BAB VI. MIKROBIOLOGI PADA PROSES TERMAL PENGOLAHAN PANGAN A. Penerapan Proses Termal pada Pengolahan Pangan 1. Blanching Blanching dapat dilakukan dengan cara steaming (pengukusan) atau boiling (perebusan) bahan pangan yang diolah. Proses ini bukan merupakan tahapan akhir dari suatu proses pengolahan pangan. Tujuan blanching diantaranya: •
Menginaktivasi mikrobia yang ada di dalam bahan pangan
•
Menginaktivasikan enzim yang ada pada bahan pangan yang olah
•
Memperbaiki tekstur sehingga memudahkan memasukan bahan yang diolah ke dalam wadah
Penerapan blanching sering dilakukan pada pengolahan sayur-sayuran dan buahbuahan sebelum dikalengkan. 2. Pasteurisasi: suhu < 1000C → 70 – 800C Pasteurisasi diterapkan untuk membunuh semua mikrobia yang ada dalam suatu bahan (misalnya pasteurisasi susu) atau pengurangan sejumlah populasi mikrobia perusak pada bahan pangan tertentu (misalnya pasteurisasi vinegar). Pasteurisasi susu dilakukan dengan pemanasan pada suhu 145oF selama 35 menit atau pada 161oF selama 15 detik (High Temperature Short Time, metode HTST). Pada umumnya tujuan pasteurisasi ialah untuk membunuh semua mikrobia pathogen. Namun perlu diingat, karena suhu kurang dari 1000C, maka dimungkinkan mikrobia dalam bentuk spora dari jamur atau bakteri tidak mengalami kerusakan/destruksi.
Pasteurisasi
dapat
merupakan
proses
final
(susu
pasteurisasi) atau bukan final (misalnya pasteurisasi susu pada pembuatan susu bubuk atau yoghurt) dari pengolahan pangan. Oleh karena itu, agar susu pasteurisasi tidak mudah terkontaminasi atau mengalami kerusakan, perlu dilakukan penyimpanan pada suhu dingin.
74
3. Sterilisasi : Suhu di atas 100oC (biasanya 115o – 1300C selama 15 menit) Sterilisasi
dimaksudkan
untuk
membunuh
semua
mikrobia
baik
yang
pathogen/merusak yang bentuk spora sel vegetatif. Tahapan ini merupakan tahap akhir dari suatu pengolahan bahan pangan. Proses ini sering disebut sebagai proses sterilisasi komersial dan banyak diterapkan pada pengalengan bahan makanan, misalnya pengalengan ikan, jamur, dsb. Mikrobia jika berada pada lingkungan yang berbeda maka ada 3 kemungkinan yang dialami oleh mikrobia tersebut. 1. Terjadi peningkatan aktivitas dari mikrobia tersebut 2. Terjadi penurunan aktivitas mikrobia/percepatan pertumbuhan 3. Terjadi pemusnahan/penghancuran aktivitas mikrobia Jika jumlah spora/bakteri dinyatakan dalam Log ∑ sel atau ∑ spora dan t = waktu pemanasan dan diperlakukan pada suhu tinggi, maka akan terjadi penurunan populasi sel/spora, sebagaimana ditunjukkan dalam gambar berikut,
T suhu pemanasan = suhu di atas suhu pertumbuhan Log Σ sel
0
t waktu pemanasan
B. Proses Kematian Bakteri oleh Panas Panas yang tinggi menyebabkan perubahan fungsi senyawa-senyawa seluler yang pada akhirnya akan mengarah pada perubahan struktur protein yaitu denaturasi. Pendapat lain mengatakan bahwa pemanasan dapat
75
menyebabkan kerusakan pada membran sel. Kerusakan DNA juga merupakan salah satu penyebab kematian sel karena pemanasan. Kerusakan DNA ini dapat dikarenakan pengaruh langsung, yaitu putusnya ikatan hydrogen intramolekuler DNA yang cukup menyebabkan kerusakan yang bersifat irreversible. C. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Ketahanan Mikrobia oleh Panas Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi resistensi mikrobia terhadapa panas ada 3 tipe : Pertama, resistensi inherent, yaitu dipengaruhi oleh jenis spesies atau strain mikrobia, spora atau sel vegetatif. Kedua, Kondisi lingkungan yang mempengaruhi selama pertumbuhan dan pembentukan sel atau spora (umur sel, suhu pertumbuhan, dan media pertumbuhan). Ketiga, Kondisi lingkungan yang mempengaruhi selama proses pemanasan sel atau spora, yaitu pH, aw, menstrum suspensi (jenis bahan pangan), garam, senyawa organik dan anorganik). Dari beberapa informasi, faktor-faktor tersebut dapat dijelaskan sebagai berikut. 1. Tipe Mikrobia Berdasarkan pada kisaran suhu pertumbuhannya mikrobia dapat dikelompokkan menjadi 4 group yaitu Thermofil, Mesofil, Psikhofil dan Psikotrof (Tabel ). Tabel 6.1. Suhu pertumbuhan untuk mikrobia prokariotik
Group
Suhu (0C) Minimal
Optimal
Maksimal
Thermofil
40-45
55-75
60-90
Mesofil
5-15
30-45
33-47
Psikhrofil
(-5) – (+5)
12-15
15-20
Psikhrotrof
(-5) – (+5)
25-30
30-35
76
Dikutip dari : International Commission on Microbiological Specification for Foods, 1980 Kelompok termofil lebih tahan disbanding mesofil, mesofil lebih tahan terhadap psikotrof, bakteri pembentuk spora dapat tahan pada suhu yang tinggi dan diketahui ada yang survive/tahan hidup beberapa menit pada suhu 120oC atau beberapa jam pada suhu 100oC. Sel vegetatif dari bakteri pembentuk spora, sebagaimana bakteri yang tidak membentuk spora, yeast dan kapang diketahui tidak lebih resisten daripada bakteri vegetatif. Kelompok yeast dan jamur kebanyakan dapat dimatikan/dibunuh setelah beberapa menit pada suhu 70-800C dan di dalam bahan pangan yang basah (moist) pemanasan pada suhu 1000C mematikan semua mikrobia tersebut. 2. Jumlah Sel Populasi bakteri awal yang lebih banyak membutuhkan waktu yang lebih lama untuk menurunkan populasinya dibandingkan dengan populasi yang sedikit. 3. Umur Sel Spora yang lebih muda lebih tahan dibanding yang tua, namun ada penelitian lain yang mengungkapkan sebaliknya. Pada E.coli, sel yang muda diketahui lebih peka/sensitif terhadap panas dibanding yang tua. 4. Tahapan Pertumbuhan Pada umumnya mikrobia yang berada pada fase pertumbuhan logaritmik lebih peka dibanding fase pertumbuhan lain. 5. Suhu Sel bakteri yang tidak membentuk spora jika ditumbuhkan pada suhu yang relatif lebih tinggi akan memiliki daya tahan yang lebih tinggi daripada mikrobia tersebut ditumbuhkan pada suhu yang lebih rendah. 6. Medium pertumbuhan Dari hasil penelitian dapat diketahui komposisi media pertumbuhan dapat menaikkan ataupun menurunkan ketahanan mikrobia terhadap panas. 77
7. Menstruum Medium yang dipergunakan untuk pemanasan ini dipengaruhi oleh aw (aktivitas air), pH, KH, protein dan lemak. Pada pH yang relatif rendah/bersifat asam akan meningkatkan kepekaan mikrobia terhadap panas dan mudah mengalami kematian. Sedangkan adanya protein dan lemak dapat bersifat protektif terhadap mikrobia.
Menurut Hansen dan Riemanm (dalam Jay, 1986), faktor-faktor yang mempengaruhi ketahanan mikrobia terhadap panas ialah: 1. Kadar Air Ketahanan mikrobia terhadap panas akan meningkat jika kadar
air
biomassa/sel tersebut rendah/menurun. Hal ini dapat disebabkan denaturasi protein terjadi lebih cepat ketika panaskan di dalam air daripada di udara. 2. Lemak Adanya lemak mengakibatkan ketahanan mikrobia terhapan panas semakin meningkat. Semakin tinggi kadar lemak dalam suatu media pemanasan, ternyata diperlukan Thermal Death Point (TDP) yang semakin tinggi pula. TDP didefinisikan suhu yang diperlukan untuk membunuh sejumlah spora atau sel mikrobia dalam selang waktu tertentu. Krim yang paling banyak mengandung lemak memerlukan suhu TDP setinggi 730C untuk membunuh sejumlah sel E. coli selama 10 menit pemanasannya (Tabel 6.2 ), sedangkan jika digunakan whey dibutuhkan suhu 630C. Tabel 6. 2. Efek medium terhadap Thermal Death Point (TDP) pada E. coli Medium Cream
TDP0C 73
78
Whole milk Skim milk Whey Berillon (broth) Waktu pemanasan = 10 menit,
69 65 63 61
2. Garam Efek dari garam terhadap ketahanan mikrobia terhadap panas sangat bervariasi tergantung jenis garam dan konsentrasi garam yang dipergunakan. Suplementasi pada media pertumbuhan Bacillus meganterium dengan CaCl2 menghasilkan spora yang lebih tahan terhadap panas dibandingkan jika medium tersebut ditambah dengan L-glutamat, L-prolin, fosfat. 3. Karbohidrat Adanya gula (sukrosa, glukosa, fruktosa) di dalam menstruum dapat meningkatkan resistensi terhadap panas. Hasil dari penelitian menunjukkan adanya sukrosa ternyata meningkatkan resistensi dari Salmonella senftenberg , dengan urutan dari yang paling tahan ialah sukrosa > glukosa > sorbitol > fruktosa > gliserol. 4. pH Pada umumnya mikrobia tumbuh baik pada pH 7, oleh karena bila derajat keasaman tersebut diturunkan/ditingkatkan akan menurunkan/ meningkatkan resistensi mikrobia terhadap panas. 5. Protein Protein diketahui bersifat protektif terhadap mikrobia sehingga adanya protein mampu meningkatkan ketahanan/resistensinya terhadap panas semakin meningkat. 6. Jumlah Mikrobia
79
Semakin besar populasi mikrobia, semakin tinggi pula ketahanannya terhadap panas. Proteksi panas dari populasi mikrobia tersebut diperkirakan adanya produksi material yang diekskresikan oleh sel-sel yang bersangkutan. Pengaruh jumlah spora awal dari C.botullinum terhadap Thermal Death Time (TDT) pada 1000C disajikan pada Tabel. TDT didefinisikan waktu yang diperlukan untuk membunuh sejumlah spora atau sel mikrobia pada suhu tertentu. Pada jumlah spora 32 juta diperlukan TDT 110 menit, tetapi pada jumlah spora 92 milyar diperlukan TDT 240 menit. Tabel 6. 3. Pengaruh jumlah spora awal dari C.botallinum terhadap Thermal Death Time (TDT) pada 1000C Jumlah spora
TDT (menit)
92.000.000.000
240
1.640.000.000
125
32.000.000
110
650.000
85
16.400
50
128
40
6. Umur Mikrobia Pada umumnya sel bakteri cenderung resisten terhadap panas ketika berada pada fase pertumbuhan stasioner ( sel tua) dan sangat peka ketika berada pada fase pertumbuhan logaritmik. 7. Suhu Pertumbuhan Ketahanan mikrobia terhadap panas cenderung meningkatkan jika suhu inkubasinya ditingkatkan.
80
8. Senyawa Inhibitor Penurunan ketahanan panas kebanyakan mikrobia terjadi jika pemanasan tersebut dilakukan bersamaan dengan adanya senyawa antibiotik, SO2, atau senyawa penghambat lainnya. 8. Time & Temperatur Kombinasi antara waktu dan suhu sangat menentukan ketahanan mikrobia terhadap panas. Semakin tinggi suhu dan semakin lama waktu pemanasan akan efektif menurunkan populasi mikrobia atau spora. Semakin tinggi suhu, semakin besar efek letalnya. Efek suhu pemanasan terhadap TDT spora C. botulinum disajikan pada Tabel VI. 4. Tabel VI. 4. Efek suhu pemanasan terhadap TDT spora C. botulinum Suhu 0C
Clostridium botulinum (60.109 spore/ml pada buffer pH 7)
Thermofil (150.000 spora/ml pada jus jagung pH 6,1) Menit
100 105 110 115 120
260 120 36 12 5
1140 180 60 17
D. Destruksi Mikrobia dan Parameter yang Digunakan untuk Mengevaluasi Ketahanan Mikrobia / Spora terhadap Pemanasan Agar dapat memahami destruksi termal pada mikrobia akibat pemanasan (pengawetan pangan dan pengalengan) perlu disampaikan konsep dasar dalam proses termal.
1.
Thermal Death Time (TDT)
81
TDT ialah waktu yang
diperlukan
untuk
Waktu Replikasi Pengenceran pemanasan (ulangan)
membunuh sejumlah mikrobia pada
suhu
tertentu.
dipertahankan
konstan
Rerata Jumlah
Suhu
5
20
10
24
dan
10
10
1
65
15
25
1
19
20
50
1
4,5
35
100
1
1,3
waktu dapat ditentukan. TDP = Thermal Death Point ialah temperatur yang diperlukan untuk
membunuh
sejumlah
mikrobia pada waktu tertentu. Misal : 10 menit pada (Tabel pangaruh lemak terhadap TDP). TDT dapat dihitung dengan mengukur ketahanan hidup mikrobia.
1250
Survival (log scale)
240 65
19 4,5
F
0
10
15
25
2400F
Waktu Pemanasan 2. D. Value → Desimal Reduction Time Ketahanan sel terhadap pemanasan dinyatakan dengan Decimal Reduction Time atau nilai D yaitu waktu yang diperlukan untuk mengurangi populasi sebanyak 90% pada suhu tertent atau waktu yang diperlukan untuk merubah sebesar 1 log cycle dalam kurva kecepatan destruksi mikrobia. Makin besar nilai D berarti
82
mikrobia tersebut makin besar ketahanannya terhadap panas. Jika D ditentukan pada suhu 250 0F, maka sering dinyatakan sebagai Dr. Pengaruh pH terhadap nilai D spora C. botulinum pada berbagai produk pangan dengan pemanasan 2400F dapat dilihat pada Tabel 6.5. Tabel 6. 5. Pengaruh pH terhadap nilai D spora C. botulinum pada bergai produk pangan dengan pemanasan 2400F D value (mnt) C.botulinum 2400F
pH
Spagheti, saus tomat, keju
Macaroni
Spanish
Creole
rice
4
0,128
0,127
0,117
4,6
0,223
0,232
0,210
5
0,260
0,306
0,266
7
0,515
0,568
0,550
Jika jumlah spora mula-mula 100 spora, maka penurunan sebesar 90% ialah
90 x 100 spora = 90 spora, dengan kata lain setelah waktu pemanasan 100 tertentu tinggal 10 spora. Dapat pula dimisalkan perubahan dari 107 sel berkurang menjadi 106 sel ( log 107 sel – log 106 sel = 1 log cycle), berarti waktu yang diperlukan untuk merubah sejumlah sel 90% atau 1 log cycle tersebut sebagai besarnya nilai D. Waktu pemanasan
83
log Σ bakteri
7
Dt 0 C = 4 mnt
6 ←D→ 5
2
4
6
8
10
t 12
Waktu pemanasan (mnt)
3. Z. Value Nilai D suatu jenis mikrobia akan berbeda dengan suhu pemanasan yang berbeda. Ketahanan panas pada suhu yang berbeda ini dapat digambarkan pada liku TDT dengan nilai D sebagai sebagai ordinat dan suhu pemanasan sebagai absisnya. Besarnya kenaikan suhu (oF) yang dibutuhkan dalam suatu liku TDT untuk melalui harga D satu satuan log disebut dengan nilai Z. Dengan kata lain, nilai Z ialah besarnya suhu yang diperlukan untuk merubah (bisa naik atau turun) sebesar 1 log cycle nilai D. nilai D dan Z ini sangat penting artinya perhitungan-perhitungan proses pemanasan. Perbandingan daya tahan terhadap panas dari beberapa jenis bakteri dan spora bakteri yang penting dalam kerusakan makanan kaleng terlihat pada Tabel 6.6.
10
Σnilai Z = 15 C
D 1 0,
100
0
←Z→
D
113 31
10
8
2,3 0,65
,1 Z =17,5
80
95
100
Suhu Pemanasan
220
240
260
Suhu Pemanasan
84
Tabel 6. 6. Perbandingan daya tahan terhadap panas beberapa organism yang penting dalam kerusakan makanan kaleng Kelompok mikorganisme
Pekiraan kisaran daya terhadap panas D (menit)
z (kisaran 0C)
Bahan pangan berasam sedang dan rendah (pH di atas 4,5) Thermofilik ( spora ), Flat D121 sour B.stearothermofilus 4,0 – 5,0 7,6 – 12,1 Pembusuk bentuk gas C. Thermosaccharolyticum 3,0 – 4,0 8,8 – 12,1 Pembusuk pembentuk sulfite C. nigrificans 2,0 – 3,0 8,8 – 12,1 Mesofilik ( spora) Pembusuk aneorobik C. botulinum (tipe A,B) 0,1 – 0,20 7,6 – 10,0 Sporogenus 0,1 – 1,5 7,6 – 10,0 (termasuk PA 3679) Bahan pangan asam (pH 3,7 atau 4.0 -4,5) Thermofilik (spora) 0,01 – 0,07 7,6 – 10,0 B.Thermoacidurans (fakultatif mesofilik) Mesofilik (spora) D100 B. polymixa, B. macerans 0,10 – 0,50 6,5 – 8,8 Anaerobic butirik C. Pasteurianum 0,10 – 0,50 6,5 – 8,8 Bahan pangan berasam tinggi (pH dibawah 3,7 atau 4,0) Mesofilik bakteri tidak berspora d65 Lactobacillus,Leuconostoc 0,5 – 1,0 4,4 – 5,5 spp, ragi, jamur
85
4. F0 Value F0 adalah waktu yang diperlukan untuk mematikan / membunuh sejumlah spora/bakteri tertentu pada suhu 121,210C atau 252 0F dengan nilai Z sebesar 100C atau 18 0F. Besarnya suhu dan Z tersebut digunakan sebagai referensi. Menurut Esty dan Meyer serta Townsend, nilai F0 untuk Clostridium botunum adalah 2,45. Nilai ini dihitung pada larutan buffer fosfat sebagai media pemanas. Dengan demikian nilai F0 untuk medium yang lain misalnya pada bahan pangan dapat ditentukan dengan metoda the inoculated pack system sebagai modifikasi metoda kaleng. Untuk mengamankan produk pangan yang dikalengkan biasa digunakan konsep 12 D atau faktor 12 decimal value. Dengan demikian pada konsep ini diterapkan pengurangan sampai 10-12 dari jumlah sel/spora mikrobia mula-mula. Menurut Stumbo (1973), pada proses pengalengan makanan apabila tiap kaleng sudah mengandung 1 spora / sel mikrobia, maka hal ini menunjukkan sanitasi yang buruk, maka nilai Fo dapat dihitung. Fo = Dr (log a – log b) Fo = 0,21 (log 1 – log 10 -12) Fo = 0,21 x 12 = 2,52 (menit) Pemanasan selama 2,52 menit pada 2500F (Dr) dapat mengurangi spora C. botulinum menjadi 1 spora atau 1 kaleng kemungkinan / probabilitas terjadi (masih hidup) dari 1012 kaleng. Dalam praktek proses termal, Fo yang diberikan sering lebih lama dari nilai Fo teoritis. Hal ini ada kekawatiran jangan-jangan produk yang dipanaskan belum steril.tentu saja ini akan memboroskan energi dan dapat merusak atribut mutu bahan pangan yang dikalengkan. Bahan makanan yang bersifat asam biasanya (yoghurt, kefir, picles) diproses dengan konsep 5–6 D.
86
Log D2 –Log D1 = 1.00
D value of Fi
100
10
D1
1
0,1 220
230
240
250
260
270
280
0
Temperature ( F)
Gambar 6.1 . Kurva TDT pada 2500F dengan D 1 menit 5. Thermal Death Time Kurva Sebagaimana dijelaskan terdahulu nilai D dapat diperoleh dari kurva Thermal Death Time. Ketahanan spora dari mikrobia termofil dan mesofil dapat dibandingkan dengan menggunakan nilai Dr (menit) dari mikrobia berikut. B. stearothermoplhilus 4 – 5 2,52 menit C. thermosccharolyticum 3 – 4 C. negrificaus 2 – 3 C. botulinum (tipe A + B) 0,1 - 0,2 C. sporagenes 0,1 - 1,5 B. coagolans 0,01- 0,07
87
E. Cara-Cara Pengukuran Ketahanan Terhadap Panas Daya tahan sel atau spora mikrobia terhadap panas dapat ditentukan dengan beberapa macam cara. Pada prinsipnya ada dua metoda dasar yaitu “successive sampling system” dan “multiple replicate unit testing system”. Pada metoda yang pertama dasarnya adalah memanaskan suatu inokulum dalam suatu wadah. setiap interval waktu tertentu diambil sejumlah cuplikan kemudian ditumbuhkan dengan metode SPC (Standart Plate Count Method). Ketahanan terhadap panas dinyatakan dengan hubungan antara pengurangan jumlah (destruksi) dengan lama pemanasan.
1. Metode Successive Sampling System Ada empat macam cara yang telah dikembangkan dari metoda “successive sampling system”, yaitu a. Pemanasan dalam wadah gelas (flash method), b. Pemanasan dengn menggunakan tanki(tank method), c. Atmospheric mixing method dan d. Nitrogen pressure mixing method.
Pemanasan Dengan Wadah Gelas (Flash Method) Pengukuran ketahanan panas dengan metoda ini dikerjakan dengan menggunakan botol Woulff, yaitu suatu wadah gelas yang mempunyai 3 leher menyempit, masing-masing untuk memasukkan pengaduk, thermometer dan untuk memasukkan inokulum serta untuk mengambil cuplikan. Semua leher ditutup dengan karet penutup atau kapas sehingga tidak terjadi kontaminasi selama percobaan. Botol beserta isinya kemudian dipanaskan dengan pemanas yang suhunya dapat dikontrol dengan termostat.selama pemanasan dilakukan pengadukan. Setelah suhu didalam botol stabil inokulum dimasukkan sambil pengadukan berjalan terus. Tiap interval
88
waktu tertentu diambil cuplikan kemudian ditumbuhkan pada medium yang sesuai dan dihitung jumlah spora yang masih hidup. Pemanasan Dengan Tangki (Tank Method) Pada pengukuran ketahanan panas dengan metoda ini dipergunakan tabung khusus yang terbuat dari logam nirkarat (stainless steel), bergaris tengah 4 inci dengan tingginya 4,5 inci. Tabung ini merupakan tabung utama yang pada bagian luarnya setinggi 2 inci diberi tabung penutup yang berjarak 0,75 inci dari tabung utama. Antara tabung penutup dan tabung utama terdapat rongga yang dapat diisi dengan uap panas. Tabung utama diberi tutup yang terbuat dari karet yang mempunyai 4 lubang, masing-masing untuk memasang thermometer, pengaduk, pengeluaran gas dan pengambilan cuplikan. Setelah tabung diisi dengan substrat dan inokulus, segera dipanaskan. Perlakuan pemanasan dilakukan sedemikian rupa, supaya suhu pemanas 1100-1200C. (230-2500F) dapat dicapai dalam waktu 2,5 menit.
Atmosferic Mixing Method Metode ini dikembangkan khusus untuk proses pasteurisasi. Alat yang digunakan sangat sederhana, yaitu suatu gelas piala yang berkapasitas 4 liter. Ke dalam gelas piala ini dimasukkan pipa yang dapat dilalui oleh air pemanas. Susu atau bahan cair lain yang akan digunakan untuk percobaan tang telah steril dimasukkan kedalam gelas piala kemudian dipanaskan. Setiap 200 ml bahan ditambahkan 1 ml inokulum. Pada setiap interval waktu tertentu diambil contoh untuk ditumbuhkan pada medium yang sesuai.
Nitrogen Pressure Mixing Method Metode ini merupakan modifikasi dari metode Atmoferic mixing method. Pada prinsipnya gas nitrogen dengan tekanan rendah diberikan diatas permukaan medium cair yang telah diinokulasi dengan sel atau spora bakteri, dengan maksud untuk menjaga agar supaya suhu pemanasan tidak banyak berubah. Sebagai pemanas digunakan uap panas yang dialirkan melalui pipa-pipa pemanas yang diletakkan 89
dalam wadah yang dipergunakan untuk percobaan. Pengambilan contoh selama pemanasan dilakukan seperti pada metoda-metoda yang lain.
2. Metode Multiple Replicate Unit Testing System Untuk metoda yang kedua yaitu multiple replicate unit testing system dikembangkan menjadi beberapa cara, diantaranya: 1. Metode tabung gelas, 2. Metoda tabung kapiler, 3. Metoda kaleng dan 4. Metoda Thermoresistometer. Metoda Tabung Gelas Alat yang digunakan adalah tabung reaksi kecil, dengan garis tengah kurang 7-10 mm. kedalam tabung dimasukkan spora-spora bakteri yang telah disuspensikan kedalam buffer fosfat netral sebanyak 2 ml. buffer fosfat dapat diganti dengan air, kultur media ataupun bahan acir lain yang dikehendaki. Tabung kemudian ditutup rapat kemudian dipanaskan dengan penangas minyak yang suhunya dikontrol dengan thermostat. Suhu pemanasan antara 100-121,10C. Setelah pemanasan selesai segera dilakukan pendinginan pada suhu 21,10C. Tutup tabung dibuka, isinya dipindahkan secara apsetik kedalam medium untuk melihat pertumbuhannya. Biasanya digunakan satu seri tabung yang terdiri atas 10 tabung untuk tiap pemanasan. Evaluasi dilakukan dengan melihat sampai seberapa jauh pemanasan dapat menghasilkan hanya satu tabung saja yang tumbuh. Metoda ini sering disebut metoda tumbuh atau tidak tumbuh (growth or no grwth method). Stumbo memuat hubungan antara waktu pemanasan, nilai D dan jumlah mikrobia awal dan jumlah mikrobia setelah pemanasan: U = F = D ( log a + P) D = nilai D (Decimal Reduction Time) a = jumlah awal mikrobia
90
P =log 1/b, dimana b adalah mikroorganime yang masih hidup setelah pemanasan selama U menit. Metoda Tabung Kapiler Metoda tabung kapiler merupakan modifikasi metoda tabung gelas untuk mengurangi kelemahan-kelemahan yang terdapat pada metoda tersebut. Metoda ini mempergunakan tabung kecil. Sehingga panas yang diberikan dapat merata ke seluruh bagian medium. Tabung kapiler ini berukuran panjang 3 inci diameter dalam 0,8 mm dan diameter luarnya 1,5 mm.setelah diisi inokulum sebanyak 0,01 ml dengan mempergunakan syringe, tabung ditutup rapat dengan memanaskan ujungnya. Kemudian dipanaskan dalam waktu tertentu, kemudian tabun kapiler dipecah diatas medium perkecambahan, kemudian diinkubasi dan diamati. Metoda Kaleng Kaleng dari logam special yang mempunyai garis tengah 2,5 inci dan tinggi 0, 375 inci, merupakan alat utama untuk penentuan ketahanan panas dengan metoda kaleng. Metoda ini dikembangkan oleh American Can Company pda tahun 1938. Karena wadah yang dipergunakan adalah kaleng, memberikan kemungkinan untuk mengadakan penelitian ketahanan panas bacteria dalam bahan makanan padat maupun cairan kental yang tidak mungkin dimasukkan ke dalam tabung gelas maupun tabung kapiler. Sebelum digunakan kaleng harus dibersihkan dan disterilkan. Seri-seri kaleng kemudian dipanaskan sesuai dengan suhu yang dikehendaki. Setiap interval waktu tertentu satu seri kaleng diangkat dan di inkubasi pada suhu yang sesuai. Evaluasi didasarkan pada terdapat tidaknya kaleng yang menggelembung. Jika ada kaleng yan menggelembung berarti sel atau spora masih dapat tumbuh.
Metoda Thermoresistometer Thermoresistometer merupakan alat yang agak kompleks terdiri atas tiga buah tangki yang dihubungkan dengan pipa-pipa sehingga dapat disterilkan bersama-sama dengan uap panas bertekanan. Kaleng-kaleng yang dipergunakan untuk pengujian dapat keluar masuk secara otomatis. Suhu pemanasan harus dicapai pada waktu yang 91
sangat singkat untuk memperpendek waktu adaptasinya. Umumnya diperlukan suhu 1500 + 0,170C dan harus dicapai dalam waktu 0,02 menit. Pengambilan contoh harus dilakukan dengan cepat untuk mengurangi pengaruh perubahan suhu yang disebabkan terlalu lamanya alat dibuka. Keuntungan metoda ini adalah waktu lag yang sangat pendek sehingga kesalahan yang disebabkan oleh panjangnya waktu lag dapat diperbaiki. Sebagai contoh perhitungan nilai D, berikut disajikan data hasil pemanasan puree terhadap bakteri anaerob ( Tabel 6.7). Berdasarkan data tersebut diatas, umumnya dikatakan bahwa waktu destruksi pada suhu 2500F (121,10F) adalah 6 menit, atau ada yang mengatakan waktu destruksi tersebut adalah 5,5 menit. Namun apabila digunakan persamaan : U=D (log a + P), akan diperoleh suatu informasi yang lebih nyata. Jika jumlah sampel yang dipanaskan untuk setiap interval waktu pemanasan adalah 12, dan tiap sampel memuat 6.250 spora, maka untuk setiap interval waktu pemanasan jumlah spora yang dipanaskan adalah 75.000 spora, maka U = D ( log 75.000 + P). Untuk pemanasan selama 5 menit, P adlah log 1/3, sehingga 5 = D ( log 75.000 + log 1/3) 5 D= Log 75.000 + (log 1 – log 3) D = 1,137 menit Tabel 6.7. Ketahanan panas bakteri anaerobik penyebab pembusukan pada “pureed canned peas”, yang dipanaskan pada suhu 2500F*
Jumlah sempel yang dipanaskan untuk setiap interval waktu pemanasan
Lama waktu pemanasan (menit)
Jumlah sempel yang menunjukkan adanya pertumbuhan setelah pemanasan
92
12
1,00
12
12
2,00
12
12
3,00
12
12
4,00
10
12
5,00
3
12
6,00
0
12
7,00
0
12
8,00
0
12
9,00
0
*Tiap sampel memiliki konsentrasi awal 6.250 spora Jika waktu pemanasan selama 6 menit disubsitusikan pada persamaan tersebut, maka besarnya P adalah : 6 = 1,137 (log 75.000 + P) P = 0,404 P = log 1/b, dimana b adalah spora yang masih hidup setelah pemanasan. Jika P = log 1/b =0,404, maka 1/b=2,536 sehingga besarnya nilai b, yaitu jumlah spora yang masih hidup adalah 1/2,536. Angka terakhir ini diartikan atau diinterpresentasikan bahwa masih ada satu spora yang hidup untuk setiap 2,536 volume bahan makanan, dan setiap volume memuat 75.000 spora apabila bahan tersebut dipanaskan pada suhu 2500F (121,10C) selama 6 menit. Berdasarkan prinsip ini dikatakan bahwa jumlah sel atau spora yang hidup tidak akan pernah mencapai 0, akan tetapi menjadi sangat kecil, misalnya 1 dalam 100 liter, 1 dalam 1000 liter, 1 dalam 100.000 liter dan seterusnya. Hal lain yang perlu diperhatikan ialah bahwa setiap metoda pasti memuat kemungkinan kesalahan, dan besar kecilnya kesalahan pada penentuan ketahanan panas ini tergantung pada jumlah ulangan dan jarak atau interval waktu pemanasan.
93
Liku Ketahanan Hidup Mikrobia Sebagaimana dijelaskan terdahulu kurva hubungan jumlah sel yang di-log (sebagi ordinat) dengan waktu pemanasan (sebagai absis), jika dilakukan proses termal dimana suhu yang diterapkan di atas suhu yang tidak dapat ditoleransi akan memliki garis lurus (Gambar a). Tetapi kurva ketahanan hidup sel / spora dapat tidak normal, karena adanya aktivasi, germinasi, dan pertumbuhan spora akibat pemanasan dimana pada suhu tersebut menguntungan bagi pertumbuhan spora tersebut, meskipun setelahnya akan mengalami kematian karena berbentuk sel vegetatif yang dapat mati pada suhu paparan (Gambar B). Jika jumlah sel yang bertambah seimbang dengan jumlah sel yang mati pada wal pemanasan, kurva akan berupa Gambar (C). Sedangkan jika berupa mikrobia campuran (mixed), ada yang resisten dan ada yang sensifit, maka bentuk kurva merupakan resultan dari mikrobia yang ada dan
Normal
Σ Sel hidup
Σ Sel hidup
ditunjukkan pada Gambar (D).
A
B
C
D
0
→t pemanasan
Tugas untuk dikumpul: Hitung nilai D 1. ∑ sel awal 109 sel/ml setelah dipanaskan pada 900C tinggal 102 sel/ml; t pemanasan = 60 menit, berapa nilai D?
94
2. Hitung nilai D1000C; jika diketahui D1200C = 0,6 menit, Z value = 100C. Berapa waktu yang diperlukan mengurangi populasi sel sebesar 5 log cycle pada 1300C. Jawab
:
dikumpulkan
ketika
tatap
muka
or
diemailkan
ke
[email protected]
95
