfidencia szinten határozott meg








































-ként, mely eredményt negatívként

értékeltünk. 65

Az adott szubsztráton nincs növekedés: -















 







Identification

















P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa

























P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa















 

































































































P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa











!





























































































































 



































P. aeruginosa



























































































 

















 



















P. aeruginosa P. aeruginosa 











P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa







P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa KÉTSÉGES IDENTIFIKÁCIÓ! (P. aeruginosa) 

OX + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ?



PAC + ? + ? + ? + + + + ? + ? ? ? ? -



CIT + + + + + + + + + + + + ? + + + + + ? + + + + + + + ? + + + + + + + + + + +



MLT + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ? + + + + + + + + + + + ? + + + + + ? + + + + +



ADI + + ? + ? + + + + + + ? ? + + + ? + + + + + + ? + + ? + + + + + + + + + + +



CAP + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +



GNT + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +



MAL ? ? + + ? ? + ? + ? -



NAG + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ? + + + + + + + + + + + + + + + +





Az adott szubsztrát hasznosítása: +

MAN + + + + + + + ? + + + + + + + + + ? + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +



MNE + + + ? ? + + ? ? ? -



ARA + + + ? + + ? + ? + ? ? + + ? ? ? -



GLU + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ? + + + + + + + + + + + + + ? + + + + +













PNG -



GEL + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +



ESC + + -



URE + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ?



ADH + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +



GLU -



TRP + + -

azonosítás eredményei



NO3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ? +





ATCC 27853 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20 P21 P22 P23 P24 P25 P26 P28 P29 P30 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 P39 P40 P41 P42 P43 P44 P45 P46




14. sz. táblázat: API 20NE kittel végzett

P. aeruginosa P. aeruginosa

Nem egyértelmű reakció: ?

66

4.4.4. Azonosítás ETA-PCR módszerrel Az izolátumokat a fenotípusos diagnosztikai módszereken túl molekuláris biológiai technikákkal is megvizsgáltuk. A 43 izolátumból 30 esetében sikerült kimutatnunk PCR módszerrel az exotoxin A toxinfehérjét kódoló gén (ETA) jelenlétét, mely



esetében bizonyítottan
























fajspecifikus bélyeg. A maradék 13 izolátummal nem eredményezett PCR amplifikátumot (ld. 14. sz. ábra). A templátként használt genomiális DNS minták használhatóságának ellenőrzésére a BSF8/20 és a BSR1540/20 primereket használtuk pozitív kontroll reakciókban (Riboszómális DNS Adatbázis, http://www.psb.ugent.be/rRNA/primers/).


























DNS templát esetén egy 397-

bp méretű amplikon volt látható a gélelektroforézis során (14. sz. ábra)

P1

P3

P5

P2

P4

P7 P6

400 300 200 100

P9

P11 P10

P8

P12

P15

P14

P17 P16

P19

P18

P21

P20

P23 P22

397 bp

P24

P26

P25

P29

P28

P31

P30

P32

P32

P35

P34

P36 P38 P40 P42 P44 P46 P37 P39 P41 P42 P43

400 300 200 100

14. sz. ábra:


























azonosítás eredményei ETA PCR módszerrel

Az izolátumok tesztelésén kívül megkíséreltük feloldani a módszer korábban publikált leírásai, valamint a saját tapasztalataink között felfedezhető ellentmondásokat. Az eltérések az amplikon hosszában, - valamint a PCR termék validálására használt restrikciós endonukleáz - a PvuI enzim hasítási helyében, és az emésztett termékek hosszában voltak. Munkánk során a 67

módszert megvizsgáltuk, értékelését pedig többszörös megerősítéssel tisztáztuk. A módszer leírásaiban található különbségeket a 15. sz. táblázatban összegeztem.

15. sz. táblázat: Az ETA gén kimutatását célzó módszer különböző leírásai Amplikon mérete a szerzők szerint

Amplikon emésztése PvuI restrikciós endonukleázzal

ETA-1 (24-bp) ETA-2 (24-bp)

397-bp

134 + 263-bp

KHAN & CERNIGLIA, ETA-1 (24-bp) 1994 ETA-2 (24-bp)

396-bp

150 + 246-bp

ETA-1 (24-bp) ETA-2 (24-bp)

367-bp

Nem vizsgálták

Szerzők

Primer

ATZÉL et al., 2008

SONG et al., 2000

A várt PCR termék hipotézisünk szerint 397-bp méretű, melynek igazolására a PCR terméket a gélből visszaizoláltuk, majd szekvencia-analízisnek vetettük alá. Az így kapott nukleotid szekvencia 100% homológiát mutatott a korábban GRAY és munkatársai (1984) által publikált génszakasszal (15. sz. ábra) Ki kellett zárnunk annak a lehetőségét, hogy általunk használt primerek (ETA1, ETA2) esetleg máshol is képesek feltapadásra, mint az ETA gén. Ennek érdekében a PCR terméket visszaizoláltuk a gélből, majd PvuI restrikciós endonukleázzal emésztettük, majd elvégeztük emésztett termék gélelektroforézisét is. Mindössze egyetlen PvuI hasítási hely található a 14. sz. ábrán bemutatott PCR terméken, melyet szekvencia-analízissel is megerősítettünk. A hasítási pont egy 134-bp és egy 263-bp hosszúságú fragmentre osztja az eredeti 397-bp méretű PCR terméket. ETA1 1

gacaacgccc tcagcatcac cagcgacggc ctgaccatcc gcctcgaagg

51

cggcgtcgag ccgaacaagc cggtgcgcta cagctacacg cgccaggcgc

101 gcggcagttg gtcgctgaac tggctggtac cgat’cggcca cgagaagccc 151 tcgaacatca aggtgttcat ccacgaactg aacgccggca accagctcag 201 ccacatgtcg ccgatctaca ccatcgagat gggcgacgag ttgctggcga 251 agctggcgcg cgatgccacc ttcttcgtca gggcgcacga gagcaacgag 301 atgcagccga cgctcgccat cagccatgcc ggggtcagcg tggtcatggc 351 ccagacccag ccgcgccggg aaaagcgctg gagcgaatgg gccagcg ETA2 „CGAT’CG”: PvuI felismerési hely aláhúzott szakasz: primer feltapadási hely

15. sz. ábra: A 397-bp hosszú PCR termék általam meghatározott bázissorrendje 68

Hipotézisünk igazolására elvégeztük az emésztett DNS szakaszok szekvencia-analízisét is, melynek eredményei megerősítették a teóriánkat. Eszerint, „ETA pozitív” DNS izolátum esetén az ETA1 és ETA2 primer pár egy 397-bp hosszúságú PCR terméket amplifikál, mely termék PvuI enzimmel végzett emésztése során egy 263-bp és egy 134-bp terméket kapunk, mely egyértelműen elkülöníthető a gélen (16. sz. ábra). Ez ellentmond KHAN és CERNIGLIA (1994) korábbi publikációjának, melyben hasonló reakció körülmények között egy 396-bp méretű PCR termékről, valamint 150 és 246-bp hosszúságú hasítási termékekről számolnak be.

1

400 300

2

3

397 bp 263 bp

200 100

134 bp

1: Gene Ruler 3-kb marker, 2: emésztett fragmentek (263+134-bp), 3: Eredeti PCR termék (397-bp)

16. sz. ábra: A 397-bp méretű PCR termék emésztése PvuI restrikciós endonukleázzal

4.4.5. Azonosítás PA-SS PCR módszerrel A 3.6.2. fejezetben leírt módszerrel vizsgálva a 43 környezeti izolátumból 31 bizonyult
























-nak Pozitív reakció esetén egy 956-bp hosszúságú fragment válik láthatóvá a gélen (17.


sz. ábra). Ezek a teszteredmények 100% összhangban álltak az ETA gén kimutatását célzó módszer eredményeivel. Az öt azonosítási módszer eredményeinek összevetését a 16. sz. táblázatban mutatom be. 5 izolátum (P15, P16, P32, P37 és P42) esetében ellentmondások születtek a fenotípusos módszerek eredményei között. A PCR alapú molekuláris biológiai módszerek mind a 43 izolátum esetében egybehangzó eredményt hoztak.

69

P1

P3

P5

P2

P7

P4

P9

P6

P8

P11

P14 P12

P10

P16

P15

P18

P17

P20

P19

P22

P21

P23 1000 900

956-bp

P24

P26

P25

P29

500

P31

P28

P33

P30



P32
















P37 P36

P34

P39

P38

P41 P40

P43

P42

P44

P45 P46

azonosítás eredményei PA-SS PCR módszerrel



17. sz. ábra.

P35







4.4.6. Identifikáció 16S rDNS szekvencia-analízissel Mivel a P15, P16, P32, P37 és P42 jelzésű izolátumok egyes vizsgálati eredményei nem álltak összhangban egymással, ezért elvégeztük ezek 16S rDNS szekvencia-analízisét, mely a faji besorolását minden kétséget kizárólag megerősíti. A szekvenciák >99% -os egyezőséget mutattak különböző



törzsek



































-ban fellelhető szekvenciáival. Ennek alapján

megállapíthatjuk, hogy a P15, P16, P32, P37 és P42 környezeti izolátumok egyértelműen a nevezett fajhoz tartoznak.

4.4.7. A vizsgált azonosítási módszerek eredményeinek összevetése Munkánk során 43 db, különböző kárhelyekről származó, környezeti baktérium izolátumot és egy kontroll törzset ( 
























ATCC 27853) vetettünk alá öt különböző


























kimutatási módszernek. Az öt módszerből három fenotípusos, kettő pedig molekuláris biológiai detektálási módszer. A 43 izolátum közül 5 esetben ellentmondást tapasztaltunk a különböző vizsgálati módszerek eredményeiben. A Magyar Szabvány (MSZ 21470-77:1988) által előírt módszer a P15 és P16 jelzésű izolátum esetében hamis negatív eredményt produkált. Az ACGM agaros módszer szintén két izolátum, a P37 és P42 esetében produkált hamis negatív eredményt. A P32 izolátum az API 20NE identifikációs tesztben szintén fals negatív eredményt adott. A felsorolt ellentmondások miatt 16S rDNS analízist végeztünk a kérdéses izolátumokon, a többségben lévő 70

pozitív azonosítási eredmények megerősítésének céljából. A vizsgált azonosítási módszerek eredményeinek összevetését a 16. sz. táblázaton foglaltam össze.

16. sz. táblázat: A vizsgált



azonosítási módszerek eredményeinek összehasonlítása
























Törzs

MSZ 2147077:1988

ACGM agar

ATCC 27853 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20 P21 P22 P23

+ + + + + + + + + + + + + + -

+ + + + + + + + + + + + + + + + -

API 20NE

ETA PCR

PA-SS PCR

Törzs

MSZ 2147077:1988

ACGM agar

+ + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + -

+ + + + + + + + + + + + + + + + -

P24 P25 P26 P28 P29 P30 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 P39 P40 P41 P42 P43 P44 P45 P46

+ + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + -

+

API 20NE

ETA PCR

PA-SS PCR

+ + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + +

Munkánk célja volt hatékonyság és megbízhatóság szempontjából értékelni és összehasonlítani különböző


























kimutatási módszereket. Minden diagnosztikai módszernek nyilvánvalóan

megvannak a korlátai, és mindegyik magában hordozza a hamis negatív, és/vagy hamis pozitív eredmény kockázatát. Ebből kifolyólag a nagy biztonságú, faj szintű azonosítási módszerek kivitelezése nagy körültekintést igényel. A


























faj nagy fenotípusos variabilitása

(pyocianin termelés, pigmentáció, motilitás, stb.) miatt fennáll a tévedés kockázata a fenotípusos kimutatási módszerek alkalmazásakor. Minden alkalommal, amikor


























kimutatás szükséges, elengedhetetlenül fontos az

identifikáció megerősítése, hiszen a vizsgálatot végző laboratóriumok általában nem végeznek több vizsgálatot párhuzamosan az eredmények kettős ellenőrzésének céljából. Kísérleti eredményeink adatokat szolgáltatnak a módszerek megbízhatóságára vonatkozóan. Az öt módszer által adott helyes azonosítási eredmények arányát a 17. sz. táblázatban szemléltetjük.

71

17. sz. táblázat: A vizsgált


























azonosítási módszerek általadott helyes eredmények

összehasonlítása Vizsgálati módszer

Σ tesztelt izolátum

Fals negatív eredmények

Helyes azonosítások aránya

Magyar Szabvány 43

2

95,34%

ACGM agaros módszer

43

2

95,34%

API 20NE

43

1

97,67%

43

0

100%

43

0

100%

MSZ 21470-77:1988

Exotoxin A gén kimutatás (ETA PCR) 16S rDNS V2 & V8 alegység kimutatás (PA-SS PCR)

Az azonosítási protokollok időigényét tekintve a Magyar Szabvány (MSZ 21470-77:1988) által előírt módszer 96 órát, az API 20NE teszt 72 órát, az ACGM agaros vizsgálat pedig 24 órát vesz igénybe. Ezzel szemben a vizsgált PCR technikák a talaj- vagy talajvíz-mintából történő DNS izolálással együtt is kivitelezhetőek 12 óra alatt (egy munkanapon belül). A vizsgált kimutatási módszerek részletes kritikai elemzését és a saját eredményeinkből fogalmazott következtetéseimet az 5. fejezetben mutatom be. Munkánk során emellett felülvizsgáltuk az exotoxin A (ETA) gén kimutatását célzó PCR technikát, melyet korábban ellentmondásosan publikáltak (KHAN & CERNIGLIA, 1994, SONG et al., 2000). A vonatkozó vizsgálatok eredményei igazolták feltevésünket, miszerint az ETA1 és ETA2 primerek az exotoxin A gén egy 397-bp hosszúságú szakaszát amplifikálják. A PCR termék egyetlen PvuI restrikciós pontot tartalmaz, mely pont egy 263-bp és egy 134-bp hosszúságú alegységre osztja az amplikont. Feltevésünket GRAY és munkatársainak (1984) eredményei is alátámasztják, akik első ízben publikálták a nevezett gén teljes szekvenciáját.

ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNY(EK) (A 4.4 fejezetben és alfejezeteiben bemutatott eredmények alapján): (4.

tézis)

Öt

különböző,

Pseudomonas

aeruginosa

kimutatására

és

azonosítására általánosan használt módszert, 43 környezeti izolátumon összehasonlítva megállapítottuk a fenotípusos és a molekuláris biológiai módszerek előnyeit és hátrányait, alkalmazásukat alátámasztó és korlátozó

72

tényezőket. Az eredményeket nemzetközi publikációban adtuk közre (ATZÉL et al., 2008).

(5. tézis) Az eredetileg leírt, Pseudomonas aeruginosa-ra nézve fajspecifikus exotoxin A gén kimutatását célzó módszer kiértékelését módosítottuk. Megállapítottuk, hogy az ETA1 és az ETA2 primerekkel megsokszorozott génszakasz 397-bp hosszú. Ezt a génszakaszt a PvuI restrikciós endonukleáz enzim egy 134 és 263-bp hosszú fragmentre osztja. Az eredményeket nemzetközi publikációban adtuk közre (ATZÉL et al., 2008).

73

5. KÖVETKEZTETÉSEK, JAVASLATOK Az általunk vizsgált bioaugmentációs törzsgyűjtemény identifikációjának felülvizsgálata megtörtént, ezáltal a készítmény engedélyezetésének minden feltétele teljesült. Az eredmények azonban több érdekes következtetés levonását is lehetővé tették. 16S rRNS gén szekvenciájuk alapján az öt baktériumtörzsből háromnak más volt a faji besorolása, mint azt korábban fenotípusos jegyek alapján meghatározták. A baktériumok bizonyos fiziológiai, fenotípusos, enzimatikus vagy morfológiai bélyegei egyes esetekben elegendőek a pontos faj szerinti besoroláshoz, korábban

ezek a tulajdonságok képezték a mikroszervezetek klasszikus

rendszertanának alapjait. Azonban - amint azt vizsgálataink is bebizonyították – bizonyos esetekben a fajok közötti különbségek csak nukleotid szinten mutatkoznak meg egyértelműen, ennek következtében kizárólag hagyományos módszerek alkalmazásával nem mutathatóak ki. Ma már több olyan molekuláris biológiai módszer is ismert, melyek kombinált alkalmazása a hagyományos identifikációs eljárásokkal, a legnagyobb biztonsággal alkalmas egy ismeretlen izolátum pontos, faj szintű meghatározására. Kiemelten javasolom a dolgozatban felhasznált módszerek kombinált alkalmazását olyan esetekben, amikor az identifikáció eredményén (mint a mi esetünkben is) egy biológiai készítmény engedélyezése, vagy esetleg egy helyes klinikai diagnózis múlik. Ezen kívül, a fenotípusos módszerek kizárólagos alkalmazásával, mint az a CHB-20p törzs esetében is egyértelműen látszik, eddig még ismeretlen, új fajok maradhatnak felfedezetlenül, hiszen fenotípusos bélyegei alapján a hagyományos identifikációs rendszerek nagy eséllyel azonosítják – tévesen – egy már ismert, az adatbázisban szereplő baktériumfajjal. Doktori értekezésem egyik fő eredménye egy új baktériumfaj felfedezése volt. Az általunk leírt Chryseobacterium hungaricum CHB-20pT minden kétséget kizáróan új faj, melynek létezésével mostantól mindenképpen számolni kell a baktériumok összehasonlító rendszertanában. Ezen túl a már említett törzsgyűjtemény tagjaként alkalmas bioaugmentációs eljárások kivitelezésre. Kiegészíti a korábbi szakirodalmi adatokat a faj szénhidrogén-bontó képessége, mivel hasonló tulajdonságról a





nemzetségen belül egyik fajleíró publikáció sem számol






















be. Javaslom a nemzetség más tagjainak, bioaugmentációs célra való értékmérését, tesztelését. Felderítettünk továbbá a nemzetségen belül egy fajcsoportot ( 






















































és






) mely a 3. számú zsírsav-főkomponens (C16:1ώ7c/iso-C15:0 2OH és/vagy iso-C17:0 3OH)

tekintetében eltér az eddig leírt


























fajoktól.

74

Bár egyes Chryseobacterium fajok tápanyagban szegény táptalajon flagellumot fejlesztenek, saját vizsgálataink alapján arra következtetésre jutottunk, hogy a sejtfüggelékek hiánya gazdag táptalajon a nemzetség fontos taxonómiai bélyege. Az általunk tervezett fajspecifikus primerek nested-PCR reakcióban alkalmasnak bizonyultak a Chryseobacterium hungaricum faj talajból történő „in vitro” kimutatására. Javaslom a módszer „in vivo” biológiai monitoring célokra való felhasználásának további tesztelését. Érdemes lenne továbbá, hasonló módon a CHB-20p-hez, a bioaugmentációs törzsgyűjtemény minden egyes tagjához fajspecifikus nested PCR módszert tervezni, és azokat „ 











” tesztelni. Ezáltal a törzsgyűjtemény minden tagjának biológiai monitoringja elérhetővé

válna. Kutatásaim során, saját kísérleteken alapuló, a Pseudomonas aeruginosa baktérium környezeti kimutatására alkalmas módszerek megbízhatóságára és alkalmazhatóságára irányuló összehasonlító elemzést végeztünk. Vizsgálati eredményeink fényében megállapítottuk a fenotípusos és a molekuláris biológiai módszerek előnyeit és hátrányait, alkalmazásukat alátámasztó és korlátozó tényezőket. A PCR alapú technikáknak több előnye is van a hagyományos, tenyésztéses módszerekkel szemben. Nagyobb érzékenységgel alkalmasak mikroorganizmusok kimutatására, függetlenül azok élettani fázisától, fiziológiai állapotától. A PCR körülményeinek laboratóriumi optimalizálása után egy környezeti mintából könnyen és gyorsan lehet diagnosztikai eredményhez jutni akár 24 órán belül is, szemben a tenyésztéses módszerekkel, melyek több napot, vagy akár egy hetet is igénybe vehetnek. A DNS alapú technikáknak azonban hátrányai is vannak. A módszer nem tud különbséget tenni a tekintetben, hogy a minta DNS tartalma életképes, vagy már elpusztult sejtekből származik. Az elpusztult baktériumsejtből kikerült DNS ugyanis még hosszú ideig megmaradhat a talajban, talajvízben. Ilyen módon fennáll a lehetősége, hogy a PCR pozitív eredménye ellenére a minta valójában nem tartalmazza a keresett baktérium egyetlen élő sejtjét sem. Fals pozitív reakciót könnyen okozhat ezen felül még a reakcióközeg DNS kontaminációja is. További hátránya ezeknek a módszereknek, hogy a környezeti mintában jelenlévő humuszanyagok, ill. fémek hatására a reakció gátlást szenvedhet. A DNS izolálás ezért környezeti mintából különös körültekintést, és jól megválasztott protokollt igényel. Mindezen hátrányok ellenére a PCR olyan lehetőségeket nyitott a környezeti mikrobiológia előtt, melyek korábban elképzelhetetlenek voltak. Ha sikerül a jövőben elérni a PCR és a hagyományos technikák együttes alkalmazásának széleskörű elfogadottságát, akkor ezek kombinált használata a környezeti mikrobiológia fontos kérdéseinek gyors megoldásához vezet majd.

75

A vizsgált módszercsoportok alkalmazhatóságára vonatkozó következtetéseimet a 18. táblázatban foglaltam össze:

18. sz. táblázat: Az általunk vizsgált


























azonosítási módszerek előnyei és hátrányai

Előnyök Fenotípusos (és biokémiai) -egyszerű kivitelezés módszerek

-szokványos, egyszerű laborhátteret igényel

Molekuláris biológiai

-fals negatív eredmény kockázata -időigényes

-fals pozitív eredmény kockázata

-gyors

módszerek

Hátrányok

-érzékeny

-műszerezett, költségesebb laborhátteret igényel

A kérdéskörben megfogalmazott javaslatom: a jövőben a környezeti baktérium kimutatási módszereknek érdemes lenne az RNS alapú technikák felé fordulnia. Az RNS molekula felezési ideje ugyanis lényegesen rövidebb, mint a DNS-é, tehát a sejtből kikerülve az élettartama órákban mérhető. RNS molekula amplifikációjával kiküszöbölhető lenne az esetleges fals pozitív reakció, melyet az életképtelen sejtekből származó DNS okozhat. Annak ellenére, hogy a molekuláris biológiai technikák előnyeit régóta vizsgálják baktériumok kimutatása esetén, a világ legtöbb országban az állami szabályozás hagyományos fenotípusos módszereket standardizál P. aeruginosa környezeti izolálására és azonosítására. Többek között az USA-ban az APHA Standard Method 9213F, ugyanúgy az Európai Unióban a Német Vízminőségi Szabvány DIN EN 12780:2002, és hazánkban is a már említett Magyar Szabvány (MSZ 21470-77:1988). Figyelembe véve eredményeimet és más korábbi hasonló témájú publikációkat (WELLINGHAUSEN et al., 2005) kétségtelen, hogy ezek a szabványok felülvizsgálatra szorulnak. Legvégül pedig, a


























azonosítására használt, korábban hibásan leírt exotoxin A gén

kimutatási módszerének kiértékelésén végzett korrekcióinkat ajánlanám olyan szakmai műhelyek figyelmébe, melyek ma is rutinszerűen alkalmazzák ezt az eljárást a nevezett faj kimutatására.

76

6. ÖSSZEFOGLALÁS Szénhidrogén szennyezések kármentesítésére ma már elterjedten használnak bioremediációs, azon belül is bioaugmentációs módszereket. Ezek terepi alkalmazásánál a technológia hatékonysága és biológiai biztonsága csak megfelelően megtervezett és kivitelezett biológiai monitoringon keresztül ellenőrizhető. A felhasznált mikroszervezetek, valamint az esetlegesen előforduló fakultatív patogén baktériumok nyomon követésére ma még nem sok figyelmet fordít a szakma, ezért ez a kutatási témakör még sok megoldatlan kérdést rejt.

Doktori kutatási témámban három célkitűzést fogalmaztam meg: -Bioaugmentációs célra felhasznált baktérium törzsgyűjtemény fenotípusos identifikálási eredményeinek felülvizsgálata 16S rRNS gén szekvencia hasonlóság elemzés alapján. -A bioaugmentációs célra felhasznált törzsgyűjtemény egyik tagjának (CHB-20p) biológiai monitoringjára alkalmas, fajspecifikus molekuláris genetikai módszer fejlesztése. - A








































biológiai monitoringjára alkalmas azonosítási módszerek

összehasonlító kritikai elemzése, mely a bioaugmentációs eljárások biológiai biztonságának viszonylatában az egyik leggyakrabban felmerülő, fakultatív humán-patogén baktérium.

Célkitűzéseim elérése érdekében, a vonatkozó szakirodalom részletes tanulmányozása után saját kísérleteket állítottunk be. Munkám során részt vettem egy bioaugmentációs baktériumkészítmény engedélyeztetésének előkészítésében. A felhasználási engedély kiadásának kritériuma többek között a készítményben felhasznált baktériumok legalább faj szintű identifikációja. Bár a törzsek identifikációját korábban már elvégezték hagyományos fenotípusos módszerekkel, az eredmények inkonzisztens jellege miatt indokoltnak látszott azok felülvizsgálata. 16S

rRNS

gén

szekvencia-hasonlóság

elemzéssel

megtörtént

a

törzsgyűjtemény

identifikációjának felülvizsgálata (ld. 19. sz. táblázat). A vizsgálatok eredményeként az öt baktériumból háromnak a taxonómiai besorolását megváltoztattuk. Kísérleteink nyomán a törzsgyűjtemény ismert tulajdonságai a felhasználási engedély minden feltételének megfelelnek. A törzsek gyors és érzékeny biológiai monitoringjához javaslom fajspecifikus nested PCR reakciók tervezését és alkalmazását.

77

19. sz. táblázat: Bioaugmentációs törzsgyűjtemény identifikációjának felülvizsgálata Laborjelzés

Korábbi identifikáció

CHB-15



Új identifikáció 











































































































































CHB-20p







































AK-35


























AK-37









































































































































































AK-40





















































A törzsek fajmeghatározása során derült ki, hogy 16S rRNS génjének szekvencia-analízise alapján a CHB-20p jelű izolátum, bár a Chryseobacterium nemzetséghez tartozik, mégis elkülönül annak tagjaitól. A törzs részletes fenotípizálása, enzimprofiljának felvétele, kemotaxonómiai vizsgálata, valamint a filogenetikusan hozzá legközelebb álló rokonfaj típustörzsével (

DSM 17710) végzett teljes DNS-DNS hibridizáció után megállapítottuk,

















hogy a CHB-20p. egy új baktérium faj. Az új faj részletes leírását elvégeztük, annak a Chryseobacterium hungaricum nevet adtuk. Az általunk leírt











































CHB-20pT létezésével mostantól mindenképpen számolni kell a baktériumok összehasonlító rendszertanában. A Chryseobacterium nemzetség filogenetikai törzsfáját aktualizáltuk. Később a Chryseobacterium hungaricum fajra nézve specifikus nested-PCR reakciót terveztünk, mely „in vitro” lehetővé teszi a baktérium gyors, érzékeny és megbízható kimutatását talajmintákból. Biológiai monitoring folyamatokban történő gyakorlati felhasználása előtt a módszer további











tesztelése is szükséges.






Bioaugmentációs eljárások biztonságos kivitelezéséhez szintén elengedhetetlen a fakultatív patogén baktériumok, köztük a Pseudomonas aeruginosa biológiai monitoringja. Harmadik célkitűzésemnek megfelelően öt, általánosan alkalmazott kimutatási módszer által adott eredmények egybehangzóságát vizsgáltuk 43 környezeti izolátumon. A módszerek között három fenotípusos, és két molekuláris biológiai módszer szerepelt.





















































- A Magyar Szabvány (MSZ 21470-77:1988) által előírt módszer - ACGM agaros módszer

78

- API 20NE kit 










































































Exotoxin A gén kimutatását célzó PCR technika (ETA PCR)



16S rDNS V2 & V8 alegység kimutatását célzó PCR technika (PA-SS PCR)

Az egyes módszerek által adott fals negatív eredményekből számoltuk a helyes azonosítási eredmények százalékos arányát, mely érték megmutatja az egyes módszerek tévedhetőségét. Kísérleteinkben a fenotípusos módszerek mindegyike hozott fals negatív eredményt, míg a molekuláris biológiai módszerek minden esetben korrekt identifikációt adtak. Érdekes tény, hogy a hazai és a nemzetközi szabványok is kivétel nélkül még mindig a hagyományos, fenotípusos módszereket standardizálják. Vizsgálati eredményeink alapján egyértelműen kiderül, hogy ez a szabályozás sürgős felülvizsgálatra szorul. Saját kísérleti eredményeink és a szakirodalmi adatok fényében elvégeztem a vizsgált módszercsoportok kritikai összehasonlítását. Megállapítottam a fenotípusos és a molekuláris biológiai módszerek előnyeit és hátrányait, alkalmazásukat alátámasztó és korlátozó tényezőket. Az előnyök és hátrányok feltárása után, javaslatom szerint a P. aeruginosa leghatékonyabb környezeti kimutatása a két módszercsoport kombinált alkalmazásával érhető el. A módszertan azonban RNS alapú módszerek fejlesztésével tovább pontosítható. Kísérleteink során ellentmondásokat fedeztünk fel a



exotoxin A génjét célzó PCR






















alapú módszer (ETA PCR) korábbi leírásaiban is. Ezek az ellentmondások késztettek a módszer kiértékelésének részletes felülvizsgálatára. Megfelelő szoftveres elemzéssel és szekvencia analízissel is alátámasztva megállapítottuk, hogy ellentétben a korábbi leírásokkal, az ETA1 és az ETA2 primerekkel megsokszorozott,










































ra nézve fajspecifikus

génszakasz 397-bp hosszú, ezt a génszakaszt pedig a PvuI restrikciós endonukleáz enzim egy 134 és 263-bp hosszú fragmentre osztja. Ezen a téren elért eredményeink lehetővé teszik a módszer pontosabb értékelését, ezért mindenképpen hasznos lehet olyan laboratóriumok számára, melyek rutinszerűen használják ezt az eljárást. Doktori értekezésemben világos célkitűzéseket fogalmaztam meg, melyeket kivétel nélkül megvalósítottam. A vonatkozó szakirodalom részletes tanulmányozása után, korszerű vizsgálati módszerek alkalmazásával laboratóriumi kísérleteket állítottam be. A kísérletekből több új tudományos eredmény is született, melyeket öt tézis formájában összegeztem. Téziseimből

79

levont következtetések a környezetvédelmi- és a mikrobiológiai gyakorlat számára is alkalmazható, új információkat hordoznak.

80

7. ENGLISH SUMMARY Bioremediation and bioaugmentation within are common methods for the elimination of hydrocarbon contamination. The effectiveness and biological safety of these methods in field application can only be followed with a well designed biological monitoring system. Monitoring the microorganisms and facultative pathogens incidental in the system is not a well-studied field, so many unanswered questions remain.

In my PhD dissertation I formulated three objectives: -Verification of the phenotypic identification results of a bacterial strain collection used for bioaugmentation, analyzing 16S rRNS gene sequence analogies. -Development of a species-specific molecular genetic method suitable for the biomonitoring of a bacterial strain (CHB-20p) from the collection used for bioaugmentation. - Comparative critical analysis of identification methods suitable for the biomonitoring of 

the most common facultative human pathogen bacterium in








































bioaugmentation methods, in respect of biological safety. In order to achieve my objectives, after reviewing the referring literature, we set up our experiments. I participated in the preparation of a bioaugmentation bacteria product authorization. One criterion of issuing the licence among others was the identification of bacteria at least at species level. However, the identification of strains was done before with traditional identification methods, the verification of the results seemed to be reasonable considering their inconsistency. Identification verification of the strain collection was carried out by analyzing 16S rRNS gene sequence analogies (see Table 9.). On the basis of the results, (taxonomic) classification of three bacteria from the examined five was changed. According to our results, all known properties of the strain collection meet the requirements of the application authorization process. For fast and sensitive biological monitoring of the strains, I suggest to plan and use species-specific nested PCR reactions. In the course of species identification of the strains, it turned out that the CHB-20p isolate based on 16S rRNS gene sequence analysis, although belonging to the Chryseobacterium genus, is a distinct strain. After detailed phenotypic analysis, enzyme profile determination, chemotaxonomic analysis and total DNA-DNA hybridization of the strain with the standard strain of the closest relative (

DSM 17710), I found that CHB-20p. is a new species. Detailed

















description of the new species was done and it was named: Chryseobacterium hungaricum. This newly described











































CHB-20pT will certainly be considered in the

comparative taxonomy of bacteria. We actualized the phylogenic tree of the Chryseobacterium genus. 81

Table 19.: Identification verification of the bioaugmentation strain collection Laboratory

Previous identification

New identification

ID CHB-15






















































CHB-20p
































































































































AK-35
























AK-37











































































































































































AK-40





















































Afterwards, I designed a nested-PCR specific for Chryseobacterium hungaricum permitting fast, sensitive and reliable identification of the bacterium „in vitro” from soil samples. Before using this method in practice, further
















tests are needed. Biological

monitoring of facultative pathogens as Pseudomonas aeruginosa is also indispensible for the safety of bioaugmentation processes. According to my third objective, I analyzed the correspondance of the results of five commonly used identification methods on 43 environmental isolates. Three phenotypic and molecular biological methods were used.


















































- Hungarian Standard method (MSZ 21470-77:1988) - ACGM agar plate method - API 20NE kit 













































PCR technique targeting the species specific region of the Exotoxin A gene (ETA PCR)



PCR technique targeting V2 & V8 the species specific regions of 16S rRNS gene (PA-SS PCR)

The percentages of correct identification results were calculated using the false negative results given by the examined methods. This percentage value shows the accurateness of the techniques. During our examinations, all of the phenotypic methods yielded at least one false negative identification, while the molecular techniques gave correct identification in all cases. It is an interesting fact, that conventional phenotypic methods are still standardized in both the

82

Hungarian and also the international law. Our results made it clear that this kind of regulation needs urgent review. Based on our own results and the analysis of the relevant literature, critical comparison of the examined method-groups was made. I assessed the advantages and disadvantages of phenotypic and molecular methods, and the supportive and inhibitive factors of their use. Due to my recommendation, the most effective environmental detection of


























may be carried

out by combined using of the two method-groups. Further refinement of the detection methodology can be reached by the improvement of RNA based techniques.

During the work, faults were found in the evaluation of the originally described ETA PCR protocol, which were corrected by us. We attempted to explore the reason for inconsistent results of this method reported previously. There were discrepancies in the amplicon size and also in the location of the PvuI restriction site which is used to validate the amplification product. We examined the method thoroughly then we clarified the evaluation of the results with multiple confirmation. We confirmed our theory that using primers ETA1 and ETA2 to amplify a portion of the exotoxin A gene, the size of the PCR product is 397-bp. This product contains a single PvuI restriction site that splits the fragment into a 263-bp and a 134-bp long subfragment. This is consistent with the results of the original publication of this gene sequence. This results may be usable for institutes those apply this method as a daily routine. In my Ph.D. dissertation, clear objectives were drawn, which were achieved one and all. After studying the relevant literature, laboratory trials were set using up-to-date examination methods. The work yielded several new scientific results which were discussed in five thesis. Those carrying new applicable data and information for the environmental protection and microbiological practice.

83

MELLÉKLETEK

84

1. SZ. MELLÉKLET: IRODALOMJEGYZÉK 10/2000. (VI. 2.) KöM-EüM-FVM-KHVM együttes rendelet a felszín alatti víz és a földtani közeg minőségi védelméhez szükséges határértékekről 16/2002. (IV. 10.) EüM rendelet a települési szilárd és folyékony hulladékkal kapcsolatos közegészségügyi követelményekről. APHA 9213 F. American Public Health Association (APHA): Standard Methods for The Examinations of Water and Wastewater, Section 9213 - Recreational waters, Part F - Multipletube technique for 









































ALBANESE, G., DAVIS, R.E., GRANATA, G., DALLY, E.L., SANTUCCIO, T. & TESSITORI, M. (1996): DNA-based analyses to detect and identify phytoplasmas in yellows diseased , 6, 65-76. p. grapevines in Sicily. 










ALTSCHUL, S.F., MADDEN, T.L., SCHÄFFER, A.A., ZHANG, J., ZHANG, Z., MILLER, W. & LIPMAN, D.J., (1997): Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein 25 (17) 3389-3402. p. database search programs. 






































ARMON, R., ARBEL, T., NARKIS, N. & RUBIN, H. (2000): Aerobic biodegradation of benzene, toluene and ethyl-benzene in liquid medium by a bacterial consortium, isolated from nonhistory clay soil, and their interrelation effect 42 (1-2): 25-30. p.


















































ASHOK, B.T., SAXENA, S. & MUSARRAT J. (1995): Isolation and characterization of four polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria from soil near an oil refinery. 21 (4) 246–248. p.



















































ATLAS, R. M. (1981): Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective. , 45 (1)180-209. p.




































ATLAS, R. M. (Szerk.) (1984):









































































New York: Macmillan Publishing. 692. p.

ATZÉL, B., SZOBOSZLAY, S., MIKUSKA, ZS. & KRISZT, B. (2008): Comparison of phenotypic and genotypic methods for the detection of environmental isolates of . , 211 (1-2) 143-155. p. 
































































































































BARÓTFI, I. (2000): Környezettechnika, Budapest: Mezőgazda Kiadó. BARROW G. I. & FELTHAM, R. K. A. (Szerk.) (1993): Cowan and Steel’s manual for identification of medical bacteria, 3rd edition, Cambridge University Press. BAZYLINSKI, D. A., WIRSEN, C. O. & JANNASCH, H. W. (1989): Microbial utilization of naturally occuring hydrocarbons at the Guayamas Basin hydrothermal vent site. 55 (11) 2832-2836. p. 



































































BEDARD, D. L., (2003): Polychlorinated biphenyls in aquatic sediments: environmental fate and outlook for biological treatment. In: HÄGGBLOM, M. M. & BOSSERT, I.D. (Szerk.): 85







































. Kluwer Academic











































































Publishers, Boston. DE BEER, H., HUGO, C. J., JOOSTE, P. J., WILLEMS, A., VANCANNEYT, M., COENYE, T. & VANDAMME, P. (2005): sp. nov., isolated from raw chicken in a chicken-processing plant. , 55 (5) 2149–2153. p. 






















































































































































DE BEER, H., HUGO, C. J., JOOSTE, P. J., VANCANNEYT, M., COENYE, T. & VANDAMME, P. (2006): sp. nov., isolated from fish of the South Atlantic Ocean off South Africa. , 56 (6) 1317–1322. p. 










































































































































BEHRENDT, U., ULRICH, A., SPRÖER, C. & SCHUMANN, P. (2007). sp. nov., associated with the phyllosphere of grasses. , 57 (8) 1881 – 1885. p. 








































































































































BÉLÁDI, I. et al. (1983): Orvosi mikrobiológia – immunitástan – parazitológia. Budapest: Medicina Könyvkiadó, 542. p. BERNARDET, J.-F., NAKAGAWA, Y. & HOLMES, B. (2002): Proposed minimal standards for describing new taxa of the family and emended description of the family. , 52 (3) 1049-1070. p. 











































































































































Biomérieux [1996.]: Technical guide. Identification and susceptibility testing. Manual methods. Marcy-I’ Etoile, France, 235 p. BLUMENROTH, P. & WAGNER-DÖBLER, I. (1998): Survival of inoculants in polluted sediments: effect of strain origin and carbon source competition. 35 (3) 279– 288. p.

































BOZZOLA, J.J. & RUSSELL, L.D. (1991): Electron Microscopy, Jones & Bartlett Publish. ISBN 0-86720-126-6. BREGNARD, T. P-A., P. HÖHENER, A. HANER AND J. ZEYER (1996): Degradation of weathered diesel fuel by microorganisms from a contaminated aquifer in aerobic and anaerobic , 15 (3) 299-307. p. microcosms.





























































CASHION, P., HODLER-FRANKLIN, M. A., MCCULLY, J. & FRANKLIN, M. (1977): A rapid method for base ratio determination of bacterial DNA. 81 (2) 461466. p. 





































CHOI, B.K., WYSS, C., GOBEL, U.B. (1996): Phylogenetic analysis of pathogen related oral spirochetes. , 34 (8) 1922–1925. p.























































CHERN, L.-L., STACKENBRANDT, E., LEE, S.-_F., LEE, F.-L., CHEN, J.-K. & FU, H.-M. gen. nov., sp. nov., a chitin-degrading aerobe from soil in (2004): Taiwan. 54 (4) 1387-1391. p. 


















































































































































86

CLARRIDGE III, J.E. (2004): Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. 17 (4) 840–862. p. 















DAVIS, J. B. (1967):






























































New York: Elsevier.














DA SILVA FILHO, L.V., LEVI, J.E., ODA BENTO, C.N., DA SILVA RAMOS, S.R., & ROZOV, and direct detection in cystic T. (1999): PCR identification of fibrosis patients. 48 (4) 357-361. p. 






























































































DE LEY, J., CATTOIR, H. & REYNAERTS, A. (1970): The quantitative measurement of DNA , 12 (1) 133-142. p. hybridization from renaturation rates.















































DEZSŐ, P. & NAGY, J. (2005): A polimeráz láncreakció gyógyszerkutatási alkalmazásai. 111 (4) 155-158. p. 




























































































DE VOS, D., LIM JR., A., PIRNAY, J., STRUELENS, M., VANDEVELDE, C., DUINSLAEGER, L., VANDERKELEN, A., & CORNELIS, P. (1997): Direct detection and indentification of in clinical samples such as skin biopsy specimens and expectorations and by multiplex PCR based on two outer membrane lipoprotein genes, 35 (6) 1295-1299. p. 



















































































































DIEKEMA, D.J., PFALLER, M.A. & JONES, R.N. (1999): Survey of blood-stream infections due to gram-negative bacilli: frequency of occurence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States, Canada and Latin America for the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. 29 (3) 595-607. p. 















































DIN EN 12780:2002. European Standard: EN 12780:2002, Water quality – Detection and by membrane filtration. DA SILVA, M. L. B. & enumeration of ALVAREZ, P. J. J., (2004): Enhanced anaerobic biodegradation of benzene–toluene– ethylbenzene–xylene–ethanol mixtures in bioaugmented aquifer columns. 70 (8) 4720– 4726. p. 














































































































DYBAS, M. J., BARCELONA, M., BEZBORODNIKOV, S., DAVIES, S., FORNEY, L., HEUER, H., KAWKA, O., MAYOTTE, M., SEPU´LVEDA-TORRES, L., SMALLA, K., SNEATHEN, M., TIEDJE, J., VOICE, T., WIGGERT, D. C., WITT, M. E. & CRIDDLE, C. S. (1998): Pilotscale evaluation of bioaugmentation for in situ remediation of a carbon tetrachloride32 (22) 3598–3611. p. contaminated aquifer.


























































DYBAS, M. J., HYNDMAN, D. W., HEINE, R., TIEDJE, J., LINNING, K., WIGGERT, D., VOICE, T., ZHAO, X., DYBAS, L. & CRIDDLE, C. S. (2002): Development, operation, and long-term performance of a full-scale biocurtain utilizing bioaugmentation. 36 (16) 3635–3644. p.


























































ELLIS, D. E., LUTZ, E. J., ODOM, J. M., BUCHANAN Jr., R. J., LEE, M. D., BARTLETT, C. L., HARKNESS, M. R. & DeWEERD, K. A., (2000): Bioaugmentation for accelerated in situ , 34 (11) 2254–2260. p. anaerobic bioremediation.
























































ERNST, R.K., ADAMS, K.N., MOSKOWITZ, S.M., KRAIG, G.M., KAWASAKI, K., STEAD, C.M., ST. TRENT, M. & MILLER, S. I. (2006): The lipid A deacylase: selection for expression and loss within the cystic fibrosis airway. , 188 (1) 191-201. p. 












































































87

Európai Tanács [1996.]: Technical Guidance Document in Support of Commission Directive 93/67/EEC on Risk Assessment for New Notified Substances and Commission Regulation (EC) No 1488/94 on Risk Assessment for Existing Substances, ISBN-92-8278011-2 European Commission, Brussels, 1996. Európai Tanács [2000.]: Directive 2000/54/ec of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). FENCHEL, T. & B.J. FINALAY (1995): Ecology and evolution in anoxic worlds. Oxford: Oxford University Press, 208. p. FERGUSON, M.W., MAXWELL, J.A., VINCENT, T.S., SILVA, J. & OLSON, J.C. (2001): Comparison of the exoS gene and protein expression in soil and clinical isolates of . , 69 (4) 2198-2210. p. 









































































FREIJER, J. I. (1996): Mineralization of hydrocarbons in soil under decreasing oxigen availability. , 25 (2) 296-304. p.


















































GALLEGO, V., GARCIA, M. T. & VENTOSA, A. (2006): isolated from the drinking water distribution system of Sevilla, Spain. 56 (7) 1589–1592. p. 





























sp. nov.,





















































































































GERHARDT, P., MURRAY, R. G. E., WOOD, W. A. & KRIEG, N. R. (Szerk.) (1994): Methods for Genereal and Molecular Bacteriology. Washington, DC: American Society for Microbiology. GOLDSTEIN, M. G., MALLORY, L. M. & ALEXANDER, M. (1985): Reasons for possible failure of inoculation to enhance biodegradation. , 50 (4) 977– 983. p.







































































GRAY, G.L., SMITH, D.H., BALDRIDGE, J.S., HARKINS, R.N., VASIL, M.L., CHEN, E.Y. & HEYNEKER, H.L., (1984): Cloning, nucleotide sequence, and expression in of the exotoxin a structural gene of 81 (9) 2645-2649. p.



























































































































































































GROBE, S., WINGENDER, J. & TRUPER, H.G., (1995): Characterization of mucoid strains isolated from technical water systems. , 79 (1) 94-102. p. 


























































































GRUIZ, K. (2001): Bioremediációs kislexikon. Magyar Országos Közös Katalógus, Országos Széchényi Könyvtár. 5. p. (www.mokkka.hu/mokka/publications/kislexikon.pdf) HANTSIS-ZACHAROV, E. & HALPERN, M. (2007): psychrotolerant bacterium isolated from raw. 57(10) 2344-2348. p.















sp. nov., a





































































































































HARWATI, T. U., KASAI, Y., KOMADA, Y., SUSILANINGSIH & WATANABE, K. (2007): Characterization of diverse hydrocarbon-degrading bacteria isolated from indonesian seawater. 22 (4) 412-415. p.










































88

HAZELTON, P., R. & GELDERBLOM, H., R. (2003): Electron Microscopy for Rapid Diagnosis of Infectious Agents in Emergent Situations. , 9 (3) 294-303. p.












































HICKEY, W. J. (1995): Soil ventillation: effects on microbial populations in gasoline contaminated subsurface soils. , 24 (4) 571-582. p.


















































HUGO, C., SEGERS, P., HOSTE, B., VANCANNEYT, M. & KERSTERS, K. (2003). sp. nov., isolated from the dairy environment. 53 (3) 771–777. p. 















































































































































HUSS, V. A. R., FESTL, H. & SCHLEIFER, K. H. (1983): Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. , 4, 184-192. 

























































INNIS, M. A. & GELFAND, D. H. (1990): Optimization of PCRs. pp. 3-12 In: INNIS, M. et al. (szerk.) Academic Press, New York. 
























JARVIS, W.R., & MARTONE, W.J. (1992): Predominant pathogens in hospital infections. Suppl A:19-24. p. 
























































JOHNSON, J. E. & HILL R. T. (2003): Sediment Microbes of Deep-Sea Bioherms on the 46 (1) 55-61. p. Northwest Shelf of Australia.
































JOOSTE, P. J. & HUGO, C. J. (1999): The taxonomy, ecology and cultivation of bacterial genera . 53 (2) belonging to the family 81–94. p. 










































































































JOSEPHSON, K. L., PILLAI, S. D., WAY, J., GERBA, C. P. & PEPPER, I. L. (1991): Fecal coliforms in soil: detection by polymerase chain reaction and DNA-DNA hybridizations. 55 (5) 1326-1332. p. 

































































JOYANES, P., DEL CARMEN CONEJO, M., MARTINEZ-MARTINEZ, L. & PEREA, E. J., (2001): Evaluation of the VITEK 2 system for the identification and susceptibility testing of three species of nonfermenting gram-negative rods frequently isolated from clinical samples. 39 (9) 3247–3253. p.

























































JUKES, T. H. & CANTOR, C. R. (1969): Evolution of protein molecules. In: MUNRO, H. N. vol. 3, 21-132. p. New York: Academic Press. (Szerk.) 















































KÄMPFER, P., DREYER, U., NEEF, A., DOTT, W. & BUSSE, H. J. (2003): sp. nov., isolated from wastewater. 53 (1) 93–97. p. 














































































































































KÄMPFER, P. & KROPPENSTEDT, R. M. (1996). Numerical analysis of fatty acid patterns of 42 (10) 989-1005. coryneform bacteria and related taxa. 



























































from clinical and KHAN, A.A. & CERNIGLIA, E. (1994): Detection of environmental samples by amplification of the exotoxin A gene using PCR. 60 (10) 3739-3745. p. 








































































































89

KIM, K. K., BAE, H. S., SCHUMANN, P. & LEE, S. T. (2005a): sp. nov., isolated from freshwater lake sediment. 55 (1) 133–138. p.



























































































































































KISKA, D.L., KERR, A., JONES, M.C., CARACCIOLO, J.A., ESKRIDGE, B., JORDAN, M., MILLER, S., HUGHES, D., KING, N. & GILLIGAN, P.H. (1996): Accuracy of four and other gram-negative commercial systems for identification of nonfermenting bacilli recovered from patients with cystic fibrosis. , 34 (4) 886–891. p.


























































































KONKOLY THEGE, M. (2003): Hiperrezisztens előhírnöke.


























































: a postantibiotikum éra













































, 10 (3) 89-91. p.






KOVÁCS, G. (2006): Molekuláris mikrobiológiai vizsgálati módszerek alkalmazhatósága a vízközművek HACCP rendszerében: előnyök és limitációk. Magyar Hidrológiai Társaság, XIV. Országos Vándorgyűlés, 2/3. szekció, Pécs, 2006. július 5-6. KUYKENDALL, L.D., ROY, M.A., O'NEILL, J.J. & DEVINE, T.E. (1988): Fatty acids, antibiotic . resistance, and deoxyribonucleic acid homology groups of 38, 358-361. p.





















































































































LEAHY, J. G. & R. R. COLWELL (1990): Microbial degradation of hydrocarbons in the ie , 54 (3) 305-315. p. Environment.




































LEE, D.H., ZO, Y.G., & KIM, S.J., (1996): Nonradioactive method to study genetic profiles of natural bacterial communities by by PCR-single-standard-conformation polymorphism. 62 (9) 3112-3120. p. 



































































LEE, I.-M., GUNDERSEN, D.E., HAMMOND, R.W. & DAVIS., R.E. (1994): Use of mycoplasmalike organism (MLO) group-specific oligonucleotide primers for nested-PCR assays to detect mixed-MLO infections in a single host plant. , 84 (6) 559-566. p. 




















LI, Y., KAWAMURA, K., FUJIWARA, N., NAKA, T., LIU, H., HUANG, X., KOBAYASI, K. & sp. nov., a novel species isolated from EZAKI, T. (2003): 26 (4) 523-528. condensation water of space station Mir. p. 





































































































LU, J., PERNG, C., LEE, S. & WAN C., (2000): Use of PCR with universal primers and restriction endonuclease digestion for detection and identification of common bacterial pathogens in 38 (6) 2076-2080. p. cerebrospinal fluid.

























































LYCZAK, J.B., CANNON, C.L. & PIER, G.B., (2002): Lung infections associated with cystic fibrosis. 15 (2) 194–222. p. 




















































MAIER, R. M. (2000): Microorganisms and organic pollutants. In: MAIER, R. M., I. L. PEPPER & , New York: Academic Press, 363-402. CH., P. GEBRA (Szerk): p.












































MAJOR, D. W., MCMASTER, M. L., COX, E. E., EDWARDS, E. A., DWORATZEK, S. M., HENDRICKSON, E. R., STARR, M. G., PAYNE, J. A. & BUONAMICI, L. W., (2002): Field 90

demonstration of successful bioaugmentation to achieve dechlorination of tetrachloroethene to ethane. , 36 (23) 5106–5116. p.
























































MARLOWE, E. M., JOSEPHSON, K. L. & PEPPER, I. L. (2000): Nucleic acid-based methods of analysis. In: MAIER, R. M., PEPPER, I. L. & GEBRA, C. P. (2000): . San Diego, Academic Press. 294. p.










































MAYOTTE, T. J., DYBAS, M. J. & CRIDDLE, C. S., (1996): Bench-scale evaluation of bioaugmentation to remediate carbon tetrachloride-contaminated aquifer materials. , 34 (2) 358–367. p.
















McCLURE, N. C., WEIGHTMAN, A. J. & FRY, J. C. (1989): Survival of UWC1 containing cloned catabolic genes in a model activated-sludge unit. . 55 (2) 2627–2634. p. 



































































































McCLURE, N. C., Fry, J. C. & Weightman, A. J. (1991): Survival and catabolic activity of natural and genetically engineered bacteria in a laboratory-scale activated-sludge unit. 57 (2) 366–373. p.







































































MESBAH, M, PREMACHANDRAN, U. & WHITMAN, W. (1989): Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high performance liquid chromatography. 39 (2) 159-167. p.














































































MILLER, L.T. (1982): A single derivatization method for bacterial fatty acid methyl esters including hydroxy acids. 16 (3) 584-586. p.

























































MINNIKIN, D. E., COLLINS, M. D. & GOODFELLOW, M. (1979): Fatty acid and polar lipid composition in the classification of Cellulomonas, Oerskovia and related taxa 47 (1) 87-95. p.
























































MIYOSHI, M. (1895): Die Durchbohrung von Membranen durch Pilzfäden. , 28, 269-289. p.




























































MOSSEL, D.A. & INDACOCHEA, L. (1971): A new cetrimide medium for the detection of . Human- and animal-pathogenic members of the genus Pseudomonas. Bergan, T. In: STARR, M.P., STOLP, H., TRÜPER, H.G., BALOWS, A., AND SCHLEGEL, H.G.: The Prokaryotes, A handbook of isolation, characteriztation and identification of Bacteria. Berlin-Heidelberg-New York: Springer-Verlag, 673. p. 










































MSZ 21470-77:1988 Környezetvédelmi talajvizsgálatok. Mikrobiológiai vizsgálatok. MSZ 448/44:1990 Ivóvízvizsgálat. Bakteriológiai vizsgálat szabványok. MUNSON, M.A., BANERJEE, A., WATSON, T.F. & WADE, W.G., (2004): Molecular analysis of the microflora associated with dental caries. , 42 (7) 3023– 3029. p.























































NAWA, A., NISHIYAMA, Y., KIKKAWA. F., KAWAI, M., MANO, H., GOTO, S., SUGANUMA, N., TOMODA, Y. & NAKASHIMA, N. (1993): Detection of human papillomaviruses from histologically normal lymph nodes of Japanese cervical cancer patients , 53 (6) 932-937. by nested polymerase chain-reaction assay. p.





















































91

NCBI GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ NÉMEDI, L. et al. (1998) Közegészségügyi környezetbakteriológia. In: ANDRIK et al.: Budapest: Környezetgazdálkodási Intézet 2. (bővített) kiadás, 149247. p.











































NÉMETH T. (Szerk.) (2003): Kármentesítési útmutató 6, Tényfeltárás és monitoring, a szennyezett területek tényfeltárása és a kármentesítési monitoring-rendszerek. Környezetvédelmi és Vízügyi Minisztérium 2003, ISBN: 963 0344 08 4 ISSN: 1471-9393. p. NÉMETH T. (Szerk.) (2004): Kármentesítési útmutató 7, a mennyiségi kockázatfelmérés alapjai, 5. melléklet. Környezetvédelmi és Vízügyi Minisztérium 2003, ISBN: 963 0344 08 4 ISSN: 1471-9393. p. NIKOLAUSZ, M., MÁRIALIGETI, K. & KOVÁCS, G., (2004): Comparison of RNA- and DNAbased species diversity investigations in rhizoplane bacteriology with respect to chloroplast sequence exclusion. 56 (3) 365-373. p.

























































NÜßLEIN, K., MARIS, D., TIMMIS, K. & DWYER, D. F. (1992): Expression and transfer of spp. introduced into activated sludge engineered catabolic pathways harbored by microcosms. , 58 (10) 3380–3386. p. 


























































































NYER, E. K. (1993): Practical techniques for groundwater and soil remediation. Lewis Publishers, Boca Raton, Avn Arbor, London, Tokyo. PARK, M. S., JUNG, S. R., LEE, K. H., LEE, M.-S., DO, J. O., KIM, S. B. & BAE, K. S. (2006): sp. nov. and sp. nov, isolated from roots of sanddune plants. 56 (2) 433–438. p. 











































































































































































































PAVLOV, D., DE WET, C. M. E., GRABOW, W. O. K. & EHLERS, M. M. (2004): Potentially pathogenic features of heterotrophic plate count bacteria isolated from treated and untreated 92 (3) 275–287. p. drinking water.








































































PEPPER, I. L. & DOWD, S. E. (2002): PCR applications for plant and soil microbes. In: HURST, C. J., et al. (Szerk.) Manual of environmental microbiology, 2nd edn. ASM, Washington D.C., 573–582. p. PETTI, C.A., POLAGE, C.R., SCHRECKENBERGER, P. (2005): The role of 16S rRNA gene sequencing in identification of microorganisms misidentified by conventional methods. 43 (12) 6123–6125. p.

























































QIN, X., EMERSON, J., STAPP, J., STAPP, L., ABE, P. & BURNS, J.L. (2003): Use of real-time and other nonfermenting gramPCR with multiple targets to identify 41 (9) negative bacilli from patients with cystic fibrosis. 4312–4317. p. 
































































































QUAN, X., HANCHANG, S., HONG, L., WANG, J. & QIAN, Y., (2004): Removal of 2,4dichlorophenol in a conventional activated sludge system through bioaugmentation. , 39 (11) 1701–1707. p. 





























92

QUAN, Z.-X., KIM, K. K., KIM, M.-K., JIN, L. & LEE, S.-T. (2007): nov., isolated from bioreactor sludge. 57 (1) 141-145. p.








































































sp.






































































Riboszómális DNS adatbázis: http://www.psb.ugent.be/rRNA/primers/ ROFFEY, R. (1994): Biodeterioration of petroleum products stored underground in rock caverns. In: GARG, K. L., GARG, N. & MUKERJI, K. G. (Szerk) Calcutta: Naya ProKash, Vol. II, Chapter I, 1-16. p. 





























































































ROSENBERG, E. & RON, E. Z. (1996): Bioremediation of hydrocarbons. In: CRAWFORD, R. L. . & CRAWFORD D. L. (Szerk.) (1996). Cambridge: Cambridge University Press.











































































RZHETSKY, A. & NEI, M. (1992): A simple method for estimating and testing minimum9 (5) 945-967. p. evolution trees. 



















































SAIKI, R. K., SCHARF, S., FALOONA, F., MULLIS, K. B., HORN, G.T., ERLICH, H. A. & ARNHEIM, N. (1985): Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and 230 (4) 1350–1354. p. restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. 















SAIMAN, L., BURNS, J.L., LARONE, D., CHEN, Y., GARBER, E. & WHITTIER, S. (2003): isolates from Evaluation of MicroScan Autoscan for identification of 41 (1) 492– 494. p. cystic fibrosis patients. 
































































































SAITOU, N. & NEI, M. (1987): The neighbour-joining method: a new method for reconstructing 4 (4) 406-425. p. phylogenetic trees. 



















































SALANITRO, J. P., JOHNSON, P. C., SPINNLER, G. E., MANER, P. M., WISNIEWSKI, H. L. & BRUCE, C. (2000): Field scale demonstration of enhanced MTBE bioremediation through aquifer bioaugmentation and oxygenation. , 34 (19) 4152–4162. p.
























































SCHMALENBERGER, A., SCHWIEGER, F. & TEBBE, C.C. (2001): Effect of primers hybridizing to different evolutionarily conserved regions of the small subunit rRNA gene in PCR-based microbial community analyses and genetic profiling. 67 (8) 3557–3563. p. 



































































SCHMIDT, S. K. & ALEXANDER, M. (1985): Effects of dissolved organic carbon and second substrates on the biodegradation of organic compounds at low concentrations. , 49 (4) 822–827. p.







































































SHEN, F. O., KÄMPFER, P., YOUNG, C. C., LAI, W. A. & ARUN, A. B. (2005): sp. nov., isolated from contaminated soil. 55 (3) 1301–1304. p. 





















































































































































SHIMOMURA, K., KAJI, S. & HIRAISHI, A. (2005): yellow-pigmented aerobic bacterium isolated from a lactic acid beverage. 55 (5) 1903–1906. p. 



































sp. nov., a
















































































































93

SHELLY, D.B., SPILKER, T., GRACELY, E., COENYE, T., VANDAMME, P. & LIPUMA J.J. (2000): Utility of commercial test systems for identification of complex 38 (8) 3112–3115. p. from cystic fibrosis sputum culture.




























































































SIMON, L. (1999): Néhány talajremediációs eljárás részletes ismertetése. In: SIMON, L. (Szerk.): 2. (bővített) kiadás, Környezetügyi műszaki-gazdasági tájékoztatás sorozat, Budapest: KGI. 165-185. p. 






























































SONG, H., X. WANG & R. BARTHA (1990): Bioremediation potential of terrestrial fuel spills. , 56 (3) 652-656. p. 

































































SONG, K.P., CHAN, T.K., JI, Z.L. & WONG, S.W. (2000): Rapid identification of from ocular isolates by PCR using exotoxin A-specific primers. 14 (4) 199-204. p.



























































































SPILKER, T., COENYE, T., VANDAMME, P. & LIPUMA, J.J. (2004): PCR-based assay for from other species recovered from differentation of cytic fibrosis patients. 42 (5) 2074-2079. p. 











































































































STROO, H. F. (1992): Biotechnology and hazardous waste treatment. , 21 (2) 167-175. p. 


























































SUN YOON, S., COAKLEY, R., LAU, G.W., LYMAR, S.V., GASTON, B., KARABULUT, A.C., HENNIGAN, R.F., HWANG, S., BUETTBER, G., SCHURR, M.J., MORTENSEN, J.E., BURNS, J.L., SPEERT, D., BOUCHER, R.C. & HASSET, D.J. (2006): Anaerobic killing of mucoid by acidified nitrite derivates under cystic fibrosis airway 116 (2) 436-446. p. condition. 

































































































SWINDOLL, C. M., AELION, C. M. & PFAENDER, F. K. (1988): Influence of inorganic and organic nutrients on aerobic biodegradation and on the adaptation response of subsurface microbial communities. , 54 (1) 212–217. p.







































































SWOFFORD, D. L. (1993): PAUP: Phylogenetic Analysis Using Parsimony, version 3.1.1. Laboratory of Molecular Systematics, Smithsonian Institution. Champaign, Illinois SZABÓ I. M. (1989): A bioszféra mikrobiológiája. Budapest: Akadémia Kiadó SZOBOSZLAY, S., TÖRÖK, G., KRISZT, B. & RÚZS-MOLNÁR, S. (1995): Nem patogén mikroorganizmusok alkalmazása szénhodrogénnel szennyezett területek környezetkímélő 9 (1) 34-37. p. mentesítésére. 











































































SZOBOSZLAY, S., SOLYMOSI, J. & KRISZT, B. (2002): The biodegradation of hydrocarbon compounds concerning to environmental safety. 1(1):103-106. p. 



















































































SZOBOSZLAY, S. (2003): Katonai tevékenységek során a talajba kerülő szénhirogén szennyezések kármentesítésének környezetbiztonsági követelményei. Ph.D. értekezés, Zrínyi Miklós Nemzetvédelmi Egyetem, Katonai Műszaki Doktori Iskola, 2003, Budapest. SZOBOSZLAY, S., ATZÉL, B., CSERHÁTI, M., SZABÓ, I., & KRISZT, B. (2004): Biological safety of anaerobic technologies for environmental treatments. Montréal, Canada, Aug 29- Sep 2, 2004, 3, 1530-1534. p. 































































94

SZOBOSZLAY, S., Atzél, B., Kukolya, J., M. Tóth, E., Márialigeti, K., Schumann, P. & Kriszt, B. (2008): sp. nov. isolated from hydrocarbon-contaminated soil. (in press). 















































































































































TAI, C.-J., KUO, H.-P., LEE, F.-L., CHEN, H.-K., YOKOTA, A. & LO, C.-C. (2006): sp. nov., isolated from soil in Taiwan. 56 (8) 1771-1776. p. 




















































































































































TAMURA, K., DUDLEY, J., NEI, M. & KUMAR, S. (2007): MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. 24 (8) 1596-1599. p. 



















































TANG, Y., ELLIS, N.M., HOPKINS, M.K., SMITH, D.H., DODGE, D.E. & PERSING, D.H. (1998): Comparison of the phenotypic and genotypic techniques for identification of unusual 36 (12) 3674aerobic pathogenic gram-negative bacilli. 3679. p.

























































TINDALL, B.J. (1990a): A comparative study of the lipid composition of from various sources. , 13 (2) 128-130. p. 

































































































TINDALL, B.J. (1990b): Lipid composition of , 66 (11) 199-202.





















.






























































TÖRÖK G., SZOBOSZLAY, S., KRISZT, B. & S. RÚZS-MOLNÁR (1996): Szénhidrogének stimulált biodegradációja. MTA Általános Mikrobiológiai Bizottságának előadóülése, Budapest, Magyar Tudományos Akadémia Székháza, 1996.02.21. TSAI, Y., TRAN, B. & SANGERMANO, L. R. (1993): Detection of and sludge by polymerase chain reaction. 353-357. p. 
































in sewage 59 (2)































































YAMANE, A., SAKAKIBARA, K., HOSOMI, M. & MURAKAMI, A. (1999): Microbial degradation of petroleum hydrocarbons in estaurine sediment of Tama River in Tokyo urban area. 35 (8): 69-76. p.















































YOON, J. H., KANG, S. J. & OH, T. K. (2007): from wastewater of a textile dye works. 55 (6) 1355-1359. p.









sp. nov., isolated











































































































































YOUNG, C. C., KÄMPFER, P., SHEN, E. T., LAI, W. A. & ARUN, A. B. (2005): sp. nov., isolated from the rhizosphere of L. 55 (1) (garden lettuce). 423–426. p. 












































































































































































VAN DE PEER, Y., CHAPELLE, S. & DE WACHTER, R. (1996): A quantitative map of 24 (17) 3381–3391. p. nucleotide substitution rates in bacterial rRNA. 






































VANDAMME, P., BERNARDET, J. F., SEGERS, P., KERSTERS, K. & HOLMES, B. (1994): New perspectives in the classification of the : description of gen. nov., gen. nov., and nom. rev. 44 (4) 827–831. p. 

































































































































































95

VAN DER MEER, J. R, WERLEN, C., NISHINO, S. F. & SPAIN, J. C. (1998): Evolution of a pathway for chlorobenzene metabolism leads to natural attenuation in contaminated 64 (11) 4185–4193. p. groundwater.







































































VANEECHOUTTE, M., KÄMPFER, P., DE BAERE, T., AVESANI, V., JANSSENS, M. & WAUTERS, G. (2007): sp. nov., to accommodate clinical isolates 57 (11) biochemically. 2623-2628. p. 












































































































































VAUTERIN, L., YANG, P., HOSTE, B., VANCANNEYT, M., CIVEROLO, E. L., SWINGS, J. & KERSTERS K. (1991): Differentiation of pv. strains by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of proteins, fatty acid analysis, and DNA, 41, 535–542. p. DNA hybridization.




































































































































VOVERIENË, G., MICKËNIENË, L. & ÐYVOKIENË, J. (2002): Hydrocarbon-degrading bacteria in the digestive tract of fish, their abundance, species composition and activity. , 12 (3) 333. p. 









































WALKER, J. D., P. A. SEESMAN, R. R. COLWELL (1975), Effect of South Luisiana crude oil and No. 2. fuel oil on growth of heterotrophic microorganisms, including proteolytic, Iypolitic, ion, 9, 13–33. p. chitinolytic and cellulolytic bacteria.






























WALKER, J. D. & COLWELL, R. R. (1976): Measuring potential activity of hydrocarbon degrading bacteria. 31 (2) 189-197. p. 



































































WANG, Y., MA X., ZHAO W., JIA X., KAI, L. & XU, X. (2006): Study on the creatinase from . strain WB1. , 41 (9) 2072-2077. 





















































WATANABE, K., YAMAMOTO, S., HINO, S. & HARAYAMA, S. (1998): Population dynamics of phenol-degrading bacteria in activated sludge determined by -targeted quantitative , 64 (4) 1203–1209. p. PCR.













































































WEBER, W. J. J. & CORSEUIL, H. X. (1994): Inoculation of contaminated subsurface soils with enriched indigenous microbes to enhance bioremediation rates. , 28 (6) 1407–1414. p. 

























WELLINGHAUSEN, N., KÖTHE, J., WIRTHS, B., SIGGE, A. & POPPERT, S. (2005): Superiority of molecular techniques for identification of gram-negative, oxidase-positive rods, , from patients with cystic including morphologically nontypical 43 (8) 4070-4075. p. fibrosis. 
































































































WEON, H. Y., KIM, B. Y., YOO, S. H., KWON, S. W., CHO, Y. H., GO, S. J. & STACKEBRANDT, E. (2006): sp. nov., isolated from greenhouse soil in Korea. 56 (7) 1501–1504. p. 




















































































































































WILSON, S. C. & JONES, K. C. (1993): Bioremediation of soil contaminated with polynuclear 81 (3) 229-249. p. aromatic hydrocarbons (PAHs): a rewiev.






































96

WILSON, V.L., TATFORD, B.C., YIN, X., RAJKI, S.C., WALSH, M.M., & LAROCK P. (1999): Species-specific detection of hydrocarbon utilizing bacteria. 39 (1) 59-78. p.

























































WITT, M. E., DYBAS, M. J., WIGGERT, D. C. & CRIDDLE, C. S., (1999): Use of bioaugmentation for continuous removal of carbon tetrachloride in model aquifer columns. 16 (6) 475–485. p.




























































WOLF, M. & R. BACHOFEN (1991): Microbial degradation for bitumen matrix used in nuclear 78 (7) 414-417. p. waste repositories.

































World Health Organization [2004.]: Laboratory biosafety manual, 3rd edition. Geneva: World Health Organization. ISBN 92 4 154650 6. ZHANG, R. L., HUANG, G. Q., LIAN J. Y. & LI, X. G.(2007): Degradation of MTBE and TEA by a new isolate from MTBE-contaminated soil. , 19 (9) 11201124. p.























































ZHOU, Y., DONG, J., WANG, X., HUANG, X., ZHANG, K. Y., ZHANG, Y. Q., GUO, Y. F., LAI, R. & LI, W. J. (2007): sp. nov., isolated from polluted soil. 57 (8) 1765-1769. p. 











































































































































97