Aminosavak, peptidek, fehérjék
Aminosavak O
NH2 ,
NH ,
N , N
C
OH Amino- és karboxilcsoport egy molekulában.
Csoportosítás - az amin rendűsége szerint (első, másod, harmad, negyedrendű) - az amino- és karboxil-csoportok száma szerint monoamino-monokarbonsav diamino-monokarbonsav monoamino-dikarbonsav, stb - a szénlánc szerkezete szerint nyíltláncú, gyűrűs, alifás, aromás
Nyíltláncú, alifás, monoamino-monokarbonsavak 3
H2N
CH2 COOH
H3C β
2
1
CH α
COOH
NH 2
Amino-ecetsav Amino-etánsav Glicin H2N
CH2 CH 2 COOH
β-amino-propionsav 3-amino-propánsav β-alanin
α-amino-propionsav 2-amino-propánsav Alanin H2N
(CH2)5
COOH
ε-amino kapronsav 6-amino-hexánsav
Fehérjealkotó aminosavak H 2N-CH 2-COOH
R
Glicin (Gly) G Glycin
H
H2N
N H
COOH
α-C-n helyettesített α-aminosavak
R=
CH3
CH3 Alanin (Ala) A
Prolin (Pro) P
CH3
CH3
CH3
Valin (Val) V
Leucin (Leu) L
OH
Fenilalanin (Phe) F Phenylalanin
SH
Szerin (Ser) S Serin CH3 OH
COOH
CH3 CH3
Izoleucin (Ile) I Isoleucin
S
CH3
Cisztein (Cys) C Metionin (Met) M Cystein Methionin Treonin (Thr) T -S-S- Cisztin Threonin
R= NH3 OH
Tirozin (Tyr) Y Tyrosin OH
N H
N
Triptofán (Trp) W N H Tryptophan Hisztidin (His) H O Histidin OH
O
Aszparaginsav (Asp) D Glutaminsav (Glu) E Aspartic acid Glutamic acid NH2 O
Lizin (Lys) K Lysin NH2 N H
NH2
Arginin (Arg) R Arginin
O NH2
Aszparagin (Asn) N Glutamin (Gln) Q Glutamin Asparagin
Fehérjealkotó aminosavak: glicin, alanin + 18 alaninszármazék királisak, L konfiguráció, S(Cys R)
Kémiai tulajdonságok
gyenge sav
1. Sav-bázis jelleg H
H N H
CH 2
O C OH
„aminoecetsav” gyakorlatilag nem létezik
H
N H
O CH2
C
glicin „ikerion”
O
gyenge bázis
pI=6 izoelektromos pont
alanin pufferhatása
2. Karboxilcsoportra jellemző tulajdonságok savszármazékok amidok 3. Aminocsoportra jellemző tulajdonságok acilezhető
α-aminosavval acilezett α-aminosav → peptid
α-Aminosavak előállítása: 1. Kinyerés fehérje hidrolizátumból, vagy fermentléből pl. lizin (Lys) cukorgyári melaszból 2. Kémiai szintézis β
α
c. Strecker szintézis
a. ammónia b. Gabriel szintézis d. malonészter szintézis
a. Halogénezett karbonsavból ammóniával Cl
CH2
COOH + NH3
H2N
CH2
COOH + NH4Cl
glicin b. Gabriel-szintézissel
c. Strecker-Zelinszkij szintézis aldehidből
CH2
NH4Cl O NH CN 4
C -H 2O α H
CN CH2
CH
H H 2O
NH2 α-aminonitril
CH2 CH
COOH
NH2
DL-fenilalanin
d. Malonészterből
α β
malonsav- acetamino-malonészter dietilészter „malonészter” DL-szerin hidroklorid
Peptidek
H2N CH R1
COOH
H2N CH
α-aminosavak
N-terminus (amino láncvég)
COOH
H2N CH
CO
NH
R1
R2
CH
COOH
R2
peptid
H2N CH CO Q
-H 2O
peptidkötés
NH
CH Q
CO
NH n
CH Q
polipeptid (fehérjelánc) (a Q húszféle csoportot jelenthet!) polikondenzáció, poliamid
COOH
C-terminus (karboxil láncvég)
CH3 H2N-CH2-CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH glicil - alanil - glicin H-Gly-Ala-Gly-OH GAG
Peptidek szerkezetmeghatározása 1. Aminosav összetétel:
hidrolízis
aminosav analízis
a. papírkromatográfia, vékonyréteg-kromatográfia
b. oszlopkromatogáfia - ioncserélő - RP-HPLC
származék képzés
elválasztás után elválasztás előtt
előhívás
2. Peptid szekvenciameghatározás a. Edman lebontás
N
C
S+
NH
H2N O
R1 NH NH
NH
R1
NH
H
fenil-tiokarbamoil-peptid O
H
+
TFA
R3
O
S
NH
2-anilino-tiazolidin-5-on
R2
vizes HCl
O
R1
S NH
O
R2
H2N +
R3
O
O
N
O
OH
S
NH
NH R2
_
fenil-izotiocianát
R3
O
R1
OH NH
S _ HO 2
O
NH
feniltiokarbamoil-aminosav
O
3-fenil-2-tiohidantoin (PTH-aminosav) NH
R1
Peptidszekvencia meghatározás tömegspektrométerrel Tömegspektrométer: 1. a vizsgált molekulákat ionizálja 2. az elektromos térben felgyorsított ionokat m/z értékük szerint szétválasztja
VSPTDIEEGMR
a. fragmentálódás
b. y fragmensek
Peptidszintézis
O
H
H
O
O
H
+ H-N-CH-C-OH + H-N-CH-C-OH + H-N-CH-C-OH + ... Q2
Q1
Q3
OH
H
O
OH
... -N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-... Q1
Q2
Q3
Dipeptid szintézis R1
O
R1 OH
H2N
H2N
OH
védés
NH
H2N
R2
O
O
O
OH R2
R1 OH
YHN
védőcsoport eltávolítás
védés
O
aktíválás O
R1 X
YHN O
H2N
OZ R2
R1
kapcsolás
O NH
YHN O
OZ R2
Védőcsoport: átmenetileg megszünteti egy funkciós csoport reaktivitását, legyen könnyen, jó hozammal bevihető és enyhe körülmények közt eltávolítható X = aktíváló csoport Y = amino-védőcsoport, Z = karboxil-védőcsoport
Tripeptid szintézis, lánchosszabbítás R1
YNH R1
C
N
H N
H2N
OH
H2N O
R2
R3
R3 OH
YNH
OZ R2
R1
szelektív védőcsoport hasítás
OZ
O R3
O
O
O
H N
X
YNH
YNH O R1
N
R2
racemizáció! O X
O
R2
R3
R3 R3
YNH O
R2
O
H N R1
N H
OZ
H2N
OZ O
YNH O
R3
O
H N R2
N H
OZ O
OH
H2N O
O R1
C
OH
H N
YNH
O
O
O
H N
Uretán típusú aminovédőcsoportok
szénsav félamid-félészter uretán C2H5OCONH2
fluoren
Z -,
N-karbonsav
PhCH2-O-CO-Cl + H2N-CH2-COOH
PhCH2-O-CO-NH-CH2-COONa
Z = benziloxi-karbonil, Boc = terc.-butiloxi-karbonil, Fmoc = 9-fluorenilmetiloxi-karbonil
Karboxil védőcsoport: benzil-észter, terc.-butil-észter Oldallánc védőcsoport: Asp, Glu, Lys, Cys (Arg, His, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln) A védőcsoportokra a szintézis végéig szükségünk van az oldalláncokon és a felépítendő molekula láncvégein (tartós védelem), a továbbépülő láncvégeken a védőcsoportot minden láchosszabbítás előtt szelektíven el kell távolítani (átmeneti védelem).
Aktiváló csoportok: aktív észterek p-nitrofenil-észter
N-hidroxi-szukcinimid- észter
kondenzálószerek
diciklohexil-karbodiimid (DCC)
DCU
védőcsoportok: átmeneti: Boc tartós: Z, Cys(Bzl) C-term.- on nem kell, mert amid
Peptidek az élő szervezetben: hormonok, neurotranszmitterek
Oxitocin szintézis
M. Bodánszky, V. du Vigneaud 1959 9 aminosav, 8 peptidkötés láncépítés: 2x7+1 reakciólépés + 1 végső védőcsop. eltáv. + 1 diszulfid képzés = 17 reakciólépés, 15 izolált intermedier
polisztirol- 0,5% DVB
Szilárd fázisú peptidszintézis
polimer hordozó 1. funkcionalizálás
2. az első védett aminosav kapcsolása 3. az átmeneti védőcsoport eltávolítása
R
4. a következő védett aminosav kapcsolása 5. a 3. és 4. lépés ismétlése szükség szerinti számban 6. a peptid lehasítása a gyantáról, az összes védőcsoport eltávolítása
R Cl
R'-COOH R R'
O O
R. B. Merrifield 1963
nagy reagens felesleg: gyors reakció, 100% konverzió izolálás: mosással tisztítás: HPLC (csak a végtermék tisztítható) miniatürizálás automatizálás hagyományos (oldatfázisú)
szilárdfázisú
peptidszintézis vegyszerigény
kicsi
nagy
oldószerigény
kicsi
nagy
hozam
közepes
magas (>90%)
sarzsméret
g-tól több kgig (>0,1g)
néhány mg-tól több g-ig
automatizálható
nem
igen
időigény
nagy
kicsi
munkaigény
nagy
igen kicsi
intermedier
izolált, tisztítható
nem izolálható ezért nem tisztítható
Fehérjék ∼ 100 - több száz (ritkán több ezer) aminosavból álló polipeptidlánc, többnyire stabil konformáció (a felületi hurkok, oldalláncok mozgékonyak, a vázelemek is elmozdulhatnak egymás mellett)
A fehérjék szerepe az élő anyagban alapvető protein (proteosz = első) proteom: egy sejt, szövet, vagy egy élőlény teljes fehérjekészlete (vö. gén genom)
Fehérjék molekulaszerkezete KONSTITÚCIÓ 1. Elsődleges szerkezet: aminosav sorrend (szekvencia), meghatározása tömegspektrometriával, DNS szekvencia alapján KONFORMÁCIÓ (meghatározása Röntgen diffrakcióval, NMR-rel) 2. Másodlagos szerkezet: periodikusan rendezett szakaszok 3. Harmadlagos szerkezet: jellemzően gombolyagszerkezet: periodikusan és nem periodikusan rendezett szakaszokból áll Szerkezeti típusok: - fonal (fibrilláris) - gombolyag (globuláris) sokszor egy láncon több gombolyag (domének) - membránfehérje, transzmembrán szakasz(ok) - eredendően rendezetlen fehérje (nincs stabilis konformációja, IDP, IUP) 4. Negyedleges szerkezet: több láncból álló fehérje asszociátum szerkezete
1. Fehérjék molekulatömeg meghatározása tömegspektrométerrel a. Elektroporlasztásos ionizálás : a többszörösen töltött molekulaionok képződése kiterjeszti a méréshatárt, növeli a pontosságot +16 mioglobin mt: 16951 Da
+24 +10
b. Mátrixszal segített lézerdeszorbciós ionizálás (MALDI-TOF) : a lézerfénnyel gerjesztett mátrix ionizálja a mintát, repülési időből határozza meg a tömeget, fmol (10-18 mol) mintaméret
2. Fehérjék aminosavsorrendjének meghatározása (elsődleges szerkezet)
A.
B.
a. enzimes hidrolízis b. a peptid keverék szétválasztása, a komponensek aminosavsorrendjének meghatározása (LC-MS) c. a szerkezet részletek összeillesztése átfedő szekvenciák segítségével Ha ismert a fehérjét termelő szervezet genomja, a fehérjéből nyert peptid aminosavsorrendjének segítségével azonosítható az őt kódoló gén, és ezzel a fehérje teljes aminosavsorrendje is megismerhető.
Fehérjekeverék komponenseinek azonosítása Előkészítés: 1.Fehérjekeverék elválasztása 2D gélelektroforézissel (izoelektromos fókuszálás + SDS-gélelktroforézis), utána enzimes hasítás 2. Enzimes hasítás, utána fordított fázisú kromatográfia (RPHPLC) LC-MS Tandem tömegspektrométer (MS/MS) : elválasztás
kDa
fragmentálás
szekvencia meghatározás
ioncsapda detektor
azonosítás
(Nature 2014 66 szerző)
60.000-szeres felbontás !
100
30
enzimes emésztésre kivett minták
7
2D elektroferogram pH3
10
Ezen az úton a vizsgált minta, több mintából a vizsgált szervezet teljes fehérje készlete (proteom) azonositható (bioinformatika, nincs szükség a teljes aminosavsorrend meghatározására!). A minta fehérjéinek rendszer szintű vizsgálata is megvalósítható.
Humán proteom DNS
átírás
~20.000 gén
pre-mRNS
érés, splicing
mRNS
egy génből többféle mRNS
Transzláció utáni módosulások: - diszulfid kötések Cys SH-csoportok között - peptidlánc hasadás - láncvég módosulások (N-terminális Glu - piroglutamil, C-terminális amid Gly lebomlásával) - acetilezés - foszforilezés - glikozilezés Ser, Thr, Asn - fém ionok, kis molekulák kapcsolódása (pl. hem) - stb. összesen ~50-féle glükóz N-acetil-glükozamin mannóz galaktóz 5-acetil-neuraminsav fukóz N-acetil-galaktozamin
transzláció
fehérje
transzláció utáni módosulások
polipeptidek
fehérje
több százezer
módosított polipeptidek
3. A fehérjék térszerkezetének meghatározása (másod- és harmadlagos szerkezet) a. Röntgen diffrakció: A Röntgen sugarak a kristályok rácsán áthatolva szóródnak. Ez a visszavert sugarak interferenciája miatt csak meghatározott irányokban észlelhető. A szóródott hullámok intenzitása (és a beeső sugárhoz viszonyított fázisa) a rácsot felépítő molekuláknak az elhelyezkedésétől függ. Értékükből a rács elemi cellájának elektronsűrűség térképe kiszámítható, ezzel a rácsot felépítő molekulák térbeli szerkezete meghatározható.
szinkrotron röntgensugárzással kapott diffrakciós kép
b. NMR spektroszkópia: A térben egymáshoz közel álló atomok közti távolságokra nyerhető NMR adatokból is meg lehet határozni a fehérjék térszerkezetét. Ebben segítséget jelent, ha a hidrogén atomokon kívül más NMR jelet adó atom pl. 15N is van a molekulában. Ehhez a fehérjét jelzett aminosavakat tartalmazó táptalajon baktériummal kell szintetizáltatni. A távolságadatokból több egymáshoz közel álló alternatív szerkezet nyerhető.
c. Elektron mikroszkópia
~10.000 új szerkezet/év
>100.000
1994 Fehérje és nukleinsav térszerkezetek a Fehérje Adatbankban (Protein Data Bank) 2015. február 28.
A fehérje konformáció meghatározói: 1. mozgási (forgási) lehetőségek (a lánc gerince, oldalláncok) 2. konformációt stabilizáló, molekulán belüli (intramolekuláris) kölcsönhatások - poláris hidrogénkötés sókötés - apoláris hidrofób kölcsönhatások a peptidlánc gerince: poláris N - H hidrogén donor C = O hidrogén akceptor az aminosav oldalláncok: kétfélék poláris (hidrofil) D, E, K, R; S, T, N, Q, Y, W apoláris (hidrofób) A, V, L, I, F, P, M nem kategorizálható G, C
Apoláris (hidrofób) kölcsönhatás P … P dipól-dipól kölcsönhatás A … P indukált dipól kölcsönhatás A … A diszperziós erők
A…P
A…A
A…P
P…P
AP AP
H2O
AA
PP
A fehérje konformációt nagyszámú, kisenergiájú kölcsönhatás együttesen hozza létre. Egy 80-120 tagú peptidláncból akkor képződik stabilis gombolyag, ha a belsejében az apoláris oldalláncok halmozódnak és a lánc gerincének poláris csoportjai egymással le vannak kötve. Ilyenkor a vízmolekulák a gombolyag belsejéből kiszöknek.
A fehérjemolekula konformációját a peptidlánc gerincének konformációja határozza meg …-CO-NH-CαHR-CO-NH-CαHR-CO-NH-… a peptidlánc „gerince” a gerinc görbületét az ω, φ és ψ diéderszögek értékei írják le Cα
CO
NH
Cα
CO
NH
Cα
CO
ω
torziós v. diéder szög
NH
CO
φ
NH
Cα
ψ
a CO-NH konjugáció miatt ω mentén nincs szabad forgás
C α – C – N – Cα ω = 180o
ω = ~ 180o
ω = ~ 0o
N – Cα - C - N ψ ψ = 180o
C – N – Cα – C φ = 180o
φ
Φ = 0 o ψ = 180 o
Φ = 180 o ψ = 180 o
R=H! L
ψ
Φ = 180 o ψ = 0 o
Ramachandran diagram nincs szabad körbe forgás
Φ Φ = 0 o ψ =0 o
NH
lepke
CO
Φ = - 139 o ψ = +135 o ψ
NH CO
Φ csavart
Φ = - 57 o ψ = - 47 o előnyös helyzetek
Másodlagos szerkezetek keratin
dimer
protofilament
a hajszál szerkezete
α-hélix csavart elemek egymás fölött mikrofibrillum H-kötések
5,47 A = = 3,61 . 1,50 A
peptidlánc
makrof.
mikrofibrillum
Hkötések
párhuzamos láncok
6,95 A = 2 . 3,47 A
β-redőzött réteg
Hkötések
váltakozó„lepke”elemek szalagot képeznek az R-csoportok az alsó és a felső oldalon a törésvonalakon sorokat alkotnak
ellentétes láncok
egymásra halmozott β-rétegek GAGAGAGAGA
Selyem fibroin
Harmadlagos szerkezet másodlagos szerkezetű szakaszok + összekötő szakaszok, hurkok
α-szerkezetek
mioglobin 153 as
α/β-szerkezetek
aszpartát karbamoiltranszferáz
flavodoxin
plasztocianin
hidrofób csoportok hidrofil csoportok
α-szénatomok hálózata
olaj – szappan micella
citokróm c - a gombolyag belsejéből kiszorul a víz - A H-donorok és –akceptorok egymással vannak lekötve
Ámbrás cet mioglobinjának H-hélixe hidrofób csoportok
hidrofil csoportok AQGAMNKALELFRKDIAA
18 as > 5 menet
Antiparallel β-réteg a concanavalin-a felületén a peptidláncok gerince fehér
hidrofil csoportok hidrofób csoportok
denaturált állapot
rendezetlen lánc (random coil)
Felgombolyodás, összetekeredés (folding)
mozgási szabadság
„energiatölcsér” E
intramolekuláris kontaktusok száma H-kötések száma (szekunder struktúra)
natív szerkezet felgombolyodott állapot
hidrofób kontaktusok száma (apoláris kölcsönhatás) elfoglalt térfogat
Az elsődleges szerkezet egyértelműen meghatározza a fehérjemolekula térszerkezetét (ez lehet rendezetlen is!). Biztosítja ebben az irányban a gyors felgombolyodást (msec!).
Negyedleges szerkezet fehérje asszociátumok
hemoglobin
Fehérjék működés közben kovalens szerkezet
?
1. HIV proteáz (homodimer)
térszerkezet
?
funkció
enzim-szubsztrát komplex oldallánc „zsebek”
hasadó kötés
Pepszin monomer, 2 domén
2. Hemoglobin β 146 as
α 141 as
mioglobin 154 as
tüdő
szövetek
mioglobin
hemoglobin
Membrán fehérjék: transzport fehérjék, receptorok
foszforilezett befelé nyitott
kifelé nyitott
3. Nátrium-kálium pumpa E1
Na+ -kötő
E2
K+ -kötő
E2
E1
E1
