Aminosavak HPLC elemzése 9-fluorenil-metiloxikarbonil-származékokként Doktori értekezés
Jámbor Andrea
Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola
Témavezető: Perlné Dr. Molnár Ibolya, D.Sc. Hivatalos bírálók: Dr. Bősze Szilvia, Ph.D. Dr. Gazdag Mária, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Klebovich Imre, D.Sc. Dr. Török Ilona, Ph.D. Dr. Józan Miklós, Ph.D.
Eötvös Lóránd Tudományegyetem Kémiai Intézet, Analitikai Kémiai Tanszék Budapest 2009
Tartalomjegyzék
1. Rövidítések jegyzéke ............................................................................... 5 2. Irodalmi áttekintés .................................................................................. 7 2.1 Az aminosavak meghatározása a gázkromatográfia (Gas Chromatography, GC) felhasználásával .......................................................................................... 7 2.2 Az aminosavak meghatározása a folyadékkromatográfia (Liquid Chromatography, LC) módszereivel ................................................................ 8 2.2.1 Az ioncsere folyadékkromatográfia (Ion Exchange Chromatogaphy, IEC); az aminosav analizátor ........................................................................................ 8 2.2.2 A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) ............................................................................. 10 2.2.3 Az ultra nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC).................................................................. 10 2.2.4 Az aminosavak elemzése származékképzés nélkül ....................................... 11 2.2.5 Az aminosavak elemzése oszlop előtti származékképzéssel ......................... 12 2.2.5.1 Származékképzés 5-dimetil-amino-naftalin-1-szulfonil-kloriddal (5dimethylaminophthalene-1-sulfonyl chloride, DANSYL-Cl)................ 13 2.2.5.2 Származékképzés 4-dimetil-amino-azobenzol-4’-szulfonil-kloriddal (4dimethylaminoazobenzene-4’-sulfonyl chloride, DABSYL-Cl)............ 13 2.2.5.3 Származékképzés fenil-izotiocianáttal (phenyl isothiocyanate, PITC) .. 14 2.2.5.4 Származékképzés 6-amino-kinolin-N-hidroxi-szukcinimidil-karbamáttal (6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate, AQC) ............... 14 2.2.5.5 Származékképzés orto-ftálaldehiddel (ortho-phthalaldehyde, OPA) kéntartalmú segédanyagok jelenlétében ................................................. 15 2.2.5.6 Származékképzés 9-fluorenil-metiloxi-karbonil-kloriddal (9fluorenylmethyloxycarbonyl chloride, FMOC-Cl)................................. 16 a)
A puffer és a pH szerepe ........................................................................ 19
b)
Az FMOC reagens oldószere, a reakcióelegy fázisaránya ..................... 20
c)
A műveleti üres kérdése ......................................................................... 20
1
d)
Az FMOC és az aminosavak reakciója .................................................. 21
e)
Az FMOC feleslegének elvétele............................................................. 22
f)
A His és a Tyr kérdése............................................................................ 22
g)
A származékok stabilitása ...................................................................... 24
2.3 Az aminosavak meghatározása a vékonyréteg kromatográfia (Thin Layer Chromatography, TLC) felhasználásával ...................................................... 24 2.4 Az aminosavak meghatározása a kapilláris elektroforézis (Capillary Electrophoresis, CE) felhasználásával............................................................ 24 2.5 Az aminosavak meghatározása a mágneses magrezonancia spektroszkópia (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) felhasználásával........ 26 2.6 A plazma szabad aminosav (Plasma Free Amino Acid, PFAA) tartalmának meghatározása .................................................................................................. 27 2.6.1 A PFAA mérése HPLC módszerrel, oszlop előtti származékképzéssel ........ 27 2.6.2 Egyidejű fehérjementesítés és származékképzés........................................... 29 2.6.3 A daganatos betegek aminosav anyagcseréjének változása .......................... 30
3. Célkitűzések ........................................................................................... 33 4. Kísérleti rész .......................................................................................... 34 4.1 Vegyszerek........................................................................................................... 34 4.2 A minták .............................................................................................................. 34 4.3 A modell oldatok................................................................................................. 34 4.4 A puffer oldatok.................................................................................................. 34 4.5 A reagens oldatok ............................................................................................... 35 4.6 Származékképzés ................................................................................................ 35 4.6.1 A reagens oldatok jellemzése ........................................................................ 35 4.6.2 Optimális származékképzés és fehérjementesítés ......................................... 35 4.7 Kromatográfiás körülmények ........................................................................... 36 4.8 A pH-mérő készülék ........................................................................................... 38
2
5. Kísérleti eredmények és következtetések ............................................ 39 5.1 Az aminosavak és az FMOC reakciójának tanulmánya és az abból eredő következtetések ................................................................................................. 39 5.1.1 Az FMOC-aminosavak és a műveleti üres szennyezői ................................. 39 5.1.2 A pH változás értékelése ............................................................................... 41 5.1.3 A műveleti üres szennyezőinek értékelése .................................................... 42 5.1.4 Az FMOC reagens feleslegének elvétele....................................................... 45 5.1.5 A FL- és az UV válaszjelek összehasonlítása ............................................... 46 5.1.6 A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő az FMOC reagens abszolút koncentrációjának és az [FMOC]/[aminosav]T mólarányának függvényében ............................................................................................... 47 5.1.7 A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő a puffer pH értékének és az FMOC reagens oldószerének függvényében ...................... 51 5.1.8 A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő az aminosavak tulajdonságainak függvényében ................................................................... 53 5.1.9 A His és a Tyr kérdése................................................................................... 54 5.1.10 A Cys mérése............................................................................................... 67 5.1.11 Reprodukálhatósági vizsgálatok .................................................................. 69 5.2 Az FMOC-aminosavak elválasztásának optimálása ....................................... 71 5.2.1 Az oszlopok tulajdonságainak hatása az elválasztás hatékonyságára ........... 71 5.2.2 A hőfok hatása az elválasztás hatékonyságára .............................................. 75 5.2.3 Az eluens pH értékének hatása az elválasztás hatékonyságára ..................... 76 5.2.4 Az eluens összetétel hatása az elválasztás hatékonyságára ........................... 78 5.3 Módszerfejlesztés, plazma minta előkészítése: az egyidejű származékképzés és fehérjementesítés optimálása ...................................................................... 80 5.3.1 Az FMOC-aminosavak és a műveleti üres szennyezői ................................. 80 5.3.2 A fehérjementesítés és a származékképzés optimálása ................................. 82 5.3.3 A módszer validálása..................................................................................... 83 5.3.4 Emlőrákos betegek plazma szabad aminosav tartalma műtét előtt és után ... 86
3
6. Összehasonlító tanulmány: az aminosavak meghatározása OPA/tiol, OPA+FMOC, valamint FMOC származékképző szerekkel............ 89 6.1 A reagensek jellemzői......................................................................................... 91 6.2 A reakció, valamint a képződött fő- és melléktermékek jellemzői................. 91 6.3 A származékok elválasztásának gyakorlati tapasztalatai ............................... 93 6.4 Alkalmazhatóság a különböző biológiai mátrixok esetében, összegzés ......... 94
7. Összefoglalás, az értekezésben foglalt új tudományos eredmények 95 8. Summary, new scientific statements.................................................... 96 9. Irodalomjegyzék .................................................................................... 97 9.1 Hivatkozott irodalmak jegyzéke ....................................................................... 97 9.2 Saját közlemények jegyzéke ............................................................................ 109
10. Köszönetnyilvánítás .......................................................................... 110
4
1. Rövidítések jegyzéke ACN
acetonitril
ADAM
1-aminoadamantán
AMQ
6-amino-kinolin
AQC
6-amino-kinolin-N-hidroxi-szukcinimidil-karbamát
CE
kapilláris elektroforézis
CLND
kemilumineszcens nitrogén detektor
Cys-(FMOC)2
N,S-(FMOC)2-cisztein
(Cys)2-(FMOC)2
N,N-(FMOC)2-cisztin
CZE
kapilláris zónaelektroforézis
DABSYL-Cl
4-dimetil-amino-azobenzol-szulfonil-klorid
DAD
fotódiódasoros detektor
DANSYL-Cl
5-dimetil-amino-naftalin-1-szulfonil-klorid
EC
elektronbefogásos detektor
ELSD
gőzfázisú fényszórás detektor
EtOH
etanol
FID
lángionizációs detektor
FL
fluoreszcens
FMOC-Cl
9-fluorenil-metiloxi-karbonil-klorid
GC
gázkromatográfia
HEPA
heptilamin
His-1
N-FMOC-hisztidin
His-2
N,NH-(FMOC)2-hisztidin
HPLC
nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia
HPTLC
nagyhatékonyságú vékonyréteg kromatográfia
IEC
ioncsere folyadékkromatográfia
LC
folyadékkromatográfia
LED
fénykibocsátó dióda
LID
lézerindukált fluoreszcenciás detektor
LOQ
mennyiségi mérés határértéke
MCE
2-merkapto-etanol
5
MEKC
micellás elektrokinetikus kromatográfia
MeOH
metanol
MRM
többszörös ionkövetéses
MS
tömegszelektív detektor
MS-MS
tandem tömegspektrometria
NMR
mágneses magrezonancia spektroszkópia
NP-HPLC
normál fázisú folyadékkromatográfia
OPA
orto-ftálaldehid
PAD
pulzáló amperometriás detektálás
PFAA
plazma szabad aminosavak
PITC
fenil-izotiocianát
RP-IP-HPLC
fordított fázisú ionpár-folyadékkromatográfia
RSD
relatív standard deviáció
SFI
szelektív ionkövetéses
SSA
szulfoszalicilsav
TBDMS
terc-butil-dimetilszilil
TCA
triklór-acetát
TFEA
trifluorecetsav anhidrid
THF
tetrahidrofurán
TLC
vékonyréteg kromatográfia
TMS
trimetil-szilil
Tyr-1
N-FMOC-tirozin
Tyr-2
N,O-(FMOC)2-tirozin
UPLC
ultra nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia
UV
ultraibolya
Az aminosavak az IUPAC szerinti nemzetközi hárombetűs kóddal rövidítettek [1].
6
2. Irodalmi áttekintés Az irodalmi áttekintés során az aminosav meghatározására alkalmazott eljárásokat mutatom be, különös tekintettel a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) területén alkalmazott különböző származékképzési módszerekre.
Az élő szervezet testnedveiből és szöveteiből a szabad- és a fehérje hidrolizátumok aminosav tartalmának minőségi-mennyiségi meghatározása, valamint a fehérjék aminosav- sorrendjének ismerete a modern biokémia, az orvostudomány, a klinikai diagnosztika, a genetika, a taxonómia, az élelmiszeripar, a vegyipar és a gyógyszeripar számára alapvetően nélkülözhetetlen. Az aminosavak nem csak a fehérjék építőkövei, hanem energiaforrásként szolgálnak, egyes neurotranszmitterek, porfirinek, poliaminok és nitrogén-oxidok bioszintézisének prekurzorai [2]. A kromatográfiás technikák fejlődésével lehetőség nyílt a sokösszetevőjű minták érzékeny meghatározására, valamint hatékony királis aminosav elválasztási módszerek fejlesztésére. Az eltérő célú aminosav-tartalom elemzések a kromatográfiás technikát is meghatározhatják. Először a gázkromatográfia, majd a folyadékkromatográfia módszereit ismertetem.
2.1 Az aminosavak meghatározása a gázkromatográfia (Gas Chromatography, GC) felhasználásával
A GC az aminosavak elválasztására széleskörűen, sokféle detektálással alkalmazott eljárás [2]: hátránya a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) módszereivel szemben, hogy az aminosavak mindkét csoportjának előzetes származákká alakítását igényli. Az aminosavak GC meghatározásának klasszikus alapjait, és nagyszámú származékképzési technikát ismertet az 1987-ben, Gehrke szerkesztésével megjelent három kötetes mű [3]. A GC technika egyik jelentős eredményét holdkőzetek lehetséges aminosav tartalmának meghatározása jelentette. A kőzeteket az Apollo 11 hozta a 17. útjáról [4,5].
7
Az aminosavak klasszikus GC meghatározása a két lépésbeni – munka- és időigényes – származékkészítésen alapszik. Első lépcsője a karboxilcsoport észteresítése, amelyet az aminocsoport acilezése követ. Az észteresítésre leggyakrabban használt alkoholok a nbutanol [6], a n-propanol [7] és az izobutanol [8]. Az acilezési lépés mind ecetsavanhidriddel [9,10], mind propionil-kloriddal [11] megvalósítható. Leggyakrabban a perfluoroacil [12] vegyületekkel acileznek, amelyek lehetővé teszik a lángionizációs detektornál (FID) nagyobb érzékenységű elektronbefogási detektor (EC) használatát. A fehérjealkotó aminosavak eltérő szerkezetű oldalláncai megnehezítik az acilezés során alkalmazható körülmények (hőfok, reakcióidő) egységesítését: az Arg és a His származékká alakulása szempontjából optimális hőfokon a Trp már bomlásnak indul. A leggyakrabban
trifluorecetsav
anhidridben
(TFEA)
[13],
metilén-klorid/TFEA
elegyében [6], vagy acetonitril (ACN)/TFEA elegyében acileznek [14,15]. Az aminosavak egylépcsős származékká alakítása trimetil-szilil- (TMS) [12,16,17] és terc-butil-dimetilszilil reagensekkel (TBDMS) [18-20] széleskörben alkalmazott módszer, amely sajnálatos módon egynél több terméket ad [21]. Az 1990-es évek elején írták le az aminosavak egylépcsőbeni észteresítését és alkilezését az alkil-kloroformát vegyületekkel [22-24]. A reakció a víz-alkohol-piridin megfelelő arányú elegyében egyszerűen kivitelezhető, melynek során a megfelelő N(O,S)-alkiloxi-karbonil-alkil-észterek keletkeznek, a termékek szerves oldószerbe átrázhatóak [2,23]. A kloroformát kiterjesztette a GC-vel vizsgálható aminosavak spektrumát: kiküszöbölték ezzel a módszerrel az N-metil-His, a Ser és a Gln részleges veszteségét vagy teljes elbomlását az injektorban [25].
2.2 Az aminosavak meghatározása a folyadékkromatográfia (Liquid Chromatography, LC) módszereivel
2.2.1 Az ioncsere folyadékkromatográfia (Ion Exchange Chromatogaphy, IEC); az aminosav analizátor
Az aminosavak minőségi-mennyiségi meghatározására kidolgozott automatikus aminosav analizátorok ötven éve működnek, az IEC elvén. Hosszú ideig az egyetlen
8
módszer volt ezen a területen [26]. Az ioncserélő kromatográfia őse, a nátriumaluminínium-szilikát, mint cserélő mátrix, az 1850-es években jelent meg. Fejlődésének óriási lendületet adott az Adams és Holmes által elkészített szintetikus organikus ioncserélő gyanta [27]. Az IEC módszer lényege, hogy különböző pH értékű puffer oldatokkal, kationcserélő oszlopon választják el az aminosavakat, majd az effluenst ninhidrin reagensbe vezetik, ezt követi az UV detektálás (440-570 nm) [2,28]. A ninhidrinnel festési eljárás a primer aminosavak esetében bíbor színű (abszorpciós maximum = 570 nm) terméket eredményez. A szekunder Pro és a Hyp sárga (abszorpciós maximum = 440 nm) színnel festődik [2]. A kromatográfiás elválasztást követő származékkészítés hátránya a kémiai reakció kivitelezéséhez szükséges többlet műszerezettség magas költségigénye. A reagens oldatot kiegészítő pumparendszerrel kell az oszlop eluátumhoz adni, ezen kívül szükség van keverőre és termosztálható reaktorra is. Az oszlop utáni származékképzést először az aminosavak IEC meghatározásánál alkalmazták. E technika ma is fontos szerepet játszik az elemzésekben, bár az eredeti, Spackman és munkatársai által kidolgozott módszert [29] a nagyobb érzékenység, a gyorsabb elemzés és a nagyobb fokú automatizálás érdekében tovább fejlesztették [3032]. Növényi szövetek szabad aminosavait – mintegy 59 komponenst – választottak el a Pickering rendszer használatával [32], 42ºC hőfokon, ninhidrin reagenssel, oszlop utáni származékkészítéssel. A detektálás érzékenységének növelése céljából először a fluoreszkamin reagenst [33], majd az orto-ftálaldehidet (OPA) és valamely tiol tartalmú segédanyagot [34] alkalmazták ninhidrin helyett.
Az aminosav analizátorok használata háttérbe szorult az 1960-as években, először a GC, majd az 1970-es évektől a HPLC vette át a vezető szerepet az aminosav elemzésekben. Ennek oka egyrészt a hosszas elemzési időkben, s a kizárólagos elemzési feladatra való alkalmasságában keresendő. További hátránya, hogy a ninhidrin reagál a biológiai mátrix egyéb összetevőivel is [2].
9
2.2.2 A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)
Az elmúlt negyven évben az LC nagymértékű fejlődésével korlátlan lehetőségek nyíltak a preparatív és az analitikai kémiai célú aminosav elemzések előtt. A modern, nagyteljesítményű
HPLC
módszerek
elterjedésével, a
detektálási
lehetőségek
bővülésével, az egyre jobb minőségű és szélesebb választékú kromatográfiás oszlopok alkalmazásával, valamint a számítástechnika előretörésével - az adatgyűjtés és az adatfeldolgozás területén - az elemzési költségek és idők nagymértékű csökkenését tapasztalhattuk. Mindezen tényezők ugrásszerűen növelték a kutatások és a gyakorlati alkalmazások fejlődésének ütemét is. Az aminosavak HPLC elemzésének két nagy területét különíthetjük el: a) a származékképzés nélküli elválasztásokat (2.2.4 fejezetben részletezett), valamint b) a származékokkénti elemzéseket (2.2.5 fejezetben részletezett). 2.2.3 Az ultra nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)
Az UPLC készülék, amely a Waters terméke, hatékonyabban és gyorsabban választ el, mint a klasszikus HPLC [35]. Előnyének lényege, hogy az alkalmazott elválasztó kolonna töltete kis szemcseátmérőjű (1,7 µm [36]), nagy külső felületű, ezáltal - a van Deemter összefüggés értelmében - nagy kinetikai hatékonyság érhető el. A kisebb szemcseméret szűk kromatográfiás zónákat eredményez, így egységnyi idő alatt több összetevőt tudunk elválasztani [37]. Az UPLC magas nyomáson dolgozik (15000 psi). A napjainkban kifejlesztett technikát alkalmazták aminosavak meghatározására 6amino-kinolin-N-hidroxi-szukcinimidil-karbamát
(AQC)-származékokként
(UV
detektálással) [36], valamint származékképzés nélkül (tandem MS módszerrel) [38].
10
2.2.4 Az aminosavak elemzése származékképzés nélkül
Az elmúlt húsz évben több módszert javasoltak az aminosavak származékképzés nélküli HPLC meghatározására [39-46]. E módszerek előnye, hogy kiküszöbölik a reagens feleslege/ bomlása vagy a minta egyéb összetevőivel alkotott vegyületek okozta szennyező csúcsok zavaró hatását. Mind normál fázisú folyadékkromatográfiás (NP-HPLC) [39], mind fordított fázisú ionpár-kromatográfiás (RP-IP-HPLC) [40] elválasztásra tettek javaslatot, de a módszerek a rossz reprodukálhatóságuk miatt nem terjedtek el. Az aminosavak többsége, az aromás gyűrűt tartalmazó Phe-t, Tyr-t és Trp-t kivéve, nem fluoreszkál, érzékeny és szelektív meghatározásuk optikai detektorral nem lehetséges. Néhány biológiailag aktív, kéntartalmú aminosav [Cys, (Cys)2, Met és glutation] nagy érzékenységű mérését írták le [41] pulzáló amperometriás detektálással (PAD) [42]. A HPLC elválasztásoknál az univerzális detektorokat, mint a gőzfázisú fényszórás detektort (ELSD) [40,46], a tömegszelektív detektort (MS) [43] és a kemilumineszcens nitrogén detektort (CLND) [44,45] is használják. A felsorolt detektorok közül az MS a legelterjedtebb, mivel a biológiai minták gyakran tartalmaznak olyan egyéb összetevőket, melyek az aminosavak meghatározását zavarhatják. Ez elkerülhető az MS detektorok alkalmazásával. További nagy előnye, hogy különbséget tesz az izotóp és az izobár aminosavak (Ile-Leu) között. Anyagcsere vizsgálatra kiválóan alkalmas: izotópjelzett szubsztrátok kimutathatók [2]. Az MS detektorok szelektív ionkövetéses (SFI) üzemmódja lehetővé teszi az el nem váló komponensek minőségi – és mennyiségi azonosítását [47]. A tandem tömegspektrometria (MS-MS) alkalmazásával a módszer érzékenysége tovább növelhető [48]. 21 aminosavat elemeztek narancslében 40 perc alatt [49]. A mérési idő csökkenthető, 1,5 perc alatt 19 aminosav meghatározását is megvalósították [50]. Többszörös ionkövetéses (MRM) technikával a komponensek száma növelhető, 76 aminosavat elemeztek 20 perc alatt [51].
11
2.2.5 Az aminosavak elemzése oszlop előtti származékképzéssel
Az aminosavak HPLC elemzése körében az oszlop előtti származékképzés a leggyakoribb.
Elterjedtségét
a
rendelkezésre
álló
származékképző
szerek
sokféleségével, a fordított fázisú oszlopok eredményezte hatékonyabb elválasztásokkal és az általánosan használt, ugyanakkor megfelelően érzékeny detektorok (UV, FL) alkalmazásával
magyarázhatjuk.
A
származékká
alakítás
előnye,
hogy
a
származékképző csoportok egyszerre hidrofóbok és kromofórok, jelentős mértékben növelhetik a retenciós tényezők közötti különbséget, javítják a detektálás érzékenységét és szelektivitását. A felhasználók általában a célfeladatnak megfelelően és a rendelkezésre álló műszereik alapján választanak. Így napjainkban is újabb és újabb lehetőségek után folynak kutatások. Az ideális származékképző szernek a következő tulajdonságokkal kellene egyidejűleg rendelkeznie: a) gyors és kvantitatív reakciót adjon az aminosavakkal; b) lehetőleg vizes közegben, szobahőfokon végbemenjen a származékképzés; c) stabil származékot képezzen; d) mind a primer, mind a szekunder aminosavakkal reagáljon; e) feleslege és az esetleges mellékreakciók ne zavarják a kromatográfiás elválasztást; f) az oldalláncukon egyéb reaktív csoportot tartalmazó aminosavakkal egy-egy csúccsal eluálódó származékot adjon; g) megfelelő érzékenységű, szelektivitású, lehetőleg fluoreszkáló származékot képezzen; h) a módszer gazdaságos legyen. Ezen legfontosabb feltételek alapján rendszerezhetjük és értékelhetjük a leggyakrabban alkalmazott származékképző szereket. Az elmúlt tíz év irodalmi adatait tekintve megállapítható, hogy a szobahőfokon kivitelezhető reakciókat előnyben részesítik: a legtöbbször alkalmazott származékképző szer az OPA+tiol (36%-a az összes HPLC elválasztásoknak 1999. és 2009. március között). (Tudományos keresőprogramok: SCOPUS, Web of Science alapján feldolgozott adatok.) Ezt követik az egyre elterjedtebb FMOC-Cl (19%), valamint az egyre kisebb jelentőségű DABSYL-Cl és DANSYL-Cl (együttvéve 19%) alkalmazások.
12
2.2.5.1 Származékképzés 5-dimetil-amino-naftalin-1-szulfonil-kloriddal (5dimethylaminophthalene-1-sulfonyl chloride, DANSYL-Cl) A DANSYL-Cl-dal származékképzést Gray és munkatársai vezették be 1963-ban [52]. H3C
N
H3C
CH3
+
N
CH3
H2N CH COOH R
SO2Cl
O2S NH CH COOH R
1. ábra: DANSYL-Cl reakciója aminosavakkal Előnye, hogy reagál mind a primer, mind a szekunder amino csoporttal [52]. Királis elválasztás céljából γ-CD-el alkalmazzák [53,54]. Jellemzője, hogy a reakció pH 9,5-10 értékű, adott arányú szerves/vizes oldatokban zajlik [55]. Hátránya, hogy szobahőfokon 24 óra alatt teljes [55]; emelve a hőfokot a reakcióidő csökken (60 perc) [56-58]; 80ºC hőfokon 30 perc alatt kvantitatív a származékképzés [59,60]. A reakció során fluoreszkáló melléktermékek (DANSYL-OH és DANSYL-NH2) keletkeznek, melyek az aminosav-származékokkal együtt eluálódnak, az elválasztást zavarják [55]. Alacsony a származékok UV érzékenysége [55].
2.2.5.2 Származékképzés 4-dimetil-amino-azobenzol-4’-szulfonil-kloriddal (4dimethylaminoazobenzene-4’-sulfonyl chloride, DABSYL-Cl) A DABSYL-Cl-ot 1975-ben Lin és munkatársai alkalmazták először [61]. H3C N H3C
N N
SO2Cl
+
H2N CH COOH R
H3C N H3C
N N
SO2 NH CH COOH R
2. ábra: DABSYL-Cl reakciója aminosavakkal
13
Előnye, a DANSYL-Cl-hoz viszonyítva, hogy a DABSYL-Cl-dal képzett termékek fluoreszkálnak. Mind a primer, mind a szekunder amino csoporttal reagál; a képződött származékok stabilak. UV- és FL detektálással egyaránt mérhetőek [55], a képződött szulfonamid 420 és 450 nm közötti abszorpciója miatt a biológiai eredetű mintákban jelenlévő
kisebb
hullámhosszakon
abszorbeáló
szennyezők
zavaró
hatása
elhanyagolható [62-65]. Jellemzője, hogy a kvantitatív származékképződéshez a szerves/vizes oldat térfogataránya 1:1, a használt puffer pH értéke 8,5-9,5 [55]. Hátránya, hogy nagy hőfokon teljes a reakció (67ºC, 10 perc [66]; 70 ºC, 15 perc [67]).
2.2.5.3 Származékképzés fenil-izotiocianáttal (phenyl isothiocyanate, PITC) Az aminosavak feniltiokarbamoil származékokkénti HPLC elemzését 1977-ben Zimmerman és munkatársai írták le [68]. S N C S
+
H2N CH COOH
NH C NH CH COOH R
R
3. ábra: PITC reakciója aminosavakkal Előnye, hogy reagál mind a primer, mind a szekunder aminocsoporttal; a reakció szobahőfokon 5 perc alatt teljes; a képződött származékok stabilak, vízmentes közegben, mélyhűtőben korlátlan ideig eltarthatóak [55]. Hátránya, hogy a) a származékképzés során sok zavaró melléktermék képződik, melyeket a kromatográfiás oszlop védelme érdekében vákuum segítségével el kell távolítani [69], valamint hogy b) a keletkezett származékoknak kicsi az érzékenysége [70].
2.2.5.4 Származékképzés 6-amino-kinolin-N-hidroxi-szukcinimidil-karbamáttal (6aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate, AQC) Az AQC és az amino csoport reakciótermékek HPLC elemzését Cohen dolgozta ki 1993-ban [71]. A módszer továbbfejlesztett UPLC változatát Duchateau írta le [36].
14
H N
O O O
N
N
H2N CH COOH
+
O
R H N
N
O NH CH COOH R
O
HO
+
N
O
4. ábra: AQC reakciója aminosavakkal Előnye, hogy az AQC hidrolíziséből képződő 6-amino-kinolin (AMQ) és az aminosavszármazékok emissziós spektrumának maximumai 60 nm-re térnek el egymástól, így nem zavarja az elválasztást. A keletkezett származékok stabilak [71,72]. Ezzel a módszerrel igen alacsony kimutatási határt értek el, érzékenysége fmól tartományba esik [55]. Jellemzője, hogy a származékképzés széles pH tartományban (pH 8,0-10,5) kvantitatív [55]. Hátránya, hogy 10 perc alatt 55ºC hőfokon teljes a reakció [73,74], valamint az Orn-nal nem reagál [71].
2.2.5.5 Származékképzés orto-ftálaldehiddel (ortho-phthalaldehyde, OPA) kéntartalmú segédanyagok jelenlétében Az első cím szerinti összetétel, Roth ajánlásában, 1971-ben az OPA/2-merkaptoetanol (MCE) volt [75].
S R CHO
+ CHO
1
R SH + H2N CH COOH
1
N CH COOH R
R
5. ábra: OPA+tiol tartalmú segédanyag reakciója aminosavakkal Előnye, hogy a reakció gyors (1-2 perc); szobahőfokon teljes; nincs szükség a reagensfelesleg eltávolítására; FL- és UV detektálás egyaránt alkalmazható, s a módszer érzékeny [76-79]. Jellemzője, hogy vizes közegben, pH 9-10 értékű oldatokban reagál az aminosavakkal. Hátránya, hogy csak a primer aminocsoportúakkal képez származékot [55], melyek nem stabilak [78]; mind az OPA-, mind a tiol tartalmú segédanyag feleslege másodlagos termékek keletkezéséhez vezet [55].
15
Az
OPA/tiol-módszer
hiányosságát
kiküszöböljék
–
miszerint
a
szekunder
aminocsoportú Pro és Hyp nem mérhetők -, az OPA-t 9-fluorenil-metiloxi-karbonilkloriddal (FMOC-Cl) párosítva, kétlépcsős származékképzést javasoltak [80]. Első lépésben az OPA a primer amino csoportokkal, második lépésben az FMOC a szekunder amino csoportokkal reagál. A módszer hátránya, hogy mérés közben hullámhossz-váltást kell beiktatni [81,82].
2.2.5.6 Származékképzés 9-fluorenil-metiloxi-karbonil-kloriddal (9fluorenylmethyloxycarbonyl chloride, FMOC-Cl) Az FMOC egy 3 gyűrűs (6+5+6), poliaromás vegyület nagy kiterjedésű, delokalizált elektronrendszerrel. Az FMOC-ot 1972-ben írták le Carpino és munkatársai a peptidkémiában az amin védőcsoportjaként [83]. Majd 1979-ben mutattak rá, hogy a primer és a szekunder aminokkal egyaránt fluoreszkáló terméket eredményez [84]. Származékképző reagensként a folyadékkromatográfia területére 1983-ban Einarsson vezette be [85]. +
H2N CH COOH R
O O
O Cl
O
NH CH COOH R
6. ábra: FMOC-Cl reakciója aminosavakkal
Előnye, hogy mind a primer, mind a szekunder amino csoporttal reagál, a reakció szobahőfokon gyors [83], az FMOC reagens elkészítése egyszerű [85], a származékok néhányat kivéve stabilak [85]. Jellemzője, hogy adott arányú szerves/vizes közegben teljes a reakció, az enyhén lúgos közeg kedvező [55]. Hátránya, hogy a kromatogramon a reagens hidrolízisterméke, az FMOC-OH, széles csúccsal eluálódik [85,86]. Számos módszert javasoltak az FMOC-OH nem kívánatos zavaró hatásának kiküszöbölésére [85,87-95], a maradéktalan eltávolítása nem megoldott.
16
+
+
H2O
O O
CO2 + HCl
OH Cl
7. ábra: FMOC-Cl hidrolízise Az irodalomban alkalmazott reakciókörülményeket az 1. táblázat tartalmazza, amelyeket az (a-g) pontok alapján értékelek.
17
1. táblázat: Az aminosavak és az FMOC-Cl reakciójának származékképzési és kromatográfiás körülményei: irodalmi adatok Származékképzés feltételei M* 0,1 0,1 0,1 0,1 0,01 0,05 0,05 0,1 0,05 0,1 0,1 0,1 0,11 0,18 0,05 0,125 0,166 0,16 0,08 0,035 0,325 0,125 0,143 0,1
Puffer Só pH b 7,7 b 7,7-8,0 b 6,0-8,5 b 7,7 b 7,7 b 9,5 8,0 k b 7,85 b/k 8,0 b 8,5 b 7,7 b 8,5 b 8,5 b 8,0 b 8/11,4 b 8,8 b 8,0 b 9,9 b 10,0 b 9,0 k 10,2 b 8,5 k 10,2 b 8,0/9,0
Oldószer: (v/v) AC:V=1:1 AC:ACN:V=1:1:2 AC:V=1:1 AC:V=1:1 AC:V=1:1 THF:V=1:1 AC:V=1:1 AC:ACN:V=1:1:2 AC:V=1:1 ACN:V=1:1 AC:V=1:1 ACN:V=1:1 AC:V=2:2,5 AC:V=5:6 AC:V=1:1 ACN:V=1:1 AC:V=1:2 ACN:V=2:3 ACN:V=2:3 ACN:V=4,5:5,5 AC:V=1:1 ACN:V=1:1 AC:V=1,15:1 ACN:V=1:1; AC:V=1:1
Reagensfelesleg eltávolítása (mM)*:
FMOC: mM*; Idő: [FMOC]/[As]T mp 7,5; 31,25:1 30-40 extr: C5H12 ; sav 7,5; 37,5:1 40 extr: C5H12 ; sav 3,75-30; 15,6–125:1 15-120 extr: C5H12 7,5; 31,25:1 40 extr: C5H12 0,5; 11,4:1 45 ADAM (20) 3,9; 1,54:1 240f v 2; 16:1 600 extr: C5H12 :EtAc =90:10 2; 20:1 600 extr: C5H12 3; 7,2:1 60 extr: C5H12 or, ADAM (30) 8; 16,7:1 90 NH2OH+NaOH (50) 7,5; 2,3:1 40 extr: C6H14 8; 16,7:1 90 NH2OH+NaOH (50) 1,33; 5:1 180 HEPA (10,5) 1,36; 97:1 120 ADAM (12,5) 3; 75:1 2-40perc extr: C5H12 7,75; 18:1 90 NH2OH+NaOH (33) 0,33-4; 1; 5,5-66,6:1 45-300 ADAM (3) 4; 4:1 60 Extr. C7H16 6; 24-120:1 300 ADAM (86) 1,9; 1:1 60 ciszteinsav (4,7 ) 1200 cc.HCl (460) 1,7; 72:1 7,75; 69:1 90 NH2OH+NaOH (30) 2,67; 31,4:1 600 & cc.HCl (357) perc 0,25- 5; 2,75–55:1 1-20 ADAM (6,2) vagy HEPA (7,8)
Tyr
His
m m m m+d m+d m+d m+d m+d m m m m+d m+d m m m m m m m m m+d
d m+d d d m+d m+d m d d m+d m d m+d d m m d m+d
No/ perc 20/20 21/92 19/54 12/50 19+2/30 9/24 20+1/35 18+1/40 20+2/45 30/30 13/25 15/30 24/75# 16+1/45 19+2/40 17/35 16/50 25+1/80 16/40 18/80 25/32#
16/43 27/43# 22+2/40
Műveleti üres + + -
+ + +
Hivatkozás [85] [96] [97] [98] [88] [95] [93] [99] [100] [89,101] [87] [102] [91] [103] [104] [105] [106] [94] [107] [90] [92] [108] [109] [110]
Jelölések: V=víz; AC=aceton; ACN=acetonitril; sav=10 μL jégecettel savanyított; ADAM=1-aminoadamantán.HCl; HEPA=heptilamin; *a puffer, a reagens és a reagensfelesleg eltávolítására szolgáló vegyület koncentrációja a reakcióelegy össztérfogatára vonatkoztatva; [As]T=az aminosavak együttes mennyisége; 90:10v=9:10 (v/v); No/perc=az összetevők száma/elúciós idő percben kifejezve; m=’mono-származék’ (N-FMOC-hisztidin, N-FMOC-tirozin); d=’di-származék’ [N,NH-(FMOC)2hisztidin, N,O-(FMOC)2-tirozin]; 240f=csepegtetve; b=borát; k=karbonát; #=aminosavak és aminok együtt; =N-(9-fluorenilmetoxikarboniloxi)szukcinimid; &=40C-os hőfokon.
18
a) A puffer és a pH szerepe A leggyakrabban alkalmazott puffer a borát puffer (1. táblázat), melynek kapacitása a reakciónak kedvező pH 8,5 - 9,5 tartományban optimális [111]. A pH 6 [97] - pH 11,4 [104] értékű pufferek alkalmazásával a reakcióelegyre vonatkoztatott puffer koncentráció 0,01 M [88] – 0,325 M [92] között változott. 11 esetben pH 8 értékű [85,87,88,93,96,98-100,103,104,106], 8 esetben pH 9 értékű [8991,101,102,105,108,110], 5 esetben pH 10 értékű [92,94,95,107,109] puffert használtak. 4 esetben karbonát puffert alkalmaztak [92,93,100,109]. A gyakorlat során a borát puffer előnyösebbnek bizonyult. Használata előtt nem kell semlegesíteni a mintát, s a mérés kedvezőbb, ugyanis a karbonát puffer alkalmazása során felszabaduló CO2 zavar [100]. Jóllehet a reakciónak a lúgos közeg kedvez, mégis a ≥ pH 10 értékű puffer kedvezőtlen választás lenne. Számos hátránya van, melyek egymásból következnek, úgymint: 1. a reagens hidrolízisének sebessége a pH érték emelésével nő, 2. a gyorsuló hidrolízis miatt nagyobb FMOC koncentrációt kellene alkalmazni, mely több FMOC-OH képződésével jár, 3. az FMOC-OH szélesebb csúccsal eluálódik a kromatogramon, 4. mely megnehezíti a szomszédos aminosavak elválasztását (hogy mely és mennyi aminosavval euálódik együttesen, függ az alkalmazott grádienstől). Az irodalmi adatok alapján pH 6 - pH 11,4 értékű puffer oldatokat választottak, melyek számított átlaga pH 8,5. A reakcióelegy tényleges pH értékéről irodalmi adat nincs. Schilb egyedi módszert dolgozott ki, mely szerint cseppenként adagolta az FMOC reagenst az aminosavakat tartalmazó oldathoz, és az egyes frakciók között 15 mp-et várt. Célja volt, hogy a reagens melléktermékeit csökkentse, mert úgy gondolta, az FMOC az aminosavakkal gyorsabban reagál, mint ahogy elhidrolizál [95]. Brückner vizsgálta a hőfok hatását (4-60ºC) a származékképzés sebességére: szignifikáns különbséget az aminosav-származékok válaszjelében nem tapasztalt, ezért a kvantitatív reakcióhoz a szobahőfokot találta kedvezőnek [103]. Lozanov 40ºC hőfokot javasolt a reakció kivitelezéséhez (10 perc, 2,7 mM acetonban oldott FMOC reagens, pH 10,2) [109].
19
Az FMOC-aminosavak királis elválasztását foglalja össze Péter Antal visszatekintő tanulmánya [112].
b) Az FMOC reagens oldószere, a reakcióelegy fázisaránya Az FMOC szerves oldószerben oldódik, vízzel hidrolizál; a származékképzési reakciónak a vizes elegy kedvez. Következésképpen, kevés kivételtől eltekintve, a szerves és a vizes fázis térfogataránya 1:1 (1. táblázat). 3 esetben tértek el a fenti aránytól: szerves/vizes = 1:2 [106] és 2:3 [94,107] térfogatarányt javasolnak. Minél nagyobb a vizes fázis aránya, annál nagyobb az FMOC-OH mennyisége. Az FMOC reagens oldószere aceton és ACN, egy esetben használtak THF-t [95]. Az 1. táblázatban részletezett 24 esetből 13 esetben alkalmaztak acetont [85,87,88,9193,97,98,100,103,104,106,109] és 7 esetben ACN-t [89,90,94,102,105,107,108]. Egy esetben összehasonlító kísérletet végeztek a két oldószerre vonatkozóan, mely szerint az aceton elegyében gyorsabb a reakció, mint ACN tartalmúban [89]. Aceton tartalmú reakcióelegyet alkalmazva egy nagy műveleti üres csúcs zavarja az elválasztást, mely az FMOC-OH és az FMOC feleslege és/vagy származékai között eluálódik. Ezt a nagy csúcsot és az egyéb szennyező csúcsok megjelenését korábban is tapasztalták, de részletesen nem írtak róla [104].
c) A műveleti üres kérdése Az FMOC reagensből származó műveleti üres tekintetében kevés irodalmi adat áll rendelkezésre. Jóllehet a pmól tartományban mérés esetén a szennyező csúcsok figyelembe vétele kötelező. A szennyezésre vonatkozó irodalmi megjegyzések [92,104,106,107] mennyiségi számításokat nem tartalmaznak, miszerint: 1. a megállapítások választott tartományokra vonatkoznak [104], 2. a mennyiségi mérés határértékeit (LOQ) befolyásolják [106], 3. bemutattak egy műveleti üres kromatogramot, s további részletes elemzésük nélkül megjelöltek három ismeretlen csúcsot [107],
20
4. megjegyezték, hogy FMOC-Cl alkalmazása esetén sok ismeretlen csúcs eluálódik a poliaminok tartományában [92]. Kísérletes munkám során – jóllehet HPLC tisztaságú vegyszereket és hidrogénperoxiddal tisztított edényeket használtam - számos, az egyes aminosavakkal együttesen eluálódó szennyező csúcsokat mértem. Megállapítható, hogy a mérések hiteles értékelésének és az eredmények reprodukálhatóságának érdekében a szennyező csúcsok mennyiségi ismerete alapvetően nélkülözhetetlen.
d) Az FMOC és az aminosavak reakciója Az irodalmi adatok e tekintetben a legkuszábbak: látszólag egymásnak ellentmondó szélsőséges reakciókörülményeket találunk (1. táblázat). Az irodalmi feltételeket elemezve az alábbi következtetéseket vonhatjuk le: 1. Az FMOC koncentrációt a reakcióközegre vonatkoztatva, mM-ban fejeztem ki, hogy a reakciókörülmények összehasonlíthatóak legyenek. Irodalmi adatok alapján 0,5 mM [88] az alkalmazott legkisebb, és 8,0 mM [101,102] a legnagyobb reagens koncentráció. 2. Egyetlen tanulmányt kivéve, ahol az FMOC/aminosav mólaránya 1:1 [90], minden esetben kisebb-nagyobb feleslegben alkalmazták a reagenst. Kritikus pont a reakciókörülmények optimálási folyamatában, hogy mekkora a szükséges minimális mólfelesleg, ahol a reakció kvantitatív. 3. A kvantitatív származékképzéshez szélsőséges, 30 mp [85] és 40 perc [104] közötti reakcióidőket javasolnak. Az irodalmi adatokat tanulmányozva kitűnt, hogy az idő megválasztása kritikus az Asp, a Glu, az Asn, a Gln, a Ser, és a Thr esetében. Leglassúbb a reakciója a dikarbonsav aminosavaknak, az Asp-nak és a Glu-nak [88,89]. Az
irodalomban
javasolt
tisztázatlan,
szélsőséges
reakciókörülmények
tették
szükségessé a kvantitatív származékképzés eléréséhez a minimális FMOC/aminosav mólarány, az FMOC reagens koncentráció és a szükséges reakcióidő optimálását.
21
e) Az FMOC feleslegének elvétele Az FMOC-OH folyamatos képződését elkerülendő az aminosavak kvantitatív származékképzése után a reagens feleslegének eltávolítása előnyös. Erre a célra kétféle javaslatot ismerünk: 1. az FMOC-ot szerves oldószerbe extraháljuk [85,87,93,94], vagy 2. az FMOC feleslegét aminocsoportúakkal [88,89,91] elvesszük (1. táblázat). 1. Az extrakcióhoz szerves oldószerként pentánt [85,93,96-100,104], pentán/etilacetát elegyét [93], hexánt [87], vagy heptánt [94] alkalmaztak. Az extrakció hátránya, hogy az aminosav-származékok csak veszteséggel jutnak a szerves fázisba, különösen a két FMOC csoportúak [85]. A hiány aceton tartalmú reakcióelegyből származékkészítés után nagyobb, mint ACN tartalmúból [85]. Továbbá minél nagyobb az extrakciós oldat polaritása, annál nagyobb a veszteség (dietil-éter esetében 25%) [85]. Pentánt alkalmazva a ≤20 pmól/ aminosav/ injektált mennyiség esetén a His, az Orn és a Lys 50-75%-a elvész [113]. Miller a pentán/etil-acetát = 9:1 térfogatarányú eleggyel javasolta az extrakciót, ilyenkor nincs mérhető veszteség, jóllehet az FMOC-OH mennyiségét nem sikerült jelentős mértékben csökkenteni [93]. 2. Az FMOC felesleg eltávolítására aminocsoportúakat: 1-aminoadamantánt (ADAM)
[88,100,103,106,107],
NaOH-ban
oldott
NH2OH-t
[89,101,102,105,108] és heptilamint (HEPA) [91]; ciszteinsavat [90] vagy tömény sósavat [92,109] használtak. A sósav kivételével reakciótermékeik a kromatogramon
zavaró
csúcsokként
eluálódnak
[88-91].
Betnér
-
összehasonlító tanulmánya alapján - az FMOC feleslegének elvételére az ADAM-t javasolja: az FMOC-származéka stabil, a reakció során más melléktermék nem keletkezik, és borát pufferben jól oldódik [113]. f) A His és a Tyr kérdése A His és a Tyr két FMOC-cal is reagálhat. Az első FMOC a primer amino csoporttal: NFMOC-hisztidin (His-1) és N-FMOC-tirozin (Tyr-1), míg a második a His esetében az oldallánci imidazol csoport N-jével: N,NH-(FMOC)2-hisztidin (His-2) és a Tyr esetében az oldallánc aromás hidroxil csoportjával: N,O-(FMOC)2-tirozin (Tyr-2) reagál [86].
22
Következésképpen a két aminosavnak négy formája lehet, melyek négy csúccsal eluálódhatnak [88,89,100,104]. Elválasztásukat a többi aminosav-származékkal mind pmól- (21 FMOC-származék, azaz 19+2 csúcs [88]), mind nmól tartományban (22 FMOC-származék, azaz 20+2 csúcs [100]) bemutatták, képződésük és átalakulásuk folyamatait nem elemezték [88,100]. Két részletesebb tanulmány készült a His és a Tyr mono- és di-származékainak képződéséről és átalakulásáról [89,104]. 1. Ha az FMOC feleslegét pH 10 és 12 értékű oldatokban NaOH és hidroxilamin elegyével reagáltatjuk, 1 perc reakcióidő letelte után a di-származékok hidrolizálnak, a fő termékek a mono-származékok [89]. - A His-1 2,5-szer nagyobb válaszjelű csúcsot adott, mint a His-2; a Tyr-1 2,3-szor nagyobbat, mint a Tyr-2. Látható, hogy Haynes [89] elképzelése a magasabb pH értéket illetően nem valósult meg, miszerint pH 10 és 12 közötti oldatokban a His-2 és a Tyr-2 mennyiségileg visszaalakult volna His-1-gyé és Tyr-1-gyé. Továbbá ezen a pH értéken a többi FMOC-aminosavnak mintegy 25%-a bomlik [89]. 2. Bank [104] a származékképzést pH 8,0 és 11,4 értékű pufferben, mindkét esetben 2 és 40 perc reakcióidő után vizsgálta.
A His esetében pH 8,0 értékű puffert alkalmazva mind 2, mind 40 perc után a His-2 válaszjele a domináns. 2 perc után a His-1 csupán a huszada lehet a His-2 területének, míg 40 perc után a mono-származék csúcsa nem mérhető. pH 11,4 értékű puffer esetében 2 és 40 perc után a His-1 és a His-2 területének összege közel egyenlő. A területarányuk idővel nő: His1/His-2 = 1:1 (2 perc) és His-1/His-2 = 8:1 (40 perc).
A Tyr esetében pH 8,0 értékű puffert alkalmazva 2 perc után nagyobb a Tyr-1 területaránya: Tyr-1/Tyr-2 = 2:1; 40 perc után a Tyr-2 válaszjele a jelentős: Tyr-1/Tyr-2 = 1:4. pH 11,4 értékű puffer esetében mind 2, mind 40 perc után a Tyr egy csúcsként, Tyr-2-ként eluálódik [104].
23
g) A származékok stabilitása Az irodalmi adatok egyöntetűen azt mutatják, hogy az FMOC-származékok, a His-2-t kivéve, szobahőfokon-hűtőszekrényben (4ºC), világosban-sötétben 13 napig stabilak. A His-2 bomlási félideje: szobahőfokon 5-6 nap, hűtőszekrényben 4 hét (aceton/víz = 1:1 térfogatarányú, pH 7,7 értékű borát puffer elegyében). A fény nem katalizálja a bomlást [85].
2.3 Az aminosavak meghatározása a vékonyréteg kromatográfia (Thin Layer Chromatography, TLC) felhasználásával
Minőségi vagy fél-kvantitatív meghatározásra ma is széleskörben alkalmazzák a TLC-t, mind a szabad- [114,115], mind az aminosav-származékok [116-119] elválasztására. Az első esetben az egy- [120], vagy kétdimenziós [121] kromatográfiás fejlesztést a ninhidrin reagenssel festési eljárás követi [2] (2.2.1 fejezetben részletezett). A módszer előnye, hogy egyszerre nagyszámú minta és modell oldat futtatható azonos körülmények között, csökkentve az elemzések idejét és költségeit egyaránt. Sokösszetevőjű minták elemzésében [118,119] a TLC és a nagyhatékonyságú vékonyréteg kromatográfia (High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC) jelentősége másodrendű. Elfogadható elválasztások megvalósításában sem a különleges állófázisok [122,123], sem a különböző származékképzési reakciók [116-119] alkalmazása nem hozott megoldást.
2.4 Az aminosavak meghatározása a kapilláris elektroforézis (Capillary Electrophoresis, CE) felhasználásával
A CE különösen hasznos biológiai eredetű minták elemzésében [124]. Az aminosavak elválasztását mind a kapilláris zónaelektroforézis (CZE), mind ennek micellás elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) változatát [125] alkalmazzák. A CZE esetében
24
mind származékképzés nélkül (15 aminosav, UV detektálás 185 nm-en) [126], mind különböző származékok [127-130] formájában elválasztották a vizsgált aminosavakat. A CE technikánál általában a kapillárison kivitelezett UV detektálást alkalmazzák. A hagyományos lézerindukált fluoreszcenciás detektor (LID) [129] érzékenysége tovább növelhető fény kibocsátó diódával (LED) [130], mely mind UV, mind látható fénytartományban működik. További előnye, hogy stabil és kedvező a költsége [2,131]. Az érzékenység MS detektorral is fokozható [131]: az aminosavakat 18-korona-6tetrakarbonsavval (18-C-6-TCA) alkotott komplex formában vizsgálták vörösvértestben [132]. Alkalmazásáról Morton részletes visszatekintő tanulmányt készített [133]. Jóllehet, származékképzés nélkül is meghatározhatóak CE-sel az aminosavak, a származékképzés nagy előnye, hogy ezáltal érzékenyebbé válik a módszer [2]. A HPLC meghatározásoknál már részletesen ismertetett származékképző szerek használata a CE technikában is elterjedtek, úgymint: a) az L-/D-Ser meghatározására OPA/MCE reagenst és 2-hidroxipropil-γciklodextrint, mint királis szelektort alkalmaztak UV detektálással [127]; b) 6 pár L-/D-aminosav DANSYL-származékkénti elválasztását mono-6-Nalkilammónium-6-dezoxi-ß-CD-klorid
királis
szelektor
segítségével
UV
detektálás követte [128]; c) 18 FMOC-aminosav származékot választottak el LID detektor alkalmazásával [129]; d) mintegy 17 fluoreszcein-izotiocianát (FITC) aminosav elválasztását optimálták az elektrolit rendszerhez adagolt szerves módosítok segítségével, LED detektálást alkalmazva [130]; e) 13
aminosavat
választottak
el
naftalin-2,3-dikarbaldehid
(NDA)
származékokként nátrium-dodecil-szulfát (SDS), mint felületaktív anyag, segítségével (MEKC), LED detektort használtak [125]. Összefoglalóan elmondhatjuk, hogy a CE technikában még sok kérdést kell megoldani, úgymint: 1) a származékképzés helyének optimálása (kapilláris előtt, kapilláris után, vagy közvetlenül a kapillárison történjen); 2) a mennyiségi értékelés és a migrációs idők reprodukálhatóságának javítása; 3) az elválasztandó aminosav összetevők számának növelése;
25
4) a nagyszámú, kísérleti állapotú technika gyakorlati hasznosítása, valamint széleskörű felhasználása a mindennapos analitikai feladatok megoldására. Királis elválasztásoknál előszeretettel használják a CE technikát mind direkt, mind indirekt formában. A direkt elválasztásoknál királis szelektor vegyületeket alkalmaznak [134-137],
míg
az
származékképzéssel,
indirekt melyeket
módszernél akirális
diasztereomer
körülmények
között
párokat
képeznek
kromatografálnak
[135,138,139].
2.5 Az aminosavak meghatározása a mágneses magrezonancia spektroszkópia (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) felhasználásával
Az elmúlt években több módszert dolgoztak ki az aminosavak NMR meghatározására [140-143]. A módszer előnye, hogy egy minta összes proton tartalmú összetevőjét egyidejűleg detektálni lehet [2]. Különböző biológiai minták aminosav tartalmát kvantitatívan meghatározták mind 1H NMR technikával: sörben [141], ecetben [140], szérumban [142]; mind szimultán
13
C NMR és
1
H NMR csatornán patkány
agyszövetében [143]. A fiziológiás oldatok direkt analizálhatóak [2,140-142], és az érzékenysége nem függ a fizikai-kémiai jellemzőktől, mint a hidrofobicitás, a pK érték [2]. További előnye, hogy az összetevők elválasztás nélkül meghatározhatóak. Az eredmények reprodukálhatóak. Az NMR hátránya, hogy a módszer nem érzékeny és hosszú a mérési idő [2].
26
2.6 A plazma szabad aminosav (Plasma Free Amino Acid, PFAA) tartalmának meghatározása
A plazma szabad aminosav tartalmának meghatározására a HPLC területén alkalmazott különböző származékképzési és fehérjementesítési eljárásokat mutatom be. Kitérek a meghatározás jelentőségére, a daganatos betegek aminosav anyagcseréjének változására.
2.6.1 A PFAA mérése HPLC módszerrel, oszlop előtti származékképzéssel
Az aminosavak HPLC elemzése körében az oszlop előtti származékképzés a legelterjedtebb, a 2.2.5 fejezetben részletezett. A 2. táblázat az elmúlt tíz évben (1999. és 2009. március között) a plazma szabad aminosav meghatározására használt származékképző szereket és az alkalmazott fehérjementesítő vegyületeket foglalja össze, mely szerint: a) Előnyben részesítik az OPA+tiol reagenst (59%-a az összes PFAA elemzésekor alkalmazott származékképző szereknek), ezt követi az FMOC-Cl (14%). b) Fehérjementesítő vegyületként szerves- (SSA, TCA) és szervetlen (HClO4, HCl) savakat, valamint semleges szerves oldószereket (ACN, MeOH, EtOH) használtak közel egyenlő megoszlásban. A fehérjét vegyszer nélkül, molekulasúly szerinti szeparáció elve alapján is leválasztották a plazmától.
27
2. táblázat: A plazma szabad aminosav tartalmának mérése HPLC módszerrel, oszlop előtti származékképzéssel (1999-2009. március)
Fehérjementesítő szer/p, (v/v)
Származékképző szer
Kísérlet tárgya: mért As
No/ perc
RSD%; Hiv. vny
ACN/p=1:1
FMOC, pentán kirázás
kérődző: Pip, Lys
20/40
0,84; [144] 97,5±1,3
0,1M HCl/ p=3,3:1
PITC
30 g/v% SSA/ p=1:10
OPA/ MPA
jéghideg MeOH/ p=4:1 centr. szűrés* (5000 Da, 5000xg), 120 perc
OPA/ MCE OPA/ MPA
MeOH/p= 4:1
OPA/ MCE
SSA/p=11:1
OPA/ MCE
jéghideg MeOH/ p=4:1
(I) OPA/ jodoacetát (II) DNFB
10% TCA/p=1:1
SBD-F
60% HClO4/ p=1:10
DVS
ACN/p= 1:1,5
OPA/ MPA
10% TCA/ p=5:1
FMOC
jéghideg EtOH/ p=1:1 centr. szűrés (20800xg), 15 perc, 10ºC MeOH/p= 3:1 2,0 M HClO4/ p=3:10
OPA/ MPA OPA/ MPA + FMOC OPA/ IBC
juharfaszörp-betegség: -/Val, Ile, Leu piridoxin és folsav hatása: Met, Glu, Cys, Hcy, Tau, 16/10 Ser, Gly Nephros Norvegicus, 12/parazita fertőzés: PFAA izomfehérje szintézis stimulálás: EAs/NEAs
19/-
-
[145]
-
[146]
-
[147]
-
[148]
KV: Hcy, Cys, Glu, Asp, 7/30 2,6-5,8; - [149] Asn, Ser, Gln patkány, hiperleucinémia: Ser, His, Ala, Tyr, Met, 18/45 [150] Val, Phe, Ile, Leu veleszületett metabolikus 22/45 -; 97-101 [151] rendellenesség: PFAA enzimműködés: GSH, Cys, 3/- -; 101±9,6 [152] CysGly aromás-,elágazó szénláncú -; 95,115/15 [45] As 102 izomfehérje szintézis: EAs, -/[153] NEAs plazma fehérje pontosság: 1/30 [154] hidrolizátum: CML ≤10% p: Arg és metabolitjai módszerkidolgozás, összehasonlítás (IEC): PFAA glutamáterg rendszer: L-,D-Ser, Glu, Gln, Gly
9/35 24/18 5/35
r=0,99
[155]
pontosság: [156] ≤10% r>0,99
[157]
FMOC; 40°C; módszerkidolgozás: PFAA 27/43 0,4-7,6; - [109] ccHCl
28
2. táblázat (folytatás): A plazma szabad aminosav tartalmának mérése HPLC módszerrel, oszlop előtti származékképzéssel (1999-2009. március) Fehérjementesítő szer/p, (v/v)
Származékképzőszer
Kísérlet tárgya: mért As
No/ perc
6% SSA/p=1:1
OPA/ MPA
placentán keresztüli As csere vizsgálata: PFAA
-/-
0,5 M HClO4/ p=1:1
OPA/ MPA
1M HClO4/ p=1:1
OPA/ MPA
jéghideg 5% HClO4/p=1:1
BCEOC
ACN/p=1:1,5
OPA/ MPA
módszerkidolgozás: PFAA 22/35
RSD%; Hiv. vny 2-5;-
[158]
5,2; 91-108
[159]
gyógyszer hatása, 14/[160] ráktípusok szerint: PFAA módszerkidolgozás, 0,9995≤r≤ 20/65 [161] patkány: PFAA 0,9999 1 óra stressz hatása: Leu, 4/[162] Ile, Val, Gln
Jelölések: mint 1. táblázatban, továbbá p=plazma; SSA=szulfoszalicilsav; *=molekulatömeg szeparáció elve szerinti fehérjementesítés; TCA=triklórecetsav; DNFB=dinitro-fluoro-benzén; SBD-F=ammónium-7-fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4szulfonát; IBC=N-izobutiril-l-cisztein; BCEOC=1,2-benzo-3,4-dihidrokarbazol-9-etilkloroformát; As=aminosav; EAs=esszenciális aminosavak; NEAs=nemesszenciális aminosavak; KV=kardiovaszkuláris betegek; GSH=glutation; BCAA=elágazó szénláncú aminosavak; CML=NΣ-karboxi-metil-lizin; -=nincs adat; r=regressziós koefficiens; vny=visszanyerhetőség, %; Hiv.=hivatkozás.
2.6.2 Egyidejű fehérjementesítés és származékképzés
Az irodalmi adatok, melyek a plazma szabad aminosav szintjének meghatározására javasolnak módszereket, a fehérjementesítést és a származékképzést elkülönítik. Egylépéses eljárást nem alkalmaztak. Becslésem szerint az esetemben a két lépés kombinálása kézenfekvő volt annak ismeretében, hogy a) a rendszerint használt fehérjementesítő vegyület az ACN; (hígított) plazma/ACN = 1:1 (v/v) arányban alkalmazott [144,163-165], ez a minimális aránya az ACNnek, mely szükséges a fehérjék kicsapásához [164]; b) az aminosavak az FMOC-cal adott arányú reakcióelegyben [víz/szerves = 1:1 (v/v); 2.2.5.6. b fejezetben részletezett] reagálnak; c) az FMOC reagens oldószere ACN [110].
29
A szimultán módszert különböző biológiai mátrixok előkészítésének leegyszerűsítésére már alkalmazták, úgymint: 1) Amfetamint határoztak meg HPLC analízissel humán vizeletben acetonDANSYL-Cl oldat direkt hozzáadását követően [166]. 2) GC-MS-sel formiátot és acetátot mértek vérben, ezeket pentafluorobenzilbromiddal alkilezték aceton és foszfát puffer elegyében [167]. 3) Ecetsavanhidriddel szimultán fehérjementesítettek és származékképeztek plazma metformin tartalmának HPLC analíziséhez [168]. 4) Szintén humán plazmában mérték meg a ketontest szintet p-nitrofenildiazónium-származék formájában, szimultán szűrve a kicsapódott fehérjét és a reagensfelesleget [169].
2.6.3 A daganatos betegek aminosav anyagcseréjének változása
A tumor-diagnosztizált betegek esetében az aminosav metabolizmus, következésképpen a plazma aminosav profilja eltér az egészséges egyedekétől [170]. A daganatos betegek szervezetében az alábbi anyagcsere-folyamatok változnak: a) az elégtelen táplálkozás következtében az aminosavbevitel csökken; b) a májban megnövekszik a glukoneogenezis, az aminosavakat glükózzá alakító folyamat; c) intenzívebb a máj protein szintézise; d) csökken az izomfehérje szintézise, ezzel egyidejűleg fokozódik a lebontása; e) megnövekszik a teljes test aminosav forgalma és -szintézise [171-173]. Következésképpen a PFAA forgalma is nagyobb rákos betegekben egészséges egyedekével összehasonlítva [174]. Az intenzíven osztódó sejtek nagy mennyiségű saját fehérjét szintetizálnak, aminosav- és energia felhasználásuk folyamatosan nő. Normál sejtekben a fő aminosav- és energiaforrás a citromsavciklus (8. ábra), mely az akut oxigénhiány következtében a tumorsejtekben csökkent intenzitású normál sejtekével összehasonlítva.
30
Trp*
Phe* Cys
Leu
Ile*
Lys Tyr*
Ala Gly
Asn
Ser
Asp
piruvát
oxálacetát citrátkör
Phe*
Trp*
acetoacetil-CoA
acetil-CoA
Tyr*
α-ketoglutarát
Glu
fumarát Pro His Arg szukcinil-CoA
metil-malonil-CoA
Val
Met
Thr
Ile*
8. ábra: Az aminosavak belépése a citromsavciklusba [175] A hiányzó nemesszenciális- és esszenciális aminosavakat a vérből veszik fel. Az agresszív tumor ektópiás hormonok és mediátorok közvetítésével a gazda szervezet sejtjeit saját energiaforrásának biztosítására és építő anyagainak termelésére kényszeríti, aminosavakat von el a szervezet többi részéről [174,176]: 1) A máj a vérből Ala-t és Gly-t vesz fel, melyek a fokozott glukoneogenezis fő szubsztrátjai [170]. A folyamat terméke, a glükóz, a tumor intenzíven növekvő energiaigényét nem tudja kielégíteni. 2) A további energiaforrást a szervezet saját vázizomzat fehérjéinek lebontásából származó elágazó szénláncú aminosavai biztosítják, melyek a vérbe áramlanak [172]. A tumor növekedése Gln-t, Asn-t, Gly-t és Asp-t igényel a purin- és pirimidin termeléshez; Ser-t a membrán lipid komponensének szintéziséhez [177]. Gln-t és Asn-t nem tud a daganatos sejt szintetizálni, így ezek teljes mennyiségét a gazdaszervezet biztosítja számára [170,172,176].
31
Gln
3) Az ureaciklusban az argináz enzim és a NO szintáz enzim aktivitása nő, melyek az Arg-t alakítják át rendre Orn-né és ureává, valamint Cit-ná és NO-dá, következésképpen az Arg koncentrációja a plazmában csökken. Az Orn fontos metabolitja a Glu-, a Pro és egyes poliaminok bioszintézisének [178,179]. 4) A Cys a glutátion prekurzora, mely intracelluláris antioxidáns, fontos detoxikáló ágens karcinogenezisben. Gyorsítja a nehézfémek, metabolitok és egyéb karcinogén anyagok kiürülését. A folyamat során a Cys-ből Met keletkezik hCys intermedieren keresztül [155]. Tehát az (1-4) pontok alapján látható, hogy a tumormassza intenzív növekedése felborítja a teljes test aminosav forgalmát. Felmerül a kérdés, vajon létezik-e rákspecifikus aminosav, melynek plazma szintje szignifikánsan változik. Jelentősége – természetesen több esetszámra kiterjesztett kutatások eredményeképpen – a klinikai diagnosztikában lehet.
32
3. Célkitűzések Célom az irodalmi adatok alapján egymásnak ellentmondó reakciókörülmények tisztázása. Az FMOC és az aminosavak reakcióját optimálom: a) az alkalmazott borát puffer pH értékének (pH 8, 9, 10), b) az FMOC reagens oldószerének (aceton, ACN) és c) az FMOC koncentrációjának (0,25 - 5 mM) függvényében. d) Vizsgálom az [FMOC]/[aminosav]T mólarány hatását, és meghatározom e) a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt. f) Figyelembe
veszem
a
szennyező
csúcsok
és
az
FMOC-OH
reakciókörülményektől függő mennyiségét. g) Tanulmányozom a két csúccsal eluálódó aminosav-származékok (His-1, His-2 és Tyr-1, Tyr-2) keletkezését és mennyiségi meghatározásuk lehetőségeit. A kidolgozott módszert a gyakorlatban alkalmazom: plazma minták szabad aminosav koncentrációját határozom meg.
33
4. Kísérleti rész
4.1 Vegyszerek Az FMOC-Cl, az aminosavak, az ADAM, a HEPA, a HPLC tisztaságú ACN, metanol, aceton és tetrahidrofurán (THF) részben a Sigma (St. Louis, MO, USA), részben a Serva (Heidelberg, Németország) termékei voltak. Valamennyi használt vegyszer az analitikailag legtisztább minőségű volt. A vízmentes nátrium-acetát, a bórsav, a káliumklorid, a kálium-hidroxid, a nátrium-hidroxid és a sósav a Reanal termékei (Budapest, Magyarország).
4.2 A minták A szérum mintákat az Országos Onkológiai Intézettől kaptam. A vért mellrákban szenvedő, 55-65 év közötti, posztmenopauzás nőbetegektől vették le közvetlenül a műtét előtt és a műtét után 3 héttel. A betegek onkológiai kezelést nem kaptak. A vérmintát centrifugálták (4000 rpm, 4ºC, 10 perc), a felülúszót mélyhűtőben tároltuk. A mintákat felolvasztás után közvetlenül használtam.
4.3 A modell oldatok Az aminosavak analitikai pontossággal mért, 0,03 M koncentrációjú, 0,1 M sósavval készült oldatait hűtőszekrényben (4ºC) tároltam, és használat előtt desztillált vízzel hígítottam.
4.4 A puffer oldatok A borát pufferek 25 ml, a bórsavra és a kálium-kloridra egyaránt 0,8 M tartalmú oldat és 0,8 M nátrium-hidroxid elegyítésével készültek. Az oldatok pH értékeit a 0,8 M nátrium-hidroxid oldattal pH 8,00-, pH 9,00- vagy pH 10,00 értékekre állítottam, majd desztillált vízzel 50 ml térfogatra egészítettem (a továbbiakban 0,4 M borát puffer).
34
4.5 A reagens oldatok Az FMOC oldat: az analitikai pontossággal mért, 0,026 g FMOC-Cl-ot 5,0 ml ACNben, vagy acetonban oldottam (20 mM), s használat előtt hígítottam. Az ADAM oldat: a 0,06 g, analitikai pontossággal mért, ADAM.HCl-ot az ACN/0,2 M sósav = 1:1 térfogatarányú elegye 5,0 ml-ében oldottam (80 mM), s a továbbiakban nem hígítottam. A HEPA oldat: a 0,058 g, analitikai pontossággal mért heptilamint desztillált vízben oldottam (100 mM), s a továbbiakban nem hígítottam. . 4.6 Származékképzés 4.6.1 A reagens oldatok jellemzése Műveleti üres felvételeket a reagens oldatokkal naponta legalább kétszer készítettem. (Az automata mintaadagolót +20ºC hőfokra termosztáltam.)
4.6.2 Optimális származékképzés és fehérjementesítés Modell oldat esetén a származékképzést az optimális feltételek szerint végeztem: 1 ml térfogatú automata mintaadagoló ampullába (Waters, Milford, MA, USA) rendre 150 µl aminosav oldatot (5,4x10-8 mól aminosav desztillált vízben), 150 µl borát puffert (0,4 M, pH 9), 300 µl FMOC reagenst (ACN-ben vagy acetonban oldva) elegyítettem (3x10-7 mól, FMOC [FMOC]/[aminosav]T = 5,5:1). A reakciót 20 perc elteltével 50 µl ADAMvagy HEPA oldattal állítottam meg. Plazma minták esetében mindenben a fentiek szerint jártam el azzal a különbséggel, hogy: -
a plazma minta különböző hígításait (7,5x, 15x, 30x) használtam;
-
a plazma mintát hozzáadott aminosav standarddal (szabad aminosav tartalom ≤ 4x10-8 mól) vagy anélkül mértem;
-
az FMOC mennyisége a reakcióelegyben 1,8 mól volt ([FMOC]/[aminosav]T = 47:1);
35
-
a reakcióelegyet a centrifuga szűrőre (cellulóz membrán, 850 μl, pórusátmérő 0,45 μm; W. R. Grace & Co, Deerfield, Conn. USA) juttattam, és centrifugáltam (5000 rpm, 10 perc; Zuglói Gépgyár, Budapest, Magyarország). Ezután a fehérjementes
aminosav-származékokat
tartalmazó
mintát
az
automata
mintaadagoló ampullájába juttattam. A modell vizsgálatokat eltérő reakciókörülmények között, minden esetben azonos térfogatú reakcióelegyekben készítettem, melyek az egyes fejezetekben részletezettek.
4.7 Kromatográfiás körülmények Waters HPLC rendszert (Waters Pharmaceutical Division, Milford, MA, USA) használtam, amely a Waters 996 fotódiódasoros (DAD)- és a Waters 474 fluoreszcenciás
(FL)
pumparendszerből
detektorokból,
(szabályozható
a
hőfokú
Waters
600
vezérlő
kolonnatartóval),
„négyfejes”
Waters
717plus
termosztálható automata mintaadagolóból áll. A számítógép program a Millennium 2.10 (1992-95) volt. A DAD és FL detektorokat a felsorolási rendben, egyidejűleg használtam. A műveleti üres- és az aminosav-származékok mérései 190 és 400 nm közötti felvételek voltak (DAD). A DAD kromatogramokat 262 nm-en értékeltem. A FL
felvételeket
az
optimális
excitáció/emisszió
hullámhosszakon
készítettem
(λEx/Em=254/313 nm). Az oszlopok: (I) Hypersil-120 ODS (5 μm, 150 x 4,6 mm; BST, Budapest, Magyarország) és (II) Thermo Hypersil-100 ODS (5 μm, 150 x 4,6 mm; Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA) voltak. Az előtét oszlopok Hypersil ODS töltetet tartalmaztak (5 μm, 30 x 4,6 mm; BST, Budapest, Magyarország). Három eluensrendszert használtam, az elúciót 50ºC hőfokon végeztem, grádiens módban [3-5. táblázatok, a nátrium-acetát oldat és a desztillált víz szűrt (0,7 μm); az eluensek levegőmentesítése He-mal biztosított].
36
3. táblázat: Az optimális grádiens 22 aminosav elválasztására (tartalmazza a His-1, His-2, Tyr-1, Tyr-2 származékokat is) az (I) oszlopon, melynek hőfoka: 50C Áramlási Idő, sebesség, perc ml/perc 1,5 0 1,5 2 1,0 14 1,0 23 1,5 28 1,5 29 1,5 34 1,5 35 1,5 40
4. táblázat: Az optimális grádiens a His-1, His-2, Tyr-1, Tyr-2 elválasztására az (I) oszlopon, az áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, az oszlop hőfoka: 50C
Eluens,% A 70 63 27 0 0 0 0 70 70
B
Idő, Eluens,% perc A B
C
30 0 37 0 73 0 100 0 100 0 0 100 0 100 30 0 30 0
0 2,5 6,6 8,2 8,3 8,4 10 10,1 20 21,5 24 26 31
Eluensek A: 0,05 M nátrium acetát oldat, pH 7,20; B: 0,10 M nátrium acetát oldat/ ACN = 23:22 (v/v), pH 7,20; C: ACN
100 100 93 93 86 79 79 83 50 0 0 100 100
0 0 7 7 14 21 21 17 50 100 100 0 0
Eluensek A: 0,1 M nátrium acetát/THF/ACN = 15:3:2 (v/v), pH 4,40; B: ACN/THF = 17:3 (v/v)
37
5. táblázat: Az optimális grádiens 22 aminosav elválasztására a (II) oszlopon, melynek hőfoka: 50C Áramlási sebesség, ml/perc 1,5 1,5 1,0 1,0 1,0 0,8 0,8 0,8 1,5 1,5 1,8 1,8 1,5
Eluens, %
Idő, perc
A
B
0 2 15 19 25 25,1 26 37 38 43 44 50 50,1
70 63 50 38 0 0 0 0 0 0 70 70 70
30 0 0 37 0 0 50 0 0 62 0 0 0 100 0 0 100 0 0 100 0 0 14 86 0 0 100 0 0 100 30 0 0 30 0 0 30 0 0
C
D
Eluensek A: 0,05 M nátrium acetát, pH 7,20; B: 0,1 M nátrium acetát/ACN = 23:22 (v/v), pH 7,20; C: 0,1 M nátrium acetát/ACN/THF = 23:11:11 (v/v), pH 7,20; D: ACN/desztillált víz = 80:20 (v/v)
4.8 A pH-mérő készülék Az oldatok pH értékét Radelkis OP-208/1-es típusú precíziós pH-mérővel állítottam be. 2 pontos kalibrációt végeztem: K-91 (pH 9,28) és K-21 (pH 2,06) jelzésű kiforralt desztillált vízzel megfelelően hígított Radelkis puffer koncentrátummal; naponta ellenőriztem K-71 (pH 7,03) jelzésűvel.
38
5. Kísérleti eredmények és következtetések
5.1 Az aminosavak és az FMOC reakciójának tanulmánya és az abból eredő következtetések
Ebben a fejezetben a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt elemzem az FMOC koncentrációjának (0,25 – 5 mM), az [FMOC]/[aminosav]T mólarányának, a puffer pH értékének (pH 8, 9, 10), valamint a reagens oldószerének (ACN, aceton) függvényében, az FMOC hidrolízisének és a szennyező csúcsok nagyságának figyelembevételével. Részletesen kitérek a két csúccsal eluálódó aminosavak, a His és a Tyr származékainak jellemzésére.
5.1.1 Az FMOC-aminosavak és a műveleti üres szennyezői
Grádienst (3. táblázat) dolgoztam ki a 22 FMOC-aminosav elválasztására (5.2 fejezetben részletezett), optimális körülmények közötti származékkészítést követően (4.6.2 fejezet), különös tekintettel a His-2, a Tyr-1 és a Tyr-2 elválasztására a szomszédjaiktól (megjegyzés: a His-1 mennyiségileg átalakult His-2-vé, a retenciós idejét feltüntettem; 9. ábra, 5.1.9 fejezetben részletezett). A szennyező csúcsokkal együttesen eluálódó FMOC-aminosavak csillaggal jelöltek, szaggatott vonallal ábrázoltam a műveleti üres kromatogramot (a szennyező csúcsok mennyiségi tanulmánya az 5.1.3 fejezetben részletezett).
39
Lys*
Orn*
Phe Ile* Leu* Trp
Val* Met
Tyr-2
10
Pro*
5
(Cys)2
0,1
Tyr-1*
0,2
Asn* Gln
0,3
His-1
Hyp
Ser*
0,4
Ala*
Gly* Thr Arg*
0,5
Asp* Glu*
Fluoreszcenciás intenzitás
0,6
FMOC-ADAM
FMOC-OH
FMOC-aminosavak mûveleti üres
His-2
0,7
0,0 0
15
20
25
30
35
40
tR, perc
9. ábra: Az FMOC-aminosavak kromatogramja (folyamatos vonal) a műveleti üressel (szaggatott vonal) (I) oszlopon FL detektálás alapján; az FMOC-aminosavak optimális körülmények között készültek (pH 9, ACN tartalmú 0,5 mM FMOC reagens, 20 perc); grádiens elúció: 3. táblázat szerint (Megjegyzés: a csillaggal jelölt aminosavak a műveleti üres szennyezőivel együttesen eluálódnak.)
40
5.1.2 A pH változás értékelése
Mielőtt részletes elemzésbe merülnénk, fontos kitérnünk a pH változás jelenségére, megkülönböztetni a puffer-, a látszólagos- és a reakcióelegy-, a valódi pH érték fogalmát. A pH érték változásáról és hatásáról irodalmi adatot nem találtam. Mit jelent ez? A puffer pH értékének (pH 8 és 9) és az alkalmazott reagens oldószerének (ACN és aceton) függvényében jóllehet különböző mértékben, de a reakcióelegy pH értéke nő. Következésképpen az aminosavak és az FMOC a valódi pH értékén reagálnak egymással. Az FMOC feleslegének elvétele előtt megmértem a reakcióelegy pH értékét különböző körülmények között: rögtön elegyítés után, majd 40 perccel elegyítés után, mind az aminosav standardot tartalmazó elegy, mind a műveleti üres esetében (6 táblázat). A mért pH értékek reprodukálhatóak: ≤0,54% RSD.
6. táblázat: A látszólagos (a puffer) és a valódi (a reakcióelegy) pH értékeinek, valamint a két érték különbségének nyomon követése a puffer oldat és a reakcióelegy oldószer tartalma függvényében Puffer pH értéke 8,0 9,0
FMOC reagens oldószere aceton acetonitril aceton acetonitril
Reakcióelegy pH értéke* 10,1 9,8 10,8 10,6
pH érték növekedése 2,1 1,8 1,8 1,6
RSD %* 0,46 0,43 0,54 0,43
Jelölések: *=az egyes elegyek pH értékeinek átlagai (legkevesebb három párhuzamos mérés alapján, mind a műveleti üresé, mind az aminosavak származékképzési közegé, elegyítés után azonnal, illetve 40 perc eltelte után; ez összesen 12 mérés átlagát jelenti ugyanazon a napon kivitelezve); az FMOC reagens koncentrációja 0,5 mM a reakcióelegy össztérfogatára vonatkoztatva. Ezen eredmények alapján azt találtam, hogy: a) minél alacsonyabb a látszólagos pH érték, annál nagyobb a pH növekmény; b) aceton hatására 0,2 - 0,3 egységgel nagyobb mértékben változik a pH érték (pH 8: 2,1 és pH 9: 1,8 egység), ACN tartalmúval összehasonlítva (pH 8: 1,8 és pH 9: 1,6 egység).
41
Nem tapasztaltam különbséget a műveleti üres, valamint az aminosav standardot tartalmazó reakcióelegy pH értékében, és a tekintetben sem, hogy elegyítés után azonnal, vagy 40 perccel utána mértem meg.
5.1.3 A műveleti üres szennyezőinek értékelése
Az irodalmi adatokat elemezve kitűnik, hogy 4 dolgozat kivételével, ezekben is az említés sorrendjében [92,104,106,107], a műveleti üres kérdését elhanyagolják (2.2.5.6 c fejezetben részletezett). A műveleti üres kromatogramon az FMOC-OH széles csúcsán kívül, az aminosavakkal együttesen egyéb, reagensből származó szennyező csúcsok eluálódnak (9. ábra). Munkamenetünk során meggyőződtünk arról, hogy amikor a vizsgált minta aminosav tartalmát állandó reagens koncentráció alkalmazásával, a pmól tartományban mérjük, a szennyező csúcsok mennyiségi ismerete elengedhetetlen. Következésképpen, a származékképzési optimálási folyamat során a különböző reakciókörülmények között az FMOC-aminosavakkal párhuzamosan műveleti üres kromatogramot vettem fel. Megmértem a szennyező csúcsok nagyságát az együttesen eluálódó aminosavak válaszjelével számítva, pmólban kifejezve: az alkalmazott puffer pH értékének (pH 8, pH 9), a reagens oldószerének (ACN, aceton) és koncentrációjának (0,5 mM – 5 mM) függvényében a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőben, mind UV, mind FL detektálás esetén (7. táblázat).
42
7. táblázat: A műveleti üres szennyezőinek válaszjelei, az adott üres csúccsal együttesen eluálódó aminosav válaszjelével számolva, pmólban kifejezve, a pH érték és az FMOC reagens oldószerének (aceton, ACN) függvényében (egy adott feltételnél a kvantitatív reakcióhoz szükséges időben) [FMOC] mM 0,5
As
tR, perc
4,67 Asp 5,58 Glu 8,98 Hyp 9,67 Asn Gln 10,17 Ser 10,73 Gly 11,72 Arg 12,48 Ala 13,18 Pro 13,62 Tyr-1 14,52 Val 16,83 18,93 Ile Leu 19,33 Trp 19,92 Phe 20,23 F-OHUV 21,03 (Cys)2 22,70 Orn 27,22 Lys 27,65 Ü.cs.** 30,03 Ü.cs.T***
1,5
3 5 pH 8 pH 9 pH 9, ACN AC, 10 perc ACN, 30 perc AC, 5 perc ACN, 20 perc 5 perc 3 perc 1 perc UV FL UV FL UV FL UV FL FL pmól-ban kifejezve, az együttesen elulódó aminosavak válaszjeleiből számítva 0 1,58 0 0,93 0 0,91 0 0,66 1,17 1,37 4,04 0 0,67 0 0,59 0 0,32 0 0,22 0,61 0,64 1,40 1,93 0 1,89 0 2,23 0 2,66 0 0 0 0 0 0,45 0 0,45 0,50 0,25 0 0,17 0,15 0,32 0,94 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1,10 11,29 11,14 11,79 11,14 6,72 6,89 5,99 5,88 11,99 10,84 11,03 10,00 8,39 11,20 8,51 5,88 5,66 4,71 4,72 8,97 7,14 9,84 1,08 1,93 2,24 2,12 0,66 0,74 0,94 0,95 1,11 1,33 3,67 2,70 2,98 2,96 2,82 1,60 1,84 1,57 1,57 3,00 2,56 3,20 1,37 2,56 2,21 2,09 1,15 1,70 1,58 2,01 3,30 3,36 8,77 1,40 2,01 2,46 3,64 0,28 2,00 5,91 8,78 2,91 6,14 3,60 2,82 1,75 3,17 1,70 2,42 1,37 2,87 1,57 2,63 3,38 2,36 2,97 0,65 3,16 0,72 2,71 0,49 3,50 0,58 0,63 0,52 0,79 0,60 0,81 1,33 1,07 0,76 0,61 1,35 0,87 0,84 0,99 1,69 3,30 0 5,25 0 0,69 0 0,50 0 0 0 0 0,33 0,27 0,14 0,16 0 0 0 0 0 3,4×103 2,5×103 4,3×103 2,8×103 5,4×103 9,5×103 26×103 0,11 0 0,20 0 0,37 0 0,74 0 0 0 1,78 2,15 2,13 2,33 1,42 1,63 0,95 1,31 2,34 1,97 3,55 1,48 1,27 2,43 3,53 1,05 1,33 3,69 3,45 8,59 17,11 3,86 96,7 109,3 0 0 110,7 99,1 0 0 0 0 0 140 148 52,6 40,7 139 123 37,0 32,5 44,9 57,7 59,9
43
Jelölések: As=adott aminosavval együttesen eluálódó üres csúcsok; *= FMOC koncentráció a reakcióközeg össztérfogatára vonatkoztatva (600 µL); AC = aceton/víz=1:1 (v/v); ACN = acetonitril/víz=1:1 (v/v); F-OHUV = a reagens hidrolízistermékének mennyisége UV detektálással mérve, 262 nmen, a Phe válaszjeléből számolva (a fluoreszcenciás detektáláskor tapasztalt óriási csúcs kívül esik a csillapítási határon, ezért nem lehet kvantitatívan mérni); Ü.cs.**=üres csúcs az Orn válaszjelével számolva; T Ü.cs. ***=az üres csúcsok összege, kivéve az F-OHUV-t; tR=az adott aminosav retenciós ideje.
A 7. táblázat adatait az alábbiak szerint értékelem: a) A FL és UV detektálás során mért szennyező csúcsok intenzitása jóllehet, eltérő, de az összegük (az FMOC-OH-ot kivéve) szignifikánsan nem változik (utolsó sora a 7. táblázatnak). b) A pH 8 és 9 értékű puffer alkalmazása során mért szennyező csúcsok nagyságában
azonos
reakciókörülmények
között,
a
kvantitatív
származékképzéshez szükséges idő tekintetében számottevő különbség nem található. c) A legnagyobb különbség, ACN tartalmúval összehasonlítva, az aceton tartalmú reakcióelegy műveleti üres felvételében megjelenő aminosav nagyságú jelentős szennyező csúcs [tR = 30,03 perc, 96,7 – 110,7 pmól/ injektált térfogat a szomszédos (FMOC)2-Orn válaszjelével számolva (9. ábra, 7. táblázat, 185 integrátor egység (i.e.)/pmól)]. Ennek a szennyező csúcsnak a nagysága független volt az eltelt reakcióidőtől, a puffer pH értékétől, az alkalmazott detektálástól és a HPLC tisztaságú aceton gyártójától (4.1 fejezetben részletezett). Következésképpen a szennyező csúcsok összege aceton tartalmú reagens esetén, ACN tartalmúval összehasonlítva, 3-4-szer nagyobb. További hátránya, hogy a Tyr-2 elválasztását zavarja. d) Az FMOC reagens koncentráció (pH 9 értékű puffer, ACN tartalmú FMOC reagens: 0,5 mM – 5 mM, a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő: 1-20 perc, FL detektálás során mért adatok) és a reagens elkészítése óta eltelt idő nagyságával a szennyező csúcsok válaszjele nő, beleértve az FMOC-OH-t is. Az optimális származékképzési körülmények megválasztásánál kulcskérdés volt a kromatogram közepén (tR = 21,03 perc) eluálódó FMOC-OH csúcsának szélessége. Ugyanis, minél szélesebb a hidrolízistermék csúcsa, annál nehezebb a szomszédos aminosav-származékoktól elválasztani. Az FMOC-OH UV detektálás során mért válaszjele (az FMOC-aminosavak UV válaszjelének átlagából, 1,41 i.e./pmól, számítva) tájékoztat a FL detektálás alkalmazása során fellépő zavaró hatásáról: lévén sokkal nagyobb, mint a mért aminosav-származékok válaszjele (40 pmól/ aminosav/ injektált térfogat, vagy kevesebb). Következésképpen a kvantitatív származékképzés esetében a
44
minél kisebb mennyiségű hidrolízistermék jelenléte alapvető szempont az optimum reakciókörülmény megválasztása során (8. táblázat).
5.1.4 Az FMOC reagens feleslegének elvétele
Az FMOC kvantitatív származékképzést követő hidrolízisének megakadályozása céljából, a reagens feleslegének elvétele szükséges, e célra a 2.2.5.6 e fejezetben részletezett eljárásokat írták le: (1) a szerves oldószerbe extrakcióját; vagy (2) aminocsoportúakkal való reakcióját javasolják. Az aminosav veszteség miatt az extrakciós módszert elvetettem (2.2.5.6 e fejezetben részletezett). Követelmény az FMOC feleslegével képződő termék esetén, hogy: a) az aminosav-származékok elválasztását ne zavarja: előttük vagy utánuk eluálódjon, b) az FMOC-cal gyorsan és kvantitatívan reagáljon, c) az aminosavak meghatározását ne zavarja. Az FMOC feleslegének további hidrolízisét ADAM-mal (1 perc [88]) vagy HEPA-val (3 perc [91]) állítottam le, aminek következtében: 1) a feleslegelvétel a kromatogram közepén eluálódó FMOC-OH csúcsának alakjára és szélességére kedvezően hatott, az irodalomnak megfelelően [106]: leszálló szára meredekebb lett; 2) következésképpen a csúcs alapvonalon mért szélessége mintegy 1,5 perccel csökkent, az elúciós profil javult; 3) egy-egy széles csúcsként eluálódtak a kromatogram végén, az elválasztást nem zavarták; 4) a szennyező csúcsok mennyiségét nem csökkentették; 5) az aminosav-származékok válaszjelét nem befolyásolták; Az ADAM származékképzési reakciója gyorsabb, ezért ennek használata kedvezőbbnek bizonyult.
45
5.1.5 A FL- és az UV válaszjelek összehasonlítása
Az irodalmi adatok alapján FL és UV detektorokkal mérték az FMOC-származékok válaszjelét. Az 1. táblázatban részletezett dolgozatok közül 15 esetben FL, 7 esetben UV és 4 esetben egyidejű [85,88,89,180] detektálást alkalmaztak. A válaszjelek arányára (FL válaszjel/ UV válaszjel = RR = 25) egyetlen utalás található [89]. 22 FMOC-aminosavat szimultán detektálással mértem optimális reakciókörülmények között. A 10. ábrán foglaltam össze az eredményeket (a hasáb csíkos része a FL-, fekete része az UV válaszjelek nagyságát jelenti aminosav-származékokként). Az egyes oszlopok fölött számértékek i.e./pmól-ban kifejezve, s azok arányai szerepelnek, 1
UV válaszjel FL válaszjel
12,6/2,49=5,1 22,9/0,80=28,6
Il e Leu Trp Phe (Cys) 2 H is- 2 Orn L ys Tyr-2
A la Pro V al Met
G ln Ser G ly T hr Arg
G lu H yp Asn
A sp
1,14/1,65=0,69
127/1,44=88
113/1,28=89 116/1,34=87 103/1,21=85 84/1,03=82 86/1,04=82 92/1,13=81 93/0,88=105 107/1,28=84 118/1,27=93 133/1,44=92 75/1,03=74 88/1,11=80 80/1,16=69 125/1,34=93 117/1,41=83
é FL/UV válaszjel, integrátor egység/pmól
185/2,32=80 163/2,20=74 161/2,20=73
ml/perc áramlási sebességre vonatkoznak.
10. ábra: Az egyes aminosav-származékok FL és UV válaszjelei integrátor egység/ pmól-ban kifejezve, valamint ezek aránya
46
a) A FL válaszjelek 1,14 (Trp) és 185 (Orn) i.e./pmól közötti értékek, átlaguk 99,9 i.e./pmól. b) Az UV válaszjelek 0,80 (His-2) és 2,49 [(Cys)2] i.e./pmól közöti értékek, átlaguk 1,41 i.e./pmól. c) Az RR értékek 3 kivételtől - a Trp-tól (0,69), a (Cys)2-től (5,1) és a His-2-től (28,6) - eltekintve, 69 (Met) és 105 (Gly) közötti értékek, átlaguk 70,9. Az irodalomban számított RR = 25 értéknél 2,8-szor nagyobb (70,9/25 = 2,8). Az alacsonyabb értékek [Trp, (Cys)2, His-2] az alacsonyabb FL válaszjelekből adódnak, melynek oka az intramolekuláris hasadás a detektorban [88].
5.1.6 A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő az FMOC reagens abszolút koncentrációjának és az [FMOC]/[aminosav]T mólarányának függvényében
E kísérletekben azt vizsgáltam, hogy az FMOC reagens koncentrációja (reakcióelegyre vonatkoztatva: 0,25 – 5 mM), egyúttal az [FMOC]/[aminosav]T mólaránya (2,75:1 – 55:1) milyen hatással van a reakció sebességére állandó aminosav koncentráció, ACN tartalmú reagens és pH 9 értékű puffer alkalmazása esetén (8. táblázat). A 8. táblázat az egyes aminosavak válaszjelét tartalmazza a reakcióidő és az FMOC koncentráció függvényében, i.e./pmól-ban kifejezve (a műveleti üres értékek levonásával, a 3. táblázatban részletezett grádiens alapján 1 ml/perc áramlási sebességre számítottak). Kvantitatív reakció esetén a válaszjelek reprodukálhatóak (≤6,0% RSD, számított átlag: 1,51% RSD). A kvantitatív származékképzési reakció a következő elvárásoknak kell, megfeleljen: a) a szükséges reakcióidő, valamint b) a hidrolízistermék mennyisége minél kisebb legyen, s c) a His és a Tyr származékait (His-1, His-2, Tyr-1, Tyr-2; 5.1.9 fejezetben részletezett) mennyiségileg tudjuk értékelni.
47
8. táblázat: A válaszjelek értékei (integrátor egység/pmól-ban kifejezve). Reakciókörülmények: ACN/víz = 1:1 (v/v), pH 9, az össztérfogatra számított FMOC koncentráció (0,25 5 mM)* és a kölcsönhatás idejének (1 60 perc) függvényében, állandó aminosav koncentráció mellett (aminosav mennyisége: 5,4 10-8 mól) FMOC, mM*; zárójelben: [FMOC]/[aminosav]T mólaránya Amino0,25; {2,8:1} 0,5; {5,5:1} 1,5; {16,5:1} 3; {33:1} tR, savak Reakcióidő, perc perc 1 30 60 15 20 30 1 3 5 10 1 3 5 integrátor egység (i.e.)/pmól aminosav Asp 4,67 14,48 63,94 63,89 106,6 113,2 111,9 71,20 100,3 109,9 109,6 94,75 115,2 116,1 5,58 23,00 84,76 85,42 117,8 115,1 117,4 94,95 114,4 118,2 117,7 111,1 118,1 115,4 Glu Hyp 8,98 104,6 104,5 104,9 101,8 102,4 101,9 101,7 102,6 101,7 103,9 103,6 101,7 103,5 Asn 9,67 17,14 61,55 63,56 82,50 82,87 83,60 72,73 84,53 85,05 86,03 83,04 83,38 81,84 Gln 10,17 28,02 77,15 76,80 85,30 85,93 86,80 80,47 85,87 86,22 86,38 84,44 85,76 84,25 Ser 10,73 33,19 92,58 92,23 91,95 92,43 92,20 91,27 91,51 91,59 92,20 92,26 92,55 90,87 Gly 11,72 88,11 93,34 93,15 93,63 93,34 92,98 91,36 89,75 90,10 91,44 92,59 95,92 92,72 Thr 12,12 67,64 106,1 106,7 109,3 106,4 106,2 107,8 109,6 108,3 108,4 104,9 108,0 106,9 Arg 12,48 101,7 119,7 120,1 114,3 120,0 113,8 121,7 119,7 120,3 121,3 118,0 113,6 118,7 Ala 13,18 83,88 132,4 128,9 133,6 134,1 131,1 132,7 134,1 134,4 134,4 132,8 131,2 132,9 Pro 13,62 33,97 75,67 72,03 76,38 76,70 76,67 77,50 74,66 75,12 76,15 74,75 72,33 73,94 Val 16,83 58,24 89,45 89,75 86,95 90,61 87,67 89,10 89,22 88,45 88,36 88,03 87,43 85,87 Met 17,22 47,01 81,05 81,94 79,7 83,26 79,00 80,99 80,56 79,79 79,61 79,70 79,51 80,10 18,93 91,27 126,3 126,6 128,8 129,2 124,7 128,9 124,8 124,3 124,4 122,1 123,5 119,7 Ile Leu 19,33 75,69 118,3 120,5 115,9 121,6 114,7 119,4 120,8 118,2 114,6 116,6 114,2 113,4 1,10 1,16 1,11 1,14 1,13 1,14 1,17 1,12 1,18 1,15 1,16 1,09 Trp 19,92 1,16 127,7 125,7 Phe 20,23 97,67 127,2 128,6 127,4 126,0 126,8 122,4 (Cys)2 22,70 13,80 13,12 13,00 12,60 13,18 12,40 12,79 12,08 12,34 12,28 Orn 27,22 144,8 184,9 185,2 188,5 184,0 182,9 187,6 183,4 185,1 184,0 181,0 181,8 187,0 Lys 27,65 96,03 158,4 160,2 159,9 162,5 162,3 165,0 161,4 161,7 165,0 163,6 161,0 161,2 F-OHUV 21,03 0,87×103 1,8×103 2,1×103 2,4×103 2,8×103 3,1×103 2,8×103 4,2×103 5,3×103 7,9×103 5,5×103 9,4×103 12×103 6,72 6,69 6,72 0 0 7,30 6,86 0 0 0 0 0 His-1# 11,30 1,09 0 22,90 22,91 22,70 22,67 22,82 22,91 22,91 22,24 23,27 22,74 23,13 22,71 His-2# 25,60 48,9 48,9 52,2 50,0 52,2 56,2 58,8 48,7 51,9 Tyr-1# 14,52 24,8 67,0 65,5 42,9 Tyr-2# 30,96 160,3 160,5 160,5 160,7 160,6 160,8 160,6 160,8 160,5 160,5 160,5 160,5 160,4
5; {55:1} 10 114,6 117,3 104,9 85,96 85,39 90,79 95,33 108,5 114,2 135,6 77,34 86,47 79,14 124,6 116,1 1,09 11,82 183,9 165,0 18×103 0 22,98 51,9 160,5
1
Átlag (RSD%)
10
113,8 115,6 114,0 115,4 104,1 102,4 85,67 84,64 85,47 83,71 90,69 90,56 91,99 92,07 107,0 107,1 117,6 118,7 136,0 131,5 75,14 76,85 88,93 85,56 80,75 80,83 127,5 122,3 116,7 118,6 1,17 1,11 185,5 183,1 161,1 165,6 9,4×103 26×103 0 0 23,48 22,88 51,8 0,00 161,0 160,5
113,3 (2,11) 116,1 (1,89) 103,0 (1,18) 84,1 (1,65) 85,5 (1,07) 91,7 (0,78) 92,7 (1,80) 107,4 (1,20) 118,1 (2,37) 133,1 (1,40) 75,4 (2,22) 88,1 (1,66) 80,4 (1,41) 125,2 (2,18) 117,3 (2,15) 1,14 (2,65) 126,5 (1,49) 12,64 (3,14) 184,5 (1,12) 162,5 (1,20) 6,86 (3,73) 22,9 (1,23) 51,9 (6,0) 160,6 (0,10)
Jelölések: mint a 7. táblázatban, továbbá a dőlt betűvel szedett értékeket figyelmen kívül hagytam az átlag számításakor; ()=zárójelben az RSD % értékek; -=nincs adat; His-1#, His-2#, Tyr-1# és Tyr-2#, =számított értékek, a His-2 és a Tyr-2 alapján, amikor utóbbiak egy csúccsal eluálódnak, ezekben az esetekben a His-1 és Tyr-1 0 értékkel jelezve (kiegészítések 17.a,b-24.a,b ábrák). 48
A 8. táblázatban összefoglalt eredmények alapján az alábbi következtetések vonhatók le: 1) 0,25 mM reagens koncentráció, jóllehet, az FMOC-OH csúcsa a legkeskenyebb, elégtelennek bizonyult: a karboxil- (Asp, Glu) és a savamid (Asn, Gln) csoportot tartalmazó aminosavak reakciója 60 perc után sem teljes. Ezért ezt a reagens koncentrációt elvetettem. 2) Növelve az FMOC koncentrációját (0,5 – 5 mM) az [FMOC]/[aminosav]T mólarány is nőtt (5,5:1 – 55:1), a kvantitatív reakcióhoz szükséges idő csökkent (0,5 mM: 20 perc; 1,5 mM: 5 perc; 3 mM: 3 perc; 5 mM: 1 perc után teljes a származékképzési reakció). Tehát a 7. és 8. táblázat alapján (az FMOC-OH szélesedésével és a szükséges reakcióidővel számolva) az optimum koncentráció 0,5 mM (20 perc). 3) Az optimálási vizsgálatok során kitűnt, hogy a His és a Tyr mono- és diszármazékai reprodukálhatóan mérhetőek, azaz képződésük és átalakulásuk analitikailag nyomon követhető. A származékképzési reakció optimálásának második lépéseként vizsgáltam, vajon a reakcióelegy FMOC koncentrációja és/vagy az [FMOC]/[aminosav] T mólaránya szabja meg a reakció sebességét? A kérdést megválaszolandó, állandó FMOC koncentráció mellett változtattam az aminosavak mennyiségét. A két sebesség-meghatározó dikarbonsav aminosav (Asp, Glu) [89] részletesebb vizsgálatát két irányból közelítettem, alapul véve két, bizonyítottan kvantitatív, szélsőséges reakciókörülményt (8. táblázat, 0,5 mM FMOC reagens, 20 perc és 5 mM, 1 perc): a) 0,5 mM FMOC koncentráció esetében az Asp reakcióideje 20 perc, a Glu-é 15 perc [FMOC]/[aminosav]T = 5,5:1 mólarány mellett. Csökkentettem a teljes aminosav mennyiséget állandó FMOC koncentráció mellett, így a mólarány 5,5:1-ről 25:1-en keresztül 66:1-re nőtt, de az Asp és a Glu származékképzése ugyanúgy rendre 20 és 15 perc után teljes (11. ábra).
49
T
FMOC, FMOC, 0.5 0,5 mM; mM; [FMOC]/[AAs]T=5.5/1 [FMOC]/[As] =5,5:1 T
25
FMOC, FMOC, 0.5 0,5 mM; mM; [FMOC]/[AAs]T=25/1 [FMOC]/[As] =25:1 T
FMOC, 0.5 0,5 mM; mM; [FMOC]/[AAs]T=66/1 [FMOC]/[As] =66:1 FMOC, T
FMOC, 55 mM; mM; [FMOC]/[AAs]T=5.5/1 [FMOC]/[As] =5,5:1 FMOC, T
FMOC, 55 mM; mM; [FMOC]/[AAs]T=55/1 [FMOC]/[As] =55:1 FMOC,
Reakcióidő, perc
20
15
10
5
0 Asp
Glu
b) 11. ábra: Az Asp és a Glu reakcióideje az FMOC reagens koncnetrációjának, valamint az [FMOC]/[aminosav]T mólarányának függvényében, ahol [As]T = az aminosavak együttes mennyisége b) 5 mM FMOC koncentráció esetében [FMOC]/[aminosav]T = 55:1 mólarány mellett a szükséges reakcióidő 1 perc. Az aminosav mennyiségét növeltem állandó FMOC koncentráció mellett, így a mólarány csökkent 5,5:1-re, de a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő 1 perc maradt (11. ábra). A legkevésbé reaktív aminosavak, az Asp és a Glu válaszjeleinek eredménye alapján (természetesen a többi 20 aminosavat is figyelembe véve) egyértelműen az alábbi következtetések vonhatók le: 1) Minél nagyobb az FMOC reagens koncentrációja, annál gyorsabb a reakció.
50
2) Azaz növelve a mólarányt 0,5 mM FMOC koncentráció esetében, a szükséges reakcióidő minden esetben 20 perc. 3) Csökkentve a mólarányt 5 mM FMOC koncentráció esetében, 1 perc reakcióidő elégségesnek bizonyult. A fenti részletes vizsgálatok eredményeit összefoglalva: i. állandó aminosav koncentráció mellett, az FMOC mennyiségét változtatva; ii. állandó FMOC koncentráció mellett, az aminosav mennyiségét változtatva ebben a mérési tartományban az FMOC reagens abszolút koncentrációja határozza meg a reakció sebességét. Ezen mérési eredmények birtokában tisztázhatóak az irodalomban tapasztalt látszólag ellentmondó reakciókörülmények (2.2.5.6 d fejezetben részletezett). Például Grzywacz[102], López-Cervantes és munkatársai [108] pH 8,5 értékű puffert és 8 mM ACN tartalmú FMOC reagenst alkalmaztak, jóllehet az [FMOC]/[aminosav]T mólarány eltérő: az előbbinél 16,7:1, az utóbbinál 69:1, de a javasolt reakcióidő ugyanannyi: 90 mp [102,108]. . 5.1.7 A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő a puffer pH értékének és az FMOC reagens oldószerének függvényében
Az irodalomban néhány kivételtől eltekintve borát puffert alkalmaztak (2.2.5.6 a fejezetben részletezett), így a puffer típusának tanulmányozására nem tértem ki. A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt vizsgáltam a puffer pH értékének (pH 8, 9, 10), valamint az FMOC reagens oldószerének függvényében. pH 10 értékű puffert, 0,5 mM koncentrációjú FMOC reagenst alkalmazva (ACN tartalmú, [FMOC]/[aminosav]T = 25:1) a reakció nem kvantitatív. Ennek oka, hogy az FMOC hidrolízise annyira felgyorsul, hogy az [FMOC]/[aminosav]T mólarány az optimális alá csökken. A pH 10 értékű puffert elvetettem. pH 9 értékű puffert alkamazva, aceton tartalmú reakcióelegyben 5 perc, ACN tartalmúban 20 perc; míg pH 8 értékű puffert használva aceton tartalmú reakcióelegyben 10 perc, ACN tartalmúban 30 perc szükséges az összes aminosav kvantitatív származékképzéséhez (12. ábra).
51
Tehát mind az aceton, mind az ACN tartalmú reakcióelegyben, pH 9 értékű puffer oldatokban csökken a származékképzéshez szükséges idő, pH 8 értékűvel hasonlítva, azonos
reakciókörülmények
között
(12.
ábra;
0,5
mM
FMOC
reagens,
[FMOC]/[aminosav]T = 25:1). Ennek oka, hogy a származékképzési reakció során az aminosavak amino csoportjainak deprotonált-protonált egyensúlya lúgosabb közegben a deprotonált felé tolódik.
30 pH 9, aceton pH 8, aceton pH 9, ACN pH 8, ACN
Reakcióidő, perc
25 20 15 10 5
As p Gl u As n Gl n Se Th r Ar r g Al a Gl y Hy p Pr o Va M l et Ile Le u Tr p Ph (C e ys )2 Or n Hi Ly s-( s T y 1+ r-( 2) 1+ 2)
0
12. ábra: Az egyes aminosavak reakcióidejének összehasonlítása a pH érték (8 és 9), valamint az FMOC oldószerének (ACN és aceton) függvényében Az irodalomban az egy THF kivételtől eltekintve ACN és aceton FMOC reagenst alkalmaztak (2.2.5.6 b fejezetben részletezett). Jóllehet, az a tény, hogy acetonban gyorsabb a származékképzési reakció, mint ACN-ben, ismert [89]: részletes összehasonlító elemzés nincs. E két oldószer hatását a származékképzés sebességére a 12. ábrán mutatom be, szigorúan azonos mérési körülmények között, pH 8 és 9 értékű puffert alkalmazva. Mind pH 8, mind pH 9 értékű puffer esetén, aceton tartalmú reakcióelegyben valóban gyorsabb a származékképzés, mint ACN tartalmúban, az „1 perces aminosavakat” kivéve (pH 8: a Hyp, a Pro, az Ile, a Leu, a Trp; pH 9: a pH 8-nál
52
felsoroltakon kívül a Gly és a Phe). Az esetükben annyira gyors a reakció (1 perc), hogy ilyen mérési módszer mellett nem látható az esetleges időbeli különbség. Az oldószertől függő eltérő reakciósebesség egyik oka, hogy a polárosabb aceton kedvezőbb közeget biztosít az FMOC ionos intermedier képződésének. Másik oka az oldószer okozta eltérő pH növekmény (5.1.2 fejezet, 6. táblázat). A reakció sebességén és a szennyező csúcsok mennyiségén túl az FMOC reagens stabilitását is befolyásolja az alkalmazott oldószer. ACN-ben oldva legalább 6 hónapig hűtőben stabil, míg acetonban 2 hónap után elkezd bomlani. A reagens eltarthatósága az oldószer víztartalmával (aceton: 0,5 v/v%, ACN: 0,02 v/v%) függhet össze.
5.1.8 A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő az aminosavak tulajdonságainak függvényében
Minden reakciókörülményt figyelembe véve (5.1.6 és 5.1.7 fejezetekben részletezett) a sebesség-meghatározó aminosav az Asp. A vizsgált aminosavak eltérő sebességgel reagálnak az FMOC-cal, az amino csoport nukleofilitását az alábbi szerkezeti tulajdonságok határozzák meg: a) Az aminosavak amino csoportjának pK értékei (9. táblázat), melyek a deprotonált-protonált egyensúly állapot eltolódását meghatározzák, eltérőek. b) Az oldalláncon a poláros csoportok (Asp, Glu: kaboxil-; Asn, Gln: savamid-; Ser, Thr: hidroxil csoport) nemkötő elektronpárjai hidrogén hidat létesítenek az amino csoporttal, csökkentve annak nukleofilitását. c) Az oldallánci alkil csoport elektronküldő jellege szintén befolyásolja az amino csoport nukleofilitását, ezzel együtt d) az FMOC sztérikus gátlását is okozza.
53
9. táblázat: Az aminosavak disszociációs állandói (pK) [181] Aminosav pK1 (α-COOH) 2,35 Ala 1,82 Arg 2,14 Asn 1,99 Asp 1,92 Cys 4,03 GABA 2,17 Gln 2,10 Glu 2,35 Gly 1,80 His 1,82 Hyp 2,32 Ile 2,33 Leu 2,16 Lys 2,13 Met 1,71 Orn 2,20 Phe 1,95 Pro 2,19 Ser 2,09 Thr 2,46 Trp 2,20 Tyr 2,39 Val
pK2 (α-NH2) 9,87 8,99 8,72 9,90 10,70 10,55 9,13 9,47 9,78 9,33 9,66 9,76 9,74 9,06 9,28 8,69 9,31 10,64 9,21 9,10 9,41 9,21 9,74
pKr (R) 12,48 3,90 8,37
4,07 6,04
10,54 10,76
10,46
Jelölések: pK1 (α-COOH)=az aminosav α-karboxil csoportjának disszociációs állandója; pK2 (α-NH2)= az aminosav α-amino csoportjának disszociációs állandója; pKr (R)=az aminosav oldallánci csoportjának disszociációs állandója.
5.1.9 A His és a Tyr kérdése
Részletesen vizsgáltam a His és a Tyr mono- és di-származékainak képződését és átalakulását. His esetében az első FMOC molekula az amino csoporttal reagál: NFMOC-hisztidin (His-1) (13. ábra), míg a második az oldallánci imidazol gyűrű Njével: N,NH-(FMOC)2-hisztidin (His-2) (14. ábra).
54
OH O H 2N
OH H N
O O
+
N
His
O O
H N NH N
O Cl
FMOC-Cl His-1
13. ábra: A His-1 képződése
OH O O O
OH H N
NH N
O O
+
His-1
O
N NH N
O
O O
O
His-2
Cl
FMOC-Cl bomlás OH O O O
H N
OH
NH N
+
FMOC-OH His-1
14. ábra: A His-2 képződése és bomlása Tyr esetében az első FMOC molekula szintén az amino csoporttal reagál: N-FMOCtirozin (Tyr-1) (15. ábra), míg a második az oldallánci fenolos hidroxil csoporttal: N,O(FMOC)2-tirozin (Tyr-2) (16. ábra).
55
OH
HO
O
O O
+
NH2
OH
NH
OH
O
Tyr
O Cl
O
FMOC-Cl
Tyr-1
15. ábra: A Tyr-1 képződése
HO O O
HO NH
OH
O
O O
+
O
NH
O
O
O O O
Cl
FMOC-Cl
Tyr-1
Tyr-2
16. ábra: A Tyr-2 képződése Ahhoz, hogy a négy formát (His-1, His-2, Tyr-1, Tyr-2) reprodukálható és összehasonlítható válaszjelekkel jellemezni tudjuk, az alábbi feltételeknek kell teljesülniük: a) Legyen egy grádiens program, mely a négy forma alapvonali elválasztását biztosítja (4. táblázat). b) Legalább egy olyan reakciókörülmény legyen, mely esetben a két aminosav egyegy származéka (His-2, Tyr-2) kizárólagosan mérhető, ebből mind a négy forma számítható. c) A His-2 és a Tyr-2 az analitikailag elfogadható idő intervallumban (20-60 perc) stabil és kvantitatív célú mérésre alkalmas legyen. Mind a három feltételnek (a-c) eleget tettem a származékképzés optimálása során (5.1.6 fejezetben részletezett, 8. táblázat), kiegészítve a His és a Tyr származékainak részletezett képződésével és átalakulásával. A részletes vizsgálatot 0,5 mM FMOC
56
koncentráció esetében mind pH 8 és 9 értékű puffer, mind ACN (17.a,b-20.a,b ábra) és aceton (21.a,b-24.a,b ábra) tartalmú reagens alkalmazásával elvégeztem.
57
0,10
(a)
Fluoreszcenciás intenzitás
0,08
1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 30 perc 60 perc
His-2
0,06
0,04 His-1
0,02
0,00 2,5
3,0
20,0
20,5
tR, perc
(b)
40 His-1 His-2
35 30
pmól
25 20 15 10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
Reakcióidő, perc
17. ábra: A His-1 és a His-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 8 értékű pufferral készített, ACN tartalmú reakcióelegyben
58
0,10
(a)
1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 20 perc 30 perc 60 perc
Fluoreszcenciás intenzitás
0,08
His-2
0,06
0,04 His-1
0,02
0,00 2,5
3,0
20,0
20,5
tR, perc
(b)
40 His-1 His-2
35 30
pmól
25 20 15 10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
Reakcióidő, perc
18. ábra: A His-1 és a His-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 9 értékű pufferral készített, ACN tartalmú reakcióelegyben
59
0,30
(a)
0,25
1 perc 3 perc 60 perc 10 perc 30 perc 5 perc
Fluoreszcenciás intenzitás
0,20
0,15
Tyr-2 Tyr-1
0,10
0,05
0,00 8,5
9,0
9,5
22,5
23,0
23,5
tR, perc
40
(b)
Tyr-1 Tyr-2
35 30
pmól
25 20 15 10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
Reakcióidő, perc
19. ábra: A Tyr-1 és a Tyr-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 8 értékű pufferral készített, ACN tartalmú reakcióelegyben
60
0,30
(a)
0,25
1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 20 perc 30 perc 60 perc
Tyr-2
Fluoreszcenciás intenzitás
0,20
0,15
0,10
Tyr-1
0,05
0,00 8,5
9,0
9,5
22,5
23,0
23,5
tR, perc
40
(b)
Tyr-1 Tyr-2
35 30
pmól
25 20 15 10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
Reakcióidő, perc
20. ábra: A Tyr-1 és a Tyr-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 9 értékű pufferral készített, ACN tartalmú reakcióelegyben
61
0,10
(a)
1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 30 perc 60 perc
Fluoreszcenciás intenzitás
0,08
His-2
0,06
0,04
His-1 0,02
0,00 2,5
3,0
20,0
20,5
tR, perc
40
(b)
His-1 His-2
35 30
pmól
25 20 15 10 5 0 0
10
20
30 40 Reakcióidő, perc
50
60
21. ábra: A His-1 és a His-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 8 értékű pufferral készített, aceton tartalmú reakcióelegyben
62
0,10
(a)
1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 30 perc 60 perc
Fluoreszcenciás intenzitás
0,08
0,06
His-2
0,04 His-1
0,02
0,00 2,5
3,0
20,0
20,5
tR, perc
40
(b)
His-1 His-2
35 30
pmól
25 20 15 10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
Reakcióidő, perc
22. ábra: A His-1 és a His-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 9 értékű pufferral készített, aceton tartalmú reakcióelegyben
63
0,30
(a)
1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 30 perc 60 perc
0,25
0,20 Fluoreszcenciás intenzitás
Tyr-2
0,15 Tyr-1 0,10
0,05
0,00 8,5
9,0
9,5
22,5
23,0
23,5
tR, perc
40
(b)
Tyr-1 Tyr-2
35 30
pmól
25 20 15 10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
Reakcióidő, perc
23. ábra: A Tyr-1 és a Tyr-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 8 értékű pufferral készített, aceton tartalmú reakcióelegyben
64
0,30
(a)
0,25
1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 30 perc 60 perc
Tyr-2
Fluoreszcenciás intenzitás
0,20
0,15
0,10 Tyr-1
0,05
0,00 8,5
9,0
9,5
22,5
23,0
23,5
tR, perc
(b)
40 Tyr-1 Tyr-2
35 30
pmól
25 20 15 10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
Reakcióidő, perc
24. ábra: A Tyr-1 és a Tyr-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 9 értékű pufferral készített, aceton tartalmú reakcióelegyben
65
Mind a His-, mind a Tyr-származékok képződésének és átalakulásának eltérő sebességének oka, hogy a második FMOC molekula reakciója a His deprotonált imidazol N-jével és a Tyr deprotonált fenolos hidroxil csoportjával lassúbb, mint az első FMOC reakciója az α-amino csoporttal. A származékképzési reakció optimálása során (5.1.6 fejezetben részletezett) a képződési és átalakulási folyamatok termékei az egyes részletekben számítottak, ACN tartalmú reakcióelegyben, pH 9 értékű puffert alkalmazva (8. táblázat, 18.a,b és 20.a,b ábra): 1) A His-2 kizárólagos megjelenése 16 reakciókörülményből 10 esetben megvalósított (8. táblázat). A His-1 kvantitatív átalakulása 0-val jelölt. A His-2 válaszjele 22,9 i.e./pmól, megerősíti ezt a kiváló reprodukálhatósága (≤ 1,23% RSD) és a stabilitása (8. táblázat, 18.a,b ábra). 2) A Tyr-2 kizárólagos megjelenése 2 esetben megvalósított. A Tyr-1 kvantitatív átalakulása 0-val jelölt (8. táblázat, 5 mM FMOC reagens, 10 perc reakcióidő és 3 mM, 20 perc), szélsőségesen nagy FMOC koncentrációt, speciális reakcióidőt és megfelelő pH értékű puffert igényel. A Tyr egy csúcsként, Tyr-2-ként mért válaszjel ismeretének birtokában, a továbbiakban a többi értékek ebből számítottak (8. táblázat, Tyr-1: 0, Tyr-2: 160,5 i.e./pmól), elfogadható reprodukálhatóságot és stabilitást eredményezve, melyek a Tyr-1 + Tyr-2 összege alapján jellemzettek (8. táblázat, 20.a,b ábra). A His és a Tyr származékainak válaszjeleit elemezve (17.a,b-24.a,b ábrák), az alábbi következtetések vonhatók le: a) Számértékkel kifejezve a képződött és átalakult termékeket, a di-származékok nagyobb intenzitásúak (8. táblázat, His-1/His-2 = 6,86/22,9 = 1:3,3 és Tyr1/Tyr-2 = 51,9/161 = 1:3,2) a második FMOC csoportnak köszönhetően. A His és a Tyr kvantitatív meghatározására érzékenység szempontjából rendre a His-2 és a Tyr-2 forma kizárólagos megjelenése az előnyösebb. b) A His-1, a His-2 és a Tyr-1, a Tyr-2 képződésének és átalakulásának elúciója, valamint pmólban kifejezett mennyiségi viszonya hasonló tendenciát mutat a pH függvényében. Azonos körülmények között, az alkalmazott puffer pH értékét kivéve (pH 8 és 9), a származékok képződésének és átalakulásának sebessége nagyobb pH értékű puffer esetében gyorsabb. Ez a jelenség feltehetően a
66
származékok deprotonált formájának nagyobb arányú jelenlétével függ össze: a nagyobb pH értékű reakcióelegyben a második FMOC reakciója kedvezőbb. c) A His és a Tyr képződése és átalakulása aceton tartamú reagens alkalmazása esetén gyorsabb, ACN tartalmúval összehasonlítva - az oldószerek polaritásbeli különbségének és a pH változásnak köszönhetően (5.1.7 fejezetben részletezett, 6. táblázat) -, kvantitatív meghatározás céljára kevéssé alkalmas (5.1.3 fejezetben részletezett). A származékképzési folyamatokat részletesen vizsgáltam (0,5 mM FMOC reagens, [FMOC]/[aminosav]T = 25:1), az alábbi következtetéseket vontam le: 1) Összehasonlítva a His-1 és a His-2 egymásba alakulását, a His-2 kvantitatív képződéséhez szükséges reakcióidő ACN tartalmú reakcióelegyben pH 8 értékű puffert alkalmazva 60 perc (17.a,b ábra), pH 9 értékű puffer esetében 20 perc (18.a,b ábra); míg aceton tartalmúban pH 8 értékű puffer esetében 10 perc (21.a,b ábra). Jóllehet aceton, pH 9 esetében a His-2 képződése gyorsabb, de egyúttal megkezdődik a bomlása is His-1-gyé (22.a,b ábra). 2) A Tyr-1 és a Tyr-2 megoszlását tükrözik a 19.a,b, 20.a,b, 23.a,b, 24.a,b ábrák. ACN tartalmú reakcióelegyben a Tyr-2 mennyiségi növekedése lassúbb, az aceton tartalmúval összehasonlítva. Aceton tartalmú reakcióelegyben pH 8 értékű puffer esetében 27-28 perc (23.a,b ábra), míg pH 9 esetében már 7-8 perc (24.a,b ábra) után egyenlő a Tyr-1 és a Tyr-2 mennyisége.
5.1.10 A Cys mérése
A Cys (monomer forma) spontán intramolekuláris oxidációja vizes közegben ismert [182,183], mennyiségét (Cys)2-ként (dimer forma) mértem (25. ábra). A két forma [Cys és (Cys)2] együttes meghatározása kvantitatív és reprodukálható abban az esetben, ha az oxidáció teljes. a) A Cys-nek oldatkészítéstől számított 5 perc után több mint a fele (55%), 20 perc alatt a teljes mennyisége dimerizálódik (pH 9 értékű puffer, 0,5 mM ACN tartalmú FMOC reagens, [FMOC]/[aminosav]T = 12:1).
67
H2N CH COOH CH2
H2N CH COOH 4
CH2
+
S
2
O2
+
2 H2O
S
HS
CH2
Cys
H2N CH COOH
(Cys)2
25. ábra: A Cys oxidációja b) A Cys esetében az első FMOC molekula az amino csoporttal reagál, míg a második az oldallánci tiol csoporttal [94]: N,S-(FMOC)2-cisztein [Cys(FMOC)2] (26. ábra).
CH2
NH CH COOH
O
H2N CH COOH
O
+ 2 O
O
S
O
HS
CH2
O
Cl
Cys Cys-(FMOC)2
FMOC-Cl
26. ábra: A Cys reakciója FMOC-cal A (Cys)2 esetében két FMOC molekula reagál a két amino csoporttal: N,N(FMOC)2-cisztin [(Cys)2-(FMOC)2] (27. ábra).
H2N CH COOH
O
CH2
NH CH COOH O
S
S
+ 2
S
S
O
CH2
O
H2N CH COOH
CH2
CH2
Cl O
FMOC-Cl
NH CH COOH O
(Cys)2
(Cys)2-(FMOC)2
27. ábra: A (Cys)2 reakciója FMOC-cal
68
A (Cys)2-(FMOC)2 és a Cys-(FMOC)2 származékok 130 percig stabilak. c) A monomer forma származéka nagyobb intenzitású, mint a dimer formáé (Cys(FMOC)2/(Cys)2-(FMOC)2 = 9,8:1).
5.1.11 Reprodukálhatósági vizsgálatok
A származékképzés optimálási folyamata során az egy adott reakciókörülményhez tartozó értékeket legalább három párhuzamos mérés átlagából számítottam. Az FMOCaminosavak válaszjelei relatív standard deviációval bizonyítottan reprodukálhatóak: ≤ 4,0% RSD, átlagértékük: 1,0% RSD (10. táblázat). Az FMOC-aminosavak mennyiségi mérési határa 23 vizsgált származék közül 17 esetben 1 pmól, kivételt képeznek a Ser, a Gly, a Val (LOQ = 2,5 pmól), a (Cys)2, a His-2 (LOQ = 5 pmól) és a Trp (LOQ = 10 pmól; 10. táblázat).
69
10. táblázat: Az eltérő mennyiségű aminosavak válaszjelének reprodukálhatósága optimális reakciókörülmények* között mérve Aminosav 40 injektált pmól T [FMOC]/[As] 5,5:1 119 Asp 119 Glu 108 Hyp 81,8 Asn 84,6 Gln 90,0 Ser 95,3 Gly 105 Thr 116 Arg 131 Ala 76,1 Pro 90,0 Val 85,2 Met 129 Ile 124 Leu 1,17 Trp** 131 Phe 12,6 (Cys)2 186 Orn 168 Lys 27,2 His-2 51,1 Tyr-1 156 Tyr-2
Integrátor egység/1 pmól aminosav 20 10 5 2,5 1 11:1 22:1 44:1 88:1 220:1 118 116 118 114 120 117 119 118 116 113 112 109 109 104 105 80,0 82,0 81,3 85,5 86,3 84,8 85,7 83,9 87,4 84,1 90,9 90,9 90,0 96,3 95,7 96,5 97,6 92,1 106 106 106 104 107 117 118 118 112 121 129 129 134 128 128 76,8 77,9 76,2 72,8 74,8 89,7 90,0 90,0 93,6 84,6 85,1 84,8 81,5 89,2 126 128 129 123 118 121 125 125 122 119 1,16 1,15 1,11 1,06 1,18 127 131 131 124 132 12,4 12,4 12,9 186 188 185 178 179 168 168 170 166 170 23,3 22,6 22,0 51,0 51,0 48,8 161 163 169 167 165
Átlag
RSD %
117 117 108 82,8 85,1 91,6 95,5 106 117 130 75,7 90,7 85,0 126 122 1,14 129 12,6 184 168 22,6 50,5 163
1,9 2,0 2,7 3,0 1,5 2,9 2,2 0,98 2,5 1,8 2,3 1,8 2,9 3,5 2,0 4,0 2,4 1,9 2,3 0,89 2,9 2,2 3,1
Jelölések: mint a 7. és a 8. táblázatokban, továbbá *=pH 9 értékű pufferral készült, ACN tartalmú, a reakcióelegy össztérfogatára számított 0,5 mM FMOC koncentrációjú; Trp**=a Trp mennyisége 10 és 400 pmól/ injektált térfogat között változott.
70
5.2 Az FMOC-aminosavak elválasztásának optimálása Az FMOC-aminosavak meghatározására kiindulópontként az irodalmi tapasztalat szerinti legszebb elválásokat mutató kromatogramhoz tartozó grádienst alkalmaztam, figyelembe véve a két csúccsal eluálódó aminosavak, a His és a Tyr, mono- és diszármazékainak jelenlétét és hatékony elválasztását [88]. 21 FMOC-származékot, azaz 19+2 csúcs elválasztását valósították meg 30 perc alatt pmól tartományban Gustavsson és munkatársai a 4. táblázatban részletezett grádiens szerint 1,5 ml/perc áramlási sebesség mellett (ODS oszlop: 5 μm, 250 x 4 mm) [88]. Az irodalomban javasolt elválasztási körülményt alkalmazva az Arg, a Ser és az Asp; valamint a Trp és a Phe nem, a Glu, a Thr és a Gly, valamint az Ile és a Leu rosszul váltak el (csúcsfelbontásuk: R Glu/Thr 0,64 ; R Thr/Gly 0,76 ; R Ile/Leu 0,69 ). A His-1, a His-2, a Tyr-1 és a Tyr-2 alapvonalig elváltak. Az irodalmi optimált grádiens reprodukálása nem sikerült. Az aminosav-származékok hatékony elválasztása érdekében új grádienst készítettem, további aminosavakkal kiegészítve. A készülék óvása érdekében a javasolt [88] állandó 15% THF tartalmú eluensek összetételét megváltoztattam (A eluens: 0,05 M nátrium-acetát oldat, B eluens: 0,10 M nátrium-acetát oldat/ACN/MeOH = 23:11:11 (v/v) [184]). Az időigényes optimálási folyamatot lépésenként végeztem: mindig egy paramétert változtattam, melyek az 5.2.1-5.2.5 fejezetekben részletezettek.
5.2.1 Az oszlopok tulajdonságainak hatása az elválasztás hatékonyságára
Az optimálási munkám az oszlopok tulajdonságainak változtatásával folytatódott. a) Az oszlop hosszának hatását Hypersil 120-ODS 100, 150, 200 és 250 x 4 mmes, 5 μm töltetű oszlopon, Hypersil ODS 30 x 4 mm előtét oszloppal („Hypersil” oszlopok, BST, Budapest, Magyarország), ugyanazon grádiens alkalmazásával végeztem. Az oszlop hosszának növekedésével az elválasztás hatékonysága javult, az aminosav-származékok retenciója nőtt. Az első aminosav pár, az Asp és a Glu, 250 mm oszlopon későn, 9,8 és 10,4 percnél eluálódott, szemben a 100 mm oszlopon 4,1 és 5,1 perc retenciós idővel. Az oszlophossz tekintetében 150
71
mm volt az optimum érték [(I) jelű oszlop] az első aminosav pár (9. ábra, tR = 4,7 és 5,6 perc), valamint az elválasztás hatékonyságát figyelembe véve. b) Az elválasztást Nucleosil 120-ODS 200 x 4 mm, 5 μm töltetű oszlopon („Nucleosil” oszlop, BST, Budapest, Magyarország) is vizsgáltam (28. ábra). A Nucleosil típusú töltetek másodlagos szerkezetének hiánya miatt az oszlop nem bizonyult tartósnak. Két aminosav (az Arg és a His-2) retenciós sorrendje más, ugyanilyen
tulajdonságú,
„Hypersil”
oszloppal
összehasonlítva,
az
oszlophossztól függetlenül. „Hypersil” oszlopon az Arg a Thr és az Ala között eluálódott (9. ábra), Nucleosil töltetű oszlop az Arg-t nagyobb mértékben tartotta vissza: a Tyr-1 és a Val között jelent meg a csúcsa (28. ábra). A His-2 Hypersil típusú töltet hatására az Orn előtt (9. ábra), míg „Nucleosil” oszlopon a Lys és a Tyr-2 között (28. ábra) eluálódott. Az (I) és (II) jelű oszlopokon összehasonlítva az Arg retencióját, a 100 Å pórusátmérőjűn [(II) oszlop] kisebb mértékű: a Ser és a Gly között eluálódott (9. és 30. ábra). c) Oszlop tulajdonságainak hatását vizsgálva az elválasztás hatékonyságára, 22 FMOC-aminosav elválasztása elsőként optimált Hypersil 175-ODS 200 x 4 mm, 5 μm töltetű oszlopon („Hypersil Gold” oszlop, BST, Budapest, Magyarország 29.
ábra),
melyet
BST
Kft.
(Budapest,
Magyarország)
bocsátott
rendelkezésemre. A töltet a legújabb technológiával készült, az oszlop pórusátmérőjének szélsőséges értékre (175 Å) növelésével, a csúcsok szélességének csökkentése céljából. Tapasztalataim szerint éles csúcsokkal eluálódtak az FMOC-aminosavak, de az elválasztás hatékonyságán nem javított, feltehetően a szélsőséges nagy felületi adszorpció miatt. Az eltérő tulajdonságú oszlopokon kis mértékben eltérő válaszjeleket tapasztaltam azonos körülmények között (értékük ≤8,6%). Továbbiakban az (I) jelű oszlopon folytattam az optimálási lépéseket.
72
Tyr-2
Ile Leu Phe
0,6
0,4 Val
x Met
Arg
x
Tyr-1
(Cys)2
His-2
Ala GABA Pro
Gly Thr
0,2
Asn Gln Ser
Hyp
x
Asp Glu
Fluoreszcenciás intenzitás
FMOC-ADAM
Lys
FMOC-OH
FMOC-aminosavak mûveleti üres
Orn
0,8
0,0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
tR, perc
28. ábra: Az FMOC-aminosavak kromatogramja (folyamatos vonal) a műveleti üressel (szaggatott vonal) „Nucleosil” oszlopon (5.2.1 fejezetben részletezett) FL detektálás alapján; az FMOC-aminosavak optimális körülmények között készültek (pH 9, ACN tartalmú 0,5 mM FMOC reagens, 20 perc); grádiens elúció: 5. táblázat szerint
73
Thr Arg
Tyr-2
Ile Leu Phe
Orn Lys
x
His-2
(Cys)2
Tyr-1
Ser Gly
Hyp
0,2
Asn Gln
0,4
Val
0,6
FMOC-ADAM
FMOC-OH
Met
Ala Pro GABA
mûveleti üres FMOC-aminosavak
Asp Glu
Fluoreszcenciás intenzitás
0,8
x
0,0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
tR, perc
29. ábra: Az FMOC-aminosavak kromatogramja (folyamatos vonal) a műveleti üressel (szaggatott vonal) „Hypersil Gold” oszlopon (5.2.1 fejezetben részletezett) FL detektálás alapján; az FMOC-aminosavak optimális körülmények között készültek (pH 9, ACN tartalmú 0,5 mM FMOC reagens, 20 perc); grádiens elúció: 5. táblázat szerint
74
5.2.2 A hőfok hatása az elválasztás hatékonyságára
A hőfok emelésével az oldatok viszkozitása csökken [37]. Az elválasztás hatékonyságát 40, 45, 50, 55, 60ºC hőfokon vizsgáltam. A oszlop hőfokának változtatása a Gly, a Thr, az Arg, az Ala és a Pro retenciójára volt legnagyobb hatással. Az imént felsoroltak közül az első (Gly) és az utolsó (Pro) aminosav között rendre 1,2 – 1,5 - 1,7 – 1,8 – 1,8 perc a retenciós időbeli különbség a hőfok függvényében (40 - 60°C). Az elúciós profil tekintetében a 60ºC és az 55ºC oszlop hőfok között nincs jelentős különbség, a 60°C további vizsgálatával nem foglalkoztam. A 11. táblázat tartalmazza a fent említett kritikus aminosav párok csúcsfelbontását, továbbá a rosszul elváló Val és Met, valamint Ile és Leu csúcsfelbontásának értékeit az oszlop hőfokának függvényében. 11. táblázat: Az oszlop hőfokának hatása a kritikus aminosav párok csúcsfelbontására, t t az R értékre, mely a következő képlet alapján számított : R 2 R 2 R 1 W1 W2 Az oszlop A hőfoka kritikus aminosav párok Gly/Thr
40°C
45°C
50°C
55°C
0
0
0,65
0,22
Thr/Arg
0,77
0,61
0,62
0,79
Ala/Pro
0
0,59
0,70
0,81
Val/Met
0,64
0,66
0,64
0,65
Ile/Leu
0,61
0,72
0,72
0,73
Phe/F-OH
1,23
1,11
0,98
0,44
Jelölések: mint a 7. táblázatban, továbbá W=csúcs alapvonali szélessége percben kifejezve; F-OH=FMOC-OH; vastaggal jelölt az adott aminosav párhoz tartozó optimum R érték. 40ºC hőfokon a Gly és a Thr, valamint az Ala és a Pro együtt eluálódnak (11. táblázat, 40°C: R Gly/Thr 0, R Ala/Pro 0 ). Jóllehet a hőfok emelésével az Ala és a Pro elválása egyre jobb: 55ºC hőfok esetében RAla/Pro = 0,81; a Gly és a Thr maximális
75
csúcsfelbontása a vizsgált tartományban a 50°C oszlop hőfok esetében tapasztalható (11. táblázat, 50°C: R Gly/Thr 0,65; R Ala/Pro 0,70 ). A további kritikus párok, a Val és a Met; a Thr és az Arg, valamint az Ile és a Leu elválasztására az oszlop hőfok változtatásának nincs számottevő hatása (11. táblázat). A 11. táblázat eredményeiből jól látható, hogy az oszlop hőfokának változására a legnagyobb mennyiségben jelenlévő FMOC-OH retenciós ideje a legérzekenyebb. A szomszédos Phe-lal a csúcsfelbontásuk a hőfokkal fordíottan arányos, az elválasztásuk ≤50°C esetén megvalósított. Az összes, hőfok változásra érzékeny kritikus aminosav pár elválaszthatóságát tekintve kijelenthető, hogy 50°C az ideális oszlop hőfok.
5.2.3 Az eluens pH értékének hatása az elválasztás hatékonyságára
Az elválasztás optimálása szempontjából kulcsfontosságú lépés az eluens pH értékének megválasztása, mely az aminosav-származékok protonáltsági állapotát határozza meg. Az általunk választott ODS apoláros oszlopon az elválasztandó komponensek visszatartását jelentős mértékben befolyásolja az adott vegyület polaritásának mértéke [37]. Az aminosav-származékok protonálható csoportjai közül az α-karboxil csoport (9. táblázat, pK értéke 1,7 és 2,6 közötti érték, kivéve a GABA: 4,03) deprotonált állapotban van a vizsgált pH sorozaton (pH 8,20; 7,20; 6,20; 5,20; 4,20; 3,20), töltéssel rendelkeznek. Polaritásbeli különbségüket az oldallánc, valamint az esetlegesen protonálható csoport határozza meg. A 9. és a 12. táblázatokat összevetve jól látható az összefüggés, az oldallánci csoportok pK értékei hogyan befolyásolják a protonáltsági állapotot, a polározottság mértékét, következésképpen az elúciós sorrendet, adott pH értéken, úgymint: a) Az Asp és a Glu nagyobb pH értékű tartományban (pH 8,20 - 5,20) elsőként eluálódnak. pH 4,20 és 3,20 értékeken az oldallánci karboxil csoport protonálódásának (pK értékük rendre 3,90 és 4,07) következtében polaritásuk csökken, visszatartásuk az oszlopon nő: a Ser és a Gly között eluálódnak. b) Két aminosav pár, a GABA és a Pro, valamint a Val és a Met egymáshoz viszonyított polaritásuk az eluens pH értékének függvényében változik: pH 8,20,
76
7,20, 6,20 értékeken az említett párok közül a GABA és a Val polárosabb, majd pH 5,20, 4,20, 3,20 esetében a sorrend megfordul, a Pro-t követi a GABA, a Met-t a Val. c) Az FMOC-OH retenciója függ legnagyobb mértékben az eluens pH értékének változásától. pH 8,20 értékű eluens esetén 19. összetevőként (t R = 22,8 perc), míg pH 3,20 esetében 11. összetevőként (tR = 18,1 perc) eluálódik. d) Az eluensek pH értéke a mért tartományon belül nem befolyásolja az aminosavszármazékok válaszjeleinek nagyságát. A fent összefoglalt (a-d) pontok alapján a pH 8,20 és 7,20 értékű eluensek esetében tapasztaltam a legkedvezőbb elválásokat. A továbbiakban az oszlop védelme érdekében a pH 7,20 értékű eluensekkel folytattam az optimálási munkámat. A kritikus aminosavak: a Gly, a Thr, az Arg, az Ala, a GABA és a Pro, valamint a Met és a Val elválasztásának megoldása még további erőfeszítéseket igényel.
77
12. táblázat: Az FMOC-aminosavak elúciós sorrendje a felsorolás rendjében (fentről lefelé) az eluens pH értékének függvényében ugyanazon körülmények közötti felvételek alapján pH 8,20 pH 7,20 pH 6,20 pH 5,20 pH 4,20 pH 3,20 Asn Asn Asp Asp Asp Asp Gln Gln Glu Glu Glu Glu Hyp Hyp Hyp Hyp Hyp Hyp Asn Asn Asn Asn Ser Ser Gln Gln Gln Gln Asp Asp Ser Ser Ser Ser Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala F-OH F-OH GABA GABA GABA Pro 21,0 18,1 Pro Pro Pro GABA Pro Pro Val Val Val Met GABA GABA F-OH Met Met Met Met Met 21,8 Ile Ile Ile Val Val Val Leu Leu Leu Ile Ile Ile Trp Trp Trp Leu Leu Leu Phe Phe Phe Trp Trp Trp F-OH F-OH F-OH Phe Phe Phe 22,8 22,5 22,1 (Cys)2 (Cys)2 (Cys)2 (Cys)2 (Cys)2 (Cys)2 His-2 His-2 His-2 His-2 His-2 His-2 Orn Orn Orn Orn Orn Orn Lys Lys Lys Lys Lys Lys Tyr-2 Tyr-2 Tyr-2 Tyr-2 Tyr-2 Tyr-2 Jelölések: F-OH=FMOC-OH; az utána szereplő, vastaggal jelölt számérték az FMOCOH retenciós ideje percben kifejezve; dőlttel jelölt aminosavak viszonylagos tR értékét az eluens pH értéke befolyásolja; az egy cellában feltüntetett aminosavak együttesen eluálódnak.
5.2.4 Az eluens összetétel hatása az elválasztás hatékonyságára
Az A eluens változatlan összetételű: 0,05 M nátrium-acetát oldat, szervetlen só; a B eluens a kiindulás szerint 0,1 M nátrium-acetát/ACN/MeOH = 23:11:11 (v/v), azaz 49% szerves oldószer tartalmú. Az aminosav-származékok elválasztásának érdekében a
78
továbbiakban a B eluens szerves oldószer arányát és minőségét (ACN, MeOH, THF) optimáltam. (A két eluens optimált pH értéke 7,20; oszlop hőfoka 50°C; 5.2.2 és 5.2.3 fejezetekben részletezettek; állandó áramlási sebesség mellett: 1,5 ml/perc). a) A „kritikus aminosavak”: a Gly, a Thr, az Arg, az Ala, a GABA és a Pro, valamint a Met és a Val elválasztását javította az eluens MeOH tartalmának cseréje ACN-re. b) Az induló grádiens arány csak 70% A eluens/ 30% B eluens bizonyult optimálisnak az Asp és a Glu elválása érdekében. c) Továbbiakban a szerves oldószer tartalmú B eluens percenkénti százalékos emelkedés ütemét változtattam (0,4 és 9,7 %/perc között). Az optimális értékeket a 3. és 5. táblázatban tüntettem fel. Az eluens szerves oldószer tartalom optimálása során [(a-c) pont] a Phe összecsúszott az FMOC-OH-dal, amit a szerves oldószer tartalom változtatásával nem sikerült kiküszöbölni, így a továbbiakban az áramlási sebességet változtattam.
5.2.5 Az áramlási sebesség optimálása
Az áramlási sebesség - a vizsgált tartományon belül (0,8-1,7 ml/perc) – folyamatos csökkentése tovább javította a Gly, a Thr és az Arg, valamint a Val és a Met elválasztását; alacsony értéken tartása mellett a Phe és az FMOC-OH csúcsok elválasztása megoldott (3. és 5. táblázat).
Megjegyzés: Az (I)-es jelű oszlop elhasználódott az 5.1 és 5.2 fejezetben részletezett kísérleti munka során, ezért a (II)-es jelű oszlop eltérő tulajdonsága miatt módosítani kellett a grádiensen (5. táblázat). Újabb eluenst iktattam be, a B eluens alapján az ACN felét THF-ra cseréltem: a His-2-t el kellett választani az Orn-tól és a Lys-től.
79
5.3 Módszerfejlesztés, plazma minta előkészítése: az egyidejű származékképzés és fehérjementesítés optimálása
Ebben a fejezetben a kidolgozott módszer gyakorlati alkalmazását mutatom be: plazma mintát
elemzek.
Minden
kulcskérdés,
ami
az
aminosavak
és
az
FMOC
reakciókörülményeihez, valamint a képződött származékok mennyiségi viszonyaihoz kapcsolódik, tisztázott (5.1 fejezetben részletezett). Ezek az eredmények állandó feltételeket biztosítanak a jelenlegi munkámhoz (műveleti üres, puffer pH értéke, reagens oldószere, reakcióidő tekintetében), kivéve az FMOC koncentrációt. A minta fehérjéinek FMOC fogyasztását figyelembe kell venni, az aminosavak kvantitatív származékképzéshez szükséges FMOC mennyiségét ismét optimálom [185].
5.3.1 Az FMOC-aminosavak és a műveleti üres szennyezői
Grádienst (5. táblázat) dolgoztam ki a 22 FMOC-aminosav elválasztására (5.2 fejezetben részletezett), optimális származékkészítésük után
(4.6.2 fejezetben
részletezett), különös tekintettel a His-2 és a Tyr-2 elválasztására a szomszédjaiktól. Szaggatott vonallal ábrázoltam a műveleti üres kromatogramot (30. ábra).
80
Tyr-2
Ile Leu Phe (Cys)2
His-2
Hyp
Asn Gln Ser Arg Gly Thr Ala Pro GABA
0,4
FMOC-ADAM
x
Val Met
0,6
Asp Glu
Fluoreszcenciás intenzitás
FMOC-OH
0,8
0,2
Orn Lys
FMOC-aminosavak mûveleti üres
1,0
x x
x 0,0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
tR, perc
30. ábra: Az FMOC-aminosavak kromatogramja (folyamatos vonal) a műveleti üressel (szaggatott vonal) (II) oszlopon FL detektálás alapján; az FMOC-aminosavak optimális körülmények között készültek (pH 9, ACN tartalmú 3 mM FMOC reagens, 20 perc); grádiens elúció: 5. táblázat szerint
81
5.3.2 A fehérjementesítés és a származékképzés optimálása
Ezen vizsgálatok során az FMOC koncentrációt változtattam, ACN oldószer, pH 9 értékű puffer, és állandó PFAA koncentráció alkalmazásával (azaz 150 µl, 15-szörös hígítású, a 11 emlőrákos beteg közül 1, közvetlenül műtét előtti plazma mintát használtam, a továbbiakban: 1-es számú beteg). Az FMOC reakcióelegyre vonatkoztatott koncentrációját 0,5 és 7,5 mM között változtattam. A származékképzés hatékonyságát az FMOC-származékok válaszjelének nagyságával jellemzem az 1-es számú beteg plazmájának összetevői µmól/l-ben kifejezve (reakcióidő 20 perc, 13. táblázat). 13. táblázat: Az 1-es számú beteg plazmájában talált szabad aminosavak mennyisége az FMOC reagens koncentráció függvényében Aminot , perc Hígított (15x) plazma szabad aminosav tartalma [µmól/l] savak R 0,5 1,5 3,0 5,0 7,5 Átlag RSD% [FMOC] mM* 10,2 42,0 39,2 39,4 40,2 3,9 9,52 27,1 Asp 11,2 164 166 168 166 1,2 105 139 Glu 16,3 14,2 14,5 13,9 13,4 13,7 14,0 3,1 Hyp 18,7 42,2 42,4 41,9 42,1 0,55 15,0 37,1 Asn 19,8 476 492 473 480 2,1 271 456 Gln 21,2 166 170 160 172 167 3,2 115 Ser 22,2 157 158 163 155 158 2,2 139 Arg 23,6 362 368 356 381 352 364 3,1 Gly 24,5 95,8 93,8 95 93,1 94,4 1,3 59,9 Thr 26,0 270 265 256 257 266 263 2,2 Ala 26,6 110 108 110 108 108 109 1,0 Pro 30,6 147 151 148 150 146 148 1,4 Val 31,1 15,0 15,5 15,6 17,2 15,9 15,9 5,2 Met 32,0 47,5 46,0 47,9 44,6 46,7 46,5 2,8 Ile 32,2 95,4 95,5 95,6 96,5 98,0 96,2 1,2 Leu 32,6 62,7 62,9 62,8 66,5 62,8 63,5 2,6 Phe 33,4 176 179 179 178 187 180 2,3 (Cys)2 36,5 75,5** 75,4** 72,1 74,0 73,7 74,1 1,9 His 36,7 88,0 81,6 88,4 82,3 89,4 85,9 4,3 Orn 37,0 121 123 122 120 124 122 1,3 Lys 38,3 35,7** 36,1** 34,5 35,0 36,8 35,6 2,6 Tyr Jelölések: [FMOC] mM*=a reakcióelegyre vonatkoztatva értendő; dőlt betűvel jelzett értékek nem kvantitatív adatok, az átlagba nem számítottak; **His és **Tyr=His-2 és Tyr-2 formában mértek, kivéve ahol dupla csillaggal jelöltek [az adatok a His-1+His-2 és a Tyr-1+Tyr-2 összegéből számítottak: His-2/His-1=3,3:1 és Tyr-2/Tyr-1=3,2:1 (5.1.9 fejezetben részletezett)].
82
Az eredményekből következik, hogy a reakcióelegy FMOC koncentrációja legalább 3 mM kell, legyen: az aminosavak származékképzése teljes, valamint a His-1 és a Tyr-1 mennyiségileg átalakulnak His-2-vé és Tyr-2-vé (13. táblázat). 1,5 mM esetében a két dikarbonav és a két savamid aminosav reakciója nem kvantitatív; 0,5 mM esetében az előbbiek mellett a Ser, a Thr, az Arg reakciója sem teljes; valamint a His és a Tyr értéke számított a His-1 + His-2 és a Tyr-1 + Tyr-2 válaszjeleiből (5.1.9 fejezetben részletezett). Tehát a származékképzés kvantitatív, a válaszjelek reprodukálhatóak, a párhuzamos értékek mérési hibahatáron belül vannak, melyet relatív standard deviációval jellemeztem (13. táblázat, ≤5,2% RSD, átlaga 2,2% RSD). A plazma fehérjementesítése ACN-lel [plazma/ACN = 1:1 (v/v) arányban] és a PFAA meghatározása FMOC-származékokként külön lépésenként kidolgozott módszere ismert [144]. A két lépés együttesen 48 perc mintaelőkészítést vesz igénybe [144], ezt az időt az egyidejű módszeremmel 30 percre csökkentettem.
5.3.3 A módszer validálása
Az
egy
lépésben
történő
fehérjementesítési
és
származékképzési
módszer
megbízhatóságának bizonyításaképpen vizsgáltam a plazma minták aminosav tartalmának visszanyerhetőségét, a mérések reprodukálhatóságát, valamint az FMOCaminosavak mennyisége és válaszjele közötti összefüggést (legalább három párhuzamos mérés átlagából számított értékek, 14. és 15. táblázat). Az
aminosav-származékok
válaszjeleit
(i.e./pmól-ban
kifejezettek)
értékelve
elmondható: a) A különböző koncentrációjú aminosav standard oldatok eredményei között az összefüggés lineáris (14. táblázat, 2,5 és 80 pmól/ aminosav/ injektált térfogat között számított regressziós koefficiens: 0,98156 ≤ r ≤ 0,99999). b) Az 1-es számú beteg plazmájához hozzáadott aminosav standard oldat viszonya szintén lineáris (14. táblázat, 5 és 40 pmól/ aminosav/ injektált térfogat között számított regressziós koefficiens: 0,98700 ≤ r ≤ 0,99998).
83
14. táblázat: Különböző mennyiségű aminosavak reprodukálhatósága, standard oldatokból, az 1-es számú beteg plazmájához hozzáadott standard oldatokból, valamint az eltérően hígított plazma mintából, FMOC-származékokként Amino savak Injektált pmól Asp Glu Hyp Asn Gln Ser Arg Gly Thr Ala Pro GABA Val Met Ile Leu Phe (Cys)2 His Orn OrnUV Lys LysUV TyrUV
80 96,9 96,5 98,6 87,8 64,1 102 94,5 104 104 122 98,2 105 89,1 81,2 95,3 102 99,4 4,92 41,9 + 2,55 + 3,06 2,69
Integrátor egység/pmól Plazma (15x hígított) + As RSD Standard oldat Átlag standard oldat % 40 20 10 5 2,5 40 20 10 5 96,6 101 96,1 87,3 64,7 105 93,5 105 103 124 98,1 104 89,1 80,3 94,9 102 99,7 4,92 40,3 172 2,56 216 3,02 2,67
100 103 96,6 87,5 65,7 104 94,7 104 107 123 98,6 107 92,7 83,5 99,4 104 100 4,88 41,1 176 2,56 219 3,13 2,74
96,5 99,4 101 87,7 65,8 104 93,9 107 104 118 95,3 107 94,6 84,5 98,3 105 103 4,90 42,3 180 2,60 218 2,96 2,76
101 106 96,1 89,5 64,8 105 91,6 108 108 118 96,8 105 89,2 80,5 96,9 104 105 4,96 41,1 169 2,63 212 2,92 -
100 100 102 96,3 96,2 102 98,4 102 101 87,4 87,9 91,5 64,2 66,7 63,3 105 102 105 94,5 90,8 94,2 107 106 109 104 103 107 123 117 121 96,0 96,6 101 105 108 106 92,2 92,6 95,9 81,0 82,0 84,9 95,8 95,7 95,6 102 102 107 101 103 108 5,05 5,08 41,6 40,2 44,0 174 + 180 2,50 2,60 217 + + 3,17 3,14 2,63* 2,77*
100 98,7 103 89,9 65,5 106 91,5 107 117 98,1 104 92,4 83,3 98,6 106 106 4,68 44,2 181 2,56 216 2,99 2,80*
101 102 98,8 88,3 90,7 108 91,9 80,6 96,2 105 104 4,98 40,9 172 2,72 215 2,96 -
99,5 100 99,2 88,5 65,0 104 93,0 106 106 120 97,6 106 92,0 82,2 96,7 104 103 4,93 41,8 176 2,59 216 3,04 2,72
Talált [µmól/l] Hígított plazma 30x
1,9 40,1 3,3 167 2,5 14,7 1,6 42,9 1,6 468 1,3 170 1,8 155 1,7 369 2,1 92,6 2,4 274 1,7 111 1,3 LOQ 2,5 153 2,1 16,9 1,6 43,9 1,8 99,1 2,8 65,0 2,4 171 3,3 77,2 2,5 92,0 2,4 LOQ 1,0 122 3,1 LOQ 2,4 34,2
15x
Átlag
RSD %
7,5x
39,8 38,4 39,4 2,2 165 165 166 0,69 14,0 13,5 14,1 4,0 41,4 42,1 42,1 1,7 476 476 473 0,98 171 171 171 0,34 156 158 156 0,98 368 363 366 0,88 95,1 94,9 94,2 1,5 271 273 272 0,56 110 109 110 0,91 LOQ LOQ LOQ 149 148 1,7 150 16,1 15,7 16,2 3,9 46,1 47,9 46,0 4,4 95,6 95,7 96,8 2,0 63,2 63,7 64,0 1,5 174 179 2,3 175 71,7 72,1 73,7 4,1 91,5 + 91,5 0,63 LOQ 90,9 LOQ 122 + 122 0,47 122,1 LOQ LOQ 35,6 36,8* 35,5 3,7
Jelölések: mint a 13. táblázatban, továbbá As=aminosavak; dőlt betűvel jelzett értékek UV felvételből számítottak (OrnUV, LysUV); +=FL intenzitás a detektálási határon túl esik; *=a Tyr Tyr-2 formában mért, kivéve a csillaggal jelölt adatokat, ahol a Tyr-1+Tyr-2 összegéből számítottak (Tyr-2/Tyr1(UV)=1,66:1); -=nem szignifikáns válaszjel az alacsony intenzitás vagy a kiindulási nagy mennyiségű aminosav miatt.
84
c) Az 1-es számú beteg különböző mértékben hígított plazma mintájából készült aminosav-származékok válaszjelei a hígítással arányosan változnak (14. táblázat utolsó öt oszlopa). d) Az 1-es számú beteg 15-szörösére hígított plazma mintájához különböző mennyiségben hozzáadott aminosavak visszanyerhetőek, átlaguk 100,8% (15. táblázat).
15. táblázat: A páciens 1 15-szörösére hígított plazma mintához hozzáadott aminosavak visszanyerhetősége Aminosavak Asp Glu Hyp Asn Gln Ser Arg Gly Thr Ala Pro GABA Val Met Ile Leu Phe (Cys)2 His Orn Lys Tyr
Visszanyerhetőség, % RSD% Hozzáadott As/ injektált tf. Átlag 40 pmól 20 pmól 10 pmól 5 pmól 104 102 104 100 1,5 102 95,4 99,1 99,3 95,7 2,2 97,4 107 105 101 103 2,2 104 101 105 103 98,6 2,5 102 103 96,4 99,5 3,3 99,6 96,6 101 102 3,0 100 97,2 99,4 97,5 99,0 1,1 98,3 101 105 2,2 103 100 100 102 99,5 1,2 101 94,6 98,3 99,5 2,6 97,5 98,5 102 103 2,4 101 104 99,1 96,9 3,7 100 104 104 97,7 103 2,8 102 102 102 98,5 100 1,7 101 101 96,2 100 99,3 2,1 99,2 100 103 101 101 1,1 101 103 107 103 98,3 3,6 103 103 104 95,4 100 3,8 101 99,6 107 104 99,4 3,7 103 97,6 105 101 101 2,9 101 105 100 99,4 101 2,4 102 98,5 101 101 1,6 100
Jelölések: mint a 14. táblázatban. Az értékek reprodukálhatósága relatív standard deviációval jellemzett, a kidolgozott módszer alkalmazhatósága bizonyított, átlaguk a felsorolás rendjében a), b) 3,3% RSD (14. táblázat 13. oszlopa); c) 4,4% RSD (14. táblázat, utolsó oszlop); d) 2,4% RSD (15. táblázat).
85
5.3.4 Emlőrákos betegek plazma szabad aminosav tartalma műtét előtt és után
11 emlőrákos nőbeteg PFAA szintjét mértem közvetlenül műtét előtt és 3 héttel műtét után (31. ábra, 16. táblázat). Reprodukálható és megbízható méréseim alapján (16. táblázat, átlag: 2,1% és 3,0% RSD) az alábbi következtetések vonhatók le: a) Az irodalmi adatoknak megfelelően számottevő különbséget az aminosavak plazma szintjében műtét előtt és után nem találtunk [174,186], mely tumor jelölő vegyületként szolgálhatna. b) A 11 beteg aminosav szintje jelentős egyéni változatosságot mutat, széles tartományt ölel fel, mely a legkisebb és a legnagyobb mért értékkel jellemzett mind műtét előtt, mind műtét után (16. táblázat, negyedik és hetedik oszlop). c) A mért plazma aminosavak összegének halvány növekménye minden beteg esetében megfigyelt: mind az átlagban (műtét előtt: 2849 µM; műtét után: 2967 µM), mind a sorozatban (műtét előtt: 2178-3479 µM; műtét után: 2300-3836 µM).
86
Lys
FMOC-ADAM
Leu
His-2
Thr
Tyr-2
Pro Hyp
2 3
x x
Asn
0,2
Ser Arg
Glu
0,4
x
Orn
Val
Gln
0,6
FMOC-OH
Gly
1=Met 2=Ile 3=Phe 4=(Cys)2
0,8
Asp
Fluoreszcenciás intenzitás
Ala
mûtét elõtt mûtét után
1,0
1
x
4
0,0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
tR, perc
31. ábra: Az 1-es számú beteg PFAA tartalmának kromatogramja közvetlenül műtét előtt (piros vonal) és három héttel műtét után (fekete vonal) (II) oszlopon FL detektálás alapján; az FMOC-aminosavak optimális körülmények között készültek (pH 9, ACN tartalmú 3 mM FMOC reagens, 20 perc); grádiens elúció: 5. táblázat szerint
87
16. táblázat: 11 emlőrákos beteg plazmájának szabad aminosav tartalma közvetlenül műtét előtt és három héttel műtét után Aminosavak Asp Glu Hyp Asn Gln Ser Arg Gly Thr Ala Pro Val Met Ile Leu Phe Cys His Orn Lys Tyr Totál
Talált aminosavak [µmól/l] Műtét előtt Műtét után Átlag RSD%* (terjedelem) Átlag RSD%* (terjedelem) 3,4 (27,1 -79,6) 2,5 (25,4 – 75,1) 43,9 39,0 2,0 (118 – 228) 3,4 (108 – 266) 163 163 2,6 (3,90 - 26,9) 3,4 (6,51 – 23,2) 10,9 14,1 2,3 (29,8 – 54,8) 42,5 3,2 (28,4 – 60,9) 41,4 1,5 (365 – 598) 2,7 (215 – 566) 480 446 3,3 (94,0 – 187) 3,2 (82,7 – 220) 139 144 3,1 (89,5 – 234) 3,3 (99,7 – 195) 145 147 2,5 (164 – 401) 2,7 (134 – 430) 256 273 2,7 (68,5 - 125) 3,1 (61,3 – 157) 92,5 96,2 2,6 (177 – 464) 2,7 (199 – 487) 270 309 2,8 (105 – 391) 2,8 (117 – 399) 187 212 1,9 (141 – 234) 3,1 (152 – 301) 189 212 3,3 (12,0 - 24,4) 3,8 (14,4 – 31,7) 17,0 22,8 2,8 (37,0 – 61,8) 61,7 2,6 (45,3 – 84,7) 51,4 2,8 (74,2 – 167) 2,8 (83,0 – 181) 111 121 2,3 (48,2 – 114) 2,5 (51,0 – 120) 71,0 71,2 2,4 (122 -308) 4,2 (137 – 340) 208 201 3,3 (58,0 – 117) 3,5 (58,7 -127) 79,2 92,9 2,7 (61,5 – 117) 2,5 (63,3 – 119) 90,8 87,6 2,1 (122 – 208) 2,3 (136 – 212) 170 171 1,9 (24,4 - 50,8) 3,3 (26,1 – 57,4) 33,6 39,9 (2178 – 3479) 2967 (2300 - 3836) 2849
Jelölések: mint a 13. és a 14. táblázatban, továbbá *=az RSD% az egyes minták legalább három párhuzamos mérések RSD%-ainak átlaga.
88
6. Összehasonlító tanulmány: az aminosavak meghatározása OPA/tiol, OPA+FMOC, valamint FMOC származékképző szerekkel Az ELTE kutatócsoportja Perlné Dr. Molnár Ibolya irányítása alatt tíz éve foglalkozik aminosavak különböző származékokkénti meghatározásával. Az elmúlt tíz évben a leggyakrabban (36%-a az összesnek) alkalmazott származékképző reagens, az OPA és valamilyen tiol tartalmú segédanyag részletes vizsgálatába, valamint az OPA+FMOC kétlépcsős származékkészítési meghatározásba kapcsolódtam be, majd egy módszert fejlesztettem az aminosavak FMOC-származékokkénti elemzéséhez (5. fejezetben részletezett). Ebben a fejezetben a három módszer - az OPA és valamilyen tiol tartalmú segédanyag (5.ábra), az OPA+FMOC kétlépcsős eljárás, valamint az FMOC reagenssel származékképzés
(6.ábra;
továbbiakban
a
felsorolás
rendjében
„OPA/tiol”,
„OPA+FMOC”, „FMOC”) - összehasonlító tanulmányát mutatom be a különböző szempontok szerint, melyek a következőek (17. táblázat): 1. a reagensek jellemzői; 2. a reakció, valamint a képződő fő- és melléktermékek jellemzői; 3. az elválasztás gyakorlati tapasztalatai; 4. alkalmazhatóság a különböző biológiai mátrixok esetében, összegzés.
89
17. táblázat: Az ELTE kutatócsoportja által kidolgozott „OPA/tiol”-, „OPA+FMOC”- , „FMOC”-módszer összehasonlítása az aminosavak származékokkénti meghatározására, a reagens, a reakció és a keletkezett termékek jellemzői alapján Összehasonlítási szempontok
Mért vegyület
elkészítése Reagens stabilitása
kivitelezés Reakciókörülmények
puffer típusa/pH idő hőfok Származékok stabilitása másodlagos termék(ek) Reagensképződése felesleg elválasztás során zavaró hatás Műveleti üres csúcsok FL hullámhossz, nm Spektrális UV absz.max., tulajdonság nm RR érték Érzékenység (LOQ; FL) aminosavak
Egynél több származékot adó termékek
Vizsgált származékképző szerek OPA/tiol OPA+FMOC FMOC 1.lépés: OPA, primer-, 2.lépés: primer és primer amino FMOC, szekunder csoport szekunder amino amino csoport csoport OPA r.: sz. OPA OPA r. mint FMOC r.: sz. MeOH-ban oldva OPA/tiol; FMOC FMOC-Cl + puffer + tiol r.: sz. FMOC-Cl ACN-ben segédanyag ACN-ben oldva oldva OPA r.: 2 nap; 2 nap FMOC r.: 6 hónap 6 hónap 3 lépés: puffer 2 lépés: OPA r. + 1 lépés: OPA r. + FMOC r. + FMOC r. ADAM borát/9-10 borát/10 borát/8-9 1 perc 1 + 1 perc 20 + 1 perc szobahőfok szobahőfok szobahőfok 6 óra 6 óra/ 13 nap 13 nap van
van
nincs
nincs
nincs
van
vannak
vannak ex: 330/ em: 460; ex: 263/ em: 313
vannak ex: 254/ em: 313
334
334, 262
262
5,87 30 pmól Orn, Lys, Gly, His
5,87/ 79,5* 30 pmól -
csúcsterületek
összege állandó
-
egy-egy származékot adjanak
80% MeOH tartalmú reagens
-
70,9 2,5 pmól His, Tyr arányuk állandó nagyobb FMOC konc, hosszabb reakcióidő
ex: 330/ em: 460
mérés közben hullámhosszt kell feleslegelvétel Megjegyzés váltani a FL szükséges detektoron Jelölések: sz.=szilárd; r.=reagens; RR=FL válaszjel/UV válaszjel; *=FMOC-Pro és FMOC-Hyp átlaga; absz.max.=abszorpciós maximum; LOQ=mennyiségi mérés határértéke, FL detektálás esetén. fehérjealkotó Pro, Hyp nem mérhető
90
6.1 A reagensek jellemzői Az OPA és valamely tiol tartalmú segédanyag, valamint az FMOC reagens (a) elkészítésének módját és időigényét, valamint (b) a kész reagensek eltarthatóságát hasonlítom össze. a) A reagensek elkészítésének módja és időigénye: Az OPA/tiol reagens elkészítése többlépcsős folyamat, melynek során a megfelelő mennyiségű MeOH-ban oldott OPA-t kell elegyíteni 1:4 térfogatarányban borát pufferrel (pH 9,3), valamint a tiol tartalmú segédanyaggal. Az összetétel adott mólarányú: OPA/tiol = 1:10. Az elkészítési idő átlagosan 30 perc. Az FMOC reagens elkészítése egy lépésből áll: a megfelelő mennyiségű szilárd FMOC-Cl-ot ACN-ben kell oldani, mely 10 percet vesz igénybe. A reagensek összetevőinek minősége és aránya hosszas kutatómunka eredményeképpen adott. b) A reagensek eltarthatósága: Az OPA reagens 2 napig, az FMOC reagens 6 hónapig tartható el hűtőszekrényben (4ºC).
6.2 A reakció, valamint a képződött fő- és melléktermékek jellemzői
Az alábbi pontokban a három módszer reakcióinak gyakorlati vonatkozásait, azaz (a) a mérhető
vegyületeket,
(b)
a
gyakorlati
megvalósítást,
(c)
a
kvantitatív
származékképzéshez szükséges reakciókörülményeket és -időt, (d) a reakció során keletkező fő- és melléktermékek jellemzőit hasonlítom össze. a) A mérhető vegyületek: Az OPA csak primer amino csoporttal reagál. Az „OPA/tiol” ezen hiányosságát küszöböli ki az „OPA+FMOC”, melynek során a második lépésben az FMOC reagál a szekunder amino csoportú Pro-nal és Hypnal. Következésképpen az OPA reagens kiiktatásával az „FMOC” esetében egy lépésben meghatározhatóak mind a primer, mind a szekunder amino csoportú aminosavak. b) A gyakorlati megvalósítás: Az „OPA/tiol” és az „OPA+FMOC” esetében az OPA reagens tartalmazza a puffert, melyet „FMOC” esetében (pH 9) a modell oldattal/mintával kell elegyíteni. Ezt követi az FMOC reagens hozzáadása, majd
91
a reagensfelesleg eltávolítása. Az „OPA+FMOC” esetében jóllehet, a puffert nem kell külön elegyíteni, de két reagens alkalmazása szükséges. Tehát a származékképzési reakció „OPA/tiol” esetében 1 lépésben, „OPA+FMOC” esetében 2 lépésben, míg FMOC esetében 3 lépésben kivitelezhető. c) A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakciókörülmények és –idő:
Mind az OPA-, mind az FMOC reakciója aminosavakkal enyhén lúgos közegben (rendre pH 9,3 és pH 9 értékű az alkalmazott puffer), adott arányú szerves oldószer tartalmú vizes oldatban teljes.
A származékképzési reakció sebességét az OPA/tiol esetében az [OPA]/[aminosav]T mólarány, FMOC esetében a reagens abszolút koncentrációja határozza meg ([FMOC]/[aminosav]T ≥ 5,5:1) a vizsgált analitikai tartományban.
Az amino csoport reakciója OPA-val szobahőfokon gyors (1 perc), FMOCcal a reagens koncentrációjától függően 1-20 perc.
d) A reakció során keletkező fő- és melléktermékek jellemzői: Az OPA és tiol tartalmú segédanyagok feleslege másodlagos termékek keletkezéséhez vezet: a Gly, az Orn, a Lys és a His izoindolszármazékával reagál a második OPA. A képződött másodlagos termékek instabilak, a kromatogramon 7 perc után mérhetőek a bomlástermékek. Az egy OPA-val reagáló származékok nagyobb stabilitásúak (6 óra). Az FMOC esetében a His, a Tyr, az Orn és a Lys két FMOC-cal reagál. Mind a di-származékok, a His-t kivéve, mind az egy FMOC-cal reagáló származékok 13 napig
stabilak.
melléktermék
Az
FMOC
(FMOC-OH)
mellékreakciója, keletkezik.
hidrolízise
Következésképpen
során a
zavaró
kvantitatív
származékképzési reakció után az FMOC felesleg további hidrolízisét megakadályozandó, a reagensfelesleget el kell távolítani.
92
6.3 A származékok elválasztásának gyakorlati tapasztalatai
Az alábbi fejezetben a kromatográfiás művelet során tapasztaltakat összegzem, úgymint (a) a műveleti üres csúcsok (és az FMOC-OH), valamint (b) a több reagens molekulával reagáló aminosavak kérdése, (c) a keletkezett származékok érzékenysége (FL/UV), (d) egyéb szükséges művelet. a) A műveleti üres csúcsok: Kutatócsoportunk bizonyította, hogy mindhárom módszer esetében a reagensből származó, az aminosav-származékokkal együttesen eluálódó műveleti üres csúcsok mennyiségi mérése pmól tartományban alapvetően nélkülözhetetlen. Az FMOC hidrolízisének terméke, az FMOC-OH széles csúcsként eluálódik a kromatogram közepén, mely a szomszédos FMOC-aminosavak elválasztását zavarja. b) A több reagens molekulával reagáló aminosavak kérdése: „OPA/tiol” és „OPA+FMOC” esetében a két OPA-val reagáló Gly, Orn, Lys és His 7 perc után több csúccsal eluálódik a kromatogramon, az egy aminosavhoz tartozó csúcsok összege 6 óráig állandó. „FMOC” esetében az Orn, a Lys és a Tyr di-származékai 13 napig stabilak, a diHis 60 perc után elkezd bomlani mono-His-né. Az Orn és a Lys esetében a második FMOC belépése ilyen mérési metodika mellett olyan gyors, hogy a kromatogramon nem mutatható ki több csúcs. A His és a Tyr esetében a monoés a di-származékok jóllehet, eltérő intenzitásúak, de az arányuk állandó, így értékük számítható. c) A keletkezett származékok érzékenysége (FL/UV): Az OPA-származékok FL- és UV válaszjelének aránya, RROPA = 5,87; az FMOC-származékok esetében RRFMOC = 70,9 azonos mérési körülmények között (ugyanazon készüléken mért értékek alapján, azonos érzékenységre beállítva). Az FMOC-származékoknak FL detektálás esetén a mennyiségi mérés határértéke 12-szerese az OPAszármazékoknak (LOQOPA-származék = 30 pmól; LOQFMOC-származék = 2,5 pmól). FMOC-származékok közül kivételt képez a Trp és a (Cys)2 származéka, melyek FL válaszjele igen alacsony (LOQCys = 10 pmól; LOQTrp = 10 pmól). d) Egyéb szükséges művelet: A kétlépéses „OPA+FMOC” esetében hullámhosszváltást kell beiktatni az FMOC-Pro és FMOC-Hyp eluálódásakor.
93
6.4 Alkalmazhatóság a különböző biológiai mátrixok esetében, összegzés
A fent részletezett tapasztalatok alapján összegzem az „OPA/tiol”-, az „OPA+FMOC”-, valamint az „FMOC”-módszerek gyakorlati alkalmazhatóságának előnyeit, valamint hátrányait. Az „OPA/tiol”-módszer előnye az „FMOC”-cal szemben, hogy a reagens felesleget nem kell eltávolítani, továbbá, az „OPA+FMOC”-cal is összehasonlítva, a reakció egy lépésben, gyorsan kivitelezhető. Hátránya, hogy a reagens elkészítése időigényes, a kész reagens rövid ideig tárolható, továbbá csak a primer amino csoporttal reagál, a keletkezett származékok instabilak. Biológiai minták meghatározása során a szekunder aminosavak (Pro és Hyp) és aminok nem mérhetőek, ezáltal kizárólagosan meghatározhatóak a primer aminosavak. Az „OPA+FMOC”-módszer „továbbfejlesztett” „OPA/tiol”-módszer: a szekunder aminosavak és aminok is mérhetőek a biológiai mátrixokban. A képződött izoindol- és fluorenil-származékok
eltérő
kémiai
szerkezetűek,
fluoreszcens
tulajdonságaik
különbözőek, következésképpen az optimális excitáció/emisszó hullámhossz-váltás beiktatása szükséges a FL detektoron. Az „FMOC”-módszer előnye az „OPA/tiol”-lal és az „OPA+FMOC”-cal szemben, hogy a reagens elkészítése egyszerű, sokáig eltartható, meghatározhatóak - egy lépésben - mind a primer, mind a szekunder aminosavak és aminok. Hátránya, hogy a reagensfelesleget el kell távolítani, valamint a kromatogramon megjelenő FMOC-OH megnehezíti a szomszédos FMOC-származékok elválasztását.
94
7. Összefoglalás, az értekezésben foglalt új tudományos eredmények Kutatómunkám során az aminosavak és a 9-fluorenil-metiloxi-karbonil-klorid (FMOCCl) reakciójának az irodalomban javasolt eltérő körülményeit tisztáztam. 1. Az FMOC és az aminosavak mennyiségi származékkészítése idejét, eltérő reakció feltételek között mértem. Sebesség-meghatározó aminosav az aszparaginsav. 2. Optimális mennyiségi származékképzési feltételeket javasoltam (pH 9 értékű borát puffer, ACN tartalmú 0,5 mM FMOC reagens, {[FMOC]/[aminosav]T = 5,5:1; szerves/vizes = 1:1 (v/v)}, 20 perc reakcióidő, reagensfelesleg elvétele 1aminoadamantánnal). 3. Igazoltam, hogy a mennyiségi származékká alakulás reakcióidejét az FMOC koncentrációja határozza meg: méréseim a 0,5 mM - 5 mM tartományban voltak. 4. Az [FMOC]/[aminosav]T mólviszonyt a 2,5:1 – 66:1 arányok szerint változtattam.
Kitűnt,
hogy
az
FMOC
felesleg
biztosítása
érdekében,
az
T
[FMOC]/[aminosav] ≥ 5,5:1 kell, legyen. 5.
Az
aminosav-származékokkal
együttesen
érkező
szennyezőket,
mennyiségileg, elsőként mértem. Mind FL, mind UV detektálással bizonyítottam, hogy számításba vételük elengedhetetlen. 6. Elsőként vizsgáltam és bizonyítottam, hogy az irodalomban megadott értékek, kivétel nélkül, a puffer és az aminosavak vizes elegyének pH értékére vonatkoznak (látszólagos pH). Az FMOC reagenssel elegyítés után a reakcióelegy pH értéke késedelem nélkül nő, majd órákig változatlan (valódi pH). Optimált mérési feltételek között, e növekmény értéke 1,6 pH egység, mely pH növekmény az FMOC reagens oldószerétől és a puffer oldat eredeti pH értékétől függően változik. 7. 22 FMOC-aminosavat, pH 7,20 értékű eluensekkel, elsőként választottam el. 8. A két terméket adó hisztidin (His-1, His-2) és tirozin (Tyr-1, Tyr-2) származékainak képződését és átalakulását mennyiségileg jellemeztem. 9. Egyidejű fehérjementesítési és származékképzési eljárást dolgoztam ki. A módszert a plazma szabad aminosav tartalmának meghatározására hasznosítottam.
95
8. Summary, new scientific statements In the frame of my studies the controversial points of literature data about the reaction conditions of amino acids and 9-fluorenylmethyloxycarbonyl-chloride (FMOC-Cl) have been critically evaluated. 1. The quantitative interaction between the amino acids and the FMOC reagent(s) has been determined under various conditions: aspartic acid proved to be the rate limiting amino acid. 2. The optimum derivatization conditions were defined (borate buffer pH 9, ACN containing 0.5 mM FMOC reagent, {[FMOC]/[amino acids]T = 5.5:1, solvent/water = 1:1 (v/v)}, reaction time 20 min, reagent excess elimination by 1-aminoadamantane). 3. It has been proved that the reaction time of the quantitative derivatization is determined by the FMOC concentration, while, 4. on the basis of derivatizations, performed under various molar ratios of the reactants {[FMOC]/[amino acids]T = 2.5:1 – 66:1}, it has been confirmed that the reaction rate could not been influenced by increasing these molar ratios. In addition, it turned out that in order to ensure the necessary FMOC excess the ratio of [FMOC]/[amino acids]T should be ≥ 5.5:1. 5. Impurities, coeluting with the FMOC-amino acids, have been quantified for the first time. Based both on FL and on UV detections it has been demonstrated that to take into consideration the amount of these impurities is inevitable necessary. 6. As to the intrinsic phenomenon of the pH values of the derivatization reactions, it has been studied and defined for the first time. It was shown that pH values, given in the literature, are related to the aqueous mixture of the buffer and the amino acids (apparent pH values). After mixing with the FMOC reagent, immediately, a considerable change in pH values takes place and pH proved to be constant after any time (real pH values). Under optimum derivatization conditions this increment of pH change proved to be 1.6 pH units. 7. The separation of 22 FMOC-amino acids was carried out by eluents of pH 7.2. 8. The formation and transformation of the single and two FMOC group containing derivatives of histidine (His-1, His-2) and tyrosine (Tyr-1, Tyr-2) have been quantitatively characterized. 9. The simultaneous deproteinization and derivatizations method was introduced and applied to the quantitative determination of the plasma free amino acids.
96
9. Irodalomjegyzék
9.1 Hivatkozott irodalmak jegyzéke 1.
2. 3. 4. 5. 6.
7. 8.
9.
10. 11. 12.
13.
14.
15.
Dixon HBF, Cornish-Bowden A, Liebecq C, Loening KL, Moss GP, Reedijk J, Velick SF, Vliegenthart JFG. (1984) Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides. Eur J Biochem, 138: 9-37. Kaspar H, Dettmer K, Gronwald W, Oefner P. (2009) Advances in amino acid analysis. Anal Bioanal Chem, 393: 445-452. Zumwalt RW, Kuo KCT, Gehrke CW. Amino Acid Analysis by Gas Chromatography. CrC Press, Boca Raton, Florida, 1987. Gehrke CW, Wixom RL, Bayer E. Chromatography: a Century of Discovery 1900-2000. Elsevier, Amsterdam, 2001. Gehrke CW, Zumwalt RW, Kuo KC, Ponnamperuma C, Shimoyama A. (1975) Search for Amino Acids in Returned Lunar Soil. Origins of Life, 6: 541-550. Kaiser FE, Gehrke CW, Zumwalt RW, Kuo KC. (1974) Amino acid analysis: Hydrolysis, ion-exchange cleanup, derivatization, and quantitation by gas-liquid chromatography. J Chromatogr, 94: 113-133. Wayne Moss C, Lambert MA, Diaz FJ. (1971) Gas-liquid chromatography of twenty protein amino acids on a single column. J Chromatogr A, 60: 134-136. Desgres J, Boisson D, Padieu P. (1979) Gas-liquid chromatography of isobutyl ester, N(O)-heptafluorobutyrate derivatives of amino acids on a glass capillary column for quantitative separation in clinical biology. J Chromatogr B, 162: 133-152. Coulter JR, Hann CS. (1968) A practical quantitative gas chromatographic analysis of amino acids using the n-propyl n-acetyl esters. J Chromatogr A, 36: 42-49. McGregor RF, Brittin GM, Sharon MS. (1973) Determination of urinary amino acids by gas chromatography. Clin Chim Acta, 48: 65-75. Dawson PSS. (1965) The intracellular amino acid pool of Candida utilis during growth in batch and continous flow cultures. Biochim Biophys Acta, 111: 51-66. Sassaki GL, Souza LM, Serrato RV, Cipriani TR, Gorin PAJ, Iacomini M. (2008) Application of acetate derivatives for gas chromatography-mass spectrometry: Novel approaches on carbohydrates, lipids and amino acids analysis. J Chromatogr A, 1208: 215-222. Darbre A, Blau K. (1965) Gas chromatography of volatile amino acid derivatives : I. Alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, serine and threonine. J Chromatogr A, 17: 31-49. Gamerith G. (1983) Gas-liquid chromatographic determination of N(O,S)trifluoroacetyl n-propyl esters of protein and nonprotein amino acids. J Chromatogr A, 256: 267-281. Gamerith G. (1983) Derivatization of amino acids to their N(O,S)-acyl alkyl esters for gas-liquid chromatographic determination. J Chromatogr A, 256: 326330.
97
16.
17. 18. 19.
20.
21.
22.
23. 24. 25.
26. 27. 28. 29. 30.
31.
32.
Gehrke CW, Leimer K. (1970) Trimethylsilylation of amino acids : Effect of solvents on derivatization using bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide. J Chromatogr A, 53: 201-208. Gehrke CW, Leimer K. (1971) Trimethylsilylation of amino acids derivatization and chromatography. J Chromatogr A, 57: 219-238. Wittmann C, Hans M, Heinzle E. (2002) In vivo analysis of intracellular amino acid labelings by GC/MS. Anal Biochem, 307: 379-382. Schwenk FW, Berg PJ, Beaufrere B, Miles JM, Haymond MW. (1984) Use of tbutyldimethylsilylation in the gas chromatographic/mass spectrometric analysis of physiologic compounds found in plasma using electron-impact ionization. Anal Biochem, 141: 101-109. Chaves das Neves HJ, Vasconcelos AMP. (1987) Capillary gas chromatography of amino acids, including asparagine and glutamine: sensitive gas chromatogaphic-mass spectrometric and selected ion monitoring gas chromatographic-mass spectrometric detection of the N,O(S)-tertbutyldimethylsilyl derivatives. J Chromatogr A, 392: 249-258. Katona ZF, Molnár-Perl I. (2000) GC-MS of amino acids as their trimethylsilyl/ t-butyldimethylsilyl derivatives: in model solutions III. Chromatographia, 51: S228-S236. Tao X, Liu Y, Wang Y, Qiu Y, Lin J, Zhao A, Su M, Jia W. (2008) GC-MS with ethyl chloroformate derivatization for comprehensive analysis of metabolites in serum and its application to human uremia. Anal Bioanal Chem, 391: 2881-2889. Husek P. (1991) Rapid derivatization and gas chromatographic determination of amino acids. J Chromatogr A, 552: 289-299. Kaspar H, Dettmer K, Gronwald W, Oefner PJ. (2008) Automated GC-MS analysis of free amino acids in biological fluids. J Chromatogr B, 870: 222-232. Husek P, Simek P, Hartvich P, Zahradnickova H. (2008) Fluoroalkyl chloroformates in treating amino acids for gas chromatographic analysis. J Chromatogr A, 1186: 391-400. Moore S, Spackman DH, Stein WH. (1958) Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins. An improved system. Anal Chem, 30: 1185-1190. Adams BA, Holmes EL. (1935) Absorptive properties of synthetic resins. J Soc Chem Ind, 54: 1T-6T. Ettre LS, Gehrke CW. (2006) The development of the amino acid analyzer. LCGC North America, 24: 390-400. Spackman DH, Stein WH, Moore S. (1958) Automatic Recording Apparatus for Use in Chromatography of Amino Acids. Anal Chem, 30: 1190-1206. Iwase H, Ozawa S, Ikuta M, Ono I. (1995) Determination of amino acids in human plasma by liquid chromatography with postcolumn ninhydrin derivatization using a hydroxyapatite cartridge for precolumn deproteination. J Chromatogr B, 663: 15-24. Csapó J, Csapó-Kiss Z, Martin TG, Folestad S, Orwar O, Tivesten A, Némethy S. (1995) Age estimation of old carpets based on cystine and cysteic acid content. Anal Chim Acta, 300: 313-320. Grunau JA, Swiader JM. (1992) Chromatography of 99 amino acids and other ninhydrin-reactive compounds in the Pickering lithium gradient system. J Chromatogr A, 594: 165-171.
98
33.
34. 35. 36.
37. 38.
39. 40.
41.
42.
43.
44. 45.
46.
47.
48.
Stein S, Böhlen P, Stone J, Dairman W, Udenfriend S. (1973) Amino acid analysis with fluorescamine at the picomole level. Arch Biochem Biophys, 155: 203-212. Roth M, Hampai A. (1973) Column chromatography of amino acids with fluorescence detection. J Chromatogr, 83: 353-356. http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_US&cid=513206. Boogers I, Plugge W, Stokkermans YQ, Duchateau ALL. (2008) Ultraperformance liquid chromatographic analysis of amino acids in protein hydrolysates using an automated pre-column derivatisation method. J Chromatogr A, 1189: 406-409. Pokol G, Sztatisz J. Analitikai kémia I. Műegyetemi Kiadó, Budapest, 2006: 17. fejezet. Demacker PNM, Beijers AM, van Daal H, Donnelly JP, Blijlevens NMA, van den Ouweland JMW. (2009) Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. J Chromatogr B, 877: 387-392. Schuster R. (1980) Determination of free amino acids by high performance liquid chromatography. Anal Chem, 52: 617-620. Petritis KN, Chaimbault P, Elfakir C, Dreux M. (1999) Ion-pair reversed-phase liquid chromatography for determination of polar underivatized amino acids using perfluorinated carboxylic acids as ion pairing agent. J Chromatogr A, 833: 147-155. Vandeberg PJ, Johnson DC. (1993) Pulsed electrochemical detection of cysteine, cystine, methionine, and glutathione at gold electrodes following their separation by liquid chromatography. Anal Chem, 65: 2713-2718. Thiele C, Gänzle MG, Vogel RF. (2002) Sample preparation for amino acid determination by integrated pulsed amperometric detection in foods. Anal Biochem, 310: 171-178. Tripp JA, McCullagh JSO, Hedges REM. (2006) Preparative separation of underivatized amino acids for compound-specific stable isotope analysis and radiocarbon dating of hydrolyzed bone collagen. J Sep Sci, 29: 41-48. Petritis K, Elfakir C, Dreux M. (2001) HPLC-CLND for the analysis of underivatized amino acids. LC-GC Europe, 14: 389-395. Uchikura K. (2003) Determination of aromatic and branched-chain amino acids in plasma by HPLC with electrogenerated Ru(bpy)33+ chemiluminescence detection. Chem Pharm Bull, 51: 1092-1094. Chaves das Neves HJ, Morais ZB. (1997) HPLC assay of underivatized free amino acids with column switching and evaporative light-scattering detection. J High Resolut Chromatogr, 20: 115-118. Chaimbault P, Petritis K, Elfakir C, Dreux M. (1999) Determination of 20 underivatized proteinic amino acids by ion-pairing chromatography and pneumatically assisted electrospray mass spectrometry. J Chromatogr A, 855: 191-202. Chaimbault P, Petritis K, Elfakir C, Dreux M. (2000) Ion-pair chromatography on a porous graphitic carbon stationary phase for the analysis of twenty underivatized protein amino acids. J Chromatogr A, 870: 245-254.
99
49.
50.
51.
52. 53.
54.
55. 56.
57.
58.
59.
60.
61. 62. 63.
Gómez-Ariza JL, Villegas-Portero MJ, Bernal-Daza V. (2005) Characterization and analysis of amino acids in orange juice by HPLC-MS/MS for authenticity assessment. Anal Chim Acta, 540: 221-230. Jander G, Norris SR, Joshi V, Fraga M, Rugg A, Yu S, Li L, Last RL. (2004) Application of a high-throughput HPLC-MS/MS assay to Arabidopsis mutant screening; evidence that threonine aldolase plays a role in seed nutritional quality. Plant J, 39: 465-475. Piraud M, Vianey-Saban C, Bourdin C, Acquaviva-Bourdain C, Boyer S, Elfakir C, Bouchu D. (2005) A new reversed-phase liquid chromatographic/tandem mass spectrometric method for analysis of underivatised amino acids: evaluation for the diagnosis and the management of inherited disorders of amino acid metabolism. Rapid Commun Mass Spectrom, 19: 3287-3297. Gray WR, Hartley BS. (1963) The structure of a chymotryptic peptide from pseudomonas cytochrome c-551. Biochem J, 89: 379-380. Takeuchi T, Nagae N. (1992) Enantiomeric resolution of dansyl phenylalanine and analogs by microcolumn liquid chromatography with gamma-cyclodextrin as mobile phase additive. J High Resolut Chromatogr, 15: 121-123. Takeuchi T, Miwa T. (1994) Effect of cyclodextrin as mobile phase additive on fluorescence intensity of dansylamino acids in microcolumn liquid chromatography. Anal Chim Acta, 292: 275-279. Molnár-Perl I. Quantitation of amino acids and amines by chromatography: methods and protocols. Elsevier, Amsterdam, 2005. Martins AR, Padovan AP. (1996) A practical approach to improve the resolution of dansyl-amino acids by high-performance liquid chromatography. J Liq Chromatogr Related Technol, 19: 467-476. Takeuchi T, Miwa T. (1995) Effect of sodium dodecyl sulfate as stationary phase on signal intensities of dansylamino acids in microcolumn liquid chromatography with on-column fluorimetric detection. J Chromatogr A, 696: 185-192. Takeuchi T, Miwa T. (1995) Fluorescence enhancement of dansylamino acids by bovine serum albumin as mobile phase additive in microcolumn liquid chromatography. Chromatographia, 40: 159-162. Kang X, Xiao J, Huang X, Gu Z. (2006) Optimization of dansyl derivatization and chromatographic conditions in the determination of neuroactive amino acids of biological samples. Clin Chim Acta, 366: 352-356. Wang Y, Kang X-J, Ge W-H, Sun X-Z, Peng J. (2007) Simple, Rapid, and Accurate RP-HPLC Method for Determination of Cystine in Human Urine after Derivatization with Dansyl Chloride. Chromatographia, 65: 527-532. Lin JK, Chang JY. (1975) Chromophoric labeling of amino acids with 4dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonyl chloride. Anal Chem, 47: 1634-1638. Lin JK, Wang CH. (1980) Determination of urinary amino acids by liquid chromatography with "dabsyl chloride". Clin Chem, 26: 579-583. Yang C-Y, Yang T, Yeh BK. (1993) Liquid chromatographic analysis of amino acids: Using dimethylamino-azobenzenesulfonyl chloride and hypersil ODS column to analyze the composition of apo B peptides. J Protein Chem, 12: 1114.
100
64.
65.
66.
67.
68.
69. 70.
71.
72.
73.
74.
75. 76.
77.
Gorbics L, Urge L, Otvos L. (1994) Comparative and optimized dabsyl-amino acid analysis of synthetic phosphopeptides and glycopeptides. J Chromatogr A, 676: 169-176. Krause I, Bockhardt A, Neckermann H, Henle T, Klostermeyer H. (1995) Simultaneous determination of amino acids and biogenic amines by reversedphase high-performance liquid chromatography of the dabsyl derivatives. J Chromatogr A, 715: 67-79. Syu K-Y, Lin C-L, Huang H-C, Lin J-K. (2008) Determination of Theanine, GABA, and Other Amino Acids in Green, Oolong, Black, and Pu-erh Teas with Dabsylation and High-Performance Liquid Chromatography. J Agric Food Chem, 56: 7637-7643. Oliveira AP, Pereira DM, Andrade PB, Valentao P, Sousa C, Pereira JA, Bento A, Rodrigues MA, Seabra RM, Silva BM. (2008) Free Amino Acids of Tronchuda Cabbage (Brassica oleracea L. Var. costata DC): Influence of Leaf Position (Internal or External) and Collection Time. J Agric Food Chem, 56: 5216-5221. Zimmerman CL, Apella E, Pisano JJ. (1977) Rapid analysis of amino acid phenylthiohydantoins by high-performance liquid chromatography. Anal Biochem, 77: 569-573. Molnár-Perl I. (1994) Advances in the high-performance liquid chromatographic determination of phenylthiocarbamyl amino acids. J Chromatogr A, 661: 43-50. Morvai M, Fábián V, Molnár-Perk I. (1992) Buffer and pH dependence of the retention of phenylthiocarbamylamino acids in reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 600: 87-92. Cohen SA, Michaud DP. (1993) Synthesis of a fluorescent derivatizing reagent, 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate, and Its application for the analysis of hydrolysate amino acids via high-performance liquid chromatography. Anal Biochem, 211: 279-287. Cohen SA, De Antonis KM. (1994) Applications of amino acid derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate : Analysis of feed grains, intravenous solutions and glycoproteins. J Chromatogr A, 661: 25-34. Bosch L, Alegría A, Farré R. (2006) Application of the 6-aminoquinolyl-Nhydroxysccinimidyl carbamate (AQC) reagent to the RP-HPLC determination of amino acids in infant foods. J Chromatogr B, 831: 176-183. Reverter M, Lundh T, Lindberg JE. (1997) Determination of free amino acids in pig plasma by precolumn derivatization with 6-N-aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidyl carbamate and high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B, 696: 1-8. Roth M. (1971) Fluorescence reaction for amino acids. Anal Chem, 43: 880-882. Hanczkó R, Jámbor A, Perl A, Molnár-Perl I. (2007) Advances in the ophthalaldehyde derivatizations: Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. J Chromatogr A, 1163: 25-42. Kutlán D, Presits P, Molnár-Perl I. (2002) Behavior and characteristics of amine derivatives obtained with o-phthaldialdehyde/3-mercaptopropionic acid and with o-phthaldialdehyde/N-acetyl-cysteine reagents. J Chromatogr A, 949: 235-248.
101
78.
79.
80.
81.
82.
83. 84.
85.
86. 87.
88.
89.
90.
91.
Molnár-Perl I, Bozor I. (1998) Comparison of the stability and UV and fluorescence characteristics of the o-phthaldialdehyde/3-mercaptopropionic acid and o-phthaldialdehyde/N-acetyl-cysteine reagents and those of their amino acid derivatives. J Chromatogr A, 798: 37-46. Molnár-Perl I, Vasanits A. (1999) Stability and characteristics of the ophthaldialdehyde/3-mercaptopropionic acid and o-phthaldialdehyde/N-acetylcysteine reagents and their amino acid derivatives measured by highperformance liquid chromatography. J Chromatogr A, 835: 73-91. Schuster R. (1988) Determination of amino acids in biological, pharmaceutical, plant and food samples by automated precolumn derivatization and highperformance liquid chromatography. J Chromatogr B, 431: 271-284. Kőrös Á, Varga Z, Molnár-Perl I. (2008) Simultaneous analysis of amino acids and amines as their o-phthalaldehyde-ethanethiol-9-fluorenylmethyl chloroformate derivatives in cheese by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 1203: 146-152. Kőrös Á, Hanczkó R, Jámbor A, Qian Y, Perl A, Molnár-Perl I. (2007) Analysis of amino acids and biogenic amines in biological tissues as their ophthalaldehyde/ethanethiol/fluorenylmethyl chloroformate derivatives by highperformance liquid chromatography: A deproteinization study. J Chromatogr A, 1149: 46-55. Carpino LA, Han GY. (1972) 9-Fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group. J Org Chem, 37: 3404-3409. Moye HA, Boning AJ. (1979) A versatile fluorogenic labelling reagent for primary and secondary amines: 9-fluorenylmethyl chloroformate. Anal Lett, 12: 25 - 35. Einarsson S, Josefsson B, Lagerkvist S. (1983) Determination of amino acids with 9-fluorenylmethyl chloroformate and reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr, 282: 609-618. Matzner M, Kurkjy RP, Cotter RJ. (1964) The chemistry of chloroformates. Chem Rev, 64: 645-687. Clapp CH, Swan JS, Poechmann JL. (1992) Identification of amino acids in unknown dipeptides: A derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate. J Chem Ed, 69: A122-A127. Gustavsson B, Betnér I. (1990) Fully automated amino acid analysis for protein and peptide hydrolysates by precolumn derivatization with 9-fluorenyl methylchloroformate and 1-aminoadamantane. J Chromatogr A, 507: 67-77. Haynes PA, Sheumack D, Kibby J, Redmond JW. (1991) Amino acid analysis using derivatisation with 9-fluorenylmethyl chloroformate and reversed-phase hogh-performance liquid chromatography. J Chromatogr, 540: 177-185. Hoeger U, Abe H. (2004) β-Alanine and other free amino acids during salinity adaptation of the polychaete Nereis japonica. Comp Biochem Physiol Mol Integr Physiol, 137: 161-171. Kirschbaum J, Luckas B, Beinert WD. (1994) Pre-column derivatization of biogenic amines and amino acids with 9-fluorenylmethyl chloroformate and heptylamine. J Chromatogr A, 661: 193-199.
102
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
101. 102.
103.
104.
Lozanov V, Petrov S, Mitev V. (2004) Simultaneous analysis of amino acid and biogenic polyamines by high-performance liquid chromatography after precolumn derivatization with N-(9-fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimide. J Chromatogr A, 1025: 201-208. Miller EJ, Narkates AJ, Niemann MA. (1990) Amino acid analysis of collagen hydrolysates by reverse-phase high-performance liquid chromatography of 9fluorenylmethyl chloroformate derivatives. Anal Biochem, 190: 92-97. Or-Rashid MM, R. Onodera, S. Wadud, Mohammed N. (2000) Convenient method of threonine, methionine and their related amino compounds by highperformance liquid chromatography and its application to rumen fluid. J Chromatogr B, 741: 279-287. Schilb LA, Fiegel VD, Knighton DR. (1990) Hydroxyproline measurement by high performance liquid chromatography: An improved method of derivatization. J Liq Chromatogr, 13: 557-567. Einarsson S, Folestad S, Josefsson B, Lagerkvist S. (1986) High-resolution reversed-phase liquid chromatography system for the analysis of complex solutions of primary and secondary amino acids. Anal Chem, 58: 1638-1643. Näsholm T, Sandberg G, Ericsson A. (1987) Quantitative analysis of amino acids in conifer tissues by high-performance liquid chromatography and fluorescence detection of their 9-fluorenylmethyl chloroformate derivatives. J Chromatogr, 396: 225-236. Keller H-J, Do KQ, Zollinger M, Winterhalter KH, Cuénod M. (1987) 9fluorenylmethoxycarbonylpyroglutamate, a side-product of derivatization of glutamate with 9-fluorenylmethyl Chloroformate: A warning. Anal Biochem, 166: 431-434. Fernández-Trapiella AC. (1990) Quantitative analysis of methionins, cysteine and lysine in feeds by reverse-phase liquid chromatography using precolumn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate: Preliminary study. J Assoc Off Anal Chem, 73: 935-939. Malmer M, Schroeder LA. (1990) Amino acid analysis by high-performance liquid chromatography with methansulfonic acid hydrolysis and 9fluorenylmethylchloroformate derivatization. J Chromatogr, 514: 227-239. Haynes PA, Sheumack D. (1991) Applications of automated amino acid analysis using 9-fluorenylmethyl chloroformate. J Chromatogr, 588: 107-114. Grzywacz CM. (1994) Identification of proteinaceous binding media in paintings by amino acid analysis using 9-fluorenylmethyl chloroformate derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 676: 177-183. Brückner H, Lüpke M. (1995) Use of chromogenic and fluorescent oxycarbonyl chlorides as reagents for amino acid analysis by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 697: 295-307. Bank RA, Jansen EJ, Beekman B, te Koppele JM. (1996) Amino acid analysis by reverse-phase high-performance liquid chromatography: Improved derivatization and detection conditions with 9-fluorenylmethyl chloroformate. Anal Biochem, 240: 167-176.
103
105.
106.
107.
108.
109.
110.
111. 112.
113.
114. 115. 116.
117.
118. 119. 120.
Ou K, Wilkins MR, Yan JX, Gooley AA, Fung Y, Sheumack D, Williams KL. (1996) Improved high-performance liquid chromatography of amino acids derivatised with 9-fluorenylmethyl chloroformate. J Chromatogr A, 723: 219225. Péter A, Tourwé D, Baumann MEM, Elskens M, Goeyens L. (1999) High performance liquid chromatographic determination of free amino acids in algae. J Liq Chromatogr Related Technol, 22: 1077-1093. Fabiani A, Versari A, Parpinello GP, Castellari M, Galassi S. (2002) Highperformance liquid chromatographic analysis of free amino acids in fruit juices using derivatization with 9-fluorenylmethyl-chloroformate. J Chromatogr Sci, 40: 14-18. López-Cervantes J, Sánchez-Machado DI, Rosas-Rodríguez JA. (2006) Analysis of free amino acids in fermented shrimp waste by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 1105: 106-110. Lozanov V, Benkova B, Mateva L, Petrov S, Popov E, Slavov C, Mitev V. (2007) Liquid chromatography method for simultaneous analysis of amino acids and biogenic amines in biological fluids with simultaneous gradient of pH and acetonitrile. J Chromatogr B, 860: 92-97. Jámbor A, Molnár-Perl I. (2009) Amino acid analysis by high-performance liquid chromatography after derivatization with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride: Literature overview and further study. J Chromatogr A, 1216: 30643077. Bates RG. Determination of pH, theory and practice. John Wiley and Sons, New York, 1973: 83. Ilisz I, Berkecz R, Péter A. (2008) Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: A review. J Pharm Biomed Anal, 47: 1-15. Betnér I, Földi P. (1986) New automated amino acids analysis by HPLC precolumns derivatization with fluorenylmethyloxycarbonylchloride. Chromatographia, 22: 381-388. Stahl E. Thin-Layer Chromatography. Springer, Berlin, 1969. Simion G, Liana G, Letitia G. (2001) TLC of some free amino acids from sanguine plasma. J Pharm Biomed Anal, 26: 681-685. Wawrzycki S, Pyra E. (2000) Detection, separation and analysis of α-amino acids by means of TLC using 4-diethylaminodiazabenzene-4′-isothiocyanate (DEABITC). Chromatographia, 51: S309-S312. Zakrzewski R, Ciesielski W, KaĹşmierczak D. (2002) Application of the iodineazide procedure for the detection of glycine, alanine and aspartic acid in planar chromatography. J Liq Chromatogr Related Technol, 25: 1599 - 1614. Alaiz M, Navarro J L, Giron J, Vioque E. (1992) Quantitative HPTLC analysis of dansyl amino acids. J Planar Chromatogr - Mod TLC, 5: 143-146. Das B, Shubhangi S. (1993) Quantitative HPTLC analysis of dansyl amino acids. J Planar Chromatogr - Mod TLC, 6: 294-295. Devenyi T, Bati J, Kovacs J, Kiss P. (1972) Thin-layer ion-exchange chromatographic screening test for aminoacidemias in blood samples dried on filter paper. Acta Biochim Biophys Hung, 7: 237-9.
104
121.
122.
123.
124.
125.
126. 127.
128.
129.
130.
131. 132.
133. 134.
135.
Yang Z, Rogers LM, Song Y, Guo W, Kolattukudy PE. (2005) Homoserine and asparagine are host signals that trigger in planta expression of a pathogenesis gene in Nectria haematococca. Proc Nat Acad Sci USA, 102: 4197-4202. Bhushan R, Mahesh VK, Varma A. (1994) Improved thin layer chromatographic resolution of PTH amino acids with some new solvent systems. Biomed Chromatogr, 8: 69-72. Norfolk E, Khan SH, Fried B, Sherma J. (1994) Comparison of amino acid separations on high performance silica gel, cellulose, and C-18 reversed phase layers and application of HPTLC to the determination of amino acids in Biomphalaria glabrata snails. J Liq Chromatogr, 17: 1317-1326. Dadoo R, Yan C, Zare RN, Anex DS, Rakestraw DJ, Hux GA. (1997) Advances towards the routine use of capillary electrochromatography. LC-GC Europe, 10: 164-174. Chiu TC, Chang HT. (2007) Stacking and separation of fluorescent derivatives of amino acids by micellar electrokinetic chromatography in the presence of poly(ethylene oxide). J Chromatogr A, 1146: 118-124. Thorntion MJ, Fritz JS, Klampfl CW. (1997) Separation of native amino acids at low pH by capillary electrophoresis. J High Resolut Chromatogr, 20: 647-652. Koval D, Jirásková J, Strísovský K, Konvalinka J, Kasicka V. (2006) Capillary electrophoresis method for determination of D-serine and its application for monitoring of serine racemase activity. Electrophoresis, 27: 2558-2566. Tang W-H, Muderawan IW, Ong T-T, Ng S-C. (2005) Enantioseparation of dansyl amino acids by a novel permanently positively charged single-izomer cyclodextrin: mono-6-N-alkylammonium-6-deoxy-ß-CD chlorid by capillary electrophoresis. Anal Chim Acta, 546: 119-125. Chan KC, Janini GM, Muschik GM, Issaq HJ. (1993) Laser-induced fluorescence detection of 9-fluorenylmethyl chloroformate derivatized amino acids in capillary electrophoresis. J Chromatogr A, 653: 93-97. Kostal V, Zeisbergerova M, Hrotekova Z, Slais K, Kahle V. (2006) Miniaturized liquid core waveguide-based fluorimetric detection cell for capillary separation methods: Application in CE of amino acids. Electrophoresis, 27: 4658-4665. Poinsot V, Rodat A, Gavard P, Feurer B, Couderc F. (2008) Recent advances in amino acid analysis by CE (Review). Electrophoresis, 29: 207-223. Moini M, Schultz CL, Mahmood H. (2003) CE/Electrospray ionization-MS analysis of underivatized d/l-amino acids and several small neurotransmitters at attomole levels through the use of 18-Crown-6-tetracarboxylic acid as a complexation reagent/background electrolyte. Anal Chem, 75: 6282-6287. Morton MRN, Soga T. (2007) Metabolome analysis by capillary electrophoresis–mass spectrometry. J Chromatogr A, 1168: 237-246. Lindner W, Böhs B, Seidel V. (1995) Enantioselective capillary electrophoresis of amino acid derivatives on cyclodextrin evaluation of structure-resolution relationships. J Chromatogr A, 697: 549-560. Wan H, Andersson PE, Engström A, Blomberg LG. (1995) Direct and indirect chiral separation of amino acids by capillary electrophoresis. J Chromatogr A, 704: 179-193.
105
136.
137. 138.
139.
140.
141. 142.
143.
144.
145.
146.
147.
148.
149.
Kurosu Y, Murayama K, Shindo N, Shisa Y, Ishioka N. (1996) Optical resolution of phenylthiohydantoin-amino acids by capillary electrophoresis and identification of the phenylthiohydantoin-amino acid residue of [-Ala2]methionine enkephalin. J Chromatogr A, 752: 279-286. Wren SAC. (1997) Mobility measurements on dansylated amino acids. J Chromatogr A, 768: 153-159. Tivesten A, Folestad S. (1997) Chiral o-phthaldialdehyde reagents for fluorogenic oncolumn labeling of D- and L-amino acids in micellar electrokinetic chromatography. Electrophoresis, 18: 970-977. Liu Y-M, Schneider M, Sticha CM, Toyooka T, Sweedler JV. (1998) Separation of amino acid and peptide stereoisomers by nonionic micelle-mediated capillary electrophoresis after chiral derivatization. J Chromatogr A, 800: 345-354. Caligiani A, Acquotti D, Palla G, Bocchi V. (2007) Identification and quantification of the main organic components of vinegars by high resolution 1H NMR spectroscopy. Anal Chim Acta, 585: 110-119. Nord LI, Vaag P, Duus JO. (2004) Quantification of organic and amino acids in beer by 1H NMR Spectroscopy. Anal Chem, 76: 4790-4798. Bharti S, Sinha N, Joshi B, Mandal S, Roy R, Khetrapal C. (2008) Improved quantification from 1H-NMR spectra using reduced repetition times. Metabolomics, 4: 367-376. Risa Ř, Margareta T, Sonnewald MU. (2009) Quantification of amounts and 13C content of metabolites in brain tissue using high- resolution magic angle spinning 13C NMR spectroscopy. NMR Biomed, 22: 266-271. Hussian-Yusuf H, Onodera R, Nasser MEA, Sato H. (1999) Simple method for the simultaneous analysis of pipecolic acid and lysine by high-performance liquid chromatography and its application to rumen liquor and plasma of ruminants. J Chromatogr B, 735: 63-72. Surarit R, Srisomsap C, Wasant P, Svasti J, Suthatvoravut U, Chokchaichamnankit D, Liammongkolkul S. (1999) Plasma amino acid analyses in two cases of maple syrup urine disease. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 30: 138-139. Suliman ME, Filho JCD, Barany P, Anderstam B, Lindholm B, Bergstrom J. (1999) Effects of High-Dose Folic Acid and Pyridoxine on Plasma and Erythrocyte Sulfur Amino Acids in Hemodialysis Patients. J Am Soc Nephrol, 10: 1287-1296. Stentiford GD, Neil DM, Coombs GH. (1999) Changes in the plasma free amino acid profile of the Norway lobster Nephrops norvegicus at different stages of infection by a parasitic dinoflagellate (genus Hematodinium). Dis Aquat Organ, 38: 151-157. Tipton KD, Gurkin BE, Matin S, Wolfe RR. (1999) Nonessential amino acids are not necessary to stimulate net muscle protein synthesis in healthy volunteers. J Nutr Biochem, 10: 89-95. Tcherkas YV, Denisenko AD. (2001) Simultaneous determination of several amino acids, including homocysteine, cysteine and glutamic acid, in human plasma by isocratic reversed-phase high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection. J Chromatogr A, 913: 309-313.
106
150.
151.
152.
153.
154.
155.
156.
157.
158.
159.
160.
161.
162.
163.
Araújo P, Wassermann GF, Tallini K, Furlanetto V, Vargas CR, Wannmacher CMD, Dutra-Filho CS, Wyse ATS, Wajner M. (2001) Reduction of large neutral amino acid levels in plasma and brain of hyperleucinemic rats. Neurochem Int, 38: 529-537. Suresh-Babu SV, Shareef MM, Pavan A, Shetty K, Shetty KT. (2002) HPLC method for amino acids profile in biological fluids and inborn metabolic disorders of aminoacidopathies. Indian J Clin Biochem, 17: 7-26. Yoshida Y, Ohiwa Y, Shimamura M, Izumi T, Yoshida S, Takahashi K, Miyairi S, Makimura M, Naganuma A. (2003) Optimum Conditions for Derivatization of Glutathione, Cysteine and Cysteinylglycine in Human Plasma with Ammonium 7-Fluorobenzo-2-Oxa-1,3-Diazole-4-Sulfonate for Accurate Quantitation by High-Performance Liquid Chromatography. J Health Sci, 49: 527-530. Bohe J, Low A, Wolfe RR, Rennie MJ. (2003) Human muscle protein synthesis is modulated by extracellular, not intramuscular amino acid availability: a doseresponse study. J Physiol, 552: 315-324. van de Merbel NC, Mentink CJAL, Hendriks G, Wolffenbuttel BHR. (2004) Liquid chromatographic method for the quantitative determination of Nεcarboxymethyllysine in human plasma proteins. J Chromatogr B, 808: 163-168. Zhang SM, Willett WC, Selhub J, Manson JE, Colditz GA, Hankinson SE. (2003) A prospective study of plasma total cysteine and risk of breast cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 12: 1188-1193. Schwarz EL, Roberts WL, Pasquali M. (2005) Analysis of plasma amino acids by HPLC with photodiode array and fluorescence detection. Clin Chim Acta, 354: 83-90. Grant SL, Shulman Y, Tibbo P, Hampson DR, Baker GB. (2006) Determination of D-serine and related neuroactive amino acids in human plasma by highperformance liquid chromatography with fluorimetric detection. J Chromatogr B, 844: 278-282. Cleal JK, Brownbill P, Godfrey KM, Jackson JM, Jackson AA, Sibley CP, Hanson MA, Lewis RM. (2007) Modification of fetal plasma amino acid composition by placental amino acid exchangers in vitro. J Physiol, 582: 871882. Frank MP, Powers RW. (2007) Simple and rapid quantitative high-performance liquid chromatographic analysis of plasma amino acids. J Chromatogr B, 852: 646-649. Glazev AA, Nefyodov LI. (2008) Changes in amino acid patterns of blood plasma in tumor patients with the anticancer drug NSC-631570: possible approaches to cancer diagnostics. Biomed Chem, 2: 318-324. Zhao X, Suo Y. (2008) LC determination of amino acids in rat plasma with fluorescence detection: Application to exercise physiology. Chromatographia, 67: 375-382. Mero A, Leikas A, Knuutinen J, Hulmi JJ, Kovanen V. (2009) Effect of strength training session on plasma amino acid concentration following oral ingestion of leucine, BCAAs or glutamine in men. Eur J Appl Physiol, 105: 215-223. Kondo K, Nakamura M, Nishioka R, Kawai S. (1985) Direct method for determination of valproic acid in serum by high performance liquid chromatography. Anal Sci, 1: 385-387.
107
164. 165.
166.
167.
168.
169.
170. 171.
172. 173.
174. 175. 176. 177.
178.
179.
Ralston PB, Strein TG. (1997) Deproteinization methods for serum protein removal. Microchem J, 55: 270-283. Bugnon D, Giannoni E, Majcherczyk P, Glauser MP, Moreillon P. (2002) Pitfalls in Cefepime Titration from Human Plasma: Plasma- and TemperatureRelated Drug Degradation In Vitro. Antimicrob Agents Chemother, 46: 36543656. Wang TK, Fuh MS. (1996) Determination of amphetamine in human urine by dansyl derivatization and high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. J Chromatogr B, 686: 285-290. Kage S, Kudo K, Ikeda H, Ikeda N. (2004) Simultaneous determination of formate and acetate in whole blood and urine from humans using gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B, 805: 113-117. David V, Barcutean C, Sora I, Medvedovici A. (2005) Determination of metformin in plasma derivatization and precipitation with acetic anhydride. Rev Roum Chem, 50: 269-276. Yamato S, Shinohara K, Nakagawa S, Kubota A, Inamura K, Watanabe G, Hirayama S, Miida T, Ohta S. (2009) High-performance liquid chromatography determination of ketone bodies in human plasma by precolumn derivatization with p-nitrobenzene diazonium fluoroborate. Anal Biochem, 384: 145-150. Dank M. (2001) A tumoros anorexia-cachexia szindróma. Magyar Onkológia, 45: 431-436. Kubota A, Meguid M, Hitch DC. (1992) Amino Acid Profiles Correlate Diagnostically With Organ Site in Three Kinds of Malignant Tumors. Cancer, 69: 2343-2348. Levin L, Gevers W. (1981) Metabolic alterations in cancer, Part II. Protein and fat metabolism. S Afr Med J, 59: 553-556. Okamoto N, Miyagi Y, Chiba A, Akaike M, Shiozawa M, Imaizumi A, Yamamoto H, Ando T, Yamakodo M, Tochikubo O. (2009) Diagnostic modeling with differences in plasma amino acid profiles between non-cachectic colorectal/breast cancer patients and healthy individuals. Int J Med Med Sci, 1: 001-008. Lai H-S, Lee J-C, Lee P-H, Wang S-t, Chen W-J. (2005) Plasma free amino acid profile in cancer patients. Semin Canc Biol, 15: 267-276. Ádám V, Dux L, Faragó A, Fésüs L, Machovich R, Mandl J, Sümegi B. Biokémia. Medicina Kiadó, Budapest, 2002: 246. Henderson JF, LePage GA. (1959) The nutrition of tumors: a review. Cancer Res, 19: 887-902. Proenza AM, Oliver J, Palou A, Roca P. (2003) Breast and lung cancer are associated with a decrease in blood cell amino acid content. J Nutr Biochem, 14: 133-138. Vissers YLJ, Dejong CHC, Luiking YC, Fearon KCH, Meyenfeldt MFv, Deutz NEP. (2005) Plasma arginine concentrations are reduced in cancer patients: evidence for arginine deficiency? Am J Clin Nutr, 81: 1142-1146. Porembska Z, Luboinski G, Chrzanowska A, Mielczarek M, Magnuska J, Baranczyk-Kuzma A. (2003) Arginase in patients with breast cancer. Clin Chim Acta, 328: 105-111.
108
180.
181. 182. 183. 184.
185.
186.
Brückner H, Langer M, Lüpke M, Westhauser T, Godel H. (1995) Liquid chromatographic determination of amino acid enantiomers by derivatization with o-phthaldialdehyde and chiral thiols Applications with reference to food science. J Chromatogr A, 697: 229-245. Furka Á. Szerves kémia. Tankönyvkiadó, Budapest, 1991: 840. Mathews AP, Walker S. (1909) The spontaneous oxidation of cystin and the action of iron and cyanides upon it. J Biol Chem, 6: 289-298. Mathews AP, Walker S. (1909) The action of metals and strong salt solutions on the spontaneous oxidation of cystein. J Biol Chem, 6: 299-312. Vasanits A, Molnár-Perl I. (1999) Temperature, eluent flow-rate and column effects on the retention and quantitation properties of phenylthiocarbamyl derivatives of amino acids in reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 832: 109-122. Riedl J, Moll F. (1986) Quantitative Bestimmung von Gelatine in Arzneizubereitungen durch HPLC mit fluorimetrischer Detektion. Arch Pharm, 319: 89-91. Minet-Quinard R, Praagh IV, Kwiatkowski F, Beaujon G, Feillel V, Beaufrére B, Bargnoux P-J, Cynober L, Vasson M-P. (2004) Pre- and postoperative aminoacidemia in breast cancer: A study vs. matched healthy subjects. Cancer Invest, 22: 203-210.
9.2 Saját közlemények jegyzéke 1.
Kőrös Á, Hanczkó R, Jámbor A, Qian Y, Perl A, Molnár-Perl I. (2007) Analysis of amino acids and biogenic amines in biological tissues as their ophthalaldehyde/ethanethiol/fluorenylmethyl chloroformate derivatives by highperformance liquid chromatography: A deproteinization study. J Chromatogr A, 1149: 46-55.
2.
Hanczkó R, Jámbor A, Perl A, Molnár-Perl I. (2007) Advances in the ophthalaldehyde derivatizations: Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. J Chromatogr A, 1163: 25-42.
3.
Jámbor A, Molnár-Perl I. (2009) Amino acid analysis by high-performance liquid chromatography after derivatization with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride: Literature overview and further study. J Chromatogr A, 1216: 30643077.
4.
Jámbor A, Molnár-Perl I. (2009) Quantitation of amino acids in plasma by high performance liquid chromatography: Simultaneous deproteinization and derivatization with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride. J Chromatogr A, 1216: 6218-6223.
109
10. Köszönetnyilvánítás Hálás köszönetemet szeretném ezúton is kifejezni témavezetőmnek, Perlné Dr. Molnár Ibolyának, aki nemzetközileg elismert szakmai tudásával segített. Munka iránti szeretete és szorgalma példaképet jelent számomra.
Köszönöm a Gyógyszertudományok Doktori Iskola elnökének, Dr. Szőke Évának a lehetőséget, hogy a Ph.D. tanulmányaimat elvégezhettem, továbbá a Semmelweis Egyetem Doktori Iskolának a nekem ítélt utazási támogatást és predoktori ösztöndíjat.
Köszönöm Dr. Záray Gyulának, hogy az ELTE TTK, Kémiai Intézet Analitikai Kémiai Tanszéken, vezetőként, fogadott.
Szeretném megköszönni Dr. Noszál Bélának a lehetőséget, hogy a Magyar Tudományos Akadémia Szerves és Gyógyszeranalitikai Munkabizottság ülésén bemutathattam doktori munkámat.
Köszönetemet nyilvánítom az Országos Onkológia Intézetnek a plazma mintákért, valamint a Richter Gedeon Centenáriumi Alapítványnak a számomra ítélt utazási támogatásért és ösztöndíjért.
Köszönet illeti Dr. Kursinszki Lászlót, Dr. Hanczkó Róbertet, Dr. Kőrös Ágnest, akik a HPLC rejtelmeibe bevezettek, továbbá Varga Zsolt okleveles vegyészt.
Köszönöm a biztatást a tanszék dolgozóinak és doktorandusztársaimnak.
Végül, de kiemelten szeretném köszönetemet kifejezni Férjemnek, Szüleimnek, Barbinak és barátaimnak, hogy szeretetteli hátteret biztosítanak számomra.
110
