Aminosavak, peptidek, fehérjék Aminosavaknak nevezzük azokat a karbonsavakat, amelyekben a szénlánc egy vagy több hidrogénjét amino (NH2) csoportra cseréljük. Csoportosításuk történhet az amino és karboxilcsoportok száma és egymáshoz viszonyított helyzete alapján.
Az aminosavak elnevezése történhet szubsztitúciós nomenklatúrával, azonban a természetes aminosavakat triviális névvel szokás elnevezni:
Jóllehet, a számtalan aminosav ismert, és bármilyen szerkezetű aminosav előállítása megoldható, a fenti csoportból az a-aminosavak kiemelkedő fontossággal bírnak, mivel az élőszervezetekben található fehérjék és peptidek a-aminosavakból épülnek fel. Eddig minegy 20-23 a-aminosavat izoláltak fehérjék hidrolízisével. Csoportosításuk történhet az amino és karboxilcsoportok száma szerint. 77
Aminosavak fizikai tulajdonságai: Az a-aminosavak kristályos, magas olvadáspontú vegyületek. Olvadáspontjuk sokkal magasabb, mint azoké a karbonsavaké vagy aminoké, melyekből helyettesítéssel levezethetők. Olvadáspontjuk fölött elbomlanak, gázhalmazállapotban nem létképesek. Oldékonyságuk is a sókra emlékeztet. Szerves oldószerekben, például alkoholban a prolin és a hidroxiprolin kivételével gyakorlatilag oldhatatlanok, míg vízben valamennyi jól oldódik. Aminosavak optikai sajátságai: Az aminosavak királis vegyületek, és a természetben enantiomer tiszta formában fordulnak elő. A fehérjék felépítésében csak az L konfigurációjú aminosavak vesznek részt.
A két kiralitáscentrumot tartalmazó vegyületek esetében (treonin és izoleucin) négy lehetséges szteroizomer létezik, azonban itt is csak az L konfigurációjú vegyület vesz részt a fehérjék feléoítésében.
78
79
Aminosavak sav-bázis sajátságai: Ikerionos forma
Izoelektromos pont: az a pH, ahol az adott aminosav csak ikerionos formában van jelen
80
Elektroforézis vázlata
Az elektroforézis töltött részecskék (ionok, felületi töltéssel bíró részecskék) vándorlása elektromos erőtér hatására. Az elektroforézist elsősorban az analitikai kémiábanhasználják a különböző részecskék elválasztására, mivel a különböző elektroforetikus mozgékonysággal jellemezhető részecskék elektromos erőtérben különböző sebességekkel mozognak, így egymástól elválasztódnak. Az elektroforézis jelenleg az egyik legnagyobb hatékonyságú elválasztástechnikai módszer. A géles közegben végzett elektroforézis a biológiai makromolekulák (fehérjék, DNS, RNS) meghatározásának egyik legfontosabb eszköze.
a-Aminosavak előállítása Az a-halogénezett savak ammónium-hidroxiddal aminosavakká alakíthatók át. A keletkező aminosav aminocsoportja az ikerionos szerkezet miatt kevésbé bázisos, mint más aminokban, így a további alkilezési reakció lassú.
Tisztább terméket kapunk a-bróm-karbonsavészterből kiindulva, ahol a nitrogénatomot az erősen nukleofil ftálimid-kálium szolgáltatja.
Ez tulajdonképpen a Gabriel-szintézis. • Kérdés: alkalmazható-e bonyolultabb aminosav származékok előállítására? 82
Aminosavak előállítása malonészter szintézissel
Malonészter szintézis elvi alapjai. Michael addíció
83
Strecker–Zelinszkij-féle szintézis: Aldehidek ammóniumaddícióját kísérő eliminációjában a keletkező aldimin cseppfolyós hidrogén-cianiddal a-aminonitrillé alakítható, melyből hidrolízissel aminosav nyerhető
Erlenmeyer-féle azlakton szintézis
Reduktív aminálás
84
a-Aminosavak rezolválása I. Az előzőekben ismertetett eljárások az aminosavak racemátjait eredményezik. Az enantiomerek szétválasztását (rezolválását) enzimekkel mint biokatalizátorokkal, vagy diasztereomer sóképzéssel valósítják meg. Aminosavak N-acetilszármazékainak racemátjai aciláz enzim jelenlétében úgy hidrolizálnak, hogy csak az (S)konfigurációjú enantiomer szenved hidrolízist, mely az (R)-N-acetilaminosavtól könnyen elválasztható. Az aciláz enzim sertésveséből nyerhető.
85
a-Aminosavak rezolválása II.
További lehetőség a szétválasztásra a diasztereomer sóképzés, amely során először az aminosav amfoter jellegét, például N-benzoilezéssel megszüntetik. Az így nyert N-benzoilszármazékból molekvivalens mennyiségben vett optikailag tiszta bázissal [pl. (-)-brucin vagy (-)-sztrichnin] sót képeznek. Az diasztereomer sók 1:1 arányú keveréke frakcionált kristályosítással szétválasztható. A diasztereoegységes sókból a megfelelő konfigurációjú N-benzoilaminosav savas kezeléssel szabadítható fel, és végül a benzoilcsoport hidrolízissel hasítható le.
86
Az aminosavak kémiai tulajdonságai Amino csoport reakciói: alkilezés, acilezés
Észteresítés
Reakció salétromos savval
Reakció N-nukleofilekkel
Oxidáció
Aminosavak kimutatása: színreakció ninhidrinnel, csak rájuk jellemző (a prolin kivételével).
A szekunder aminok narancssárga szinű terméket adnak! 88
Xantoprotein - teszt Az aromás oldalláncot tartalmazó aminosavak (pl.: tirozin, fenilalanin, triptofán) salétromsav hatására nitrálódnak, ami sárga elszíneződést eredményez.
Biuret - teszt A biuret teszt az amid kötés jelenlétét mutatja ki, mivel Cu(II) ionokkal lila színű komplex keletkezik. Legalább tripeptidnek kell lennia a színreakcióhoz.
Peptidek, fehérjék A fehérjék (peptidek) olyan makromolekuák, melyek a-aminosavakból épülnek fel. A fehérjékben aminosavak peptid kötéssel (amidkötés) kapcsolódnak össze.
Fehérjék csoportosítása összetétel alapján: • egyszerű fehérjék: hidrolízisükkel csak aminosavak keletkeznek • összetett fehérjék: hidrolízisükkel aminosavak mellett egyébb anyagok (szénhidrátok, nukleotidok, stb.) is keletkeznek. Fehérjék csoportosítása funkció alapján alapján: • enzimek : biológiai, kémiai folyamatot katalizálnak a szervezetben (pl: tripszin – hidroláz enzim) • transzportfehérjék: kis molekulák szállítását végzik (pl: hemoglobin) • kontraktilis fehérjék: mozgásban vesznek részt (pl: miozin) • vázfehérjék: kollagén (inak, porcok) • tartalékfehérjlék: ovalbumin (tojás) • védőfehérjék: ellenanyagok 90 • hormonok: inzulin (glükózanyagcsere)
az
Az aminosavak csoortosíthatóak az oldallánc jellege szerint is:
• apoláris oldalláncot tartalmaznak: alanin; valin; leucin; izoleucin; propiln; metionon; fenilalanin; triptofán • poláros oldalláncot tartalmaznak: glicin; szerin; treonin; cisztein; tirozin; aszparagin; glutamin • savas oldalláncot tartalmaznak: aszparaginsav; glutaminsav
• bázikus oldalláncot tartalmaznak: lizin; arginin; hisztidin • esszenciális aminosav: nem képes az emberi vagy állati szervezet szintetizálni, csak a táplálékkal juttatható be megfelelő mennyiség a szervezetbe. Az emberi szervezet számára 9 esszenciális aminosav van: metiomim, treonin, lizin, leucin, izoleucin, valin, fenilalanin, triptofán hisztidin
93
Fehérjealkotó a-aminosavak csoportosítása
hidrofób
hidrofil
Peptidek
Pentapeptid serylglycyltyrosylalanylleucine, vagy Ser–Gly–Tyr–Ala–Leu, vagy SGYAL.
A biomakromolekulák szerkezeti szintjei • Elsődleges szerkezet : A monomerek kapcsolódási sorrendje, ami lehet lineális, mint a fehérjéknél és a nukleinsavaknál, vagy elágazó, ami az oligo és poliszacharidok esetében léphet fel. • Másodlagos szerkezet: Lokális rendezettség a biomakromolekulán (hélix, redő, stb) • Harmadlagos szerkezet: Leírja a biomakromolekula teljes 3D szerkezetér. Minden atom helyzete ismert. Tartalmazza a másodlagos szerkezeti elemeket is. • Negyedleges szerkezet: Speciális rendeződése több azonos típusú biomakromolekulának. Pl: hemoglobinban négy alegység (négy fehérje lánc) található • ötödleges szerkezet: Különböző típusú biomakromolekulák összekapcsolódásával létrejövő komplex sejtalkotó komponensek. Pl.: hiszton (DNS-fehérje), riboszóma (RNS-fehérje), glikoprotein (oligoszaharid-fehérje).
A fehérjék elsődleges szerkezetének (aminosav sorrendjének) megállapítása Az N-terminális aminosav meghatározása (Senger módszer):
A peptidet reagáltatjuk 2,4-dinitrofluorobenzollal, és a keletkezett termék hidrolizálva az N-terminális aminosav jelzetten található. Az C-terminális aminosav meghatározása: a klasszikus módszer szerint redukáljuk a C-terminális végét a fehérjéknek, így a hidrolízis sorén az aminosavak mellett lesz egy aminoalkohol is, ami a C-terminális aminosavból keletkezett.
A fehérjék hidrazinnal is bonthatóak, ebben az esetben a C-terminális aminosav kivételével mindegyik 98 aminosav savhidrazid származékká alakul.
Az aminosav szekvencia meghatározása Edman lebontással. NH2
H2N O HN NH2
S O
H2N
N H
NH N C S
O HN
O O
O O
NaOH O O
OH
N H
O NH
H2N
S
HCl +
O HN
O O
S O
O
OH
N
N S
OH
N
NH
N N H
O
O
N H
NH
O S tiohidantoin származék
A peptidet lúgos közegben izotiocianáttal reagáltatják, és a keletkező tiokarbamid származék savas hidrolízisével az N-terminális aminosav lehasd és tiohidantoin struktúra alakul ki. Jól automatizálható 99 folyamat.
100
101
102
103
•elsődleges szerkezet:
• harmadlagos szerkezet
• másodlagos szerkezet:
• negyedleges szerkezet:
104
105
Dipeptidek előállítása Curtius (1888)
De! Két különböző aminosav közvetlen kapcsolása, négy terméket eredményez!
Védés és aktiválás
Aminocsoport védése - karbamátok
Aktiválás és kapcsolás
Aktiválás DCC-vel
Szilárd fázisú technika (Merrifi): A módszerben az egyik aminosavat olyan divinilbenzollal térhálósított polisztirol gyantához kötjük, amelynek kb. minden 100-adik fenilcsoportja klórmetilcsoportot tartalmaz. A kapcsolás után, amit DCC-vel végezhetünk, a szennyezések és melléktermékek a polimerből könnyen kimoshatók, és a peptid a polimerről HF-dal lehasítható. A kapcsolási lépést a polimerhez kötött peptiden – a védőcsoport eltávolítása után – ismételhetjük. Az eljárás hatékonyságát példázza a 124 aminosav egységet tartalmazó nukleinsav bontó enzim – a pankreász-ribonukleáz – szintézise. A módszer automatizálható, programozható, de időigényes a sok lépés miatt (inzulin = 21 + 30 aminosav kapcsolása, 19 napig tart).
Cl Robert Bruce Merrifield (1921-2006) Nobel díj 1984
Cl
mûgyanta
110
O gyanta
CH2Cl
HO C CH NHCOOR R1 - HCl O
gyanta
CH2 O C CH NHCOOR R1 hidrolízis/- CO2 O
gyanta
CH2 O C CH NH2 R1 1. DCC, 2. hidrol. O
gyanta
O
CH2 O C CH NH C CH NH2 R1
R2
O gyanta
O
O
CH2 O C CH NH C CH NH C CH NH2 R1
R
n-1 Rn
HJ v. HF O gyanta
CH2 I +
O
O
HO C CH NH C CH NH C CH NH2 R1
R
n-1
Rn
111
Néhány jelentős természetes peptid Glutation: tripeptid, glu-cys-gly, oxidációs-redukciós folyamatok partnere, a szulfidcsoport diszulfiddá oxidálódik. Természetes állapotban néhány gyümölcsben és zöldségben, továbbá növényi és állati szövetekben fordul elő. Nagyobb mennyiségben pedig fehérjetartalmú ételekben található meg. A máj képes előállítani a három aminosavból.
O HOOC
NH
NH NH2
A
SH
O
COOH
2 G-SH
AH2 G-S-S-G
B
BH2
112
Oxitocin és vazopresszin az agyalapi mirigy hormonjai. Oktapeptidek, majdnem azonos szerkezetűek, két aminosav különbözik bennük. Oxitocin: az agyalapi mirigy hátulsó lebenyében tárolódó, a hipotalamuszból érkező hormon. Szabályozza a simaizmok működését, fontos szerepe van a szülés megindításában. Vazopresszin: vérnyomás szabályozása és a vizelet kiválasztása (antidiuretikus hormon)
oxitocin
vazopresszin 113
Inzulin (diabetes mellitis kezelése), (a latin insula = sziget szóból) a hasnyálmirigy Langerhans-szigeteiben található béta-sejtek által termelt polipeptid hormon, amely a szénhidrátok, fehérjék és zsírok anyagcseréjének szabályozásában vesz részt. A szervezet sejtjei (az agysejtek kivételével) csak inzulin jelenlétében képesek felvenni a vérből a glükózt.
114
