Az acetaminofen-indukálta redox stressz az endoplazmás retikulumban

Az acetaminofen-indukálta redox stressz az endoplazmás retikulumban Doktori értekezés

Nagy Gábor

Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola

Témavezető: Prof. Mandl József egyetemi tanár, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Tretter László egyetemi docens, az MTA doktora Dr. Jemnitz Katalin tud. főmunkatárs, az MTA doktora Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Machovich Raymund egyetemi tanár, PhD Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Geiszt Miklós egyetemi adjunktus, PhD Dr. Tordai Attila munkacsoportvezető, PhD Budapest, 2008

TARTALOMJEGYZÉK Rövidítések jegyzéke

5

1. Bevezetés

8

1. 1. Az endoplazmás retikulum

8

1. 1. 1. Az endoplazmás retikulum (ER) szerepe a fehérjeérésben

8

1. 1. 2. Redox folyamatok a fehérjehajtogatódásban

9

1. 1. 3. A glutation szerepe a fehérjehajtogatódásban

12

1. 1. 4. A valódi molekuláris chaperonok szerepe a fehérjehajtogatódásban

13

1. 1. 5. Funkcionális kapcsolat az ER redox státusza és kalciumhomeosztázisa között

15

1. 1. 6. A chaperonok összjátéka

16

1. 2. Endoplazmás retikulum stressz

16

1. 2. 1. Az endoplazmás retikulum stressz létrejötte

16

1. 2. 2. Az ER transzmembrán stressz-szenzorai

18

1. 2. 3. Az UPR pro-apoptotikus jelenségei

22

1. 2. 4. A kaszpázok szerepe az AAP-toxicitásban

24

1. 3. Az acetaminofen

25

1. 3. 1. Az acetaminofen felhasználása

25

1. 3. 2. Az aceataminofen metabolizmusa

26

1. 3. 3. Az acetaminofen-toxicitás mechanizmusa

29

1. 3. 4. A non-parenchima sejtek részvétele az AAP-toxicitásban

31

1. 3. 5. A Ca2+-homeosztázis felborulása AAP-toxicitásban

33

1. 3. 6. AAP-indukálta sejthalál: nekrózis, apoptózis vagy mindkettő?

34

2. Célkitűzések

36

3. Anyagok és módszerek

37

3. 1. Sejtkultúrák

37

3. 2. Vegyszerek és antitestek

38

3. 3. Állatkísérletek

38

3. 4. Szérum enzimaktivitások mérése

39

3. 5. Immunoblot kísérletek

39

2

3. 6. Mikroszómaizolálás

40

3. 7. Mikroszómális glutation mérése

41

3. 8. Sejtes glutationtartalom mérése

41

3. 9. Mikroszómális glutationtranszport mérése gyorsszűréses módszerrel

42

3. 10. Mikroszómális glutationtranszport mérése fényszórásos módszerrel

42

3. 11. Mikroszómális NADPH mérése

43

3. 12. A szabad tiolcsoportok kovalens módosítása (AMS-jelölés)

43

3. 13. Mikroszómális fehérjék karboniláltságának vizsgálata

44

3. 14. RNS-izolálás és real-time PCR

45

3. 15. Apoptotikus sejtek számolása szövetmintában

46

4. Eredmények

47

4. 1. Az AAP-toxicitás mechanizmusa egérmájban

47

4. 1. 1. Az in vivo kísérleti modell kialakítása

47

4. 1. 2. Redox változások vizsgálata AAP-kezelés után

49

4. 1. 2. 1. A mikroszómális glutationszint csökkenése AAP hatására

49

4. 1. 2. 2. A mikroszómális glutationszint csökkenése BSO hatására

50

4. 1. 2. 3. A mikroszómális NADPH-szint csökkenése

53

4. 1. 2. 4. Az ER oxidoreduktázainak redox eltolódása

53

4. 1. 2. 5. Az ER fehérjék karboniláltságának vizsgálata

55

4. 1. 2. 6. Apoptózis vizsgálata

55

4. 1. 3. ER stresszmarkerek vizsgálata AAP-kezelés után

56

4. 1. 3. 1. Az eIF2α foszforilációjának vizsgálata

56

4. 1. 3. 2. Az ATF6 transzkripciós faktor aktivációjának vizsgálata

57

4. 1. 3. 3. A JNK protein-kináz foszforilációjának vizsgálata

58

4. 1. 3. 4. Kaszpázok aktivációja az AAP-metabolizmus során

59

4. 1. 3. 5. A GADD153/CHOP transzkripciós faktor vizsgálata

60

4. 1. 3. 6. Az ER chaperonok vizsgálata

61

4. 2. Az AAP-toxicitás mechanizmusa hepatóma sejtvonalon

63

4. 2. 1. Az AAP-hatás vizsgálata humán májtumor eredetű sejtvonalon

63

4. 2. 2. Az AAP-hatás vizsgálata egér májtumor eredetű sejtvonalon

65

5. Diszkusszió

69

6. Összefoglalás

75

3

7. Irodalomjegyzék

77

8. Saját publikációk jegyzéke

92

4

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

AAP: acetaminofen AARE: amino acid responsive element ADP: adenozin-difoszfát ALT: alanin-aminotranszferáz AMS: 4-acetamido-4`-maleimidilsztilbén-2, 2`-diszulfonsav Apaf-1: apoptotic protease activating factor 1 AP-1: apoptotikus transzkripciós faktor ASK1: apoptosis signal-regulating kinase 1 Asn: aszparagin AST: aszpartát-aminotranszferáz ATF4, illetve ATF6: aktiváló transzkripciós faktor 4, illetve 6 ATP: adenozin-trifoszfát Bcl-2: B-cell CLL/lymphoma 2 BSO: butionin-szulfoximin c-Myc: v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog CYP: citokróm P450 Cys: cisztein DnaJ: 40 kDa-os Escherichia coli chaperon DTT: ditiotreitol EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav eIF2α: eukarióta iniciációs faktor 2 alfa ER: endoplazmás retikulum ERAD: endoplasmic reticulum-associated degradation Ero1: ER oxidoreduktin ERp44, ERp57, ERp72: 44, 57, illetve 72 kDa-os endoplazmás retikulum protein ERSE: endoplasmic reticulum stress element FAD: flavin-adenin-dinukleotid GADD153: growth arrest- and damage inducible gene 153 GDP: guanozin-difoszfát Gly: glicin

5

GRP78: 78 kDa-os glukóz-regulálta protein GRP94: 94 kDa-os glukóz-regulálta protein GSH: redukált glutation GSSG: oxidált glutation GTP: guanozin-trifoszfát HEPES: 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-etánszulfonsav His: hisztidin HPLC: high performance liquid chromatography; nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia IP3: inozitol-1,4,5-triszfoszfát IRE1: inositol requiring enzyme 1 JNK: c-Jun NH2-terminal kinase LDH: laktát-dehidrogenáz MEM: minimum essential medium mg/ttkg: milligramm per testtömegkilogramm MKK4: mitogen-activated protein kinase kinase 4 MOPS: 4-morfolino-propánszulfonsav NAD/NADP: nikotinamid-adenin-dinukleotid (foszfát) NAPQI: N-acetil-p-benzokinonimin NF-κB: nukleáris faktor-κB NOS: nitrogén-monoxid-szintáz p53: protein 53 PARP: poli(ADP-ribóz)-polimeráz PBS/PBS-T: phosphate buffered saline/phosphate buffered saline with TWEEN PDI: protein diszulfid izomeráz PERK: PKR-szerű endoplazmás retikulum kináz PMSF: fenil-metilszulfonil-fluorid ROS: reactive oxygen species; reaktív oxigénvegyületek RT-PCR: reverse transcriptase polymerase chain reaction S1P/S2P: Site-1 protease/Site-2 protease SDS: sodium dodecyl sulfate; nátrium-laurilszulfát Ser: szerin

6

SERCA: szarko/endoplazmás retikulum Ca2+-ATPáz TCA: trichloroacetic acid; triklórecetsav Thr: treonin TNFα: tumornekrózis faktor alfa TRAF2: TNF-receptor-asszociált faktor 2 TUNEL: terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling UGGT: UDP-glukóz-glikoprotein-glikozil-transzferáz UGT: UDP-glukuronozil-transzferáz X: bármelyik aminosav XBP1: X-box binding protein 1

7

1.

BEVEZETÉS

1. 1.

Endoplazmás retikulum

1. 1. 1. Az endoplazmás retikulum szerepe a fehérjeérésben Eukarióta sejtekben az endoplazmás retikulum (ER) a szekréciós útvonal fontos állomása.

Az

ER

lumenében

történik

a

szekretálódó

és

membránfehérjék

poszttranszlációs kovalens módosítása és ezzel párhuzamosan hajtogatása, azaz a natív konformáció felvétele. Az ER lumenébe jutó, hajtogatásra váró fehérjéket kliens-, vagy másnéven cargofehérjéknek hívjuk. Az ER-ben minőségellenőrzés is zajlik; a megfelelően hajtogatott fehérjék továbbjutnak a Golgi-komplexbe, a rosszul vagy félig hajtogatott fehérjéket pedig az ER lumen visszatartja, hogy végbemenjen a korrekt hajtogatódás vagy az ER-függő degradáció (Ellgaard és mtsai 1999). Ha e folyamatok valamelyike zavart szenved, az ER stresszt okoz és beindítja az ER stresszválaszt. Amennyiben a rosszul hajtogatott fehérjék felszaporodnak és aggregálódnak, úgy ER raktározási betegségek is kialakulhatnak (Rutishauer és Spiess 2002, Paschen 2003). A következőkben azt tekintem át, hogy mely fehérjék, illetve redox-aktív molekulák felelősek az ER-ben zajló megfelelő fehérjehajtogatódásért. A kovalens módosulás többek között aszparagin-függő glikozilációt, intra- és intermolekuláris diszulfidhidak kialakulását jelenti. Az aszparaginfüggő glikoziláció során nagyméretű, elágazó oligoszacharid-egységek kapcsolódnak a kliensfehérjék AsnX-Ser/Thr szekvenciáihoz (Hubbard és Ivatt 1981). Ennek révén a létrejövő glikoprotein vízoldékonysága nő, emellett az oligoszacharid rész stabilizálja a peptidvázat és csökkenti a környező fehérjemolekulákkal való érintkezés vagy aggregáció valószínűségét (Wormald és Dwek 1999). A felkapcsolt oligoszacharid egység

α-glukozidázok,

α-(1,2)-mannozidázok

illetve

UDP-glukóz-glikoprotein

glukoziltranszferáz (UGGT) hatására többször de-, majd reglukozilálódhat. Az egymást követő ciklusokból kikerülve a nem megfelelően hajtogatott és monoglukozilált fehérjék lektinekhez (kalnexin, kalretikulin) kötődve visszamaradnak, és lebontásra kerülnek, míg a normálisan hajtogatottak egy további mannózcsoport lehasítása után a

8

Golgi irányába távoznak. A többszöri újraglukozilálódással meghosszabbodik a fehérje által a lumenben töltött idő, így többszörösére nő a helyes konformáció kialakulásának esélye. A fehérjehajtogatás további segítői a chaperonok. Egy részük (az ún. hajtogatási katalizátorok: folding catalysts) ténylegesen gyorsítja a hajtogatódás sebességét, mivel cisz-transz izomerizációs lépéseket (pl. ciklofillinek) vagy oxidoredukciós reakciókat katalizál (Price és mtsai 1991, Freedman 1989, Spee és mtsai 1999, Lewis és mtsai 1986, Jessop és mtsai 2004, Pollard és mtsai 1998). Más részük pedig (a szűkebb értelemben vett molekuláris chaperonok, azaz kísérőfehérjék) más módon segítik elő a folyamatot; önmagukban nem növelik a hajtogatás reakciósebességét, ugyanakkor kapcsolódhatnak a részlegesen hajtogatott, „félkész” fehérjék még felszínen lévő hidrofób részeihez, esetleg ko-chaperonként a GRP78 regulálásával (Bertolotti és mtsai 2000, Okamura és mtsai 2000, Lee 2001). 1. 1. 2. Redox folyamatok a fehérjehajtogatódásban Ismert, hogy a sejtmembránba kihelyeződő vagy szekrécióra kerülő fehérjék az átlagosnál több diszulfidhidat tartalmaznak. Valószínű, hogy ezáltal stabilabb fehérjestruktúrák jönnek létre, ami lényeges a hosszabb időt extracelluláris környezetben

töltő

fehérjék

funkciója

szempontjából.

A

naszcens

fehérje

diszulfidhídjainak kialakulását oxidatív hajtogatódásnak hívják. Lényege, hogy két cisztein aminosavmaradék tiolcsoportjai között oxidációval intra- vagy intermolekuláris kovalens S-S-kötés jön létre. Az oxidatív hajtogatódást oxidoreduktázok katalizálják, bár a folyamat - mint erre Anfinsen híres kísérlétével rávilágított – spontán is végbemehet (Anfinsen és mtsai 1961). Az oxidoreduktázok saját redoxpotenciáljuk, illetve a környezetük redox státusza függvényében egyaránt katalizálhatják fehérje diszulfidhidak redukálását vagy cisztein tiolok oxidációját. A családba tartozó enzimek közös szerkezeti jellemzője a tioredoxin-szerű motívum (CxxC, azaz két cisztein, köztük két tetszőleges aminosavmaradék). A CxxC-motívum segítségével katalizált reakciók egyszerűsített sémája a következő: először diszulfidhíd jön létre a két cisztein között, ezután a célfehérje egy intramolekuláris diszulfidja redukálódik, és az egyik tiolcsoport vegyes (intermolekuláris) diszulfidot képez az oxidoreduktázzal.

9

A legnagyobb mennyiségben előforduló tioredoxin-motívumot hordozó ER oxidoreduktáz a protein diszulfid izomeráz (PDI). Alapvető szerepét a megfelelő fehérjehajtogatásban mennyisége is jelzi: az egész sejt összfehérjéinek 0,8%-át teszi ki. A PDI két konzervált, tioredoxinszerű Cys-Gly-His-Cys (CGHC) motívumot tartalmaz és két további ciszteint, de ez utóbbiak nem CXXC-motívumban helyezkednek el, így redox inaktívnak tekinthetők (Goldberger és mtsai 1963). A PDI több funkcióval is bír: diszulfidak kialakulását, azok redukcióját és átrendeződését (izomerizációját) egyaránt katalizálhatja (Freedman 1989). Az élesztő PDI döntően oxidált formában van jelen, így valószínűsítik, hogy elsődleges feladata a fehérje tiol-csoportok oxidálása (Frand és Kaiser 1999). A CGHC-motívumban mutációt hordozó PDI-ról kimutatták, hogy oxidánsként nem működik, viszont diszulfidok izomerizációját képes katalizálni, így ez utóbbi funkciót tekintik elsődlegesnek (Laboissiere és mtsai 1995). A PDI nem csupán kovalens módosításokat hoz létre. Egyes mutáns változatai izomerázként nem működnek,

ugyanakkor

elősegítik

denaturált

fehérjék

renaturációját,

kivédik

aggregációjukat (Winter és mtsai 2002). Ez azt jelenti, hogy a PDI a nem megfelelően hajtogatott

(nem

natív)

részeket

felismeri,

azokhoz

kötődik,

tehát

valódi

chaperonfunkcióval is bír. A fehérjeérés során a diszulfidhidak kialakulása párhuzamosan zajlik a natív konformáció létrejöttével (az előbbi valójában része az utóbbinak), így a PDI multifunkcionalitása érthető. A redukált PDI-nek egy sajátos „kihajtogató” (unfoldase) vagy anti-chaperon funkciót is tulajdonítanak. (Puig és mtsai 1994, Primm és mtsai 1996). In vitro kísérletek azt mutatták, hogy a szubsztráthoz képest alacsony koncentrációban jelen lévő PDI inkább viselkedik anti-chaperonként, mint chaperonként, és nem-kovalens kötésekkel stabilizált aggregátumok létrejöttét idézi elő. Ez az - állítólagos - aktivitás független mind a CGHC-motívumot tartalmazó aktív centrumtól, mind pedig a chaperon aktivitáshoz kellő peptidkötő helytől. A redukált enzim egy jóval könnyebben értelmezhető funkciója az izomeráz aktivitás. Lényege, hogy a redukált PDI tiolcsoportja reagálni képes a szubsztrátfehérje egy diszulfidhídjával, és átmeneti vegyes (intermolekuláris) diszulfid jön létre. A szubsztrátfehérjében szabaddá váló tiolát (R-S-) megtámad egy másik diszulfidhidat a szubsztrátfehérjén belül, és új kénhidat alakít ki annak egyik pillératomjával. Az itt szabaddá váló tiolát pedig reagál az intermolekuláris diszulfidhíddal.

Végeredményben

a

PDI

10

ismét

redukált

állapotba

kerül,

a

szubsztrátfehérjén belül pedig új diszulfidhidak alakultak ki. (Molteni és mtsai 2004). A vázolt redoxreakció ugyanazon redox körülmények közt ellenkező irányban is végbemehet, vagy a szubsztrátfehérje más diszulfidjaival ismétlődhet, hiszen a PDI kiindulási redoxállapotába kerül vissza, és a reakció nem jár a [GSH]/[GSSG] arány megváltozásával sem. Az izomerációs ciklusok addig ismétlődnek, ameddig a fehérjében létrejönnek a legstabilabb konformációt biztosító diszulfidhidak, azaz kialakul a natív szerkezet. A redukált PDI mint kihajtogató és izomeráz nem csupán a natív szerkezet létrejöttéért felelős. Ahogy a PDI a szubsztrátfehérjében létrehozott egy diszulfidhidat, redukált formába kerül. Chaperon/anti-chaperon funkciója révén asszociálva marad(hat) a szubsztráttal, így „első kézből” kap információt arra nézve, hogy az megfelelő konformációban van-e. Amennyiben több izomerációs ciklus után sem jött létre natív konformáció, úgy a PDI szubsztrátját egy membránpórushoz irányítja, amin keresztül a szubsztrát visszajut a citoszólba és degradálódik (ERAD, lásd később). Oxidázként működve a PDI redukálódik, mégis, ahogy már említésre került, a PDI (élesztőben nagyobb, emlős sejtekben kisebb) részben oxidált formában van jelen. Ennek oka, hogy az ER oxidoreduktin 1 (Ero1), az oxidatív hajtogatás másik lényeges komponense, elektronakceptorként működik a PDI mellett. (Tu és mtsai 2000). In vitro rekonstitúciós és in vivo kísérletekben egyaránt bizonyított, hogy a PDI és az Ero1 között vegyes diszulfid alakulhat ki, a két fehérje közti redox reakció tehát diszulfidkicserélődéssel történik (Tu és Weissman 2004). Az Ero1 a hajtogatódó fehérjéket közvetlenül oxidálni csak igen kis hatékonysággal képes. Az Ero1 FAD koenzimmel működik, és laboratóriumunkban végzett kísérletsorozat eredményeként ismert, hogy a luminális szabad FAD is serkenti a diszulfidképződést (Varsányi és mtsai 2004). A FAD ugyanakkor nem túl erős oxidálószer, így felvetődik, hogy nem ez a végső elektronakceptor. Bizonyított, hogy anaerob körülmények között az Ero1 aktivitása csökkent. Az Ero1-hez kapcsolt FAD-ról kiderült, hogy nagy hatékonysággal képes elektronokat továbbadni molekuláris oxigénnek; ez magyarázza, miként tudja a mikromólos koncentrációban jelen lévő FAD a millimólos koncentrációjú PDI-t – részben - oxidált állapotban tartani. Az oxidatív hajtogatódás során tehát a mai koncepció szerint az elektronok útja a következő: éretlen fehérje → PDI → Ero1 → FAD → O2. Lényeges, hogy molekuláris oxigén mint elektronakceptor az élesztőben

11

játszik kitüntetett szerepet, jelen ismereteink szerint emlős sejtekben szerepe kisebb. Emlős ER-ben a legfontosabb végső elektronakceptor még nem ismert. Az Ero1-FAD által felhasznált molekuláris oxigén sorsa sem ismert teljesen. Az Ero1 működése szubsztöchiometrikus mennyiségű reaktív oxigén speciesz (ROS) keletkezésével jár. Nyilvánvaló, hogy minél aktívabb egy sejtben a szekréciós útvonal, annál nagyobb az Ero1 hozzájárulása a sejt összes ROS-termeléséhez. Ha az Ero1 aktivitása stressz hatására fokozott, akkor jelentős mennyiségű ROS szaporodik fel. (Harding és mtsai 2003) Az oxidatív hajtogatódás szabályozása tehát azért lényeges, mert hiányában az ER túloxidálttá válhat. Ez a redox pufferek kimerülésének, a [PDIred]/[PDIox]

arány

eltolódásának,

illetve

a

rosszul

hajtogatott

fehérjék

felszaporodásának veszélyét rejti magában. 1. 1. 3. A glutation szerepe a fehérjehajtogatódásban Az oxidatív hajtogatódás működőképessége szorosan függ az ER lumen redox státuszától. Redox státusz, vagy redox környezet alatt általában a redox pufferek redukált illetve oxidált alakja közti megoszlását értjük. Definíciószerűen: nΣi=1 = Ei· [redukált alak]i, azaz az összes redoxpár redukciós potenciálja és a redukált alak koncentrációja szorzatának összege (Molteni és mtsai 2004, Sitia és Molteni 2004). A nagyszámú diszulfidhíd létrehozása alapvetően oxidatív környezetet igényel. Nem véletlen, hogy az ER lumen a citoszólhoz képest egyértelműen oxidatív jellegű. (E0`= -180 mV) Lényeges ismételten megjegyezni, hogy az ER redox státusza szigorú szabályozás alatt áll. Túl oxidatív környezetben rosszul hajtogatott fehérjék keletkeznek, azaz az ER lumenben érő fehérjék - látszólagos ellentmondásként - erős oxidatív ágensekre sokkal érzékenyebbek, mint a citoszól fehérjéi (van der Vlies és mtsai 2003). A citoszól és az ER lumen közötti potenciálkülönbséget jól tükrözi a fő redox puffer, a glutation redukált és oxidált alakjainak aránya; a citoszólban a [GSH]/[GSSG] arány 30:1 és 100:1 között mozog, míg az ER lumenben 1:1 és 3:1 között van. Ezek alapján sokáig úgy tartották, hogy az oxidatív hajtogatódás végső elektronfelvevője az oxidált glutation. Bebizonyosodott viszont, hogy az Ero1-katalizálta diszulfid-képződés a glutationtól függetlenül zajlik, sőt a glutation kompetál a szubsztrátfehérjékkel az

12

oxidáló ágensekért (Cuozzo és Kaiser 1999). A glutation nettó reduktáns szerepét bizonyítja az is, hogy a sejt glutation-szintjét csökkentve nő a diszulfidhidak kialakulásának sebessége, de ez nem párosul korrekt fehérjehajtogatódással (Chakravarthi és Bulleid 2004). Korábbi, a GSSG lumenbe történő transzportját favorizáló elképzelésekkel szemben laboratóriumunkban bizonyítást nyert, hogy a GSH a transzportált forma (Bánhegyi és mtsai 1999). Az oxidatív folding tehát nem független a citoszól redox státuszától sem. Valószínű, hogy a glutation szerepe a szubsztrátfehérjék diszulfidhídjai átrendeződésének az elősegítése. Ezt támasztja alá az a megfigyelés is, hogy az ER-glutation több, mint fele fehérjékkel vegyes diszulfid formájában van jelen (Bass és mtsai 2004). 1. 1. 4. A valódi molekuláris chaperonok szerepe a fehérjehajtogatódásban A valódi molekuláris chaperonok nem-kovalens kötésekkel kapcsolódnak az érés alatt lévő fehérjékhez, továbbá a hajtogatásban részt vevő több más ER-rezidens fehérjéhez. Hatásuk sokrétű. Legismertebb képviselőik a 78- illetve 94-kDa-os glukózregulálta proteinek (GRP78, másnéven immunoglobulin-binding protein, BiP, illetve GRP94). Felfedezésük úgy történt, hogy embrionális fibroblasztokban glukózmegvonás hatására erősen indukálódtak, innen a nevük (Lee 2001). Jelen tudásunk szerint a GRP78 központi szerepet tölt be az ER funkciók szabályozásában. A glukózmegvonás mellett egy sor más tényező is az indukciójához vezet. Ilyenek például: redukáló szerek, mutáns, rosszul hajtogatott fehérjék megjelenése, az ER Ca2+-raktárainak ürülése, a fehérjeglikoziláció kísérletes gátlása, hipoxia, a sejt malignus transzformációja stb. Élesztőben a GRP78 részt vesz a naszcens fehérjék ER lumenbe történő transzlokációjában. Érdekes, hogy a transzlokáció kezdetekor a luminális oldal felől zárja a pórust, így fenntartja a membrán barrierfunkcióját. Az összeállított, de riboszómát még nem kötő pórust is zárja. Amikor a naszcens fehérje elkezd lejönni a riboszómáról, a GRP78 „beengedi” a lumenbe és egyben köti (Hamman és mtsai 1998). Emlőssejtekben ez a funkció eddig még nem bizonyított. Lényeges viszont emlős sejtekben is, hogy a GRP78 gátolja a részlegesen hajtogatott fehérjék egymással való asszociációját (végeredményben az aggregációjukat), irányítja a hajtogatódást és a több alegységből álló fehérjék összerakását. A GRP78 résztvesz a félrehajtogatott fehérjék

13

felismerésében. Ennek mechanizmusa a következő: az N-terminális rész ATPáz aktivitással bír, míg a C-terminális a szubsztrátkötő hely. Amikor az N-terminális ADPt köt, a C-terminális nagy affinitással köti a fehérjeszubsztrátokat. Random peptidkönyvtárak alkalmazásával kimutatták, hogy leginkább a rövid hidrofób szekvenciákat ismeri fel, azokat tehát, amik az érett fehérjében már főként β-redők formájában a fehérje belsejében helyezkednek el. A szubsztrát kötése fokozza az ATPáz aktivitást. Mikor az ADP ATP-re cserélődik ki, a szubsztrát leválik a C-terminálisról, majd ezt követően az ATP gyors hidrolízise következik be, és a ciklus kezdődhet előlről. Az ellenőrzés tehát energiaigényes, így az ATP-raktárak kiürítésével számos szekréciós fehérje hajtogatódása gátolható (Dorner és mtsai 1990). Valószínű, hogy a nukleotidkötés a GRP78 konformációváltozásait segíti elő (Wei és mtsai 1995). Az ADP-ATP-ciklust több, ún. ko-chaperon segíti. Mind a nukleotidcsere, mind az ATP hidrolízise ezen ko-chaperonok irányítása alatt áll; a DnaJ-szerű fehérjék (ERdj1-5) és a Sec63p az ATPáz aktivitást növelik, míg az Sls1p a nukleotidcserét. (Chevalier és mtsai 2000, Yu és mtsai 2000, Feldheim és mtsai 1992, Kabani és mtsai 2000). Ezek a kochaperonok transzmembranális lokalizációt mutatnak, így a GRP78 fehérjék egy hányada folyamatosan a membránhoz asszociálva kell, hogy legyen. A GRP78 részt vesz a végleg félrehajtogatott fehérjék ER lumenből való kijuttatásában, azaz a retrográd transzlokációban is. Egy további funkciója, hogy Ca2+ kötésére képes. Bár kapacitása alacsony (1-2 Ca2+-ion GRP78 molekulánként), magas luminális koncentrációja így is a legfontosabb Ca2+-tároló molekulák egyikévé teszi; a luminális összkalcium mintegy 25%-nak tárolásáért felelős (Lievremont és mtsai 1997). Az ER homeosztázisa fenntartásában betöltött szerepét egyértelművé teszi, hogy ER stressz esetén a GRP78 indítja el a stresszre adott választ. Ennek részletes mechanizmusát az „Endoplazmás retikulum stresszválasz” részben tárgyalom. A másik magas koncentrációban előforduló molekuláris chaperon a GRP94. Indukálhatóságát és funkcióit tekintve sok hasonlóságot mutat a GRP78-al, kalciumkötő szerepe is ismert. A hajtogatásban mint minőségellenőrző vesz részt. ATP-függő autofoszforilációját leírták (Csermely és mtsai 1995), ugyanakkor eddigi ismereteink szerint

a

szubsztrátfehérjékről

való

disszociációjához

adenozinnukleotidok

kötése/hidrolízise nem járul hozzá (Rosser és mtsai 2004). Feltételezik, hogy

14

„állványzat” (scaffold) szerepe van más chaperonokkal kialakított multi-protein komplexekben. 1. 1. 5. Funkcionális

kapcsolat

az

ER

redox

státusza

és

kalcium-

homeosztázisa között Az ER lényeges feladata a Ca2+-tárolás. Az ER-ben tárolt Ca2+ különböző stimulusok hatására inozitol-triszfoszfát (IP3)-receptoron vagy rianodinreceptoron keresztül a citoszólba ürül, és intracelluláris mediátorként sejttípustól függő válaszokat vált ki. A sejtválasz lecsengésekor a Ca2+ ATP-függő pumpák (szarko- endoplazmás retikulum kalcium ATPáz; SERCA) segítségével visszajut az ER lumenbe. Számos ER fehérjéről ismert, hogy Ca2+ kötésére képes (Van és mtsai 1989); nagy kapacitású, kis affinitású (~ 50 Ca2+ fehérjemolekulánként, Kd ~ 1 mM) például a kalretikulin és a kalnexin, kis kapacitású, nagy affinitású (~ 1-2 Ca2+ fehérjemolekulánként, Kd ~ ? mM) a GRP78 és a GRP94. Az ER-ben tárolt Ca2+ nem kizárólag mint az ER lumen és a citoszól között cirkuláló, időről-időre felszabadítható szignálmediátor van jelen. Ca2+áteresztő ionofórok alkalmazásával mutatták ki, hogy egyes kliensfehérjék csökkent luminális Ca2+-szint mellett nem képesek a Golgi irányába elhagyni az ER-t. Valószínű, hogy hajtogatódásuk ilyenkor zavart szenved (Lodish és Kong 1990). A közelmúlt felfedezése, hogy egy tioredoxin-motívumot hordozó oxidoreduktáz, az ERp44, regulálni képes az 1-es típusú IP3-receptort. A reguláció pH-, kalciumkoncentráció-, és redox állapot-függő. Ez utóbbi abban nyilvánul meg, hogy az IP3-receptor bizonyos cisztein-oldalláncainak redukált állapota szükséges az ERp44 kapcsolódásához. A kapcsolódás a receptor gátlását eredményezi. (Higo és mtsai 2005). Az oxidoreduktáz család egy másik tagja, az ERp57 pedig Ca2+-függően modulálni képes a SERCA 2b luminális cisztein tiol-csoportjainak redox állapotát. Az ERp57 gátlószernek bizonyult magas intraluminális Ca2+-szint mellett. (Li és Camacho 2004). Ezek az eredmények tovább valószínűsítik, hogy az ER redox státusza és a kalciumszint szabályozása között szoros kapcsolat áll fenn.

15

1. 1. 6. A chaperonok összjátéka Amint már utaltam rá, a tárgyalt ER chaperonok funkciói egymással átfednek. Elképzelhető, hogy a chaperonfunkciók tiszta megkülönböztetése nem is lehetséges, mivel egyre több bizonyíték gyűlik amellett, hogy a chaperonok nem egyenként, hanem nagy multi-protein komplexekben vannak jelen (Kuznetsov és mtsai 1997). Ezek a komplexek aktív fehérjeszintézis hiányában is kimutathatók, a hajtogatódó/hajtogatandó fehérjék megjelenésével pedig asszociálnak azokkal. A komplexben jelen van a GRP78, a GRP94, a kalcium-kötő diszulfid izomeráz protein 1 (CaBP1), a PDI, a ciklofillin B, az ERp72, a GRP170 és az UGGT (Meunier és mtsai 2002). Érdekes viszont, hogy más fontos chaperonokat, így a kalciumkötésben szerepet játszó kalnexint, kalretikulint, és ERp57-t nem sikerült kimutatni ebben a komplexben. Ez utalhat arra, hogy többféle, egymástól a lumenen belül térben elválasztott komplex működik, eltérő feladatokkal.

1. 2.

Endoplazmás retikulum stressz

1. 2. 1. Az endoplazmás retikulum stressz létrejötte Az ER működésének alapja a szekréciós útra lépő fehérjék áthaladásának folyamatos biztosítása. Az ER lumen térfogata, illetve a lumenben tevékeny chaperonok kapacitása behatárolt – ha a transzláció ütemének megfelelően mindkettő változhat is. Az ER ugyanakkor csak a megfelelően hajtogatott fehérjéket engedheti tovább; a rosszul hajtogatott fehérjék sejtmembránban vagy a szekrétumban való megjelenése, esetleg lumenben történő aggregációja súlyosan diszfunkcionális sejtekhez vezet. Nem véletlen, hogy a lumen gazdagon van ellátva chaperonokkal, illetve, hogy az áthaladó fehérjék a lumenben a belépéstől a kilépésig chaperonokhoz kapcsolódnak. Mindez több szempontból is alapvető. Egyfelől a fehérjeérés így egész folyamatában szigorúan ellenőrzött. Másfelől a chaperonok leterheltsége, foglaltsága állandóan jelzi, miként aránylik a pillanatnyi ER-kapacitás a transzláció üteméhez. A kettő közti egyensúly

16

megborulása az ER stressz. Pontosan ez, a chaperon-foglaltság megváltozása, indítja el az ER stresszre adott válaszát. Az ER stressz kivédése az egész sejt szempontjából esszenciális. Nem véletlen, hogy az ER által indított stresszválasz széleskörű hatással bír a sejtfolyamatokra; újkeletű vélemények szerint az ER mint szabályozóközpont „rangban” a második a sejtmag után (Hendershot 2004). A stresszválasznál érdemes röviden megemlíteni, hogy stresszmentes állapot már a stressz fogalmának bevezetője, Selye szerint sem létezik (Selye 1975). Csupán a fenti, egyszerű definíciót alkalmazva is nyilvánvaló, hogy stressz folyamatosan jelen van, hiszen bármely sejt, vagy az adott sejt endoplazmás retikuluma folyamatosan változó környezetben létezik. A (kismértékű) stresszre való reagálás – az ER példájánál maradva: a chaperonok mennyiségének a kliensfehérjék mennyiségéhez való folyamatos igazítása – tartja fenn az egyensúlyt. Ennek látványos megnyilvánulása, hogy növekedési faktorok megvonására az ER chaperonok transzkripciós rátája erősen lecsökken – a citokin-stimulus hiánya a fehérjeszintézis általános csökkenését jelzi, így chaperonokból is kevesebbre van szükség (Brewer és mtsai 1997). Ezen elméleti megfontolások mellett a stressz kifejezést – az általános gyakorlatnak megfelelően – az egyensúlyt durvábban megbontó hatásokra alkalmazom. Számos tényező válthat ki ER stresszt, így a fehérjehajtogatódás, a glikoziláció vagy a Golgiba irányuló transzport blokkolása, a Ca2+-felvétel vagy leadás gátlása, vagy a redox homeosztázis megbontása. Hasonlóan stresszor tényező a transzláció ütemének felgyorsulása, mert így megnő a kliensfehérjék mennyisége. Mindezen hatásokban közös, hogy hajtogatatlan vagy félrehajtogatott kliensfehérjék felhalmozódáshoz vezet, és endoplazmás retikulum stresszválaszt vált ki (Rutkowski és Kaufman 2004). Az ER stresszválasz másik elterjedt elnevezése a hajtogatatlan fehérje válasz (unfolded protein response, UPR). A stresszválasz célja, hogy helyreállítsa a felborult egyensúlyt, azaz visszaállítsa a luminális fehérjeérés folyamatosságát. A stresszválasz négy alapvető mechanizmust foglal magában (Oyadomari és Mori 2004). Az első a transzláció általános leállítása, ezáltal a kliensfehérjék mennyiségének csökkentése. A transzláció általános gátlása alól csak néhány fehérje képez kivételt, ezek a fehérjék szükségesek a

17

stresszválasz levezényléséhez. A második mechanizmus olyan fehérjék indukciója, amelyek előmozdítják a fehérjehajtogatódást. Ide tartoznak a hajtogatási katalizátorok (PDI, peptidil-prolil izomeráz), a molekuláris chaperonok (GRP78, GRP94), illetve egyes ER struktúrfehérjék (pl. SERCA 2). Indukálódnak továbbá a transzláció későbbi helyreállításához kellő fehérjék, a glutation-szintézis és a redox védelem egyéb fehérjéi. Az első két válaszkomponens összességében a chaperonkapacitás és a kliensfehérje terhelés közötti egyensúlyt állítja vissza. A folyamat része a stressz során felgyülemlett selejtes, javíthatatlan (terminally misfolded) fehérjék eltávolítása is. A javíthatatlan fehérjék – chaperonoktól kísérve – egy membránpórushoz szállítódnak, majd azon keresztül visszajutnak a citoszólba, ahol poliubikvitinálódás után a proteoszómákban lebomlanak (ER-associated degradation, ERAD; McCracken és Brodsky 2000). Amennyiben az ERAD nem működik, úgy az ER stresszválasz kostitutívan indukált marad (Travers és mtsai 2000). A stresszválasz harmadik eszköze az NFκB aktivációja a korai apoptózis kivédésére. A negyedik az apoptózis iniciációja. Ez akkor jelenik meg, ha az ER funkciói súlyosan károsodtak 1. 2. 2. Az ER transzmembrán stressz-szenzorai Az ER stresszválasz tehát több egymással párhuzamosan zajló történést foglal magában. Ezek a történések részben egy közös kiindulási pontra vezethetők vissza, mégpedig a GRP78 molekuláris kölcsönhatásainak megváltozására. A GRP78 mint klasszikus

molekuláris

chaperon

nem

csupán

kliensfehérjékkel,

illetve

ko-

chaperonjaival asszociálódik. Jelentős részben membránközeli lokalizációt mutat, itt ugyanis kapcsolódik több, az ER membránjába ágyazott szignálfehérje luminális doménjével. A ma ismert három legfontosabb ilyen transzmembrán fehérje az IRE1 (inositol requiring enzyme 1), az ATF6 (aktiváló transzkripciós faktor 6) és a PERK (double-stranded RNA-activated protein kinase [PKR]-like endoplasmic reticulum kinase). A luminális oldalon kapcsolódó GRP78 ezeket a fehérjéket inaktív formában tartja. A kapcsolódás a GRP78 ugyanazon doménjével történik, amivel a GRP78 a kliensfehérjék hidrofób részeit köti. Amennyiben a fent felsorolt stresszor tényezők hatására megnő a hajtogatatlan kliensfehérjék mennyisége, úgy a jelen lévő GRP78 nagyobb hányada fogja ezeket kötni, és elengedi a transzmembrán szignálfehérjéket.

18

proteaszómális degradáció

ER lumen PERK transzlációs STOP

IRE1 eIF2α

ASK1

XBP1 splicing

ATF6 kaszpáz-12

P

ATF4

kaszpáz-kaszkád

XBP1

JNK1,2

ER chaperonok

Citoszol

XBP1

GADD153

Sejtmag

DNS

1. 1. ábra A hajtogatatlan fehérjeválasz (UPR) mechanizmusai ER stressz során a lumenben rosszul hajtogatott fehérjék szaporodnak fel, és nagyszámú luminális chaperonnal (kék oválisok) lépnek kölcsönhatásba. Ennek hatására az ER transzmembrán szenzorfehérjéi (IRE1, PERK, ATF6) és a kaszpáz-12 aktiválódnak, és különböző jelátviteli utakat aktiválnak. Rövidítések: UPR; unfolded protein response, IRE1; inositol requiring enzyme 1, PERK; PKR-szerű endoplazmás retikulum kináz, ATF6; aktiváló transzkripciós faktor 6, XBP1; X-box binding protein 1, GADD153; growth arrest- and damage inducible gene 153. Ismert ugyanakkor, hogy a GRP78 disszociációja önmagában nem elég a szignálfehérjék aktiválásához, de nem is elengedhetetlen feltétele annak. Az IRE1, a

19

PERK és az ATF6 a luminális oldalon egyaránt rendelkeznek olyan konzervált doménekkel, amelyek hajtogatatlan fehérjéket képesek kötni (Credle és mtsai 2005, Shen és mtsai 2002). Ezek minden bizonnyal szereppel bírnak az ER stressz felismerésében. Másfelől, DuRose és mtsai kimutatták, hogy tunikamicinnel kiváltott ER stresszben úgy kerül sor a PERK foszforilációjára, hogy a GRP78 nem disszociál a fehérjéről (DuRose és mtsai 2006). Harmadrészt, az ATF6-GRP78 komplex esetében már elvetették a dinamikus kötés lehetőségét, mely szerint a hajtogatatlan fehérjék kompetitorként szorítanák le a GRP78-at az ATF6 luminális doménjéről (Shen és mtsai, 2005). Az ER transzmembrán szignálfehérjék aktiválása tehát még számos nyitott kérdést rejt. Az IRE1 a GRP78 leválása nyomán homodimerizálódik és szerin/treonin kináz aktivitása révén autofoszforilálódik. Az így aktiválódott IRE1 citoszólba belógó Cterminális része endoribonukleáz aktivitással bír, és kihasít egy 26 nukleotidból álló intront az XBP1 (X box-binding protein 1) transzkripciós faktort kódoló éretlen mRNSből. A hasítás nyomán eltolódik az mRNS leolvasási kerete. Bár transzláció mind az éretlen, mind a hasított (érett) mRNS-ről történik, csak a hasított mRNS-ről átíródó fehérje működőképes, mert ebben egymás mellett van a DNS-kötő- és a transzaktiváló domén (Mori és mtsai 2000). Az XBP1 transzkripciós faktor számos olyan gén promoteréhez kötődik (ER stresszválasz elemek; endoplasmic reticulum stress elements, ERSE), melyek az ER stresszválaszban résztvevő fehérjéket kódolnak, és fokozza ezek átíródását. Az ER stresszválasz elemek konzervált szekvenciája: CCAAT(N9)CCACG, ahol az N9 egy 9 nukleotidból álló CG-gazdag régió (Lee 2001). Az IRE1 citoszóli doménje autofoszforilációt követően nem csupán endonukleáz, hanem kináz aktivitással is bír. Az autofoszforiláció megnöveli a citoszólikus domén affinitását a TRAF2 adaptor fehérje iránt, és a kihorgonyzó TRAF2 az ASK1-MKK4JNK (apoptosis signal-regulating kinase 1 – mitogen-activated protein kinase kinase 4 c-Jun NH2-terminal kinase) jelpályát indítja be, továbbá az NF-κB aktivációjához vezet. A JNK protein-kinázok stresszben indukálódnak, így növekedési faktorok hiányában, TNFα hatására, oxidatív károsodás vagy UV-sugárzás nyomán, továbbá különféle ágensekkel kiváltott ER stresszben. Az aktiváció bizonyítottan az IRE1 citoszólikus doménje részvételével történik (Urano és mtsai 2000). Szerepük a jeltovábbításban van, foszforilálva transzkripciós faktorok foszforilálását és aktiválását végzik (Kyriakis és

20

mtsai 1994). Jelen ismereteink alapján úgy tűnik, a JNK protein-kinázok rövidtávú aktiválása a stressz feloldását, és a sejt túlélését segíti, míg hosszabb távú aktiválásuk apoptotikus történéseket indít el (Shen és Liu 2006). Az ER stressz egy további jelentős transzmembrán szignálfehérjéje a PKR-szerű endoplazmás retikulum kináz (PERK, másnéven eukarióta iniciációs faktor 2α-kináz 3 [EIF2AK3]). A PERK aktivációjának menete hasonló az IRE1-nél leírthoz. A GRP78 elengedése után a PERK is homodimerizálódik és autofoszforilálódik. Kináz aktivitásának fő célpontja az eukarióta iniciációs faktor 2α (eIF2α) Ser-51 oldalláncának hidroxilcsoportja. Foszforilált állapotban az eIF2α gátolja az eIF2B cserélő faktor működését, így nem történhet meg a GDP – GTP nukleotidcsere. Ennek következményeként az iniciátor Met-tRNS riboszómához való bekötődése akadályozott, ami általános transzlációgátlshoz („transzláció stop”) vezet. A transzláció gátlása alól megmenekül néhány speciális nyílt leolvasási kerettel (upstream open reading frame) rendelkező mRNS. Ilyen például az ATF4 transzkripciós faktort kódoló mRNS, ennek transzlációjához egyenesen szükséges, hogy az eIF2α foszforilált legyen (Harding és mtsai 2000). Az eIF2α foszforilálását nem kizárólag a PERK végezheti. További három ilyen aktivitású kinázt azonosítottak emlőssejtekben. A PERK mellett a további eIF2αkinázok: az EIF2AK1 (vagy heme-regulated inhibitor), ami hem-depriváció esetén, hőés oxidatív stresszben aktiválódik; az EIF2AK2 (másnéven interferon-induced doublestranded RNA-activated protein kinase), ami vírusos fertőzések esetén jelent védelmet a gazdasejt számára veszélyes fehérjék megjelenése ellen; a GCN2 (general control nonderepressible-2, másnéven EIF2AK4) ami aminosavhiány, proteoszómagátlás, vagy UV-besugárzás esetén aktiválódik. Az eIF2α foszforilációja tehát nem csupán már fennálló ER stresszben figyelhető meg, hanem minden olyan állapotban, ahol a luminális fehérjeérés mennyiségének csökkentése a cél. Az ATF6 az ER-membrán 90 kDa-os glikoproteinje (p90ATF6). C-terminális része a lumenben van, ez felelős a stresszérzékelésért, míg a citoszóli orientációjú Nterminális rész egy transzkripciós faktor. ER stresszben a GRP78 disszociál az ATF6 luminális doménjáról, és az ATF6 a Golgiba transzportálódik. Itt Site-1 és Site-2 proteázok (S1P, S2P) lehasítják az 50 kDa-os citoszólikus domént (p50ATF6), ami ezután bejut a sejtmagba, és a már említett stressz-válaszelemekhez (ERSE) kötődve ER

21

chaperonok, illetve pro-apoptotikus faktorok indukcióját okozza (Shen és mtsai 2002, Haze és mtsai 1999). Érdekes, hogy pl. a luminális Ca2+-raktárakat kiürítő thapsigargin által kiváltott ER stresszben a p90ATF6-készlet egy része proteoszómákban gyors lebontásra kerül (Hong és mtsai 2004). Feltételezik, hogy ez a stresszválasz különböző komponenseinek egymáshoz hangolását segíti. Valószínű, hogy a p50ATF6 által indukált pro-apoptotikus faktorok (lásd később) túl hamar indítanák el a sejthalál programot, míg a GRP78 idő előtti indukciója azt eredményezné, hogy a felszaporodó GRP78 kapcsolódna a szignálfehérjék luminális részéhez és leállítaná a stresszválaszt. Az ATF6 luminális doménjén található ciszteinek egymással diszulfidhidakat tudnak kialakítani, így a fehérje intramolekuláris diszulfidhidakat tartalmazó monomer, továbbá dimer és oligomer formákban van jelen. ER stresszben a dimer és az oligomerek monomerekké redukálódnak, majd az oxidált monomer is redukálódik. A Golgiba történő transzportnak és az S1P/S2P általi hasításnak előfeltétele, hogy az ATF6 a redukált monomer formában legyen jelen (Nadanaka és mtsai 2007). Valószínű, hogy a 3 tárgyalt stressz-szenzor eltérő aktivációs mechanizmusa a lehetséges stresszválaszok sokféleségét és stressz-specificitását teszi lehetővé. A p50ATF6 indukálja az XBP1 transzkripiós faktort. A megjelenő XBP1 mRNS-t pedig – ahogy láttuk - az aktivált IRE1 módosítja. Az IRE1 és az ATF6 által indított válaszutak itt ugyan összeérnek, ez azonban nem jelenti azt, hogy a két szignál indítása egymással teljesen egyenértékű válaszokhoz vezet. Ahogy láttuk, az IRE1, a PERK és az ATF6 aktivációja egyaránt a GRP78-ról való lekapcsolódással kezdődik. A három jelpálya aktiválódása, és az aktiválási kinetika viszont erősen függ a vizsgált sejttípustól, illetve az ER stresszor ágenstől (DuRose és mtsai 2006). A hajtogatatlan fehérjeválasz (UPR) jelpályáit az 1. 1. ábrán foglalom össze. 1. 2. 3. Az UPR pro-apoptotikus jelenségei Az eddig tárgyalt stresszválasz komponensek a homeosztázis helyreállítását, a sejt túlélését célozzák. A stresszválasz más komponensei viszont a programozott sejthalál, az apoptózis beindítását idézik elő, azaz pro-apoptotikusnak tekinthetők. Ha az ER stressz súlyos, akkor ezek a komponensek dominálnak. Mostanáig három faktorról

22

bizonyosodott be, hogy részt vesz az ER-függő apoptózis kiváltásában, ezek a GADD153/CHOP, a JNK és a kaszpáz-12. A GADD153 egy 29 kDa-os transzkripciós faktor. Neve a growth arrest- and DNA damage-inducible gene 153 rövidítése. Másik neve onnan ered, hogy a CCAT/enhancer kötő fehérjék (CCAT/enhancer binding proteins; C/EBP) közé tartozik (C/EBP-homologous protein; CHOP). A GADD153 egy N-terminális transzaktiváló doménnel és egy C-terminális bázikus leucin-cippzár (basic leucine zipper domain; bZIP) doménnel rendelkezik. Az utóbbin egy bázisos aminosavakban gazdag rész után egy leucin-cippzáras dimerizációs szekvencia következik. A bázikus részben két szerin található, amelyeket a p38 MAP-kináz család tagjai foszforilálhatnak, és a foszforiláció növeli a transzkripciós aktivitást. A GADD153 homo- és heterodimerizációra is képes, bizonyos gének esetében gátló, másoknál serkentő szerepet tölt be. Ahogy a név is jelzi, a GADD153-nak eredetileg a növekedés leállásra és a DNS károsodásra adott reakcióban tulajdonítottak lényeges szerepet. Ma már ismert, hogy egyik előbbi hatásra sem következik be törvényszerűen a GADD153 indukciója. Minden olyan történés létrehozza viszont az indukciót, aminek nyomán a luminális fehérjehajtogatás zavart szenved, így a Ca2+-háztartás zavara, a glukózmegvonás, a tioldiszulfid státusz megváltozása, vagy a hipoxia (Bartlett és mtsai 1992, Carlson és mtsai 1993, Chen és mtsai 1992, Price és Calderwood 1992). A GADD153 ER stresszorok hatására történő indukciója gátolható a GRP78 túlexpresszáltatásával (Wang és mtsai 1996). Mai tudásunk szerint tehát a GADD153 közvetlenül az ER stresszre reagál, és a GADD153 indukciója az ER stresszválasz lényeges része. Az ATF4, az ATF6 és az XBP1 egyaránt kötődnek a GADD153 gén promoterén található ERSE és AARE (aminosav regulátor elem) motívumokhoz, és fokozzák a transzkripciót. Nem stresszelt állapotban a GADD153 a citoszólban található. Stressz hatására transzkripciója fokozódik, és a GADD153 fehérje a sejtmagba vándorol (Ron és Habener 1992). A jelpályában a GADD153 utáni lépések csak részben ismertek, viszont tudott, hogy a GADD153 apoptózist aktivál. Indukálja ugyanis a GADD34-et, s ez a transzláció-gátlás feloldásához vezet. A GADD34 stimulálása az ER stresszválaszban negatív visszacsatolás, amennyiben a válasz leállítását biztosítja. Túl erős stressz esetén viszont halálos, mivel az amúgyis leterhelt ER-t tovább terheli friss kliensfehérjékkel. Emellett, az ERO1 indukciója révén még az oxidatív terhelést is

23

fokozza (Marciniak és mtsai 2004). A GADD153 ezek mellett csökkenti a Bcl-2 mennyiségét, ami egy fontos anti-apoptotikus fehérje (McCullough és mtsai 2001). A JNK protein-kinázok szerepéről az IRE1 kapcsán már szóltam. A mitogénaktivált protein-kinázok (MAPK) szupercsaládjába tartozó JNK protein-kinázoknak 3 izoformája van: JNK1, JNK2 és JNK3, melyeket 3 különböző gén kódol. Míg a JNK1 és a JNK2 gének ubikviter előfordulásúak, addig a JNK3 idegi eredetű sejtekben van csak jelen. A JNK család fontosabb szubsztrátjai az AP-1 transzkripciós faktorok, a p53, a c-Myc, továbbá a Bcl-2 fehérjék, mely utóbbiak apoptotikus folyamatokat indítanak el. 1. 2. 4. A kaszpázok szerepe az AAP-toxicitásban Az ER stressz nyomán aktiválódik a kaszpáz-12 is. A kaszpázok intracelluláris proteolítikus enzimek, aktív centrumukban ciszteint tartalmaznak és aszpartát mellett hasítanak. Aktivációjuk – hasonlóan a véralvadás proteázaihoz – kaszkádszerű. A kaszkádban elfoglalt helyük alapján a kaszpázok iniciátor és végrehajtó csoportokba sorolhatók (Thornberry és Lazebnik 1998). Aktiválásuk – a prokaszpáz hasítása - is proteolízissel történik és kisebb fragmentumok megjelenésével jár. A kaszpázaktivációt régebben úgy képzelték, hogy külső jel hatására (a kaszpázaktiváció extrinsic útja), vagy mitokondriális történések nyomán (intrinsic út) történik. A kaszpáz-12 mint ERrezidens kaszpáz megismerése azonban bizonyította, hogy az ER is képes a kaszkád indítására. A kaszpáz-12 a ma ismert egyetlen ER-specifikus kaszpáz, proformája (a prokaszpáz-12) az ER membrán citoszóli oldalán helyezkedik el. Nyugalmi, nem stresszelt állapotban egy TRAF2 nevű adaptor fehérjéhez kapcsolódik (Yoneda és mtsai 2001). ER stresszben a TRAF2 és a prokaszpáz közti kölcsönhatás gyengül, a prokaszpáz-12 dimerizálódik és autoaktiválódik. A TRAF2 az IRE1 citoszólikus doménját is képes kötni, így valószínű, hogy az IRE1 aktivációja vezet a prokaszpáz-12 aktivációjához. Az aktivációhoz szükséges hasítást végezheti az ER membránhoz a citoszólból kihorgonyzó kaszpáz-7, vagy a Ca2+-érzékeny kalpain is (Nakagawa és Yuan 2000). Aktivációja nyomán aktiválódik a kaszpáz-9, majd a kaszpáz-3, tehát citokróm c- és Apaf-1-től független jelpályákon (azaz mitokondriális részvétel nélkül)

24

jut el a jel a végrehajtó kaszpázokhoz. ER stressz során a kaszpáz-12 nem csupán aktiválódik, hanem indukálódik is (Rao és mtsai 2001).

ER stresszben az itt felsorolt faktorok közti egyensúly fogja végül eldönteni, hogy a sejt túlél vagy apoptotizál. A transzláció átmeneti általános gátlása, a chaperonok és az ERAD-komponenseinek indukciója, az NF-κB aktivációja, illetve a transzláció újraindítása a túlélést segítik, míg a GADD153, a JNK, és a kaszpáz-12 indukciója/aktiválása az apoptózis felé billentik az egyensúlyt.

1. 3.

Az acetaminofen

1. 3. 1. Az acetaminofen felhasználása Az acetaminofen (paracetamol, N-acetil-p-aminofen; a továbbiakban rövidítve: AAP) az egyik legelterjedtebb nem-szteroid gyulladásgátló. Hatásspektruma széles; gyulladáscsökkentő, fájdalomcsillapító, és lázcsillapító szer. Terápiás dózisban szedése biztonságos, nagy számban fordulnak elő ugyanakkor akut májkárosodással, esetenként letalitással járó túladagolások. Klinikai szempontból a májkárosodást kiváltó esetek két csoportba sorolhatók; az első csoportba az öngyilkossági szándékú túladagolás esetei tartoznak, míg a második csoportnál terápiás túladagolásról beszélhetünk. Ez utóbbi azt jelenti, hogy szokott dózis mellett fejlődik ki hepatotoxicitás a gyógyszerezéssel paralell történő éhezés/fogyókúra, masszív alkoholfogyasztás, esetleg egyéb P450-szubsztrát gyógyszer (pl. isoniazid) együttes szedése nyomán. Bármi is legyen a túladagolás oka, a kialakuló májkárosodás súlyos, akut, gyakran hospitalizációt igénylő állapot. Az AAPmérgezés kezdeti, nem specifikus tünetei a hastáji fájdalom, gyengeség, étvágytalanság. Valamivel később lesznek kimutathatók az emelkedett szérum enzimszintek, a megnövekedett protrombinidő, valamint az artériás pH csökkenése. Súlyos AAPtúladagolás vagy későn elkezdett, esetleg elmulasztott kezelés esetén fulmináns májelégtelenség, hepatikus kóma is kialakulhat, szükségessé válhat a májátültetés. Kihangsúlyozandó, hogy bár a mérgezéses esetek relatív gyakorisága alacsony, az

25

acetaminofen-tartalmú készítményeket szedők hatalmas száma miatt a mérgezések abszolút száma így is meglepően magas. Az Egyesült Államokban az 1980-as évek közepén kezdett emelkedni az acetaminofenes májkárosodások száma. Ennek fő oka, hogy ezekben az években hozták összefüggésbe az aszpirint a gyerekeket érintő Reyeszindrómával, így a betegek a biztonságosabb(nak vélt) acetaminofent kezdték használni (Martens és Lee 1984). 2004-es adat szerint az Egyesült Államokban AAPtúladagolás miatt évente mintegy 56000 alkalommal keresik fel az orvosokat, 2600 beteget hospitalizálni kényszerülnek, és 458 beteg életét veszti a mérgezés nyomán. Ugyanitt az akut májkárosodások feléért-harmadáért az acetaminofen-túladagolást teszik felelőssé. Magyarországon 1967-ben törzskönyvezték az első acetaminofentartalmú készítményt, a Scutamil-C-t. A gyógyszer- (és nem elhanyagolható módon a reklám-) piac robbanása után, az 1990-es évektől kezdve itthon is meredeken emelkedni kezdett az acetaminofenfogyasztás, és evvel párhuzamosan a mérgezéses esetek száma. Jelenleg, 2007-ben a hazai gyógyszertári forgalomban különböző gyógyszerformákban és márkaneveken (a FoNo-s készítményeket is beleértve) 99 acetaminofen hatóanyagot (is) tartalmazó készítmény kapható. A budapesti Péterfy Sándor utcai Kórház adatai szerint évente 30-50 AAP okozta gyógyszermérgezés fordul elő országosan. Az említett számok ismeretében nem meglepő, hogy az elmúlt négy évtizedben világszerte 30000nél több szakcikk foglalkozott az acetaminofennel. Értelemszerűen a vegyület metabolizmusa, a mellékhatások, toxicitás molekuláris háttere is régóta igen intenzív kutatás tárgya. A következőkben azt kívánom összefoglalni, amit az acetaminofen metabolizmusáról, illetve az akut acetaminofen-toxicitás molekuláris alapjairól tudunk. 1. 3. 2. Az aceataminofen metabolizmusa Az acetaminofen – terápiás adagolás esetén – 96%-ban a májban metabolizálódik, 4%-a pedig változatlan formában ürül a vizelettel. Az AAP metabolizmusa tankönyvi példája a máj biotranszformációs enzimrendszere működésének. A vegyület több, mint 90%-a konjugálódik UDP-glukuronil transzferáz (UGT), illetve szulfotranszferáz enzimek segítségével. Az előbbi enzimek magasabb aktivitásának megfelelően nagyobb részben glukuronid, kisebb részben szulfát konjugátumok keletkeznek. Ezek transzporterek segítségével elhagyják a májparenchima sejteket és a vizelettel, kisebb

26

mennyiségben az epével ürülnek; a hepatotoxicitás kialakulásában nem vesznek részt. Az AAP mintegy 4-5%-a ugyanakkor a citokróm P450 enzimrendszeren keresztül 3hidroxi-acetaminofenné vagy N-acetil-p-benzokinoniminné (NAPQI) oxidálódik. A keletkező

kevés

NAPQI

redukált

glutation

hatására

teljes

mennyiségében

visszaredukálódhat acetaminofenné, vagy a GSH-val konjugálódva 3-glutation-S-ilacetaminofent képez. A 3-hidroxi-acetaminofen úgyszintén glutationos konjugátumként ürül. Amennyiben AAP-túladagolás lép fel, a korlátozott szubsztrátellátás miatt a konjugációs útvonalak telítődnek. Ekkor nagyobb szerep jut a citokrómok által katalizált oxidációs útvonalaknak, minek következtében nagyobb mennyiségű NAPQI képződik. Csökkent GSH-készletek mellett lelassul a NAPQI konjugációja. Évtizedek óta ismert, hogy az acetaminofen hepatotoxikus hatásáért a rendkívül reaktív NAPQI felelős. Az előbbiek fényében érthető, hogy az AAP dózis növekedésével a NAPQI koncentrációja nem arányosan változik, így nem állítható fel egyszerű, lineáris összefüggés az AAP-dózis és a hepatotoxicitás között. Ennek kísérletes jelentőségére az Eredmények részben visszatérek.

27

28

NADPH

O2

UGT

CYP450, NADPH-CYP450-reduktáz

NAPSQI

½ NADP+

NADP+, ROS

ROS

NAPQI

NAD(P)H

½ NADPH

NADPH-citc-red

NQO/ NADPH-CYP450-reduktáz/ n.e.

1.2 ábra Az acetaminofen metabolizmusa

AAP

NAD(P)+

UGT

GSH

GST

AAP-glukuronid

3-S-glutationil-AAP

SG

1. 3. 3. Az acetaminofen-toxicitás mechanizmusa Az AAP-okozta májkárosodás a drog-indukálta oxidatív stressz klasszikus, a kutatásban is kiaknázott példája. Az évtizedek óta zajló kutatás és a nagyszámú kísérleti eredmény ellenére a májkárosodás mechanizmusa még messze nem ismert minden elemében. Ami bizonyosnak tekinthető, az az, hogy a molekuláris történések iniciációjáért a NAPQI keletkezése felelős. A citokróm P450 enzimcsalád (CYP izoenzimek) több tagja is hozzájárul az AAP NAPQI-vá történő oxidációjához. A legfontosabb szerepet a CYP1A2, a CYP2E1 és a CYP3A4 izoenzimeknek tulajdonítják. Bár a különböző metabolizációs utak közti megoszlásban lényeges individuális különbségek lehetnek, a felsorolt izoenzimek közül a 2E1 szerepe a domináns, különösen alkoholistáknál bekövetkező AAP-túladagolás esetén (McClain és mtsai 1980). A CYP2E1 - amelynek egyébként az etanol is szubsztrátja – szerepét egyértelműen bizonyították humán HepG2 sejtek CYP2E1-el történő transzfekciójával; a CYP2E1-et (túl)expresszáló sejtekben intenzívebb volt a NAPQI termelődése (Dai és Cederbaum 1995).

A NAPQI keletkezése számos ok miatt citotoxikus. A citokróm P450 enzimek működése során általában reaktív gyökök szabadulnak fel, így az AAP → NAPQI átalakulásnál is. Bizonyított, hogy a képződő NAPQI többféle lehetséges redox ciklusban is részt vesz. A kinonimin egyfelől reciklizálódhat szemikinonná NADPHcitokróm P450-reduktáz részvételével (van de Straat és mtsai 1987 és 1988, de Vries 1984). Másfelől, ugyanezen enzim hatására, úgyszintén NADPH fogyasztásával, acetaminofenné is visszaredukálódhat (Dahlin és mtsai 1984). A vegyület metabolizmusánál már említést nyert, hogy a NAPQI konjugációja jelentős glutationfogyasztó folyamat, így glutationdepléciót okoz. A NADPH és a redukált glutation fogyása drasztikusan csökkentik a redox pufferek kapacitását. Egyértelmű, és többszörösen bízonyítást nyert, hogy a NAPQI megjelenése az oxidatív stressz veszélyét rejti magában, és a redox egyensúly gyors felborulásához vezethet. Nagy dózisú acetaminofen adása után 1 órán belül a májban megnő a H2O2-koncentrációja, csökken a glutation és ezen belül a redukált glutation mennyisége, erőteljesen fokozódik

29

a szuperoxid termelés (Arnaiz és mtsai 1995). Az eddigiek alapján érthető, hogy az AAP-kiváltotta májkárosodás centrilobuláris zonalitást mutat, mivel itt magas citokróm P450 aktivitás, és az átlagosnál alacsonyabb glutation-koncentráció mérhető. Az is világossá válik, miért nagyobb a toxicitás veszélye alkoholistáknál, illetve alultáplált egyéneknél. Utóbbiaknál egyfelől csökkentek a hepatikus glikogénraktárak, ezáltal kevesebb UDP-glukuronsav áll a konjugációs folyamatok rendelkezésére. (Mandl és mtsai 1995, Braun és mtsai 1997, Bánhegyi és mtsai 1988). Másfelől a hiányos vitaminellátás miatti megváltozott antioxidáns státusz is növeli a kockázatot. Alkoholistáknál e tényezők mellett a CYP2E1 etanol hatására bekövetkező indukciója is kockázatnövelő, mivel még tovább nőhet az oxidatív úton keletkező NAPQI mennyisége adott AAP-dózis mellett (McClain és mtsai 1999, Lauterburg és Velez 1988). A NAPQI fontos jellemzője, hogy fehérje-adduktokat képez. Bár feltételezték, hogy létezik néhány kitüntetett fehérje-célpont, melyek kovalens módosítása nagyrészben felelőssé tehető a májkárosodásért, ezt bizonyítani nem sikerült. AAPfehérje-adduktok elleni antitestekkel legalább 40 fehérjéről mutatták ki, hogy érintettek. Így valószínűbbnek látszik, hogy a több tucatnyi target-fehérje károsodása összességében járul hozzá a károsodáshoz. (Cohen és Khairallah 1997, Qiu és mtsai 1998, Roberts és mtsai 1991). Az acetaminofen által kiváltott májkárosodás mechanizmusában komoly figyelmet kaptak a mitokondriális események. A kovalensen módosított fehérjék között kimutattak mitokondriális lokalizációjúakat is, ami magyarázhatja a mitokondriális diszfunkciót. Bizonyított ugyanis, hogy a mitokondriális oxigénfogyasztás csökken, az oxidatív foszforiláció lassul acetaminofen mérgezésben. (Meyers és mtsai 1988, Tirmenstein és Nelson 1989, Burcham és Harman 1991, Donelly és mtsai 1994, James és mtsai 2003, El-Hassan és mtsai 2003). MRI vizsgálatok igazolták, hogy AAP hatására a piruvát citrátköri hasznosítása romlik; hasonlóképpen csökken a zsírsavak βoxidációjának sebessége (Coen és mtsai 2003). Mindezen változásokat követően még alapvetőbb

mitokondriális

események

zajlanak:

az

oxidatív

stressz

nyomán

megemelkedik a mátrix szabad Ca2+-szintje, kinyílik az átmeneti permeabilitási

30

póruskomplex, permeabilizálódik a membrán (MMP), és a belső membránból a citoszólba jut a citokróm c. Ez utóbbi az elektrontranszportlánc működését ismereteink szerint nem befolyásolja, viszont az apoptoszóma nevű fehérjekomplex részeként mitokondrium-függő apoptotikus jelpálya iniciációját váltja ki (Kroemer és Reed 2000). Az apoptoszóma működése ATP-igényes, ugyanakkor láttuk, hogy a mitokondriális ATP-szintézis csökkent, így az apoptotikus program lefutása nem feltétlenül biztosított. Amint azt a Diszkusszió részben majd részletesebben tárgyalom, hasonló jelenség figyelhető meg az ER-függő apoptózis iniciációjánál is acetaminofen okozta stresszben. 1. 3. 4. A non-parenchima sejtek részvétele az AAP-toxicitásban Megemlítendő, hogy a máj non-parenchima sejtjeinek, így a rezidens makrofág Kupffer-sejteknek, az endotélsejteknek, továbbá a beszűrődő immunsejteknek (makrofágok, monociták, neutrofilek) is szerepet tulajdonítanak az acetaminofenes májkárosodás kialakulásában (Laskin és mtsai 1986). A hepatociták az oxidatív stressz nyomán ugyanis kemotaktikus molekulákat szekretálnak, amik a rezidens makrofágok aktivációja mellett további immunsejtek beszűrődését is kiváltják. Az immunsejtek ROS

termelésével,

illetve

gyulladásos

mediátorok

szekretálásával

tovább

súlyosbíthatják a folyamatot. Számos eredmény szól azonban amellett, hogy az immunsejtekhez köthető események ugyan valóban befolyásolják a gyulladásos folyamatot, a májkárosodás kialakulásában viszont csak kisebb szerepet játszanak. Azok a knock-out egerek például, amelyek Kupffer-sejtjei nem képesek szuperoxid termelésére, a vad-típusú állatokéhoz hasonló szenzitivitást mutattak AAP-kezeléssel szemben (James és mtsai 2003). Ismert az is, hogy az AAP-kezelést követő májgyulladáskor neutrofil granulociták halmozódnak fel a májban; ez viszont lokális jelenség, a neutrofil granulociták szisztémás aktivációját nem vonja maga után. Emiatt a legtöbb gyulladásos mediátor vérszintje sem elégséges ahhoz, hogy a gyulladást súlyosbító

tényezőnek

tekinthessük.

A

neutrofil

akkumuláció

továbbá

a

májkárosodással paralell, esetleg azt követően figyelhető meg. Feltételezhető tehát, hogy ok-okozati összefüggés fordított sorrendben áll fenn, azaz nem a neutrofilek fokozott megjelenése súlyosbítja a károsodást, hanem a károsodás miatt szűrődnek be a májba neutrofilek, hogy a széteső, nekrotizáló sejteket eltávolítsák (Lawson és mtsai

31

2000). Nem kerülhető meg az az ellentmondás sem, hogy míg a ROS-t legaktívabban termelő Kupffer-sejtek a periportális területeken vannak, addig a májkárosodás leginkább a centrilobuláris részekre lokalizálható (Jaeschke és mtsai 1991 és 1992). A toxikus hatás kialakulásához hozzájárulhat a peroxinitrit (ONOO-) is, ami erős oxidáló és nitráló szer. Peroxinitrit ekvimoláris szuperoxid gyök (O2˙-) és nitrogénmonoxid gyök (NO˙) nem-enzimatikus reakciójában keletkezhet. Okozhatja fehérjék kovalens módosítását és csökkent funkcióját, amennyiben a tirozin oldalláncokat nitrotirozinná alakítja. A redukált glutation - fiziológiás koncentrációban legalábbis – hatékonyan védi ki a nitrotirozilációt, mert a tirozil-gyököket képes visszaredukálni (Kirsch és mtsai 2001). A peroxinitrit, lévén erős oxidálószer, a makromolekulák, így a DNS és a fehérjék direkt oxidációját is okozza (Salgo és mtsai 1995). Nem véletlen, hogy az AAP-kezelés után adott antioxidáns (GSH) hepatoprotektívnek bizonyul; fokozza a hepatociták regenerációs képességét és a hosszútávú túlélést (Bajt és mtsai 2003). A NO˙ illetve a peroxinitrit szerepe az AAP-toxicitásban nem egyértelmű; egyes szerzők szerint súlyosbítja a károsodást, (Gardner és mtsai 1998), mások NO˙-donor szerekkel védőhatást tudtak kimutatni (Fiorucci és mtsai 2004). Az irodalom nem egységes továbbá a tekintetben sem, hogy az indukálható nitrogén-monoxid szintáz (iNOS vagy NOS II) szerepet játszik-e a folyamatban, vagy csupán a fokozott szuperoxidtermelés tehető felelőssé a nitrotirozin adduktok képződéséért (Gardner és mtsai 2002). Az érendotélsejtekben expresszálódó, nem indukálható NOS III izoenzim által termelt NO˙, a hepatocitákból és immunsejtekből származó szuperoxiddal reagálva elegendő a fehérjék nitrálásához, a NOS II indukciója nem mindig bizonyítható (Knight és mtsai 2001). Valószínű, hogy az AAP adása miatt gyökeresen megváltozott GSH/GSSG arány változatlan NO˙-termelés mellett is okozhatja a nitrotirozilált adduktok felszaporodását. A nitrogén-monoxiddal kapcsolatos ellentmondásokat feloldani látszik az az elképzelés, miszerint az AAP metabolizmusa során keletkező szuperoxid NO˙ hiányában

hidrogén-peroxiddá

alakul

és

súlyosbítja

az

oxidatív

stresszt

(lipidperoxidáció, a DNS oxidatív károsítása), míg NO˙ jelenlétében inkább peroxinitritté alakul és fehérjéket nitrál (Hinson és mtsai 2002). Az oxidatív stressz illetve a nitrotiroziláció pedig eltérő körülmények között eltérő súlyosságú sejtkárosodást válthatnak ki, innen a – látszólag – ellentmondásos megfigyelések.

32

1. 3. 5. A Ca2+-homeosztázis felborulása AAP-toxicitásban Az acetaminofenes hepatotoxicitás egy további manifesztációja az intracelluláris Ca2+-homeosztázis felborulása. Az AAP metabolizmusa során egyértelműen megnő a citoszól szabad Ca2+-szintje. Ezt a plazmamembrán Ca2+-Mg2+-ATPáz, illetve a SERCA gátlása okozza. Valószínűsíthető emellett, hogy az ER rianodin-receptorain keresztül is fokozottan ürül Ca2+ a lumenből a citoplazmába (Holownia és Braszko 2004). Egyes elképzelések szerint a plazmamembránban lévő pumpa gátlásáért a NAPQI (esetleg további, minor oxidatív metabolitok) adduktképzése felelős (Tsokos-Kuhn és mtsai 1988). Más eredmények alapján a csökkent GSH-szint, és a protein-tiolok következményes oxidációja vezet a Ca2+ intracelluláris akkumulációjához (Moore és mtsai 1985). A SERCA-aktivitás gátlásáért az előzőekben említett peroxinitritet teszik felelőssé (Grover és mtsai 2003). A citoszóli szabad [Ca2+] növekedése miatt a mitokondrium nagyobb mennyiségben fog Ca2+-t felvenni, tehát a mátrix [Ca2+]-ja is megemelkedik. Ez pedig az átmeneti permeabilitási póruskomplex nyitásával egy apoptotikus útvonalat indíthat be (Masubuchi és mtsai 2005). Az emelkedett [Ca2+]citoszól további következménye a nukleáris Ca2+-függő endonukleázok aktiválódása. Ez a DNS egyes és kettős lánctöréseiben, fokozott fragmentációban jut érvényre (Lawson és mtsai 1999, Ray és mtsai 1990). In vitro kísérletekben igazolták, hogy Ca2+-kelátorokkal valóban csökkenthető az AAP hepatotoxicitása (Salas és Corcoran 1997). A fokozott DNS-fragmentáció bizonyítottan a poli(ADP-ribóz)polimeráz (PARP) aktivációját váltja ki. A PARP NAD+ terhére ADPribóz egységeket kapcsol fel önmagára és számos más fehérjére; lényeges, ám csak részleteiben tisztázott szereppel bír a DNS-károsodásra adott válasz lebonyolításában (Ivana Scovassi és Diederich 2004). Túlzott aktivációja apoptotikus vagy nekrotikus sejthalálhoz vezethet, mert a NAD+-szint és következményesen az ATP-szint csökkenését váltja ki. Az irodalom a PARP-aktiváció megítélésében sem egységes; vannak eredmények melyek szerint a PARP aktivációja oki tényező az AAP hepatotoxicitásában (Kroger és mtsai 1996, Ray és mtsai 2001, Cover és mtsai 2004), mások szerint az oxidatív stressz hatására beinduló apoptotikus folyamatban a PARP nem játszik szerepet (Leist és mtsai 1997).

33

1. 3. 6. AAP-indukálta sejthalál: nekrózis, apoptózis vagy mindkettő? Egy további, alapvető fontosságú kérdés, ami megosztja az AAP hepatotoxicitását kutatókat, hogy a sejtpusztulás nekrotikus vagy apoptotikus jellegű-e. A kérdés az utóbbi évtizedben került a figyelem homlokterébe, mivel részleteiben vált ismertté a két halálnem molekuláris mechanizmusa. Ezt megelőzően a hepatotoxikus dózisú acetaminofen- és általában a drog-indukálta májsejtpusztulást nekrózisnak tekintették. A két sejthaláltípus jellegzetességei röviden: nekrózisnál a sejt megduzzad, vakuolizáció, kariolízis figyelhető meg, és a sejtmembrán fokozatos szétesése miatt a károsodott sejt tartalma a környezetbe ürül. Apoptózis során a sejt zsugorodik, a kromatinállomány kondenzálódik, a DNS a hisztonok közti részen endonukleázok hatására feldarabolódik (az izolált DNS-t agarózgélen futtatva megjelenik az ún. DNS-létra). Végül a sejt intakt sejtmembránnal körülvett apoptotikus testekké esik szét. Ez utóbbiakat a környező sejtek fagocitózissal eltávolítják (Jaeschke és mtsai 2004). Bonyolítja az előbbiekben vázoltakat, hogy az apoptózis bizonyos faktorok hiányában (lásd később) másodlagos nekrózisba mehet át. Hasonlóképpen, nekrotikus folyamat is folytatódhat apoptózisban. Egyes érvelések szerint a két mechanizmus csupán két szélső formája egyazon jelenségnek (Kaplowitz 2000). Az apoptózis részvétele mellett szól, hogy bizonyos morfológiai jegyek alapján (DNS-létra megjelenése, illetve TUNEL-esszé) nagyobb számú apoptotizáló sejtet sikerült kimutatni AAP-kezelés után (Ray és mtsai 1996, Gujral és mtsai 2002). Ugyanitt és más cikkekben (Grasl-Kraupp és mtsai 1995) viszont leírják, hogy a megfigyelt morfológiai jegyek nem felelnek meg teljesen az apoptózisnak. Még lényegesebb érv, hogy a pusztuló sejtek csupán kevesebb, mint 1%-a apoptotikus, több, mint 99%-uk nekrózis jeleit mutatja (Gujral és mtsai 2002). Az AAP hatására bekövetkező apoptózis során is lényeges molekuláris történés lehet a kaszpázok egymás általi, egymást követő – kaszkádszerű – aktivációja (Thornberry és Lazebnik 1998). AAP-okozta toxicitásnál az intrinsic útvonal aktivációját valószínűsítették. Mesterséges kaszpáz-inhibitorokkal végzett kísérletek azonban nem minden esetben támasztották alá a kaszpázaktiváció AAP-toxicitásban betöltött szerepét (Kass és mtsai 2003, Lawson és mtsai 1999). Hasonlóan nincs

34

meggyőző bizonyíték a végrehajtó kaszpázok hasítására, illetve aktivációjára sem (ElHassan és mtsai 2003). Mindez nem meglepő, ha figyelembe vesszük, hogy a kaszpázaktivitás döntően függ az aktív centrumban található cisztein oldalláncának tiolcsoportjától; az SH-csoport alkilálása vagy oxidálása inaktiválja az enzimet. A redukált glutationszint csökkenése vagy egyéb, a redox státusz megváltozásával járó esemény blokkolhatja a már beindult kaszpáz-kaszkádot (Hampton és mtsai 1998, Lawson és mtsai 1999). Bizonyított, hogy a kaszpáz-3 és -8 aktiválódása a sejt glutation-depléciója esetén gátolt (Hentze és mtsai 2002 és 2003, Musallam és mtsai 2002).

Összefoglalva elmondható, hogy az acetaminofen hepatotoxikus hatásáért az oxidatív reakcióúton keletkező fő metabolit, a NAPQI felelős. A sejtkárosodás két fő mechanizmusra vezethető vissza; i) a NAPQI konjugációja, és reciklizációja, illetve az ezek nyomán keletkező reaktív gyökök kimerítik a redox puffereket és oxidatív stresszt idéznek elő, ii) a NAPQI és a gyökös reakcióban keletkező peroxinitrit fehérjék kovalens módosulását és funkcióvesztését okozzák. Ezek következtében megváltozik a sejtkompartimentumok közti Ca2+-eloszlás, DNS-törések jelennek meg és apoptotikus faktorok is aktiválódnak. Valószínűsíthető viszont, hogy a súlyos oxidatív stressz miatt az apoptotikus program nem tud lefutni, és programozatlan sejthalálba, azaz nekrózisba megy át.

35

2.

CÉLKITŰZÉSEK

Az AAP túladagolás májkárosító hatásában számos közlemény foglalkozik a mitokondrium károsodások szerepével.

Feltételeztük, hogy az AAP nemcsak a

mitokondriumok, hanem az ER működését is megzavarja májsejteken. Az ER redox homeosztázisának változása oxidatív fehérjehajtogatódás zavart, és következményként ER stresszválaszt okozhat. Az AAP-túladagolás oxidatív stresszt vált ki. Feltételeztük, hogy az AAP-vel kiváltott oxidatív stresszben az ER redox homeosztázisa is változik. Feltételeztük, hogy ennek során ER stressz is kialakulhat, és ez szerepet játszhat az AAP túladagolás májkárosító hatásában. Vizsgálni kívántuk, hogy az AAP-túladagolás eredményez-e az ER-ben redox statusz változást. Az AAP metabolizmusa során glutation depléció alakulhat ki. Vizsgálni kívántam, hogy az AAP az ER-ben is okoz-e glutationdepléciót, illetve, hogy a feltételezett ER-stresszor hatása mennyiben alapul az AAP ismert glutationdepletáló hatásán. Tanulmányozni akartuk, megfigyelhető-e ER stresszválasz, ennek milyen jelátviteli útjai aktiválódnak, megváltozik-e az ER chaperonjainak expressziója, aktiválódnak-e proapoptotikus faktorok, van-e kaszpáz aktiválódás. Vizsgálatainkat sejtkultúrákon és in vivo is végeztük. Az in vivo vizsgálatok jelentőségét az alapkutatási megfigyelések mellett abban is látjuk, hogy AAP által kiváltott májkárosodást a redox stresszen alapuló ER stressz in vivo modelljének tekinthetjük, ami releváns lehet humán májkárosodás modelljeként is. Kísérleteinknél a korai jelenségek tanulmányozását tűztük ki célul. A korai jelenségek tanulmányozásánál a nekrotikus jelenségek még nem fedik el az ER stresszválasz szabályozottan zajló történéseit.

36

3.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

3. 1.

Sejtkultúrák

Az acetaminofen-toxicitás vizsgálatához májeredetű letapadó sejtvonalakat használtam. A C34 és E47 humán hepatóma sejtvonalakat Prof. Arthur Cederbaum (Mount Sinai School of Medicine, New York) bocsátotta rendelkezésünkre. Mindkét sejtvonal az elterjedten használt HepG2 sejtvonal származéka, az E47 jelű transzfekciós vektorban hordozza a CYP2E1 gént, míg a C34 a megfelelő kontrollvektort tartalmazza. A két sejtvonalat azonos körülmények között tartottam fenn; 5%-os CO2-t tartalmazó atmoszférában 37°C-on. A sejteket MEM alapú sejtmédiumban növesztettem, amit 10% borjúsavóval (foetal bovine serum), 1% glutaminnal, továbbá 100 ml-enként 10000 U penicillinnel és 10 mg streptomycinnel egészítettem ki. A sejteket Prof. Cederbaum javaslatának megfelelően ötnaponta oltottam át. A Hepa1c1c7 sejtvonal egér májtumor eredetű, könnyen fenntartható, gyorsan növő sejtvonal, szekréciós fehérjéi a hepatociták által termelt fehérjék széles spektrumát lefedik. Ezt a sejtvonalat Prof. Oliver Hankinson (Center for the Health Sciences, UCLA, USA) bocsátotta munkacsoportunk rendelkezésére. A Hepa1c1c7 vonal fenntartása a humáneredetű sejtekével megegyező inkubációs körülmények között történt, azzal a különbséggel, hogy a Hepa1c1c7 sejtek alfa-MEM alapú sejtmédiumban nőttek, amit a fent említett összetevők mellett még 250 μg/100 ml amfotericinnel egészítettem ki, a fungális befertőződés elkerülésére. Ezt a sejtvonalat átlagosan négynaponta oltottam át. Kísérletekhez a sejteket 10 cm átmérőjű Petri-csészékre oltottam szét. Mikor a sejtek az edényt 70-80%-ban benőtték (tehát a konfluencia elérése előtt), a sejteken médiumot cseréltem, majd 24 órával később került sor a kezelésre. Valódi hipoxia létrehozásához a Petri-csészéket 1% oxigént tartalmazó gázkeverékkel átáramoltatott kamrákba helyeztem.

37

3. 2.

Vegyszerek és antitestek

A kísérletek során használt acetaminofent és butionin-szulfoximint a SigmaAldrichtól (St. Louis, MO, USA) vásároltuk. Az aszpartát-aminotranszferáz, alaninaminotranszferáz és laktát-dehidrogenáz szérum enzimaktivitások méréséhez a Diagnosticum Rt. által forgalmazott kiteket használtam. A kitek használatakor túl magas enzimaktivitások esetén módosítottam a felhasznált szérummennyiségeket a pontos mérhetőség érdekében. Az elsődleges ellenanyagok közül az ATF6 elleni monoklonálist az AnaSpec (San Jose, CA, USA), a CYP2E1 elleni poliklonálist a Chemicon (USA), az eIF2α, a foszfo-eIF2α, továbbá a foszfo-JNK elleni poliklonálisokat a Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA), az ERp72 elleni poliklonálist a Calbiochem (San Diego, CA, USA), a kaszpáz-3 elleni poliklonálist az Upstate (Lake Placid, NY, USA), a kaszpáz-12 elleni monoklonálist a Sigma-Aldrich gyártotta. Az összes többi elsődleges ellenanyagot (β-aktin, kaszpáz-8, GADD153, GRP78, GRP94, p53, PDI) a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) termékei közül választottuk; az anti-GADD153 ellenanyag kivételével ezek poliklonálisak. A másodlagos ellenanyagokat részben a Santa Cruz Biotechnology (kecske, egér és nyúl elleni IgG-k), részben a Sigma-Aldrich (patkány elleni IgG) gyártotta. A HPLC-s méréseknél használt monoklorobimánt a Flukától vásároltuk. A CoCl2-ot és a desferrioxamint a Sigma-Aldrichtól szereztük be.

3. 3.

Állatkísérletek

In vivo kísérleteimhez egereket választottam, mivel az acetaminofen-toxicitás irodalma jelentős részben egérkísérleteken alapul. A CD-1 hím állatokat a Charles River Magyarországtól vásároltuk (Gödöllő). Az egerek állatházi tartása és a kísérletek az Egyetemünk által lefektetett szabályok betartásával történtek. Az állatok az állatházi tartás során szabadon jutottak táplálékhoz és vízhez. Az állatok kezelése akkor történt, mikor testsúlyuk a 25-30 grammos tartományba került. A kezelést 24 órás éheztetés előzte meg; az állatok ivóvíz-hozzáférése ez idő alatt is megmaradt. Az éheztetés célja, hogy a máj glikogénkészlete kimerüljön, ezáltal csökkenjen a glukuronidáció szerepe az AAP hepatocelluláris konjugációja során. Az irodalomból ismert, hogy éhezésben,

38

illetve éhezés után csökken a rendelkezésre álló UDP-glukuronsav mennyisége, ezáltal nő az AAP toxicitása. Kísérleteim során az egereket AAP-vel (450 mg/kg), illetve butioninszulfoximinnel (BSO; 7,2 mmól/kg, Goldring és mtsai 2004) kezeltem. Mindkét szert fiziológiás pH-jú steril PBS pufferben oldottam fel, majd a testhőmérsékleten tartott oldatok 1 ml-es térfogatát intraperitoneálisan adtam be. A kontroll állatok azonos térfogatú steril PBS-t kaptak.

3. 4.

Szérum enzimaktivitások mérése

A kezelés után meghatározott időpontokban az állatokat cervikális diszlokációval megöltem. A méréshez szükséges vért a vena cava inferiorból, injekciós tűvel nyertem. A levett vért azonnal citrátos pufferral kevertem, majd az alakos elemeket centrifugálással eltávolítottam, és a szérumot jégben hűtve tároltam a mérésig. Az aszpartát-aminotranszferáz

(AST),

alanin-aminotranszferáz

(ALT)

és

laktát-

dehidrogenáz (LDH) enzimaktivitások mérése fotometriás detektálással (Multiskan Spectrum, Thermo LabSystems, Franklin, MA, USA), a kitekben leírtaknak megfelelően történt.

3. 5.

Immunoblot kísérletek

Immunoblot készítéséhez in vitro kísérletek esetén a sejtekről a médiumot eltávolítottam. A sejteket ezután jégen hűtött PBS pufferrel kétszer gyorsan mostam, majd 150 µl jéghideg lízispuffert (összetétele: 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5, 1 V/V% Nonidet-P40, 0,15 M NaCl, 0,01 M EDTA, 1% NaN3, 10 mM PMSF, továbbá frissen adott proteáz- és foszfatáz-inhibitorok) mértem rájuk. Két perc várakozás után a sejteket kaparóval összegyűjtöttem és Eppendorf-csőbe juttattam. A csöveket jégen tartva 30 másodpercig szonikáltam, majd 10 percig 4°C-on 10000 g-n centrifugáltam a durva sejttörmelék eltávolításához. Állatkísérletek esetén közelítőleg 0,1 grammnyi frissen eltávolított

májdarabokat

homogenizáltam

jégen

hűtött

lízispufferben.

A

homogenátumokat 30 másodpercig jégen szonikáltam, majd 10 percig 4°C-on 10000 gn centrifugáltam a szöveti törmelék eltávolításához. 39

A centrifugálás után nyert felülúszót eltávolítottam, ennek kis részéből fehérjetartalmat

határoztam

meg,

míg

zömét

-80°C-on

lefagyasztottam.

A

fehérjetartalom meghatározása a Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) felhasználásával, 750 nm-en fotometrálva történt. A sejt-, illetve szövethomogenátumok megfelelő mennyiségéhez desztillált vizet, majd 1 : 1 arányban mintafelvivő puffert (ennek összetétele: 100 mM Tris; pH 6,8, 4% SDS, 20% glicerin, 0,2% brómfenolkék), végül 2 %-os végkoncentrációban (V/V%) βmerkaptoetanolt adtam. Az így készített elegyeket 10 percig 100°C-on forraltam. Hűtés után 40-100 µg fehérjének megfelelő mennyiséget futtatáshoz a gélzsebekbe juttattam. A futtatáshoz az előbb leírt módon előkészített, de aktuálisan nem felhasznált mintákat 80°C-on lefagyasztottam. A minták futtatását 11 vagy 13%-os denaturáló SDSpoliakrilamid gélen végeztem, Bio-Rad készülék segítségével. A futás végeztével a fehérjéket nitrocellulóz membránra transzferáltam. A transzfer során a transzferkádat 4°C-on tartottam, vagy jégben hűtöttem. A transzfer végeztével a membránt 1 órán keresztül 5% tejport tartalmazó PBS-ben blokkoltam. A membránt ezt követően 3x10 percig 1% tejport tartalmazó PBS-T-ben (PBS + 0,25% Tween-20) mostam, majd egy éjszakán át a PBS-T + 1% tejporban feloldott elsődleges ellenanyaggal inkubáltam. Ezután a membránt 4x 15 percig mostam 1% tejport tartalmazó PBS-T-ben, majd 1 órán keresztül inkubáltam a tormaperoxidázzal konjugált másodlagos ellenanyaggal. A nem specifikusan kötött ellenanyagot 4x 15 perces mosással (1% tejport tartalmazó PBS-Tvel) eltávolítottam, majd a membránokat kemilumineszcens reagens felhasználásával (Perkin Elmer, Boston, MA, USA) hívtam elő.

3. 6.

Mikroszómaizolálás

Az egerek cervikális diszlokációja után azonnal eltávolított májakat jégre tettem, és belőlük 0,1 grammos darabokat vágtam ki. A májdarabokat négyszeres térfogatú szaharóz-HEPES pufferben (pH: 7,2) homogenizáltam (Janke&Kunkel, IKALabortechnik, Németország), és a homogenátumokat 1000 g-n 4°C-on 10 percig centrifugáltam a durva szöveti törmelék eltávolítására. A felülúszót átraktam ultracentrifuga-csövekbe és 30000 g-n 4°C-on 10 percig centrifugáltam (Optima LE80K Ultracentrifuge, Beckman-Coulter, Fullerton CA, USA). A keletkezett felülúszót új ultracentrifuga-csövekbe raktam át, és 100000 g-n 4°C-on 1 óráig centrifugáltam. A 40

csapadékot jéghideg MOPS pufferben (pH: 7,4) felszuszpendáltam és ismételten 100000 g-n 4°C-on 1 óráig centrifugáltam. A mikroszómális csapadékot MOPS pufferben felszuszpendáltam, alikvotoztam, és a 2-300 μl-es alikvotokat folyékony nitrogénben lefagyasztottam.

3. 7.

Mikroszómális glutation mérése

Az előző pontban leírtaknak megfelelően májmikroszómát izoláltam. A mikroszómák fehérjetartalmát BioRad Protein Assay-vel határoztam meg. A mikroszómális glutationtartalom méréséhez glutation kalibrálósort készítettem; a méréshez előkészített minták 0 – 275 pmól glutationt tartalmaztak. A nitrogénből felvett mikroszómamintákból körülbelül 300 μg fehérjének megfelelő mennyiségeket TRIZMA pufferben (pH: 8,0) feloldottam. Összglutation-mennyiség meghatározásakor 0,1 mM ditiotreitollal (DTT) kezeltem a mintákat (inkubáció 25°C-on, 1 óráig), redukált glutation (GSH) meghatározásához a DTT-vel végzett redukció elmarad. Ezt követően 1 mM monoklorobimánnal derivatizáltam a mintákat (inkubáció sötétben, 25°C-on, 10 percig). A monoklorobimán tiol-specifikus reagens, a reakcióban erősen fluoreszcens tioéter keletkezik. A mintákat ezután egytized térfogatnyi 100%-os TCA-val kezeltem, és a leváló csapadékot 5 perces 20000 g-s centrifugálással választottam le. A derivatizált glutation mérése a felülúszókból vett mintákból, HPLC módszerrel történt. Elválasztásra Teknokroma Nucleosil 100 C-18 oszlopot használtam (4,6 x 250 mm, 5 μm szemcseméret). A derivatizált glutation mennyiségét fluoreszcens detektorral (Waters 2475 Multi λ Fluorescence Detector) mértem. Irodalmi adatokból tudjuk, hogy a fagyasztott-olvasztott mikroszómák glutationtartalmámak mérésével pontos adatok nyerhetők az eredeti ER glutation-szintekről, mivel a GSH, illetve a GSSG mikroszómális membránon keresztül történő átjutása lassú (Bánhegyi és mtsai 1999, Bass és mtsai 2004).

3. 8.

Sejtes glutationtartalom mérése

Petricsészéken közel konfluenssé növesztettem Hepa1c1c7 egér hepatóma sejteket. Médiumcserét követően 24 órával AAP-vel (10 mM), illetve BSO-val (1 mM) 41

kezeltem a sejteket. Kezelés után 1 illetve 3 órával a sejteket jéghideg PBS-sel mostam, jégen lizáltam, 30 mp-ig szonikáltam, majd centrifugáltam (10 perc, 10000g). A 10xesre hígított felülúszó 10 μl-ét használtam fel redukált glutation és teljes glutation meghatározására, a 3. 7. pontban leírtaknak megfelelően.

3. 9.

Mikroszómális glutationtranszport mérése gyorsszűréses módszerrel

Mikroszómális vezikulákat (0,5–1 mg fehérje/ml) szobahőmérsékleten (22 °C) inkubáltunk 1 mM GSH-t és a radioaktívan jelölt analóg [3H]GSH-t (10 μCi/ml) tartalmazó pufferben (100 mM KCl, 20 mM NaCl, 20 mM MOPS). Különböző időpontokban eltávolított alikvotokat (0,1 ml) cellulózacetát vagy -nitrát membránon (pórusméret: 0,22 μm) szűrtünk és mostunk azonos összetételű jéghideg pufferrel. A membránon visszamaradt radioaktivitást szcintillációs számlálóval mértük. Az intravezikuláris és membránkötött radioaktivitás elkülönítésére párhuzamos méréseket is végeztünk alameticintartalmú (50 μg/mg fehérje) mintákból. Az alameticin egy pórusképző antibiotikum, a mikroszómális vezikulákat permeábilissá teszi számos hidrofil molekulára, így GSH-ra és GSSG-re (Bánhegyi és mtsai 1999). Az alameticinnel permeabilizált mikroszómális vezikulákat is az előbb leírt módon szűrtük, majd mostuk. A mikroszómális fehérjék több, mint 95%-a visszamaradt a membránon, ami mutatja, hogy az alameticin-kezelés nem változtatja meg a mikroszómák vezikuláris

szerkezetét.

Az

alameticinnel

kiengedhető,

tehát

intravezikuláris

radioaktivitást a membránkötött radioaktivitás teljes radioaktivitásból való kivonásával nyertük.

3. 10.

Mikroszómális glutationtranszport mérése fényszórásos módszerrel

A mikroszómális membránok GSH-permeabilitását fényszórásos módszerrel is mértük; a módszer a vezikulák méretének/alakjának ozmotikus hatásra bekövetkező változásán alapul (Fulceri és mtsai 1994). Mikroszómális vezikulákat (50 μg fehérje/ml) 2 óráig ekvilibráltunk hipoozmotikus pufferben (5 mM K-PIPES, pH 7,0). Ezt követően a mikroszómák fényszórását 400 nm-en, fluorimetriásan detektáltuk (Hitachi F-4500), temperált küvettákban (Bánhegyi és mtsai 2003; saját közlemény). Kis térfogatú (a 42

teljes inkubációs térfogat <5%), pH-neutrális GSH-törzsoldatot adva az elegyhez a fényszórás gyors növekedését detektáltuk; ez a vezikulák méretcsökkenésének következménye. A csúcs után a fényszórás fokozatos csökkenését tapasztaltuk, amit a vezikulák méretének növekedése okoz, ahogy az extra- és intravezikuláris tér között kiegyenlítődik a GSH-koncentráció. A fényszórási csúcs relatív magassága és a görbe meredeksége a vezikuláris membrán GSH-permeabilitásának függvénye.

3. 11.

Mikroszómális NADPH mérése

A 3. 6. pontban leírtaknak megfelelően májmikroszómát izoláltam. A NADPHtartalmat az irodalomban leírt módszer alapján végeztem (Piccirella és mtsai 2006). Röviden: 2 mg/ml fehérjekoncentrációjú minták NADPH-tartalmát fluoriméterrel (Cary Eclipse Varian) határoztam meg, 340 nm-es excitációs, illetve 460 nm-es emissziós hullámhosszaknál. 2 percig vettem fel alapvonalat, majd 10 μM koncentrációban metirapont adtam a mintákhoz. A gátlószer jelenlétében a 11β-hidroxiszteroiddehidrogenáz elhasználja a rendelkezésére álló NADPH-t, a jelcsökkenés arányos az eredetileg jelenlévő NADPH mennyiségével.

3. 12. A szabad tiolcsoportok kovalens jelölése (AMS-jelölés) Az AMS (4-acetamido-4`-maleimidilsztilbén-2,2`-diszulfonsav) erős alkiláló szer, így a fehérje ciszteinoldalláncok tiolcsoportjaihoz is kovalensen kötődik. Az AMSjelölés lényege, hogy a fehérjék tiolcsoportjaihoz kapcsolódó AMS molekulák lassítják a fehérjemolekula vándorlását gélelektroforézis során. Minél több (redukált) tiolcsoportot tartalmaz tehát a fehérje, annál lassabban fut AMS-jelölést követően. A fehérje oxidáltabb és redukáltabb formái között eltolódás (shift) figyelhető meg nemredukáló gélben történő futtatás során. Az endoplazmás retikulum oxidoreduktázai redox állapotának tanulmányozásához májmikroszómák AMS-jelölését végeztem el. A leölt állatok májából mikroszóma-frakciót izoláltam a 3. 6. pontban leírt módon. A mikroszómák fehérjetartalmát BioRad Protein Assay-vel határoztam meg. 40 μg fehérjét tartalmazó mintákat 0,1 M Tris pufferrel (pH: 7,2) 100 μl térfogatra hígítottam. A mintákat ezután 5% végkoncentrációjú triklórecetsavval (TCA) 43

kicsaptam, majd 10000g-n 4°C-on 5 percig centrifugáltam. A csapadékot háromszor mostam 70%-os acetonnal, majd háromszor a 0,1 M-os Tris pufferrel. Ezután a csapadékot 40 μl visszaoldó pufferben felvettem (ennek összetétele: 0,1 M Tris, 70 mM SDS, 6 M urea, pH: 6,8). A visszaoldott mintából 18 μl-t felvettmemk és hozzáadtam 2 μl-t az AMS törzsoldatból (0,2 M, DMSO-ban), hogy az AMS végkoncentrációja 20 mM legyen. A mintákat ezután 15 percig jégen tartottam, majd 15 percig 37°C-on inkubáltam. Az AMS-sel jelölt minták futtatásakor lényeges oxidált és redukált kontrollminták egyidejű futtatása. A kontrollok elkészítéséhez 40 μg fehérjét tartalmazó mikroszómális mintákat 0,1 M Tris pufferrel (pH: 7,2) 100 μl térfogatra hígítottam. Ezeket 50 mM ditiotreitollal (redukált kontroll), illetve 25 mM diamiddal (oxidált kontroll) inkubáltam 37°C-on 15 percig, ezután 5% végkoncentrációjú TCA-val kicsaptam. A redukált és oxidált kontrollminták kezelése innentől megegyezett a fent leírtakéval. Az AMS-jelölés után egyszeres térfogatú mintafelvivő puffert adtam a mintákhoz (összetételét lásd az immunoblot

leírásánál),

alapos

vortexelés

után

az

elegyeket

10

percig

szárazblokkfűtőben forralta, majd gyors hűtés után 13%-os nem-redukákó SDSpoliakrilamid gélen megfuttattam. Futtatás után a fehérjéket 4°C-on nitrocellulóz membránra transzferáltam. A membránok jelölése az „Immunoblot kísérletek” részben leírtaknak megfelelően történt.

3. 13.

Mikroszómális fehérjék karboniláltságának vizsgálata

A 3. 6. pontban leírtaknak megfelelően májmikroszómát izoláltam. A mikroszómafrakciók fehérjetartalmát BioRad Protein Assay-vel határoztam meg. A fehérjeoldalláncok karboniláltságának vizsgálatát OXYBLOT kittel végeztem. A kitet korábban munkacsoportunkban nem használtuk, így először kontrollkísérleteket végeztem. A mérendő minták, illetve a pozitív (oxidált) kontrollok előkészítése során az eredeti OXYBLOT protokolltól eltértem, mivel az túl erős jelintenzitáshoz vezetett. A meghatározás során az elektroforézist és transzfert követően a módosult (karbonilált) oldalláncokat először dinitrofenilhidrazinnal (DNPH) reagáltattam, majd DNPH-ra specifikus elsődleges antitesttel inkubáltam. Innentől a hagyományos immunoblot metodikával azonos módon történt a meghatározás.

44

3. 14.

RNS-izolálás és real-time PCR

Az eltávolított májakból TRIzol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) teljes RNS-t izoláltam a reagens használati utasításának megfelelően. A szennyezésként jelen lévő DNS-t “RNAfree” kit segítségével (Ambion, Austin, TX, USA) távolítottam el. A tisztított RNS koncentrációját és tisztaságát 260 illetve 280 nm-en végzett UVfotometriával határoztam meg. Az RNS esetleges degradációjának kimutatására pedig próbafuttatást végeztem 1,5%-os, etídium-bromidot is tartalmazó agarózgélen. Az Ambion “RETROscript” kitjének felhasználásával mintánként 1 μg RNS-ből cDNS-t szintetitáltam a használati utasításnak megfelelően. A minták felsokszorozására polimeráz láncreakciót (PCR) végeztem optical-capped PCR plétekben (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a Bio-Rad “iCycler” Real Time PCR gépével, “Sybr Green PCR Master Mix” (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) és minta-specifikus cDNS felhasználásával. A cDNS mérési pontonként 1,25 ng RNS-ből származott. A PCR-hez szükséges specifikus primereket (=oligókat) a “Beacon Designer 3” szoftverrel terveztük. A szoftvert a PREMIER Biosoft International (Palo Alto, CA, USA) készítette, és az Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) forgalmazza. A felhasznált oligók szekvenciái: egér 18S rRNS forward 5`-AAT GGC TCA TTA AAT CAG TTA TGG TTC-3`; 18S rRNS reverse 5`-TGT ATT AGC TCT AGA ATT ACC ACA GTT-3`; egér GADD153 forward 5`-ATG AAG GAG AAG GAG CAG GAG AA-3`; GADD153 reverse 5`-CTT GGT GCA GGC TGA CCA TG-3`; egér kaszpáz-12 forward 5`-TGG AGA CAG AGT TAA TGC AGT TTG-3`; kaszpáz-12 reverse 5`TGC TTC ACC CCA CAG ATT CC-3`; humán GADD153 forward 5`-TGA GGA GGA GCC AGA ACC AC-3`; humán GADD153 reverse 5`-GAA TGA CCA CTC TGT TTC CGT TT-3`; humán GRP78 forward 5`-GTG GAG ATC ATC GCC AAC GA-3`; humán GRP78 reverse 5`-GGA GGT GAG CTG GTT CTT GG-3`. Minden mérést triplán végeztem el, és a három párhuzamos Ct-értékeinek számtani átlagát vettem. A relatív mRNS-tartalmak számításához azt feltételeztem, hogy a real-time PCR minden ciklusában megduplázódott a fluoreszcens jelintenzitás. A vizsgált mRNS-ek mennyiségét a 18S rRNS szintjére normalizáltam. A PCR-termékek olvadáspontjának meghatározásával, továbbá a minták gélelektroforézisével bizonyítottam azok specificitását.

45

3. 15.

Apoptotikus sejtek számolása szövetmintában

Az eltávolított májakban lévő apoptotikus sejteket az ApopTag Peroxidase Kit (Chemicon, CA, USA) felhasználásával számoltuk, a használati utasításnak megfelelően. A kit a TUNEL reakción alapul; a minták deparaffinizációját követően a DNS-fragmentumokat

a

terminális

deoxinukleotid-transzferáz

enzim

(TdT)

digoxigeninnal jelölt nukleotidokkal kapcsolja. Az így jelölt DNS-darabok kötik a peroxidáz enzimmel konjugált anti-digoxigenin ellenanyagot. Az immunhisztokémiai detektálás során a konjugált enzim a hozzáadott kromogén anyagot átalakítja, így erős, jól lokalizált jel jön létre. A festődött sejtmagokat hagyományos, nagyfelbontású (600x) fénymikroszkóppal számoltuk. Mintánként 1000 sejtek vizsgáltunk meg, és ez alapján számoltuk az apoptotikus sejtindexet.

46

4.

EREDMÉNYEK

4. 1.

Az AAP-toxicitás mechanizmusa egérmájban

4. 1. 1. Az in vivo kísérleti modell kialakítása Az acetaminofen-mérgezés során létrejövő endoplazmás retikulum stressz tanulmányozásához először is szükséges volt a megfelelő állatmodell kialakítása. Tekintettel arra, hogy az in vivo acetaminofen-toxicitás irodalma jelentős részben egérkísérleteken alapul, ezt a fajt választottam; kísérleteimet 4-5 hetes (25-30 grammos) hím CD-1 egereken végeztem. A kísérleti felállás lényegi eleme volt, hogy az alklamazott AAP-dózisnál a májmetabolizmus során az UDP-glukuronil-transzferáz és a szulfotranszferáz általi konjugációs reakciók helyett az oxidatív átalakulás kapjon jelentős szerepet. Ezt egyfelől a megfelelően magas AAP-dózissal, másfelől a máj glikogénkészletének leapasztásával értem el. Ez utóbbi bizonyítottan csökkenti a biotranszformációs reakciók rendelkezésére álló UDP-glukuronsav mennyiségét, így az AAP metabolizmusa az oxidatív utak felé tolódik el (Bánhegyi és mtsai 1988). A májglikogén depletálását 24 órás éheztetéssel értem el, ezt követően kezeltem az állatokat. Az AAP-toxicitás molekuláris mechanizmusainak vizsgálatát a kezelés utáni első 3 órában nyert mintákból végeztük. Ennek egyik oka, hogy a későbbi időpontokban már kiterjedt a májsejtnekrózis; az elhaló sejtekből fokozatosan a környezetbe ürül tartalmuk, így megbízható kvantitatív fehérje- és RNS-meghatározások nem végezhetők. A másik ok, hogy az AAP-toxicitás során a mitokondriumok is károsodnak, és a mitokondriumokból induló - főként apoptotikus – jelpályák nehezíthetik az ERfüggő jelpályák nyomon követését. A mitokondriális jelpályák irodalmi adatok alapján 4-6 órával az AAP adása után indukálódnak, így az AAP-toxicitás korai történéseinek (0 - 3 óra) vizsgálatát tűztem ki célul. Az egereket 300 és 600 mg/ttkg közötti AAP-dózisokkal kezeltem, és a létrejövő májkárosodást szérum enzimaktivitások mérésével követtem nyomon (Gujral és mtsai 2002). A szérum aszpartát-aminotranszferáz (AST, másnéven SGOT), a szérum alaninaminotranszferáz (ALT, másnéven SGPT), és a szérum laktát-dehidrogenáz (LDH) aktivitását mértem a kezelés után 1, 2, 3, illetve 12 órával levett vérmintákból. Bár 47

eredményeinkből LD50-értéket nem számoltam – ez túlzottan nagyszámú állat felhasználását jelentette volna, – elvégzett kísérleteimből valószínűsíthető, hogy az AAP-dózis növelésével nem egyenesen változik a májkárosodás súlyossága. 350 mg/ttkg dózisig még a 12 órás kezelés után sem volt mindig szignifikáns különbség a kontroll és az AAP-kezelt csoport között. Az 500 mg/ttkg és magasabb dózisok alkalmazásakor pedig a 12 órás mérésig az állatok elfogadhatatlanul nagy hányada – közel fele - pusztult el. Megfigyeléseim tehát arra utaltak, hogy az intraperitoneálisan adott AAP csak egy szűk dózistartományban képes úgy májsejtelhalást kiváltani, hogy közben nem okozza 12 órán belül az állatok pusztulását. Ennek valószínű oka, hogy egy bizonyos dózisig a májsejtek konjugációs kapacitása elegendő, az oxidatív átalakulások ekkor minor szerepet játszanak. Ha a metabolizálandó AAP mennyisége túllépi a konjugációs kapacitást, akkor ugrásszerűen megnő az oxidatív reakcióutak jelentősége, és ez masszív sejtelhalást eredményez. E szerint az elképzelés szerint tehát az AAP oxidatív metabolizmusa feltétele az AAP-mérgezés során bekövetkező sejthalálnak. Az előbbiek alapján az állatkísérletekhez megfelelő AAP-dózist 450 mg/ttkg-nak találtam. A modell beállítására végzett kísérletsorozat végére kialakult, 24 órás éheztetést követő 450 mg/ttkg AAP adásával végzett kísérletek eredményeit a 4. 1. ábra szemlélteti. Az AAP hatására a szérum AST-, ALT- és LDH-aktivitások emelkedni kezdtek; 1 óránál még nem találtam szignifikáns eltérést a kontroll értékekhez képest, kezelés után 2 órával viszont az AST- ás ALT-értékek már szignifikánsan magasabbak voltak a kontrollértékeknél. Kezelés után 3 órával pedig már mindhárom mért szérumérték szignifikáns különbséget mutatott a kontrollértékekhez képest. A 2 és 3 órás időpontokban tehát már beindult a sejtelhalás.

48

4. 1. ábra AST, ALT és LDH szérumaktivitások AAP-kezelés után. AAP-vel (450 mg/ttkg) kezelt egereket az ábrán látható időpontokban leöltem, vérszérumból enzimaktivitásokat határoztam meg. (n≥4, *** p<0,00005)

4. 1. 2. Redox változások vizsgálata AAP kezelés után Ismert, hogy az AAP oxidatív stresszor hatású májsejtekben. Az AAP metabolizmusa az ER-hez kötött, így az általunk beállított kísérleti rendszeren megvizsgáltuk, hogy AAP-kezelés nyomán létrejön-e glutationdepléció, illetve redox stressz az ER-ben. 4. 1. 2. 1. A mikroszómális glutationszint csökkenése AAP hatására Ismert, hogy AAP hatására a sejt összglutationszintje csökken. Az ER mint önálló sejtkompartment elkülönült glutationkészlettel rendelkezik, és ennek változásáról az AAP-toxicitás irodalma nem írt. Kérdés volt, hogy AAP hatására változik-e a mikroszómális teljes glutationszint, illetve az ER lumen amúgy is alacsony redukált glutation-szintje. A citoszól [GSH]/[GSSG] arány 30:1 és 100:1 között található, míg az ER lumenben ez a hányados 1:1 és 3:1 között van. Ezért különösen fontos, hogy AAP hatására milyen változás történik. Saját korábbi eredményeink alapján tudjuk, hogy 49

rianodin-receptor-típusú Ca2+-csatornát (RyR1) nem tartalmazó sejtekből, (ide sorolandók a hepatociták) a luminális glutation lassan ürül, így a glutationtartalom a mikroszómapreparálás során nem változik szignifikánsan (Bánhegyi és mtsai 1999, Bánhegyi és mtsai 2003, Csala és mtsai 2003). Ez biztosítja, hogy a mikroszómális frakcióban mért glutationmennyiségek jól közelítik az ER lumenében még in vivo létező glutationkoncentrációkat, illetve –arányokat. 1 órával az AAP-kezelés után eltávolított májakból izolált mikroszómákban a teljes glutation mennyisége a kezeletlen állatokéhoz képest mintegy 70%-kal kevesebb (4. 2A. ábra). 3 órás kezelésnél nincs további szignifikáns csökkenés, a teljes glutation ennél az időpontnál is a kontroll érték 25-30%-a. A teljes glutation kifejezés alatt a molekula redukált formája (GSH), diszulfidhíd képződéssel kialakuló oxidált dimer formája (GSSG), és a fehérjékkel képzett vegyes diszulfidjai együttesen értendők. Az izolált mikroszómákból a teljes és a redukált glutation mennyiségét külön meghatároztam. Azt találtam, hogy a kezeletlen májakhoz képest az AAP-vel mérgezett májakban 1 óránál a redukált glutation szintje körülbelül a kezeletlen érték 10%-ára csökkent és ugyanezen a szinten maradt 3 órával a kezelés után is. A teljes glutationszint ugyanakkor a kontroll érték 20%-ára esett vissza; a redukált glutation tehát arányában jobban lecsökkent, mint a teljes glutation. Ha kiszámoljuk a redukált és teljes glutation arányát, akkor azt találjuk, hogy a kezeletlen kontrollban ez körülbelül 1:2, míg AAP-kezelés után 1 és 3 órával már csak 1:4. A glutation redoxrendszerben tehát szignifikáns eltolódás következik be az oxidált formák javára. Ez fokozottan valószínűsíti

a

luminális

redox-érzékeny

folyamatok

károsodását,

így

a

fehérjehajtogatódás károsodását. 4. 1. 2. 2. A mikroszómális glutationszint csökkenése BSO hatására Célul tűztem ki, hogy az AAP hatását összehasonlítsam egy tisztán glutationdepléciót okozó szer hatásával, annak érdekében, hogy a későbbiekben megvizsgáljam, képes-e a glutationdepléció önmagában ER stresszt kiváltani. A glutation depléciójához a de novo glutationszintézis gátlószerét, a butionin-szulfoximint (BSO) alkalmaztuk. A BSO a gamma-glutamilcisztein-szintetáz (γ-GCS) specifikus gátlószere. Az egereket az irodalomban elfogadott 7,2 mmol/ttkg dózisú BSO-val kezeltem. A szer hatásának kifejlődését 1 és 3 órával kezelés után vizsgáltam. 1 órás kezelésnél a 50

mikroszómális teljes glutationtartalom 45%-kal csökkent a kontroll értékhez képest (4. 2. ábra). A 3 órás kezelésnél mért érték a kontrollhoz képest 75%-kal volt alacsonyabb. A BSO így 3 óránál a szubletális dózisú AAP-vel közel azonos mértékű mikroszómális teljes glutation-depléciót váltott ki, tehát az AAP hatásával összemérhető. A glutationszintézis

blokkolása

az

első

3

órában

fokozatosan

csökkentette

a

glutationszintet, míg az AAP már az első órában eltüntette a mikroszómális glutation nagy részét, és további depléciót már nem váltott ki. Az AAP glutationdepléciót kiváltó hatásaival összevetve további lényeges különbség, hogy a BSO-val kezelt állatokban szignifikáns eltérést a redukált/teljes glutation hányadosban nem tapasztaltam (4. 2B. ábra).

51

4. 2. ábra Mikroszómális gluationtartalom változása BSO és AAP hatására BSO-val (7,2 mmol/ttkg), illetve AAP-vel (450 mg/ttkg) kezelt egerek májából készült mikroszómafrakció A: redukált és teljes (GSH + GSSG + glutation-fehérje vegyes diszulfid) glutationtartalma. B: a redukált és teljes glutationtartalom hányadosa (n≥4, *p<0,005, **p<0,0005, *** p<0,00005).

52

4. 1. 2. 3. A mikroszómális NADPH-szint csökkenése Megvizsgáltuk, hogy AAP-kezelés hatására változik-e az ER lumenben a CYP izoenzimek által koenzimként használt redukáló ekvivalens, a NADPH szintje. 1 órás kezelésnél még nem találtam szignifikáns különbséget a kontrollal összevetve, de 3 óránál már szignifikánsan csökkent a luminális NADPH-tartalom (4. 3. ábra). BSO-val kezelve sem 1, sem 3 óránál nem találtam változást a luminális NADPH-tartalomban.

4. 3. ábra Mikroszómális NADPH-tartalom BSO és AAP-kezelés után Kezeletlen, BSO-val (7,2 mmol/ttkg), illetve AAP-vel (450 mg/ttkg) kezelt egerek májából mikroszómát izoláltam, ezekben metirapon hozzáadása után fluorimetriásan mértem a NADPH eltűnését. A fluoreszcens jelintenzitás az eredetileg jelenlévő NADPH mennyiségével arányos (n≥4, *p<0,005).

4. 1. 2. 4. Az ER oxidoreduktázainak redox eltolódása Feltételeztem, hogy a glutation-puffer kimerülése, illetve redox eltolódása nem hagyja érintetlenül az ER CXXC-motívumot hordozó chaperonjai, így a PDI és ERp72 redox státuszát sem. Megvizsgáltam, mi történik az említett két fehérje ciszteinoldalláncainak tiolcsoportjával AAP-kezelés illetve BSO-kezelés nyomán. Az ERp72 esetében az AAP már 1 óránál is lényegi változást okozott, hiszen a fehérje redukált alakja(i) szinte teljesen eltűnt(ek) a gélből (4. 4. ábra). A többes szám arra utal, hogy a fehérje több alkilálható tiolcsoporttal bír, ugyanakkor az eltérő tiol-oxidáltsági fokú 53

formák nem mind válnak el egymástól láthatóan a gélelektroforézis során. A gélen két széles sáv figyelhető meg; egy felső, a redukált formáknak megfeleltethető, és egy alsó, ami az oxidált formákat mutatja. A 3 órás kezelésből származó mintáknál is csak az oxidált formáknak megfelelő sáv látható. Az AAP-vel ellentétben azonban a BSO sem 1, sem 3 órás kezelés esetén nem váltotta ki az ERp72 fehérje redox eltolódását. Elvégeztem a PDI redox státuszának vizsgálatát is, de az eredményeket itt nem mutatom. A PDI-nél az ERp72-hez hasonló eredményeket kaptam, de az AAP-kezelés nyomán létrejött oxidatív eltolódás kevésbé volt kifejezett. Ennek valószínű oka, hogy a PDI eleve oxidáltabb állapotban van jelen, mint az ERp72.

1

2

3

RED OXD

4

5

6

RED OXD

redukált forma oxidált forma

redukált forma oxidált forma

4. 4. ábra Az ERp72 fehérje redox státusza AAP- és BSO-kezelés után Kezeletlen, AAP-vel (450 mg/ttkg), illetve BSO-val (7,2 mmol/ttkg) kezelt egerek májából mikroszómát készítettem. A mikroszómális fehérjék AMS-jelölését követően a mintákat hagyományos immunoblot analízisnek vetettem alá. (1: kontroll, 2: AAP 1h, 3: AAP 3h, 4: kontroll, 5: BSO 1h, 6: BSO 3h, RED: redukált kontroll, OXD: oxidált kontroll) Az ER oxidoreduktázainak vizsgálata tehát megerősítette, hogy az AAP metabolizmusa során felborul az ER lumen redox homeosztázisa. Ugyanakkor az ER glutationkészletének depletálása önmagában nem tolja el az oxidoreduktázok redox állapotát az oxidáltabb formák irányába.

54

4. 1. 2. 5. Az ER-fehérjék karboniláltságának vizsgálata Az AAP-metabolizmus során felszabaduló ROS, továbbá a redox pufferek kimerülése növelik a fehérjék oxidatív károsodásának veszélyét. OXYBLOT kit segítségével azt vizsgáltam meg, fokozódik-e a mikroszómális fehérjék oldalláncainak karboniláltsága. A vizsgált májmikroszómákon azonban különbséget nem sikerült kimutatni, sem AAP-, sem BSO-kezelt egerekből származó mikroszómákon, egyik kezelési időtartamnál sem (az adatokat nem mutatom). 4. 1. 2. 6. Apoptózis vizsgálata Megvizsgáltam, hogy az AAP illetve a BSO által kiváltott ER redox stressz indukál-e apoptózist a májban. 3 órás kezelések után eltávolított májakban APOPTAG kit segítségével apoptotikus sejtszámlálást hajtottunk végre. A kontroll szövetekben 1,5 % körül volt az apoptotikus morfológiát mutató sejtek aránya. BSO-kezelés hatására ez az érték nem változott, ugyanakkor a toxikus AAP-dózis után szignifikánsan, mintegy 3,5 -szeresére nőtt az apoptotikus sejtek száma (4. 5. ábra).

55

4. 5. ábra Hepatocelluláris apoptózis BSO és AAP kezelés hatására Kezeletlen, BSO-val (7,2 mmol/ttkg), illetve AAP-vel (450 mg/ttkg) kezelt egerek májából metszeteket készítettünk, és APOPTAG kit felhasználásával megszámoltuk az apoptotikus morfológiájú sejteket. (n≥4, *p<0,005)

4. 1. 3. ER stresszmarkerek vizsgálata AAP-kezelés után Eddig tárgyalt kísérleteim bizonyították, hogy az AAP metabolizmusa felborítja az ER lumen redox homeosztázisát. A következőkben arra kerestem a választ, kimutathatók-e az ER stresszt jellemző stresszmarkerek. 4. 1. 3. 1. Az eIF2α foszforilációjának vizsgálata Az eIF2α reverzibilis foszforilációja az ER stressz egyik legkorábbi jele, ezért AAP-vel kezelt és kezeletlen májakon mértük e faktor foszforiláltságát. A foszforilált eIF2α-ra specifikus ellenanyag használatával 3 órás AAP-kezelés után erőteljes foszforilációt sikerült kimutatni, míg a kontroll mintákon egyáltalán nem tapasztaltam foszforilációt (4. 6. ábra). A jelölt membránt újrajelöltem az eIF2α foszforilált és foszforilálatlan formáit egyaránt felismerő ellenanyaggal és megállapítottam, hogy a fehérje összmennyiségében nincs különbség kezelt és kezeletlen minták között. Az a tény, hogy 3 órával az AAP adása után az eIF2α foszforilált állapota fenntartott, arra utal, hogy a jelpálya aktív, a stresszhelyzet még nem oldódott fel. 56

Ahogy láttuk, az eIF2α nem csupán a PERK szubsztrátja, így foszforilációja nem perdöntő bizonyítéka az ER stressznek. Ennek megfelelően az ismert ER stresszmarkerek közül továbbiak vizsgálatába kezdtem.

kontroll

AAP

40 kDa

P-eIF2α

40 kDa

eIF2α

4. 6. ábra Az eIF2α aktiválódása AAP-kezelésben Kezeletlen és AAP-vel (450 mg/ttkg) kezelt egerek májában az eIF2α transzlációs faktor aktivált formájának (P-eIF2α), illetve foszforilált + defoszforilált formáinak együttes (eIF2α) mennyiségét immunoblottal meghatároztam.

4. 1. 3. 2. Az ATF6 transzkripciós faktor aktivációjának vizsgálata ER stresszben az ATF6 a Golgi-membránba kerül, és specifikus proteázok hatására 90 kDa-os proformájából egy 50 kDa-os, nukleáris transzportra alkalmas rész hasad le. Immunoblot meghatározást végeztem annak eldöntésére, hogy AAPtoxicitásban bekövetkezik-e az ATF6 proteolítikus hasítása. Érdekes módon a kontrollmintákban is detektálható volt a hasított forma, de a 3 órás AAP-kezelt mintákban mennyisége jelentősen nőtt (4. 7. ábra).

57

kontroll

AAP

proforma hasított forma 4. 7. ábra ATF6 aktiválása AAP-toxicitásban Kezeletlen és AAP-vel (450 mg/ttkg) kezelt egerek májából az ATF6 transzkripciós faktor inaktív proformáját és proteolitikusan hasított formáit mutattam ki immunoblottal.

4. 1. 3. 3. A JNK protein-kináz foszforilációjának vizsgálata A JNK olyan stresszmarker, ami az IRE1 aktivációjának eredményeként aktiválódik. AAP-vel kezelt egerek májhomogenátumait vizsgáltam immunoblot módszerrel, a Thr-183-on és Tyr-185-ön foszforilált JNK ellen termelt ellenanyaggal (4. 8. ábra, felső panel). Kettős jelet találtam a membránokon, annak megfelelően, hogy az ellenanyag a foszforilált JNK1-et (46 kDa), és a foszforilált JNK2-t (54 kDa) egyaránt felismeri. A kontroll májmintákban az ellenanyag nem adott jelet. A membránt a fehérje foszforilált és foszforilálatlan formáit egyaránt felismerő ellenanyaggal is előhívtam (4. 8. ábra, alsó panel), bizonyítandó, hogy a fehérje összmennyisége nem változik meg a kezelés hatására.

kontroll

AAP 55 kDa

P-JNK2 P-JNK1

43 kDa 55 kDa 43 kDa

JNK2 JNK1 4. 8. ábra A JNK protein-kináz foszforilációjának vizsgálata

Kezeletlen és AAP-vel (450 mg/ttkg) kezelt egerek májából a JNK1/2 foszforilált (felső panel) és összmennyiségét (alsó panel) mutattam ki immunoblottal. 58

4. 1. 3. 4. Kaszpázok aktivációja az AAP-metabolizmus során Immunoblot jelölést végeztem egy olyan anti-kaszpáz-12 ellenanyaggal, ami a fehérje 55 kDa-os proformáját, a proteolízis során keletkező ún. intermedier fragmentumokat és a 15 kDa-os aktív kaszpáz-12-t egyaránt felismeri (4. 9. ábra). A kontroll mintákhoz képest az 1 órás és 3 órás kezelésekből származó mintákban fokozatosan nőtt a proforma mennyisége. A 40 kDa-os intermedier fragmentumból 1 óránál lényegesen több van, mint a kontrollban, ugyanakkor 3 óránál ismét a kontroll szintjére csökken vissza mennyisége. Az aktív formát az AAP-kezelt mintákon – 1 és 3 óránál egyaránt – sikerült kimutatni. A prokaszpáz-12 hasítása tehát stressz nélkül is végbemegy, viszont az AAPtoxicitás első órájában intenzívebb. Az aktiválásnál azonban mennyiségileg jelentősebbnek tűnt a proforma felszaporodása, így real time RT-PCR-al meghatároztam a májak kaszpáz-12 mRNS-tartalmát. Nem kaptam szignifikáns különbséget kontroll és kezelt májak között, ezért transzkripciós szintű változásokat nem feltételezhetünk a jelenség hátterében (4. 12. ábra). Miután a kaszpáz-12 aktív formája megjelent a májban, feltételeztem, hogy „downstream” avagy végrehajtó kaszpázok is aktiválódnak. Ennek megfelelően immunoblottal megvizsgáltam, aktiválódik-e a kaszpáz-3. A felhasznált ellenanyag csak a kaszpáz-3 intermedier hasított formáit mutatta AAP-kezelt májmintákban, valószínű tehát, hogy az aktiváció a kaszkád e pontján már csak részleges (4. 9. ábra). A kaszpáz-aktiváció Bevezetőben már említett extrinsic útját is ellenőriztem, amennyiben kaszpáz-8 elleni antitesttel is jelöltem a mintákat. Az immunoblot a kaszpáz-8 semmilyen aktivált/hasított formáját nem mutatta ki (az adatokat nem mutatom).

59

kontroll AAP 1h AAP 3h

prokaszpáz-12 intermedier fragmentumok

55 kDa

aktív kaszpáz-12

12 kDa

40 kDa

kontroll

AAP 1h

AAP 3h

prokaszpáz-3

40 kDa

intermedier fragmentum

33 kDa

4. 9. ábra Kaszpázok aktiválódása AAP-toxicitásban Kezeletlen és AAP-vel (450 mg/ttkg) kezelt egerek májából a kaszpáz-12 és -3 proformáját és hasított formáit mutattam ki immunoblottal.

4. 1. 3. 5. A GADD153/CHOP transzkripciós faktor vizsgálata Az ER stresszválasz lényeges eleme a GADD153/CHOP transzkripciós faktor indukciója. AAP- és BSO-kezelt mintákban, 1 és 3 órás kezeléseket követően végeztem immunoblot meghatározásokat GADD153/CHOP elleni antitesttel (4. 10. ábra). A kontroll májakban a fehérje kimutathatatlan volt, 1 órás AAP-kezelés után már látható jelet adott, míg 3 órás kezelésnél még nagyobb mennyiségben volt jelen. BSOkezeléssel nem sikerült indukciót kiváltani, sem 1, sem 3 órás kezelés után a jel nem látható. Megvizsgáltam, hogy az AAP-kezelés után a transzkripciós ráta fokozódása, vagy más tényező okozza a megnövekedett fehérjemennyiséget. Real time RT-PCR-t végezve kimutattam, hogy a GADD153/CHOP mRNS szintje már 1 órás kezelésnél is

60

szignifikáns különbséget mutat a kontrollhoz képest, és 3 órás kezelésnél már a kontroll közel húszszorosára emelkedett (4. 12. ábra).

kontroll

AAP 3h

GADD153

30 kDa

4. 10. ábra A GADD153 transzkripciós faktor indukciója AAP-toxicitásban Kezeletlen és AAP-vel (450 mg/ttkg) kezelt egerek májából a GADD153 fehérjét mutattam ki immunoblottal. 4. 1. 3. 6. Az ER chaperonok vizsgálata Az ER stresszválaszban indukálódhatnak az ER lumen chaperonjai. A legfontosabb

chaperonok

szintjét

immunoblottal

határoztam

meg

teljes

májhomogenátumokból az AAP-toxicitás első 3 órájában. Érdekes módon a GRP78, a GRP94, a PDI és az ERp72 fehérjeszintek nem változtak a vizsgált időpontokban a megfelelő kontrollokhoz képest (4. 11. ábra). Real time RT-PCR-ral a GRP78 mRNSszintjét is megvizsgáltam. Az első 3 óra során enyhe emelkedő tendenciát észleltem, de a vizsgálatra jellemző magas hibahatár miatt a kapott különbségek nem tekinthetők szignifikánsak (4. 12. ábra).

61

kontroll AAP 1h AAP 3h PDI

55 kDa

ERp72

72 kDa

GRP78

72 kDa

GRP94

100 kDa

4. 11. ábra ER chaperonok expressziója AAP-toxicitásban Kezeletlen és AAP-vel (450 mg/ttkg) kezelt egerek májából az ER túlélést segítő chaperonjait mutattam ki immunoblottal.

kontrollra vonatkoztatott érték

30 GADD153 GRP78 kaszpáz-12

20

10

0 kontroll AAP 1h

AAP 2h

AAP 3h

4. 12. ábra Az ER stresszválasz néhány komponensének mRNS-expressziós szintje AAP-toxicitásban Kezeletlen és AAP-vel (450 mg/ttkg) kezelt egerek májából a GADD153, a GRP78 és a kaszpáz-12 mRNS-szintjeit vizsgáltam real-time RT-PCR-ral. 62

4. 2.

Az AAP-toxicitás mechanizmusa hepatóma sejtvonalon

4. 2. 1. Az AAP-hatás vizsgálata humán májtumor eredetű sejtvonalakon AAP

hatására

megjelenő

endoplazmás

retikulum

stresszmarkereket

tanulmányoztam májtumor erdetű sejtvonalon. Elsőként két HepG2 eredetű hepatóma sejtvonalat vizsgáltam: az AAP-t oxidáló CYP2E1 enzimet expresszáló E47 vonalat, és kontrollként, a CYP2E1-et nem expresszáló C34 vonalat. A CYP2E1 jelenlétét, illetve hiányát az izoenzimet specifikusan felismerő ellenanyaggal, immunoblot kísérletekkel mutattam ki teljes sejthomogenátumokon (4. 13. ábra). C34 (és a HepG2) sejtekben nem sikerült detektálni a fehérjét, viszont az E47 vonalból készített mintákon erős jelet kaptam 55 kDa-nál.

4. 13. ábra CYP2E1 expressziója humán májeredetű sejtvonalakban A CYP2E1 jelenlétét immunoblottal mutattam ki humán májtumor sejtekben. Kontrollstresszorként thapsigargint használtam, ami az ER membrán Ca2+ATPázának specifikus gátlószere, sejteken mikromólos koncentrációban alkalmazott, az irodalomban általánosan elfogadott ER stresszor. ER stresszmarkerként pedig a GRP78at, és a GADD153-at választottam. 4, 12 és 24 órás kezeléseket végeztem, majd immunoblot és real-time RT-PCR vizsgálatokat végeztem. A GRP78 mRNS-szintje 4 óránál már szignifikáns különbséget adott a kontrollhoz képest, míg 12 és 24 óránál tovább emelkedett (4. 14. ábra). A GRP78 fehérje mennyiségében 24 óránál találtam emelkedést. A GADD153 mRNS-szintje már 4 órás kezelés hatására is a kontroll hatszorosára emelkedett, és ezen a szinten maradt 24 óráig (4. 15. ábra). A GADD153 fehérje késéssel követte a mRNS-szint változását, először a 12 órás kezelésből származó mintákból sikerült a fehérjét kimutatni. Az immunoblot 24 órás kezelésnél már jelentős 63

expressziónövekedést mutatott. Eredményeim tehát arra utaltak, hogy a C34 és az E47 sejtvonalak alkalmasak ER stresszmarkerek tanulmányozására. Ezután a C34 és E47 sejteket 10 mM AAP-vel kezeltem, 4, 12, illetve 24 óráig, majd ugyanazokat a vizsgálatokat végeztem el, mint a thapsigargin-kezeléseket követően. Egyik időpontban sem kaptam a kontrolloktól eltérő értékeket, sem a GADD153, sem a GRP78 mennyiségében, sem RT-PCR, sem pedig immunoblot meghatározásokkal (4. 14. és 4. 15. ábra).

B kontroll

thapsigargin 4h

12h

AAP 24h

4h

12h

24h

72 kDa

4. 14. ábra GRP78 expressziója thapsigargin és AAP-kezelés után E47 humán májtumor sejteket kezeltem thapsigarginnal (1 μM), illetve AAP-vel (10 mM). A sejtlizátumokból a GRP78 expresszióját mutattam ki RT-PCR-al (A) és immunoblot technikával (B). Irodalmi adatok figyelembevételével a sejtek stresszelését glutation-deplécióval kiegészítve is elvégeztem. A glutation depletálását az állatkísérleteknél is felhasznált 64

butionin-szulfoximinnel értem el. 1 mM BSO és 10 mM AAP együttes adásával sem tudtam azonban ER stresszmarkereket kimutatni a sejtekből, egyik vizsgált időpontban sem.

B kontroll

thapsigargin 4h

12h

AAP 24h

4h

12h

24h 30 kDa

4. 15. ábra GADD153 expressziója thapsigargin- és AAP-kezelés után E47 humán májtumor sejteket kezeltem thapsigarginnal (1 μM), illetve AAP-vel (10 mM). A sejtlizátumokból a GADD153 expresszióját mutattam ki RT-PCR-al (A) és immunoblot technikával (B).

4. 2. 2. Az AAP-hatás vizsgálata egér májtumor eredetű sejtvonalon Hepa1c1c7 jelű egér májeredetű sejtvonalon tanulmányoztam az AAP esetleges stresszor hatását. A sejtvonal stresszválaszra való képességét kétféle stressztípussal bizonyítottam; hipoxia- és thapsigargin-kezeléssel. A hipoxia-jelpálya aktiválásához a sejteket 3 óráig hipoxiakamrában tartottam, illetve kémiai hipoxiát idéztem elő CoCl2 65

vagy

desferrioxamin

alkalmazásával.

A

HIF-1α

szintjének

immunoblot

meghatározásával bizonyítottam, hogy mind a valódi hipoxia, mind a kémiai ágensek HIF-1α-indukciót eredményeznek a Hepa1c1c7 sejteken. (4. 16. ábra). A hipoxiareszponzivitás lehetővé tette a sejtvonal felhasználását xenograft-tumor növekedését vizsgáló kíséletsorozatunkban.

4. 16. ábra HIF-1α expressziója kémiai és valódi hipoxiát követően Hepa1c1c7 egér májtumor sejteket kezeltem desferrioxaminnal (DFO; 250 μM), CoCl2-dal (150 μM), illetve hipoxiakamrában 4 óráig. A sejtlizátumokból a HIF-1α expresszióját mutattam ki immunoblot technikával. A thapsigarginos kontrollkísérletek pozitív eredményt hoztak; 3 óránál a GADD153 már jelentősen indukálódott, és a prokaszpáz-12 mennyisége egyértelműen csökkent (4. 17. ábra). A GRP78 indukcióját csak 24 órás thapsigargin-kezeléssel tudtam kiváltani, ez a kezeléshossz megfelel a sejtes kísérletekben általában alkalmazott thapsigargin-kezelés hosszával (Rao és mtsai 2002, ábrát nem mutatom). Immunoblottal megvizsgáltam a GADD153 és a GRP78 fehérjék relatív mennyiségét AAP-kezelés után. AAP hatására már 1 óránál már detektálható volt a GADD153; 3 óránál már erősebb expressziót tapasztaltam, míg 12 óránál további expressziónövekedést figyeltem meg (4. 17. ábra). A kezelés első 3 órájában ugyanakkor a prokaszpáz-12 szintjében nem találtam különbséget a kontrollhoz képest, csak a 12 órás kezelésnél csökkent a prokaszpáz-12 szintje. Sajnos a használt ellenanyag nem jelölte a kaszpáz-12 hasított formáit, így csupán a proforma eltűnéséből következtethettem aktivációjára. Kísérleteimet kiegészítettem a BSO felhasználásával is. A vizsgált időpontokban (1, 3, 12 óra) a BSO önmagában nem okozott eltérést a kontroll mintáktól, és AAP-vel együtt adva sem erősítette az AAP hatását.

66

ko ntr o BS ll O 1 AA h P 1h BS O+ AA AA P 1h P 3h BS O+ AA BS P 3h O 1 AA 2h P 1 BS 2h O+ AA Th P 12 ap h sig arg Th in ap 3 sig arg h in 12 h

30 kDa

GADD153

55 kDa

prokaszpáz-12 4. 17. ábra GADD153 és kaszpáz-12 expressziója AAP-kezelés után

Hepa1c1c7 egér májtumor sejteket kezeltem BSO-val (1 mM), AAP-vel (10 mM), illetve thapsigarginnal (1 μM). A sejtlizátumokból a GADD153 és a kaszpáz-12 expresszióját mutattam ki immunoblot technikával. Megvizsgáltam, indukálódnak-e a luminális chaperonok, és - hasonlóan az állatkísérletek eredményéhez – itt sem találtam változást a GRP78, a GRP94, a PDI és az ERp72 szintjében a kezelés első 12 órájában (4. 18. ábra).

4. 18. ábra ER chaperonok expressziója AAP-kezelés után Hepa1c1c7

egér

májtumor

sejteket

kezeltem

AAP-vel

(10

mM).

A

sejtlizátumokból a PDI, az ERp72, a GRP78 és a GRP94 expresszióját mutattam ki immunoblot technikával. 67

A vizsgált sejtvonalban alacsony szinten expresszálódnak a biotranszformációs enzimek, az AAP metabolizmusa így vélhetően sokkal kevésbé intenzív, mint a máj parenchima sejtjeiben. Ennek fényében kísérletet végeztem annak eldöntésére, hogy az AAP-kezelés

után

kialakul-e

egyáltalán

glutationdepléció

a

Hepa-sejtekben.

Kontrollnak itt is a glutationszintézist gátló BSO-t használtam; a glutationdepléció biztos kiváltásához az 1 illetve 3 órás kezelések mellett 24 órás BSO-kezelést is végeztem. Az 1 és 3 órás kezelések közül egyik sem változtatta meg szignifikánsan a glutationszinteket (4. 19. ábra).

glutation (pmol/μg fehérje)

140

teljes glutation redukált glutation

120 100 80 60 40 20 ko nt ro ll B SO 1h B SO 3h B SO 24 h A A P 1h A A P 3h

0

4. 19. ábra Glutationszintek alakulása Hepa1c1c7 sejtvonalban Hepa1c1c7 sejteket BSO-val (1 mM), illetve AAP-vel (10 mM) kezeltem, majd a sejtlizátumokból teljes és redukált glutationtartalmat határoztam meg HPLC-vel.

68

5.

DISZKUSSZIÓ

Vizsgálataim abból a munkahipotézisből indultak ki, hogy az AAP nagy dózisban okozott májkárosító hatásában az ER szerepet játszik. Az elmúlt évtizedben számos olyan új megfigyelést közöltek, amelyek átértékelték az ER funkcióját a külső és belső környezethez történő alkalmazkodásban. Az ER-ből induló jelátvitel, illetve az ER-ben lejátszódó folyamatok változásához köthető apoptózis megismerésével az ER-nek a sejtes homeosztázisban betöltött szerepéről kialakult kép is jelentősen módosul. Számos betegség patomechanizmusában vetődött fel az ER-ből kiinduló jelátvitel részvétele. A disszertációban közölt kísérletek alapján bizonyítottam az ER részvételét az AAPtúladagolás okozta akut májkárosodásban. Az AAP májkárosító hatást csak a terápiás dózist jelentősen meghaladó mennyiségben adva okoz. A továbbiakban AAP hatás alatt mindig AAP túladagolást értek, mivel a disszertációban közölt in vivo kísérleteinket kizárólag nagydózisú AAP-vel folytattam. (Dózis beállításával kapcsolatos ábrákat az értekezésem nem tartalmaz.) Értekezésemet megalapozó kísérleteimben a hepatocita endoplazmás retikulum AAP-toxicitásban betöltött szerepét vizsgáltam in vivo és in vitro körülmények között. Az AAP májban redox stresszt okoz, és ennek részeként az egyik legfontosabb vízoldékony intracelluláris antioxidáns, a glutation deplécióját hozza létre. Ismeretes, hogy a glutation az ER redox-homeosztázisában meghatározó komponens. Kimutattam, hogy az intracelluláris glutationkészleten belül a mikroszómális teljes glutation, és ezen belül a redukált glutation jelentősen depletálódnak (4. 2. ábra, A). Ezen túlmenően a redukált/teljes glutation-arány jelentős csökkenését észleltem; a hányados az AAP kezelés nyomán a felére esik vissza (4. 2. ábra, B). A redukált forma arányának csökkenése a teljes glutation állományon belül, minden bizonnyal azért jön létre, mert a GSH a rendkívül gyors depléció miatt (Arnaiz és mtsai 1995) nem tud kellő sebességgel pótlódni. A későbbiekben tovább vizsgáltam a glutationdepléció szerepét az AAP májkárosító hatásában úgy, hogy az AAP hatását ismert glutationdepletáló szerrel (BSO) hasonlítottam össze. Kísérleteimben a BSO in vivo az AAP-hoz hasonló mértékű glutationdepléciót okoz, de nem változtatja meg a redukált/teljes glutation-arányt (4. 2.

69

ábra). Feltételeztem, hogy a GSH-depléció nem önmagában, hanem az arányváltozással együtt felelős az AAP májkárosító hatásának kialakulásáért. AAP-kezelés nyomán a glutationdeplécióval párhuzamosan, de a glutationénál kisebb mértékben csökken a másik fontos luminális redukáló ekvivalens, a NADPH mennyisége is (4. 3. ábra). Munkacsoportunk részletesen foglalkozott az ER-lumen redox-homeosztázisát fenntartó kismolekulasúlyú molekulák – glutation, aszkorbát, NADPH - kapcsolataival, de erre az értekezésem nem tér ki (Czegle és mtsai). Az AAP miatt létrejövő oxidatív stressz nyomán az ER lumen legjelentősebb oxidoreduktázainak szabad tiolcsoportjai eltűnnek, ezek a fehérjék az oxidáltabb állapot felé tolódnak el. Ezt a glutationdeplécióval összefüggő jelenséget az ERp72 esetében vizsgáltam és bizonyítottam. AAP hatására az ERp72 az oxidáltabb állapot felé tolódott el (4. 4. ábra), ugyanezt a redox eltolódást azonban nem kaptuk meg BSO kezelés hatására. Mindezek a megfigyelések azt bizonyítják, hogy AAP-toxicitásban az ER-lumen, mint metabolikus kompartment (Bánhegyi és mtsai 2007, Csala és mtsai 2006) redox homeosztázisa megváltozik, de ez a változás nem magyarázható önmagában a glutation deplécióval. A fehérjehajtogatás (folding) érzékenyen reagál a redox homeosztázis változásaira. Feltételeztem, hogy az AAP által kiváltott oxidatív májkárosodásban az UPR egyes elemei aktiválódnak. Az UPR három ismert jelpályáját vizsgáltam meg közvetlenül,

illetve

közvetve.

AAP

kezelés

hatására

kimutattam

az

eIF2α

foszforilációját (4. 6. ábra). A PERK aktivitásának célpontja, az eIF2α transzlációs faktor. Az ATF6 aktivációját szintén sikerült bizonyítani az ATF6 nukleáris transzportra képes, aktivált formájának detektálásával (4. 7. ábra). Az IRE1 aktivációja nyomán többek között a JNK aktiválódik. Kimutattam, hogy AAP kezelés hatására a JNK foszforilált formái jelennek meg (4. 8. ábra). Összefoglalva, mind a három UPR jelpálya aktiválódik az AAP-vel okozott oxidatív stressz miatt kiváltott májkárosításban, amely így ER stressz bizonyítékaként is értékelhető. Az AAP ER-stresszor hatására utaló további esemény, hogy indukálódott a proapoptotikus transzkripciós faktor GADD153, amely szintén ER függő UPR jelátvitelhez kötött folyamat következménye.

70

A kaszpáz-12 aktiválása ER stresszhez kötött folyamat. Kimutattam, hogy a prokaszpáz-12 AAP hatására aktiválódik (4. 9. ábra). A hasított intermedier formák a kezeletlen májban is kimutathatóak, de az aktív forma csak AAP-kezelés nyomán jelenik meg. A proforma fokozott hasítása ugyanakkor átmeneti jelenségnek tűnik, mivel 3 órával az AAP-kezelést követően májban a hasított intermedier formák mennyisége a kontrollszintre esik vissza. Ebben az időpontban már a proforma felhalmozódása a domináns jelenség. Mindez egyfelől arra enged következtetni, hogy a proforma (részleges) hasítása stressz nélkül is bekövetkezik, azaz létezik kaszpáz-12 alapaktivitás. Ez nem volna meglepő, hiszen egyes iniciátor kaszpázokról bizonyították, hogy autolízissel képesek önmagukat aktiválni (Shi, 2004). Másfelől, a proforma felszaporodása úgy jön létre, hogy közben a kaszpáz-12 mRNS mennyisége nem nő, ami az alapaktivitás blokkolására utal. A kaszpáz-12 által indított kaszpáz-kaszkád végrehajtó molekulájának, a kaszpáz-3-nak aktivációját nem sikerült kimutatnom (4. 9. ábra). Ez összhangban van más in vivo nyert irodalmi adatokkal, amennyiben Gujral és mtsai leírják, hogy nem tapasztalták a kaszpáz-3 fokozott aktivitását az AAP hatására kialakult ER stresszben vesében, Lawson és mtsai pedig arról számolnak be, hogy a kaszpáz-3 gátlószereivel nem lehetett az AAP-kezelés következményeit enyhíteni. Az AAP hatására létrejövő fokozott prokaszpáz-12-aktiválás további bizonyítéka az ER stresszválasz kialakulásának. A kaszpáz-kaszkád ugyanakkor idő előtt terminálódik, így (önmagában) aligha okozza az apoptózist. A kaszpáz-12 aktivációja tehát nélkülözhető elemnek tűnik az AAP által okozott májsejtpusztulásban. Ez a megfigyelésem is egybevág korábbi in vivo vizsgálatokkal, ahol különböző ER stresszorokkal kiváltott apoptotikus folyamatokról bizonyították, hogy a kaszpáz-12 részvétele nélkül is végbemennek (Obeng és mtsai 2005). Felvetődik a kérdés, hogy miért csupán átmeneti jelenség a kaszpáz-12 aktivációja, és miért szakad meg a kaszpáz-kaszkád aktivációs sora? Néhány kaszpázról (kaszpáz-3 és -8) bizonyították, hogy aktiválhatóságuk függ a glutation státusztól. Egyes szerzők itt a glutation közvetlen szerepét valószínűsítik, a glutation depléciót és a redukált/teljes glutation arány csökkenését teszik felelőssé a kaszpázok inaktiválhatóságáért (Musallam és mtsai 2002). Más eredmények szerint a glutation depléció önmagában nem zárja ki, hogy a kaszpázok aktiválhatók legyenek, de a redox puffer kimerülése lehetővé teszi, hogy reaktív gyökök vagy egyéb (pl. alkiláló) ágensek módosítsák a kaszpázok tiolcsoportjait

71

(Hristova és mtsai 2007, Kappler és mtsai 2007). Saját állatmodellünkben a kaszpáz-12 gyenge aktiválása és a kaszpáz-3-aktiváció elmaradása minden bizonnyal a durva glutationdepléció, illetve a redox egyensúly felborulásának a következménye. Mindezt jól kiegészíti, hogy sejtes kísérleti rendszerünkben a prokaszpáz-12 eltűnése 12 és 24 óránál is megfigyelhető volt, és a sejtekben nem tapasztaltam glutationdepléciót. Mindez összefügg az AAP-indukálta májsejtpusztulás mechanizmusáról szóló vitával. Az elmúlt években egymásnak ellentmondó cikkek foglalkoztak a mechanizmussal; a korábbi, nekrózist hangsúlyozó eredményekkel szemben néhány szerző az apoptózis mellett tette le voksát. A kérdés tisztázására Gujral és mtsai végeztek kísérleteket, és egyértelműen bizonyították, hogy az apoptotikus morfológiájú sejtek alig 1%-át adják az AAP-toxicitás során elhaló sejteknek (Gujral és mtsai, 2002). Saját morfológiai vizsgálatunk az apoptotikus sejtek számának négyszeres emelkedését mutatta AAP-kezelés után 3 órával (4. 5. ábra). Tekintve, hogy az alkalmazott AAPdózis 12 órán belül a kezelt állatok mintegy negyedének pusztulását okozta, továbbá a nekrózisra utaló AST/ALT/LDH-szérumszintek több százszoros szintre emelkedtek 12 óra után, feltételezésünk szerint az apoptotikus index négyszeres emelkedése csupán alárendelt szerepet játszhat a májsejtpusztulásban. Valószínű, hogy a máj parenchima sejtjeiben apoptotikus jelpályák indulnak be, de az apoptózis program nem fut végig, másodlagos

nekrózissá

fajul.

Ebben

minden

bizonnyal

szerepe

van

a

glutationdepléciónak: működő kaszpáz-kaszkád nélkül nincs apoptózis. A de novo glutationszintézis BSO-val történő gátlása, mely az AAP-kezeléssel összevethető mértékű teljes glutationdepléciót okozott, nem tolta el a redukált/teljes glutation-arányt (4. 2. ábra), nem okozott GADD153-indukciót, sem fokozott apoptózist (4. 5. ábra). Tehát az in vivo AAP-kezelés következtében kialakuló ER stresszjelenségek az AAP hatásra kialakuló glutationdeplécióval önmagában nem magyarázhatók. A hatásban az oxidatív változás a döntő. Eredményeim összhangban vannak más munkacsoportok állításaival. Chen és mtsai írják le izolált hepatocitákon, hogy a glutationdepléció csupán érzékenyítette a sejteket az NO-donorral való kezelésre, oxidatív stressz és fokozott sejtelhalás csak a két kezelés kombinálásával volt kiváltható (Chen és mtsai 2005). Sejtkultúrákon vizsgálva az AAP hatását, azt tapasztaltam, hogy az ER stresszválasz egyes jelenségei kialakulnak, ugyanakkor nincs glutationdepléció. Ez

72

érthető, amennyiben in vivo a glutationdepléció és az oxidatív stressz az AAP citokróm P450-függő, gyors metabolizmusa révén jönnek létre. Sejtkultúrákon ezen izoenzimek expressziója jóval szerényebb, mint in vivo, így gyors metabolizmusról sejtkultúrán nem beszélhetünk. Az AAP hatása sejteken tehát nem köthető glutationdeplécióhoz. Az irodalmi és saját eredményeink összevetése arra enged következtetni, hogy az acetaminofen-toxicitás mechanizmusa in vivo és in vitro egymástól eltér. Állatok szubletális dózisú AAP-kezelése után májban glutationdepléció és kiterjedt nekrózis figyelhető meg, a kaszpázaktiváció részleges, esetleg elmarad. Máj-, illetve vesesejtek AAP-stresszelésénél ugyanakkor nem törvényszerű a glutationdepléció, viszont a kaszpázaktiváció jelen van, és ezek következtében a sejtek apoptotizálnak (Gujral és mtsai 2002, Boulares és mtsai 2002, Kass és mtsai 2003, Lorz és mtsai 2004). Az in vivo és in vitro mechanizmusban közös az ER stresszválasz kialakulása. Az ER stresszválasz egyik alapjelenségének tekintik az ER chaperonok indukcióját. A legfontosabb luminális chaperonok indukciója azonban sem a sejtes, sem állatkísérletek során nem következett be (4. 11. ábra). Ezek a chaperonok a stresszhez való alkalmazkodást, illetve a túlélést szolgálják. Hogyan magyarázhatjuk akkor a „pro-survival” történések hiányát kísérleteinkben? Az állatkísérleteknél csak a harmadik órában tapasztalható erős ATF6-aktiváció, márpedig az ATF6 proteolízise és nukleáris transzlokációja előfeltétele a chaperonindukciónak. Elképzelhető, hogy hosszabb ideig tartó kezelésnél emelkedett GRP78 fehérjeszintet találtunk volna, hiszen 3 órás kezelésnél már enyhén – de nem szignifikánsan – emelkedett a GRP78 mRNSének mennyisége. A 3 órás kezelés utáni vizsgálatot azonban azért választottuk, hogy elkerüljük a nekrotikus jelenségek torzító következményeit. További magyarázatul szolgálhat, hogy a GRP78 mRNS és fehérje féléletideje jóval hosszabb, mint például a GADD153-é (Rutkowski és mtsai 2006). Tankönyvi tény, hogy egy molekula féléletideje alapvetően meghatározza, hogy mennyisége milyen gyorsan követi szintézisének pozitív vagy negatív irányú változását (Alberts és mtsai 1994). Lényeges az is, hogy a GRP78 túl korai indukciója a proximális stressz-szenzorok (IRE1, PERK, ATF6) inaktiválását okozhatja, így a stresszválasz fenntartása szempontjából kifejezetten hátrányos. Mindez segít annak megértésében, hogy egérmájban miért maradt el a chaperon-indukció az ER stressz korai fázisában, ugyanakkor nem

73

magyarázza, miként lehet sejtekben GADD153-indukció chaperon-indukció nélkül 12 órán keresztül. Ennek tisztázása csak további kísérletekkel lehetséges.

74

6.

ÖSSZEFOGLALÁS

Kísérleteimben a hepatocita ER szerepét kívántam tisztázni az acetaminofen (AAP) által kiváltott stresszben. Szubletális AAP-dózist követően megváltozott az ER lumen redoxstátusza. Megállapítottam, hogy a legfontosabb luminális oxidoreduktázok, a PDI és az ERp72 tiolcsoportjai oxidálódtak. Elsőként írtam le, hogy a mikroszómális glutationszint töredékére csökken, és a mikroszómális redukált/teljes glutation arány is szignifikánsan alacsonyabb, mint kontroll májakban. Az ER stresszválasz számos komponensének aktivációját találtam. Kimutattam az ATF6 transzkripciós faktor proteolízisét, az eIF2α, és a JNK foszforilációját. Az ER stresszválasz lényeges downstream

elemeként

funkcináló

GADD153/CHOP

transzkripciós

faktor

transzkripciós szintű aktiválását és fokozott expresszióját bizonyítottam. Leírtam az ERrezidens prokaszpáz-12 átmeneti aktivációját, majd a proforma felhalmozódását. További kaszpázok vizsgálatából arra következtetek, hogy nem fut végig a kaszpázkaszkád, amit a glutationdeplécióval hozhatunk összefüggésbe. A butionin-szulfoximinkezelést nem követte GADD153-indukció, sem fokozott apoptózis, azaz a hepatocelluláris glutationdepléció önmagában nem elégséges az ER stresszválaszhoz. Egérmájtumor eredetű sejteken AAP hatására glutationdepléció nélkül voltak megfigyelhetők az ER stresszválasz egyes elemei. Eredményeim bizonyítják, hogy az AAP által kiváltott hepatocelluláris károsodásban érintett az endoplazmás retikulum. A luminális redox homeosztázis felborulása, az UPR számos elemének megjelenése, összességében proapoptotikus történések jellemzik az ER aktív stresszválaszát.

75

SUMMARY My study focused on the possible role of the hepatic endoplasmic reticulum in acetaminophen-induced liver damage. Sublethal dose of AAP caused an altered redox status of the ER. I observed that active thiols of the most prominent luminal oxidoreductases, protein disulfide isomerase and ERp72, became oxidized upon AAP insult. As a novelty, I measured microsomal glutathione levels instead of measuring whole cellular glutathione in AAP-toxicity, and observed a significant decrease in both total microsomal glutathione and reduced-to-total ratio. Several components of ER stress response were activated. Proteolytical activation of ATF6, phosphorylation of eIF2α and JNK were detected. Transcriptional activation and elevated expression of GADD153/CHOP, an ER stress-responsive proapoptotic transcription factor, was observed upon AAP addition. Transient activation of the ER-resident caspase-12 was shown followed by an elevation in procaspase-12 level. Caspase-3 and caspase-8 activation could not be detected. AAP treatment resulted in an increased apoptosis of hepatocytes. Buthionine-sulfoximine treatment was unable to mimic the effects by AAP indicating that glutathione depletion alone is insufficient to provoke apoptosis. These results show that intraluminal redox imbalance of the ER and consequential activation of signaling processes and proapoptotic events are involved in hepatocellular damage caused by AAP overdose. Several components of ER stress response were observed on mouse hepatoma cells upon AAP, without decrease of cellular glutathione. My results give clear evidence for the involvement of the ER in AAP-induced hepatocellular damage. Luminal redox imbalance, activation of certain UPR components, proapoptotic signaling are the most prominent features of an active ER involvement.

76

7.

IRODALOMJEGYZÉK

Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD. (1994) Molecular Biology of the Cell (Third edition). Garland Publishing, New York, 727-728. Anfinsen CB, Haber E, Sela M, White FH Jr. (1961) The kinetics of formation of native ribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain. Proc Natl Acad Sci USA, 47: 1309-1314. Arnaiz SL, Llesuy S, Cutrín JC, Boveris A. (1995) Oxidative stress by acute acetaminophen administration in mouse liver. Free Rad Biol Med, 19: 303-310. Bajt ML, Knight TR, Farhood A, Jaeschke H. (2003) Scavenging peroxynitrite with glutathione promotes regeneration and enhances survival during acetaminophen-induced liver injury in mice. J Pharmacol Exp Ther, 307: 6773. Bánhegyi G, Garzó T, Antoni F, Mandl J. (1988) Glycogenolysis - and not gluconeogenesis - is the source of UDP-glucuronic acid for glucuronidation. Biochim Biophys Acta, 967: 429-435. Bánhegyi G, Lusini L, Puskás F, Rossi R, Fulceri R, Braun L, Mile V, di Simplicio P, Mandl J, Benedetti A. (1999) Preferential transport of glutathione versus glutathione disulfide in rat liver microsomal vesicles. J Biol Chem, 274:12213-12216. Bánhegyi G, Benedetti A, Csala M, Mandl J. (2007) Stress on redox. FEBS Lett, 581: 3634-3640. Bartlett JD, Luethy JD, Carlson SG, Sollott SJ, Holbrook NJ. (1992) Calcium ionophore A23187 induces expression of the growth arrest and DNA damage inducible CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP)-related gene, GADD153. Ca2+ increases transcriptional activity and mRNA stability. J Biol Chem, 267: 20465-20470. Bass R, Ruddock LW, Klappa P, Freedman RB. (2004) A major fraction of endoplasmic reticulum-located glutathione is present as mixed disulfides with protein. J Biol Chem, 279: 5257-5262.

77

Bertolotti A, Zhang Y, Hendershot LM, Harding HP, Ron D. (2000) Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfolded-protein response. Nat Cell Biol, 2: 326-332. Boulares AH, Zoltoski AJ, Stoica BA, Cuvillier O, Smulson ME. (2002) Acetaminophen induces a caspase-dependent and Bcl-XL sensitive apoptosis in human hepatoma cells and lymphocytes. Pharm Toxicol, 90: 38-50. Braun L, Kardon T, Puskás F, Csala M, Bánhegyi G, Mandl J. (1997) Regulation of glucuronidation by glutathione redox state through the alteration of UDPglucose supply originating from glycogen metabolism. Arch Biochem Biophys, 348: 169-173. Brewer JW, Cleveland JL, Hendershot LM. (1997) A pathway distinct from the mammalian unfolded protein response regulates expression of endoplasmic reticulum chaperones in non-stressed cells. EMBO J, 16: 7207-7216. Burcham PC, Harman AW. (1991) Acetaminophen toxicity results in site-specific mitochondrial damage in isolated mouse hepatocytes. J Biol Chem, 266: 50495054. Carlson SG, Fawcett TW, Bartlett JD, Bernier M, Holbrook NJ. (1993) Regulation of the C/EBP-related gene GADD153 by glucose deprivation. Mol Cell Biol, 13: 4736-4744. Chakravarthi S, Bulleid NJ. (2004) Glutathione is required to regulate the formation of native disulfide bonds within proteins entering the secretory pathway. J Biol Chem, 279: 39872-39879. Chen Q, Yu K, Holbrook NJ, Stevens JL. (1992) Activation of the growth arrest and DNA damage-inducible gene GADD153 by nephrotoxic cysteine conjugates and dithiothreitol. J Biol Chem, 267: 8207-8212. Chen T, Pearce TT, Peterson J, Stoyanovsky D, Billiar TR. (2005) Glutathione depletion renders rat hepatocytes sensitive to nitric oxide donor-mediated toxicity. Hepatology, 42: 598-607. Chevalier M, Rhee H, Elguindi EC, Blond SY. (2000) Interaction of murine BiP/GRP78 with the DnaJ homologue MTJ1. J Biol Chem, 275: 19620-19627.

78

Coen M, Lenz EM, Nicholson JK, Wilson ID, Pognan F, Lindon JC. (2003) An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem Res Toxicol, 16: 295-303. Cohen SD, Khairallah EA. (1997) Selective protein arylation and acetaminopheninduced hepatotoxicity. Drug Metab Rev, 29: 59-77. Cover C, Fickert P, Knight TR, Fuchsbichler A, Farhood A, Trauner M, Jaeschke H. (2005) Pathophysiological role of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) activation during acetaminophen-induced liver cell necrosis in mice. Toxicol Sci, 84: 201-208. Credle JJ, Finer-Moore JS, Papa FR, Stroud RM, Walter P. (2005) On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic reticulum. Proc Natl Acad Sci USA, 102: 18773-18784. Csala M, Fulceri R, Mandl J, Benedetti A, Bánhegyi G. (2003) Glutathione transport in the endo/sarcoplasmic reticulum. Biofactors 17:27-35. Csala M, Bánhegyi G, Benedetti A. (2006) Endoplasmic reticulum: a metabolic compartment. FEBS Lett, 580: 2160-2165. Csermely P, Miyata Y, Schnaider T, Yahara I. (1995) Autophosphorylation of GRP94 (endoplasmin). J Biol Chem, 270: 6381-6388. Cuozzo JW, Kaiser CA. (1999) Competition between glutathione and protein thiols for disulphide-bond formation. Nat Cell Biol, 1: 130-135. Czegle I, Piccirella S, Senesi S, Csala M, Mandl J, Bánhegyi G, Fulceri R, Benedetti

A.

(2006)

Cooperativity

between

11beta-hydroxysteroid

dehydrogenase type 1 and hexose-6-phosphate dehydrogenase is based on a common pyridine nucleotide pool in the lumen of the endoplasmic reticulum. Mol Cell Endocrinol, 248: 24-25. Dahlin DC, Miwa GT, Lu AZ, Nelson SD. (1984) N-Acetyl-p-benzoquinone imine: a cytochrome P-450-mediated oxidation product of acetaminophen. Proc Natl Acad Sci USA, 81: 1327-1331. Dai Y, Cederbaum AI. (1995) Cytotoxicity of acetaminophen in human cytochrome P4502E1-transfected HepG2 cells. J Pharmacol Exp Ther, 273: 1497-1505.

79

De Vries J. (1984) Hepatotoxic metabolic activation of paracetamol and its derivatives phenacetin and benorilate: Oxygenation or electron transfer. Biochem Pharmacol, 30: 399-402. Donnelly PJ, Walker RM, Racz WJ. (1994) Inhibition of mitochondrial respiration in vivo is an early event in acetaminophen-induced hepatotoxicity. Arch Toxicol, 68: 110-118. Dorner AJ, Wasley LC, Kaufman RJ. (1990) Protein dissociation from GRP78 and secretion are blocked by depletion of cellular ATP levels. Proc Natl Acad Sci USA, 87: 7429-7432. DuRose JB, Tam AB, Niwa M. (2006) Intrinsic capacities of molecular sensors of the unfolded protein response to sense alternate forms of endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell, 17: 3095-3107. El-Hassan H, Anwar K, Macanas-Pirard P, Crabtree M, Chow SC, Johnson VL, Lee PC, Hinton RH, Price SC, Kass GE. (2003) Involvement of mitochondria in acetaminophen-induced apoptosis and hepatic injury. Roles of cytochrome c, Bax, Bid and caspases. Toxicol Appl Pharmacol, 191: 118-129. Ellgaard L, Molinari M, Helenius A. (1999) Setting the standards: quality control in the secretory pathway. Science, 286: 1882-1888. Feldheim D, Rothblatt J, Schekman R. (1992) Topology and functional domains of Sec63p, an endoplasmic reticulum membrane protein required for secretory protein translocation. Mol Cell Biol, 12: 3288-3296. Fiorucci S, Antonelli E, Distrutti E, Mencarelli A, Farneti S, Del Soldato P, Morelli A. (2004) Liver delivery of NO by NCX-1000 protects against acute liver failure and mitochondrial dysfunction induced by APAP in mice. Br J Pharmacol, 143: 33-42. Frand AR, Kaiser CA. (1999) Ero1p oxidizes protein disulfide isomerase in a pathway for disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. Mol Cell, 4: 469-477. Freedman RB. (1989) Protein disulfide isomerase: multiple roles in the modification of nascent secretory proteins. Cell, 57: 1069-1072. Fulceri R, Bánhegyi G, Gamberucci A, Giunti R, Mandl J, Benedetti A. (1994) Evidence

for

the

intraluminal

80

positioning

of

p-nitrophenol

UDP-

glucuronosyltransferase activity in rat liver microsomal vesicles. Arch Biochem Biophys, 309: 43–46. Gardner CR, Heck DE, Yang CS, Thomas PE, Zhang XJ, DeGeorge GL, Laskin JD, Laskin DL. (1998) Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology, 27: 748-754. Gardner CR, Laskin JD, Dambach DM, Sacco M, Durham SK, Bruno MK, Cohen SD, Gordon MK, Gerecke DR, Zhou P, Laskin DL. (2002) Reduced hepatotoxicity of acetaminophen in mice lacking inducible nitric oxide synthase: potential role of tumor necrosis factor-alpha and interleukin-10. Toxicol Appl Pharmacol, 184: 27-36. Goldberger RF, Epstein CJ, Anfinsen CB. (1963) Acceleration of reactivation of reduced bovine pancreatic ribonuclease by a microsomal system from rat liver. J Biol Chem, 238: 628-635. Goldring CE, Kitteringham NR, Elsby R, Randle LE, Clement YN, Williams DP, McMahon M, Hayes JD, Itoh K, Yamamoto M, Park BK. (2004) Activation of hepatic Nrf2 in vivo by acetaminophen in CD-1 mice Hepatology, 39: 12671276. Grasl-Kraupp B, Ruttkay-Nedecky B, Koudelka H, Bukowska K, Bursch W, Schulte-Hermann R. (1995) In situ detection of fragmented DNA (TUNEL assay) fails to discriminate among apoptosis, necrosis, and autolytic cell death: a cautionary note. Hepatology, 21: 1465-1468. Grover AK, Kwan CY, Samson SE. (2003) Effects of peroxynitrite on sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ pump isoforms SERCA2b and SERCA3a. Am J Physiol Cell Physiol, 285: C1537-1543. Gujral JS, Knight TR, Farhood A, Bajt ML, Jaeschke H. (2002) Mode of cell death after acetaminophen overdose in mice: apoptosis or oncotic necrosis? Toxicol Sci, 67: 322-328. Hamman BD, Hendershot LM, Johnson AE. (1998) BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation. Cell, 92: 747-758. Hampton MB, Fadeel B, Orrenius S. (1998) Redox regulation of the caspases during apoptosis. Ann NY Acad Sci, 854: 328-335.

81

Harding HP, Novoa I, Zhang Y, Zeng H, Wek R, Schapira M, Ron D. (2000) Regulated translation initiation controls stress-induced gene expression in mammalian cells. Mol Cell, 6: 1099-1108. Harding HP, Zhang Y, Zeng H, Novoa I, Lu PD, Calfon M, Sadri N, Yun C, Popko B, Paules R, Stojdl DF, Bell JC, Hettmann T, Leiden JM, Ron D. (2003) An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell, 11: 619-633. Haze K, Yoshida H, Yanagi H, Yura T, Mori K. (1999) Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell, 10: 3787-3799. Hendershot LM. (2004) The ER function BiP is a master regulator of ER function. Mt Sinai J Med, 71: 289-297. Hentze H, Latta M, Kunstle G, Lucas R, Wendel A. (2003) Redox control of hepatic cell death. Toxicol Lett, 139: 111-118. Hentze H, Schmitz I, Latta M, Krueger A, Krammer PH, Wendel A. (2002) Glutathione dependence of caspase-8 activation at the death-inducing signaling complex. J Biol Chem, 277: 5588-5595. Higo T, Hattori M, Nakamura T, Natsume T, Michikawa T, Mikoshiba K. (2005) Subtype-specific and ER lumenal environment-dependent regulation of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 by ERp44. Cell, 120: 85-98. Hinson JA, Bucci TJ, Irwin LK, Michael SL, Mayeux PR. (2002) Effect of inhibitors of nitric oxide synthase on acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. Nitric Oxide, 6: 160-167. Holownia A, Braszko JJ. (2004) Acetaminophen alters microsomal ryanodine Ca2+ channel in HepG2 cells overexpressing CYP2E1. Biochem Pharmacol, 68: 513-521. Hong M, Li M, Mao C, Lee AS. (2004) Endoplasmic reticulum stress triggers an acute proteasome-dependent degradation of ATF6. J Cell Biochem, 92: 723732. Hristova M, Heuvelmans S, van der Vliet A. (2007) GSH-dependent regulation of Fas-mediated caspase-8 activation by acrolein. FEBS Lett, 581: 361-367.

82

Hubbard SC, Ivatt RJ. (1981) Synthesis and processing of asparagine-linked oligosaccharides. Annu Rev Biochem, 50: 555-583. Ivana Scovassi A, Diederich M. (2004) Modulation of poly(ADP-ribosylation) in apoptotic cells. Biochem Pharmacol, 68: 1041-1047. Jaeschke H, Bautista AP, Spolarics Z, Spitzer JJ. (1992) Superoxide generation by neutrophils and Kupffer cells during in vivo reperfusion after hepatic ischemia in rats. J Leukoc Biol, 52: 377-382. Jaeschke H, Bautista AP, Spolarics Z, Spitzer JJ. (1991) Superoxide generation by Kupffer cells and priming of neutrophils during reperfusion after hepatic ischemia. Free Radic Res Commun, 15: 277-284. Jaeschke H, Gujral JS, Bajt ML. (2004) Apoptosis and necrosis in liver disease. Liver Int, 24: 85-89. James

LP,

Mayeux

PR,

Hinson

JA.

(2003)

Acetaminophen-induced

hepatotoxicity. Drug Metabolism and Disposition, 31: 1499-1506. Jessop CE, Chakravarthi S, Watkins RH, Bulleid NJ. (2004) Oxidative protein folding in the mammalian endoplasmic reticulum. Biochem Soc Trans, 32: 655-658. Kabani M, Beckerich JM, Gaillardin C. (2000) Sls1p stimulates Sec63p-mediated activation of Kar2p in a conformation-dependent manner in the yeast endoplasmic reticulum. Mol Cell Biol, 20: 6923-6934. Kaplowitz N. (2000) Mechanisms of liver cell injury. J Hepatol, 32 (1 Suppl): 3947. Kappler M, Gerry AB, Brown E, Reid L, Leake DS, Gieseg SP. (2007) Aqueous peroxyl radical exposure to THP-1 cells causes glutathione loss followed by protein oxidation and cell death without increased caspase-3 activity. Biochim Biophys Acta, 1773: 945-953. Kass GE, Macanas-Pirard P, Lee PC, Hinton RH. (2003) The role of apoptosis in acetaminophen-induced injury. Ann NY Acad Sci; 1010: 557-559. Kirsch M, Lehnig M, Korth HG, Sustmann R, de Groot H. (2001) Inhibition of peroxynitrite-induced nitration of tyrosine by glutathione in the presence of carbon dioxide through both radical repair and peroxynitrate formation. Chemistry, 7: 3313-3320.

83

Knight TR, Kurtz A, Bajt ML, Hinson JA, Jaeschke H. (2001) Vascular and hepatocellular peroxynitrite formation during acetaminophen toxicity: role of mitochondrial oxidant stress. Toxicol Sci, 62: 212-220. Kroemer G, Reed JC. (2000) Mitochondrial control of cell death. Nat Med, 6: 513-519. Kroger H, Ehrlich W, Klewer M, Gratz R, Dietrich A, Miesel R. (1996) The influence of antagonists of poly(ADP-ribose) metabolism on acetaminophen hepatotoxicity. Gen Pharmacol, 27: 167-170. Kuznetsov G, Chen LB, Nigam SK. (1997) Multiple molecular chaperones complex with misfolded large oligomeric glycoproteins in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem, 272: 3057-3063. Kyriakis JM, Banerjee P, Nikolakaki E, Dai T, Rubie EA, Ahmad MF, Avruch J, Woodgett JR. (1994) The stress-activated protein kinase subfamily of c-Jun kinases Nature, 369: 156-60. Laboissiere MC, Sturley SL, Raines RT. (1995) The essential function of proteindisulfide isomerase is to unscramble non-native disulfide bonds. J Biol Chem, 270: 28006-28009. Laskin DL, Pilaro AM. (1986) Potential role of activated macrophages in acetaminophen hepatotoxicity. I. Isolation and characterization of activated macrophages from rat liver. Toxicol Appl Pharmacol, 86: 204-215. Laskin DL, Pilaro AM, Ji S. (1986) Potential role of activated macrophages in acetaminophen hepatotoxicity. II. Mechanism of macrophage accumulation and activation. Toxicol Appl Pharmacol, 86: 216-226. Lauterburg BH, Velez ME. (1988) Glutathione deficiency in alcoholics: risk factor for paracetamol hepatotoxicity. Gut, 29: 1153-1157. Lawson JA, Farhood A, Hopper RD, Bajt ML, Jaeschke H. (2000) The hepatic inflammatory response after acetaminophen overdose: role of neutrophils. Toxicol Sci, 54: 509-516. Lawson JA, Fisher MA, Simmons CA, Farhood A, Jaeschke H. (1999) Inhibition of Fas receptor (CD95)-induced hepatic caspase activation and apoptosis by acetaminophen in mice. Toxicol Appl Pharmacol, 156: 179-186.

84

Lee AS. (2001) The glucose-regulated proteins: stress induction and clinical applications. Trends Biochem Sci, 26: 504-510. Leist M, Single B, Kunstle G, Volbracht C, Hentze H, Nicotera P. (1997) Apoptosis in the absence of poly-(ADP-ribose) polymerase. Biochem Biophys Res Commun, 233: 518-522. Lewis MJ, Mazzarella RA, Green M. (1986) Structure and assembly of the endoplasmic reticulum: biosynthesis and intracellular sorting of ERp61, ERp59, and ERp49, three protein components of murine endoplasmic reticulum. Arch Biochem Biophys, 245: 389-403. Li Y, Camacho P. (2004) Ca2+-dependent redox modulation of SERCA 2b by ERp57. J Cell Biol, 164: 35-46. Lievremont JP, Rizzuto R, Hendershot L, Meldolesi J. (1997) BiP, a major chaperone protein of the endoplasmic reticulum lumen, plays a direct and important role in the storage of the rapidly exchanging pool of Ca2+. J Biol Chem, 272: 30873-30879. Lodish HF, Kong N. (1990) Perturbation of cellular calcium blocks exit of secretory proteins from the rough endoplasmic reticulum. J Biol Chem, 265: 10893-10899. Lorz C, Justo P, Sanz A, Subira D, Egido J, Ortiz A. (2004) Paracetamol-induced renal tubular injury: a role for ER stress. J Am Soc Nephrol, 15: 380-389. Mandl J, Bánhegyi G, Kalapos MP, Garzó T. (1995) Increased oxidation and decreased conjugation of drugs in the liver caused by starvation. Altered metabolism of certain aromatic compounds and acetone. Chem Biol Interact, 96: 87-101. Marciniak SJ, Yun CY, Oyadomari S, Novoa I, Zhang Y, Jungreis R, Nagata K, Harding HP, Ron D. (2004) CHOP induces death by promoting protein synthesis and oxidation in the stressed endoplasmic reticulum. Genes Dev, 18: 3066-3077. Martens ME, Lee CP. (1984) Reye's syndrome: salicylates and mitochondrial functions. Biochem Pharmacol, 33: 2869-2876.

85

Masubuchi Y, Suda C, Horie T. (2005) Involvement of mitochondrial permeability transition in acetaminophen-induced liver injury in mice. J Hepatol, 42: 110-116. McClain CJ, Kromhout JP, Peterson FJ, Holtzman JL. (1980) Potentiation of acetaminophen hepatotoxicity by alcohol. JAMA, 244: 251-253. McClain CJ, Price S, Barve S, Devalarja R, Shedlofsky S. (1999) Acetaminophen hepatotoxicity: an update. Curr Gastroent Reports, I: 42-49. McCracken AA, Brodsky JL. (2000) A molecular portrait of the response to unfolded proteins. Genome Biol, 1: REVIEWS1013. McCullough KD, Martindale JL, Klotz LO, Aw TY, Holbrook NJ. (2001) GADD153 sensitizes cells to endoplasmic reticulum stress by down-regulating Bcl2 and perturbing the cellular redox state. Mol Cell Biol, 21: 1249-1259. Meunier L, Usherwood YK, Chung KT, Hendershot LM. (2002) A subset of chaperones and folding enzymes form multiprotein complexes in endoplasmic reticulum to bind nascent proteins. Mol Biol Cell, 13: 4456-4469. Meyers LL, Beierschmitt WP, Khairallah EA, Cohen SD. (1988) Acetaminopheninduced inhibition of hepatic mitochondrial respiration in mice. Toxicol Appl Pharmacol, 93: 378-387. Molteni SN, Fassio A, Ciriolo MR, Filomeni G, Pasqualetto E, Fagioli C, Sitia R. (2004) Glutathione limits Ero1-dependent oxidation in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem, 279: 32667-32673. Moore M, Thor H, Moore G, Nelson S, Moldeus P, Orrenius S. (1985) The toxicity of acetaminophen and N-acetyl-p-benzoquinone imine in isolated hepatocytes is associated with thiol depletion and increased cytosolic Ca2+. J Biol Chem, 260: 13035-13040. Mori K, Ogawa N, Kawahara T, Yanagi H, Yura T. (2000) mRNA splicingmediated C-terminal replacement of transcription factor Hac1p is required for efficient activation of the unfolded protein response. Proc Natl Acad Sci USA, 97: 4660-4665. Musallam L, Ethier C, Haddad PS, Denizeau F, Bilodeau M. (2002) Resistance to Fas-induced apoptosis in hepatocytes: role of GSH depletion by cell isolation and culture. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 283: G709-718.

86

Nadanaka S, Yoshida H, Kano F, Murata M, Mori K. (2004) Activation of mammalian unfolded protein response is compatible with the quality control system operating in the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell, 15: 2537-2548. Nakagawa T, Yuan J. Cross-talk between two cysteine protease families. (2000) Activation of caspase-12 by calpain in apoptosis. J Cell Biol, 150: 887-894. Obeng EA, Boise LH. (2005) Caspase-12 and caspase-4 are not required for caspase-dependent endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis. J Biol Chem, 280: 29578-29587. Okamura K, Kimata Y, Higashio H, Tsuru A, Kohno K. (2000) Dissociation of Kar2p/BiP from an ER sensory molecule, Ire1p, triggers the unfolded protein response in yeast. Biochem Biophys Res Commun, 279: 445-450. Oyadomari S, Mori M. (2004) Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ, 11: 381-389. Paschen W. (2003) Endoplasmic reticulum: a primary target in various acute disorders and degenerative diseases of the brain. Cell Calcium, 34: 365-383. Piccirella S, Czegle I, Lizák B, Margittai E, Senesi S, Papp E, Csala M, Fulceri R, Csermely P, Mandl J, Benedetti A, Bánhegyi G. (2006) Uncoupled redox systems in the lumen of the endoplasmic reticulum. Pyridine nucleotides stay reduced in an oxidative environment. J Biol Chem, 281: 4671-4677. Pollard MG, Travers KJ, Weissman JS. (1998) Ero1p: a novel and ubiquitous protein with an essential role in oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Mol Cell, 1: 171-182. Price BD, Calderwood SK. (1992) GADD45 and GADD153 messenger RNA levels are increased during hypoxia and after exposure of cells to agents which elevate the levels of the glucose-regulated proteins. Cancer Res, 52: 38143817. Price ER, Zydowsky LD, Jin MJ, Baker CH, McKeon FD, Walsh CT. (1991) Human cyclophilin B: a second cyclophilin gene encodes a peptidyl-prolyl isomerase with a signal sequence. Proc Natl Acad Sci USA, 88: 1903-1907. Primm TP, Walker KW, Gilbert HF. (1996) Facilitated protein aggregation. Effects of calcium on the chaperone and anti-chaperone activity of protein disulfide-isomerase. J Biol Chem, 271: 33664-33669.

87

Puig A, Lyles MM, Noiva R, Gilbert HF. (1994) The role of the thiol/disulfide centers and peptide binding site in the chaperone and anti-chaperone activities of protein disulfide isomerase. J Biol Chem, 269: 19128-19135. Qiu Y, Benet LZ, Burlingame AL. (1998) Identification of the hepatic protein targets of reactive metabolites of acetaminophen in vivo in mice using twodimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. J Biol Chem, 273: 17940-17953. Rao RV, Hermel E, Castro-Obregon S, del Rio G, Ellerby LM, Ellerby HM, Bredesen DE. (2001) Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program. Mechanism of caspase activation. J Biol Chem, 276: 33869-33874. Rao RV, Castro-Obregon S, Frankowski H, Schuler H, Stoka V, del Rio G, Bredesen DE, Ellerby HM. (2002) Coupling Endoplasmic Reticulum Stress to the Cell Death Program. An Apaf-1-independent intrinsic pathway. J Biol Chem, 277: 21836-21842. Ray SD, Balasubramanian G, Bagchi D, Reddy CS. (2001) Ca2+-calmodulin antagonist chlorpromazine and poly(ADP-ribose) polymerase modulators 4aminobenzamide and nicotinamide influence hepatic expression of BCL-XL and p53 and protect against acetaminophen-induced programmed and unprogrammed cell death in mice. Free Radic Biol Med, 31: 277-291. Ray SD, Mumaw VR, Raje RR, Fariss MW. (1996) Protection of acetaminopheninduced hepatocellular apoptosis and necrosis by cholesteryl hemisuccinate pretreatment. J Pharmacol Exp Ther, 279: 1470-1483. Ray SD, Sorge CL, Raucy JL, Corcoran GB. (1990) Early loss of large genomic DNA in vivo with accumulation of Ca2+ in the nucleus during acetaminopheninduced liver injury. Toxicol Appl Pharmacol, 106: 346-351. Roberts DW, Bucci TJ, Benson RW, Warbritton AR, McRae TA, Pumford NR, Hinson JA. (1991) Immunohistochemical localization and quantification of the 3-(cystein-S-yl)-acetaminophen

protein

adduct

in

acetaminophen

hepatotoxicity. Am J Pathol, 138: 359-371. Ron D, Habener JF. (1992) CHOP, a novel developmentally regulated nuclear protein that dimerizes with transcription factors C/EBP and LAP and functions as a dominant-negative inhibitor of gene transcription. Genes Dev, 6: 439-453.

88

Rosser MF, Trotta BM, Marshall MR, Berwin B, Nicchitta CV. (2004) Adenosine nucleotides and the regulation of GRP94-client protein interactions. Biochemistry, 43: 8835-8845. Rutishauser J, Spiess M. (2002) Endoplasmic reticulum storage diseases. Swiss Med Wkly, 132: 211-222. Rutkowski DT, Arnol SM, Miller CN, Wu J, Li J, Gunnison KM, Mori K, Akha AAS, Raden D, Kaufman RJ. (2006) Adaptation to ER stress is mediated by differential stabilities of pro-survival and pro-apoptotic mRNAs and proteins. PLOS Biol, 4: 2024-2041. Rutkowski DT, Kaufman RJ. (2004) A trip to the ER: coping with stress. Trends Cell Biol, 14: 20-28. Salas VM, Corcoran GB. (1997) Calcium-dependent DNA damage and adenosine 3',5'-cyclic monophosphate-independent glycogen phosphorylase activation in an in vitro model of acetaminophen-induced liver injury. Hepatology, 25: 1432-1438. Salgo MG, Bermudez E, Squadrito GL, Pryor WA. (1995) Peroxynitrite causes DNA damage and oxidation of thiols in rat thymocytes [corrected] Arch Biochem Biophys, 322: 500-505. Selye H. (1975) Implications of stress concept. NY State J Med, 75: 2139-2145. Shen J, Chen X, Hendershot L, Prywes R. (2002) ER stress regulation of ATF6 localization by dissociation of BiP/GRP78 binding and unmasking of Golgi localization signals. Dev Cell, 3: 99-111. Shen J, Snapp EL, Lippincott-Schwartz J, Prywes R. (2005) Stable binding of ATF6 to BiP in the endoplasmic reticulum stress response. Mol Cell Biol, 25: 921-932. Shen H-M, Liu Z. (2006) JNK signaling pathway is a key modulator in cell death mediated by reactive oxygen and nitrogen species. Free Rad Biol Med, 40: 928-939. Shi Y. (2004) Revisiting the induced proximity model. Cell, 117: 855-858. Sitia R, Molteni SN. (2004) Stress, protein (mis)folding, and signaling: the redox connection. Sci STKE, pe27.

89

Spee P, Subjeck J, Neefjes J. (1999) Identification of novel peptide binding proteins in the endoplasmic reticulum: ERp72, calnexin, and GRP170. Biochemistry, 38: 10559-10566. Thornberry NA, Lazebnik Y. (1998) Caspases: enemies within. Science, 281: 1312-1316. Tirmenstein MA, Nelson SD. (1989) Subcellular binding and effects on calcium homeostasis produced by acetaminophen and a nonhepatotoxic regioisomer, 3'hydroxyacetanilide, in mouse liver. J Biol Chem, 264: 9814-9819. Travers KJ, Patil CK, Wodicka L, Lockhart DJ, Weissman JS, Walter P. (2000) Functional and genomic analyses reveal an essential coordination between the unfolded protein response and ER-associated degradation. Cell, 101: 249-258. Tsokos-Kuhn JO, Hughes H, Smith CV, Mitchell JR. (1988) Alkylation of the liver plasma membrane and inhibition of the Ca2+-ATPase by acetaminophen. Biochem Pharmacol, 37: 2125-2131. Tu BP, Ho-Schleyer SC, Travers KJ, Weissman JS. (2000) Biochemical basis of oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Science, 290: 15711574. Tu BP, Weissman JS. (2004) Oxidative protein folding in eukaryotes: mechanisms and consequences. J Cell Biol, 164: 341-346. Urano F, Wang X, Bertolotti A, Zhang Y, Chung P, Harding HP, Ron D. (2000) Coupling of stress in the ER to activation of JNK protein kinases by transmembrane protein kinase IRE1 Science, 287: 664–666. Van de Straat R, de Vries J, Vermeulen NP. (1987) Role of hepatic microsomal and purified cytochrome P-450 in one-electron reduction of two quinone imines and concomitant reduction of molecular oxygen. Biochem Pharmacol, 36: 613-619. Van de Straat R, Vromans RM, Bosman P, de Vries J, Vermeulen NP. (1988) Cytochrome P-450-mediated oxidation of substrates by electron-transfer; role of oxygen radicals and of 1- and 2-electron oxidation of paracetamol. Chem Biol Interact, 64: 267-280. Van der Vlies D, Makkinje M, Jansens A, Braakman I, Verkleij AJ, Wirtz KW, Post JA. (2003) Oxidation of ER resident proteins upon oxidative stress: effects

90

of altering cellular redox/antioxidant status and implications for protein maturation. Antioxid Redox Signal, 5: 381-387. Van PN, Peter F, Soling HD. (1989) Four intracisternal calcium-binding glycoproteins from rat liver microsomes with high affinity for calcium. No indication for calsequestrin-like proteins in inositol 1,4,5-trisphosphatesensitive calcium sequestering rat liver vesicles. J Biol Chem, 264: 1749417501. Varsányi M, Szarka A, Papp E, Makai D, Nardai G, Fulceri R, Csermely P, Mandl J, Benedetti A, Bánhegyi G. (2004) FAD transport and FAD-dependent protein thiol oxidation in rat liver microsomes. J Biol Chem, 279: 3370-3374. Wang XZ, Lawson B, Brewer JW, Zinszner H, Sanjay A, Mi LJ, Boorstein R, Kreibich G, Hendershot LM, Ron D. (1996) Signals from the stressed endoplasmic

reticulum

induce

C/EBP-homologous

protein

(CHOP/GADD153). Mol Cell Biol, 16: 4273-4280. Wei J, Gaut JR, Hendershot LM. (1995) In vitro dissociation of BiP-peptide complexes requires a conformational change in BiP after ATP binding but does not require ATP hydrolysis. J Biol Chem, 270: 26677-26682. Winter J, Klappa P, Freedman RB, Lilie H, Rudolph R. (2002) Catalytic activity and chaperone function of human protein-disulfide isomerase are required for the efficient refolding of proinsulin. J Biol Chem, 277: 310-317. Wormald MR, Dwek RA. (1999) Glycoproteins: glycan presentation and proteinfold stability. Structure Fold Des, 7: R155-160. Yoneda T, Imaizumi K, Oono K, Yui D, Gomi F, Katayama T, Tohyama M. (2001) Activation of caspase-12, an endoplastic reticulum (ER) resident caspase, through tumor necrosis factor receptor-associated factor 2-dependent mechanism in response to the ER stress. J Biol Chem, 276: 13935-13940. Yu M, Haslam RH, Haslam DB. (2000) HEDJ, an Hsp40 co-chaperone localized to the endoplasmic reticulum of human cells. J Biol Chem, 275: 24984-24992.

91

8. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Az értekezés a következő publikációkon alapul: Bánhegyi G, Csala M, Nagy G, Sorrentino V, Fulceri R, Benedetti A. (2003) Evidence for the transport of glutathione through ryanodine receptor channel type 1. Biochemical J, 376: 807-812. (IF: 4,101) Kardon T, Nagy G *, Csala M, Kiss A, Schaff Z, Nagy PL, Wunderlich L, Bánhegyi G, Mandl J. (2006) Influence of BGP-15, a nicotinic amidoxime derivative, on the vascularization and growth of murine hepatoma xenografts. Anticancer Research, 26: 1023-1028. (IF: 1,604) Nagy G, Kardon T, Wunderlich L, Szarka A, Kiss A, Schaff Zs, Bánhegyi G, Mandl J. (2007) Acetaminophen induces ER dependent signaling in mouse liver. Arch Biochem Biophys, 459: 273-279. (IF: 2,969) Megjegyzés: * megosztott elsőszerzős cikk Kardon T.-vel

Értekezéshez nem kapcsolódó publikációk:

Braun L, Coffey M J, Puskás F, Kardon T, Nagy G, Conley AA, Burchell B, Mandl J. (1998) The molecular basis of bilirubin UDP-glucuronosyltransferase induction in spontaneously diabetic rats, acetone-treated rats and starved rats. Biochem J, 336: 587-592. (IF: 3,855) Csala M, Braun L, Coffey MJ, Puskás F, Kardon T, Nagy G, Conley AA, Burchell B, Mandl J. (2000) A bilirubin UDP-glukuroniltranszferáz indukciója diabéteszes, acetonnal kezelt és éhezõ patkányokban. Biokémia, 24: 7-12.

92

Margittai É, Bánhegyi G, Kiss A, Nagy G, Mandl J, Schaff Z, Csala M. (2005) Scurvy leads to endoplasmic reticulum stress and apoptosis in the liver of guinea pigs. J Nutrit, 135: 2530-2534. (IF: 3,689)

93