Aminosavak tisztításának és elválasztásának vizsgálata szimulált mozgóréteges preparatív folyadékkromatográfiás művelettel

Aminosavak tisztításának és elválasztásának vizsgálata szimulált mozgóréteges preparatív folyadékkromatográfiás művelettel Doktori (PhD) értekezés

Készítette: Molnár Zoltán Témavezetők: Dr. Szánya Tibor egyetemi docens Dr. Hanák László egyetemi docens

Pannon Egyetem Vegyipari Műveleti Tanszék Veszprém, 2009.

Aminosavak tisztításának és elválasztásának vizsgálata szimulált mozgóréteges preparatív folyadékkromatográfiás művelettel Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Molnár Zoltán Készült a Pannon Egyetem Vegyészmérnöki Doktori Iskolája keretében Témavezetők: Dr. Szánya Tibor, egyetemi docens Dr. Hanák László, egyetemi docens Elfogadásra javaslom (igen / nem) …………………………….. (aláírás) Elfogadásra javaslom (igen / nem) …………………………….. (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton …......... % -ot ért el, Veszprém,

…………………………….. a Szigorlati Bizottság elnöke

Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: …........................ …................. igen /nem …………………………….. (aláírás) Bíráló neve: …........................ …................. igen /nem …………………………….. (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …..........% - ot ért el Veszprém,

………………………………. a Bíráló Bizottság elnöke

A doktori (PhD) oklevél minősítése…................................. ………………………………. az EDT elnöke

Tartalomjegyzék Kivonat

iii

Abstract

iv

Auszug

v

Köszönetnyilvánítás

vi

1. Bevezetés

1

2. Elméleti rész

3

2.1 Aminosavak

3

2.1.1 Fizikai-kémiai tulajdonságok

3

2.1.2 Az aminosavak előfordulása, aminosav források

7

2.1.3 Az aminosavak felhasználása

8

2.1.4 Aminosavak ipari előállításának lehetőségei

9

2.1.5 Aminosavak szorpciós tulajdonságai

10

2.2 A folyadékkromatográfia elméleti áttekintése

15

2.2.1 Történeti áttekintés

15

2.2.2 A kromatográfia alapfogalmai

15

2.2.3 Folyamatos preparatív folyadékkromatográfiás műveletek

22

2.3 A preparatív folyadékkromatográfia és az SMB gyakorlata

36

2.3.1 A szimulált mozgóágy létrehozása

36

2.3.2 Az SMB alkalmazási területei

41

2.3.3 Polimer adszorbens gyanták jellemzői

44

3. Matematikai modell

47

3.1 Matematikai modellezés lehetőségei

47

3.2 Az aminosav elválasztás matematikai modelljének megalkotása

50

i

4. Kísérleti rész

55

4.1 Célkitűzés

55

4.2 Fenilalanin vizes oldatának sómentesítése

62

4.2.1 Feladatmeghatározás

62

4.2.2 A sómentesítési kísérletekhez felhasznált eszközök és anyagok

63

4.2.3 Fenilalanin sómentesítési kísérletek

68

4.3 Fenilalanin-glicin aminosav elválasztás vizsgálata

84

4.3.1 Feladatmeghatározás

84

4.3.2 A fenilalanin-glicin elválasztáshoz felhasznált eszközök és anyagok

84

4.3.3 Fenilalanin – glicin SMB szeparációs kísérletek

91

4.4 Fenilalanin-glicin aminosav elválasztás sógradienssel

111

4.4.1 Feladatmeghatározás

111

4.4.2 A fenilalanin-glicin sógradiens elválasztás eszközei és felhasznált anyagok 112 4.4.3 Fenilalanin – glicin sógradienses elválasztási kísérletek

114

5. Új kutatási eredmények

123

Theses

125

Irodalomjegyzék

127

Függelék

130

ii

Kivonat

A szerző aminosavak elválasztását, és vizes aminosav oldatok sómentesítését vizsgálta polimer

adszorbens

gyanta

tölteteken,

szimulált

mozgóréteges

preparatív

folyadékkromatográfiás művelettel. Kísérleteit egy kislaboratóriumi méretű 6 oszlopos (belső átmérő 1,3 cm, oszlophossz 12,5 cm) és egy nagylaboratóriumi méretű 4 oszlopos (belső átmérő 5 cm, oszlophossz 50 cm) készüléken végezte. Az elválasztáshoz használt töltetek az Amberlite XAD-7, XAD1180, a DIAION HP20, HP2MG és a SEPABEADS SP825 polimer adszorbensek. Mindegyikre jellemző, hogy 0,3…0,5 mm szemcseméret tartományú gyöngypolimerek. Az adszorpciós egyensúlyok, a töltet jellemzők mérése után az SMB készülék geometriája ismeretében korábban elkészített matematikai modelleket fejlesztett tovább a szerző, amellyel a művelet paraméter optimálását és szimulációját végezte. Ez a munka az oszlopkonfiguráció, a hőmérséklet, az aminosav-koncentráció és az elektrolit koncentráció műveleti jellemzőkre gyakorolt hatásait kísérleti úton és számítógépi szimulációval vizsgálja. Minden esetben a termelékenység javítása a cél, előre meghatározott tisztaságra és kihozatalra vonatkozó követelmények figyelembevételével. A referencia paramétereket tekintve a hőmérséklet 60°C-ra történő emelésével 216%-os, az aminosavkoncentráció növelésével 360%-os, míg sógradiens alkalmazásával 200%-os termelékenység növekedés mérhető. A kísérletek során mért és a szimulációval számított adatok jól egyeznek.

Kulcsszavak: szimulált mozgóréteges kromatográfia, aminosav elválasztás, polimer adszorbens

iii

Investigation of amino acid separation and purification by simulated moving bed chromatography

Abstract The author has examined separation of amino acids, and desalination of aqueous amino acid solutions with simulating moving bed (SMB) chromatography. His experiments were performed on a six-column small-laboratory-scale (I.D. = 13 mm, L = 125 mm) equipment and on a 4-column large-laboratory-scale (I.D. = 50 mm, L = 500mm) equipment. The packings used for the separation are the Amberlite XAD-7, XAD1180, the DIAION H20, HP2MG and the SEPABEADS SP825 polymeric adsorbents. It is characteristic for all of them that they are polymer beads with particle diameter between 0,3-0,5 mm. After the measurement of the adsorption equilibriums and the parameters of the packing by knowing the geometry of the SMB equipment, the author was improving previously made mathematical models, with which the parameter optimization and simulation of the operation were performed. This work is examining the effects of the columns configuration, the temperature, the concentration of amino acids and electrolyte on operation parameters by experimenting and computer simulation. In every case the aim is increasing the productivity by considering the prescribed requirements concerning purity and yield. An increase of productivity of 216% can be measured by raising the temperature to 60°C (taking into account the reference parameters), 360% by increasing the concentration of amino acids and 200% by using salt gradient. The measured and the calculated data agreed well.

Keywords: simulated moving bed chromatography, amino acid separation, polymeric adsorbent resin

iv

Untersuchung zur Trennung und Purifikation Aminosäuren mit SMB-Prozessen Auszug In diesem Dissertation wurde die SMB (simulierter Gegenstrom) chromatographische Trennung den Aminosäuren in Wasser-Lösungen sowie die Salz-Entfernung von Aminosäuren in Wasser-Lösungen untersucht. Für die Separation wurde unterschiedliche Adsorptionspolymers gebraucht (Polymerperlen mit verschiedenen chemischen Aufbau, typischer Durchmesser zwischen 0,3 und 0,5 mm). Die Versuche wurden einerseits mit einem 6-säuligen SMB (Trennsäulen innere Durchmesser 1,3 cm, Länge 12,5 cm), andererseits mit einem 4-säuligen SMB (Trennsäulen innere Durchmesser 5 cm, Länge 50 cm) durchgeführt. Beide Apparat wurde an der Pannon Universität Veszprém gebaut. Für die Rechnung den optimalen Verfahrensparameter wurden zuerst die Messungen den Gleichgewichte und Säulen-charakteristik (NTP, Porosität) durchgeführt. Die Verfahrensparameters am Anfang wurden mit dem linearen Morbidelli-Method kalkuliert, dann dieselbe in der Kentniss den Adsorptionsisothermen und NTP mit einem Simulationssoftware optimalisiert. An der Universität Veszprém ein früher geschriebene Simulationssoftware wurde vom Author weiter entwickelt, so wurde möglich auch die 6-säuligen System und SMB-Prozessen mit Salzgradient zu modellieren. In dieser Arbeit es handelt sich um den Einfluss verschiedene Parameters auf

die

Leistungskennzahlen, sowie die Temperatur den Säulen, der Konzentration den Aminosäuren und die Elektrolyten in der Trennungsmischung und der Konfiguration den SMB-Säulen. Mit dem optimierten SMB-Parameters wurden Versuche

sowie auch Simulationen ausgeführt, die Ergebnisse

übereinstimmen gut.

Schlüsselwörter: simulierte Gegenstromchromatographie (SMB), Trennung Aminosäuren, Polymer Adsorbenzien

v

Köszönetnyilvánítás Köszönetemet ezúton szeretném kifejezni témavezetőimnek, Dr. Szánya Tibornak és Dr. Hanák Lászlónak kísérleti munkámban, publikációimban és az értekezés megírásában nyújtott folyamatos segítségükért. Itt szeretném megköszönni Dr. Szánya Tibor egyetemi docens úrnak és Prof. Dr. Andreas Seidel-Morgenstern professzor úrnak a meghívást a Max-Planck Intézetbe, ahol lehetőségem volt nagyon sokat tanulni az ott végzett folyadékkromatográfiás és csatolt technikákból végzett kutatásokból. Köszönet Dr. Argyelán Jánosnak a szimulációs szoftver módosításában nyújtott segítségéért. Köszönet illeti továbbá a Pannon Egyetem (korábban Veszprémi Egyetem) Vegyipari Műveleti Tanszékének vezetőjét, Dr. Horváth Gézát, és a Tanszék minden dolgozóját támogató munkájukért. Köszönöm PhD-hallgató társamnak, Nagy Melinda Magdolnának - aki hasonló témakörben végzett kutatásokat, - hogy konzultáltunk a közös problémáinkról és sokszor együtt találtunk megoldást a kérdésekre. Továbbá szeretném megköszönni a dolgozat befejezéséhez nyújtott nélkülözhetetlen segítséget a Veszprémi Egyetem végzett hallgatóinak, Keszte Barbarának és Madarász Józsefnek. A kutatások pénzügyi támogatását ezúton szeretném megköszönni a Richter Gedeon Vegyészeti Gyár NyRt.-nek, illetve az NKFP-3A/0047/2002 Széchenyi Terv nemzeti kutatási és fejlesztési programjának, valamint a Veszprémi Egyetem Vegyészmérnöki Intézet Kooperációs Kutatási Központjának.

vi

1. Bevezetés Folyamatosan

növekszik

a

biotechnológiai

úton

előállított

hatóanyagok,

segédanyagok száma. A biomolekulák gyártása a legújabb mikrobiológiai módszerekkel történik.

Ezek az új módszerek több szempontból is előnyösek

lehetnek a szerves vegyipari szintézisekkel szemben. A szintetikus eljárásokhoz általában katalizátor és szerves oldószer-igény társul. Királis molekulák szintézisekor katalizátor nélkül racém termék keletkezik, csak nagyon drága, speciális katalizátorral lehetséges optikailag tiszta anyagot előállítani. Biológiai úton, a megfelelő mikroorganizmus tenyészettel elérhető az optikailag tiszta termék, de megfelelő körülmények közt az élő sejt nélküli, enzimkatalitikus eljárások is működőképesek. A biotechnológiai folyamatokban melléktermékként keletkező iszapok is hasznosíthatók (talajerő, takarmány). A biotechnológia másik területe, amikor valamilyen természetes anyagot, pl. növényi cellulózt vagy állati vázfehérjéket dolgoznak fel hidrolízissel, és így nyernek értékes molekulákat. Cellulózból lehetőség van cukrok, alkoholok gyártására, míg vágóhídi szőr-, toll, illetve bőrgyári bőrhulladékból aminosavak előállítására. A hidrolízis savas vagy lúgos közegben vagy enzimatikus úton történhet. Ebben az esetben főként vizes fázisban keletkeznek a számunkra értékes komponensek. Mivel folyamatosan bővül az ilyen módon gyártott molekulák száma, egyre nagyobb szerepet kapnak az ehhez kapcsolódó elválasztási módszerek. A fizikai feldolgozás (szűrés, centrifugálás) után az ioncsere vagy a fordított fázisú adszorpciós folyadékkromatográfia lehet a leghatékonyabb megoldás, ha a komponensek nem illékonyak, magasabb hőmérsékleten bomlanak, illetve, ha a fizikai tulajdonságaik (pl. forráspont) igen közeliek. A kromatográfiás eljárás termelékenysége növelhető, oldószer felhasználása mérsékelhető, ha folyamatos művelettel, pl. szimulált mozgóréteges kromatográfiával dolgozunk. Értekezésem

témája

folyadékkromatográfiás

aminosavak elválasztásának

szimulált

mozgóréteges

vizsgálata.

A

preparatív

folyadékkromatográfiás

elválasztási műveleteknek ez egy, az utóbbi években dinamikusan fejlődő ága. A Veszprémi Egyetem (Pannon Egyetem) Vegyipari Műveleti Tanszéke az 1990-es évek végétől eredményes kutatásokat végez szimulált mozgóréteges preparatív folyadékkromatográfiás műveletek területén. Ezen műveletek elsősorban a nehezen 1

szétválasztható és/vagy nagytisztaságú anyagok kinyerésére, tisztítására, izolálására alkalmazhatók előnyösen, különösen abban az esetben, ha kétkomponensű vagy kromatográfiás szempontból kétkomponensűnek tekinthető elegyek frakcionálása a feladat. A téma előzményeihez tartozik továbbá a Tanszék korábbi kutatási területe, melynek során a Pécsi Bőrgyárral és a REANAL Finomvegyszergyárral közösen bőrgyári hulladékok hidrolízises feldolgozásával és aminosavak kinyerésével foglakoztak. A dolgozat három fő egységből áll. Az első egységben áttekintést kaphatunk az aminosavakról, a polimer adszorbensekről, a preparatív kromatográfiáról és annak tervezési módszereiről, valamint a szimulált mozgóréteges elválasztási technikákról és alkalmazási területeiről. A második egységben a szimulált mozgóréteges művelet matematikai modelljét, annak alkalmazását és az aminosav elválasztással kapcsolatos kísérleteket mutatom be. A harmadik egységben a kutatási munka eredményei alapján megfogalmazott tézisek szerepelnek. Reményeim szerint a megfogalmazott megfigyelések, tézisek hasznosak lesznek a kutatások folytatásához.

2

2. Elméleti rész 2.1 Aminosavak A szimulált mozgóréteges preparatív elválasztási műveletek a biotechnológiában is egyre szélesebb körben terjednek, például cukrok, hormonok, fehérjék és aminosavak elválasztása területén. A Veszprémi Egyetem Vegyipari Műveleti Tanszéke régebb óta végez kutatásokat fehérjehulladékok hidrolízises feldolgozása és egyedi aminosavak ipari méretű előállítási területén [1, 2, 3]. Az aminosavak általában könnyen beszerezhető, közepes árú anyagok, egyre szélesebb körben használják fel különféle iparágak intermedierként és végtermék hatóanyagként.

2.1.1 Fizikai-kémiai tulajdonságok A természetes aminosavak azonos felépítésű és eltérő szerkezetű részből állnak. Az azonos rész az -szénatom, melyhez egy aminocsoport és egy karboxilcsoport kapcsolódik. A prolin az egyetlen aminosav, amely nem tartalmaz szabad aminocsoportot. Ismeretesek még olyan nem fehérjealkotó aminosavak, amelyekben az amino- és a karboxilcsoport nem ugyanazon a szénatomon helyezkedik el, pl. L- -fenilalanin, amely gyógyszeripari intermedier vagy a amino-vajsav (GABA) [4]. Az -aminosavak általános szerkezeti képlete:

R CH H2N

COOH

2.1 ábra Az aminosavak fontosabb jellemzői:  stabil, nem illékony, fehér, kristályos anyagok  amfoter karakterű molekulák, mivel legalább egy bázikus amino- és legalább egy savas karboxilcsoportot tartalmaznak,  az -szénatom királis tulajdonságú, optikailag aktív, kivétel ez alól a glicin.

3

Az aminosavakat jellemzi, hogy szilárd kristályokat alkotnak, ezen belül még a legkisebb molekulatömegű (M=75,07) glicin is. Ez azzal magyarázható, hogy a karboxilcsoportja és aminocsoportja egymással belső sót képez, egy alacsonyabb energiaszintű ikerionos állapotba kerül, ami minden -aminosavra jellemző tiszta, kristályos formában [5]. Oldott állapotban az ikerionos forma aminosavanként más és más, jellemző pH értéken, az izoelektromos ponton alakul ki attól függően, hogy milyen az amino- és karboxilcsoportok aránya, illetve ezek disszociációs állandója. A funkciós csoportok számától függően a következők szerint csoportosíthatók az aminosavak:  monoamino-monokarbonsavak: semleges aminosavak, pH=6-7 körüli izoelektromos ponttal,  diamino-monokarbonsavak: bázikus aminosavak, pH>7 izoelektromos ponttal,  monoamino-dikarbonsavak: savas karakterű aminosavak, pH<<6 izoelektromos ponttal. Az a tulajdonságuk, hogy egy egyedileg jellemző pH értéken vannak ikerionos, kifelé elektromosan semleges állapotban, számos kromatográfiás elválasztásban kihasználható, pl. pH-gradiens ioncsere kromatográfia, izoelektromos fókuszálás. Ezen kívül az izoelektromos ponton a legkisebb az aminosavak oldhatósága, a pH-beállítás pl. a kristályos cisztin előállításának az alapja. Másik fontos jellemzőjük, hogy az aminosavak a glicin kivételével optikailag aktívak. Az élő szervezetek fehérjéi L-aminosavakból épülnek fel, és az élő szervezetekben csekély mennyiségű szabad aminosav is L-aminosav (kivétel néhány prokarióta szervezet). Az L- és D-jelölések az

-szénatom körüli abszolút konfigurációt fejezik ki, melyek az L- és D-

gliceraldehid, mint referenciamolekula felhasználásával a következő térbeli szerkezeti képletekkel írhatók le [6]:

R

R COO-

C +H3N

-OOC

H

C H

a) L-aminosav

NH3+

b) D-aminosav

2.2 ábra A vízoldhatóság függ az optikai tisztaságtól, pl. az L-fenilalanin vízoldhatósága kb. kétszeres, a racém aminosavéhoz képest, a másik aromás aminosav, a tirozin esetén a racém oldódik kb.

4

9-szeres mennyiségben, ugyanannyi vízben, mint a tiszta L-izomer (aminosavaknál általában a racém vízoldhatósága jobb). Az utóbbi években figyeltek fel arra a problémára, hogy élelmiszer-alapanyagok alkalikus kezelésekor vagy hőkezelésekor, pl. tej pasztőrözésekor minden esetben történik aminosavracemizálódás, és az így keletkezett D-aminosavak elsősorban emésztési zavarokat okoznak, az esszenciális L-enantiomerek felszívódását gátolják [7]. Hasznos alkalmazási területe a Daminosavaknak néhány D-polipeptid gyártása vagy bioszintézise, amelyek antibiotikumként baktériumok sejtfalképződését gátolják. A fehérjealkotó aminosavak és közülük néhány racém változatának fizikai-kémiai jellemzőit a 2.1 táblázatban foglaltam össze [8]. Általánosan Molekulatömeg, Izoelektromos Aminosav használt M pont, pI rövidítés L-aszparaginsav 2,98 Asp 133,1 DL-aszparaginsav 2,98 L-glutaminsav Glu 147,13 3,08 L-cisztein Cys 121,16 5,02 L-cisztin Cys-Cys 240,3 5,02 L-aszparagin Asn 132,13 5,41 L-fenilalanin 5,48 Phe 165,19 DL-fenilalanin 5,48 L-tirozin 5,63 Tyr 181,19 DL-tirozin 5,63 L-glutamin Gln 146,15 5,65 L-szerin Ser 105,09 5,68 L-metionin Met 149,21 5,74 L-triptofán Trp 204,23 5,88 L-leucin Leu 131,18 5,98 L-valin Val 117,15 6 L-alanin Ala 89,09 6,01 L-izoleucin Ile 131,18 6,02 glicin Gly 75,07 6,06 L-treonin Thr 119,12 6,16 L-hidroxiprolin Hyp 131,13 6,3 L-prolin Pro 115,13 6,3 L-hisztidin His 155,16 7,64 L-lizin Lys 146,19 9,47 L-arginin Arg 174,2 10,76

Fajlagos forgatás, 25 [ ]D +25,4° 0 +31,5° +9,7° -212° +32,6° -35,1° 0 -7,27° 0 +31,8° -6,8° +23,4° -32,15° +15,6° +26,7° +14,47° +40,6° 0 -28,6° -85° +13° +25,9° +27,58°

Vízoldhatóság 25°C-on (g/100g víz) 0,5 0,78 0,84 16,0 (20°C) 0,01 3,11 (20°C) 2,97 1,29 0,045 0,351 3,6 (20°C) 35,97 (20°C) 5,37 (20°C) 1,14 2,19 8,85 16,51 4,12 24,99 20,5 (20°C) 162,3 4,29 14,87 (20°C)

2.1 táblázat

5

Az aminosavak minőségi- és mennyiségi meghatározására alkalmas analitikai módszerek közül a legfontosabbak:  papírelektroforézis (aminosav futtatás, ninhidrines színreakció)  gázkromatográfiás (GC) elemzés (származékképzéssel) [9]  királis állófázison történő folyadékkormatográfiás elválasztás  nagyhatékonyságú

folyadékkromatográfiás

(HPLC)

elemzés

(prekolonnás

származékképzés, fordított fázisú elválasztás)  ioncserés

oszlopkromatográfiás

elemzés

(posztkolonnás

származékképzés,

színreakció) [10]. Mind az öt módszer származékképzéses technikákat foglal magába. Az ioncserés oszlopkromatográfiás módszeren alapszik az aminosav analizátor működése. A mintában lévő, esetenként 20 féle aminosav szétválasztása pH, ionerősség és hőmérséklet gradienst alkalmazva nagyhatékonyságú kationcserélő oszlopon történik. Az elválasztást követően az oszlopról már elkülönülve távozó aminosavakat ninhidrinnel teljesen elreagáltatva a színes reakciótermékeket fotometriásan detektáljuk. A ninhidrines reakció jellemző, mennyiségi meghatározásra alkalmas, a prolin kivételével kékesibolya színű, 570 nm-en detektálható terméket ad. A prolin reakciójakor a termék sárga, ez 440 nm-en detektálható. O

O R

OH OH O

O

C H

+

H2N

CH

N

COOH CO2+3H2O

R

O

O

OH

2.3 ábra Ninhidrin reakció Az aminosav analizátoros elemzési módszer specifikus, nagy érzékenységű (0,05 mol/dm3 tartomány) és nagy felbontású (20 féle fehérjealkotó aminosav tökéletes elválasztása lehetséges).

6

2.1.2 Az aminosavak előfordulása, aminosav források Az élő szervezetek fehérjéi nagyrészt glicinből és 19 különféle természetes L-aminosavból származtathatók. Néhány állati szövet (pl. agy fehérállománya), növények tartalmazhatnak kevés D-enantiomert fehérjéikben, de a baktériumok sejtfalát alkotó vázfehérje D-aminosav tartalma pár százaléknyi is lehet. Ezen kívül a nem fehérjealkotó aminosavak és származékaik száma 150…200 körül van. Szabad aminosavak csak igen kis mennyiségben, sejtközi folyadékokban találhatók az élőlényekben. Aminosavak, mint alkotó molekulák a fehérjéken kívül peptidekben, polipeptidekben (pl. hormonok) fordulnak elő. Az alábbi táblázatban néhány vázfehérje aminosav összetétele látható. A vázfehérjék egyben gyakran feldolgozóipari melléktermékekként lehetnek aminosav előállítás kiindulási anyagai.

Szárazanyag-tartalom L-aszparaginsav L-glutaminsav L-cisztin L-fenilalanin L-tirozin L-szerin L-metionin L-leucin L-valin L-alanin L-izoleucin glicin L-treonin L-hidroxiprolin L-prolin L-hisztidin L-lizin L-arginin összes aminosav a szárazanyagtartalom %-ában

Sertéssörte (keratin)

Szaru (keratin)

Kollagén

Csontliszt

90% 6,3% 13,6% 8,2% 2,1% 2,6% 7,7% 0,4% 6,4% 3,8% 4,0% 2,3% 3,7% 5,4% 7,6% 0,9% 2,9% 8,1%

95% 6,6% 12,4% 5-10% 2,8% 4,8% 7,2% 0,5% 7,5% 4,2% 4,2% 2,8% 5,1% 4,4% 4,4% 4,2% 3,4% 8,9%

60% 4,2% 9,0% 1-2% 1,8% 0,8% 0,7% 2,7% 2,3% 10,0% 0,9% 19,1% 8,4% 12,9% 0,5% 2,9% 2,9%

90% 9,3% 8,5% 2-4% 5,8% 2,2% 4,4% 1,1% 10,2% 6,8% 7,1% 0,9% 3,8% 3,5% 3,9% 5,8% 7,6% 3,6%

86,0%

83,4%

79,1%

84,5%

2.2 táblázat Az aminosavtartalom egyes hulladékfehérjék szárazanyag tartalmának %-ában

7

Jellemzően ipari aminosav forrásként használható fehérjék a sertéssörte, a csontliszt, a bőripari cserzettbőr hulladék, szaru, amelyek veszélyes hulladéknak minősülő vágóhídi, bőrgyári melléktermékek (2.2 táblázat).

2.1.3 Aminosavak felhasználása Főbb felhasználási területek:  gyógyszeripari alkalmazás,  kozmetikai-, szépségipar,  állati takarmányozás,  agrokémiai felhasználás, A fehérjék szintézise az élő szervezetekben az aminosavak koncentrációjától és az arányuktól is függ. A szintézist az esszenciális aminosavak jelenléte határozza meg. Az esszenciális aminosavakat az adott élő szervezet önmaga nem tudja előállítani, hanem külső fehérje bevitelből (táplálkozás útján) képes hozzájutni. Az ember számára ilyen esszenciális aminosav pl. a lizin, a metionin, a treonin és a triptofán. Emberi táplálék kiegészítő szerepe lehet az aminosav készítményeknek olyan esetekben, amikor például a fent bemutatott okból egyes fehérjék szintézise gátolt. Az aminosav-kombinációk előnyösebbek lehetnek a fehérjetápláléknál fenti esetekben, ugyanis a szervezetnek a bevitt fehérjéket a hasznosításhoz le kell bontania. Alkalmaznak még tápérték növelés céljából aminosav – fehérje keverék készítményeket is. Az aminosavak másik fontos tulajdonsága az ízfokozó hatás, pl. a vöröshagyma ízét az L-cisztin felerősíti. Ezt az élelmiszeriparban használják ki. Az állati, formázott takarmányhoz adott aminosav keverékek (elsősorban metionin és lizin) felhasználása többszöröse az emberi felhasználásnak. Itt a fehérje, ezáltal a húsmennyiség növekedésének intenzívebbé tétele a cél. A gyógyszeripari felhasználás nagy részét különféle infúzió oldatok készítése teszi ki, a fennmaradó rész általában gyógyszeripari intermedier, fermentációs oldatok komponense. A kozmetikai ipar előszeretettel alkalmaz aminosavakat bőr-, testápolókban, samponokban. A bőr (epidermis), mint védőréteg újratermelődését segítik, rugalmassá teszik, illetve a bőrfelületen stabilizálják a pH-t, emulziót képeznek, és így védik a külső agresszív hatásoktól. A kozmetikai termékek hatékony bőr-kompatibilis hatóanyaga a zsírsav – aminosav származékok nátriumsója, mint felületaktív anyag.

8

A mezőgazdaságban viszonylag ritkán használnak szabad aminosavakat gyomirtókban és gombaölőkben. A növekedésszabályozók blokkolásával fejtik ki hatásukat.

2.1.4 Aminosavak ipari előállításának lehetőségei Az eljárásokat három nagy csoportra oszthatjuk:  kémiai szintézis,  mikrobiológiai szintézis,  fehérjehidrolízis. Kémiai szintézissel főként glicint, DL-alanint és DL-metionint gyártanak. Aminosavak előállítására jellemzőbb módszerek a mikrobiológiai és fehérjealapú eljárások. Ma szinte bármely természetes L-aminosav előállítása lehetséges mikrobiológiai szintézissel, fermentációval. Főként L-glutaminsav és L-lizin gyártására alkalmaznak nagyhatékonyságú törzseket, de arginin, glutamin, hisztidin, i-leucin, fenilalanin, szerin, treonin, triptofán és valin L-izomerjeinek is ez az egyik használatos termelési módszere. Előnye, hogy optikailag tiszta aminosav a végtermék. Az enzimkatalitikus eljárások a mikrobiológiai eljárásokhoz hasonlóan specifikus eljárások, egy aminosavat termelő mikroorganizmus törzs aktív enzimjét használják fel szintézisre. Néha többkomponensű enzimcsaládot is alkalmaznak. Ezzel a módszerrel állítanak elő alanint, valint, metionint, fenilalanint és triptofánt. Az előállítási módszerek közül az egyik megoldás a természetben előforduló aminosavak izolálása. A legnagyobbrészt fehérjékben található aminosavakat hidrolízissel lehet kinyerni A hidrolízis attól függően, hogy mi a hidrolizáló reagens, lehet lúgos, savas vagy enzimatikus eljárás. A lúgos eljárást viszonylag ritkán alkalmazzák, mert néhány aminosav jelentős mértékben racemizálódik hidrolízis közben. Savas hidrolízis során nagyon kismértékű az optikai szennyeződés, de néhány aminosav (pl. a triptofán) érzékeny a savas közegre és hidrolízis közben elbomlik. Az enzimkatalitikus hidrolízis előnye, hogy nem jár optikai szennyeződéssel, hátránya a költségigénye. Savas és lúgos hidrolízis utáni reakcióelegy feldolgozása szűréssel és semlegesítéssel kezdődik. Ekkor nagy sókoncentrációjú aminosav, peptid-keverék oldatot kapnak. Egyes aminosavak egyedi kinyerésekor a rájuk jellemző izoelektromos pontjukat használják ki. A cisztin és a tirozin pl. pH-beállítás hatására szilárd, szűrhető kristályos anyagként kicsapódik. Más aminosavakat ioncserélő gyantával töltött oszlopon szeparálnak.

9

2.1.5 Aminosavak szorpciós tulajdonságai Aminosavakat tartalmazó oldatból történő folyadékkromatográfiás elválasztásnál a szorpciós tulajdonságok

különbözősége,

illetve

paraméterfüggése

vizsgálandó

az

elválasztás

tervezésekor. Az állófázis a fordított fázisú preparatív folyadékkormatográfiás gyakorlatban legtöbbször egy térhálósított és szabályozott pórusméretű polimer, kopolimer vagy funkciós csoport(ok)kal ellátott kopolimer gyanta. A funkciós csoporttal nem rendelkező gyantákon adszorpciós egyensúlyokkal, a gyengén savas-, ill. gyengén bázikus gyantákon (pl. a dimetilaminnal funkcionalizált gyantákon) egyidőben ioncserés és adszorpciós egyensúlyi folyamatokkal jellemezhető az aminosavak megkötődése. Ezenkívül célszerű vizsgálni még aminosav elválasztás céljára szubsztituált gyengén poláros gyantákat, pl. brómozott sztiroldivinilbenzolokat. Az adszorbens gyanták sokfélesége miatt – kémiai összetétel, polaritás, hidrofóbicitás, szemcseméret, pórusátmérő – döntő lépés a legmegfelelőbb állófázis kiválasztása. Az adszorbensválasztás első lépése, hogy azonos paraméterek mellett meghatározzuk az aminosav izotermákat a szóba jöhető adszorbenseken. Az aminosavak adszorpciós egyensúlyainak mérése adszorbens gyantákon az alábbi módszerekkel lehetséges:  Keverős üstben végzett egyensúlyi telítés Egy aminosav-törzsoldatból – ami lehet egy- vagy több komponensű – hígítással a mérni kívánt koncentráció tartományban oldatsorozatot készítünk, és minden ismert térfogatú oldathoz pontosan bemért gyantamennyiséget adunk. A gyanta hozzáadása előtt, és megfelelő ideig történő kevertetés után az oldatokból mintát veszünk, és meghatározzuk az aminosav koncentrációt. Az anyagmérleg alapján számítható, hogy mennyi aminosav kötődött meg a gyantán.  Dinamikus módszerek, oszlopkromatográfiás mérés Injektálásos módszer A retenciós térfogat és a holttérfogat hányadosából számítható az egyensúlyi megoszlási hányados, ami lineáris tartományban – kisebb koncentrációknál, ill. gyengén kötődő komponenseknél – az izoterma meredeksége. A módszer kis koncentrációknál alkalmazható előnyösen, illetve ha kis mintamennyiség áll rendelkezésre. Frontális módszer

10

Egy oszlopon különböző koncentrációjú aminosav oldatokkal végzünk frontális adszorpciós – deszorpciós méréseket. A betáplált aminosav mennyiség és a gyantaágyon átmenő aminosav mennyiség közötti különbség a megkötődött aminosav mennyisége. Ismert gyantamennyiséggel töltött oszlopon számítható az egységnyi adszorbens tömegre jutó aminosav tömeg. A módszer előnye, hogy oszlopon hajtjuk végre ugyanazzal a frontális módszerrel, mint a tervezendő preparatív elválasztást, A mérésből ezért nem csak egyensúlyi, hanem kinetikai jellemzők is meghatározhatók (pl. a deszorpció sebessége). A módszer nagy mintamennyiséget igényel és hosszú a mérési idő. Többkomponensű izotermák is mérhetők frontális módszerrel. Többlépcsős frontális módszer Oldószerrel egyensúlyban lévő oszlopra egyre nagyobb koncentráció lépcsőkben adjuk az aminosavoldatot, mindig megvárva az áttörési görbe plató-szakaszát. Előnye az egylépcsős módszerrel szemben, hogy nincs akkora kezdeti koncentrációkülönbség a betáplált oldat és az oszloppal egyensúlyban lévő oldat között (egyensúly-közeli állapot elérése gyorsabb), ill. hogy nem kell minden mérési pont után deszorpciót végezni az újabb mérés megkezdése előtt. Szintén alkalmas többkomponensű izotermák meghatározásához. Egyéb módszerek: bonyolultabb, de pontosabb eredményt adó módszerek, pl. perturbációs módszer (frontális módszer és injektálás kombinációja) [11]. Az aminosavak, peptidek, polipeptidek fordított fázisú polimer gyantákon történő adszorpciós tulajdonságait a meglévő szakirodalomban a következő jellemzők függvényében vizsgálták:  gyantatípus – adszorbeátum kombináció,  hőmérséklet,  pH érték,  oldószer-összetétel  elektrolit koncentráció. Adszorpciós egyensúlyok hőmérséklet-függése A hőmérsékletfüggés abból adódik, hogy az adszorpció hőforgalommal járó folyamat. Grzegorczyk és Carta kísérleti úton és energetikailag vizsgálták az összefüggést az adszorpciót korlátozó hő és az adszorpciós egyensúly között [12].

11

ln K T

H0 RT 2

(1)

Ahol: K – adszorpciós egyensúlyi állandó (felületre normált) (1/m2) T – hőmérséklet (K) H0 – adszorpciós hő (J/mol) Állandó H0 mellett, integrálás után a K adszorpciós egyensúlyi állandó egy preexponenciális K0 határértékkel számítható:

K

H 0 / RT

(2)

S0 / R

(3)

K 0e

A K0 tényező az adszorpció entrópiaváltozásától függ: ln K 0

A hőfelszabadulással járó adszorpciós folyamatok egyensúlya a hőmérséklet növelésére a deszorpció felé tolódik el. Ilyen esetben alacsonyabb hőmérsékleten nagyobb, a hőmérsékletet emelve egyre kisebb adszorpciós egyensúlyi állandót mérhetünk. Rodrigues és munkatársai fenilalanin adszorpciós egyensúlyát vizsgálták a hőmérséklet függvényében és ez alapján számítottak és modelleztek paraméteres szivattyúzást [13].

A folyadékfázis pH-jának aminosav adszorpcióra gyakorolt hatása Grzegorczyk és Carta igazolták, hogy az adott aminosav izoelektromos pontján mérhető a legkisebb adszorpció polimer adszorbenseken, ettől eltérő pH-kon kismértékben emelkedik a gyantafázisbeli koncentráció [12]. Az adszorpciós minimum az izoelektromos ponthoz tartozó pH-n az aminosav ikerionos állapotával hozható összefüggésbe. Ebben az állapotban a legerősebb a molekula ionos jellege (belső só), ettől pozitív és negatív irányba eltérő pH-n csökken az ionos jelleg. A folyadékfázis oldószererősségének hatása az aminosavak adszorpciójára Az oldószererősség fogalmát Snyder [14] vezette be. Fordított fázisú, hidrofób tölteteken a víz a gyenge oldószer, az oldószer molekula polaritás csökkenésével egyre erősebb az oldószer. Legtöbbször valamilyen alkoholt adnak a vízhez, ha az oldószererősség növelése a cél. A metanol- és propanolkoncentráció függvényében vizsgálva különböző aminosavakkal kapcsolatban megállapították, hogy az alkoholok, főként a kevésbé poláris propanol erősebb

12

eluáló hatást biztosítanak már viszonylag kis koncentrácóban is, így kromatográfiás alkalmazás esetén töltet-regeneráláshoz előnyös lehet alkohol gradiens alkalmazása.

Az elektrolitkoncentráció hatása az aminosavak adszorpciójára Hashimoto és szerzőtársai [15] fenilalanin adszorpcióját vizsgálták XAD-4 poliaromás gyantán a NaCl-koncentráció függvényében. A só koncentrációjának növelésével megnőtt az adszorbeált fenilalanin mennyisége, nőtt a gyanta kapacitása. Ennek magyarázata lehet, hogy elektrolitmentes vizes oldatban a fenilalanin poláris része hidratált, és az viszonylag jól oldódik. Erős elektrolit jelenléte esetén a só ionjai saját hidrát burkuk kialakításához vizet vonnak el tőle, ezért megszűnik a hidrátburok (kisózás), és ekkor a másik kölcsönhatás lesz erősebb: a polimer adszorbens gyanta és a fenilalanin aromás gyűrűi közti van der Waals kölcsönhatás. A kísérletek is igazolják ezt, ugyanis a fenilalanin, a tirozin, illetve a triptofán esetén mérhető a legnagyobb adszorpciós többlet, míg glicinnél nem tapasztalható. A sókoncentráció növelésével növekszik a megkötött aminosav mennyisége. Fenilalanin adszorpciója különböző adszorbenseken Egy adott aminosav adszorpciója különböző gyantákon igen eltérő lehet a polaritás, a hidrofób jelleg, a pórusméret és a fajlagos felület függvényében. A fenilalanin előnyös adszorpciós tulajdonságok vizsgálatára, mert a fenilalanin molekula részben apoláris, részben poláris részt tartalmaz. Kémiai összetétel alapján a legelterjedtebbek az etilvinilbenzol-divinilbenzol és a sztiroldivinilbenzol kopolimer gyanták (pl. XAD-4, XUS-43444). Léteznek továbbá a szénhidrogén polimerláncokon enyhén poláris csoportokat

tartalmazó (brómozott, klórmetilezett)

adszorbensek is (XUS-43493, 40285 és 43444). A tisztán adszorpciós, hidrofób gyanták közül a XAD-4-en kötődik legjobban a fenilalanin, a gyengén hidrofil gyanták közül és az összes vizsgált gyantát is tekintve a legnagyobb fajlagos felülettel rendelkező XUS-43444 a legnagyobb kapacitású fenilalaninra nézve [12]. Megállapítható, hogy a legnagyobb adszorpciós kapacitást fenilalaninra a fenilalaninhoz kémiai szempontból „hasonló”, tehát gyengén poláris gyanták mutatják.

13

2.2 A folyadékkromatográfia elméleti áttekintése 2.2.1 Történeti áttekintés A kromatográfia az elválasztási műveletek családjába tartozik, melynek során egy többkomponensű áramlásban lévő fluid fázisból választunk szét egyedi komponenseket vagy többkomponensű frakciókat az elválasztáshoz megosztó fázist (másnéven állófázist, oszlopot vagy vékonyréteget) felhasználva. A kromatográfiát eleinte különféle anyagok minőségi kimutatására használták, felfedezése Cvet nevéhez fűződik, aki növények zöld- és sárga színanyagát választotta szét kalcium-karbonát töltetű oszlopán. Az analitikai kromatográfia széleskörben használt, mennyiségi meghatározásra alkalmas módszercsalád, amely nagyon sok módszert foglal magába (HPLC módszerek, IC, GC és csatolt technikák). A preparatív folyadékkromatográfia célja nagytisztaságú és/vagy nehezen elválasztható anyagok előállítása. Az analitikai kromatográfia a preparatív művelet paramétereinek számításánál és optimálásánál a számítógépes modellezés mellett ma is fontos tervezési tényező, a méretnövelési számításokhoz fontos mérési adatokkal szolgál. A preparatív folyadékkromatográfia csoportosítható aszerint, hogy szakaszos vagy folyamatos műveletről van-e szó. A szakaszos preparatív kromatográfia hátránya, hogy elég nagy műveleti holtidőkkel kell számolni, az elválasztásra fordított műveleti időt általában regenerálási műveleti időnek kell követni. Más megközelítésban a szakaszos kromatográfiában az adszorbens csak kismértékben kihasznált a művelet egésze során. Ezért többféle folyamatos eljárást fejlesztettek ki, mint például a forgógyűrűs kromatográfia, a recirkulációs egyoszlopos kromatográfia és a szimulált mozgóréteges folyadékkromatográfia.

2.2.2 A kromatográfia alapfogalmai

A kromatográfiás módszerek olyan dinamikus elválasztási módszerek, amelyek egymáshoz fizikai-kémiai tulajdonságaikban nagyon hasonló anyagok minőségi és mennyiségi elválasztására alkalmasak. 15

Az elválasztás a komponenseknek az álló és a mozgó fázis között létrejövő eltérő megoszlása következtében valósul meg.

KA

[q A ]* [c A ]*

(4)

Ahol: KA – az A komponens megoszlási hányadosa [cA]* - az A komponens egyensúlyi koncentrációja a folyadékfázisban [qA]* - a A komponens egyensúlyi koncentrációja az állófázison A és B komponens kromatográfiásan elválasztható egymástól, ha az adott folyadékfázis – állófázis rendszerben a megoszlási hányadosuk eltér egymástól: KA

KB

Az oszlopkromatográfia fontos dinamikus jellemzője az elméleti tányérszám (Number of Theoretical Plates, NTP), amely megmutatja, hogy a teljes oszlophosszon az álló- és mozgófázis közötti megoszlás elméletben hányszor megy végbe. Az elméleti tányérmagasság (Height of Equivalent Theoretical Plates) az oszlophossz és az elméleti tányérszám hányadosa. Minél kisebb az elméleti tányérmagasság, annál hatékonyabb lehet az elválasztás. Az NTP és a HETP jellemző az oszlopra (töltetre), ill. egyedileg az adott komponensekre, és az áramlási sebesség függvénye. A

nagyhatékonyságú

folyadékkromatográfia

(High

Performance

Liquid

Chromatography, HPLC), olyan oszlopkromatográfiás módszer, amelyben a töltet 3…100 m szemcseátmérőjű, az oszlop nagy elméleti tányérszámmal jellemezhető, így hatékonyabb a komponensek szétválasztása. A HETP optimális körülmények között tapasztalati képlet (5) alapján a töltet szemcseátmérőjének körülbelül kétszerese, de az áramlási sebesség növelésével nő, miközben NTP csökken.

HETP

2 dp

(5)

Ahol: dp – a töltet átlagos szemcseátmérője

Oszlopkromatográfiás alapfogalmak A retenciós idő a kromatográfiás oszlopon való áthaladáshoz szükséges idő, amely adott rendszerben ugyanazon paraméterek mellett a komponensre jellemző időadat, két részből tevődik össze: 16

tR

t0 t N

(6)

Ahol: tR – bruttó retenciós idő – az az időtartam, mely az injektálástól a komponesnek az oszlop kimenetén való megjelenéséig eltelik t0 – holtidő (az oszlop összes ürestérfogatából származó tartózkodási idő) – az oszlop összes ürestérfogata az oszlop teljes térfogatának és az összes porozitásnak a szorzata, az összes porozitás a töltet szemcsék közötti és a szemcséken belüli porozitás összege tN – a vizsgált komponens adszorbensen való tartózkodásának ideje A VN nettó retenciós térfogat azt a mozgófázis térfogatot jelenti, amely az elválasztandó komponenst a kromatográfiás oszlopon éppen eluálja. Tekintettel arra, hogy az eluensnek fel kell tölteni az oszlop összes ürestérfogatát is (V0) – mely tartalmazza a szemcsék közötti ürestérfogatot és a töltetszemcséken belüli pórustérfogat értékét, definiálható egy úgynevezett bruttó retenciós térfogat: VR

t0 F t N F

V0 VN

(7)

Ahol: F – a mozgófázis áramlási sebessége A retenciós időre vonatkozó összefüggést a retenciós tényezővel vagy másnéven kapacitási tényezővel is felírhatjuk:

tR

t0 k , t0

t0 (1 k , )

(8)

Ahol: k’ – retenciós (kapacitási) tényező A retenciós (kapacitási) tényező megmutatja, hogy a nettó retenciós idő hányszorosa az ürestérfogatból származó holtidőnek, tehát a töltet és az adott komponens kölcsönhatására jellemző érték. Két komponens akkor választható el könnyen egymástól, ha kapacitási tényezőik egymástól minél nagyobb mértékben térnek el. A két komponens ugyanazon tölteten mérhető kapacitási tényezőinek hányadosa mutatja meg a rendszer szelektivitását.

ki

,

t R ,i t 0

VR ,i V0

t0

V0

(9)

17

1 2

k1

,

t R ,1 t 0

k2

,

t R,2

t0

(10)

Ahol: i – komponens index 1 – jobban kötődő komponens indexe 2 – kevésbé kötődő komponens indexe 1 2

– szelektivitási tényező

A kromatográfiás oszlop hatékonyságának jellemzője, hogy egy gyakorlatilag nem adszorbeálódó jelzőanyag injektálása milyen tartózkodási idő válaszfüggvényt eredményez, azaz a kromatográfiás sávok (csúcsok) milyen szélesek. A sávszélesedés segítségével definiálható az oszlop hatékonyságára jellemző érték, az elméleti tányérszám. Az elméleti tányérszám meghatározása azon a feltételezésen alapul, hogy a rendszer a Dirac- delta bemenetre Gauss- féle eloszlású kimenettel válaszol: NTP

tR

2

(11)

– a kromatográfiás csúcs sávszélessége

Ahol:

Az elméleti tányérmagasság:

HETP

L NTP

(12)

Az elméleti tányérmagasság áramlási sebességtől való függését a van Deemter egyenlet írja le:

HETP

A

B v

Cv (13)

Ahol: A, B, C: állandók: A

2×dp az örvénydiffúziós koefficiens

B – axiális diffúziós hatást figyelembevevő koefficiens C – kinetikai tényező v – a mozgófázis lineáris áramlási sebessége.

18

Az adszorpciós folyadékkromatográfia elmélete, izotermatípusok Az

adszorpciós

folyadékkromatográfia

esetén

a

folyadékfázisban

jelenlévő

komponensek és a porózus szilárd fázis aktív helyei között másodlagos kötőerők létesülnek. A szilárd fázist adszorbensnek, a megkötött molekulákat adszorbeátumnak nevezzük. Amennyiben egy edényben adszorbenst adunk egy egykomponensű oldathoz, az adszorbeátum és az oldott molekulák egyensúlya egy bizonyos idő után beáll, tehát ugyanannyi szolvatált molekula adszorbeálódik, mint amennyi adszorbeált molekula deszorbeálódik. Az adszorpció egyensúlyának leírására izotermákat használunk.  Lineáris izoterma Lineáris izotermának nevezzük az olyan összefüggést, amelyben a vizsgált komponens adszorbensbeli és fluidfázisbeli koncentrációja között lineáris a kapcsolat: qk

K k ck

(14)

Ahol: qk – a k-adik komponens koncentrációja az adszorbensben, ck – a k-adik komponens koncentrációja a fluidfázisban, Kk – a k-adik komponens megoszlási hányadosa. A lineáris összefüggés általában a valós rendszerekre csak nagy körültekintés mellett használható, mert általában csak kis koncentrációknál érvényes.  Langmuir - izoterma Az alábbi, gázokra és folyadékokra is általánosan érvényes adszorpciós izotermaegyenletet Langmuir (15) vezette le a következő egyszerűsítéseket feltételezve: Minden aktív centrum egy részecskét köt meg, az adszorpció legfeljebb monomolekuláris réteget alkothat a felületen. Az adszorbeált molekulák között nincs kölcsönhatás. Az adszorbens felületén adott számú, energetikailag egyenértékű aktív centrum található. Az adszorpciós réteg és az adszorbeálandó komponens között dinamikus egyensúly van. A Langmuir - egyenlet matematikai alakja:

19

qk

ak ck 1 bk c k

(15)

Ahol: ak, bk – a k-adik komponens ún. Langmuir – állandói, qk – a k-adik komponens koncentrációja az adszorbensben, ck – a k-adik komponens koncentrációja a fluidfázisban. A Langmuir-féle izoterma típus sok esetben jól alkalmazható folyadékfázisban nagyobb

koncentrációban

oldott

komponens

szilárd

fázison

történő

adszorpciójának leírására is.  „Bi - Langmuir" - izoterma Előfordulhat, hogy az adszorbens felületén elhelyezkedő aktív centrumok nem tekinthetők energetikailag egyenértékűnek. Ilyen eseteknél szokás alkalmazni ezt a fajta izotermatípust, amely két adszorpciós szempontból eltérő aktív centrummal rendelkező felületet feltételez. A modell így a két független részizoterma összege lesz:

qk

a1k ck 1 bk1 ck

ak2 ck 1 bk2 ck

(16)

Ahol: a 1k , a 1k , bk2 , bk2 : a Langmuir - egyenletek állandói, qk

-

a k-adik komponens koncentrációja az adszorbensben,

ck

-

a k-adik komponens koncentrációja a fluidfázisban.

 Versengő Langmuir - izoterma Az

egykomponensű

rendszerekre

vonatkozó

Langmuir

-

izoterma

többkomponensű rendszerekre való kiterjesztésével kaphatjuk meg ezt az izotermatípust: ak ck

qk

N

1

bjc j j 1

(17)

Ahol: ak, bk – az egykomponensű izoterma állandói, N – a komponensek száma. Ezt az izoterma-egyenletet akkor alkalmazzuk, amikor több komponens nagyobb koncentrációban van jelen a folyadékfázisban, hasonló mértékben kötődnek a szilárd fázison, és ezért a komponensek egymás adszorpcióját is befolyásolják, ugyanis az adszorbensen lévő aktív centrumok száma véges. 20

Preparatív folyadékkromatográfiás műveletek összehasonlítása A preparatív folyadék kromatográfiás műveleteket üzemvitel szerint szakaszosként ill. folyamatosként csoportosítjuk. A szakaszos üzemvitelű kromatográfiában injektálás, termékelvétel, regenerálás munkafázisokkal dolgozunk. Egy folyamatos üzemű berendezésben ezek a részfolyamatok hely szerint differenciáltan, de időben folyamatosan játszódnak le. Ahhoz, hogy folyamatossá tudjuk tenni a műveletet, első közelítésben szükség van az adszorbensnek a betáplálás pontjához képest történő relatív elmozdulására. Álló fázis

Mozgó fázis

A

A+B

B

2.4 ábra

Folyamatos ellenáramú kromatográfia elve

A folyamatos preparatív folyadék kromatográfiával a következő előnyöket érjük el:  Nagyobb termelékenység: nincs vagy elhanyagolható a műveleti holtidő.  Fázisok recirkulációja 

jó fajlagosok, tehát jó adszorbens- és oldószer

kihasználtság.  Nagy kihozatalok, kis komponensveszteségek: a komponensek koncentrációsávjainak átlapolásából nincs veszteség, ugyanis a termékeket folyamatosan vesszük el a rendszer azon részeiről, ahol tiszta komponensek vannak.  Nagyobb termékkoncentrációk: a nagyobb koncentráció miatt a termék további feldolgozásához

(kristályosítás,

bepárlás,

vákuumbepárlás)

kisebb

energiaráfordítást igényel.  Ha szakaszos kromatográfiát tervezünk, az ott megkapott paraméterek könnyen átvihetők a folyamatos kromatográfiára. A 2.4 ábrán is látható, hogy a folyamatos ellenáramú műveletek elsősorban két komponens szétválasztására alkalmasak, de megoldható az is, hogy többkomponensű

21

rendszerből egy célkomponenst izoláljunk a többitől, vagy többkomponensű, de hasonló tulajdonságú frakciókat vegyünk el. Ahhoz, hogy eldöntsük, az adott elválasztási művelethez szakaszos vagy folyamatos üzemű berendezést alkalmazzunk, látni kell a folyamatos kromatográfia hátrányait is:  Nagyon érzékeny a műveleti paraméterek megválasztására.  Alapvetően két termékes művelet (két termékelvétel lehetséges egyidőben, folyamatosan).  Magasabb beruházási költségekkel számolhatunk, ugyanis több oszlop, több szivattyú, több szerelvény kell és szinte elengedhetetlen, hogy automatizált legyen a rendszer.

2.2.3 Folyamatos preparatív folyadékkromatográfiás műveletek, szimulált mozgóréteges preparatív folyadékkromatográfia Az adszorbens fázis folyadékáramláshoz viszonyított relatív elmozdulására a legelső megoldás az ún. forgógyűrűs kromatográf (Rotating Annular Chromatograph) volt. Ezzel az elrendezéssel a fluid fázis és a forgó mozgást végző gyűrű geometriájú szilárd fázis között keresztáram érhető el. Többkomponensű szétválasztásra is alkalmas. Ellenáramú eljárással a létező adszorpciós kapacitás még jobb kihasználtsága érhető el. Ezt az adszorbens fázis folyadékárammal szembeni tényleges mozgatásával (True Moving Bed, TMB), vagy egy sorba kapcsolt oszloprendszer meghatározott időközönként a betápláláshoz képest történő relatív elforgatásával érhetjük el. Az utóbbi eljárást szimulált mozgóréteges (Simulated Moving Bed, SMB) kromatográfiának nevezzük. A TMB (2.5a ábra) egyoszlopos ellenáramú eljárás, az állófázis az oszlopon belül a gravitációs erőhatás következtében folyamatosan csúszik lefelé. A szilárd fázis oszlop tetejére történő vezetésével kapcsolatos problémák miatt nem terjedt el széleskörben, főként petrolkémiában alkalmazzák. (TMB adszorber).

22

Rec

Rec CM

IV

R

III

F

II

IV

R

III F

E

II E

I I

a)

D A Rec

D

S

Eluens S+Rec

S

b)

S+Rec

2.5 ábra a) TMB, b) SMB I, II, III, IV – zónák vagy másnéven szegmensek, F – szétválasztandó minta betáplálás (továbbiakban feed), E – extraktum a jobban kötődő komponensben dúsítva, R – raffinátum a kevésbé kötődő komponensben dúsítva, D – eluens (deszorbens), S – friss eluens, Rec – recirkulált eluens, A Rec – adszorbens visszavezetés, CM – oszlopok relatív elmozdulása

Kevesebb technikai akadály és jobb megvalósíthatóság jellemzi a TMB-hez hasonló működési elvű SMB-t (2.5b ábra). A szimulált ellenáramot sorbakapcsolt fixágyas oszlopokon hozhatjuk létre úgy, hogy valamilyen műszaki megoldással adott időközönként megfelelően cseréljük az egyes oszlopokra menő betáplálási és az oszlopokról távozó elvételi folyadékáramokat [16]. Az SMB működési elve A szimulált mozgóágyas kromatográf (SMB) alapvetően a valós mozgóágyhoz (TMB) hasonlóan működik.

23

Adszorbens

Raffinátum

Feed

Extraktum

Friss eluens

2.6 ábra TMB a folyadékáramokkal és a szilárd fázis (adszorbens) mozgási irányával A TMB működésének rövid leírása: egy oszlopon folyamatosan, felülről lefelé egyenletesen mozgó adszorbensen alulról felfelé ellenáramban halad a folyadékfázis. Az oszlop oldalán, középen az A és B komponenst tartalmazó minta bemenő áram (feed), az oszlop oldalán fent a raffinátum elvétel, alul az extraktum elvétel csonkja van. Az oszlop legalján friss eluens betáplálás helye, legfelső pontján a regenerált eluens elvétel helye található (2.6 ábra). Megfelelő adszorbens mozgatási sebesség, megfelelő eluens, feed, extraktum és raffinátum térfogatáramok, ezáltal megfelelő zónánkénti térfogatáramok alkalmazásával kialakul egy olyan stacioner állapot, amelyben az A és B komponens koncentrációprofiljai az oszlopon belül állandósulnak. A jobban kötődő B komponens a mozgó fázis haladási irányát tekintve az oszlop elején, a kevésbé kötődő A az oszlop végén helyezkedik el. Ez lehetővé teszi, hogy folyamatosan kapjuk a két tiszta komponenst az extraktumban, ill. a raffinátumban. Az SMB működése ettől annyiban tér el, hogy a TMB zónáinak megfelelő SMB zónákban egy vagy több fix töltetágyas oszlop van sorbakapcsolva, a töltet mozgását a térfogatáramok adott időközönkénti elmozdításával „szimuláljuk” (erre többféle technikai megoldás létezik). Különbség tehát, hogy SMB esetén nem folytonos a szilárd fázis mozgatása, hanem ún. „szimulált mozgatás” történik, ezért az oszlopokon a 24

koncentrációprofilok sem állandóak, de kvázi-stacionárius állapotban, egy-egy taktus azonos időpillanatához tartozó oszlopprofilok megegyezőek. Ha egy olyan SMB készüléket tekintünk, amely minden egyes zónájában 1 oszlop van, akkor a következő folyamattal írható le a működése: taktusváltáskor az első zóna oszlopa kerül a negyedik zónába, a negyedik a harmadikba, a harmadik a másodikba és a második az első zónába. A koncentrációprofil a taktusváltások között folyamatosan változik, a komponensek ilyenkor a folyadékfázissal egy irányba haladnak. Az állófázis viszont csak adott időközönként, taktusidőnként mozdul el a mobil fázis áramlási irányával ellentétes irányba. Minél több oszlopot tartalmaz az SMB-LC, tehát egy zónára minél több oszlop jut, és minél rövidebb a taktusidő, annál inkább hasonlít egy valós mozgóágyhoz, viszont a gyakorlatban egyre inkább törekednek a minél kevesebb oszloppal megvalósítható SMB elválasztások megvalósítására.

Zárt és nyitott SMB folyadékkromatográf A zárt, 4 zónás SMB kromatográfban megvalósul mind a folyadékfázis, mind a szilárd fázis regenerálása és recirkulációja. Vannak nyitott négyzónás megoldások, ahol szintén megvalósul mindkét fázis regenerálása, de a folyadékfázist inkább összegyűjtik és más technológiában hasznosítják vagy feldolgozás (pl. desztilláció) után vezetik vissza a folyamatba. Ez akkor lehet előnyös, ha a folyadékfázis többkomponensű és valamelyik oldószerkomponens adszorpciója nem elhanyagolható, ami azt eredményezi, hogy a regenerált folyadékelegy összetétele akár kismértékben is megváltozik a betáplált folyadékelegyéhez képest. (A folyadékelegy alatt itt az SMB deszorbenst, másnéven eluenst értjük, ami sok esetben megegyezik vagy legalábbis összetevőiben megegyezik a szétválasztandó komponensek oldatát képező oldószerrel). Négyzónás SMB-ben a IV-es zóna feladata, hogy a kevésbé adszorbeálódó komponenst visszatartsa, és a zóna végén távozó folyadékban csak oldószerkomponensek távozzanak. Ha a kevésbé kötődő komponens olyan kismértékben adszorbeálódik, hogy csak nagyon kevés oldószert tudunk regenerálni a IV-es zónán, ill. ha az oldószer pl. víz, akkor háromzónás SMB-t célszerűbb alkalmazni. Ekkor a raffinátum az SMB harmadik zóna végén távozik. A háromzónás nyitott SMB előnyei: A IV-es zóna hiánya leegyszerűsíti a műveletet, ezért sokszor eredetileg négyzónásra tervezett művelet háromzónásra történő egyszerűsítésével csökkenthető a tervezési feltételek száma és lényegesen növelhető a termelékenység. 25

Az utolsó zónából kilépő folyadékáram nem kerül vissza a friss oldószer áramba (nincs folyadékrecirkuláció), az extraktum áramban nyert komponens tisztasága könnyebben biztosítható.

Eluens

Eluens

E

I

IV

E

I

II

III

R

II

F

a)

III

R

F

b)

2.7 ábra

a) 4 zónás zárt kör, b) 3 zónás nyitott kör fehér nyíl: szilárd fázis szimulált mozgásának iránya fekete nyíl: folyadékfázis áramlási iránya

Az

SMB

preparatív

folyadékkromatográfia

műveleti

paramétereinek

meghatározása A megfelelő hatásfokú elválasztáshoz – tiszta A és tiszta B komponens kinyeréséhez pontosan

meghatározott

és

pontosan

beállított

zónánként

eltérő

folyadék

térfogatáramokra és taktusidőre van szükség. Az SMB paramétersor meghatározáshoz és optimáláshoz kapcsolódó módszereket a kezdetekben – Guiochon [17, 18], Seidel-Morgenstern [11, 19] és Morbidelli vezetésével – három nagynevű kutatási csoport dolgozta ki. A betáplálási (eluens – D, szétválasztandó mintabetáplálás – F) és elvételi (extraktum – E, raffinátum – R) térfogatáramokat és a taktusidőt legegyszerűbben Morbidelli és társai által kidolgozott, lineáris adszorpciós egyensúlyon alapuló elmélet alapján tudjuk meghatározni [20]. A módszer független adszorpció mellett lineáris izotermákat feltételez. A térfogatáramokkal, az oszlophosszal és az összporozitással felírt Morbidelli paramétereknek meg kell felelniük az egyes zónákra jellemző kritériumoknak. Egy 26

kiindulási tervezési paraméterrel (pl. taktusidő) a többi számítható a kritériumok figyelembevételével. Az így kapott értékek egy kísérleti laboratóriumi mérésben, a kezdeti paraméter meghatározáshoz mindenképpen alkalmasak. A Morbidelli módszer levezetésének bemutatásától itt eltekintünk. Lényege, hogy az SMB zónáira egy meghatározott taktusidő és a komponensek egyensúlyi megoszlási hányadosa (lineáris egyensúly) alapján a komponensek mozgási sebességét meghatározva olyan, zónánként különböző térfogatáramokat kell meghatározni, melyek szerint: a) az I-es zónából a jobban kötődő komponens (továbbiakban A komponens) a taktusidő vége előtt teljesen távozik b) a II-es zónából a kevésbé kötődő komponens (továbbiakban B komponens) a taktusidő vége előtt maradéktalanul távozik c) a III-as zóna végén az A komponens nem tör át d) a IV-es zóna végén a B komponens nem tör át A 2.5 b) ábra jelöléseit alapul véve a négyzónás SMB térfogatáramai a következők: –

I. zóna:

D

–

II. zóna:

D-E

–

III. zóna:

D-E+F

–

IV. zóna:

D - E + F - R.

A fenti, a) b) c) d) feltételeket tekintve az egyes zónákra az alábbi Morbidellikritériumok írhatók fel: I-es zóna:

mI

D T L Af L (1

)

KA

(18)

Ahol: mI – I-es zónára vonatkozó Morbidelli-paraméter T – taktusidő L – oszlophossz Af – oszlopkeresztmetszet E – összporozitás KA – A komponens egyensúlyi megoszlási hányadosa

27

II-es zóna:

KB

D E T L Af L (1

KB

KA

)

mII

KA

(19)

Ahol: mII – II-es zónára vonatkozó Morbidelli-paraméter KB – B komponens egyensúlyi megoszlási hányadosa III-as zóna:

KB

D E Af

F

T L

L(1

KA

)

(20)

IV-es zóna:

mIV =

( D E F R) Tl Af L (1

)

L KB

(21)

Ezek a feltételek szükségesek ahhoz, hogy egy kétkomponensű „A”, „B” elegyet tiszta „A” és „B” komponensekre tudjunk elválasztani abban az esetben, ha független adszorpcióról van szó és az adszorpciós izotermák lineárisak. Az mII-mIII II-es és III-as zónára vonatkozó Morbidelli koordináta rendszerben meghatározható az a terület, ahol az SMB tökéletesen működik, tehát mindkét termék tiszta. Ez a Morbidelli féle háromszög lineáris adszorpciós izotermák és független adszorpció esetén (2.8 ábra).

28

2.8 ábra

Háromzónás SMB készülék esetén az mII-mIII terület megegyezik a négyzónás SMB-nél számított területtel, de háromzónás esetben oldószert nem regenerálunk, ezért m IV paramétert nem kell számítani. Az SMB műveleti paramétereinek tervezése Langmuir-típusú izotermákkal

Migliorini és Morbidelli [21] továbbfejlesztették módszerüket olyan szétválasztásokhoz, amelyekben nem elhanyagolható az izotermák nagyobb koncentrációkhoz tartozó nemlineáris tartománya. Kompetitív Langmuir-izotermákból indultak ki. A következő definíciót adták a betáplált szátválasztandó minta koncentrációjától függő Morbidelliháromszög területére: a w-b, w-r, r-a és a b-a szakaszok által meghatározott terület, ahol a betűjelek a szakaszok végpontjait jelentik. Az a pont az mII – mIII koordináta rendszerben a (KA;KA) koordinátájú pont, a b pedig a (KB;KB). Az r és w pontok koordinátái (22, 23) az alábbi másodfokú egyenletrendszerből számíthatók (24):

29

2 G

r

KA

w

(1 bAcA

F

;

G

(K A

KB G ; KA F

b Bc B )

G

2

[

G

F

)(K A K B ) K B K A K B (K A F)

(K A K B ) K B (K B K B (K A F) F

G

(K A

G

F

)]

(22)

)]

F

[K A (1 bBcB ) K B (1 bAcA )] G

G

(23)

KAKB

0

(24)

0

Ahol: cAF, cBF – szétválasztandó minta koncentrációi (mg/cm3) A és B – a komponens index Az így számított tiszta extraktum – tiszta raffinátum terület a koncentráció növelésével egyre csökken, így szűkül azoknak a paraméterkombinációknak a száma, amelyek mellett tiszta termékeket kapunk.

2.9 ábra A betáplálási koncentráció hatása a Morbidelli-kritériumokra és a Morbidelli-területre. A koncentráció növelésével csökken a tiszta extraktum – tiszta raffinátum területe. Ha a szétválasztandó oldat betáplálási térfogatárama 0, akkor az mII – mIII diagram átlóján van az SMB munkapontja. Ha csak a szétválasztandó oldat betáplálást növeljük, akkor az mII – mIII diagramon függőlegesen felfelé mozdulunk el. Látszik, hogy nagyobb koncentrációknál kisebb a lehetőség úgy növelni a betáplálást, hogy a tiszta extraktum – tiszta raffinátum területen belül maradjunk.

30

SMB nevezéktan

A korábbi fejezetekben bemutatott zónák, vagy más néven szegmensek tagolják három, négy, öt, nyolc, kilenc vagy 12 egymástól eltérő funkciójú szakaszra a többoszlopos kromatográfiás rendszert. A zónák sorszáma római számmal írandó, így a konvencionális SMB esetén az I. zóna az oszlopregeneráló zóna, a II. és III. zónák a két komponens elválasztásáért, a IV. az eluens regenerálásért felelősek. A zónák számától és az egyes zónákba jutó oszlopok számától függően különféle oszlopkonfigurációkról beszélünk. Az oszlopkonfiguráció szokásos jelölése: az első zónával kezdve az oszlopok száma arab számokkal történik, az egyes zónákhoz tartozó oszlopszámokat kötőjellel választjuk el egymástól. Pl. egy háromzónás, 6 oszlopos készülék egyik lehetséges oszlopkonfigurációja: 2-2-2. Négyzónás üzemmódban a 6 oszlopos készülék pl. így is működtethető: 1-2-2-1. Abban az esetben, amikor valamely SMB zónából a regenerált oldószert visszavezetjük valamely oszlopregeneráló zónába, zárt körű SMBről beszélünk. Ha nincs az oszloprendszerben recirkuláció, nyitott körű SMB a helyes megnevezés. A betáplálási- és elvételi térfogatáramok betűjelei: az extraktum betűjele E (extract), a raffinátumé R (raffinate). Az eluens, vagyis a töltet regeneráló oldószer jele D (desorbent), megkülönböztetve így az extraktum jelölésétől. A minta (szétválasztandó oldat, feed) F betűvel jelölendő. A folyadék recirkuláció jele: Rec (recirculation). Amennyiben nem recirkuláltatott, de a IV. zónában regenerált oldószerről van szó, azt LRout (liquid regeneration output) rövidítéssel azonosítjuk. A fluidum betáplálási- és elvételi pontjainak léptetési idejét taktusidőnek (jele: T), vagy ritkábban periódusidőnek nevezzük. Ciklusidő az az időtartam, amely alatt a betáplálásiés elvételi pontok újra eljutnak a kezdeti betáplálási- és elvételi oszlopokhoz (amikor egy teljes kört tesz meg a rendszer). A ciklusidő egyenlő a taktusidő és az SMB oszlopszám szorzatával. Ez az alfejezet a továbbiakban leggyakrabban használt kifejezések bemutatását szolgálta. Összefoglalva kijelenthető, hogy az SMB elválasztások az elválasztástudományok jelenleg is dinamikusan fejlődő ágát képviselik, így folyamatosan új jelölésekkel és kifejezésekkel bővül.

31

Továbbfejlesztett SMB technikák Ebben az alfejezetben olyan SMB-üzemmódokról lesz szó, amelyek az előzőekben tárgyalt klasszikus SMB-üzemviteltől eltérnek, de véghezvihetők a hagyományos SMB készülékeken. Eleinte a korábban már említett módon, a zónánkénti oszlopszám növelésével, illetve különböző oszlopkonfigurációkkal próbáltak gazdaságosabb üzemvitelt elérni, de az oszlopszám növelése a nyomásesés növekedésén túl beruházási költségnövelő tényező is. Ezért a továbbiakban 4 vagy 6 oszlopos készülékeken speciális műveleti megoldásokat fejlesztettek ki, amelyek közül a négy legfontosabb:  A betáplálási- és elvételi térfogatáramok taktuson belüli változtatása,  Oldószergradiens alkalmazása,  ModiCon-folyamat (feed-koncentráció változtatás),  VariCol-folyamat.  A térfogatáramok változtatása: a hagyományos SMB műveleti megoldáshoz képest a különbség az, hogy taktuson belül, tehát két oszlopváltás között a térfogatáramok a készülékben valamilyen függvény szerint megváltoznak. Ezt úgy valósítják meg, hogy a kapcsolási periódus alatt a betáplálási- (feed, eluens) és elvételi (extrakt, raffinát) pontokon keresztül bevitt, illetve elvett mennyiségek a hagyományos

módnál

bevitt-

és

elvett

mennyiségekkel

összességében

megegyeznek, de időben nem állandóak, hanem lépcsősfüggvény szerint változnak. Ezt a módszert Kearney és Hieb [22] 1992-ben szabadalmaztatta, melyen keresztül a terméktisztaság, illetve a termelékenység növekedése érhető el csökkenő oldószerfelhasználás mellett. Ezzel azonos elvet követett Kloppenburg és Gilles [23], akik egy ipari elválasztófolyamat jelentős javulását érték el a kapcsolási intervallumokon belül megváltozó térfogatáramok dinamikus optimalizációján keresztül. Az utóbbi időben került technikai megvalósításra két olyan új üzemvitel is, amelyek kizárólag a szétválasztandó oldat térfogatáramának változtatásán keresztül értek el a hagyományos műveletnél jobb teljesítmény-mutatókat. Egy ilyen műveleti megoldást javasolt Morbidelli és Mazotti [24], egy másikat pedig Zang és Wankat [25].

32

 Oldószergradiens: 1995-ig az SMB-vel történő szétválasztások esetén csaknem kizárólag klasszikus izokratikus üzemvitelt alkalmaztak, tehát a feed- és friss eluensárammal azonos erősségű oldószert juttattak a rendszerbe. Az oldószerek erőssége az oldószer adszorpciós energiájával van összefüggésben. Ezt az erősséget az ún. Snyder-féle paraméterrel ( 0) szokás megadni. Az alábbi táblázatokban néhány – a gyakorlatban is előforduló – oldószer paraméterei láthatók alumíniumoxid, illetve szilikagél adszorbens esetén. n-pentán

0

etilacetát

0,58

széntetraklorid

0,18

acetonitril

0,65

kloroform

0,40

etanol

0,88

aceton

0,56

metanol

0,95

2.4 táblázat: 0 értékek alumínium-oxid adszorbensre vonatkozóan n-pentán

0

n-hexán

0,01

ciklohexán

0,03

etilacetát

0,38

2.5 táblázat: 0 értékek szilikagél adszorbensen Normál fázisú töltetnél (pl.: szilikagél, alumínium-oxid, poláris fázisok) az gyenge oldószernek és az

0

0

0 számít

1 erősnek. Fordított fázis (C4-, C8-borítású szilikagélek,

apoláris fázisok) esetén pedig fordítva. Ez utóbbinál a víz –, mint legpolárisabb komponens – a leggyengébb oldószerként értelmezhető. Az SMB működésének bemutatásánál már említésre került, de itt még egyszer utalnánk az I. és IV. zóna szerepére, mely a megfelelő terméktisztaságokhoz elengedhetetlen. Míg az I. zónában a szilárd fázisnak tökéletesen regeneráltnak kell lennie, vagyis a komponenseket deszorbeálni kell az adszorbens felületéről, addig a IV. zónában az eluens fázis tökéletes regenerálása, vagyis a komponensek adszorpciója a feladat. A komponensek adszorpciós-deszorpciós tulajdonságait az adszorpciós izotermák befolyásolják, melyek viszont – többek között – az oldószer erősségétől függnek. Ez a gondolatsor vezetett ahhoz, hogy a friss eluensáram és a szétválasztandó minta árama különböző erősségű oldószert tartalmazzon, melyen keresztül a zónák működésbeli különbségét még inkább javítani lehet. Az erősebb oldószer a deszorpciót-, a gyengébb

33

pedig az adszorpciót növeli. Tehát ha friss eluensként egy erősebb oldószert alkalmazunk, akkor az I. zóna az erősebb oldószer hatására könnyebben regenerálódik, a II. zónában pedig ezzel az erősebb oldószerrel történik az elválasztás, ami a B komponens közel maximális deszorpcióját eredményezi. A III. zónába már gyengébb oldószer áramlik, a II. és III. zóna között belépő minta ugyanis gyengébb oldószerben van oldva, ami az amúgy is erősen kötődő A komponens jobb adszorpcióját eredményezi. A IV. zónában aztán ez a gyengébb oldószer áramlik tovább elősegítve a komponensek (főleg B) tökéletes adszorpcióját. A módszer előnye a hagyományos SMB-üzemvitelhez képest, hogy alacsonyabb az oldószer-szükséglete, magasabb a termékáramainak koncentrációja és ezen keresztül jelentősebb a termelékenysége is [26, 27, 28, 29].  ModiCon folyamat: ezt az eljárást H. Schramm, A. Kienle, M. Kaspereit és A. Seidel-Mogenstern szabadalmaztatta 2002-ben [30]. A módszer lényege, hogy a klasszikus művelettel ellentétben ennél az eljárásnál a kapcsolási időn belül a feed koncentrációja megváltozik (feed gradiens). Ez a változtatás egy meglévő SMBkészülék esetében a legegyszerűbben egy szokványos gradiens szivattyún keresztül valósítható meg. Az SMB-művelet ModiConra való átalakításánál fontos szempont a szétválasztandó oldat betáplálási koncentrációjának helyes megválasztása. Az már több irodalomban is publikálásra került, hogy az SMB-művelet termelékenysége növekszik a betáplálási koncentrációval, tehát növekvő koncentráció esetén megnő. A fajlagos oldószer-szükséglet pedig fordítottan arányos a betáplálási koncentrációval, vagyis magasabb koncentráció esetén kevesebb oldószer szükséges.

2.10 ábra Az SMB-folyamat műveleti fajlagosainak változása a betáplálási koncentráció (feed koncentráció) függvényében 34

Mindkét műveleti fajlagos (termelékenység, oldószer felhasználás) annál kedvezőbben alakul, minél nagyobb feed koncentrációt választunk. Sok esetben ez azonban nem kivitelezhető, ugyanis a stabilitás (vagyis a rendszer azon képessége, hogy különböző zavarások esetén mennyire tud adott munkapontban megmaradni) szintén fordítottan arányos a feed koncentrációval, tehát nagy koncentrációknál kritikusan lecsökkenhet. Lehetőség van arra, hogy a művelet stabilitását úgy tartsuk meg, hogy taktuson belül a megfelelő részidőkben mindig az optimális koncentrációjú minta betáplálást biztosítsuk, így az átlagkoncentráció a művelet során nagyobb lehet, mint a klasszikus SMB műveletnél. 

VariCol-folyamat: ebben a NovaSEP által szabadalmaztatott eljárásban [31] a

hagyományos üzemmóddal ellentétben a betáplálási- és elvételi pontok átkapcsolása nincs szinkronban egymással, hanem különböző időpontokban történik, mégpedig a következő elv szerint: a kapcsolási időt 5 részre oszthatjuk fel olymódon, hogy egy részidőt megválasztunk, majd a többit ennek segítségével az oszlophosszok ismeretében számítjuk. Minden kapcsolási rész lejárta után a betáp-, illetve elvételi helyek közül egyet meghatározott sorrendben (raffinát, feed, extrakt, eluens) a folyadékáram irányával megegyező irányban továbbkapcsolunk. A kapcsolási idő végére – a hagyományos esethez hasonlóan – minden betáp- és elvételi pontot továbbkapcsolunk, amin keresztül a folyamat periodicitása megmarad. Ennél az eljárásnál egy-egy zóna átlagos hossza az aszinkronikus kapcsolási idők változtatásával módosítható. A módszer elnevezése is erre utal: VARICOL= Variable Column Length Process. Az eljárás előnye, hogy taktuson belül a betáplálási- és elvételi térfogatáramokkal bizonyos mértékig követni tudja a koncentrációprofilok vándorlását, így nem változik olyan nagymértékben a kilépő termékek koncentrációja és mindig a betáplálási pontnál mérhető

összetételhez

hasonló

összetételű

feed

áramlik

a

rendszerbe,

így

„folytonosabb” a művelet. Az eljárás hátránya, hogy a tervezési- és optimalizációs költségei meglehetősen magasak.

35

2.3 A preparatív kromatográfia és az SMB-LC gyakorlata

2.3.1 A szimulált mozgóágy létrehozása A preparatív SMB művelet műszaki megvalósítására alapvetően háromféle megoldás létezik: 1. Az oszlopok betáplálási és elvételi pontjait mozgatjuk a folyadék betáplálási és elvételi pontokhoz képest. 2. Rögzített oszlopokhoz képest egy csúszószerelvény továbbítja a betáplálási- és elvételi pontokat. 3. Minden folyadék betáplálási és elvételi pont minden SMB oszlophoz be van kötve rögzített csőhálózattal, és többállású váltócsapok vezérlik a folyadékáramokat. Az első megoldás alapeleme az Advanced Separation Technologies által szabadalmaztatott multifunkciós csap. Ezt a megoldást használja a KNAUER. A KNAUER multifunkciós csapja egy többállású, nagynyomású érintkező-csúszófelülettel ellátott, álló (stator)- és forgórészből (rotor) álló szerelvény (2.11 ábra). metszeti kép

64 bekötési pont, 1/16”os a belső járatok átmérője

Fénykép az álló és forgórészről

2.11 ábra A KNAUER multifunkciós csapjának rajza A rotor egy tengelyen forog a körkörösen elhelyezett és a rotor részhez csövezett HPLC oszlopokkal. A statorba bekötött kis térfogatú hurkokon keresztül jut el a folyadék egyik

36

oszlop aljáról a következő oszlop tetejére és ide történik a friss eluens, a szétválasztandó oldat betáplálása, valamint innen vezetjük el az extraktumot és a raffinátumot.

2.12 ábra A KNAUER preparatív készüléke A forgóoszlopos technika előnye, hogy kicsik a holtterei és egyszerű a vezérlése. Hátránya, hogy nem flexibilis, művelet közben (taktus közben) nem változtatható a betáplálási- és elvételi pontok helye, ugyanis egyszerre fordul el az oszloprendszer. Ez a rendszer viszonylag korlátozottan méretnövelhető. Nagyobb, akár méteres átmérőjű oszlopokkal is lehet dolgozni, ha azokat egy állványra rögzítik és minden oszlophoz be van kötve minden betáplálás és minden elvétel. Szerelvényei egyszerű nagynyomású többállású csapok vagy „nyit-zár” csapok. Ilyen technológiát alkalmaz a NOVASEP (2.13 ábra).

37

2.13 ábra Négyoszlopos NOVASEP berendezés

Az oszlopok hidraulikus dugattyús tömörítése is megoldható. Hátránya, hogy a bonyolult csőhálózat nagy holtterekkel jár, előfordulhatnak elszennyeződések, és a sok szerelvény miatt nagyobb a meghibásodási lehetősége. Egyéb, továbbfejlesztett SMB műszaki megoldások

A klasszikus négyzónás megoldást továbbfejlesztették, hogy alkalmas legyen három- vagy többkomponensű szétválasztásokra vagy enzimreakciók véghezvitelére. Kettő-, három-, négy, öt-, nyolc-, kilenc- és 12 zónás SMB készülékeket konstruáltak a fenti célokra. Meg kell jegyezni, hogy egy többkomponensű szétválasztásnál előnyösebb (főleg ha két főkomponenst, pl. nagyobb koncentrációban jelenlevő izomereket kisebb koncentrációjú szennyezők mellett tartalmaz a minta), ha inkább valamilyen előzetes technikával, előkromatográfiával kétkomponensűre redukáljuk az elegyet, mert a többkomponensű SMB-k paramétertervezése és pontos betartása rendkívül bonyolult.  Többkomponensű elegyek szétválasztására alkalmazott készülékek Lehet egy készülékbe integrált négynél több zónás készülék, illetve tandem SMB. Tandem SMB-knél több klasszikus SMB sorbakapcsolásáról van szó. Előnye, hogy egymástól viszonylag függetlenül tervezhetők a paraméterei és a taktusidő is minden SMB körben külön 38

választható. Hátránya, hogy nagy a beruházási költsége. Például egy háromkomponensű elegyhez 2, egy négykomponensűhöz már három SMB készülék kell. Gazdaságilag előnyösebb a 8, 9 és 12 zónás egykörös készülék, ezek háromkomponensű elegyeket tudnak szeparálni [32]. P - szivattyúk

Raffinátum Szétválasztandó oldat

Eluens 2

Extraktum 2

Eluens 2

Extraktum 1

2.14 ábra 8 zónás SMB 3 komponens szétválasztására A 2.14 ábrán is látszik, hogy a készülék lényegesen bonyolultabb, ha kettő helyett három komponenst akarunk szétválasztani, pl. négy szivattyú helyett hetet kell használni. Akkor érdemes használni, ha a három komponens hasonló koncentrációban van a mintában, és közeli adszorpciós tulajdonsággal rendelkeznek.  Többcélú készülékek Az ötzónás SMB alkalmas lehet 3 komponensű elegy szétválasztására, ha nyitott üzemmódban használjuk (2.15 ábra). Eluens 2

Extraktum 2

Eluens 1

Extraktum 1

Feed

Raffinátum

2.15 ábra 5 zónás nyitott körű SMB 3 komponens elválasztására 39

Másik lehetőség, ha a szétválasztandó oldattal táplált oszlop az előtte lévő oszloppal nincs sorbakötve (nem kap folyadékáramot az előtte lévő oszlopról). A szétválasztandó oldattal táplált oszlop és az előtte lévő oszlop egymással nincs összeköttetésben, mindkettő kilépő folyadékárama a szétválasztandó oldattal táplált oszlop utáni oszlopra kerül. Ezzel elérhető, hogy a mintabetáplálás oszlopának térfogatárama, illetve oldószer összetétele nem függ az előző zónák térfogatáramától és oldószerkoncentrációjától, így jobb elválasztás várható igen közeli adszorpciós tulajdonságú anyagoktól [33]. A harmadik lehetősége az ötzónás készüléknek a háromzónás nyitott SMB kibővítése ötzónásra. Az első két zóna a regeneráló zóna, amelyek vége nyitott, az első zóna elején friss eluenst adnak be, a második zóna elején pedig egy erős regenerálószert. A további zónakiosztás megegyezik a háromzónás készülékkel. Ezzel a berendezéssel az adszorbens regeneráltságát tökéletesítik, ha a jobban kötődő komponenstől vagy kis koncentrációjú szennyezésektől nehezen vagy az eluenssel egyáltalán nem regenerálható, és a tökéletlen regeneráltság miatt az értékes raffinátum elszennyeződne.  Alternatív négyzónás SMB reaktor Majdnem megegyezik a klasszikus SMB kapcsolással, de a minta (reakcióelegy) betáplálása több, párhuzamosan kapcsolt oszlopba történik. A III., reaktorzónában tehát párhuzamosan kapcsolt, azonos funkciójú reaktor oszlopok vannak abból a célból, hogy nagyobb legyen a hatékonyság. A párhuzamosan kapcsolt oszlopokba az oszlopok számával sokszorozódó mennyiségű reakcióelegy mehet be, tehát több termék keletkezik, így jobb az elválasztást végző zónák kihasználtsága is.  Különleges multifunkciós SMB szerelvények és kevesebb szerelvényt felhasználó vezérlések A háromrészes multifunkciós csapok lényege, hogy két állórész között szendvicsszerűen 1 forgórész mozog. A felső állórészhez vannak bekötve a betáplálások és elvételek, az alsóhoz az oszlopok. Két érintkező felülettel rendelkeznek, és körkörös csatornák vannak bennük a két betáplálási és két elvételi folyadékáram számára. A csatornákkal szemben furatok helyezkednek el, amelyek biztosítják a folyadékáramok megfelelő helyre történő juttatását [34, 35]. Ilyen a UOP Single Rotary Valve és a Calgon Carbon Valve elnevezésű multifunkciós csapok (2.16 ábra).

40

Extraktum Betáp.

Friss eluens

Raffinátum Stator 1 Rotor

Stator 1

Stator 2

Rotor

Recirkulációs szivattyú

2. 16 ábra

Stator 2

A Calgon Carbon háromrészes multifunkciós csapja a) az SMB készülék sémája, b) felső állórész csúszófelülete c) forgórész a furatelosztással, d) alsó állórész A 2.16 ábrán bemutatott SMB csap hátránya, hogy ezen sem lehet megvalósítani a taktuson belüli egyenkénti folyadékáram-kapcsolásokat, nem alkalmazható aszinkron üzemmódban.

2.3.2 Az SMB alkalmazási területei A múlt század ’40-es éveitől a petrolkémia fejlődésével párhuzamosan egyre nagyobb igény alakult ki a kőolajból és egyes párlataiból egyedi komponensek kinyerésére. Ellenáramú fixágyas szimulált mozgóréteges berendezésről először 1949-ben számoltak be Eagle és társai. A készülékkel aromás és olefin szénhidrogéneket izoláltak petróleumból, és ekkor még ciklikus adszorpciós (CA) eljárásnak nevezték. Később, 1961-ben a UOP (Universal Oil Products, USA) szabadalmaztatta a folyamatos technológiát (US Patent No. 2.985.589 , D.B. Broughton, C.G. Gerhold: Continous sorption process employing fixed bed of sorbent and moving inlets and outlets) [16]. Ezután egyre több technológiában használták, az UOP-nak ma már több, mint 300 szabadalma van szénhidrogénipari, petrolkémiai, de biotechnológiai és gyógyszeripari szétválasztásokra (pl.: Broughton, 1968; Ganetsos and Barker, 1993; Maher,

41

2001; Rosset és mtsai., 1981; Ruthven és Ching, 1989). A szabadalom-családot Sorbex eljárásoknak nevezik, ezek közül néhány [36]: 1964 Molex: normál- és elágazó láncú paraffinok, ill. cikloparaffinok elválasztása, 1971 Parex: p-xilol aromás C8 izomerjeitől történő elválasztása, 1971 Olex: oleffin – paraffin elválasztás. Jellemzően aktívszén töltetet használnak szénhidrogén elválasztásra, és nagynyomású gőzzel regenerálnak. A legkorábbi U.S. szabadalom cukrok szimulált mozgóágyas szétválasztására, leggyakrabban glükóz – fruktóz szeparálásra is a UOP-tól származik: 1979 Sarex: invertcukor elválasztás (Rosset és társai, 1981) 1977-ben szabadalmaztatták az SMB reaktort (Stine és Ward), amelyben egyensúlyra vezető reakciók egyidőben az elválasztással mennek végbe. Ezzel a módszerrel a reakciótermékek folyamatosan elválaszthatók a kiindulási anyagoktól, ami a céltermék keletkezésének irányába tolja el a reakciót. Metil-acetát, -feniletil acetát előállításra, ill. cukor inverzióval kombinált glükóz – fruktóz elválasztásra (Azevedo és Rodrigues, 2001) történő alkalmazásai a legismertebbek [37, 38, 39]. A gyógyszeripari alkalmazások az 1990-es évektől kezdődtek főként enantiomerek elválasztása céljából, amikor megindult a nagyszelektivitású királis töltetek fejlesztése. Először ekkor hasonlítják össze több publikációban az SMB technikát más kromatográfiás eljárásokkal, és egyre inkább előnyben részesítik preparatív szétválasztásoknál (Grill és mtsai., 2004; Miller és mtsai., 1999) [40, 41]. Enantiomerek szétválasztására a ’90-es évek végétől szuperkritikus és GC-SMB-t is használnak (Biressi és mtsai., 2000; Depta és mtsai., 1999; Johanssen és mtsai., 2002) [42, 43, 44]. Szepesy és munkatársai Magyarországon úttörő munkát végeztek a preparatív kromatográfia és az SMB ipari bevezetésében [45, 46]. A szimulált mozgóágyas elválasztási technikák biotechnológiai alkalmazási területe is egyre bővül, szennyező anyagok eltávolítására használják kis koncentrációban jelen lévő értékes anyagoktól, pl. fermentlevekből hatóanyag izolálásra (Rossiter és mtsai., 1997) [47]. Értékes szerves

savak,

zsírsavak,

enzimek,

gyulladáscsökkentő

szerek,

immunszupresszív

hatóanyagok (pl. ciklosporin), humán inzulin SMB művelettel való előállításával kapcsolatos publikációk olvashatók a 2000-es évek szakirodalmában.

42

Az SMB preparatív folyadékkromatográfia biotechnológiai alkalmazásai A legutóbbi konferenciákon, 2004-től egyre inkább előtérbe kerülnek a biomolekulák fordított fázisú vagy ioncserés elválasztását folyadékkromatográfiára, illetve SMB-re alapozó munkák. A biomolekulák fermentlevekben vagy természetes anyagokból kinyert nyerstermékekben vannak jelen, a fordított fázisú töltetek általában valamilyen olcsó polimer adszorbensek. A teljesség igénye nélkül álljon itt néhány ipari példa [32]:  Különleges cukrok elválasztása Ca2+ formájú ioncserélő gyantán hőmérséklet gradienssel. A cukrok adszorpciósan kötődnek a gyantán. 25°C-on, Dowex 99 Ca2+ formájú gyantán választanak el trehalulózt fruktóztól. Az eluens 65°C-os víz. A mintában 50%-nyi a fruktóz és 50%-nyi a trehalulóz. 5 bar nyomáson működik a 12 oszlopos SMB, tehát kisnyomású rendszerről van szó. 98%-os tisztaságú termékeket állítanak elő. 2,6 cm-es átmérőjű és 1 m hosszúságú oszlopokon naponta 3750 g 240 g/l koncentrációjú szétválasztandó oldatot táplálnak be.  Betain sómentesítése Na+ formájú ioncserélőn. Az eluens víz, a rendszer hőmérséklete 65°C. A kationcserélő itt is Dowex 99 típusú nátrium formában, kisnyomású a rendszer. 8 db 1 m hosszú és 2,6 cm oszlopból áll az SMB. 95%-os extraktum (betain) tisztaságot érnek el, a raffinátumban 2%-nyi az értékes komponens úgy, hogy naponta 6000 g 300 g/l-es szétválasztandó oldatot táplálnak be.  Fehérjék elválasztása Mioglobin és lizozim elválasztása BIOSEPRA ACA54 tölteten, 0,15M eluensbeli NaClkoncentráció mellett 25°C-on. 1 bar nyomásesés a 8 db 2,6 cm belső átmérőjű és 10 cm hosszú oszlopokon. 98%-os az extraktum (mioglobin) és 98%-os a raffinátum (lizozim) tisztasága, miközben a betáplálás 2 g/l-es oldat, amely 50-50%-ban tartalmazza a két komponenst.  További példák: glicerin, glükóz, fenilalanin és betain sómentesítése polimer adszorbenseken.  Legújabb

biotechnológiai

elválasztásokkal

kapcsolatos

publikációk,

amelyekben

aminosavak SMB elválasztását vizsgálják: Wankat

és

munkatársai

L-fenilalanin

tisztítását

vizsgálták

kétzónás

SMB-n

háromkomponensű aminosav elegyből (glicin, L-fenilalnin és L-triptofán) [48]. Egy kanadai kutatócsoport az 5 zónás és a 2 zónás SMB összehasonlítását végezte háromkomponensű aminosav-elegy elválasztása kapcsán [49]. Királis aminosav-származékok elválasztását vizsgálták Francotte és mukatársai [50]. 43

Wang és szerzőtársai fenilalanin és triptofán SMB elválasztásának állóhullám módszerrel való tervezését mutatják be [51]. Az aminosavak SMB preparatív folyadékkromatográfiás elválasztásával kapcsolatos kutatásaim a fenilalanin sómentesítése [52], a fenilalanin – glicin hőmérséklet modulált elválasztása [53, 54] témakörében publikáltam.

2.3.3 Polimer adszorbens gyanták jellemzői Az erős és a gyenge ioncserélők hordozó vázának, valamint a funkciós csoport nélküli adszorbenseknek a gyártási mechanizmusa hasonló. Polimerizációra alkalmas, tehát telítetlen molekulákból állítják elő a gyantákat gyöngypolimerizációval. A monomerek egy- vagy többfunkciósak lehetnek. Egyfunkciós pl. a sztirol és az etilvinilbenzol, kétfunkciós a divinilbenzol. A polimer gyöngy minősége a térhálósságával is jellemezhető. A polimer gyantákat általában többféle monomer kopolimerizációjával gyártják, lehetőleg minél több többfunkciós monomer hozzáadásával a térhálósítás elősegítéséhez. Az első, második és harmadik generációs gyanták éppen a divinilbenzol-tartalmukban és térhálósságukban különböznek. A legutóbbi fejlesztésű, legkorszerűbb gyanták divinilbenzol tartalma a legnagyobb és térhálóssága a legjobb, ami a tölteten tapasztalható áramlási tulajdonságok szempontjából

is

a

legelőnyösebb

[55].

Szabályozott

pórusmérettel

készítik

az

adszorbenseket, ami úgy oldható meg, hogy a polimerizációt a megfelelő pillanatban befagyasztják, és a maradék monomert a gyöngyök pórusaiból eltávolítják, pl. oldószerrel. Az adszorbens gyanták jellemző fizikai tulajdonságai:  Fajlagos felület, BET fajlagos felület: megmutatja, hogy egységnyi tömegű gyantához mekkora adszorpciós szempontból hozzáférhető felület tartozik.  Átlagos

szemcseméret:

áramlástanilag

meghatározó

tényező.

Minél

finomabb

szemcseátmérőjű a töltet, annál nagyobb a töltetágyon mérhető nyomásesés, de annál jobbak

a

szétválasztási

tulajdonságok.

A

polimer

gyöngyök

mérettartománya

leggyakrabban 0,3…0,5 mm között változik és a szemcseméret eloszlás meglehetősen inhomogén, de a kereskedelemben kaphatók akár 20 m átmérőjű gyöngyök is HPLC-s célokra, ezeket a gyanta neve után írt HP-vel jelölik.  Átlagos pórusátmérő, pórusméret eloszlás: fontos az adszorpciós kinetika szempontjából a pórusátmérő és a molekulaméret viszonya. Az adszorpciós kromatográfia felső határa a 2000 Da tömegű molekulák elválasztása.

44

 Vázsűrűség: pórusok nélkül, tisztán a polimer sűrűsége. A gyártók adják meg, és a polimer minőségére jellemző. A hidrofób tulajdonságú gyanták sűrűsége kisebb, a gyengén poláris gyantáké 10-20%-kal nagyobb. Adszorbens gyanták XAD-4 XAD-7 XAD-1180 HP20 HP2MG SP207

Típus

Pórustérfogat Nedves 3 halmaztérfogat cm /g 3 g/cm

poliaromás akrilészter poliaromás poliaromás polimetakrilát brómozott polisztirol

Vázsűrűség Átlagos Átlagos 3 fajlagos felület pórusátmérő g/cm 2 Å m /g

0,98 1,14 1,68 1,30 1,20

1,02 1,05 1,01 1,01 1,09

1,08 1,24 1,04 -

300 450 600 500 500

90 90 300 260 170

1,10

1,18

-

650

105

2.6 táblázat Néhány adszorbens gyanta fizikai tulajdonságai A gyanták felhasználási területe lehet nagymennyiségű vizes oldatból kis koncentrációjú szerves anyag kinyerése (adszorpciós víztisztítás), másrészt biokomponensek fordított fázisú kromatográfiás elválasztása. Néhány felhasználási lehetőség látható gyantákra vonatkozóan a 2.7 táblázatban.

45

Adszorbensek

HP20

HP21

HP20SS

SP825

Kémiai szerkezet

Vízfelvétel (tömeg%) Reverzibilis duzzadás (tf%) Részecskeméret-eloszlás 3

Pórustérfogat (cm /g) 2

Fajlagos felület (m /g) Átlagos pórusátmérő (Å)

Amberchrom

DIAION/SEPABEADS

DOWEX

45-55 55-65 52-62 30 >250 m 63-150 m >250 m

1,3

1,1

1,3

1,4

600 260

570 80

600 260

1000 60

szemcseátmérő [mm]

fajlagos felület [m2/g]

kémiai karakter

felhasználási terület

XAD7HP

0,26…0,8

450

akrilészter gyanta mérsékelt polaritással

szerves komponensek M=60000ig, antibiotikumok

XAD1180

0,26…0,8

600

gyengén poláris felületű poliaromás

hidrofób komponensek, antibiotikumok, vitaminok, aminosavak és enzimek

XAD2000

0,26…0,8

580

poliaromás

hidrofób komponensek, szteroidok, aminosavak, polipeptidek, antibiotikumok

CG71

0,08…0,16

500

polimetakrilát gyanta mérsékelt polaritással

aminosavak, peptidek, aromás vegyületek

CG161

0,08…0,17

900

poliaromás

fenol, hidrofób komponensek, kisebb fehérjék, aminosavak

HP20

0,25…0,85

500

poliaromás

hidrofób komponensek, antibiotikumok, biomolekulák, sómentesítés

HP2MG

0,3…0,7

500

polimetakrilát gyanta mérsékelt polaritással

hidrofób komponensek, antibiotikumok, színezékek

SP207

0,25…0,8

650

erősen hidrofób brómozott polisztirol

biomolekulák szétválasztása fluidizált ágyban

StyreneDVB

0,16…0,9

erősen hidrofób sztiroldivinilbenzol kopolimer

hidrofób komponensek, szintézis alapanyagok

adszorbens neve

Amberlite

55-65 30 >250 m

2.7 táblázat Néhány fontosabb adszorbens gyanta kémiai összetétele és felhasználási területe A főbb gyantagyártók a Rohm & Haas, a Dow Chemicals, a Mitsubishi és a Toyo-Soda Co.

46

3. Matematikai modell 3.1 Matematikai modellezés lehetőségei A modellezés a következő részlépesekből áll: 1. Egyensúlyi modellek 2. Egyensúlyi-kinetikai modellek 3. Kaszkád (cella) modellek Az első két modellfajtánál a modellspecifikus feltételek mellett a következő feltételeknek kell teljesülnie:  A kromatográfiás oszlop töltete axiálisan és radiálisan is homogén.  Az oszlopban kémiai reakció, disszociációs folyamatok nem játszódnak le.  A folyamat izotermikus (csak elhanyagolható hőmérséklet ingadozások vannak).  Az oszlopban a folyadéksebesség és -sűrűség állandó (izochor folyamat).  Radiális irányban nincs koncentráció-változás.

Egyensúlyi modell Az egyensúlyi modellnek a következő feltételekből kell kiindulnia:  A folyadék és szilárd fázis minden időpillanatban az oszlop bármely pontján termodinamikai egyensúlyban áll egymással.  Az anyagátadási ellenállás (film- és pórusdiffúzió) és az axiális keveredés elhanyagolhatók. Ezek az egyszerűsítési feltételek erősen korlátozzák az egyensúlyi modell alkalmazhatóságát, a keveredési folyamatok elhanyagolása miatt csak nagyhatékonyságú (magas elméleti tányérszámmal rendelkező) oszlopok leírásához alkalmazhatók. Mindezek ellenére az egyensúlyi modell gyakran kielégítő eredményeket szolgáltat, ami a részecskék kis méretére és a töltött ágy jó tömörítettségére vezethető vissza. Ezekkel a feltételekkel a következő mérlegegyenlet írható fel: ci t

Ahol: F – a fázisarány F

F

qi t

Vsz V foly

u 1

ci z

0, i 1...n

(25)

, u a folyadék áramlási sebessége,

47

qi és ci az i komponens koncentrációja a szilárd, illetve folyadékfázisban, a t pedig az idő. Ez az összefüggés izoterm körülmények között az adszorpciós izotermák segítségével átrendezhető. Általános esetben érvényes a következő összefüggés:

qi

qi (c1 , c2 ,..., cn ) , i 1...n

(26)

Az (25) és (26) egyenletek egyértelmű megoldásához további kezdeti- és peremfeltételek szükségesek. A t=0 időpillanatban a következő kezdeti feltételt írhatjuk fel:

c( x, t 0) 0

0 x L

(27)

ahol L az oszlophossz. Az oszlop telítettségének függvényében más, tetszőleges kezdeti feltétel is megadható, így a hely szerinti kezdeti koncentráció profil. A peremfeltételként általában a következőket adhatjuk meg:

1, cinu 2, Dax

c L 0 u (ha a diffúziót elhanyagoljuk) ci z

u (c L

0

cin ) 0 (a diffúzió figyelembevételével)

(28) (29)

L 0

48

Kinetikai modell A kinetikai modellek segítségével véges sebességű kinetikával lejátszódó folyamatok, valamint keveredési folyamatok is leírhatók.

Keveredési modell A legegyszerűbb az anyagátadást is figyelembevevő modell, az ún. keveredési modell. Ha a következő feltételek teljesülnek:  a folyadék és szilárd fázis minden időpillanatban az oszlop bármely pontján termodinamikai egyensúlyban áll egymással, illetve  az anyagátadási ellenállás elhanyagolható, akkor érvényes az alábbi összefüggés:

ci t

F

qi t

u

ci z

2

ci ,i 1...n z2

Dax,i

(30)

ahol Dax,i az i komponensre vonatkozó axiális keveredési tényező. A kinetikai modell egyszerűsítése

Guiochon és Golshan-Shirazi által részletesen tárgyalt modellelképzelés szerint az összes anyagátadási ellenállás és az axiális diszperzió egyetlen paraméterbe foglalható össze, az ún. látszólagos keveredési tényezőben (Dap,i). Ez az egyszerűsítés különösen a magas koncentrációk esetén indokolt, ahol a termodinamika befolyása jelentős az elegykomponensek retenciós magatartására és az egyéb effektusok hatása csekély. Az SMB-folyamat modellezésére is ezt az összefüggést alkalmazzuk. A fentiek figyelembevételével a következő mérlegegyenlet írható fel:

ci t

q F i t

c u i z

2

Dap ,i

ci ,i 1...n z2

(31)

49

Ezt módosított egyensúlyi-keveredési modellnek is nevezik és érvényes, hogy Dap,i ≥ Dax,i. A Dap,i koefficiens az elméleti tányérszám (NP,i) segítségével is felírható egy kis injektált anyagmennyiség által előidézett analitikai csúcs esetén:

uL 2 N P ,i

Dap ,i

[m2/sec]

(32)

ahol NP,i az elméleti tányérszám, u a haladási sebesség, L pedig az oszlophossz. Az axiális keveredés és az anyagátadási ellenállások egyetlen paraméterbe való összevonhatóságát Rhee és Amundson [56] igazolta áttörési görbék alapján.

3.2 Az aminosav elválasztás matematikai modelljének megalkotása A folyadékkromatográfiát egyensúlyi kaszkád modellel írjuk le. A modell lényege, hogy a kromatográfiás oszlop teljes hosszát (L) az NTP számának megfelelő részekre osztja (DL). Minden egyes rész megfelel egy egyensúlyi egységnek, amelyre a belépő- és kilépő folyadékfázis és a gyantafázisbeli koncentráció alapján felírható a következő mérlegegyenlet: v0 (

ck )t z

(1

)(

qk )z t

(

ck )z t

0

(33)

Az egyszerűsítés érdekében a továbbiakban csak két komponenst veszünk figyelembe, a számítási módszer azonos többkomponensű rendszerek esetében is. Az (33) egyenlet két komponensre:

vo 1

ck z

1

ck t

qk c1

c1 t

qk c2

c2 t

(34)

50

Az 1. komponensre nézve:

vo

c1 z

1

c1 t

1

q1 c1

c1 t

q1 c2

c2 t

(35)

a kompetitív-Langmuir izoterma két komponensre felírva: q1

a1 c1 1 b1c1 b2 c 2

(36)

Deriválva c1 szerint: q1 c1

a1 (1 b1 c1 b2 c 2 ) a1 b1 c1 (1 b1 c1 b2 c 2 ) 2

(37)

Deriválva c2 szerint: q1 c2

a1 b2 c1 (1 b1 c1 b2 c 2 ) 2

(38)

A továbbiakban az egyszerűbb áttekinthetőség kedvéért, a (37) és (38) kifejezés nevezőjét jelöljük N-nel: N = 1 + b1c1 + b2c2

(39)

Helyettesítsük be a (37) és (38) egyenleteket a (35) egyenletbe:

v0 1

c1 z

c1 a1 N a1b1c1 t N2

1

a1b2 c1 N2

c2 t

(40)

Mindkét oldalt N2-tel szorozva és az egyenletet átrendezve kapjuk a differenciális mérlegegyenlet megoldását:

v0 1

N2

c1 z

c1 a1 N t

1

N2

a1c1 b1

c1 c b2 2 t t

(41)

51

A véges differenciák módszerével a (41) egyenlet megoldásához a differenciálhányadosok helyett differenciahányadosokat használva (ehhez a kromatográfiás oszlopot osszuk fel J egyenlő részre L(oszlophossz)=J z, és a műveleti időt I egyenlő részre T(műveleti idő)= I t):

v0

N2

1

c1 z

c1 a1 N t

N2

1

c1 c b2 2 t t

a1c1 b1

(42)

A differenciahányadosok:

ci , j , k

ck z

ci , j

1, k

ck t

(43a )

z

ci , j , k

ci

1, j , k

(43b)

t

Ahol: i – idő index j – hely index k = 1,2 komponens index Ha a rendszerben n komponens található, akkor a (42) egyenletet a következőképpen írhatjuk: vo 1

N2

ck z

ck (a k N t

n

1

N 2 ) ak ck

(bk k 1

ck ) t

(44)

A (44) egyenletet átrendezve megkapjuk a végső egyenletet, amely a Tanszéken elkészített szimulációs program alapja [58]:

v0 1

N2

ck z

n

ak ck

bk k 1

ck t

ck ak N t

1

N2

a k bk c k

(45)

Az előzőekben ismertetett matematikai modellhez az alábbi kezdeti és peremfeltételek tartoznak.



Kezdeti feltétel alatt a t = 0 időponthoz tartozó

ck(z,0) , qk (z,0)

koncentráció hely-idő függvényeket értjük, melyek az I, II, III, IV oszlopok hossza mentén adottak a folyadékáramoltatás megkezdésekor.

52

 Peremfeltételek 0

t

T

1. Folyadék áramoltatási periódus alatt

Állandó értékek az idő függvényében: Belépő szétválasztandó folyadék térfogati sebessége F, és összetétele cF Belépő friss eluens térfogati sebessége (D) és összetétele Recirkuláltatott eluens térfogati sebessége (Rec) Extraktum térfogati sebessége (E) Raffinátum térfogati sebessége (R) Számított értékek az idő függvényében: Recirkuláltatott eluens összetétele a kezdeti feltételben megadott összetételtől indulva Extraktum összetétele a kezdeti feltételben megadott összetételtől indulva Raffinátum összetétele a kezdeti feltételben megadott összetételtől indulva T taktusidő elteltével történik az 1. oszlop „mozgatás” és kezdődik a 2. folyadék áramoltatási periódus A 2. folyadék áramoltatási periódus kezdeti feltételét az I, II, III, IV oszlopokban az 1. áramoltatási periódus végén kialakult folyadék, illetve szilárd fázisbeli oszlop hosszmenti összetételek adják. Természetesen a kezdeti feltételeknél az oszlopok „mozgatását” figyelembe kell vennünk. A 2. folyadék áramoltatási periódus perem feltételei formálisan azonosak az 1. folyadékáramoltatási periódusban leírtakkal T

t

2T időintervallumban.

A térfogati sebességek és a belépő koncentrációk rögzítettek, D, E, R összetételét számítjuk. Ettől kezdve a számítás ciklikusan ismétlődik. A fentiek alapján a Veszprémi Egyetem Vegyipari Műveletek Tanszékén Argyelán János elkészítette a KROM N számítógépi program továbbfejlesztésével az SMB-KROM N programot, mely az alábbiak szerint működik. A program numerikus módszerrel számítja az egyes oszlopok kimenetén az áttörési görbéket, az egyes oszlopokon időben változó hely szerinti folyadék és szilárd fázisbeli koncentrációkat, a raffinátum és extraktum áram koncentrációjának időbeli változását. A programban lehetőség van olyan kezdeti feltétel alkalmazására, amikor a ciklikus művelet megkezdése előtt a III. oszlopot frontálisan telítjük a belépő szétválasztandó eleggyel. Ennek eredményeként csökkenthető a kvázistacionárius állapot eléréséig szükséges ciklusszám.

53

Az SMB-KROM N alapvetően négyoszlopos, négyzónás, zárt SMB modellezésére alkalmas, kompetitív-Langmuir izotermák esetén. Ahhoz, hogy a program képes legyen hatoszlopos, háromzónás, nyitott SMB-t modellezni, módosításokra volt szükség. A zónák kezdeti és végpontját kijelölő elméleti tányérszám sorszámokat kellett megváltoztatnom (a programban megadott NTP egy teljes SMB oszlopot jelent). A 6 oszlopos készüléknél 2-2-2 oszlopkonfiguráció esetén az első zóna eleje 0, a vége 2NTP, a második zóna eleje 2NTP+1, a vége 4NTP, a harmadik zóna eleje 4NTP+1, vége 6NTP. Mivel sókoncentrációtól függő izotermákkal is számolnom kellett, így a program egyensúlyi részét is módosítottam. A Langmuir-izoterma a paramétere kibővítésre került a sókoncentrációtól függő adszorpciós többlet-tényezővel aNaCl-lel: qi

(a NaCl c NaCl a i ) c i 1 b ci

(46)

A sókoncentráció-függő Langmuir-típusú egyensúly számításához a program természetesen mindig az aktuális hely és idő szerinti sókoncentrációt veszi figyelem

54

4. Kísérleti rész 4.1 Célkitűzés Általános megközelítésben SMB preparatív folyadékkromatográfiás művelet tervezésének, optimálásának lehetőségeit vizsgáltam aminosavat tartalmazó vizes fázisú oldatok elválasztásához. Kutatásom célja volt továbbá annak vizsgálata, hogy a művelet egyes paramétereinek változtatására milyen változásokkal reagál a rendszer. Hogyan lehetséges az elválasztás hatékonyságát növelni, hogyan lehet az ipar számára fontos műveleti jellemzők figyelembevételével a műveletet optimálni. A paraméterek műveleti jellemzőkre gyakorolt hatása kísérletileg a szétválasztandó anyagi rendszer egyszerűsítésével könnyebben megfigyelhető. Kétkomponensű aminosavoldat elválasztásának, illetve vizes aminosav-oldat sómentesítésének vizsgálatát tűztem ki célul. Modell rendszerként a szimulált mozgóréteges preparatív folyadékkromatográfia műveleti tanulmányozásához fenilalanin-glicin vizes oldatot használtam. Az elválasztás jellemzőit (szelektivitási tényező, kapacitási tényező) fordított fázisú, hidrofób és gyengén poláris felületű adszorbens gyantákon vizsgáltam. A gyantaválasztás után minden esetben Morbidelli egyensúlyi háromszög-módszerével számítom az SMB művelet kezdeti paramétereit. A térfogatáramok és a taktusidő optimálása egyensúlyi kaszkád modellel történik. Az SMB művelet tervezésének lépései összefoglalva: 1. Az elválasztáshoz legelőnyösebb töltet kiválasztása. 2. Adszorpciós egyensúlyok mérése. 3. Töltetjellemzők (elméleti tányérszám, tányérmagasság, összporozitás mérése). 4. Kezdeti SMB paraméterek tervezése Morbidelli módszerével. 5. Műveleti paraméterek optimálása szimulációs szoftver segítségével. Az SMB elválasztás műveleti jellemzőinek javítása egyfelől a térfogatáramok és a taktusidő ideális beállításával, másfelől az anyagi rendszer egyensúlyi jellemzőinek megváltoztatásával történhet. Az SMB egyes zónáiban gradiens módszer felhasználásával eltérhetnek az adszorpciós egyensúlyok. Az első zóna hatékonyabb regenerálása erősebb oldószerrel (aminosav-szétválasztás fordított fázisú polimeren: metanolgradiens vízben), hőmérsékletemeléssel lehetséges. A harmadik zónában az erősebben kötődő komponens áttörését késleltetni lehet, ha nagyobb sókoncentrációjú a folyadékfázis.

55

SMB műveleti jellemzők Az elválasztási művelet legfontosabb jellemzői a tisztaság, kihozatal, termelékenység és eluens fajlagos felhasználás. A kísérleti részben elsőként fenilalanin sómentesítését, a másodikként fenilalanin-glicin vizes oldat elválasztást, végül a fenilalanin-glicin elválasztás sógradienssel történő módosítását mutatom be. Az SMB kísérleteket a kvázi-stacioner állapot beállta után még egy teljes ciklust befejezve végeztem, és az alábbi SMB műveleti jellemzőket az utolsó ciklus paramétereiből és mintakoncentrációiból számítottam.  Tisztaság

m % m B

Rc BRT ×100 % Rc BRT Rc ART

(47)

m % m A

Ec AET ×100 % Ec AET Ec BET

(48)

Ahol: m/m%B – a kevésbé kötődő B komponens tisztasága a raffinátumban (m/m% B komponens/összes komponens) m/m%A – a jobban kötődő A komponens tisztasága az extraktumban (m/m% A komponens/összes komponens) R – raffinátum térfogatárama (cm3/perc) E – extraktum térfogatárama (cm3/perc) T – taktusidő (perc) c – átlagkoncentráció (taktus elejétől végéig vett minta koncentrációja) (mg/cm3) E, R – felső indexként a termékáramok (extraktum, raffinátum) betűjele A, B – alsó indexként a komponensek betűjele A tisztaság a céltermékre vonatkozó alapkövetelmény, a termék minőségét határozza meg, minimális értékét szokás megadni.  Kihozatal

B

Rc BRT ×100 % % F Fc B T

(49)

56

A

Ahol:

B

Ec EAT ×100 [%] % Fc AF T

(50)

– a B komponens kihozatala a raffinátumban az összes betáplált B komponenshez

viszonyítva (%) A

– az A komponens kihozatala az extraktumban az összes betáplált A komponens

mennyiségéhez viszonyítva (%) F – a szétválasztandó oldat betáplálás térfogatárama (cm3/perc) c – termékáramok koncentrációi (E és R felső indexszel), ill. szétválasztandó oldat koncentrációja (F felső indexszel) A kihozatal a művelet gazdaságosságát jellemzi. Minél nagyobb kihozatallal tudjuk izolálni a célterméket, annál kisebb a veszteség az értékes komponensből. Ha az elválasztás közel tökéletes egy kétkomponensű rendszerben, akkor a tisztaság és a kihozatal is 100% közeli, a kevésbé kötődő B komponens teljes egészében a raffinátumban, az erősebben kötődő A teljes egészében az extraktumban távozik.

 Termelékenység

PB

PA

Rc BRT mg" B" TNV k H g _ töltet _ min

(51)

Ec AE T mg" A" TNV k H g _ töltet _ min

(52)

Ahol: PA, PB: az A illetve a B komponens termelékenysége (mg komponens/g töltet percenként) Vk – oszloptérfogat (cm3) H

– a gyanta halmazsűrűsége (g/cm3)

N – oszlopok száma

57

A termelékenység az iparban az elsődleges célfüggvény, ezt kell maximalizálni, miközben a termékek tisztaságát és kihozatalát az előírt értéken meg kell tartani, az eluens fajlagos felhasználás lehető legalacsonyabb szinten tartása mellett.

 Eluens fajlagos felhasználás

SFB

ST cm 3 frisseluens mg" B" Rc BRT

SFA

ST cm3 frisseluens Ec AFT mg" A"

(53)

(54)

Ahol: SFA, SFB – eluensfelhasználás a termelt A, ill. B komponensre vonatkoztatva (cm3 friss eluens/mg komponens) S – friss eluens térfogatárama (cm3/perc) Az eluens fajlagos egy gazdaságossági (ill. környezeti szempontból elsődleges) tényező, megmutatja, hogy mennyi friss oldószer szükséges ahhoz, hogy előállítsunk egységnyi tömegű tiszta komponenst.

Az itt bemutatott SMB műveleti jellemzők természetesen egymástól is függnek, pl. ha a kevésbé kötődő komponens tisztasága csökken a raffinátumban, az azt jelenti, hogy a jobban kötődő komponens szennyezi, így a jobban kötődő komponensből az anyagmérleg szerint veszteség lesz az extraktumban, tehát csökken a kihozatala.

Adszorbensek

Polimer adszorbens gyantákat vizsgáltam sómentesítés és aminosav elválasztás céljából. A vizsgált gyanták fizikai tulajdonságait és felhasználási területeit a 3.1 táblázatban foglaltam össze. A gyanták egy része sztirol-divinilbenzol kopolimer, ezek hidrofób, apoláris gyanták, másik része polimetakrilát és akrilészter polimer, ezek gyengén polárisak.

58

szemcseátmérő [mm]

adszorbens neve

Amberlite

DIAION

SEPABEADS

fajlagos felület

kémiai karakter

felhasználási terület

2

[m /g]

XAD7

0,26…0,8

450

akrilészter gyanta mérsékelt polaritással

szerves komponensek M=60000ig, antibiotikumok

XAD1180

0,26…0,8

600

gyengén poláris felületű poliaromás

hidrofób komponensek, antibiotikumok, vitaminok, aminosavak és enzimek

HP20

0,25…0,85

500

poliaromás

hidrofób komponensek, antibiotikumok, biomolekulák, sómentesítés

HP2MG

0,3…0,7

500

polimetakrilát gyanta mérsékelt polaritással

hidrofób komponensek, antibiotikumok, színezékek

SP825

0,16…0,9

900

erősen hidrofób sztiroldivinilbenzol kopolimer

hidrofób komponensek, szintézis alapanyagok

4.1 táblázat A vizsgált gyanták néhány fontosabb jellemzője és felhasználási területe. Forrás: adszorbensek, kromatográfiás töltetek katalógusa

SMB készülékek A vizsgált adszorbens gyanták szemcseméretét figyelembe véve alapvetően kisnyomású SMB készülékeket terveztem. A tervekből megvalósítottunk egy 6 oszlopos kisnyomású, kislaboratóriumi méretű és a Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Rt. és Veszprémi Egyetem közös projektjével egy 4 oszlopos nagynyomású, nagylaboratóriumi készüléket. A 6 oszlopos, nyitott háromzónás, kislaboratóriumi készülék karusszel rendszerű, vezérlő csapja egy álló- és egy forgórészből áll, az oszlopok a forgórésszel együtt elfordulnak, a csúszó-érintkező vezérlőfelület furat- és horonyelosztása saját tervezésű (ld. 4.1 b ábra, fenilalanin sómentesítése). Kis nyomáson, max. 3 bar-on, 0,3 mm átlagos szemcseméretnél max. 10…12 cm3/perc térfogatárammal működtethető, 12,5 cm hosszú, 1,3 cm átmérőjű oszlopokkal felszerelve. Anyaga műanyag: polipropilén és teflon, ill. oszlopai üvegből készültek, a folyadékáramokkal így nem érintkezik fémalkatrész. A folyadékáramok szabályozott szállítása perisztaltikus pumpákkal történik. A készüléken minden lehetséges háromzónás oszlopkonfiguráció beállítható, mérés közben viszont nem léptethetők egyedileg (aszinkron kapcsolással) a térfogatáramok, csak együtt. Ezt a készüléket fenilalanin sómentesítésének vizsgálatához használtam.

59

A nagylaboratóriumi nagynyomású négyoszlopos készülék saválló acél szerkezeti anyagból készült. Két- és négyállású csapokkal oldottuk meg a folyadékáramok vezérlését. Oszlopait termosztálható köpennyel láttuk el, amit később kívülről polifoam szigetelővel burkoltunk. A készüléket utólag PLC vezérléssel szereltük fel. A készülék maximális nyomása 50 bar. Szerelvényei 66°C-ig nyomásbiztosak. Bármely 4 és 3 zónás oszlopkonfigurációban működtethető, és alkalmas a folyadékáramok aszinkron kapcsolására is. További két nyitott, háromzónás készüléket terveztem, amelyeket nem kiviteleztünk, viszont alacsony nyomásesésű rendszerek vizsgálatához előnyösen használhatók lennének. Az egyikben 3 kisnyomású többállású csap (egy 6 állású VALCO STF és 2 db 6 állású VALCO SD csap) vezérli a folyadékáramokat (4.1 a ábra), a másik egy háromtárcsás, két álló- és egy forgórészből összeállított speciális, saját tervezésű vezérlőcsappal ellátott készülék (4.1 b ábra). Mindkettő 6 oszlopos, kis nyomásra (max. 6 bar) tervezett háromzónás, nyitott készülék. Az oszlopok 30 cm hosszú, 2,5 cm átmérőjű BESTA 22005 típusú dugattyús üvegoszlopok. A vezérlőcsapos berendezés csapja bármely oszlopkonfigurációra beállítható, a háromcsapos megoldás lehetővé teszi az aszinkron kapcsolást is.

BA

S

F S

VICI

AR BE

B F a)

b)

4.1 ábra A tervezett, 6 oszlopos, nyitott 3 zónás készülékek. a) háromcsapos megoldás b) háromrészes elosztócsapos (vezérlőcsapos) megoldás. S – oldószer, A – komponens, B – komponens, F – szétválasztandó oldat A megvalósított készülékeket a 4.2 és 4.3 fejezetben mutatom be részletesen.

60

Készülék

Méret

Folyadékáram Oszlopok Oszlophossz Átmérő vezérlés száma (cm) (cm)

Nyomáshatár Nyitott/zárt (bar)

Zónaszám

OszlopAszinkron konfiguráció kapcsolás variálhatóság

kétrészes hatállású multifunkciós csap

6

12,5…13

1,3

3

nyitott

3

igen

nem

SMBK2

4 db nagylaboratóriumi négyállású és preparatív 4 db kétállású csap

4

50

5

50

nyitott

3 és 4

igen

igen

SMBK3

félpreparatív

háromrészes 6 állású multifunkciós csap

6

30

2,5

6

nyitott

3

igen

nem

félpreparatív

1 db 6 állású STF és 2 db 6 állású SD csap

6

30

2,5

6

nyitott

3

igen

igen

SMBK1

SMBK4

kislaboratóriumi

4.2 táblázat A tervezett SMB készülékek fontosabb jellemzői Ezek közül az SMBK1 és az SMBK2 készüléket valósítottuk meg

61

4.2 Fenilalanin vizes oldatának sómentesítése

4.2.1 Feladatmeghatározás Fermentációs

eljárások

nyersterméke

a

fermentlé.

A

hatóanyag,

a

mikroorganizmusok anyagcsere termékei, élő és elhalt mikroorganizmusok és a táptalaj maradéka egyszerre vannak jelen a fermentlében. Biotechnológiai nyerstermék lehet továbbá valamilyen nagymolekulájú szerves anyag hidrolizátuma, pl. fehérje hidrolizátumok. Ezek mind sokkomponensű összetett rendszerek, amelyekben a számunkra értékes komponens kis koncentrációban van jelen. Leggyakrabban a táptalajból származó sók mellett valamilyen szerves komponens a céltermék. A sokkomponensű rendszer bizonyos előkezelések (centrifugálás, szűrés) után alkalmassá tehető preparatív folyadékkromatográfiás művelettel történő feldolgozásra. Abban az esetben, ha a célkomponens disszociábilis csoporttal rendelkezik, az ioncserés kromatográfia lehet az egyik hatékony elválasztási módszer. Az ioncserés művelet kapacitását az egyéb ionos komponensek, a jelenlévő ásványi sók viszont nagymértékben

rontják,

ezért

igen

nagy

jelentősége

lehet

a

fermentlé

veszteségmentes sószegényítésének, ill. sómentesítésének. A kísérleti munka célja egy kiválasztott modell oldat SMB alkalmazási lehetőségének vizsgálata, ezen belül különféle polimer adszorbens állófázisok összehasonlítása, adszorpciós egyensúlyok mérése, az SMB műveleti paraméterek tervezése, optimálása. A nagy sótartalmú fermentleveket DL- -fenilalanin – nátrium-klorid modell komponensekkel helyettesítettem, amelyek vizes oldatában az aminosav koncentrációja egy nagyságrenddel kisebb, mint a sóé. Az említett komponensekkel készült vizes oldatoknak a teljes sómentesítése, tehát lehetőség szerint nagytisztaságú (>99%) és minél nagyobb koncentrációjú fenilalanin-oldat nyerése a cél, miközben az aminosav-kihozatal nem csökkenhet 90% alá.

62

4.2.2 A sómentesítési kísérletekhez felhasznált eszközök és anyagok

Mintaoldatok, oldószer, kromatográfiás mozgó fázis A mintaoldatokat szilárd nátrium-klorid és DL- -fenilalanin vegyszerből készítettem, először az aminosav teljes feloldásával, majd a só hozzáadásával. A DL- -aminosav vízoldhatósága viszonylag gyenge (14 g/l 25°C-on), és nagyon lassan oldódik. A modell oldatok készítéséhez ioncserélt vizet használtam oldószerként. Az SMB bemenő oldata 3,3 g/l DL- -fenilalanin és 58,5 g/l NaCl vizes oldata volt. Eluensként tiszta ioncserélt vizet használtam.

Adszorbensek A vizsgált rendszer kémiai sajátosságait figyelembe véve, a vizes fázisú hidrolizátum-modell szétválasztásához fordított fázisú kromatográfiás tölteteket vizsgáltam. Hashimoto és szerzőtársait követve fenilalanin – NaCl vizes modell oldatok elválasztására, ill. fenilalanin adszorpciójának vizsgálatára elsőként az Amberlite XAD-7 jelű adszorbens gyantát használtam. Ezután további lehetőségem volt még néhány adszorbenst, az Amberlite XAD-1180, DIAION HP2MG és HP20 gyantákat

elválasztási

összehasonlításába

tulajdonságaik

bevonni.

A

fenti

és

töltetjellemzőik

adszorbens

gyanták

vizsgálatába, 300-500

m

szemcseátmérőjűek, durva töltetek, kis elméleti tányérszámú oszlopok készíthetők ezek felhasználásával. Az ilyen oszlopokon kicsi a nyomásesés, nagyobb folyadékáramokkal terhelhetők (adott maximális nyomású SMB rendszerben). A kísérleti kislaboratóriumi méretű SMB készülék Az aminosav sómentesítés vizsgálatához egy 3 szegmenses, összesen 6 oszlopos kislaboratóriumi méretű SMB műveleti egységet állítottunk össze a Veszprémi Egyetem Vegyipari Műveleti Tanszékén. A készülék vázlata a betáplálási és a termék folyadékáramokkal 4.2 a) ábrán látható. A 6 db üvegoszlopban a töltethossz egyenként 127 mm, a belső átmérő 13 mm. Az oszlopokban a folyadékelosztást és

63

folyadékgyűjtést polipropilén szövet korongok biztosítják. A készülék legfontosabb eleme a betáplálási- és elvételi folyadékáramok helyét változtatni képes 6 állású vezérlőcsap (4.2 b ábra). Ez egy felső állórészből és egy alsó forgórészből tevődik össze, a két rész között tömítő-csúszó felülettel. A felső részbe áramlik be a friss eluens és a szétválasztandó oldat, az alsó rész taktusidőnek megfelelő időközönként elfordul az oszlopokkal együtt egy közös tengelyen. Az oszlopforgatást egy automata frakciószedő készülék végzi, állítható időközzel és forgatási szöggel. Az SMB készülék belépő és kilépő folyadékáramait 2 db kétutas perisztaltikus szivattyú biztosítja. A rendelkezésemre álló 2 db szivattyú és ehhez a szabályozandó 4 folyadékáram bizonyos mértékig korlátot szabott a térfogatáramok szabad variálhatóságának. Ha három folyadékáramot egy nyitott SMB készüléken pontosan beállítunk, az meghatározza a negyedik mennyiségét, ugyanis 3 zónás SMB esetében: R=D-E+F , ahol az R a raffinátum térfogatárama, D a friss eluensé, E az extraktumé, F pedig a szétválasztandó oldaté. A friss eluens, az extraktum és a szétválasztandó oldat szállítását oldottam meg szivattyúval, de így az egyik szivattyúnak legalább két folyadékáramot kell áramoltatnia. A következő összefüggés szerint határozható meg a perisztaltikus pumpa (típus: PERIPUMP ’D’) által szállított térfogatáram:

Q 12,656 db

n 20

0,6328 n db

(55)

Ahol: Q – szállított térfogatáram (cm3/perc) db – perisztaltikus szilikongumi betétcső belső átmérő (cm) n – fordulatszám (1/perc) A pumpacső belső átmérők adottak, bizonyos méretek közül lehet választani, ezért ha csak két szivattyú áll rendelkezésünkre, akkor a háromból legalább 2 térfogatáram csak egymással arányosan változtatható, a fordulatszám növelésével.

64

víz

fenilalanin+ nátriumklorid

fenilalanin

nátriumklorid

ÁLLÓ

FORGÓ

a) 2

1

5

2

horony 1

1

furat 2

2

4

1 1 3 2

1

forgó rész

2

6

b)

álló rész

b) 4.2 ábra A 6 oszlopos kislaboratóriumi SMB folyadékkromatográfiás készülék a) vázlata és b) az elosztócsap forgó- és állórésze szétszerelve, felülnézetből. Jelölések: 1 – folyadékáram oszlopra, 2 – folyadékáram oszlopról, 3 – oldószer (víz) betáplálás, 4 – szétválasztandó oldat betáplálás, 5 – extraktum (fenilalanin) elvétel, 6 – raffinátum (NaCl) elvétel. A készülék fotója a Függelék 1. ábrán látható.

65

Detektálás, adatregisztrálás

A rendszer két kimenetén távozó oldatok összetételét on-line detektáltam átfolyós rendszerű detektorokkal. A vizes oldatokban jelenlévő nátrium-klorid komponens koncentrációját vezetőképességmérővel, a fenilalanint 269 nm-en átfolyó küvettás UV spektrofotométerrel mértem. A detektált jeleket kétcsatornás íróberendezés regisztrálta. Az on-line detektálás előnye, hogy kísérlet közben látható a folyamatok esetleges eltolódása. Pl. ha a raffinátumban megjelenik a fenilalanin, az UV-jelet ad, és attól függően, hogy közvetlenül taktusváltás után vagy a taktus végén jelenik meg, következtetni lehet arra, hogy az SMB első zónája nem elegendő mértékben regenerált, vagy a harmadik zónán tör át a fenilalanin. Műszeres elemzések eszközei Az on-line detektálás mellett a mérések során vett mintákat műszeres analitikai módszerekkel elemeztem. A fenilalanin koncentrációját célműszerrel, OE-914 típusú aminosav analizátorral, a NaCl koncentrációt az oldat Na+-ion tartalmából JICA AA6601F típusú atomabszorpciós-lángemissziós spektrofotométerrel, lángfotometriásan határoztam meg. Az OE-914 aminosav analizátor egy posztkolonnás származékképzéssel működő automatizált

berendezés.

Automata

a

mintainjektáló,

programozható

az

eluensválasztás (oldószergradiens), a kolonnahőmérséklet és az eluensáramoltatás időtartama. A sómentesítési kísérletek során a fenilalanin komponenst kellett meghatároznom. Ennek megfelelően konstans pH és ionerősség végeztem az analitikai elválasztást, az oszlopról távozó folyadékot ninhidrin reagenssel keverve és 80°C-on 15 percig kapilláris csőreaktorban reagáltatva a keletkező színes termékeket spektrofotométerrel 570 nm-en detektálam. Az elemzés paraméterei: Töltet:

Durrum DC-4A kationcserélő

Mintaadagolás:

automata mintaadagolóval, 30 l-es hurokból

Program:

B puffer eluens, hőmérséklet: 80°C, 20 perc/minta

66

Eluens pH-ja:

4,25

Eluens ionerőssége:

0,2 g/dm3 Na+

Eluens áramlási sebessége: 20 cm3/óra Reagens áramlási sebessége: 10 cm3/óra A minta aminosav tartalma arányos a kromatográfiás csúcs alatti területtel. Egypontos kalibrálást végeztem, referencia a sómentesítendő fenilalanin oldat volt. Az aminosav analizátorral végzett mérések egy-egy frakció aminosav tartalmára pontos eredményt adnak (átlagkoncentráció), de így nem határozható meg pl. a fenilalaninnal szennyezett raffinátum milyen okból szennyeződött (ld. on-line detektálás).

A felhasznált eszközök és anyagok

A kísérletekhez felhasznált eszközök: kromatográfiás oszlop, 6 db SMB oszlop, 1 db különálló oszlop, anyaga üveg, belső átmérője 13 mm, a töltetágy magassága 127 mm, 1 db mintabemérő csap, 300 l-es, és 800 l-es mintabemérő hurkokkal, anyaga polipropilén, átalakítható kétállású váltócsappá frontális kísérlethez, 1 db WATERS ASSOCIATES MODEL 450 UV spektrofotométer, átfolyó küvettás, megválasztható hullámhosszúságon mér, 1 db GILSON 116 UV spektrofotométer, átfolyó küvettás, 2 db RADELKIS OK102/1 vezetőképességmérő, átfolyós, 2 db PERIPUMP ,D’ perisztaltikus szivattyú, 20 és 120 1/perc között változtatható, stabilizált fordulatszámú , 2 db LINE RECORDER TZ4620 kétcsatornás adatregisztráló, változtatható papírsebességű, 1 db OE 914 aminosav analizátor

67

570 nm-en mérő fotométerrel, 2 db mikroszivattyúval, automatikus mintainjektálóval és automatizált többállású eluensválasztó csapokkal 1 db JICA AA-6601F Atomic Absorption Flame Emission Spectrofotometer AAS műszer egyebek, szilikon és polietilén folyadékszállító csövek, kb. 3 m, 14 db gumidugó, 14 db polipropilén szűrőréteg korong, Mohr-szorítók, kb. 5-6 db.

A kísérletekhez felhasznált anyagok: DL- -fenilalanin a.lt., kb. 20 g , nátrium-klorid a.lt., kb. 300 g , ioncserélt víz, kb. 50 dm3 , adszorbens gyanták: Amberlite

XAD7, XAD 1180, DIAION HP2MG,

SEPABEADS SP207, mindegyikből kb. 4,5 g szárazon, DIAION HP20, kb. 31,5 g.

4.2.3 Fenilalanin sómentesítési kísérletek A megfelelő adszorbens kiválasztásához, a kezdeti SMB műveleti paraméterek Morbidelli módszerével történő tervezéséhez, illetve a művelet KROM_N, ill. SMB KROM_N programokkal történő matematikai modellezéséhez és a későbbi paraméter optimálásához néhány előzetes laboratóriumi kísérleteket végeztem egy az SMB készülékben alkalmazott kromatográfiás oszlopokkal azonos oszlopon, illetve előzetesen meghatároztam a vizsgálat céljára alkalmas gyanták összehasonlítására szolgáló alábbi adatokat is:  a vizsgált adszorbensek BET fajlagos felület és Hg-poroziméteres mérései,  NaCl, ill. DL- -fenilalanin injektálás töltetjellemzők, mint elméleti tányérszám, összporozitás meghatározására.  az adszorbensek összehasonlító elemzése frontális kromatográfiával,

68

 DL- -fenilalanin egyensúlyi izotermáinak mérése NaCl jelenlétében a kiválasztott adszorbensen, A BET fajlagos felületeket és a pórusméret eloszlást a Veszprémi Egyetem Környezetmérnöki és Kémiai Technológiai Tanszék segítségével határoztuk meg. A

további

méréseket

folyadékkromatográfiás

célszerűen

oszlopon

az

végeztem.

SMB Az

oszlopaival eluens

és

megegyező a

mintaoldat

áramoltatásához ezen mérések során is perisztaltikus szivattyút használtam, a detektálást az előzőekben már bemutatott módon végeztem. A frontális adszorpciós méréseket később, az egyensúlyi adszorpciós jellemzők kimérése után a szimulációs szoftver segítségével modelleztem. A mért és számított áttörési görbék jó egyezése igazolja az egyensúlyi izoterma mérések és a szimuláció, a matematikai modell megfelelőségét. Az előzetes mérések eredményei alapján kiválasztott, a sómentesítésre leginkább megfelelő adszorbens töltetet az SMB készülék oszlopaiba töltöttem. A kezdeti műveleti paramétereket Morbidelli (lineáris) módszerrel határoztam meg, majd a kezdeti térfogatáramokat közelítőleg egyenesen arányosan növelve és a taktusidőket fordított arányossággal csökkentve vizsgáltam az elválasztás jellemzőit, a műveleti jellemzők változását. Az SMB KROM_N szimulációs szoftverrel előre becsültem a mérések várható műveleti jellemzőit. Adszorbens gyanták előkészítése a mérésekhez Mérések előtt a már használt gyantákat főzőpohárban 2 mólos absz. etanolos NaOH oldattal melegítve, majd 30 mm átmérőjű mosóoszlopon először etanollal, majd ioncserélt vízzel többször átmosva regeneráltam. Az első alkalommal felhasznált friss légszáraz gyantákat kb. 1 órán át a pezsgés megszűntéig alkoholban hagyva duzzasztottam, a pórusok levegőjének kiszorítása céljából, majd az alkoholos gyantát ioncserélt vízzel mostam üveg mosóoszlopon, kb. a gyanta térfogatának 10-szeres mennyiségével.

69

Folyadékkromatográfiás oszlop töltése adszorbenssel Az oszlop hengerpalástjaként egy 13 mm belső átmérőjű, 16mm külső átmérőjű és 160 mm hosszú üvegcsövet használtam. A kromatográfiás oszlopot ún. slurry (iszapolásos) módszerrel töltöttem, amelynek a lényege, hogy az adszorbens gyantagyöngyöket ioncserélt vízzel szuszpendálva töltöttem az oszlopba ügyelve a légmentes töltésre. A teljes feltöltés és a szűrőréteg felhelyezése után axiális nyomás alkalmazásával értem el a töltetágy megfelelő tömörítettségét. Minden általam vizsgált gyanta esetében 127 mm magasságú töltetágyat hoztam létre. Adszorbens töltet kiválasztása az elválasztási feladathoz A töltet kiválasztásának a következő lépései voltak: 1. Szakirodalomban

előforduló

hasonló

elválasztásokról

szóló

publikációk

tanulmányozása. Ezzel szűkítettem a kört a sztirol-divinilbenzol és a polimetakrilát gyantákra. 2. BET fajlagos felület és porozitás, pórusméret-eloszlás mérés. A méréseket a DIAION HP2MG és Amberlite XAD-7 polimetakrilát, illetve DIAION HP20 és Amberlite XAD-1180 sztirol-divinilbenzol kopolimer gyantákon végeztük. 3. Azonos vagy közel azonos körülmények (mintakoncentráció, áramlási sebesség) között végzett frontális adszorpciós-deszorpciós mérésekkel hasonlítottam össze a kiválasztott polimerek tulajdonságait a végső töltetválasztáshoz. A frontális kromatográfiás méréseket a későbbi SMB kísérletekhez is alkalmazott fenilalanin – NaCl oldatokkal végeztem. A frontális kromatográfia azért előnyös módszer az adszorbensek kiválasztására, mert az SMB egyes zónáiban a frontális adszorpcióhoz, illetve deszorpcióhoz hasonlóan játszódik le a komponenselválasztás. Pl. egy háromzónás SMB folyadékkromatográf első zónájában a jobban kötődő komponens deszorpciója, a harmadikban frontális adszorpciós folyamat zajlik. Így az SMB működésével leginkább összevethető úton választottam ki a fenilalanin sómentesítéséhez megfelelő gyantát, a DIAION HP20 jelűt. A vizsgált gyantákat a szelektivitási és kapacitási tényezőkkel jellemeztem. A kísérleti paramétereket és az eredményeket a 4.3 táblázatban mutatom be. 70

A frontális adszorpciós – deszorpciós görbéket a Függelék 2. ábrasorozatán tanulmányozhatjuk.

Adszorbens gyanta

Térfogatáram (cm3/perc)

1,76

NaCl

Phe

Áttörési görbék inflexiós pontja 3 (cm ) NaCl Phe

58,4

2,70

12,5

Minta összetétele (g/dm3)

75,3

Kapacitási tényező k' Phe

5,02 0,74

DIAION HP20

DIAION HP2MG

Amberlite XAD1180

Amberlite XAD7

Összporozitás

4,74

58,4

3,22

12,5

65,0

4,2

0,76

58,5

2,70

12,1

33,2

1,74 0,72

2,04

58,5

3,22

12,1

21,0

0,74

1,79

58,5

2,70

14,0

62,9

3,49

4,67

58,5

3,22

14,0

56,0

3,00

0,53

123,0

3,00

13,8

29,3

1,12

0,95

58,4

3,00

13,8

23,4

0,70

1,62

58,4

3,00

13,8

23,8

0,72

0,83

0,82

4.3 táblázat Frontális mérések paraméterei és eredmények. A négy különböző gyantából 13 mm belső átmérőjű üvegoszlopban 127 mm magas töltetágyakat készítettem és a méréseket ezeken végeztem.

Adszorpciós egyensúlyok mérése A fenilalanin adszorpciós izotermáit 20°C-on egylépcsős frontális adszorpcióval határoztam meg 0,002…0,02 mol/dm3 koncentráció tartományban, 5 különböző koncentrációjú fenilalanin oldattal. Az SMB oszloppal megegyező geometriájú DIAION HP20 gyantával töltött oszlopot először egyensúlyba hoztam az aminosavsó oldattal, majd az áttörési görbén az ún. plató elérésekor a váltócsappal az eluenst, vagyis ioncserélt vizet adtam az oszlopra (4.3 ábra). Az átváltásig fogyott mintaoldat

71

térfogatából és az aminosav koncentrációból kiszámítottam az oszlopra vitt aminosav mennyiséget. Ebből kivonva az áttörési görbe alatti területet – ami megmutatja az oszlopon áttörő aminosav mennyiségét – , és az oszlop ürestérfogatában lévő aminosav mennyiséget, megkaptam az oszlopon megkötődött aminosav mennyiségét. Ezt elosztva a töltet szárazon mért tömegével kaptam meg a száraz gyantára vonatkoztatott szilárdfázisbeli aminosav koncentrációt. Az izotermát vizes oldatban és 0,25, ill. 1,0 mol/dm3-es NaCl-os oldatban mértem a 4.4 táblázatban szereplő fenilalanin koncentrációkkal és térfogatáramokkal.

Fenilalanin-koncentrációk (koncentrációlépcsők) (mol/dm )

(g/dm )

Minta térfogatáram (cm3/perc)

1.

0,002

0,33

2,2

2.

0,005

0,83

2,2

3.

0,01

1,65

2,2

4.

0,015

2,48

2,2

5.

0,02

3,30

2,2

Minta száma

3

3

4.4 táblázat Aminosav-koncentrációk a 0, 0,25 és 1,0 mólos NaCl-os vizes oldatokban

72

fenilalanin-koncentráció (mol/dm3)

0,02

0,01 váltás eluensre

0 0

50

100

150

200

250

300

350

3

térfogat (cm )

4.3 ábra Egylépcsős frontális adszorpciós izoterma mérés ~0,01M fenilalanin oldattal vizes oldatban DIAION HP20 adszorbensen. Váltás mintáról az eluensre: 126,8 cm3.

A különböző sókoncentrációk mellett mért fenilalanin izotermákat összevetve megállapítható, hogy az izotermák egyrészt jelentős mértékben függnek a sókoncentrációtól – a sókoncentráció növelésével eltolódik az egyensúly a szilárd fázison való megkötődés felé – másrészt ha az izotermára a Langmuir típusú összefüggést értelmezzük, akkor a legjobb illeszkedést úgy kapjuk, ha a sókoncentrációtól függő tényezőt a kezdeti meredekséget meghatározó Langmuir paraméterbe illesztjük:

qPhe

(0,0969 cNaCl 19,4) cPhe 1 b cPhe

(56)

Az izoterma kezdeti meredekségét meghatározó Langmuir paraméter (a fenti képletben a számlálóban zárójeles tényező) a sókoncentráció növelésével nő. Az izotermákat a 4.4 ábrán tanulmányozhatjuk.

73

50

q (mg aminosav/g sz.gyanta)

45 40 35 30 25 20 15

víz, a=19,4279 b=0,2026

10

0,25M NaCl, a=20,836 b=0,1945

5

1,00M NaCl, a=25,0943 b=0,2322

0 0

0,5

1

1,5 2 2,5 3 c (mg aminosav/cm oldat)

3

3,5

4

4.4 ábra A DL- -fenilalanin sókoncentrációtól függő egyensúlyi izotermái 20°C-on, ioncserélt vízben, 0,25 mólos és 1,0 mólos NaCl-oldatban mérve. Jelölések: q – gyantafázisbeli aminosav koncentráció száraz adszorbens egységnyi tömegére vonatkoztatva, c – folyadékfázisbeli aminosav koncentráció egységnyi folyadéktérfogatra vonatkoztatva, a – Langmuir izoterma, a paraméter (cm3 folyadék/g száraz adszorbens), b – Langmuir izoterma, b paraméter (cm3 folyadék/mg aminosav).

A NaCl vízben teljesen disszociáló só. A frontális kísérletek alkalmával is láttam, hogy nagyjából a holttérfogattal azonos térfogatnál gyorsan megindul felfelé a vezetőképesség és a platót nagyon gyorsan, 1-2 cm3 átfolyása után eléri. Ebből következtethető tehát, hogy a sónak gyakorlati jelentőségű kölcsönhatása a hidrofób gyantákkal nincs. A só ezért az alapvető töltetjellemzők meghatározásához jelzőanyagként használható.

74

Töltetjellemzők meghatározása A minta inert, NaCl komponensének impulzusszerű injektálásával és a kapott válaszfüggvények (vezetőképesség az idő függvényében) detektálásával az elméleti tányérszámot, tányérmagasságot vizsgáltam a térfogatáram függvényében, illetve meghatároztam a gyanta összporozitását. Ehhez 0,5…3,5 cm3/min térfogatáram tartományban injektáltam 300- és 800 l térfogatú mintákat. Az elméleti tányérszám, tányérmagasság grafikus módszerrel, a félértékszélességből számolva kapott eredmények a 4.5 táblázatban olvashatók. Kislabor üvegoszlop

K.1.

Oszlophossz Oszlopátmérő (cm) (cm)

12,7

1,3

Jelzőanyag

0,25M NaCl

Térfogatáram 3 (cm /perc)

Keresztmetszeti NTP áramlási 127mm sebesség oszlop(cm/perc) hossz

HETP (cm)

0,64

0,48

27,1

0,47

0,98

0,74

23,9

0,53

1,60

1,21

20,5

0,62

2,35

1,77

16,8

0,76

2,58

1,94

16,2

0,78

2,87

2,16

15,5

0,82

3,89

2,93

12,9

0,98

Összporozitás

0,74

4.5 táblázat HP20 adszorbenssel töltött kislaboratóriumi oszlop jellemzői

HETP 15664 , u 3,635 Ahol: HETP – elméleti tányérmagasság (mm) u – térfogatáram (cm3/perc) A holttérfogatot (12,5 cm3) elosztva a teljes oszloptérfogattal kaptam az összporozitás értékét. A holttérfogat a NaCl retenciós idejéhez tartozó térfogatnak tekinthető. Az így kapott összporozitás: =0,74 volt a 13 mm átmérőjű és 127 mm hosszú HP20 tölteten.

75

Az előzetes mérések eredményeinek értékelése A gyanták fizikai tulajdonságait meghatározó BET fajlagos felület és Hgporoziméteres mérések alapján a polisztirol-divinilbenzol HP20 és XAD1180 gyanták, valamint a polimetakrilát típusú HP2MG fajlagos felülete, pórustérfogata és átlagos pórusátmérője közel azonos, míg a polimetakrilát XAD-7 gyantánál minden mért érték kisebb.

592,6

567,2

575,1 BET fajlagos felület [m2/g]

12,97 9,81

265,5

8,52 6,29

átlagos pórusátmérő [nm] 1,753

0,51 XAD7

kumulatív pórustérfogat az 1,7…300nm pórusátmérő tartományban [cm3/g]

XAD1180

1,136

1,089

HP2MG

HP20

4.5 ábra Fajlagos felület, kumulatív pórustérfogat és átlagos pórusátmérő mérési eredmények A kereskedelmi kiadványokban szereplő adatoktól a mért adatok nem térnek el jelentősen (4.5 ábra). A fizikai jellemzőket tekintve a XAD-7 várhatóan a legkisebb kapacitású gyanta, a fennmaradó három adszorbens között az adszorbensadszorbeátum kölcsönhatások erőssége befolyásolja a kapacitási tényező mértékét. A kölcsönhatásokat vizsgálva elméleti megközelítésben, ha a fenilalanint tekintjük, mint modell aminosavat, akkor a HP20 és a XAD1180 poliaromás kopolimer

76

gyantákon nagy kapacitási tényezők várhatók a kémiai hasonlóság miatt (fenilalanin aromás aminosav – poliaromás adszorbens). Az adszorpció egyensúlyi-dinamikai jellemzőit frontális kromatográfiás kísérletekkel vizsgáltam (ld. Függelék 2. ábrasorozat). Fenilalanin - NaCl oldattal történő adszorpciós – deszorpciós ciklust többféle áramlási sebességnél végeztem. Az áttörési görbéket elemezve kis térfogatáramoknál (legfeljebb 0,5 cm3/percnél) a vizsgált adszorbensek mindegyike jó szétválasztást biztosít. Percenkénti 0,5 cm3-nél nagyobb térfogatáramnál a XAD-7 és a HP2MG jelű gyanta esetében a fenilalanin és a nátrium-klorid áttörésének kezdete egyidőben jelentkezett (csökken a fenilalanin áttörési görbéjének élessége). Így ez a két gyanta nem alkalmazható az elválasztáshoz, ugyanis nem biztosítható a sóoldat elvétele aminosavtól mentesen, emiatt az SMB kísérletnél a fenilalanin kihozatal a célkitűzésbe foglalt 90% alá csökkenhet. Még nagyobb, 2 cm3/min feletti térfogatáramnál a XAD-1180 jelű gyanta is az előző kettőhöz hasonlóan viselkedik. Ilyen szempontból a HP20 adszorbens stabilan viselkedett, és 4 cm3/min feletti áramlásnál is szedhető volt tiszta NaCl-os frakció telítéskor és tiszta fenilalaninos frakció elúciókor. A frontális kíséletek alapján a XAD1180 és a HP20 egyaránt alkalmas nagy termelékenységű és kihozatalú SMB elválasztásra, a HP20 gyanta dinamikai jellemző jobbak, ezért az SMB kísérletek kivitelezéséhez a HP20 jelű gyantát választottam. Az SMB paraméterek meghatározásához a következő lépés a kiválasztott adszorbensen az adszorpciós egyensúly mérése volt. A frontális adszorpciósdeszorpciós mérések során érdekes jelenséget figyeltem meg. A deszorpció indításakor a NaCl oszlopról történő távozása után a fenilalanin koncentrációja a betáplált fenilalanin-koncentráció fölé emelkedett (elúciós szakaszban távozó többlet fenilalanin, ld. Függelék 2. ábrasorozat), majd az ioncserélt víz további áramoltatása után már a szokványos elúciós görbe szerint csökkent. Ez arra utal, hogy a sóoldattal töltött gyantaágyban többlet fenilalanin képes adszorbeálódni a vízzel egyensúlyban lévő gyantaágyhoz képest. Ezért a későbbiekben az aminosav izotermákat NaCl jelenlétében is megmértem. A várakozásnak megfelelően a sókoncentráció emelésével arányosan növekedett az adszorbeálódott fenilalanin mennyisége a gyantafázisban a vizsgált 0,002…0,02 mol/dm3 koncentráció tartományban. Ez a

77

jelenség hasonlítható a kisózáshoz, amikor a vizes fázisból a só kiszorítja az apoláris résszel is rendelkező fenilalanint az apoláris gyantafázisba. Az SMB művelet tervezésénél ezt a jelenséget is figyelembe kell venni, ill .a szimulációs modellbe be kell építeni. Végül a töltetjellemzőkről: a mért elméleti tányérszámok a gyantaszemcsék átlagos 0,3…0,5 mm átmérőjének megfelelően kis értékűek. Előnyük, hogy a 127 mm hosszú töltetágyakon alig mérhető nyomásesés. A 6 oszlopos kislaboratóriumi SMB is kisnyomásra tervezett készülék, ezért a sómentesítésre ilyen szempontból a nagyszelektivitású modell rendszerben várhatóan megfelelnek. Az SMB műveleti paramétereinek meghatározása A kezdeti műveleti paramétereket lineáris Morbidelli-módszerrel határoztam meg egy minimális szétválasztandó oldat térfogatáramból kiindulva (4.6 táblázat, 4.6 ábra). A kezdeti paraméterekből kiindulva a termelékenységet a térfogatáramok együtt történő arányos növelésével és a taktusidők arányos csökkentésével próbáltam növelni. A Morbidelli-kritériumokhoz meg kell határozni a komponensek egyensúlyi megoszlási hányadosát. A jobban kötődő extraktum áramban dúsuló fenilalanin megoszlási hányadosa KA=20,15, a nem kötődő, raffinátumban dúsuló NaCl-é KB=0. KA és KB mértékegysége:

mg aminosav g száraz gyanta

mg aminosav cm3 oldat

A 4.7 ábrán látható a Morbidelli kritériumok által meghatározott terület változása a sókoncentráció

függvényében

(nemlineáris,

sókoncentráció-függő

izotermára

számított Morbidelli terület). A kislaboratóriumi SMB készüléken nyitott, háromzónás üzemmódban mértem, 2-2-2 oszlopkonfigurációval, ~20°C-on. A szétválasztandó oldat (modelloldat) fenilalaninkoncentrációja 3,3 g/dm3 (0,02M), a sóé 58,44 g/dm3 (1,0M) volt). A modelloldat sókoncentrációját azért választottam több nagyságrenddel nagyobbra, ugyanis a gyakorlatban, fehérje hidrolizátumok esetén is nagy feleslegben van jelen a hidrolizáló sav, ami semlegesítéssel sóvá alakul át, míg az értékes komponens csak néhány millimólos koncentrációjú.

78

3

Mérés

cF (g/dm ) Phe NaCl

SMB3

3,3

SMB4 SMB5

T

D

E

3

3

F

R

Oszlopkonfiguráció

(min)

58,44

2:2:2:0

26

2,86

1,23

0,33

1,96

3,3

58,44

2:2:2:0

15

5,55

2,45

0,83

3,93

3,3

58,44

2:2:2:0

12,5

6,95

3,06

1,21

5,11

3

3

(cm /min) (cm /min) (cm /min) (cm /min)

4.6 táblázat A kislaboratóriumi SMB készüléken végzett fenilalanin sómentesítési kísérletek műveleti paraméterei

25

20

15 mIII 10

SMB3 SMB4 SMB5

5

0 0

5

10

15

20

25

mII

4.6 ábra A sómentesítési kísérletek munkapontjai a lineáris egyensúlyi Morbidelli háromszögben, ahol nem tekintjük a fenilalanin-izotermák sókoncentráció függését

79

25

20

15 mIII

SMB3 2:2:2:0 sómentes SMB4 2:2:2:0 1M sóval SMB5 2:2:2:0 1M sóval háromszög sómentes esetben háromszög 0,25M sóval háromszög 1M sóval

10

5

0 0

5

10

15

20

25

mII

4.7 ábra A három mérési pont a sókoncentrációval számított Morbidelli területekben

A fenti paraméterekkel végzett SMB kísérleteket csak utólag (a kísérletek után), a matematikai modell és a szimulációs szoftver átalakítása után. Az SMB kísérletek műveleti jellemzői és az eredmények értékelése Három kísérletet végeztem, ezek közül az első a kezdeti, egy minimális betáplálási térfogatárammal végrehajtott mérés volt. A sókoncentráció-függő (nemlineáris) Morbidelli háromszöget figyelembe véve a felső határig növeltem a térfogatáramokat, ahol elméletileg elérhető mindkét termékben (extraktum, raffinátum) a tiszta komponensek kinyerése. Eszerint mindhárom mérés során az extraktumban nagytisztaságú sómentes aminosavat, a raffinátum áramban teljesen aminosav mentes NaCl-ot kell kapnunk és a legnagyobb térfogatáramokkal végrehajtott SMB5 mérésnél érhetjük el a legnagyobb termelékenységet. A kísérlet nem igazolta a lineáris elmélet szerinti várakozásomat (4.7 táblázat), a raffinátum elszennyeződése fenilalaninnal (fenilalanin veszteség) nem magyarázható a nemlineáris Morbidelli módszerrel sem, ugyanis mindhárom mérés munkapontja a nemlineáris Morbidelli-területeken belül helyezkedik el (4.7 ábra). 80

Oldószer fajlagos felhasználás

Mérés

Termelékenység (mg/g h)

Tisztaság (%m/m)

NaCltartalom (ppm)

Kihozatal %

(cm3 ioncs.víz/ mg Phe)

SMB3

0,667

>99,9

26

95,6

9,53

SMB4

1,645

>99,9

38

93,0

7,50

SMB5

2,302

>99,9

45

89,1

6,71

4.7 táblázat A három sómentesítési kísérlet műveleti jellemzői. A céltermék fenilalaninra számoltam a tisztaságot, a maradék sótartalmat a kihozatalt és az oldószer fajlagos felhasználást. A 100%-nál kisebb kihozatal azt jelenti, hogy a fenilalanin nagyrészt az extraktumban távozik, de emellett a raffinátumban is megjelenik. A raffinátumban kis mennyiségben megjelenő fenilalanin oka – és ez már a frontális méréseknél is látszott, – hogy az elúciós szakaszban az aminosav koncentráció 90%ával történő csökkentéséhez ugyanannyi eluens kell, mint a maradék kb. 10%-hoz. Emiatt az elnyúlt elúciós görbe miatt nagyon lassú az SMB első zónájának regenerálása. Ez okozza az aminosav veszteséget, ami látszik az SMB5 mérés raffinátum regisztrátumán is (4.8 b ábra).

81

25

UV, vezkép jel regisztrátuma (cm)

fenilalanin NaCl 20

15

10

5

0 37,5

50

62,5

75

idő (perc)

a)

UV, vezkép jel regisztrátuma (cm)

14

NaCl fenilalanin

12 10 8 6 4 2 0 37,5

50

62,5

75

idő (perc)

b) 4.8 ábra Az SMB5 mérés a) extraktumának és b) raffinátumának regisztrátuma kvázistacioner állapotban Látszik, hogy a raffinátumban minden taktusváltás után közvetlenül minimálisan megemelkedik az aminosav koncentráció, majd a taktus vége felé fokozatosan

82

csökken. Ez azt jelenti, hogy az első zóna első oszlopának regeneráltsága nem 100%os, és amikor az első oszlop taktusváltáskor a harmadik zóna végére kerül, magával viszi az aminosav egy részét. Ez vezet a kihozatal csökkenéshez. A három mérés közül tehát az SMB4 mérés az, amelyik teljesíti a kutatási célban leírt feltételeket, tehát a 99%-osnál nagyobb tisztaságot és a 90%-osnál nagyobb aminosav kihozatalt, és egyben ez volt az időegységre és egységnyi adszorbenstömegre vonatkoztatva a legtermelékenyebb.

Szimuláció eredményei A frontális- és az SMB kísérletek matematikai modelljét a kísérletek elvégzése után készítettem el, az eredeti szimulációs szoftvert jelentősen kellett módosítani ahhoz, hogy 4 oszlopos helyett 6 oszlopos SMB-t tudjon modellezni, és a sókoncentrációtól függő adszorpciós egyensúlyt is integráltam a programban. Egy frontális kísérlet mérési és szimulációs eredményének összehasonlítása látható a 4.9 ábrán:

70

8

HP20

Q=4,74 ml/perc 7

60

fenilalanin számított fenilalanin mért

6

NaCl számított

deszorpció: 160,9 ml-től

5

NaCl mért 40

4

30 3

20 2

10

fenilalanin-koncentráció [g/L]

NaCl koncentráció [g/L]

50

1

0

0

0

50

100

150

200

250

300

350

400

térfogat [ml]

4.9 ábra Fenilalanin – só frontális adszorpciós mérés és szimuláció

83

4.3 Fenilalanin-glicin aminosav elválasztás vizsgálata

4.3.1 Feladatmeghatározás Ebben a fejezetben többkomponensű aminosavoldatok SMB elválasztását

vizsgálom,

modelloldatként fenilalanin-glicin vizes oldatát használva. Kísérleti munkámhoz a Veszprémi Egyetem Vegyipari Műveleti Tanszéke és a Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Rt. közös projektjével készült nagylaboratóriumi, nagynyomású négyoszlopos készüléket használtam. Hasonlóan a fenilalanin sómentesítéshez, most is a következő lépésekkel történt a fenilalanin-glicin oldat SMB elválasztásának vizsgálata: 6. Az elválasztáshoz legelőnyösebb töltet kiválasztása frontális kromatográfiával. 7. Adszorpciós egyensúlyok mérése. 8. Töltetjellemzők (elméleti tányérszám, tányérmagasság, összporozitás mérése). 9. Kezdeti SMB paraméterek tervezése Morbidelli módszerével. 10. Műveleti paraméterek optimálása szimulációs szoftver segítségével. Az alapvető, klasszikus kétkomponensű elválasztás hatékonyságát néhány paraméter változtatásával vizsgáltuk, mint az oszlopkonfiguráció, a rendszer hőmérséklete és az aminosav-koncentráció. Célom volt a fenilalanin-glicin kétkomponensű vizes oldatból nagytisztaságú (>99,9%) elsősorban fenilalanin (főtermék), másodsorban glicin oldat nyerése, minél nagyobb termelékenység elérése mellett.

4.3.2 A fenilalanin-glicin elválasztáshoz felhasznált eszközök és anyagok

Mintaoldatok, oldószer, kromatográfiás mozgó fázis A mintaoldatok szilárd glicinből és L-fenilalaninból készültek ioncserélt vízzel. Mindkét aminosav gyorsan oldódik vízben, az általam mért oldhatósági adatokat 4.8 táblázatban foglaltam össze. Érdekes, hogy az L-fenilalanin oldhatósága kb. kétszerese a DLfenilalaninénak.

84

oldhatóság g komponens/100g víz glicin L-fenilalanin 20°C ~250 30°C 2,51 40°C 2,94 50°C 3,39 60°C 4,71

4.8 táblázat A glicin és fenilalanin oldhatósága különböző hőmérsékleteken ioncserélt vízben 5

oldhatóság [g Phe/100g víz]

4,5 4 3,5 3 2,5 S = 0,0001T3 - 0,0166T2 + 0,6896T - 6,9749 30 és 60°C között

2 1,5 1 0,5 0 20

30

40

50

60

70

hőmérséklet [°C]

4.10 ábra Az L- fenilalanin vízoldhatóságának hőmérsékletfüggése S – oldhatóság (gramm L-fenilalanin 100 g vízben), T – hőmérséklet (°C) Az L-fenilalanin oldhatóságát a hőmérséklet függvényében is vizsgáltam. A frontális mérésekhez 0,83 g/l (0,005M) L-fenilalanin, 0,04 g/l (0,0005M) glicin oldatot készítettem. Az első SMB kísérlet bemenő oldata 3,3 g/l (0,02M) L-fenilalanin és 1,5 g/l (0,02M) glicin vizes oldata volt. A szétválasztandó oldat koncentráció változtatásának SMB műveletre gyakorolt hatását vizsgálva ezen kívül 0,38 g/l fenilalanin és 0,2 g/l glicin, 5,9 g/l fenilalanin és 2,7 g/l gicin, végül 8,3 g/l fenilalanin és 3,8 g/l glicin oldatokat használtam szétválasztandó betáplálási oldatként. SMB deszorbensként tiszta ioncserélt vizet alkalmaztam.

85

Adszorbensek

Az előző fejezetben már bemutatott DIAION HP20, illetve időközben újonnan beszerzett SEPABEADS SP825 jelű gyantát vizsgáltam fenilalanin – glicin elválasztás céljából. Az SP825 vízben sötétbarna színű, kb. 1000 m2/g fajlagos felületű és durva szemcséjű gyanta. Mindkét gyantatípusból a 0,3…0,5 mm gyöngy-átmérőjűből készítettem kislaboratóriumi méretű oszlopot az előzetes mérések céljára, és ugyanezzel töltöttem az SMB oszlopokat is.

A kísérleti nagylaboratóriumi méretű, félpreparatív SMB készülék A készülék 4 db 50 mm belső átmérőjű és 500 mm hosszúságú,termosztálóköpennyel ellátott saválló acél oszlopból áll. Az acéloszlopok folyadékelosztója és -gyűjtője lyuk-csatorna, illetve csatorna-lyuk rendszerű, 50

-os saválló frittel van kiegészítve. A megfelelő

folyadékáram betáplálási- és elvételi pontok változtatását 4 db háromutas, kétállású és 4 db ötutas négyállású SWAGELOCK típusú csappal végezzük. A készülék csővezeték rendszere 1/8”-os saválló csövekből van. A szétválasztandó oldat és a friss eluens betáplálásnál légtelenítő csapok vannak beépítve. A rendszer nyomását, a legnagyobb nyomású pontra, az eluensbetáplálás csővezetékébe beépített manométerrel ellenőrizzük. A 4 oszlop és a többállású csapok saválló állványzaton vannak elhelyezve. Különálló, saválló acélból készült kerekes kiskocsikon foglalnak helyet a készüléket kiszolgáló szivattyúk. Az egyik kiskocsira az eluensbetáplálást biztosító LEWA EKM-1 típusú membránszivattyút és a szétválasztandó oldat betáplálást biztosító PROMINENT membránszivattyút, míg a másikra, az extraktumot, illetve négyzónás üzemmódban a raffinátumot szállító 2 db LEWA EK-16 típusú dugattyús szivattyút szereltük fel. Az SMB készülék mind a négy szivattyú üzemeltetésével használható nyitott négyzónás 1-1-1-1 üzemmódban. A raffinátum szivattyú kikapcsolásával és a többállású csapok megfelelő pozíció kombinációjával elérhető az 1-1-2, az 1-2-1 és a 2-1-1 oszlopkonfigurációjú háromzónás üzemmód is az adott feladatnak megfelelően. Néhány, az új készülék tömítettségét, nyomás- és áramlási viszonyait tesztelő kísérlet és az első három SMB mérés elvégzése után elkészítettük a berendezés automatizálásának terveit. A fentiekben felsorolt oszlopkonfigurációk beállítására alkalmas, választható taktusidejű, és taktusváltáskor a szivattyúkat automatikusan leállító, majd újraindító PLC automatikát kapott az SMB. Emellett a kézi vezérlési mód is megmaradt, ebben az esetben kapcsolókkal vezérelve, a SWAGELOCK MS-142DCZ és MS-141DCX aktuátorokkal történik a többállású

86

csapok forgatása. A készülék vázlata az egy SMB ciklust kiadó 4 taktus folyadékáramaival (egy rajzon, különböző színekkel ábrázolva) a 4.11 ábrán látható. D LRIN

E

F

R

1.részperiódus 2.részperiódus 3.részperiódus 4.részperiódus

D

D E

F

D E

F

F R

D E

E

F

R R

I.

II.

R

III.

IV.

LROUT

4.11 ábra A 4 oszlopos nagylaboratóriumi SMB folyadékkromatográf vázlata 1-1-1-1 oszlopkonfigurációval. A nyilak a készülék belső folyadékáramainak irányát jelzik. Az egy elméleti ciklust alkotó 4 taktus folyadékáramait négyféle színnel ábrázoltam: barna – 1.taktus, lila – 2.taktus, zöld – 3.taktus, kék – 4.taktus. Az 1-1-2, az 1-2-1 és a 2-1-1 oszlopkonfigurációk a Függelék 3. ábráján láthatók.

87

a)

b) 4.12 ábra

Az SMB folyadékkromatográf a) kézi csapokkal b) PLC vezérléssel és hőszigetelve

Detektálás, adatregisztrálás

Az izotermamérés során a glicin és a fenilalanin egyensúlyát külön-külön mértem, a glicint 220 nm-en, a fenilalanint 269 nm-en UV-spektrofotométerrel detektáltam. A frontális és az SMB mérésekről: UV tartományban spektrofotometriásan a glicin nem detektálható a fenilalanin mellett (ld. L-fenilalanin abszorpciós spektruma, 4.13 ábra). A glicinnek 220 nm hullámhosszhoz, a fenilalaninnak 254 nm-hez tartozik a legnagyobb abszorbanciája, de a fenilalanin 220 nm-hez tartozó második abszorbancia csúcsa is többszöröse a glicinének (ugyanannál a koncentrációnál). Ezért a frontális méréseknél a fenilalanin áttörési görbéjét UV-spektrofotométerrel 269 nm-en vettem fel, míg a glicinét az előbb ismertetett okok miatt az oszlopról távozó folyadékból vett 2-3 cm3-es frakciók utólagos aminosav-analizátoros elemzésével határoztam meg. Az SMB kísérleteknél a taktusok alatt szedett frakciók átlag-koncentrációját (glicin és fenilalanin) aminosav analizátorral mértem.

88

10 9

abszorbancia × 10

8 7 6 5 4 3 2 1 0 190

210

230

250

270

290

hullámhossz (nm)

4.13 ábra Az L-fenilalanin UV-spektruma 0,33 g/l-es vizes oldatban. A spektrumot GILSON 116 típusú UV-spektrofotometriás HPLC-detektorral vettem fel.

A fenilalanint az abszorbancia maximuma helyett a továbbiakban 269 nm-en detektáltam (adott fényút-hosszúságú UV detektor „elvakulásának” megelőzése végett). Másik detektálási feladat a töltetjellemzők mérésekor az injektálás válaszfüggvényének felvétele. Az SMB oszlopok tányérszám méréséhez használt Na2SO4 jelzőanyagot átfolyó küvettás RADELKIS OK 102/1 típusú vezetőképességmérővel detektáltam. Műszeres elemzések eszközei Az aminosavak koncentrációját az előző fejezetben már bemutatott célműszerrel, az AminoChrom II OE-914 jelű aminosav analizátorral határoztam meg. Az elemzés paraméterei: Töltet:

Durrum DC-4A kationcserélő

Mintaadagolás:

automata mintaadagolóval, 30 l-es hurokból

Program:

B puffer eluens, hőmérséklet: 80°C, 20 perc/minta

Eluens pH-ja:

4,25

Eluens ionerőssége:

0,2 g/dm3 Na+-ion

Eluens áramlási sebessége: 20 cm3/óra Reagens áramlási sebessége: 10 cm3/óra

89

A minta aminosav tartalma arányos a műszerhez kapcsolt integrátor által számított kromatográfiás csúcs alatti területtel. Kalibrálógörbét vettem fel aminosav standard oldatból készített kalibráló sorral. Az SMB betáplálási szétválasztandó oldatát 40-szeres, a kilépő áramokból képzett mintákat (extrakt, raffinátum) 5-szörös vagy 10-szeres hígításban mértem.

A felhasznált eszközök és anyagok tételesen

A kísérletekhez felhasznált eszközök: 1 db, termosztálható köpennyel ellátott dugattyús üvegoszlop, anyaga üveg, hossza 320 mm, belső átmérője 13 mm, töltethossz maximum 280 mm, a dugattyú anyaga polipropilén, O-gumigyűrű tömítéssel 1 db mintabemérő csap, 300 l-es, és 800 l-es mintabemérő hurkokkal, anyaga polipropilén, átalakítható kétállású váltócsappá frontális kísérlethez, 1 db GILSON 116 UV spektrofotométer, átfolyó küvettás, 1 db RADELKIS OK102/1 vezetőképességmérő, átfolyós, 1 db LINE RECORDER TZ4620 kétcsatornás adatregisztráló, változtatható papírsebességű, 1 db OE 914 aminosav analizátor 570 nm-en mérő fotométerrel, 2 db mikroszivattyúval, automatikus mintainjektálóval és automatizált többállású eluensválasztó csapokkal egyebek, szilikon és polietilén folyadékszállító csövek, kb. 3 m, Mohr-szorítók, kb. 5-6 db.

A kísérletekhez felhasznált anyagok: L-fenilalanin, kristályos a.lt., kb. 330 g , glicin a.lt., kristályos, kb. 150 g , ioncserélt víz, kb. 800 dm3 , adszorbens gyanták: SEPABEADS SP825, kb. 1070,0 g, DIAION HP20, kb. 4,5 g.

90

4.3.3 Fenilalanin – glicin SMB kísérletek A DIAION HP20 és SEPABEADS SP825 gyantán végzett előzetes mérések:  az adszorbensek összehasonlítása frontális kromatográfiával kislaboratóriumi dugattyús üvegoszlopon,  L-fenilalanin és glicin egyensúlyi izotermáinak mérése 20 és 60°C-on kislaboratóriumi dugattyús üvegoszlopon az elválasztáshoz kiválasztott adszorbensen,  Na2SO4 injektálás az SMB oszlopaira töltetjellemzők (elméleti tányérszám, összporozitás) meghatározására. A gyantaválasztáshoz és az egyensúlyi mérésekhez egy kb. 37 cm 3 össztérfogatú, 280 mm hosszúságú és 13 mm belső átmérőjű dugattyús üvegoszlopot használtam. Az eluens és a mintaoldat szállítását perisztaltikus szivattyúkkal oldottam meg. Az előző fejezetben már bemutatott lépések következtek az elválasztáshoz előnyösebb gyanta kiválasztása után: izotermák mérése, töltetjellemzők mérése a dugattyús oszlopon, majd a szimulációs szoftverrel a frontális kísérletek modellezése. A vizsgált kétféle polisztirol-divinilbenzol gyanta jó elválasztási tulajdonságokat mutat a fenilalanin-glicin vizes oldatában. A fenilalanin mind HP20-on, mind SP825-ön nagy kapacitási

tényezővel

jellemezhetően

adszorbeálódik,

a

glicin

adszorpciója

több

nagyságrenddel kisebb. A fenilalanin-glicin SMB-elválasztásoknál a problémát elsősorban a jobban kötődő aminosav igen nagy kapacitási tényezője okozza. A nagy szelektivitás és glicinre vonatkozó kis kapacitás miatt erre a szétválasztásra előnyösen alkalmazható a háromzónás SMB. A nagy fenilalanin kapacitási tényező az SMB első zóna regenerálását nehezíti meg. A nagyobb eluensszükséglet miatt kevesebb lehet a maximálisan beadható szétválasztandó oldat betáplálási térfogatárama (mert ezáltal túlságosan megnőhet a harmadik zóna térfogatárama, ld. Morbidelli kritériumok), továbbá nagyobb extraktum hígulást eredményez. Mindezek a termelékenységet korlátozzák. Az első SMB kísérlet paramétereit Morbidelli egyensúlyi módszerével számítottam azt az elvet figyelembe véve, hogy az első zóna regenerálása a legszigorúbb feltétel, ugyanis ez a leglassúbb részfolyamat. Tehát az első zóna regenerációs idejét meghatározó eluens térfogatáramot a szivattyú maximális szállítóteljesítményének kb. 90%-ával tettem egyenlővé, így a rendszerre jellemző, közelítőleg minimális taktusidővel dolgoztam. Az első mérést a legegyszerűbben,

a

raffinátumszivattyú

kikapcsolásával

megvalósítható

1-1-2

oszlopkonfigurációval végeztem. A továbbiakban a deszorpcióhoz előnyösebb 2-1-1

91

konfigurációt vizsgáltam. Ebben az esetben az előző fejezetben már bemutatott elnyúló fenilalanin elúciós görbe miatt az oszlopprofil (fenilalanin-koncentráció hely szerinti profilja) is hasonlóan elnyúlt lesz (4.14 ábra), ezért az első zónában kétszeres oszlophosszon jobban „elfér” a szilárd fázison a fenilalanin.

aminosav-koncentráció (g/l)

1,40 1,20 1,00 glicin fenilalanin

0,80 0,60 fenilalaninmaradék

0,40 0,20

oszlophossz (cm)

0,00 0

1. oszlop D

50

2. oszlop

100

E

F

4.14 ábra Az AA01 mérés szimulációja, oszlopprofil, 10. taktus vége A további méréseknél az volt a cél, hogy valamilyen módon csökkentsem a jobban kötődő fenilalanin kapacitási tényezőjét és ezáltal kisebb eluensfelhasználást, ebből következve nagyobb termelékenységet érjek el. A kapacitás csökkenése a szakirodalom szerint többek közt a hőmérséklet növelésétől várható. Az új, emelt hőmérsékletű, izoterm SMB tervezéséhez természetesen az egyensúlyi izotermákat a tervezett magasabb hőmérsékleten is mérni kellett. A hőmérséklet emelés mértékét is meg kellett tervezni többek között a szerelvényekkel kapcsolatos előírások figyelembevételével. Az egész SMB berendezést és a betáplált friss eluenst 60°C-ra termosztáltam. A többállású csapok hőmérséklet tűrése maximum 66°C. A hőmérséklet emelés fő célja, a fenilalanin kapacitási tényezőjének csökkenése miatt várhatóan kevesebb eluenssel regenerálható az első zóna első oszlopa, így rövidebb taktusokkal dolgozva (ugyanazon betáplálási- és elvételi térfogatáramokkal)

92

nagyobb szétválasztandó oldat betáplálás alkalmazható, ezzel nagyobb termelékenység érhető el. Ezt követően még egy méréssorozatot végeztem, hogy megvizsgáljam, hogy a termelékenység hogyan növelhető a szétválasztandó aminosav oldat koncentrációjának növelésével. Ezen sorozatban utolsó mérésként a szimulációs szoftverrel optimált műveleti paramétersort alkalmaztam. Az optimált munkapont a legnagyobb aminosav-koncentrációval mért pont optimálva az adott taktusidőhöz tartozó lehető legkisebb friss eluens, legnagyobb extraktum és legnagyobb szétválasztandó oldat betáplálási térfogatárammal úgy, hogy az előírt tisztasági követelményeket is elérjük.

Folyadékkromatográfiás oszlop készítése előzetes mérésekhez, SMB oszlopok töltése Az előzetes mérésekhez egy 320 mm teljes hosszúságú, 13 mm belső átmérőjű dugattyús üvegoszlopot használtam. A gyantaágyat az előző fejezetben már bemutatott slurry technikával hoztam létre SP825, illetve HP20 adszorbensből, majd a dugattyús feltéttel rászorításával tömörítettem, így kb. 120-130 mm töltethosszt értem el. A nagylaboratóriumi félpreparatív SMB készülék oszlopainak töltésekor arra kellett figyelni, hogy az egyes oszlopokban a töltet mennyisége közelítőleg azonos legyen és a töltet szerkezete hasonlóan tömör és homogén legyen mind a négy oszlopban. Ehhez az egyik oszlopon próbatöltést végeztem slurry-iszapolásos módszerrel. A próbatöltés után 1,5-2 órán át kb 100 cm3/perc térfogattal áramoltattam a gyantaágyon az ioncserélt vizet, majd újra leszereltem az oszlopfedelet. Megvizsgáltam a töltet felületét és tömörségét. Addig töltöttem még az oszlopra újabb gyantamennyiséget, amíg a következő feltételeknek megfelelt: teljes keresztmetszeten érintkezik az oszlopfedélben lévő frittel, sima felületű, és tapintásra tömör. Ebben az esetben a gyantát kvantitatíve eltávolítottam az oszlopból, majd tömegállandóságig szárítottam 80-85°C-on. Így megkaptam azt a gyantatömeget – SP825 esetén ez 265 g légszáraz gyanta, ami szükséges egy 50 mm belső átmérőjű, 500 mm hosszúságú, 981,25 cm3-es oszlop töltéséhez. Ezután mind a négy oszlopot megtöltöttem a fentiek szerint meghatározott

mennyiségű

gyantával,

majd

az

SMB

készüléket

30

percenkénti

oszlopváltással ioncserélt vízzel járattam kb. 8 órán át.

93

Adszorbens töltet kiválasztása A töltet kiválasztásához frontális méréseket végeztem 0,83 g/l fenilalanin – 0,04 g/l glicin aminosav-keverék oldattal a 4.8 táblázatban szereplő paraméterekkel DIAION HP20 és SEPABEADS SP825 tölteteken, 13 mm belső átmérőjű és rendre 122, ill. 129 mm hosszú oszlopokon. A frontális adszorpciós-deszorpciós mérések eredményeit szintén a 4.9 táblázatban láthatjuk. A szelektivitási- és kapacitási tényezők nem mindkét gyantánál megfelelőek a szétválaszáshoz, ezek alapján mindkét vizsgált gyanta megfelel a kromatográfiás elválasztásnak. Az SP825 gyantán mért nagy fenilalanin kapacitás miatt az SMB megvalósíthatóságot vizsgálva megállapítható, hogy várhatóan nagy eluensigényű művelet lesz, tehát az SMB első zóna regenerálása a paramétertervezésben a „szűk keresztmetszet”. A glicin mindkét esetben mért igen kis kapacitási tényezője miatt alkalmazandó a háromzónás megoldás, emiatt pedig eluens-recirkulációra nincs lehetőség.

Adszorbens gyanta

Térfogatáram (cm3/perc)

Gly

Phe

Áttörési görbék inflexiós pontja (cm3) Gly Phe

Minta összetétele (g/dm3)

Kapacitási tényező k' Gly

Phe

Szelektivitási tényező

DIAION HP20

2,9

0,04

0,83

12,8

55,1

0,07

3,60

51,4

SEPABEADS SP825

2,9

0,04

0,83

13,3

114,6

0,32

10,35

32,3

4.9 táblázat Frontális adszorpciós-deszorpciós mérések 20°C-on DIAION HP20 és SEPABEADS SP825 adszorbens gyantákon. A holttérfogat, amelyet NaCl injektálással határoztam meg, a HP20 oszlop esetén 11,98 cm3, az SP825 oszlopon 10,09 cm3 volt. Jelölések: Gly – glicin, Phe fenilalanin

SMB kísérleteimhez a nagyobb kapacitású SP825 gyantát választottam, ugyanis célom volt a kapacitási tényező csökkentés SMB műveleti jellemzőire történő hatásának vizsgálata Ezt a teljes SMB (mind a négy oszlop) hőmérséklet növelésével értem el.

94

Adszorpciós egyensúlyok mérése A fenilalanin és a glicin adszorpciós izotermáit 20 és 60°C-on többlépcsős frontális adszorpcióval határoztam meg 0,002…0,02 mol/dm3 koncentráció tartományban, 5 különböző koncentrációjú aminosav oldattal, külön-külön először glicin, majd fenilalanin oldattal SP825 gyantán. A mérést a 13 mm belső átmérőjű és 129 mm hosszúságú dugattyús üvegoszlopon végeztem. Egy váltócsap segítségével a kiindulási, 0,002 mólos oldattal való egyensúly elérése után egyre töményebb oldatokat adtam az oszlopra. A legtöményebb oldat áttörése után ioncserélt vízzel eluáltam az aminosavat (4.16 ábra). A mérési paramétereket a 4.10 táblázatban foglaltam össze. Mintakoncentrációk (koncentrációlépcsők) Minta Glicinoldatok Fenilalanin-oldatok térfogatáram 3 3 3 (cm3/perc) (mol/dm ) (g/dm ) (g/dm ) 0,002

0,15

0,33

2,2

0,005

0,38

0,83

2,2

0,01

0,75

1,65

2,2

0,015

1,13

2,48

2,2

0,02

1,50

3,30

2,2

4.10 táblázat A mérések egy 13 mm belső átmérőjű, 129 mm hosszú, 12,93 cm3 oszloptérfogatú, 3,50 g légszáraz gyantával töltött, 0,59 összporozitású dugattyús üvegoszlopon történtek A fenilalanin és a glicin adszorpciós egyensúlyát SP825 tölteten 20 és 60°C-on Langmuir típusú izotermákkal jellemezhetjük. A Langmuir-izotermák a következők 20°C-on:

qGly

0,5344cGly 1 0,9291cGly

és

qPhe

34,01cPhe 1 0,1621cPhe

(57)

és

qPhe

23,47cPhe 1 0,671cPhe

(58)

60°C-on:

qGly

0,353cGly 1 0,9535cGly

A szimulációs szoftver multi-Langmuir izotermákkal számol, pl. a fenilalanin egyensúlyát 20°C-on a következő összefüggéssel számítjuk:

q Phe

34,01 c Phe 1 0,9291 cGly 0,1621 c Phe

(59)

95

Az izotermákat grafikusan a 4.15 ábrán mutatom be. A fenilalanin adszorpciója a hőmérséklet növelésével jelentős mértékben csökken, 3,3 g/dm3 oldatkoncentrációnál 20°Con még kb. 74 mg aminosavat vesz fel 1 g száraz SP825 gyanta, 60°C-on már csak 22 mg-ot. A glicin megkötődése is kisebb mértékű lesz a hőmérséklet növelésével, de nem olyan

80

3 Phe t=20°C Phe t=60°C Gly t=20°C Gly t=60°C

70 60

2,5 2

50 40

1,5

30

1

20 0,5

10 0

q (mg glicin/g száraz adszorbens)

q (mg L-fenilalanin/g száraz adszorbens)

mértékben, ami a tervezendő SMB műveletet jelentősen befolyásolná.

0 0

0,5

1

1,5 2 2,5 c (mg aminosav/cm3 oldat)

3

3,5

4

4.15 ábra Az L-fenilalanin és a glicin egyensúlyi izotermái 20°C-on és 60°C-on. Jelölések: q – gyantafázisbeli aminosav koncentráció száraz adszorbens egységnyi tömegre vonatkoztatva, c – folyadékfázisbeli aminosav koncentráció egységnyi folyadéktérfogatra vonatkoztatva Töltetjellemzők meghatározása 0,25 mólos Na2SO4 vizes oldatot injektáltam különböző, a tervezés során várható 30…200 cm3/min térfogatáramokkal a nagylaboratóriumi SMB SP825 gyantával töltött oszlopaira és a vezetőképesség válaszfüggvényeket detektáltam, majd ebből grafikus módszerrel, a félértékszélességéből számoló összefüggésekkel meghatároztam az elméleti tányérszámot és az elméleti tányérmagasságot, illetve a gyanta összporozitását külön-külön mind a négy oszlopra. Az összporozitás és az elméleti tányérszám a szimulációs szoftver bemenő adatai közé tartozik. Mivel frontális kísérleteket csak a kislaboratóriumi méretű dugattyús üvegoszlopon végeztem, ezek matematikai modellezéséhez szükség volt az üvegoszlop töltetjellemzőit is

96

mérni. Az üvegoszlopra 0,25 mólos NaCl oldatot injektáltam 2-3,5 cm3/perc térfogatáram tartományban és vezetőképességet detektáltam. Az eredményeket a 4.11 táblázatban foglaltam össze. Az SMB oszlopokon mért töltetjellemzők a mérések tanúsága szerint nem tértek el egymástól nagymértékben, 40…46 elméleti tányér mérhető 35 cm3/perc. A két szélső érték között 15%os eltérés van, ez ilyen durva szemcséjű töltet esetén nem minősül nagy oszloptöltési hibának. Így az oszlopok teljesítik azt a feltételt, hogy egymással helyettesíthetők legyenek.

SMB oszlopok

Oszlophossz Oszlopátmérő (cm) (cm)

50

1.

50

2.

5

5

Ürestérfogati NTP a áramlási teljes sebesség oszlop(cm/perc) hosszra

Jelzőanyag

Térfogatáram 3 (cm /perc)

0,25M Na2SO4

33

1,68

33 0,25M Na2SO4

HETP (cm)

Összporozitás

41,9

1,19

0,59

1,68

40,2

1,24

0,59

37,3

1,90

36

1,39

-

75,1

3,83

33,5

1,49

-

153,7

7,83

26,6

1,88

-

173,4

8,84

18,1

2,76

-

3.

50

5

0,25M Na2SO4

33

1,68

45,8

1,09

0,595

4.

50

5

0,25M Na2SO4

33

1,68

46,4

1,08

0,595

2,1

1,58

28,93

0,54

2,64

1,99

26,05

0,60

3,45

2,60

18,94

0,82

Dugattyús üvegoszlop

12,9

1,3

0,25M NaCl

0,605

4.11 táblázat

HETP 0,0043u 1,204

(60)

Ahol: HETP – elméleti tányérmagasság (cm) u – térfogatáram az 5 cm átmérőjű 0,59 összporozitású oszlopon (cm3/perc) A holttérfogat az inert Na2SO4 , illetve NaCl retenciós idejéhez tartozó térfogattal egyenlőnek tekinthető. Az így kapott összporozitás mind a dugattyús üvegoszlopra, mind az SMB saválló oszlopaira: =0,59…0,605.

97

Az előzetes mérések eredményeinek értékelése Fenilalanin és glicin SMB elválasztásának lehetőségeit vizsgáltam. A glicin a legegyszerűbb aminosav erősen poláris jelleggel. Ennek megfelelően igen jól oldódik vízben. A fenilalanin fenilcsoportja apoláris jelleget ad a molekula egyik felének, az oldallánc pedig részben poláris tulajdonságúvá teszi. Így vizes fázisban is oldékony, bár vízoldhatósága egy nagyságrenddel kisebb, mint a gliciné. A fenilalanin apoláris része és a glicin poláris tulajdonsága miatt vizes oldatban várakozásomnak megfelelően a sztirol-divinilbenzol kopolimer gyantákon nagy szelektivitás mutatkozik. A frontális kísérletekhez kétféle polisztirol-divinilbenzol állófázist vizsgáltam, a DIAION HP20 és a SEPABEADS SP825 jelűt. Az SP825 jelű gyanta fenilalaninra nézve nagyobb kapacitási tényezővel jellemezhető. Megállapítható továbbá, hogy a nagyon eltérő egyensúlyi tulajdonságok és a viszonylag kis koncentrációk miatt a két aminosav a frontális méréseknél nem befolyásolta egymás adszorpciós – deszorpciós folyamatait (ld. áttörési görbék, 4.16 ábra). A két vizsgált gyanta közül az SMB mérésekhez a választásom az SP825-re esett, mert a

nagyobb

kapacitási

tényezőjű

gyantán

várhatóan

könnyebben

vizsgálható

a

hőmérsékletnövelés hatása a kapacitásra és ezáltal az SMB műveleti jellemzőkre. Az SP825 adszorbensen az adszorpciós egyensúly mérése volt a következő feladat. Az egyensúlyi izotermákat először 20°C-on, majd 60°C-on mértem, külön a fenilalaninét és külön a glicinét vizes fázisban. Mindkét komponens adszorpciójára Langmuir-típusú izoterma illeszthető, a fenilalanin több nagyságrenddel erősebben kötődik SP825 gyantán, mint a glicin. A 60°C-on mért izotermák kezdeti meredeksége a várakozásaimnak megfelelően lényegesen kisebb, mint a 20°C-on mért izotermáké, főleg a fenilalanin esetében. A többlépcsős telítés utáni deszorpciós-elúciós görbéket összehasonlítva látható, hogy a fenilalanin deszorpciós kinetikáját is segíti a hőmérséklet emelése 20°C-ról 60°C-ra (4.16 ábra). A 20°C-on végzett izotermamérésnél a 0,02M fenilalanin-oldattal egyensúlyban lévő SP825 oszlop regenerálásához 370 cm3 ioncserélt víz kell, míg 60°C-on elég ehhez 230 cm3 víz. Ahhoz, hogy deszorpció esetén 0,02M-ról indulva a kilépő folyadékban a fenilalanin koncentrációja a századrészére essen vissza, 20°C-on 297 cm3, 60°C-on 171 cm3 eluens szükséges. Ez mindenképpen előnyös az SMB első zóna regenerálhatóságát tekintve.

98

0,025

koncentráció (mol/dm3)

0,02

0,015

0,01

0,005

0 0

300

600

900

1200

1500

térfogat (cm3)

a)

20°C-ra számított koncentráció (mol/dm3)

0,025

0,02

0,015

0,01

0,005

0 0

200

400

600

800

1000

1200

20°C-ra vonatkoztatott térfogat (cm3)

b) 4.16 ábra Fenilalanin izoterma mérése többlépcsős frontális adszorpcióval a) 20°C-on, b) 60°C-on. Látható a 60°C-os mérés deszorpciós görbéjének gyorsabb lefutása.

99

Az izotermákat egykomponensű oldatokból mértem, de a szimulációs szoftver modellje multiLangmuir-izotermát tartalmaz. Az egykomponensű izotermák a és b Langmuir-paramétereit felhasználtam a többkomponensű izotermákhoz, és így hajtottam végre a frontális kísérletek modellezését (4.17 ábra). Jól látható, hogy a szimuláció a mért áttörési és deszorpciós görbékre jól illeszkedik.

fenilalanin koncentráció (mol/dm3)

adszorpció

Phe áttörés Phe szim Gly áttörés Gly szim

deszorpció

0,005 0,004

0,0012 0,001 0,0008

0,003

0,0006

0,002

0,0004

0,001

0,0002

0 0

20

40

60

80

100

120

140

160

glicin koncentráció (mol/dm3)

0,006

0 180

mérési idő (perc)

4.17 ábra Frontális mérés 0,83 g/l fenilalanin – 0,04 g/l glicin oldattal, eluensként vízzel SP825 gyantán 2,9 cm3/perc térfogatárammal. Deszorpció kezdete: 74 perc, 214,6 cm3 20°C-on Az SMB műveleti paramétereinek meghatározása, SMB mérések eredményei, értékelés Az előzetes méréseket kisméretű folyadékkromatográfiás üvegoszlopon végeztem, és az itt kapott eredményeket a nagylaboratóriumi, oszlopméreteiben többször nagyobb SMB készülék paramétereinek tervezéséhez használtam fel. A kezdeti műveleti paramétereket most is lineáris Morbidelli-módszerrel határoztam meg, mint a kislaboratóriumi SMB-sómentesítésnél, most azonban az eluens szivattyú által szállított maximális eluens térfogatáramból kiindulva. A kezdeti paraméterekkel elvégzett szimulációk nagy terméktisztaságokat, nagy kihozatalokat és jó termelékenységet adtak. A laboratóriumi kísérletek elvégzése után a termelékenység növelése céljából az alábbi paraméterváltoztatásokat vizsgáltam: 1. Oszlopkonfiguráció változtatása 1-1-2-ről 2-1-1-re,

100

2. Rendszer hőmérsékletének növelése 20°C-ról 60°C-ra, 3. Szétválasztandó aminosav keverék oldat koncentrációjának növelése, 4. Paraméter optimálás a szimulációs szoftverrel. Az SMB paramétereket a 4.12 táblázatban, az ezekből számított Morbidelli munkapontokat a 4.18 ábrasorozaton ábrázoltam, a kísérletekből kapott műveleti jellemzőket a 4.13 táblázatban és a 4.19 ábrasorozaton foglaltam össze. A tervezés alapját képező Morbidelli-területeket a hőmérséklet és a szétválasztandó oldat koncentrációja a következőképpen befolyásolja:

25

20

20

15

15

mIII

mIII

25

10

10 Morbidelli terület t=20°C

5

3,3g/l Phe, 1,5g/l Gly 5,9g/l Phe, 2,7g/l Gly 8,3g/l Phe, 3,8g/l Gly

5

Morbidelli terület t=60°C 0

0 0

5

10

15

20

25

0

mII

10

20 mII

a)

b) 4.18 ábra

A tiszta extraktum-tiszta raffinátum területek a) a hőmérséklet függvényében 3,3 g/l Lfenilalanin és 1,5 g/l glicin szétválasztandó oldat esetén, b) a szétválasztandó oldat koncentrációjának függvényében 20°C-on. A hőmérséklet növelésével csökken a szelektivitás, így csökken a Morbidelli terület. A koncentráció növelésével is csökkennek a területek, így ha nem csökkentjük a szétválasztandó oldat betáplálás térfogatáramát, csak egy bizonyos határig növelhető a mintakoncentráció.

101

Mérés

cF (g/dm3)

Oszlopkonfiguráció Hőmérséklet

T (min)

D

E

F

3

3

3

LROUT 3

Phe

Gly

AA01

3,3

1,5

1:1:2:0

20°C

45

239,4

207,9

25,7

57,2

AA02

3,3

1,5

1:1:2:0

20°C

50

239,4

205

25,2

58,9

AA03

3,3

1,5

2:1:1:0

20°C

45

241,9

201,6

20,3

60,6

AA04

0,38

0,2

2:1:1:0

20°C

46

222,7

71,6

38,1

189,2

AA05

0,38

0,2

1:1:2:0

20°C

46

221,5

72,7

34,6

183,4

AA06

3,3

1,5

2:1:1:0

60°C

30

237,4

202,1

43,5

78,8

AA07

3,3

1,5

1:1:2:0

60°C

30

239,8

178,7

23,4

84,5

AA08

5,9

2,7

2:1:1:0

20°C

45

245,6

202,8

25,7

68,5

AA09

8,3

3,8

2:1:1:0

20°C

45

243,9

198,4

21,4

66,9

AA10

8,3

3,8

2:1:1:0

20°C

45

238,6

208,6

26,9

56,9

(cm /min) (cm /min) (cm /min) (cm /min)

4.12 táblázat AA01 … AA10 SMB mérések műveleti paraméterei Jelölések: Phe – L-fenilalanin, Gly – glicin, T – taktusidő, D – eluens-, E – extraktum-, F – szétválasztandó oldat betáplálás, LROUT – raffinátum-térfogatáram 102

Mérés

AA01

AA02

AA03

AA04

AA05

AA06

AA07

AA08

AA09

AA10

cF (g/dm3) Phe Gly

3,3

3,3

3,3

0,38

0,38

3,3

3,3

5,9

8,3

8,3

1,5

1,5

1,5

0,2

0,2

1,5

1,5

2,7

3,8

3,8

Lineáris Morbidellikritériumok

Morbidelli paraméterek

mI>KA=22,4

mI =

25,34

0,352=KB<mII
mII =

2,08

0,352=KB<mIII
mIII =

4,96

mI>KA=22,4

mI =

25,36

0,352=KB<mII
mII =

2,33

0,352=KB<mIII
mIII =

5,15

mI>KA=22,4

mI =

25,62

0,352=KB<mII
mII =

3,07

0,352=KB<mIII
mIII =

5,34

mI>KA=22,4

mI =

24,02

0,352=KB<mII
mII =

15,84

0,352=KB<mIII
mIII =

20,19

mI>KA=22,4

mI =

23,89

0,352=KB<mII
mII =

15,57

0,352=KB<mIII
mIII =

19,53

mI>KA=15,5

mI =

16,26

0,232=KB<mII
mII =

1,19

0,352=KB<mIII
mIII =

4,44

mI>KA=15,5

mI =

16,44

0,232=KB<mII
mII =

3,12

0,352=KB<mIII
mIII =

4,86

mI>KA=22,4

mI =

26,03

0,352=KB<mII
mII =

3,45

0,352=KB<mIII
mIII =

6,22

mI>KA=22,4

mI =

25,84

0,352=KB<mII
mII =

3,65

0,352=KB<mIII
mIII =

6,05

mI>KA=22,4

mI =

25,25

0,352=KB<mII
mII =

1,92

0,352=KB<mIII
mIII =

4,93

4.13 táblázat Az AA01 … AA10 SMB mérések Morbidelli paraméterei

103

A friss eluens minden mérésnél ioncserélt víz volt. A betáplált minta fenilalaninnak és glicinnek a fenti táblázatokban összefoglalt koncentrációjú vizes oldata. A méréseket 2 ciklusig folytattam és taktusonként átlagmintát vettem az extraktumból és a raffinátumból. Az utolsó taktusban adott időközönként vett részmintákat is elemeztem. A műveleti jellemzőket minden mérés utolsó négy (II/1…II/4) taktusára számítottam. Az AA01 mérés paramétereit lineáris egyensúlyi Morbidelli módszerrel számítottam az eluens

szivattyú

maximális

térfogatáramából

kiindulva.

A

raffinátum

szivattyú

kikapcsolásával 3 szegmenses 1:1:2:0 üzemmódban dolgoztunk. Az SP825 gyantán jobban kötődő fenilalaninnak az extraktumban, a kevésbé kötődő glicinnek a készülék LROUT pontján távozó raffinátumban kell lehetőleg tisztán megjelenni. Az AA01 mérés során a fenilalanin a tervezett paraméterek ellenére nem kielégítő deszorpciója miatt (első zóna nemregeneráltsága) a raffinátum elszennyeződött. Ezért taktusidő növeléssel – AA02 mérés – 45ről 50 percre, ill. változatlan taktusidő mellett az oszlopkonfiguráció változtatásával – AA03 mérés, 1:1:2:0-ról 2:1:1:0-ra – kísérleteztünk, sikerrel (tisztaság mindkét esetben >97,9%, kihozatal mindkét esetben >98,9%).

25

20

mIII

15

10 AA01 AA02 AA03

5

0 0

5

10

15

20

25

mII

4.18 a) ábra AA01, AA02 és AA03 mérések munkapontjai

104

Az AA04 és AA05 mérés során kb. 8,5-szer hígabb oldatokat használtunk az első három mérés szétválasztandó oldatához képest. Az előzetes szimuláció alapján nagyobb szétválasztandó oldat betáplálás térfogatáramot alkalmazhattunk volna, 2 ciklusig végeztük a méréseket, de ennyi idő alatt az alacsony minta koncentrációk miatt sem AA04, sem az AA05 mérés során nem állt be a kvázi-stacioner állapot.

25

20

mIII

15

10

5 AA04 AA05 0 0

5

10

15

20

25

mII

4.18 b) ábra AA04 és AA05 mérések munkapontjai

Az AA06 (2:1:1:0) és AA07 (1:1:2:0) mérést úgy terveztük, hogy a hátrányosan lassú fenilalanin deszorpciót hőmérséklet emeléssel – 20°-ról 60°C-ra – gyorsítjuk. Így kevesebb eluens is elegendő volt az SMB első zónájának regenerálására. Rövidebb, 45 helyett 30 perces taktusidőt alkalmazhattunk. Mindkét mérés tiszta extraktumot (>99,9%) és raffinátumot (>99,4%) adott, az AA06 mérés esetén AA03-hoz képest 1,8-szoros termelékenység növekedést értünk el.

105

25

20

mIII

15

10

5

AA06 AA07

0 0

5

10

15

20

25

mII

4.18 c) ábra AA06 és AA07 mérések munkapontjai Az AA08 és AA09 méréseket az AA03 mérés „továbbfejlesztésének” tekinthetjük olyan szempontból, hogy megtartva az AA03 paramétereit a minta koncentrációját növeltük. A koncentráció növelés felső határát szimulációval is ellenőriztem. Mindkét mérés során tiszta termékeket kaptunk és a termelékenységet 2,6-szorosára növeltük. 25

20

mIII

15

10

5 AA08 0 0

5

10

15

20

25

mII

4.18 d) ábra AA08 mérés munkapotja 106

25

20

mIII

15

10

5 AA09 AA10 0 0

5

10

15

20

25

mII

4.18 e) ábra Az AA09-es és a szoftverrel optimált AA10-es mérés munkapontjai

Az AA10 méréssel a legnagyobb szétválasztandó mintakoncentrációval (mint AA09-nél) a nemlineáris Morbidelli háromszög „sarokpontját”, a térfogatáram-kombinációk optimumát próbáltuk elérni az extraktum és a szétválasztandó mintaoldat betáplálás térfogatáramának növelésével. Ez csak részben sikerült a mintabetápláló szivattyú kissé pontatlan beállíthatósága miatt. Az AA09-es méréshez képest így is 1,4-szeres termelékenység növekedést értünk el.

107

100

kristályos termék tisztasága (m/m%)

98 96 94 92 90 88 86 84 Fenilalanin (m/m%) Glicin (m/m%)

82 80 AA01

AA02

AA03

AA04

AA05

AA06

AA07

AA08

AA09

AA10

4.19 a) ábra AA01…AA10 mérések, bepárolt, kristályosított termékekre vonatkozó tisztaság

100

kihozatal, betáplált aminosav %-a

90 80 70 60 50 40

Fenilalanin, extraktum (%) Glicin raffinátum (%)

30 AA01

AA02

AA03

AA04

AA05

AA06

AA07

AA08

AA09

AA10

4.19 b) ábra AA01…AA10 mérések, termék kihozatalok

108

termelékenység (mg aminosav/g töltet óránként)

16 14 12 10 8 6 4 Fenilalanin (mg/gh) Glicin (mg/gh)

2 0 AA01

AA02

AA03

AA04

AA05

AA06

AA07

AA08

AA09

AA10

4.19 c) ábra AA01…AA10 mérések, termelékenység. A fenilalanin termelékenységet az extraktumban kapott fenilalaninból, a glicin termelékenységet a raffinátumban kapott glicinből számítottam

30 25 20 15 10 5

10 A A

09 A A

08 A A

07 A A

06 A

A

05 A A

04 A A

03 A A

02 A A

A

01

0 A

o.f. (cm3 ioncserélt víz/mg fenilalanin termék)

1 g száraz adszorbensre vonatkoztatva óránként

4.19 d) ábra AA01…AA10 mérések, oldószer fajlagos felhasználás fenilalaninra vonatkoztatva

109

Mérés

Termelékenység (mg/g h) Phe Gly

Tisztaság %m/m Phe Gly

Kihozatal % Phe Gly

Oldószer fajlagos felhasználás cm3 ioncs.víz/ mg Phe

AA01

4,40

2,26

>99,9

85,01

91,8

>99,9

3,21

AA02

4,25

1,76

>99,9

97,9

98,9

>99,9

3,23

AA03

3,76

1,75

>99,9

>99,9

>99,9

>99,9

3,68

AA04

0,53

0,43

>99,9

83,55

37,92

99,9

24,03

AA05

0,50

0,39

>99,9

91,1

66,71

99,9

24,96

AA06

8,13

3,70

>99,9

>99,9

>99,9

>99,9

1,65

AA07

4,05

2,08

>99,9

99,4

93

>99,9

3,39

AA08

7,50

4,63

>99,9

99,8

98,6

>99,9

2,08

AA09

9,82

5,16

>99,9

>99,9

97,6

>99,9

1,42

AA10

13,50

5,59

>99,9

>99,9

>99,9

98,7

1,01

4.13 táblázat AA01 … AA10 SMB mérések fontosabb műveleti jellemzői (Az AA04 és AA05 méréseknél Phe esetén nem állt be 8 taktus alatt a kvázi-stacioner állapot)

110

Az előírt tisztasági és kihozatalra vonatkozó kívánalmaknak megfelelő mérések: AA02, AA03, AA06, AA07, AA08, AA09, AA10. A szimulációk és a komponensmérlegek alapján megállapítható, hogy két mérésnél, az AA04 és az AA05 híg aminosav oldatokkal végzett SMB kísérleteknél a rendelkezésre álló kísérleti idő (2 teljes ciklus) alatt nem állt be az ún. kvázi stacioner állapot, tehát nagyobb volt a bemenő aminosavak mennyisége, mint a termékekbe (extraktum és raffinátum) távozó aminosavmennyiség.

A mérések értékelése A méréseket a hosszú taktusidők miatt minden esetben 2 teljes ciklusig, 4 oszlopos készülékről lévén szó 8 taktusig végeztük. Ez két mérés, az AA04 és az AA05 kivételével elég volt ahhoz, hogy az utolsó taktusokban már beálljon a kvázi-stacioner állapot.

Az első, 1-1-2 oszlopkonfigurációval, 45 perces taktusidővel végzett mérésnél a raffinátum elszennyeződése az első zóna regenerálatlanságából származik. Ezt a mérések (taktuson belül vett részminták elemzései) is bizonyítják, bár a matematikai modell ennél kisebb mértékű regenerálatlanságot jelzett előre. (4.20 ábra).

109

aminosav koncentráció (g/dm3)

1,5 1,25

mért, Phe mért, Gly szim., Phe szim., Gly

1 0,75 0,5 0,25 0 315

320

325

330

335

340

345

350

355

360

365

mérési idő (II/4 taktus) (perc)

4.20 ábra A II/4 taktus raffinátumának koncentrációlefutása az AA01 mérés során. Rövidítés: szim. – szimulációs szoftverrel számított koncentrációlefutás taktuson belül. Az aminosav koncentrációkat a 7 percenként vett részmintákból határoztam meg. Látható, hogy a matematikai modell alulbecsüli a fenilalanin koncentrációt.

A raffinátum fenilalanin szennyezése a taktus elején jelenik meg, és folyamatosan csökken, a jobban kötődő aminosav az első zónából származik. Az első zóna regeneráltságát javíthattuk az oszlopkonfiguráció megváltoztatásával, amennyiben az első zónába két oszlopot kapcsolunk, így az első zóna második oszlopán marad kis koncentrációban a fenilalanin a taktusok végére, az első zóna első oszlopa pedig teljesen regenerált lesz. A hőmérséklet növelése is pozitív irányba hat a regeneráltság elősegítéséhez.

110

4.4 Fenilalanin-glicin aminosav elválasztás sógradienssel

4.4.1 Feladatmeghatározás A fenilalanin sómentesítése kapcsán olyan sókoncentrációtól függő folyamatokat figyeltem meg, amely a továbbiakban előnyösen alkalmazható a fenilalanin-glicin elválasztás termelékenységének növeléséhez. Vizes fázisból só jelenlétében fenilalaninból egy bizonyos mértékű többletet adszorbeálnak az apoláris poliaromás gyanták, mint só nélkül. Ennek az SMB harmadik zónájában lehet jelentősége, ahol ez az extra adszorpció segít abban, hogy a fenilalanin minél hosszabb ideig ne törjön át a harmadik zónán. Egyébiránt amennyiben több fenilalanin adszorbeálható a harmadik zónában, úgy nagyobb mennyiségű vagy koncentráltabb lehet a betáplált szétválasztandó aminosav-keverék oldat. Az első zóna fenilalanin-elúciójához, a töltet regenerálásához viszont a fentiek alapján előnyösebb, ha tiszta, elektrolitmentes ioncserélt vizet használunk eluensként, ezért a sót a szétválasztandó oldattal együtt, célszerűen abban feloldva érdemes betáplálni (hasonlóság azzal az esettel, ha aminosav hidrolizátumot akarunk szeparálni). Mivel az SMB folyadékkromatográf teljes hosszát figyelembevéve a sókoncentráció a hely függvényében változik, így az eljárást sógradienses SMB-nek tekinthetjük. Amennyiben a só a glicin adszorpciójára is a fenilalaninéhoz hasonló hatással van, tehát glicinből is nagyobb mennyiség megkötődik, úgy lehetőség nyílik négyzónás SMB-t tervezni. Ebben az esetben az extraktum fenilalanint, a raffinátum tiszta glicint tartalmazna, a negyedik zóna terméke lenne az aminosav-mentes sóoldat, ami a szétválasztandó oldat készítéséhez visszavezethető. Ha a glicin adszorpciója nem függ mérhető nagyságban a sókoncentrációtól, akkor háromzónás SMB-t kell tervezni, ahol a főterméknek számító fenilalanint az extraktumban nyerjük tisztán, míg a glicin a sóval együtt jelenik meg a raffinátumban. Az egyensúlyi adszorpciós izotermákat a sókoncentráció függvényében mértem SP825 és HP20 adszorbensen. A sómentesítésnél már mért fenilalanin-HP20 sókoncentráció függő izotermákat felhasználtam a sógradienses aminosav elválasztás tervezéséhez. A tisztasági- és kihozatalra vonatkozó követelményeket a főtermék fenilalaninra írtam elő. A fenilalanin tisztasága az extraktumban legyen nagyobb, mint 99% m/m, és a kihozatal legyen nagyobb 95%-nál.

111

4.4.2 A fenilalanin-glicin sógradienses elválasztás eszközei és a felhasznált anyagok Mintaoldatok, oldószer, kromatográfiás mozgó fázis A mintaoldatok szilárd glicinből és L-fenilalanin vegyszerből készültek ioncserélt vízzel. A fenilalanin-glicin elválasztást úgy vizsgáltam, hogy egy előzetes referenciamérést végeztem sógradiens nélkül, ezért ehhez a méréshez kellett a sómentes, 3,3 g/l (0,02M) L-fenilalanin és 1,5 g/l (0,02M) glicin vizes törzsoldat. Meghatározott mennyiségű szilárd a.lt. NaCl-ot feloldva kisebb mennyiségű aminosav törzsoldatban, majd mérőlombikban a további törszoldattal jelre töltve 0,25M és 1,0M sókoncentrációjú aminosav-oldatokat kaptam. SMB deszorbensként most is tiszta ioncserélt vizet alkalmaztam.

Adszorbensek

A poliaromás DIAION HP20, illetve a SEPABEADS SP825 jelű gyantákat vizsgáltam fenilalanin – glicin sógradienses elválasztása céljából.

A kísérleti SMB készülék

A fenilalanin-glicin elválasztást a 4.3.2 alfejezetben bemutatott saválló acélból készült nagylaboratóriumi berendezésen vizsgáltam, de a sógradienses SMB kísérleteket és a sómentes referenciamérést a sómentesítésnél már bemutatott 6 oszlopos kislaboratóriumi készüléken végeztem.

Detektálás

A kislaboratóriumi SMB kimenetein távozó oldatok fenilalanin- és sókoncentrációját on-line detektáltam átfolyós rendszerű detektorokkal. A fenilalanint 269 nm-en UV detektorral, a sót vezetőképességmérővel. A glicin UV-detektálására az 4.3.2 alfejezetben leírtak miatt fenilalanin mellett nincs lehetőség. A glicint és a fenilalanint a termékáramokból szedett mintákból aminosav analizátorral elemeztem.

112

Műszeres elemzések eszközei

Az aminosavak koncentrációját a taktusok teljes ideje alatt mindkét termékáramból vett mintákból az OE-914 aminosav analizátorral határoztam meg. A fenilalanin – glicin analitikai elválasztás paraméterei megegyeznek a 4.3.2 alfejezetben bemutatott paraméterekkel.

A felhasznált eszközök és anyagok tételesen

A kísérletekhez felhasznált eszközök: kromatográfiás oszlop, 6 db SMB oszlop, anyaga üveg, belső átmérője 13 mm, a töltetágy magassága 127mm, 1 db termosztálható köpennyel ellátott dugattyús üvegoszlop, anyaga üveg, hossza 320 mm, belső átmérője 13 mm, töltethossz maximum 280 mm, a dugattyú anyaga polipropilén, O-gumigyűrű tömítéssel 1 db mintabemérő csap, 300 l-es, és 800 l-es mintabemérő hurkokkal, anyaga polipropilén, átalakítható kétállású váltócsappá frontális kísérlethez, 3 db PERIPUMP ,D, változtatható, stabilizált fordulatszámú perisztaltikus szivattyú, 1 db WATERS ASSOCIATES MODEL 450 UV spektrofotométer, átfolyó küvettás, 1 db GILSON 116 UV spektrofotométer, átfolyó küvettás, 2 db RADELKIS OK102/1 vezetőképességmérő, átfolyós, 2 db LINE RECORDER TZ4620 kétcsatornás adatregisztráló, változtatható papírsebességű, 1 db OE 914 aminosav analizátor egyebek, szilikon és polietilén folyadékszállító csövek, kb. 3 m, 15 db gumidugó, 16 db polipropilén szűrőréteg korong, Mohr-szorítók, kb. 5-6 db.

113

A kísérletekhez felhasznált anyagok: L-fenilalanin, kristályos a.lt., kb. 20 g , glicin a.lt., kristályos, kb. 10 g , nátrium-klorid, a. lt. kb. 300 g ioncserélt víz, kb. 50 dm3 , adszorbens gyanták: SEPABEADS SP825, kb. 5 g, DIAION HP20, kb. 31,5 g.

4.4.3 Fenilalanin – glicin sógradienses elválasztási kísérletek A DIAION HP20 és SEPABEADS SP825 gyantán végzett előzetes mérések:  háromkomponensű (NaCl, fenilalanin, glicin) frontális adszorpciós-deszorpciós mérések kislaboratóriumi dugattyús üvegoszlopon,  L-fenilalanin és glicin sókoncentráció-függő egyensúlyi izotermáinak mérése 20°C-on kislaboratóriumi dugattyús üvegoszlopon a vizsgált adszorbenseken, Az előzetes méréseket egy 13 mm belső átmérőjű dugattyús kislaboratóriumi üvegoszlopon hajtottam végre. A gyantaágy hossza a DIAION HP20 töltet esetén 127 mm, a SEPABEADS SP825 esetén 129 mm volt. A folyadékbetáplálást perisztaltikus szivattyú végezte. A vizsgált kétféle polisztirol-divinilbenzol gyanta nagy szelektivitást mutat a fenilalaninglicin vizes oldatában és sóoldatban is. A frontális kísérletek alapján a glicin adszorpciója nem függ meghatározó mértékben az elektrolit koncentrációtól, nem látható a deszorpciós szakaszban a fenilalaninéhoz hasonló többletre utaló koncentrációlefutás. Ezt az SMB tervezésénél

figyelembevéve

háromzónás

oszlopkonfigurációt

alkalmaztam.

Másik

meghatározó tényező a gyantaválasztásnál, hogy bár a fenilalanin sómentes oldatban jobban kötődik SP825-ön, mint HP20-on, az izotermák sókoncentráció-függése mégis a HP20 gyantán nagyobb. Ebben a kutatási fázisban az adszorpció sókoncentráció-függésének az SMB műveletre való hatásait tanulmányoztam, ezért az SMB kísérleteket a HP20 gyantához terveztem. A Morbidelli-módszerrel történő kezdeti paramétertervezés során már figyelembe vettem azt, hogy a Morbidelli területek nem függetlenek a nátrium-klorid koncentrációtól (4.21 ábra).

114

25

20

15 mIII 10 háromszög sómentes esetben háromszög 0,25M sóval háromszög 1M sóval

5

0 0

5

10

15

20

25

mII

4.21 ábra A Morbidelli területek 3,3 g/dm3 fenilalanin és 1,5 g/dm3 glicin oldatban, HP20 adszorbenssel töltött kislaboratóriumi SMB készülékhez a sókoncentráció függvényében. A sókoncentráció növelésével nő a „tiszta extraktum – tiszta raffinátum” területe. Először a sómentes oldatból történő elválasztás paramétereit terveztem meg. A kísérletet, mint referenciamérést végrehajtottam a tervezett paraméterekkel. Ezután a sókoncentrációfüggő izotermákat a szimulációs szoftverbe írtam és a lehető legnagyobb szétválasztandó oldat betáplálást próbáltam elérni úgy, hogy a többi paramétert változatlanul hagyva a tisztaság és a kihozatal még elérje a követelményeket a modellezések során.

Adszorbens töltet kiválasztása, egyensúlyi mérések A frontális méréseket 3,3 g/l fenilalanin – 1,5 g/l glicin – 58,5 g/l NaCl aminosav-só keverék oldattal, eluensként ioncserélt vízzel 2,5 cm3/perc konstans térfogatárammal végeztem 13 mm átmérőjű és 127 mm hosszú DIAION HP20 és 13 mm átmérőjű és 129 mm hosszú SEPABEADS SP825 gyantával töltött oszlopokon. A frontális adszorpciós-deszorpciós mérések eredményeit a 4.14 táblázatban és a 4.23 a), b) ábrákon láthatjuk.

115

Adszorbens gyanta

Térfogatáram (cm3/perc)

Minta összetétele (g/dm3) Gly

Phe

NaCl

Áttörési görbék inflexiós pontja 3 (cm ) Gly Phe

Kapacitási tényező k' Gly Phe

Szelektivitási tényező

DIAION HP20

2,5

1,50

3,30 58,44

17,4

73,5

0,45

5,14

11,4

SEPABEADS SP825

2,5

1,50

3,30 58,44

14,9

124,8

0,48

11,37

23,7

4.14 táblázat A glicin koncentrációjának meghatározásához a mintavételezés úgy történt, hogy a só áttörésének kezdetétől 2-3 cm3-es részmintákat vettem a só áttörése után még 12-15 cm3-ig. Elúciókor az elúció kezdete utáni kb. 5 cm3-től a só teljes lemosása után még kb. 5 cm3-ig. A fenilalanin adszorpcióját mindkét gyantán a sókoncentráció befolyásolja, nagyobb mértékben a HP20-on, ez látszik a deszorpciós görbéken. A glicin adszorpciója nem sókoncentráció függő, nem látható az elúciós szakaszban többlet glicin távozása az oszlopról. Az izotermákat többlépcsős frontális módszerrel határoztam meg 0,002M…0,02M koncentráció-tartományban a 4.10 táblázatban már bemutatott aminosav-koncentrációkkal 0, 0,25 és 1,0M NaCl koncentrációjú oldatokban HP20 és SP825 adszorbensen. A mérések szerint – és ezek egybevágnak a frontális méréseknél megállapítottakkal – a NaCl koncentráció nem befolyásolja a glicin adszorpciós izotermáját sem HP20 sem SP825 adszorbensen. A fenilalanin adszorpcióját a következő összefüggéssel jellemezhetjük SP825ön: qPhe

(0,2534 cNaCl 32,97) cPhe 1 (0,0018 cNaCl 0,1752) cPhe

(61)

(0,0969 cNaCl 19,4) cPhe 1 b cPhe

(62)

HP20 adszorbensen: qPhe

Lásd 4.22 a) és b) ábrákat.

116

2

40

1,6

30

1,2

20

0,8

Phe elektrolitmentes, a=19,4279 b=0,2026 Phe, 0,25M NaCl, a=20,836 b=0,1945

10

q (mg Gly/g száraz gyanta) .

q (mg Phe/g száraz gyanta) .

50

0,4

Phe, 1,00M NaCl, a=25,0943 b=0,2322 Gly, a=0,5344 b=0,9291

0

0 0

0,5

1

1,5 2 2,5 3 c (mg aminosav/cm oldat)

3

3,5

4

4.22 a) ábra A fenilalanin és a glicin izotermái 20°C-on HP20 adszorbensen vízben, 0,25 mólos és 1,0 mólos NaCl oldatban 90

2

1,6

70 60

1,2

50 40

0,8

Phe elektrolitmentes, a=34,01 b=0,1621

30

Phe, 0,25M NaCl, a=35,28 b=0,2192

20

0,4

Phe, 1M NaCl, a=48,14 b=0,2772 10

q (mg Gly/g sz.gyanta) .

q (mg Phe/g sz.gyanta) .

80

Gly, a=0,5256 b=0,9311

0

0 0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

c (mg aminosav/cm3 oldat)

4.22 b) ábra A fenilalanin és a glicin izotermái 20°C-on SP825 adszorbensen vízben, 0,25 mólos és 1,0 mólos NaCl oldatban 117

Az SP825-fenilalanin páros nagyobb kapacitási tényezővel jellemezhető, mint a HP20fenilalanin, de a HP20-on a sókoncentrációtól függő adszorpciós többlet-fenilalanin nagyobb, mint SP825-ön, így a további mérésekhez, az aminosavak SMB elválasztási kísérleteihez a HP20 jelű gyantát használtam fel. A HP20 esetén a Langmuir-típusú izoterma b paramétere a vizsgált tartományban gyakorlatilag nem függ a sókoncentrációtól, míg SP825 esetén a b paraméternek is van egy kismértékű sókoncentráció függése, ebből adódik, hogy nagyobb koncentrációknál már kisebb a többlet-fenilalanin mennyisége, mint HP20-nál. Az előzetes mérések eredményeinek értékelése A HP20 és SP825 gyantán végzett frontális mérések alapján mindkettő jellemezhető azzal, hogy fenilalaninra nagy, glicinre kicsi a kapacitási tényezőjük, nagy szelektivitásúak és a fenilalanin adszorpciója a folyadékfázisbeli sókoncentrációtól jelentős mértékben függ. A frontális mérések alapján úgy döntöttem, hogy mindkét adszorbenst tovább vizsgálom, tehát mindkettőn mértem az aminosavak egyensúlyi adszorpciós izotermáját sómentes vizes oldatban és sóoldatokban. Az a tény, hogy a glicin adszorpciója nem befolyásolható jelentősen a sókoncentráció változtatásával (nem növelhető nagymértékben a glicin kapacitás), meghatározza az SMB készülék konfigurációját. Továbbra is célszerű a háromzónás SMB alkalmazása a sógradienses elválasztáshoz is, a vizsgált gyantákon a glicin – NaCl szelektivitás kicsi. Az egyensúlyi mérések kiértékelése után hozzájutottam a szimulációs szoftver összes bemenő adatához, így lehetőségem volt lefuttatni a kétféle gyantán végzett frontális adszorpciósdeszorpciós mérés modelljét (ld. 4.23 a) és b) ábra). A mérések, ill. a szimulációk paramétereit ld. korábban, a 4.13 táblázatban.

118

mért Phe számított Phe mért Gly számított Gly mért NaCl számított NaCl

Phe, Gly koncentráció (g/dm3)

3,5 3 2,5

70 60 50 40

2 30 1,5 20

1

NaCl koncentráció (g/dm3)

4

10

0,5 0

0 0

50

100

150

200

250

300

350

400

3

térfogat (cm )

4.23 a) ábra Frontális mérés és szimulációja HP20 jelű gyantán. Deszorpció: 166 cm3-től mért Phe számított Phe mért Gly számított Gly mért NaCl számított NaCl

Phe, Gly koncentráció (g/dm3)

3,5 3 2,5

70,0 60,0 50,0 40,0

2 30,0 1,5 20,0

1

NaCl koncentráció (g/dm3)

4

10,0

0,5 0

0,0 0

100

200

300

400

500

3

térfogat (cm )

4.23 b) ábra Frontális mérés és szimulációja SP825 jelű gyantán. Deszorpció: 215 cm3-től

119

A szimulációs szoftver adszorpciós egyensúlyból számító részét úgy programoztam át, hogy a a glicin - fenilalanin multi-Langmuir izotermák a és b paraméterét a hely és idő szerint aktuális sókoncentráció függvényében számítsa. Így a kísérleteket nagyon pontosan tudtam modellezni. Az egyensúlyt számító részt ezután átültethettem az SMB modelljét tartalmazó szimulációs szoftverbe. Az SMB műveleti paramétereinek meghatározása, eredmények, értékelés Kétféle, alapvetően eltérő műveletet terveztem kislaboratóriumi SMB készülékre. Az első mérést úgy kívántam végrehajtani, hogy az reprezentálja a sómentes oldatból HP20 adszorbensen a lehető legnagyobb termelékenységgel a tisztasági- és kihozatalra vonatkozó követelmények teljesítése mellett fenilalanin céltermék előállítását. Ezt a mérést úgy terveztem meg, hogy a 0 sókoncentrációhoz tartozó Morbidelli háromszög elméletileg legtermelékenyebb munkapontjára, a wr-wb sarokpontra helyeztem a mérési pontot. A kiindulási paraméter most a maximális eluens térfogatáram (amit a perisztaltikus szivattyú szállítani tud a rendelkezésre álló legnagyobb - 2 mm - belső átmérőjű csővel) kb. 90%-ához tartozó taktusidő, 34 perc volt. A tervezett paramétersorral lefuttatott szimuláció szerint azonban a 0,8 cm3/perces szétválasztandó oldat térfogatáram túl nagy, fenilalanin kerül a raffinátumba. További szimulációkkal meghatároztam, hogy a maximális szétválasztandó oldat mennyisége 0,5 cm3 lehet percenként. A meghatározott, optimált paramétersorral (4.15 táblázat) elvégeztem az SMB7 kísérletet, mint referenciamérést.

Mérés

cF (g/dm3)

T D E F R OszlopNaCl konfiguráció (min) (cm3/min) (cm3/min) (cm3/min) (cm3/min)

Phe

Gly

SMB7

3,3

1,5

0

2:2:2:0

34

5,0

4,5

0,5

1,0

SMB8

3,3

1,5

58,4

2:2:2:0

34

5,0

3,8

1,5

2,4

SMB9

3,3

1,5

58,4

2:2:2:0

34

5,0

4,5

1,5

2,0

SMB10

3,3

1,5

58,4

3:1:2:0

34

4,5

4,0

1,0

1,5

4.15 táblázat

Ezek után további méréseket terveztem most már sógradiens alkalmazásával. Egy 1,0 M sókoncentrációjú szétválasztandó oldatot szeparáló, háromzónás 2-2-2 oszlopkonfigurációjú

120

és a koncentrációarányok figyelembevételével egy előnyösebb, 3-1-2 oszlopkonfigurációjú sógradienses SMB paramétereit határoztam meg a matematikai modellt használva. A 2-2-2 oszlopkonfigurációjú SMB mérés tervezéséhez a kiindulási paraméter most is az első zóna regenerálásához szükséges minimális ioncserélt víz térfogatából és a maximális deszorbens térfogatáram 90%-ából adódó 34 perces taktusidő volt. A szimulációk során a szétválasztandó aminosav-só keverék oldat térfogatáramát növeltem 0,5-ről 0,2 cm3/percenként mindaddig, míg a raffinátumban meg nem jelent a fenilalanin. A szimuláció szerint háromszoros (1,5 cm3/perc,

4.14

táblázat,

SMB8)

szétválasztandó

oldat

betáplálás

érhető

el

a

referenciaméréshez képest. Sajnos a kísérlet nem igazolta a modellezést, kvázi-stacioner üzemállapotban fenilalanin jelent meg a raffinátumban a taktusok második felétől, ez azt jelenti, hogy túl nagy a harmadik zónában a térfogati sebesség. Ezt az extraktum mennyiségének növelésével sem tudtam jelentősen visszaszorítani (4.15 táblázat, SMB9). A Morbidelli diagramon ábrázolva a méréseket, jól látszik, hogy a kísérletek eredményeinek megfelelően az SMB8 és SMB9 mérések munkapontjai a tiszta extraktum – szennyezett raffinátum területen helyezkednek el (4.24 ábra). Ezek szerint a szimulációval meghatározott paraméterek nem felelnek meg a nemlineáris Morbidelli kritériumoknak. 25

20

15 háromszög sómentes esetben háromszög 0,25M sóval háromszög 1M sóval SMB7 2-2-2, sómentes SMB8 2-2-2, 1,0M sóval SMB9 2-2-2, 1,0M sóval SMB10 3-1-2, 1,0M sóval

mIII 10

5

0 0

5

10

15

20

25

mII

4.24 ábra Az SMB7 referenciamérés és az SMB8…10 sógradienses mérések munkapontjai. A 2-2-2 ill. a 3-1-2 az oszlopkonfigurációt jelöli.

121

A két, fenilalanin veszteséggel járó mérés után a nemlineáris Morbidelli módszert használva és a Morbidelli területet figyelembe véve a 34 perces taktusidőhöz újabb paramétersort határoztam meg (4.15 táblázat, SMB10). Ebben a paramétersorban már csak kétszeres a szétválasztandó oldat betáplálásának a térfogatárama a referenciaméréshez képest (1,0 cm3/perc), de most >99,9%-os fenilalanin-kihozatalt vártam. Mind a szimulációt, mind a laboratóriumi kísérletet 3-1-2 oszlopkonfigurációval hajtottam végre. A koncentráció arányok (fenilalanin:glicin) miatt alkalmaztam az első zónában három oszlopot, az elválasztáshoz (glicin deszorpcióhoz és sómentesítéshez) a második zónában egy oszlopot. A kísérlet igazolta a szimulációval kapott jó eredményeket, a referenciaméréshez képest kétszeres termelékenységgel tudtam előállítani 99%-nál tisztább fenilalanint gyakorlatilag 100%-os kihozatallal (4.16 táblázat). Oldószer fajlagos felhasználás Mérés

Termelékenység (mg/g h)

Tisztaság (%m/m)

Kihozatal %

(cm3 ioncs.víz/ mg Phe)

SMB7

3,92

>99,9

>99,9

2,77

SMB8

4,29

>99,9

39,9

2,53

SMB9

5,85

>99,9

54,5

1,85

SMB10

7,64

>99,9

>99,9

1,28

4.16 táblázat Az SMB7 referenciamérés és az SMB8…10 sógradienses mérések műveleti jellemzői. A termelékenység egy gramm HP20 tölteten 1 óra alatt előállított fenilalanin tömege mg-ban. Az összes műveleti jellemzőt a céltermék fenilalaninra határoztam meg. A sógradienses mérések során a só glicinnel együtt a raffinátumban távozik, ezért a glicin műveleti jellemzőit nem értelmezhetjük (nincs tiszta glicin).

122

5. Új kutatási eredmények  Modell rendszerek alkalmazása aminosav biotechnológiai elválasztásához: a fenilalanin – NaCl kétkomponensű vizes fázisú rendszer jól alkalmazható olyan biotechnológiai tisztítási-, elválasztási műveletek modellezésére, amelyek során nagy elektrolit koncentrációjú vizes oldatban kis koncentrációjú, nagymolekulájú értékes komponenst kell izolálni. Természetes nyersanyagok – szőr, toll, szaru – savas vagy lúgos hidrolizátumának semlegesítés utáni állapotában hasonlít ehhez a modell rendszerhez.  Az aminosavak polimer adszorbens gyantákon megfigyelhető egyensúlyi adszorpciós izotermáinak sókoncentráció függése: a fenilalanin és a glicin adszorpciós egyensúlya

a

vizsgált

polimer

adszorbenseken

Langmuir-típusú

izotermákkal

jellemezhető. Vizes oldatban a NaCl-nak, mint ionjaira disszociáló sónak, a funkciós csoport nélküli adszorbenseken nincs kölcsönhatása, inert jelzőanyagként alkalmazható. Új eredményként megállapítottam, hogy ha a folyadékfázis elektrolitot tartalmaz, akkor a fenilalanin többlet mennyiségben kötődik meg ahhoz képest, ha ionmentes vizes fázisból történne az adszorpció. A glicin adszorpcióját nem befolyásolja mérhetően az elektrolit koncentráció. Megállapítható, hogy csak a hidrofób résszel rendelkező aminosav molekuláknál jelentős az adszorpció sókoncentráció függése. Nagyobb koncentrációjú, 60 g/l-es sóoldatban HP20 tölteten kb. 20%-kal nagyobb fenilalanin mennyiség kerül szilárd fázisba. A sókoncentráció gyantatípustól függően a Langmuir izoterma paramétereket különböző mértékben befolyásolja: HP20 esetén a többlet adszorpció lényegesen nagyobb, mert a sókoncentráció növelésével gyakorlatilag csak a Langmuir „a” paraméter növekszik, SP825 esetében ugyanabban a koncentráció tartományban kisebb a többlet, mert a „b” paraméter is nő.  A sókoncentráció gradiens hatása az SMB műveletre: A sókoncentráció növelésével megnövekedő kapacitási tényező kihasználható a paramétertervezésnél, ahol az SMB III. zónájában a kapacitás növelése, a jobban kötődő komponens visszatartása előnyös. Fenilalanin – glicin elválasztáskor, a szétválasztandó oldatban kb. 60 g/l-es sókoncentrációt alkalmazva 200%-os termelékenység növekedés érhető el a fenilalanin – glicin vizes oldatban történő betáplálásához képest.  A hőmérséklet hatása az SMB műveletre: az SMB elválasztásokhoz választott poliaromás gyanták fenilalaninra vonatkozó igen nagy kapacitási tényezője miatt az SMB paraméterek optimálásánál hátrány, hogy az SMB első zónájának regenerálása nehéz.

123

SMB elválasztásnál előnyösebb, ha a kapacitási tényező 10 alatti, lehetőleg 3 és 5 közötti. Megállapítottam,

hogy

a

regeneráltság

problémája

megoldható

a

rendszer

hőmérsékletének közepes mértékű növelésével, melynek során a kapacitási tényező értéke jelentősen csökken. A hőmérséklet 20°C-ról 60°C-ra történő növelésével a szilárd fázisbeli fenilalanin koncentráció kb. a harmadrészére esik vissza, ezáltal jelentősen javul az SMB I. zóna regenerálhatósága. A glicin is kevésbé adszorbeálódik magasabb hőmérsékleten, de itt a csökkenés kisebb, kb. 33%-os. A 20°C-on mért 30 körüli szelektivitási tényező 60°C-on kb. harmadára csökken, de még mindig bőven elégséges az SMB elválasztáshoz. Mivel kevesebb (kisebb térfogatáramú vagy ugyanakkora térfogatáram mellett rövidebb taktusideig adagolt) eluensre van szükség, a Morbidelli kritériumok szerint nagyobb lehet a szétválasztandó oldat mennyisége. A hőmérséklet 40°C-kal történő emelésével 216%-os termelékenység növekedés érhető el.  SMB preparatív folyadékkromatográfiás készülék:

Magyarországon elsőként

terveztünk és építettünk félpreparatív-nagylaboratóriumi méretű, PLC vezérlésű váltócsapos 4 oszlopos SMB készüléket, amely alkalmas bármely négyoszlopos oszlopkonfiguráció beállítására, illetve az egyes oszlopok egyedi termosztálására is. A készüléket sikeresen alkalmaztam aminosav elválasztási kísérletekhez.  Matematikai modell: a Veszprémi Egyetem Vegyipari Műveleti Tanszékén korábban elkészített KROM_N frontális kísérleteket, ill. az SMB_KROM_N SMB kísérleteket modellező számítógépes szimulációs szoftvereket módosítottam: az eredetileg 4 oszlopos modellből elkészítettem a 6 oszlopos SMB készülék szimulációs szoftverét, ezután pedig a NaCl-nak az aminosav adszorpciós egyensúlyára gyakorolt hatását „építettem be” a szimulációs szoftverbe. Mindkét fejlesztéssel végeztem a kísérletek mellett szimulációt is, és a mért és a szimulált eredmények minden esetben jól egyeztek.

124

Theses  Using material systems for modeling amino acid separations in biotechnological processes: the two compounds phenylalanine-NaCl system can be well used for modeling biotechnological purification and separation, in case of low-concentration amino acids are needed to be isolated from strong salty aqueous solutions.  The influence of salt concentration on amino acid adsorption by using polymeric adsorbents: the adsorption of the studied amino acids (both phenylalanine and glycine) on polymeric adsorbents can be described with Langmuir-type isotherms. During my measurements I haven’t experienced any interactions between electrolytes and hydrophobic polymer adsorbents in aqueous solutions. However, regarding my observations in case the fluid phase contains electrolyte, the adsorption of phenylalanine has changed. As my observation the phenylalanine concentration has increased in the solid phase in case of using higher salt concentration, while the glycine had no excess of adsorption. E.g. on the HP20 polymeric resin if we have 60 g/L of sodium-chloride in the fluid phase, that causes 20% excess of phenylalanine adsorption. This effect is depending on the adsorbent and on the adsorbeate hydrophobicity.  The effect of the salt gradient on the SMB operation: By increasing the salt concentration the excess of adsorption gives higher capacity factor to phenylalanine. I have established that this effect can be used advantageously, because in the third zone of the SMB the higher salt concentration helps to retard the better adsorbing compound. The salt gradient is easy to reach by using higher salt concentration in the SMB-feed. E.g. an increase of productivity of 200% can be measured in case of the following type of SMBfeed: 60 g/L NaCl in phenylalanine-glycine mixture aqueous solution.  The effect of the temperature on the SMB operation: the high capacity of the phenylalanine on polyaromatic resins is disadvantageous according to the regeneration of the first SMB-zone. Better regeneration can be achieved when the capacity factor is lower than 10. I have defined that in our case the problem of regeneration can be solved by raising the temperature. By increasing the temperature from 20 °C to 60 °C degrees the capacity factor of both examined amino acids are reducing differently (in case of phenylalanine it’s 66%). However with this the selectivity factor has a decrease of 66%, but this is still enough for the separation. As the capacity factor has decreased, less amount of fresh eluent is enough for the regeneration, and so we can plan shorter

125

switching time or less eluent-stream for the SMB operation. According to the Morbidelli parameters the feed of the amino acid mixture can be enhanced and therethrough the productivity too.  SMB equipment: in Hungary it was us who have planned and constructed the first pilot-plant 4 columns SMB with PLC control. Our equipment can be used with any kind of column configuration. The columns are thermostable. We have carried out plenty of semi-preparative amino-acid separations on the above mentioned SMB equipment.  Mathematical modeling: I have improved two simulation-software which were made previously in the University of Veszprém (named KROM_N, which is modeling frontal adsorptions and SMB_KROM_N which is modeling four-columns SMB). With the modified software it is possible to simulate the effect of salt gradient, furthermore the sixcolumns SMB. The measured and calculated data agreed well.

126

Irodalomjegyzék [1] Simon G, Grevillot G, Hanák L, Szánya T, Marton Gy: Chem. Eng. Sci. 52, 467 (1997) [2] Simon G, Hanák L, Grevillot G, Szánya T, Marton Gy: J. Chromatogr. A, 732 (1996) 1-15 [3] Simon G, Hanák L, Szánya T, Marton Gy: Journal of Cleaner Production 6 (1998) 329 [4] Greenstein J.P, Winitz M: Chemistry of Amino Acids, Vol. 1,2,3, J.Wiley&Sons, New York-London (1961) [5] Dévényi T, Gergely J: Amino Acids, Peptides and Proteins, Akadémiai Kiadó, Budapest, 1974 [6] Elődi P: Biokémia, Akadémiai Kiadó, Budapest (1983) [7] Weinstein B: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol 15., Marcel Dekker, New York 1971-1978 [8] Simon G: Preparative scale Amino Acid Separation by Parametric Pumping, Doktori értekezés, Veszprémi Egyetem (1996) [9] Gehrke C. W, Kuo C.T.K, Zumwalt R. W: Amino Acid Analysis by Gas Chromatography Volume II, CRC Press (1987) [10] Spackman D.H, Stein W.H, Moore S: Anal. Chem., 30, 1190 (1958) [11] Seidel-Morgenstern A.: Modellierung der präparativen Flüssigchromatographie. Deutscher Universitäts-Verlag (1995) [12] Grzegorczyk D.S, Carta G: Chem. Eng. Sci. 51, 807 (1996) [13] Díez S, Leitao A, Ferreira L, Rodrigues A: Sep. Purif. Technol. 13 (1998) 25-35 [14] Snyder, Kirkland: Bevezetés az intenzív folyadékkromatográfiába, New York, (1988) [15] Hashimoto K, Yamada M, Adachi S, Shirai Y: J. Chem. Eng. Jpn. 22 (1989) 432 [16] Broughton D.B, Gerhold C.G: Continous sorption process employing fixed bed of sorbent and moving inlets and outlets (Parex-eljárás) US Patent 2 985 589 (1961) Megjegyzés: legelső SMB-szabadalom (UOP) [17] Guiochon G, Golshan-Shirazi S, Katti A.M: Fundamentals of Preparative and Nonlinear Chromatograpy. Boston, Academic Press. (1994) [18] Guiochon G: J. Chromatogr. A 965 (2002) 129-161 [19] Heuer C, Küstens E, Plattner T, Seidel-Morgenstern A: J. Chromatogr. A 827 (1998) 175 [20] Mazotti M, Storti G, Morbidelli M, J. Chromatogr., A 769, (1997) 3 [21] Migliorini C, Mazzotti M, Morbidelli M: J. Chromatogr. A 827 (1998) 161 [22] Kearney M. M, Hieb K.L: Time variable simulated moving bed process. US Patent 5 102 553, (1992)

127

[23] Kloppenburg E, Gilles E.D: Új műveleti eljárás szimulált ellenáramú kromatográfiához Chem. Eng. Technol. 70(12):1526-1529, (1998) [24] Morbidelli M, Mazotti M: PREP, 15th International Symposium on Preparative/Process Chromatography, Ion Exchange, Adsorption/Desorption Processes and Related Separation Techniques, Washington DC, USA, June 16-19 (2002), Book of Abstracts, L-201, 53 [25] Zang Y, Wankat P.C: Ind. Eng. Chem. Res. (2002), 41, 2504 [26] Abel S, Mazzotti M, Morbidelli M: J.Chromatogr. A, 944 (2002) 23-29 [27] Giovanni O, Mazzotti M, Morbidelli M, Denet F, Hauck W, Nicoud R: J. Chromatogr. A, 919 (2001) 1-12 [28] Antos D, Seidel-Morgenstern A: Chem. Eng. Sci., 944 (2002) 77 [29] Antos D, Seidel-Morgenstern A: Chem. Eng. Sci., 56 (2001) 6667 [30] Schramm H, Kienle A, Kaspereit M, Seidel-Morgenstern A: Patentanmeldung DE 102 35 385.9, (2002) [31] VariCol-Process US Patent 5,578,215 (1996) [32] Separation and Purification Reviews Vol. 33, No 2, (2004) [33] Voight U, Kinkel J, Hempel R, Nicoud R. M: Chromatographic process for obtaining highly purified Cyclosporin A and related Cyclosporins. US Patent 6,306,306 (2001) [34] Rosset A. J, Neuzil R. W: Fluid-solid contacting apparatus. US Patent 3,706,812 (1972) [35] Ahlgren B. K, Snyder C. B, Fawaz I: Fluid-directing multiport rotary valve. US Patent 6,431,202 (2002) [36] Separation and Purification Reviews Vol. 17, No 1, (1988) [37] Azevedo D. C. S, Rodrigues A. E: (2000) Sep. Sci. Technol. 35(16):2561-2581 [38] Azevedo D. C. S, Rodrigues A. E: (2001a) Chem. Eng. J. 82:95-107 [39] Azevedo D. C. S, Rodrigues A. E: (2001b) AIChE J. 47(9):2042-2051 [40] Grill C. M, Miller L, Yan T. Q: J. Chromatogr. A 1026 (2004) 101-108 [41] Miller L, Orihuela C, Fronek R, Honda D, Dapremont O: J. Chromatogr. A 849 (1999) 309-317 [42] Biressi G, Quattrini F, Juza M, Mazzotti M, Schurig V, Morbidelli M: Chem. Eng. Sci. 55, 4537 (2000) [43] Depta A., Giese T, Johanssen M, Bruner G: J. Chromatogr. A 865 (1999) 175-186 [44] Johanssen M, Peper D, Depta A: J. Biochem. Biophys. Methods 54 (2002) 85-102 [45] Szepesy L: A kromatográfia és rokon elválasztási módszerek története és fejlesztése Magyarországon. Magyar Elválasztástudományi Társaság (2007) [46] Szepesy L, Sebestyen Z, Feher I, Nagy Z: J. Chromatogr. 108 (1975) 285-297 128

[47] Rossiter G, Keene K, Paradis D, Pease S: Continous process separation: chiral and chromatographic with CSEP and ISEP, PREP 97 (1997) Washington DC [48] Hur J. S, Wankat P. C, Kim J. I, Kim J. K, Koo Y. M: Sep. Sci. Technol. 42 (2007) 911 [49] Jo S. H, Kim J. K, Yool C. G, Kim J. I, Koo, Y. M, Mun S: Can. J. Chem. Eng. 85 (2007) 874 [50] Francotte E, Leutert T, La Vecchia L, Ossola F, Richert P, Schmidt A: Chirality 14 (2002) 313-317 [51] Wu D. J, Xie Y, Ma Z, Wang N. H. L: Ind. Eng. Chem. Res. 37 (1998) 4023 [52] Molnár Z, Nagy M, Hanak L, Szánya T, Argyelán J: Chromatographia 60 (2004) 75 [53] Molnár Z, Nagy M, Aranyi A, Hanák L, Szánya T, Argyelán J: Hung J. Ind. Chem. 32 (2004) 23 [54] Molnár Z, Nagy M, Aranyi A, Hanák L, Argyelán J, Pencz I, Szánya T: J. Chromatogr. A 1075 (2005) 77-86 [55] Davankov V, Tsyurupa, Ilyin M, Pavlova L: J. Chromatogr. A 965 (2002) 65-73 [56] Rhee H. K, Amundson N. R: Chem. Eng. Sci. 27 (1972) 199-211 [57] Guiochon G, Felinger A, Shirazi D. G, Katti A. M: Fundamentals of preparative and nonlinear chromatography. Elsevier, Academic Press (2006) [58] Miron M, Szánya T, Hanák L, Argyelán J, Marton Gy: Hung J. Ind. Chem. 23 (1995) 293 [59] Szánya T, Hanák L, Horváth G, Szabóné R. B, Strbka A, Nagy M, Molnár Z: Process for the Separation of optical isomers of the Corey Lactone WO 2007/066160 A1 (szabadalom)

129

Függelék - ábrák

1. ábra 6 oszlopos kislaboratóriumi SMB készülék 140,00

6,00 XAD-7 0.53ml/min

120,00

NaCl-koncentráció [g/l]

100,00 elúció: 39,5ml

4,00

80,00 NaCl

3,00

60,00 fenilalanin

2,00

40,00

1,00

20,00

0,00 0,00

fenilalanin-koncentráció [g/l]

5,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

0,00 80,00

térfogat [ml]

2.a) ábra Fenilalanin-só áttörési görbék XAD-7 adszorbensen 0,53ml/perc térfogatárammal

130

70,00

4,00 XAD-7 0,952ml/min

60,00

2,50 40,00 fenilalanin

NaCl

2,00

30,00 1,50

elúció: 39,5 ml 20,00

1,00

10,00

0,00 0,00

fenilalanin-koncentráció [g/l]

3,00

50,00

NaCl-koncentráció [g/l]

3,50

0,50

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

0,00 100,00

térfogat [ml]

2.b) ábra Fenilalanin-só áttörési görbék XAD-7 adszorbensen 0,95ml/perc térfogatárammal 70,00

4,00 XAD-7 1,62 ml/min 3,50

60,00

NaCl-koncentráció [g/l]

2,50 40,00 NaCl

2,00

fenilalanin

30,00 1,50 20,00

10,00

0,00 0,00

1,00

elúció: 42,5 ml

fenilalanin-koncentráció [g/l]

3,00

50,00

0,50

0,00 20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

térfogat [ml]

2.c) ábra Fenilalanin-só áttörési görbék XAD-7 adszorbensen 1,62ml/perc térfogatárammal

131

70,00

4,50

HP2MG 0,76 ml/min

4,00

60,00

NaCl-koncentráció [g/l]

50,00 3,00 40,00

2,50 NaCl 2,00

30,00 fenilalanin

1,50

20,00

fenilalanin-koncentráció [g/l]

3,50

1,00 10,00

0,50 elúció: 53,0 ml

0,00 0,00

0,00 20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

térfogat [ml]

2.d) ábra Fenilalanin-só áttörési görbék HP2MG adszorbensen 0,76ml/perc térfogatárammal 70,00

HP2MG 2,04 ml/min

3,50

60,00

2,50 40,00 NaCl

2,00

30,00 fenilalanin

1,50

20,00

1,00

10,00

0,50

elúció: 60,0 ml 0,00 0,00

fenilalanin-koncentráció [g/l]

3,00

50,00

NaCl-koncentráció [g/l]

4,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

0,00 160,00

térfogat [ml]

2.e) ábra Fenilalanin-só áttörési görbék HP2MG adszorbensen 2,04ml/perc térfogatárammal

132

70,00

XAD-1180 1,79 ml/min

60,00

4,50 4,00 3,50 3,00

40,00

2,50 NaCl 2,00

30,00 fenilalanin

1,50 20,00

fenilalanin-koncentráció [g/l]

NaCl-koncentráció [g/l]

50,00

1,00 10,00

0,50

elúció: 99,4 ml 0,00 0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

0,00 250,00

térfogat [ml]

2. f) ábra Fenilalanin-só áttörési görbék XAD-1180 adszorbensen 1,79ml/perc térfogatárammal 70,00

4,00

XAD-1180 4,67 ml/min

3,50

60,00

NaCl-koncentráció [g/l]

NaCl

2,50

40,00 2,00 30,00 1,50

fenilalanin 20,00

1,00

10,00

fenilalanin-koncentráció [g/l]

3,00

50,00

0,50 elúció: 132,7 ml

0,00 0,00

0,00 50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

400,00

térfogat [ml]

2. g) ábra Fenilalanin-só áttörési görbék XAD-1180 adszorbensen 4,67ml/perc térfogatárammal

133

70,00

6,00

5,00

50,00 4,00 40,00 3,00

NaCl 30,00 fenilalanin

2,00

20,00

fenilalanin koncentráció [g/l]

NaCl koncentráció [g/l]

60,00

1,00

10,00 deszorpció: 116,4 ml

0,00 0,00

0,00 50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

térfogat [ml]

2. h) ábra Fenilalanin-só áttörési görbék HP20 adszorbensen 1,76ml/perc térfogatárammal 70,00

6,00

60,00

5,00

4,00 40,00 3,00 30,00 2,00

fenilalanin

20,00

fenilalanin-koncentráció [g/l]

NaCl-koncentráció [g/l]

NaCl 50,00

1,00

10,00 deszorpció: 160,9 ml/perc 0,00 0,00

0,00 50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

térfogat [ml]

2. i) ábra Fenilalanin-só áttörési görbék HP20 adszorbensen 4,74ml/perc térfogatárammal

134

D LRIN

E

F

R

1.részperiódus 2.részperiódus 3.részperiódus 4.részperiódus

D

D E

F

D E

F

F

I.

D E

II.

E

F

III.

IV.

R-LROUT

3.a) ábra A 4 oszlopos nagylaboratóriumi SMB 1-1-2 háromzónás konfigurációjának kapcsolási rajza D LRIN

E

F

R

1.részperiódus 2.részperiódus 3.részperiódus 4.részperiódus

D

D E

F

D E

F

F

I.

II.

D E

III.

E

F

IV.

R-LROUT

3.b) ábra A 4 oszlopos nagylaboratóriumi SMB 2-1-1 háromzónás konfigurációjának kapcsolási rajza

135