III BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1.
Bahandan Alat Penelitian
3.1.1. BahanPenelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut : 1. Feses sapi potong 2. Batubara subbituminous 3. NaCl Fisiologis 4. Larutan mineral I
5.
-
K2HPO4
0,6 gram
-
Aquades
100 ml
Larutan mineral II -
NaCl
1,2 gram
-
(NH4)2SO4
1,2 gram
-
KH2PO4
0,6 gram
-
CaOCl2
0,12 gram
-
MgSO4.7H2O
0,25 gram
-
Aquades
100 ml
6.
Larutan pengencer -
Larutan mineral I
7,5 ml
-
Larutan mineral II
7,5 ml
-
Cysteine-HCl . H2O
0,05 gram
-
Na2CO3
0,3 gram
-
Larutan Resazurin 0,1%
0,1 ml
21
-
Aquades
7.
100 ml
Media untuk Metanogenensis -
Cairan isi rumen
30 ml
-
KH2PO4
0,05 grram
-
K2HPO4
0,05 gram
-
NaCl
0,01 gram
-
(NH4)2SO4
0,05 gram
-
MgSO4
0,05 gram
-
CaOCl2
0,01 gram
-
Resazurin 0,1%
0,1 ml
-
NaHCO3
0,5 gram
-
Cystein-HCl.H2O
0,03 gram
-
Na2CO3 8%
5,0 ml
-
Aquades
65 ml
8.
Gas CO2
9.
Mix gas ( H2 20% dan CO280% )
3.1.2. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Plastik, berfungsi untuk pengambilan sampel feses sapi potong. 2. Ember, berfungsi untuk menampung cairan isi rumen. 3. Kain kasa, berfungsi untuk menyaring cairan isi rumen. 4. Sentrifugasi, berfungsi untuk memisahkan padatan dan cairan. 5. Autoktaf, berfungsi untuk sterilisasi bahan dan media penelitian. 6. Syringe, berfungsi untuk memindahkan cairan rumen yang akan masuk kedalam sentrifugasi, pengambilan gas untuk GC-14A, pengambilan
22
sampel untuk spektrofotometer, injeksi kultur bakteri ke dalam batubara subbituminous pengenceran dan penanaman kultur bakteri. 7. Botol Scott, berfungsi untuk menyimpan larutan resazurin 0,1%, larutan mineral I dan larutan mineral II, menyimpan cairan rumen dan media 8. Erlenmeyer, berfungsi untuk menampung larutan pengencer. 9. Mikro pipet, berfungsi untuk pengambilan larutan pengenceran ke dalam tabung pengencer 10-1 sampai 10-4. 10. Oven, berfungsi untuk sterilisasi peralatan penelitian. 11. Tempat air, untuk menyimpan air yang akan digunakan dalam penelitian. 12. Timbangan analitik, berfungsi untuk menimbang sampel dan bahan yang akan digunakan. 13. Tabung pengencer, berfungsi untuk mengencerkan isolat bakteri. 14. Tabung Hungate, berpungsi untuk mereaksikan isolat bakteri, batubara subbituminous dan media. 15. Kertas label, berfungsi untuk member label sampel. 16. Cooling box, berfungsi untuk tempat membawa sampeldalam menguji spektrofotometer. 17. Rak tabung reaksi, berfungsi untuk menyimpan tabung reaksi. 18. Kuvet, berfungsi untuk menampung sampel yang akan masuk ke dalam spektrofotometer. 19. Venoject, berfungsi untuk menampung gas yang akan dianalisis GC14A.
23
20. Parafilm, berfungsi untuk merekatkan kembali sampel yang telah diamati. 21. Satu set gas, berfungsi untuk pembebasan oksigen 22. Spektrofotometer, berfungsi untuk menganalisis kekeruhan larutan dalam pengamatan pertumbuhan total bakteri. 23. GC-14A, berfungsi untuk menganalisis gas dalam sampel.
3.2.
Prosedur Penelitian 3.2.1. Persiapan Penelitian 1. Sterilisasi peralatan penelitian - Mencuci terlebih dahulu semua alat yang akan digunakan dengan menggunakan sunlight. - Memasukkan alat-alat yang akan disterilisasi ke dalam oven. - Membungkus menggunakan kertas untuk alat-alat yang telah disterilisasi. 2. Persiapan cairan isi rumen untuk media - Cairan isi rumen dimabil dari RPH sapi potong Tanjungsari pada pukul 01.00 WIB. - Cairan isi rumen di saring dengan kain kasa 5 lapis kemudian ditampung di dalam ember. - Cairan isi rumen dibawa ke laboratorium nanoteknologi dan disaring kembali dengan kain kasa 5 lapis. - Cairan isi rumen di tuangkan ke dalam botol scott 500 ml kemudia di sterilisasi ke dalam autoklaf pada suhu 121oC tekanan 1 atm selama 20 menit.
24
- Cairan isi rumen di sentrifugasi sebanyak 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC. 3. Pengambilan sampel - Feses sapi potong dimasukan kedalam plastik yang diambil dari peternakan rakyat daerah Jatinangor. - Batubara jenis subbituminous diambil dari desa Libur Dinding, Kabupaten Paser, Kalimantan Timur. Contoh batubara diambil dari Formasi Pamaluan. 4. Larutan Pengenceran (Bryant and Burkey, 1953) - Mencampurkan pengencer mineral I 7,5 ml, pengencer mineral II7,5 ml, sistein-HCl.H2O 0,05 gram, Na2CO30,3 gram, resazurin 0,1% (0,1 gram resazurin + 99,9 ml aquades) dan aquades 100 mlke dalamerlenmeyer di atas hot platedan disterilisasi dalam autoklaf151 lb (121oC) selama 20 menit. - Setelah dimasukan ke dalam autoklaf, menutup botol segera dengan karet steril dan mendinginkannya hingga temperatur 45-50oC kemudian membebaskan O2 sampai indikator resazurin berubah warna dari pink menjadi warna bening. 5. Kulturasi bakteri feses sapi potong 1) Metode anaerobik (Hungate, 1995) Menghilangkan O2 dari media dan larutan pengencer.Media dan larutan yang lain dipanaskan sampai indikator rasazurin berubah warna dari merah muda menjadi tanpa warna. Setelah dipanaskan, media atau larutan yang lain tetap pada kondisi suhu 50 β 60oC.
25
2) Pengenceran Sampel Anaerobik (Bryant dan Burkey, 1953) - Persiapan larutan : mencampurkan larutan mineral, Cysteine-HCl, Na2CO3, larutan resazurin, dan air destilasi. - Menempatkannya pada setiap botol pengencer dan disterilisasi dalamautoklaf dengan 151 lbs (121oC) selama 20
menit.
Setelah
autoklaf
selesai,
setiap
botol
pembebasanO2 dengan mix gas sampai larutan resazurin berubah warna. Kemudian setiap botol ditutup secepatnya dengan butyl rubber stopper. Disimpan dalam suhu ruang sebelum digunakan. - Prosedur pengenceran sampel : sebanyak 45 ml larutan NaCl
fisiologis
sebagai
pengencer
anaerobikdicampurkandenganditambahkan 5 gram feses pada tabung. Pengenceran sampel feses disimpan selama 5 menit. Sampel kemudian diencerkan pada10-1, 10-2, 10-3 dan 10-4 larutan pengencer. 3) Preparasi penggunaan media - Menuangkan cairan isi rumen, KH2PO4, K2HPO4, NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4, CaOCl2, resazurin 0,1%, NaHCO3, Aquades, Cystein-HCl.H2O dan NaHCO3 8% ke dalam tabung scott 500 ml. - Menutup tabung dengan penutup karet. - Mensterilisasi media dalamautoklaf dengan tekanan 15 lbs (121oC) selama 20 menit.
26
- Setelah disterilisasi, mendinginkan medium pada tempat yang berisikan air pada suhu 45 sampai 50oC - Mengaliri mix gas ke dalammedia. - Medium yang ada pada tabung dihomogenkan dan ditransfer secara aseptik ke tabung Hungate yangbebas O2 dan ditutup dengan penutup karet butyl yang steril. 3.2.2. Pelaksanaan Penelitian Prosedur penanaman kultur bakteri 1. Batubara subbituminous berukuran 1 x 1 x 1 cm sebanyak 2 buah dimasukan ke dalam tabung Hungate yang telah berisi media 30 ml berjumlah 3 tabung. 2. Injeksi isolat bakteri pada pengenceran 10-2, 10-3 , 10-4 0,6 ml ke dalam tabung Hungate. 3. Pembebasan oksigen dengan menggunakan mix gas. 4. Tabung Hungate segera ditutup rapat dengan parafilm. 5. Mengambilsampel dari tabung Hungate dengan injeksi untuk menguji pertumbuhan total bakteri dengan Spektrofotometerdan Gas Chromatography (GC-14A)pada hari ke - 2, 5, 10, dan 14 hari. Prosedur penggunaan Spektrofotometer 1. Menyiapkan spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm. 2. Menyiapkan blanko (medium) dan sampelkultur (biakan cair) masing-masing 2 ml ke dalam kuvet steril. 3. Memutarspektrofotometer 4. Mencatat hasil absorbansi dari spektrofotometer Prosedur penggunaan GC-14A
27
1. Menyalakan GC-14A dan mengatur seluruh komponen hingga sampel sebanyak 1 ΞΌl siap diinjeksikan dan siap running. 2. Mengatur tampilan analisis. 3. Data sampel diisikan atau ditekan sample loginpada monitor sambil menunggu GC-14A pada monitor pada kondisi Ready. 4. Menekan tombol start pada monitor, sehingga automatic injector membersihkan syringe sesuai setting, kemudian sampel sebanyak 1 ΞΌl diinjeksikan ke dalam autoinjector tipe AOC-20i shimadzu. 5. Selama setting waktu awal atau bila grafik sudah menunjukkan sedikit datar analisis GC dapat dihentikan dengan menekan tombol stop pada monitor. 6. Puncak grafik diidentifikasi pada tiap waktu retensi dari puncak awal sampai puncak akhir dan dicocokkan dengan references pada program GC-14A tekan similary search. Hasil identifikasi akan menunjukkan komponen yang paling mirip dari beberapa komponen dari bobot molekul serta tinggi intens peak dan yang teratas adalah yang paling mendekati. 7. GC-14A dimatikan.
3.3.
Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan secara eksperimental.Metode yang digunakan
dalam
penelitian
ini
adalah
eksploratif
dengan
penjabaran
secara
deskriptif.Penelitian ini menggunakan 3 macam perlakuan denganpengulangan3 kali, sehingga diperoleh 9unit sampel percobaan.Berikut perlakuan yang diberikan adalah: P2 = Batubarasubbituminous+ isolat bakteri feses pengenceran 10 -2
28
P3 P4
= Batubarasubbituminous+ isolat bakteri feses pengenceran10-3 = Batubarasubbituminous+ isolat bakteri feses pengenceran 10 -4 Ulangan Perlakuan 1 P2 P3 P4 2
P3
P2
P4
3
P3
P4
P2
Ilustrasi 5. Tata Letak Percobaan Data prooduksi gas dan pertumbuhan bakteri yang diperoleh dianalisis dengan rumus yang dikemukakan Sudjana (1996), yaitu : 1. Rata-rata (π₯ ) π₯=
π π=0 π₯π
π
Keterangan :
π₯π π₯ N
= Jumlah bakteri atau gas = Rata-rata jumlah bakteri atau gas = Jumlah sampel yang diteliti
2. Varian(π 2 ) π 2 =
π π=0(π₯π
β π₯)2 πβ1
Keterangan :
S2 π₯π π₯ n
= Varian = Jumlah bakteri atau gas = Rata-rata jumlah bakteri atau gas = Jumlah sampel yang diteliti
3. Simpangan Baku (S) π=
(π₯π β π₯ )2 πβ1
Keterangan :
S π₯π π₯ n
= Simpangan baku = Jumlah bakteri atau gas = Rata-rata jumlah bakteri atau gas = Jumlah sampel yang diteliti
29
4. Koefisien Variasi (KV) πΎπ =
Keterangan : KV S π₯
π π 100% π₯
= Koefisien Variasi = Simpangan baku = Rata-rata sampel jumlah bakteri atau gas
5. Menaksir Rata-rata Simpangan baku tidak diketahui dan populasi berdistribusi normal π₯ β π‘π .
π
π
< π < π₯ + π‘π .
π
π
Keterangan :
π₯ π t p n π π₯ β π‘π . π₯ + π‘π .
π π π π
= Rata-rata sampel jumlah bakteri atau gas = Simpangan baku = Nilai t (daftar distribusi sampel) = Β½ (1 + Ξ³) = Jumlah sampel yang diteliti = Taksiran rata-rata = Batas bawah kepercayaan = Batas atas kepercayaan
30
3.4.
Peubah yang Diamati Peubah yang diamati adalah sebagai berikut:
1.
Pertumbuhan totalbakteri anaerob dengan menggunakan spektrofotometer.
2.
Produksi gas dengan menggunakan GC-14A.
