45
BAB IV METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini dirancang menjadi dua tahap yaitu : (1) Tahap I menggunakan metode eksploratif untuk mendapatkan ekstrak bubuk simplisia bunga Kamboja Cendana yang paling berpotensi sebagai antioksidan. Pelarut yang digunakan sebagai bahan pengekstrak adalah aquades, asam asetat 50%, etanol 96%, campuran etanol 96% - asam asetat 50% dengan perbandingan 1 : 1, dan metanol 80%. Ekstraksi pada penelitian tahap I menggunakan metode maserasi selama 24 jam pada suhu 28oC.
Proses ekstraksi dilakukan dalam
inkubator dan terlindung dari cahaya matahari. (2) Tahap II menggunakan metode eksperimen dengan rancangan penelitian adalah Rancangan Acak Lengkap dengan satu perlakuan. Perlakuan penelitian adalah dosis ekstrak bubuk simplisia Bunga Kamboja Cendana yang terdiri atas enam taraf yaitu dipapar dengan ekstrak 0 mg/kg bb/hari atau diberi aquades 5 ml/ekor/hari, disebut sebagai kontrol negatif (P0), dipapar dengan ekstrak bubuk simplisia (P1) sebesar 50 mg/kg bb/hari, dipapar dengan ekstrak bubuk simplisia (P2) 100 mg/kg bb/hari, dipapar dengan ekstrak bubuk simplisia (P3) 150 mg/kg bb/hari, dipapar dengan ekstrak bubuk simplisia (P4) 200 mg/kg bb/hari, dan dipapar dengan vitamin C 50 mg/kg bb/hari atau disebut sebagai kontrol positif (Vit C). Pada rancangan ini diasumsikan bahwa dalam suatu populasi tertentu, tiap unit populasi adalah homogen yang artinya semua karakteristik antar unit
46
populasi adalah sama. Diagram rancangan penelitian pada tahap ini disajikan pada Gambar 4.1.
P0 P1 P2 P
S
O0 O1 O2
P3
O3
P4
O4
VitC
O5
Keterangan : P : populasi tikus jantan galur Sprague Dawley (SD) S : sampel tikus jantan galur SD O : observasi P0
: dipapar dengan ekstrak bubuk simplisia 0 mg/kg bb/hari atau aquades 5 ml/ekor/hari
P1
: dipapar dengan ekstrak bubuk simplisia 50 mg/kg bb/hari
P2
: dipapar dengan ekstrak bubuk simplisia 100 mg/kg bb/hari
P3
: dipapar dengan ekstrak bubuk simplisia 150 mg/kg bb/hari
P4
: dipapar dengan ekstrak bubuk simplisia 200 mg/kg bb/hari
Vit C
: dipapar dengan vitamin C 50 mg/kg bb/hari
Gambar 4.1 Diagram Rancangan Penelitian Pada tahap ini dilakukan pula analisis senyawa aktif yang terkadung di dalam ekstrak bubuk simplisia Bunga Kamboja Cendana menggunakan gabumgan instrumen Gas Cromatografi - Mass Spectrofotometri (GC-MS). Analisis ini akan mengkonfirmasi senyawa dominan di dalam ekstrak yang dapat digolongkan
47
sebagai senyawa antioksidan. Analisis toksisitas akut dilakukan pula pada tahap II ini menggunakan hewan percobaan mencit galur Balb/C.
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian Tahap I dilakukan di Laboratorium Analisis Hasil Pertanian, Laboratorium Pascapanen, dan Laboratorium Pengolahan Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. Penelitian Tahap II dilakukan di Universitas Gadjah Mada Yogyakarta pada Laboratorium Kimia Organik Fakultas MIPA, UPT Pra Klinik dan Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan, PAU Pangan dan Gizi, dan di Laboratorium Patologi Anatomi FKH. Waktu penelitian dilakukan bulan Januari 2010 sampai dengan bulan Januari 2011.
4.3 Penentuan Sumber Data 4.3.1 Populasi (1) Populasi target pada penelitian eksperimental adalah seluruh tikus jantan galur SD berumur dua bulan dengan berat badan 200 sampai dengan 210 g. (2) Populasi terjangkau adalah seluruh tikus jantan galur SD berumur dua bulan yang diperoleh dari UPT UPHP UGM. 4.3.2 Kriteria sampel (1) Kriteria inklusi sampel adalah tikus jantan galur SD berumur dua bulan dengan berat badan 200 sampai dengan 210 g, sehat serta makan dan minum dengan normal.
48
(2) Kriteria eksklusi sampel adalah tikus jantan galur SD berumur dua bulan yang sakit. 4.3.3 Penentuan jumlah ulangan dan sampel Penentuan jumlah ulangan mengikuti rumus penentuan replikasi yang dilakukan oleh Montgomery (2001) yaitu dihitung berdasarkan rumus : (t-1) (r - 1) ≥ 15 Keterangan : t
: banyaknya taraf perlakuan
r
: banyaknya replikasi (ulangan)
Dalam penelitian ini t = 6, sehingga (6-1)( r-1) ≥ 15, dengan memakai rumus tersebut akhirnya diperoleh jumlah r = 4 yang artinya ulangan dilakukan minimum empat kali, sehingga sampel yang diperlukan pada penelitian ini adalah minimum 24 ekor sampel. Pada penelitian ini digunakan 36 ekor sampel tikus jantan galur SD berumur dua bulan dengan berat badan 200 sampai dengan 210 g. Dari 36 ekor ini diambil masing-masing enam ekor untuk setiap taraf perlakuan sehingga jumlah ulangan adalah enam kali. Digunakannya jumlah sampel yang lebih besar pada penelitian ini untuk menghindari terjadinya kekurangan sampel sampai pada akhir penelitian yang diduga akibat kematian sampel.
4.4 Variabel Penelitian 4.4.1 Variabel bebas Dalam penelitian ini yang menjadi variabel bebas adalah dosis ekstrak bubuk simplisia bunga Kamboja Cendana yang dikonsumsi oleh tikus percobaan.
49
4.4.2 Variabel tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah kapasitas antioksidan hati, kadar MDA hati, aktivitas enzim SOD, GPx, dan CAT pada hati tikus percobaan, dan toksisitas ekstrak. 4.4.3 Variabel kendali Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap variabel tergantung di luar variabel bebas akan dikendalikan. Faktor-faktor yang dikendalikan tersebut adalah jenis kelamin, umur, dan berat badan tikus jantan galur SD. 4.4.4 Difinisi operasional variabel Definisi operasional variabel disajikan di bawah ini. 1.
Bubuk simplisia : Bubuk yang diperoleh dari Bunga Kamboja Cendana yang telah dikeringkan dengan kadar air 8 persen
2
Kapasitas antioksidan
: Kemampuan antioksidan
suatu untuk
senyawa
yang
menghambat
mengandung laju
reaksi
Pembentukan radikal bebas yang diukur menggunakan radikal DPPH dengan standar asam galat (%) 3
Ekstraksi
: Pemisahan senyawa antioksidan dari bubuk simplisia bunga Kamboja menggunakan pelarut air, asam sitrat, etanol, etanol-asam, dan metanol.
4
Total fenol
: Jumlah senyawa fenol yang terdapat di dalam ekstrak bubuk simplisia Bunga Kamboja Cendana yang diukur menggunakan pereaksi folin-cioccalteu phenol (%).
5
Fraksinasi
: Pemisahan komponen-komponen dari suatu senyawa antioksidan menggunakan kolom fraksinasi dengan fase diam adalah senyawa tertentu dan fase bergerak adalah senyawa yang komponen-komponennya akan dipisahkan.
50
6
Senyawa aktif
: Senyawa yang berperan sebagai antioksidan.
7
AnalisisGC-MS
: Analisis menggunakan gabungan dua instrumen yaitu kromatografi
gas
Kromatografi
gas
berbagai
senyawa
dan
spektrometer
berfungsi dalam
untuk campuran
massa.
memisahkan didasarkan
distribusi senyawa pada fase gerak dan fase diam. Spektrometer massa berfungsi
mendeteksi molekul
senyawa yang telah dipisahkan berdasarkan pada penguraian senyawa organik dan perekaman pola fragmentasi menurut massanya. 8
Rendemen
: Produk yang dihasilkan dibagi dengan bahan baku (%)
9
Aktivitas GPx
: Kemampuan enzim GPx untuk mereduksi H2O2 menjadi senyawa organik hidroperoksida (ROOH) (U/mg).
10
Kadar MDA
: Kandungan senyawa malondialdehida menggunakan larutan standar tetraetoksipropana (nmol/mg protein).
11
Aktivitas enzim : Kemampuan enzim SOD untuk menangkap radikal SOD
12
anion superoksida (%).
Aktivitas CAT
: Kemampuan
enzim
Katalase
untuk
mereduksi
senyawa hidrogen peroksida (U/mg). 13
HED mg/kg
: Human Equivalent Dose (mg/kg) berdasarkan body surface area.
14
Ekstrak air
: Hasil ekstraksi menggunakan pelarut air dengan suhu 28oC selama 24 jam.
15
Ekstrak
asam : Hasil ekstraksi menggunakan pelarut asam asetat 50%
sitrat 16
Ekstrak etanol
suhu 28oC selama 24 jam. : Hasil ekstraksi menggunakan etanol 96% pada suhu 28oC selama 24 jam.
17
Ekstrak etanol- : Hasil ekstraksi menggunakan etanol 96% dan asam asam
asetat 50% pada suhu 28oC dengan perbandingan 1:1 selama 24 jam.
51
18
Evaporasi
19
Kering
20
: Proses pemekatan larutan hasil ekstraksi. beku : Proses pengeringan dengan suhu sangat rendah (di
(freeze drying)
bawah -50oC) sehingga mendapatkan produk bubuk.
Toksisitas akut
: Efek toksik suatu senyawa yang terjadi secara singkat (24 jam) setelah pemberian dosis tunggal yang bertingkat pada hewan percobaan.
21
LD50
: Dosis yang dapat menimbulkan kematian 50% hewan percobaan.
22
Karaktiristik
: Sifat-sifat khas pada ekstrak bubuk simplisia Bunga Kamboja
Cendana
yaitu
rendemen,
kapasitas
antioksidan, tannin, total fenol dan vitamin C.
4.5 Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bunga Kamboja Cendana yang diperoleh dari perkebunan kamboja di daerah Renon, Kota Denpasar, tikus jantan galur Sprague Dawley dan mencit putih jantan galur Balb/C dari UPT UPHP UGM, heksana, etil asetat, aquades, asam sitrat 50%, etanol 96%, metanol 80%, kloroform, aseton, formalin, vitamin C, gas CO2 dan pakan tikus standar. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis adalah pro analisis seperti etanol, metanol, etil asetat, kloroform, heksana, akuades, KCl , H2SO4, K2SO4, NaOH, folin-ciocalteu phenol, follin dennis dari Merck, asam gallat, radikal DDPH, HCl, TCA, TBA, TEP dan BHT dari Sigma, phosphat buffer salin (PBS), NaHCO3, NH4Cl, xantin oxidase, xantin, NaEDTA, H2O2, bovine serum albumin (BSA) 0,5%, NBT 2,5 mM, dan kertas saring Whatmann.
52
4.6 Instrumen Penelitian Peralatan yang digunakan adalah timbangan analitik, timbangan biasa, oven pengering, spektrofotometer, kompor listrik, , GC-MS, termometer, cabinet dryer, vacuum dryer dan freeze dryer, blender, ayakan berukuran 40 mesh, rotary vacum evaporator, inkubator, sentrifuse, pendingin, freezer,
pH meter,
homogenizer, spektrofotometer, pengemas vakum, mikroskop dengan kamera, spuit, alat-alat bedah tikus, dan alat-alat gelas (glassware).
4.7 Prosedur Penelitian 4.7.1 Penelitian tahap I Bunga Kamboja Cendana diperoleh dari perkebunan kamboja di daerah Sanur, Kota Denpasar, Provinsi Bali. Bunga kemudian disortir untuk mendapatkan kesegaran dan ukuran yang seragam.
Selanjutnya bunga segar
dilayukan selama 24 jam untuk melemaskan dan sekaligus mengurangi kadar air. Bunga layu dikeringkan di dalam cabinet dryer dengan suhu 60oC sampai kadar air 8%. Bunga Kamboja Cendana kering ini disebut dengan simplisia Bunga Kamboja Cendana. Simplisia dihaluskan dengan blender dan diayak untuk mendapatkan ukuran bubuk simplisia 40 mesh. Bubuk dikemas vakum, disimpan di dalam refrigerator suhu -4oC sebelum dilakukan proses ekstraksi. (1) Ekstraksi dengan air Diambil 5 g bubuk dan dimasukkan ke dalam gelas beaker, kemudian ditambahkan akuades dengan suhu 28oC sampai volume 200 ml.
Proses ini
dilakukan di dalam inkubator selama 24 jam. Setelah itu campuran tersebut
53
disaring dengan kertas Whatmann no. 4 sehingga didapat ekstrak air. Ekstrak ini kemudian dikeringkan dengan
freeze dryer dan disimpan dalam refrigerator
dengan temperatur -10oC. (2) Ekstraksi dengan asam asetat Diambil 5 g bubuk dan dimasukkan ke dalam gelas beaker, kemudian ditambahkan asam asetat 50% dengan suhu 28oC sampai volume 200 ml. Proses ini dilakukan di dalam inkubator selama 24 jam. Setelah itu campuran tersebut disaring dengan kertas whatmann no. 4 sehingga didapat ekstrak asam. Ekstrak ini kemudian dikeringkan dengan freeze dryer dan disimpan dalam pendingin pada suhu -10oC. (3) Ekstraksi dengan etanol 96% dan metanol 80% Diambil 5 g bubuk dan dimasukkan ke dalam gelas beaker, kemudian ditambahkan etanol 96% sampai volume 200 ml. Campuran ini dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 28oC dan dibiarkan selama 24 jam. Setelah itu campuran disaring dengan kertas Whatmann no. 4 dan diuapkan dengan rotary vacum evaporator pada suhu 45oC sampai seluruh pelarut menguap. Ekstrak kemudian disimpan di dalam refrigerator dengan suhu -10oC sebelum dianalisis. Ekstraksi dengan metanol dilakukan sama dengan ekstraksi etanol. (4) Ekstraksi dengan etanol-asam asetat Diambil 5 g bubuk dan dimasukkan ke dalam gelas beaker, kemudian ditambahkan etanol 96% sebanyak 100 ml dan asam asetat sebanyak 100 ml. Campuran ini dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 28oC dan dibiarkan selama 24 jam. Setelah itu campuran disaring dengan kertas Whatmann no. 4 dan
54
diuapkan dengan rotary vacum evaporator pada suhu 45oC sampai seluruh pelarut menguap. Ekstrak kemudian disimpan di dalam refrigerator dengan suhu -10oC sebelum dianalisis. Prosedur penelitian tahap I disajikan pada Gambar 4.2. Bunga Kamboja Cendana Pelayuan 24 jam Pengeringan dengan cabinet dryer 60oC sampai kadar air 8% Penghalusan dan pengayakan Bubuk simplisia ukuran 40 mesh
Diekstrak dengan air, asam asetat, etanol, etanol-asam dan metanol kemudian dipisahkan pelarutnya Ekstrak senyawa aktif Analisis rendemen, total fenol, kapasitas antioksidan (DPPH assay),tannin, dan vitamin C Senyawa aktif yang berpotensi sebagai antioksidan
Gambar 4.2 Diagram Alir Penelitian Tahap I
55
4.7.2 Penelitian tahap II (1). Penetapan dosis dan persiapan ekstrak bubuk simplisia Bunga Kamboja Dosis yang diberikan adalah dosis lazim konsumsi suplemen per hari pada manusia yang dikonversi dari manusia ke tikus. Perhitungan pemberian dosis berdasarkan pada “body surface area” (BSA) mengikuti penelitian yang dilakukan oleh Reagan-Shaw et al. (2007). Tabel konversi dosis manusia ke dosis tikus disajikan pada Lampiran 9. Rumus konversi dosis disajikan sebagai berikut : HED (mg/kg) = animal dose (mg/kg) X animal Km/ human Km Diasumsikan suplemen antioksidan perhari pada manusia rata-rata sebesar 500 mg/60 kg bb, maka HED (mg/kg) = 8,3. Apabila dikonversi ke tikus maka perhitungan menjadi : 8,3 mg/kg = animal dose (mg/kg bb) X 6/37 Animal dose = 8,3 X 37/6 = 51,2 mg/kg bb Berdasarkan perhitungan di atas, maka dosis yang diberikan untuk tikus bervariasi dari 50 mg, 100 mg, 150 mg, dan 200 mg per kilogram berat badan tikus. Ekstrak bubuk simplisia yang sudah ditimbang beratnya sesuai dengan dosis yang akan diberikan pada tikus dilarutkan di dalam 5 ml aquades kemudian disentrifuse agar tercampur dengan merata.
Masing-masing dosis ekstrak
kemudian dipaparkan ke tikus setiap pagi pada jam 06.30 – 07.30 WIB. (2). Penelitian dengan tikus percobaan Tikus jantan galur SD diadaptasi selama satu minggu, kemudian diambil sebanyak 36 ekor dan dibagi menjadi enam kelompok. Setiap kelompok terdiri
56
atas enam ekor tikus sebagai ulangan. Perlakuan diberikan selama tujuh minggu. Setiap ekor tikus menempati satu kandang sehingga diperlukan 36 kandang tikus. Kondisi kandang diatur sedemikian rupa agar pengaturan gelap terang berlangsung secara alami dan suhu kandang berkisar antara 23 sampai dengan 25oC. Kandang tikus dibersihkan dua kali seminggu. Pakan yang diberikan pada semua tikus selama masa adaptasi dan masa penelitian adalah sama yaitu pakan standar yang diberikan secara ad libitum. Pemberian pakan dilakukan setiap hari pada pukul 08.30 WIB dan penimbangan berat badan dilakukan setiap dua hari sekali.
Pemberian ekstrak senyawa
antioksidan dilakukan dengan cara melarutkan ekstrak ke dalam 5 ml aquades, kemudian dihomogenkan dan dipapar ke tikus per oral sesuai perlakuan dengan cara disonde. Perlakuan yang diberikan adalah sebagai berikut : Kelompok I
: ekstrak 0 mg/kg bb/hari atau 5 ml aquades/ekor/hari
Kelompok II : ekstrak bubuk simplisia 50 mg/kg bb/hari Kelompok III : ekstrak bubuk simplisia 100 mg/kg bb/hari Kelompok IV : ekstrak bubuk simplisia 150 mg/kg bb/hari Kelompok V : ekstrak bubuk simplisia 200 mg/kg bb/hari Kelompok VI : vitamin C 50 mg/kg bb/hari Setelah tujuh minggu masa perlakuan, tikus galur SD diterminasi (euthanasi) dengan CO2 yang dilakukan dengan cepat dan steril. Organ hati diambil dan dicuci dengan Posphat Buffer Saline (PBS), ditiriskan dan ditimbang beratnya, kemudian dikemas dengan alufo dan disimpan di dalam freezer (-20oC)
57
sebelum dianalisis kapasitas antioksidannya, MDA, aktivitas SOD, GPx dan CAT. Bagian tubuh tikus yang tidak digunakan dalam penelitian dimasukkan ke dalam mesin penghancur dan ditampung ke dalam insenerator. (3). Analisis toksisitas akut dengan mencit galur Balb/C Pada penelitian ini digunakan satu jenis hewan uji yaitu mencit putih jantan galur Balb/C, normal dan sehat, usia dewasa (2 bulan), dengan bobot badan 20 sampai dengan 30 gram. Sejumlah 30 ekor mencit dibagi menjadi enam kelompok, masing-masing terdiri dari lima ekor. Pemberian ekstrak dilakukan secara oral dengan dosis tunggal yang bertingkat.
Perhitungan pemberian dosis dilakukan menurut
penelitian Reagan-Shaw et al. (2007). Tabel konversi dosis manusia ke dosis mencit disajikan pada Lampiran 8.
Rumus konversi dosis disajikan sebagai
berikut : HED (mg/kg) = animal dose (mg/kg) X animal Km/ human Km Diasumsikan suplemen antioksidan perhari pada manusia rata rata sebesar 500 mg/60 kg bb, maka HED (mg/kg) = 8,3. Apabila dikonversi ke mencit maka perhitungan menjadi : 8,3 mg/kg = animal dose (mg/kg bb) X 3/37 Animal dose = 8,3 X 37/3 = 102,4 mg/kg bb Pada analisis toksisitas dilakukan paparan ke mencit sebesar 10 kali sampai dengan 50 kali dosis normal sehingga perlakuan menjadi sebagai berikut : Kelompok kontrol
: diberi ekstrak 0 mg/kg bb/hari atau aquades 2 ml/ekor/hari
Kelompok I
: diberi ekstrak 1024 mg /kg bb/hari
58
Kelompok II
: diberi ekstrak 2048 mg /kg bb/hari
Kelompok III
: diberi ekstrak 3072 mg /kg bb/hari
Kelompok IV
: diberi ekstrak 4096 mg /kg bb/hari
Kelompok V
: diberi ekstrak 5120 mg /kg bb/hari
Pemberian ekstrak dilakukan dengan cara melarutkan ekstrak ke dalam dua ml aquades, kemudian dihomogenkan dan dipapar ke mencit per oral sesuai perlakuan dengan cara disonde. Pengamatan gejala toksik dilakukan dalam waktu 24 jam. Kriteria pengamatan meliputi pengamatan fisik, jumlah hewan yang mati, dan pemeriksaan histopatologi organ hati. Apabila dalam 24 jam pengamatan tidak ada hewan yang mati, maka perlakuan pemberian ekstrak dan pengamatan dilanjutkan sampai satu minggu. Setelah satu minggu masa perlakuan, tikus yang masih hidup diterminasi dan diambil organ hatinya yang selanjutnya dilakukan pengamatan histopatologinya. (4). Analisis senyawa aktif dengan GS-MS Penelitian ini bertujuan untuk menentukan senyawa-senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak bubuk simplisia bunga kamboja yang berpotensi sebagai antioksidan. Ekstrak yang diteliti pada penelitian ini adalah ekstrak yang memiliki potensi paling tinggi, berdasarkan hasil penelitian tahap I. Penelitian ini dilakukan melalui tahap isolasi dengan cara fraksinasi dan dilanjutkan dengan tahap analisis GC-MS. Fraksinasi dilakukan dengan kloroform, heksana, dan etil asetat seperti yang dilakukan oleh Putra (2007).
Ekstrak bebas pelarut dicampur dengan
akuades hingga volumenya menjadi 100 ml. Campuran ini dimasukkan ke dalam
59
labu pisah lalu ditambahkan 100 ml kloroform dan dikocok selama 10 menit hingga homogen. Selanjutnya campuran ini didiamkan selama dua jam sehingga terjadi partisi antara fraksi kloroform dan air.
Fraksi air dan fraksi kloroform
dipisahkan, lalu fraksi air kembali dimasukkan ke dalam labu pisah dan dipartisi lagi dengan 100 ml kloroform. Fraksi kloroform yang diperoleh dari dua kali partisi tadi dikumpulkan lalu dikeringkan dengan rotary vacuum evaporator. Fraksi kering yang diperoleh ditimbang, lalu dilarutkan kembali dengan kloroform hingga konsentrasinya menjadi 5%. Fraksi ini disebut sebagai fraksi kloroform. Fraksi heksana dan etil asetat diperoleh dengan cara yang sama dengan fraksi kloroform.
Sisa proses fraksinasi adalah fraksi air. Seluruh hasil fraksinasi
dianalisis kapasitas antioksidannya, fraksi yang memiliki kapasitas tertinggi dianalisis kandungan senyawa aktifnya menggunakan GC-MS. Analisis GC-MS dilakukan berdasarkan metode Erdem dan Olmez (2004). Gas pembawa yang digunakan adalah Helium dengan laju aliran 30 ml per menit. Suhu GC diatur sebagai berikut. Suhu injector 300oC, suhu awal oven adalah 100oC, laju kenaikan suhu 10oC/menit, dan suhu akhir oven 300oC. Identifikasi senyawa dilakukan dengan bantuan komputer menggunakan perangkat lunak Wiley 229, NIST 12, dan NIST 62 Library. Penelitian tahap II disajikan pada Gambar 4.3.
60
Ekstrak yang berpotensi sebagai antioksidan
Fraksinasi, kloroform, etil asetat, dan heksan
Analisis GC-MS
Senyawa aktif dominan pada ekstrak antioksidan
Tikus jantan galur SD
Mencit galur Balb/C
Diadaptasi 1 minggu
Diadaptasi 1 minggu
Dibagi dalam enam kelompok @ enam ekor
Dibagi dalam enam kelompok @ lima ekor
Pemberian ekstrak sesuai perlakuan
Pemberian ekstrak sesuai perlakuan
Analisis DPPH , MDA, GPx, SOD, dan CAT
Analisis Toksisitas LD50 dan histopatologi
Kapasitas antioksidan, kadar MDA, aktivitas enzim SOD, GPx dan CAT
Toksisitas akut (kadar toksik ekstrak)
Gambar 4.3 Prosedur Penelitian Tahap II
61
4.8 Prosedur Analisis Prosedur analisis disajikan pada Lampiran 1 sampai dengan lampiran 9 yang meliputi 10 parameter yaitu : (1) Analisis rendemen (%) (AOAC, 1994) (2) Analisis total fenol (%) (Liu et al., 2002) (3) Analisis kadar tannin (%)(AOAC, 1994) (4) Analisis kadar Vitamin C (%), (AOAC, 1994) (5) Analisis aktivitas antioksidan DPPH scavenging (Okawa et al., 2001) (6) Analisis kadar MDA pada hati tikus (Singh et al., 2002) (7) Pengukuran aktivitas SOD (Kubo et al., 2002 dan Wijeratne et al., 2005) (8) Pengukuran aktivitas CAT (Iwai et al., 2002) (9) Pengukuran aktivitas GPx (Kubo et al., 2002 dan Wijeratne et al., 2005) (10) Analisis toksisitas akut (Wahyono et al., 2007)
4.9 Analisis Data Data dianalisis dengan prosedur sebagai berikut : 4.9.1 Penelitian tahap I Penentuan ekstrak yang paling berpotensi dilakukan dengan menggunakan metode indeks efektivitas (effectiveness index) (De Garmo, et.al., 1984), di mana langkah-langkah yang dilakukan adalah sebagai berikut. Pertama, variabelvariabel yang diamati dalam pemilihan alternatif diurut dan diberikan bobot (weight) berdasarkan tingkat prioritas penentu, kemudian bobot yang diberikan dinormalisasi dengan cara membagi masing-masing bobot dengan jumlah nilai
62
bobot yang diberikan. Selanjutnya, dihitung nilai efektivitas dari masing-masing alternatif dengan mengikuti persamaan berikut. (nilai hasil pengukuran – nilai terburuk) Nilai efektivitas = ---------------------------------------------------------------(nilai terbaik – nilai terburuk) Kemudian, nilai efektivitas yang diperoleh dikalikan dengan nilai normalisasi dari bobot yang diberikan untuk masing-masing parameter. Langkah terakhir adalah menjumlahkan hasil kali nilai efektivitas dengan nilai normalisasi dari masingmasing alternatif. Nilai jumlah yang terbesar adalah merupakan alternatif pilihan terbaik.
4.9.2 Penelitian tahap II Analisis data dilakukan dengan tahapan-tahapan sebagai berikut : (1) Analisis statistik diskriptif untuk menggambarkan karakteristik kelompok perlakuan dan distribusi frekuensi berbagai variabel. (2) Analisis Kolmogorov-Smirnov untuk menguji normalitas data yang dihasilkan dalam penelitian. (3) Analisis homogenitas varians dengan Leven’s Test. (4) Analisis komparasi untuk mengetahui pengaruh antara pemberian dosis ekstrak bubuk simplisia terhadap kapasitas antioksidan, kadar MDA, aktivitas SOD, CAT, dan GPx menggunakan analisis univariat (One Way ANOVA). Apabila terdapat pengaruh yang bermakna (taraf 5%) maka analisis dilanjutkan dengan uji beda rerata antar perlakuan dengan uji perbandingan berganda Duncan.
