A hisztamin és hisztamin H4 receptor hiányának hatása a dendritikus sejtek működésére

A hisztamin és hisztamin H4 receptor hiányának hatása a dendritikus sejtek működésére Doktori értekezés

Jelinek Ivett Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. László Valéria egyetemi docens, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Berki Tímea egyetemi docens, Ph.D. Dr. Dérfalvi Beáta egyetemi tanársegéd, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Prof. Dr. Oláh Imre egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Lányi Árpád egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Kiss András egyetemi adjunktus, Ph.D.

Budapest 2007

Tartalomjegyzék A dolgozatban használt rövidítések jegyzéke............................................................... 3 I. BEVEZETÉS ................................................................................................... 7 I.1 A dendritikus sejtek, és szerepük az immunológiai folyamatokban ....................... 7 I.2 A hisztamin felfedezése, bioszintézise, lebontása és alapvető funkciói ............... 14 I.2.1 A hisztamin jelátviteli mechanizmusai és főbb biológiai hatásai ...................... 15 I.2.1.1 Jelátvitel H1, H2 és H3 receptorokon keresztül.............................................. 17 I.2.1.2 Jelátvitel H4 receptoron keresztül ................................................................... 19 I.3 A hisztamin és a dendritikus sejtek kapcsolata ..................................................... 21 I.4 A hisztamin hatása a dendritikus sejtek működésére - kérdésfeltevés.................. 23 II. CÉLKITŰZÉSEK.......................................................................................... 25 III. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .................................................................... 26 III.1 Anyagok ............................................................................................................. 26 III.1.1 Állatok ............................................................................................................. 26 III.1.2 Primer sejtek, sejtkultúrák ............................................................................... 26 III.1.3 Kísérletek során alkalmazott médiumok ......................................................... 27 III.1.3 Pufferek és egyéb oldatok................................................................................ 28 III.1.4 Antitestek, mágneses gyöngyhöz konjugált antitestek, peptidek, ELISA....... 29 III.1.5 RNS izoláláshoz, tisztításhoz, átírásához és real time PCR-hez szükséges eszközök ..................................................................................................................... 30 III.1.6 Egyéb reagensek és eszközök.......................................................................... 31 III.2 Módszerek .......................................................................................................... 33 III.2.1 Dendritikus sejt izolálás................................................................................... 33 III.2.2 In vitro antigénprezentációs assay................................................................... 33 III.2.3 Hisztamin és H4R antagonista hatása aktivált dendritikus sejtek in vitro citokin termelésére.................................................................................................................. 35 III.2.4 In vivo dendritikus sejt stimulációs modell ..................................................... 35 III.2.5 RNS izolálás, reverz transzkripció és real time PCR ...................................... 36 III.2.6 Áramlási citometriás vizsgálatok..................................................................... 37 III.2.7 ELISA.............................................................................................................. 38 III.2.8 In vitro migrációs assay................................................................................... 38 III.2.9 Epidermisz preparálás és Langerhans sejtek vizsgálata .................................. 39 III.2.10 In vivo migrációs assay (FITC painting assay).............................................. 40 III.2.11 Statisztikai elemzések.................................................................................... 40 IV. EREDMÉNYEK........................................................................................... 41 IV.1 HDC-/- és vad típusú DC-k antigénprezentáló képességének összehasonlítása . 41 IV.2 HDC-/- és vad típusú DC-k áramlási citometriás vizsgálata............................... 42 IV.3 HDC-/- és vad típusú DC-k in vitro citokin termelésének vizsgálata ................. 45 IV.4 HDC-/- és vad típusú DC-k in vivo citokin termelésének vizsgálata .................. 48 IV.5 Hisztamin receptorok expressziójának vizsgálata dendritikus sejteken............. 50

1

IV.6 H4R-/- és vad típusú DC-k antigénprezentációs képességének összehasonlítása51 IV.7 DC-k antigénprezentációs képességének összehasonlítása különböző hisztamin receptor blokkolók jelenlétében.................................................................................. 52 IV.8 A H4R szerepe a hisztamin-mediált Th polarizációban..................................... 54 IV.9 A H4R szerepe a DC-k in vitro migrációjában .................................................. 55 IV.10 Langerhans sejtek számának összehasonlítása H4R-/- és vad típusú egerek fül epidermiszében ........................................................................................................... 58 IV.11 A H4R szerepe a DC migrációban in vivo (FITC painting assay) ................... 59 V. MEGBESZÉLÉS.......................................................................................... 61 VI. KÖVETKEZTETÉS ..................................................................................... 70 ÖSSZEFOGLALÓ............................................................................................ 74 SUMMARY....................................................................................................... 75 IRODALOMJEGYZÉK ..................................................................................... 76 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE................................................................ 88 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.............................................................................. 89

2

A dolgozatban használt rövidítések jegyzéke 5/4E8

egér T-sejt hibridóma sejtvonal, Balb/c egértörzsből

ANOVA

varianciaanalízis, Analysis of Variance

APC

antigénprezentáló sejt, antigen presenting cell

BSA

marha szérum albumin, bovine serum albumin

Balb/c

beltenyésztett egértörzs

C57BL/6

beltenyésztett egértörzs

cAMP

ciklikus adenozin-monofoszfát

CCL_

chemokine (CC motif) ligand _

CCR_

chemokine (CC motif) receptor _

CD

katalogizált sejtfelszíni marker sorszám-azonosítóját bevezető előtag, Cluster of Differentiation

cDC

kovencionális dendritikus sejt

cDNS

komplementer DNS

CFA

komplett Freund adjuváns, Complete Freund’s Adjuvant

CIITA

MHC class II transactivator

CT

Cycle treshold

CTLL

limfoblaszt sejtvonal, citotoxikus T-sejt klón

CXCR_

chemokine (CXC motif) receptor _

DAO

diamin-oxidáz

DC

dendritikus sejt, dendritic cell

DC-SIGN

C-típusú lektin receptor, DC-specific ICAM grabbing non-intergrin,CD209

DEC205

nem rövidítés, C-típusú lektin receptor, CD205

Dectin-1

nem rövidítés, C-típusú lektin receptor, béta-glükán-receptor

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DMSO

dimetil-szulfoxid

3

dNTP

dezoxiribonukleotid-trifoszfát

EDTA

etiléndiamin-tetraacetát

ELC (CCL19)

EBV-induced molecule-1 Ligand Chemokine

ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FACS

Fluorescence Activated Cell Sorting

FCS

embrionális borjúsavó, Fetal Calf Serum

FITC

fluoreszcein-izotiocianát

GAPDH

glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz

GATA-3

transzkripciós faktor: GATA binding protein 3

GILT

IFN-gamma-inducible lysosomal thiol reductase

GM-CSF

Granulocyte-Monocyte Colony Stimulating Factor

H1R

hisztamin H1 receptor

H2R

hisztamin H2 receptor

H3R

hisztamin H3 receptor

H4R

hisztamin H4 receptor

-/-

H4R

hisztamin H4 receptor génkiütött

HDC

L-hisztidin-dekarboxiláz

HDC-/-

L-hisztidin-dekarboxiláz génkiütött

HGPRT

hipoxanthin-guanin foszforibozil transzferáz

HNMT

hisztamin-N-metil transzferáz

IFNγ

interferon gamma

IL -_

interleukin_

ip.

intraperitoneális

KO

génkiütött, knockout

LC

Langerhans sejt

4

LPS

lipopoliszacharid

MACS

mágneses sejt szeparációs rendszer, magnetic cell separation

MAPK

mitogén-aktivált protein kináz

MFI

átlagos fluoreszcencia-intenzitás, mean fluorescence intensity

MHC

major histocompatibility complex

MMR

macrophage mannose receptor, CD206

mRNS

hírvivő, messenger RNS

MTT

metiltiazolil-difenil-tetrazólium bromid

OD

optikai denzitás

PAMP

patogénekre jellemző molekuláris mintázat, Pathogen-Associated Molecular Pattern

PBS

foszfát-pufferelt fiziológiás sóoldat, phosphate-buffered saline

PCR

polimeráz láncreakció, polymerase chain reaction

pDC

plazmacitoid dendritikus sejt

PE

phycoerythrine

PerCP

peridinin-chlorophyll-protein complex

PLC

foszfolipáz C

PRR

mintázat felismerő receptor, Pattern Recognition Receptor

RNS

ribonukleinsav

RPMI

Roswell Park Memorial Institute által kifejlesztett tápfolyadék

SDF-1

stromal cell derived factor-1

SEM

standard hiba, Standard Error of Mean

SPF

egyes kritikus kórokozóktól mentes, specific pathogen free

SV129

nem beltenyésztett egértörzs

T-bet

transzkripciós faktor, T-box expressed in T-cells; T-box protein 21

Th

segítő, helper T- sejt

5

TLR

Toll-like Receptor

TNF

tumor nekrózis faktor

Treg

regulatórikus T-sejt

WT

vad típus, wild type

6

..

I... Bevezetés

Jelen doktori értekezés tárgyát egy kismolekulájú biogén amin, a hisztamin, dendritikus sejtek működését, érését és migrációját befolyásoló hatásainak elemzése képezi.

I.1 A dendritikus sejtek, és szerepük az immunológiai folyamatokban A dendritikus sejtek (DC-k) az immunrendszer meghatározó antigénbemutató sejtjei (1. ábra). Heterogén populációik csontvelői eredetűek, megtalálhatók szinte mindenhol a szervezetben, mind limfoid, mind nem limfoid szövetekben. Mégis legjellemzőbbek azokon a területeken, ahol a szervezet kapcsolatba kerül a környezettel, így az epidermiszben, mukózális membránokban, de a szervek közötti intersticiális területeken is. Bár ezek a sejtek csupán 1-2%-át teszik ki a bőr, illetve a mukózális felszínek teljes sejtszámának, mégis jellemző nyúlványaikkal szinte behálózzák a teljes szöveti felszínt és ellenőrzés alatt tartják azt. A DC-k jellegzetes nyúlványaikról könnyen felismerhetők, ebből ered a „dendritikus” sejt elnevezés is.

1. ábra A DC‐k jellegzetes nyúlványos morfológiájú sejtek 

7

Kezdetben azt gondolták, hogy a dendritikus sejtek mieloid eredetűek, mivel számos morfológiai és funkcionális hasonlóságot mutattak a makrofágokkal. Később, mikor a dendritikus sejtek differenciálódási útvonalainak pontos feltérképezése lehetségessé vált, kiderült, hogy ezen sejtek kialakulása igen komplex és bonyolult folyamat1;2. Jelenlegi ismereteink szerint, a dendritikus sejtek mind limfoid, mind mieloid progenitor sejtekből differenciálódhatnak, létrehozva a három legnagyobb dendritikus sejt alpopulációt: az epidermális Langerhans sejteket (LC-k), a szöveti, dermális és interstíciális dendritikus sejteket, vagy más néven a „konvencionális” dendritikus sejtek csoportját (cDC-k) és a plazmacitoid dendritikus sejteket (pDC-k)1-6. Ezek az alpopulációk fenotípusukban, funkcióikban, aktiváltsági állapotukban és anatómiai lokalizációjukban is különböznek egymástól2;6;7. Jelen dolgozat vizsgálati tárgyát az egérben található DC-k képezik, amelyek funkcionális felosztása alapvetően eltér az emberi DC-kétől, különösképpen a limfoid szövetekben található DC-k tekintetében. Az itt található konvencionális dendritikus sejteket ugyanis további alcsoportokba sorolják jellemző sejtfelszíni antigén-mintázatuk alapján. Így ha a fő dendritikus sejtfelszíni markeren, a CD11c-n kívül a dendritikus sejt CD8α expressziót is mutat, akkor limfoid dendritikus sejtről, ha viszont CD8α helyett CD11b-t hordoz, akkor mieloid dendritikus sejtről beszélhetünk. Fontos látni ugyanakkor, hogy ez a nomenklatúra némiképpen félrevezető lehet, ugyanis a „limfoid” és „mieloid” jelzők nem utalnak egyértelműen a sejt eredetére3;6;7. A képet tovább bonyolítja, hogy valójában mára már ennél jóval több dendritikus sejt alpopuláció létezését is igazolták, sőt azt is, hogy az egyes alpopulációk képesek átalakulni egymásba2;3;8. A dendritikus sejtek differenciálódását igen komplex transzkripciós faktor hálózat tartja kézben. Ez a rendszer szabja meg, hogy adott esetben mely dendritikus sejt alosztály jön létre2. Ezek az alpopulációk különböző, de ugyanakkor részben át is fedő differenciálódási útvonaluknak köszönhetően, a felszínükön expresszált markerek alapján különíthetőek el egymástól9;10. A fentiektől függetlenül azonban le kell szögeznünk, hogy a dendritikus sejtek egerekben és emberekben ugyanazt az alapvető szerepet töltik be, habár bizonyos eltérések is megfigyelhetők olykor ezen sejtek viselkedésében6. A dendritikus sejtek, mint professzionális antigénprezentáló sejtek meghatározó szerepet töltenek be az immunválasz megindításában és szabályozásában. Fő feladatuk

8

az antigének felvétele, feldolgozása és bemutatása T-limfocitáknak (2. ábra)11-15. A Tsejtek a DC-k által feldolgozott peptideket MHC molekulákkal együtt, míg a glikolipideket a CD1 molekulák segítségével ismerik fel11;16.

2. ábra Az antigénprezentáció sémája  DC= dendritikus sejt, Th1 és Th2= 1‐es és 2‐es típusú segítő T‐sejt,  Treg= regulatórikus T‐sejt, PRR= mintázat‐felismerő receptor

A dendritikus sejtek az immunrendszer őrszemei, melyek állandóan vándorolva a vér, perifériás szövetek, nyirokutak és limfoid szövetek között, folyamatosan ellenőrzés alatt tartják a szervezetet, felkészülten várják az esetlegesen szervezetbe kerülő patogéneket, majd a patogének természetétől függően, aktív immunválaszt vagy toleranciát indukálnak. Ugyanakkor a DC-k az immunrendszer „szenzorainak” is tekinthetők, amelyek aktivációtól függően, legyen az mikrobiális vagy egyéb stimulus, intenzív érési folyamaton (maturáció) mennek keresztül, amely elengedhetetlen az effektív adaptív immunválaszhoz nemcsak egy esetleges fertőzéssel szemben, hanem transzplantáció, tumorok, autoantigének, és allergének esetében is11;13. Megfigyelések szerint, a szervezetben található DC-k többsége úgynevezett éretlen formában található. Ezek az éretlen DC-k igen csekély T-sejt aktivációs képességgel rendelkeznek, ugyanakkor hihetetlen aktív antigén felismerő képességgel bírnak, ami csak ebben az állapotukban jellemző rájuk13. Az éretlen DC-k felszínén számos

9

antigénfelismerő receptor található, amelyek az endocitózisban, azaz az antigének felvételében vesznek részt. Néhány molekula ezek közül a C-típusú lektinek csoportjába tartozó receptor, például az MMR, DEC-205, DC-SIGN és a Dectin-1, amelyek az antigéneket cukormintázatuk alapján ismerik fel17-19. Az éretlen DC-k szelektíven aktiválódnak különböző TLR (Toll-like Receptor) ligandokra megfelelő receptoraik révén, amelyek különböző mikrobiális termékek mintázatának felismerésére képesek. Ezen ligandok nagy részét mára már sikerült azonosítani20-24. Fontos itt megjegyezni, hogy a különböző DC alosztályok meghatározott TLR mintázattal rendelkeznek, így különböző mikrobák ellen különböző DC populációk indukálnak effektív választ. Például a plazmacitoid DC-k jellemzően TLR7 és TLR9 receptorral rendelkeznek, mely receptorok elsősorban mikrobák DNS-ét ismerik fel. A CD8α pozitív DC-k jellemzően TLR3, TLR4 és TLR9 receptorral rendelkeznek, míg a CD8α negatív DC-k TLR4, TLR7 és TLR9 receptorokat expresszálnak4;25. A TLR-ok és egyéb mintázatfelismerő receptorok (PRR-ek, Pattern Recognition Receptors) által a DC-kben olyan jelátviteli útvonalak indulnak be, amelyek a DC-ket olyan, hatékony effektor dendritikus sejtekké alakítják át, amelyek képessé válnak az adott kórokozó elleni leghatékonyabb immunválasz kiváltására. A DC-k érését azonban egy sor egyéb molekula is befolyásolhatja, így a citokinek, kemokinek és számos egyéb szolubilis faktor is26;27. Ilyen faktor a hisztamin is, amelynek hatásaival foglalkozik a dolgozat28;29. A DC-k érése elengedhetetlen az effektív immunválasz kialakulásához. Számos megfigyelés igazolja, hogy a DC-kben az antigén felvételét követően beindul az az érési folyamat, mely során kialakul a DC-kre jellemző „dendritikus” morfológia, azonban nemcsak morfológiai, hanem egy sor funkcionális változás is bekövetkezik a sejtekben, például az MHCII molekulák kihelyeződnek a sejtek felszínére. Így a DC-k már képesek a felvett és feldolgozott antigének hatékony bemutatására, amely az első feltételt jelenti az antigénprezentáció folyamatában. Ekkorra már a DC-k egyrészt elvesztik képességüket az antigének felvételére, másrészt számos kostimulációs molekula is megjelenik a felszínükön, amelyek közül a legjellemzőbbek a B7 családba tartozó CD80 és CD86 molekulák30-32. E molekulák az antigénprezentációval egyidejű kostimulációban veszenek részt. A kostimuláció az aktív immunválasz beindításának második, elengedhetetlen feltétele, ennek hiánya a T-sejtben anergiát, illetve toleranciát eredményez.

10

Azonban a kostimuláció megléte sem elégséges az effektív immunválaszhoz, mivel mind a bemutató DC-k (IL-12 és interferonok), mind a felismerőT-sejtek (Th1 és Th2 citokinek) által termelt citokinek is szükségesek az immunválasz irányának és erősségének meghatározásához33-35. A DC-k által termelt citokinek tehát alapvető szerepet töltenek be a természetes és adaptív immunválasz összekapcsolásában. Az interferonok és az IL-12 számos olyan jelátviteli útvonalat indukálnak, amelyek meghatározóak többek között a Th1 irányú Tsejt differenciálódásban, a Th2 válaszban, így szerepet játszanak az antitestek termelődésében,

a

makrofágok

aktivációjában,

a

citotoxikus

immunválasz

kialakításában és ez által az adaptív ellenálló képesség kialakításában36-38. A DC-k jellemzően mobilis sejtek. Számos olyan kivételes tulajdonsággal rendelkeznek, amely lehetővé teszi számukra a hatékony immunválasz megindítását olyan antigénekkel/patogénekkel szemben is, amelyek sok esetben a szervezet limfoid szöveteitől távol, a periféria bármely területén jelennek meg. A DC-k azok, amelyek eljuttatják az antigéneket a felvétel helyszínétől az immunrendszer nyirokszerveibe, és ott megjelentetik azokat, mint immunogén MHCII/peptid komplexeket. A DC-k ezen képessége alapvető az elsődleges immunválasz megindítása szempontjából39;40. Tehát az antigénfelvétel és -bemutatás a szervezet különböző helyszínein történik. Ennek érdekében az immunrendszer fejlődése során a dendritikus sejteket irányító jól szervezett és kontrollált migrációs rendszer alakult ki, amelyben a kemokinek és kemokin receptorok meghatározó szerepet töltenek be41-44. A kemokinek olyan szolubilis molekulák, amelyek növekvő koncentrációjukkal kemotaxist váltanak ki a kemokint kibocsájtó szerv, vagy sejtcsoport felé, emellett jellemzik a sejteket körülvevő szöveti környezetet is. A jeleket csak az a sejt tudja fogni, amely rendelkezik a kemokin felismerésére szolgáló megfelelő kemokin receptorral. A kemokinekre és receptoraikra korlátozott specificitás jellemző, mivel egy adott receptor több különböző kemokin felismerésére is képes, illetve ugyanaz a kemokin több eltérő receptorhoz is képes kötődni45. A kemokineken kívül egyéb molekulák, nem kemokin-jellegű kemotaktikus agonisták, citokinek, lipid mediátorok, membrán proteinek, gyulladási mediátorok- így a hisztamin- is modulálhatják a DC-k migrációját41;46. Az immunrendszer sejtjei eltérő kemokin és kemokin receptor mintázattal rendelkeznek, sőt ezen mintázat időben, aktiváltsági állapottól függően is eltérést mutat45.

11

Így a DC-k is számtalan kemokin receptort hordoznak a felszínükön. Ezek többségében két nagy kemokin-családba tartozó kemokinek receptorai, a CC- és CXC-kemokineké (CXCR4, CCR1, stb.), amelyek a DC-k érettségi állapotától függően eltérő mintázatokban jelennek meg a sejtek felszínén. Már az éretlen DC-k is számos kemokin receptorral rendelkeznek, ezek közül néhány a CCR1, CCR2, CCR5 és CXCR1, CCR6. Ezen receptorok ligandjai a CCL5, CXCL8, CCL3, CCL7; többségében gyulladás hatására termelődnek, szerepük a DC-k odavonzása a gyulladás helyszínére47;48. A DC-k érésük során a fenti kemokin receptoraik expresszióját csökkentik, ezáltal elvesztik érzékenységüket az előbb említett kemokinek iránt, ami lehetővé teszi, hogy elhagyják a gyulladás helyszínét7. Ugyanakkor fokozzák egy másik kemokin receptor, a CCR7 expresszióját, amely a konstitutívan expresszálódó kemokineknek, a CCL19, illetve a CCL21 receptora40;41;47;48. Ezt a két kemokint a nyirokcsomók T-sejtes zónájában található stróma-sejtek termelik, és egy növekvő grádienst képezve a DC-ket a nyirokcsomókba irányítják. Így az érett DC-k kapcsolatba kerülnek a naív T-sejtekkel és bemutathatják a felvett és feldolgozott antigéneket. A másik két kemokin receptor, amely ugyancsak az érett DC-kre jellemző a CCR4 és CXCR4, ezek ligandjai a CCL17 és az SDF-147;49. Ugyanakkor csak abban az esetben indulhat meg egy sikeres immunválasz, ha a DC-k kapcsolatba kerülnek megfelelő naiv T-limfocitákkal, ezért a DC-k is számos kemokint (CCL19, CCL17) termelnek azért, hogy a T-sejteket magukhoz vonzzák, és ezzel még inkább növeljék az antigénprezentáció és a T-sejt aktiváció hatékonyságát47. Mindezek azt mutatják, hogy a kemokinek, kemokin receptorok és egyéb migrációban szerepet játszó faktorok egy olyan rendkívül komplikált, de ugyanakkor jól szervezett hálózatot alkotnak, amelyek lehetővé teszik, irányítják és fenntartják a szervezet sejtjeinek és ezen belül a DC-knek is a mozgását. A dendritikus sejtek miután megérkeznek a gyulladás helyszínére, felveszik az antigéneket, aktiválódnak a környezetből származó egyéb aktivátor, illetve gyulladásos molekulák hatására és érési folyamaton mennek keresztül. Ilyen környezeti faktorok a PAMP-ok (patogénekre jellemző molekuláris mintázatok), endogén gyulladási molekulák (pl. hisztamin), gyulladásos citokinek (pl. IL-1, TNFα) és különböző bakteriális termékek (pl. LPS).

12

Összefoglalva: mindezen folyamatok végső célja természetesen az, hogy amikor egy fertőző ágens megtámadja a szervezetet, hatékony immunválasz alakuljon ki ellene. Azonban az is fontos, hogy a patogén ellen megindított válaszreakció során a DC-k a lehetséges immunológiai válaszlépések közül a leghatékonyabb mechanizmusok optimális kombinációját indítsák be. Másrészről legalább ilyen fontos, hogy a DC-k működése következményeként, a saját antigénekkel szemben ne szűnjön meg a tolerancia, ne alakuljon ki immunreakció, azaz autoimmunitás. Mindezen döntések meghozatalában a DC-k alapvető szerepet játszanak, mivel elsősorban ezek a sejtek a felelősek a naív és az effektor T-sejtek aktivációjáért és a centrális és perifériás tolerancia kialakításáért is. A DC-k mintázat-felismerő receptoraik segítségével (TLRok, C-típusú lektinek, stb.) információhoz jutnak az antigén természetéről és ezt az információt citokinek és kostimulációs molekulák termelése révén megosztják a reagáló T-sejttel is. A DC-k által termelt IL-12 és IFNγ például Th1 irányba polarizálja az aktiválódott T-sejteket, ugyanakkor az IL-10 immunszupressziót vált ki36;50;51.Ezek a jelek aztán olyan jelátviteli folyamatokat indítanak meg a T-limfocitákban, amelyek a fertőző organizmussal szembeni leghatékonyabb választ eredményezik.

13

I.2 A hisztamin felfedezése, bioszintézise, lebontása és alapvető funkciói A hisztamin egy alkalikus biogén amin, amely előállításáért egyetlen enzim, az Lhisztidin karboxilcsoportját eltávolító L-hisztidin dekarboxiláz (HDC) a felelős.52-55 A hisztamin szinte minden emberi szövetből izolálható, de különösen nagy mértékű hisztamin termelést a hízósejtek és bazofil granulociták folytatnak. Ezek a sejtek granulumaikban tárolják a termelt hisztamint, amelyek tartalma különféle fizikai és kémiai stimulusra degranulálódik a hisztamint termelő sejtekből56. A hisztamin izolálása, legfontosabb élettani hatásainak leírása már mintegy 100 esztendővel ezelőtt megtörtént. Az elsők között fedezték fel, mint szolubilis gyulladási mediátort, így kutatástörténeti szempontból ez a molekula egyedülállóan hosszú tudományos pedigrével rendelkezik. Simaizom-stimuláló és vazodepresszor hatásait elsőként Dale és Laidlaw írták le még 1910-ben57. Később kiderült, hogy a hatásokért felelős molekula mindössze 17 atomból álló igen egyszerű hatóanyag, amelyet számtalan szövetből is izolálni tudták, így a „histos”, a szövet görög neve után, hisztaminnak nevezték el (3. ábra)58. A hisztamin inaktiválásában két enzim, a diamin-oxidáz (DAO), és a hisztamin-Nmetil-transzferáz (HNMT) játszik szerepet. A DAO a hisztamint imidazol-acetaldehiddé alakítva, a terminális aminocsoport eltávolításával inaktiválja azt59. A HNMT a hisztamint Nτ-metil-hisztaminná metilálja60. Jelentős eltérés van a két enzim szervi, illetve szöveti expressziójában, míg a DAO csak néhány szövettípusban expresszálódik, így elsősorban a vékonybélben, a vesékben, illetve a terhesség alatt a placentában és a vérben 61;62, addig a HNMT a szervezet számos szövetében kimutatható60;63.

3. ábra A hisztamin (2‐(4‐ imidazolil)‐etilamin)  szerkezeti képlete 

14

A hisztamin alapvető szerepet tölt be a szervezet fiziológiás és patológiás folyamataiban64. Számos kórkép kialakításában vesz részt, sok esetben, mint effektor funkciók mediátora, más esetekben, mint szabályozó molekula, a betegségben szerepet játszó sejtek működését regulálja. Különösen fontos szerepet játszik immunológiai folyamatokban56. Legismertebb ezek közül is az allergiás folyamatokban betöltött szerepe, de részt vesz a gyulladásos folyamatok regulálásában is65-67. A hisztamin számtalan más immunfolyamat szabályozásában vesz részt 52;68

atheroszklerózisban

56

, így kimutatták hatásait

69

, daganatokban és autoimmun betegségekben70 is.

I.2.1 A hisztamin jelátviteli mechanizmusai és főbb biológiai hatásai A hisztamin hatásait négy különböző hisztamin receptor közvetítheti a célsejt felé. Ezek a receptorok a felfedezésük sorrendjében, a hisztamin H1, H2, H3 és H4 néven leírt receptorok (a tömörség kedvéért a továbbiakban a konvencionálisnak tekinthető H1R, H2R, H3R, H4R rövidítéseket fogjuk használni). Mind a négy receptor integráns, 7 transzmembrán doménnel rendelkező, tipikus G-proteinhez kapcsolt plazmamembránreceptor, melyek ligandkötő affinitása, szervezeten belüli szöveti megoszlása, jelátviteli útjai és funkcionális sajátságai egyaránt jelentős mértékben különböznek egymástól71. Mindegyik receptor rendelkezik számos, többé-kevésbé specifikus antagonistával, de vannak olyan blokkoló molekulák is, amelyek az összes receptort gátolni képesek. A hisztamin antagonisták szerkezeti hasonlóságot mutatnak a hisztaminnal, így kötődni képesek a hisztamin egy vagy több receptorához. Az antagonisták, ellentétben a hisztaminnal, bár kötődnek ugyan a receptorhoz, de a kötődés nem eredményez receptor aktivációt, így jel-továbbítás sem történik. Ahogy léteznek a hisztaminnak antagonistái, úgy vannak olyan molekulák, amelyek a hisztamin receptorhoz kötődve annak aktiválódását eredményezik. Ezek a hisztamin receptor agonisták. A természetes ligand, a hisztamin így maga is agonistának tekinthető. Az egyéb hisztamin agonisták hasonlóképp működnek, mint a hisztamin, csak a kötési affinitásuk és hatékonyságuk eltérő72-74. Ugyanakkor azt is kimutatták, hogy függetlenül a ligandok jelenlététől, ezek a Gproteinhez kapcsolt receptorok aktív és inaktív állapotban is lehetnek. Valójában egy állandó equilibrium figyelhető meg az aktív és inaktív állapot között, amelyet az

15

agonista bekötődése az aktív konformáció felé billent el, amennyiben az aktív állapotot stabilizálja, míg az antagonista a receptor inaktív formáját stabilizálja. Ez alapján tehát elmondhatjuk, hogy az agonisták a receptor aktív konformációjához képesek kötődni és ez által tartós aktivációs szignálokat közvetítenek. Ezzel szemben a hisztamin receptor antagonisták jelentős része egyedi abban a tekintetben, hogy az inaktív receptor állapotot preferálják, stabilizálják a receptort ebben a működésképtelen állapotában, ezzel gátolva a szignál transzdukciót. Ezért sok hisztamin receptor antagonistát valójában inverz-agonistának tekintünk72-74. Az alábbi táblázatban összefoglaltuk a legfontosabb tudnivalókat a négy hisztamin receptorról (1. táblázat) 1. táblázat A hisztamin receptorok jellemző tulajdonságai Antagonisták

H1R

H2R

H3R

H4R

Agonisták

Mepiramin, Chlorpheniramin, Cetirizin, Astemizol, Clemastin, Terfenadin, Loratidin, Tripolidin Zolantidin, Cimetidin, Ranitidin, Tiotidin, Famotidin

Hisztamin, Histaprodifen

Thioperamid, Clobenpropit, Carboperamid, Iodoproxyfan, Thioperamid, JNJ7777120, JNJ10191584

Imetit, (R)-a Methylhisztamin, Immepip

Hisztamin, Dimaprit, Amthamin, Ipromidin, Amthamin

Clobenpropit, Imetit, Clozapin, 4-methyl-hisztamin

16

Előfordulás

G protein

Szinte minden sejten (ideg-sejtek, légút- és ér simaizom, kondrociták, endotél sejtek, hepatociták, T- és Blimfociták, DC-k, monociták, eozinofil és neutrofil granulociták) Szinte minden sejten (ideg-sejtek, légút- és ér simaizom, kondrociták, endotél sejtek, hepatociták, T- és Blimfociták, DC-k, monociták, eozinofil és neutrofil granulociták) Központi idegrendszer, hisztaminerg neuronok, alacsony expresszió a perifériás szövetekben Hízósejtek, bazofil és eozinofil granulociták, DC-k, T-limfociták, hematopoetikus prekurzorok

Gq

Gs

Gi/o

Gi/o

I.2.1.1 Jelátvitel H1, H2 és H3 receptorokon keresztül Hisztamin H1 receptor (H1R) A négy hisztamin receptor közül a H1R-t fedezték fel elsőként. A hisztamin receptorai közül ez rendelkezik a legkisebb kötési affinitással (Ki = 12.500 nM), jelátvitele elsősorban Gq/11 proteineken keresztül, tehát a foszfolipáz-C aktivált útvonalakon, többek között a protein-kináz C közreműködésével zajlik46;75;76. A H1R számos sejttípus felszínén expresszálódik, így az érfal-endotél sejteken, simaizomsejteken, a mellékvesevelő kromaffin sejtjein, de a központi idegrendszer számos neuronján, és a szívizomsejtek felszínén is megjelenik77. Az immunrendszer sejtjei közül a granulociták, monociták, dendritikus sejtek, T- és B-limfociták is megjelenítenek H1R-t a felszínükön. A szervi, szöveti megoszlását tekintve elmondhatjuk, hogy ez a receptor igen nagy elterjedtséget mutat, hiszen a gasztrointesztinális rendszerben, az agyban, az urogenitális rendszerben és a szívben is igen nagy mértékben expresszálódik71;74. A H1R a fő hisztamin receptor az allergiás válasz során, mivel mind a hörgők és tápcsatorna simaizomzatának összehúzódásában, az érfal-endotél aktivációjában, az érfal-permeábilitás növekedésében, mind pedig az allergiás válasz során tipikus, erőteljes vazodilatációban is központi szerepe van77;78. A H1R aktiválódása számos jellegzetes hisztamin-hatás kialakulásához vezet, így például a viszketés, vagy a mucus szekréció a H1R aktiváció tipikus következményei. Mivel mindezen azonnali típusú hiperszenzitivitás tünetei H1R antagonistákkal („antihisztaminokkal”) jól kezelhetők, ezért a H1R-nak nagy jelentősége van a klinikumban is78. A H1R a központi idegrendszerben is fontos szereppel bír, többek között szabályozza a cirkadián ritmust, és étvágy szabályozó hatása is van79-81. A H1R immunológiai folyamatokat szabályozó hatása igen összetett, de általában véve úgy tűnik, hogy a H1R a Th1-jellegű, azaz a celluláris immunválaszt támogató immunrendszeri kommunikációt erősíti82. Hisztamin H2 receptor (H2R) Mivel a H2R alapvető funkciót tölt be a gyomornyálkahártya sósav-szekréciójának szabályozásában, ez a receptor ugyancsak kiváló klinikai célpont gyomorfekélyes betegek kezelése során83. A hisztamin H2R-hoz kötődése a K+-H+ pumpákat stimulálja a gyomorban, amely megnövekedett gyomorsav-szekrécióhoz vezet. Ez a folyamat alapvető védekezési reakció az esetlegesen a tápcsatornába jutó parazitákkal szemben,

17

ugyanakkor a savas pH megfelelő környezet biztosít a gyomorban történő emésztési folyamatokhoz is84. H2R számos egyéb szerepét is leírták, az erek simaizom-sejtjeinek kontrakcióját okozza, a szívben a H1R-ral ellenkező hatást vált ki85;86, és kimutatták jelenlétüket a központi idegrendszerben és a zsírsejteken is74. A H2R sok esetben ugyanazokon a sejteken is megtalálható, amelyeken a H1R, és ilyen esetekben a hisztamin rajta keresztül gyakran a H1R-ral ellentétes hatásokat vált ki. Így a hisztamin ugyanazon a sejten mind aktiváló, mind gátló hatásokat is kiválthat különböző receptorain keresztül, ilyen esetekben a hisztamin által okozott végső hatás a receptorok megjelenési arányától és kötési affinitásuktól függ71. A H2R affinitása egyértelműen felülmúlja a H1R-ét (Ki = 2.000 nM), és esetében a hisztamin hatását főként Gs fehérjék közvetítik, tehát elsősorban ciklikus adenozin monofoszfát (cAMP) keletkezését katalizáló útvonalak aktiválódnak56;87. Az immunrendszerben a H2R főként Th2-jellegű, szuppresszív, illetve részben a humorális válaszokat is támogató immunmodulatórikus jeleket közvetít82;88. Hisztamin H3 receptor (H3R) A H3R az előző két receptorral szemben igen korlátozott szöveti megjelenésű, elsősorban a központi idegrendszeri neuronok felszínén jellemző, de egyes perifériás idegsejteken és nem-idegrendszeri sejteken is expresszálódik89;90. A H3R mint preszinaptikus receptor a hisztamin és egyéb neurotranszmitterek kibocsájtását szabályozza, illetve autokrin módon negatív visszacsatolás útján regulálja az idegszövetek hisztamin termelését91. A négy hisztamin receptor közül a H3R rendelkezik a legnagyobb hisztaminkötő-affinitással (Ki = 5,4 nM). A hisztamin hatást főként Gi/o fehérjék közvetítik, amelyek gátolják a cAMP keletkezését, serkentik a Ca++ felhalmozódást és aktiválják a mitogén-aktivált protein kináz (MAPK) útvonalat92. A H3 receptornak több izoformáját is megfigyelték, amelyek alternatív splicing következtében jönnek létre. Ezek az általuk aktivált jelátviteli mintázatok minőségében finom különbségeket mutattak egymáshoz képest93. A H3R-nak az étvágy, a figyelem, a memória, továbbá a szervezet spontán lokomotórikus

aktivitásának,

cirkadián

ritmusának,

testhőmérsékletének a szabályozásában is jelentősége van94;95.

18

és

alvás

közbeni

Mivel a negyedik hisztamin receptor szerepének és működésének vizsgálata szerves tárgyát képezi a doktori dolgozatnak, ezzel a receptorral egy külön alfejezetben foglalkozunk.

I.2.1.2 Jelátvitel H4 receptoron keresztül Hosszú ideig csak a három, az előzőekben említett hisztamin receptor volt ismert, de az egyre növekedő számú nyitott kérdés és megmagyarázhatatlan eredmény sejtette a létezését egy negyedik receptornak is, amelyet csak nemrégiben (2001-ben) fedeztek fel96. A hisztamin immunkompetens sejtekre gyakorolt hatásai, ezen belül is például az eozinofil és hízósejtek migrációban betöltött szerepe már évtizedek óta igazolt volt, de csak az elmúl években - miután a H4 receptort felfedezték – derült ki, hogy melyik receptor mediálja ezeket a hatásokat. Ezt a „legfiatalabb” hisztamin-receptort valójában nem is a hagyományos kutatási stratégiákkal, hanem egy in silico kutatási programban, a H3R-ral való homológiája révén sikerült azonosítani96. Bár sem a receptor által aktivált intracelluláris jelátviteli utakat, sem a biológiai funkcióit nem írták még le teljes részletességgel, úgy tűnik, hogy a H4R jelátvitele elsősorban Gi/o proteinek aktiválásán keresztül zajlik. Aktiválása olyan jelátviteli útvonalakat indít be, amelyek Ca++ beáramláshoz, cAMP-szint csökkenéshez és a MAPK útvonal aktiválódásához vezetnek56. A H4R a H3R mögött éppen csak lemaradva a második legnagyobb affinitású hisztamin-receptor (Ki = 8,1 nM)97. A H4R-ról elmondható, hogy a legtöbb szövetben igen alacsony szinten expresszálódik, de ez alól kivételt képeznek a primer és szekunder nyirokszervek, így a csontvelő, a thymus, a lép, és a nyirokcsomók. A H4 receptor szinte kizárólag immunkompetens sejteken jelenik meg, így elsősorban bazofil és eozinofil granulocitákon, hízósejteken, egyes T-limfocitákon, és így a dendritikus sejteken is56;97-99. Mivel az emberi H4R 31%-os szekvencia azonosságot mutat a H3R-al, számos széles körben alkalmazott H3R agonistáról és antagonistáról kiderült, hogy H4R-on keresztül is

közvetítenek

hatásokat56;97.

Például

a

thioperamid,

amely

korábban

H3

antagonistaként vált ismertté, ugyanolyan hatékonyan kötődik a H4R-hoz is, és ez felveti számos korábbi eredmény újraértékelését a H3R-ral kapcsolatban97. Az utóbbi években H4R-nak mind specifikus gátló szereit, antagonistáit, mind agonistáját megszintetizálták, sőt, egy genetikailag H4R-hiányos egérmodell is rendelkezésre áll

19

szerepének és hatásainak feltérképezéséhez. A két, már kereskedelmi forgalomban (de a klinikumban még nem) megjelent antagonista a JNJ7777120100 és JNJ10191584100-102 egymástól csak egyetlen nitrogén atomban eltérő molekulák, amelyek igen nagy affinitással kötődnek a H4R-hoz (Ki=4 nM és Ki=27 nM). Specifikus H4R agonistaként a 4-methyl-hisztamint alkalmazzák103, amely egy már régen ismert molekula, ugyanakkor a H4R felfedezéséig, mint H2R agonista volt ismert. Csak a H4R felfedezése után derült ki róla, hogy a H4R-hoz körülbelül 100-szor nagyobb affinitással kötődik, mint a többi hisztamin receptor típushoz, így ennek a molekulának is átértékelődött a jelentősége. Az a tény, hogy a H4R az immunrendszer sejtjein expresszálódik, előrevetíti esetleges szerepét gyulladásos és egyéb immunfolyamatokban46;98;104. Ez a feltételezés a vele kapcsolatban eddig leírt kísérleti adatok alapján igazolódni is látszik. Specifikus antagonistákkal és agonistákkal folytatott kísérletekből, illetve H4R knockout egerek vizsgálatainak eredményeiből kiderült, hogy a hisztamin a H4R-on keresztül serkenti a kemotaxist eozinofil granulocitákban illetve hízósejtekben, mivel aktin polimerizációt indukál és Ca++-ot szabadít fel (4. ábra)46;99;104;105.

H

H

H

H H4R

Gαi/o Gβγ

Ca++ Ca++ Ca++

Ca++

Ca++

PLC

Ca++

Ca++

Kemotaxis

4. ábra H4R‐mediált jelátvitel egyik lehetséges következménye a kemotaxis  serkentése   H= hisztamin, PLC= foszfolipáz C

20

A H4R-nak a migrációban betöltött szerepére később még visszatérünk, hiszen a DC migráció és a hisztaminnak a DC-k migrációjára gyakorolt hatása egyik a három alapvető DC funkciók közül, amit a dolgozatban megvizsgáltunk. A H4R szerepet játszhat viszketéses tünetek kialakulásában is, amely tünetek H4R antagonistával szintén kezelhetők106;107. Ezen kívül H4R antagonistával kezelt illetve H4R génkiütött egerekben csökkentek az allergiás, gyulladásos tünetek, amelyek együtt jártak a tüdőt infiltráló eozinofilek és limfociták számának csökkenésével. Ezeken túlmenően a T-sejtek citokin termelése is megváltozott, gyengültek a Th2 irányú, illetve gyulladásos válaszok, így az IL-4, IL-5, IL-13, IL-6 és IL-17 citokinek termelődése is99;108. A H4R antagonisták megakadályozták a peritonitisz kialakulását egy zymosan indukált modellben109. Mindezen adatok felvetik annak a lehetőségét, hogy a H4R antagonisták a H1R antagonisták mellett hatékonyan felhasználhatók lesznek az allergiás megbetegedések, például az allergiás asztma terápiájában, de ezen kívül nagy reményeket fűznek a H4R blokkolók terápiás alkalmazáshoz egyéb gyulladásos (pl. colitis) és autoimmun betegségekben is110;111.

I.3 A hisztamin és a dendritikus sejtek kapcsolata A DC-k működésében a környezeti faktorok, mint például a citokinek, kemokinek, és különböző gyulladási mediátorok, így például a hisztamin is meghatározóak28;29. Az is köztudott,

hogy

a

DC-k

számos

hisztamin

receptor-típust

expresszálnak

a

felszínükön28;88. Eltérő DC alosztályok eltérő funkciót töltenek be az immunfolyamatok során és irodalmi adatok alapján az is körvonalazódni látszik, hogy ezek az alpopulációk nemcsak funkciójukban, hanem sejtfelszíni molekula-mintázatukban is eltérnek, sőt eltérő hisztamin receptorokat jelenítenek meg a felszínükön112. A hisztamin és a DC-k kapcsolatának irodalmát áttekintve kitűnik, hogy kevés és sokszor ellentmondó adat szól a hisztamin szerepéről a DC-k fejlődésében és működésük szabályozásában. Az előző fejezetben említett módon a DC-k stimulustól függően Th1, vagy Th2, sőt akár Treg irányba polarizálhatják a T-sejteket. Van olyan irodalom, ami arról számol be, hogy monocitákból történő DC differenciáltatás során a hisztaminnal való

kezelés

H1R-on

keresztül

Th1

irányú

polarizációt

és

hatékonyabb

28

antigénprezentációt eredményez . Ezzel szemben a H2 receptoron közvetített szignálok inkább szuppresszív hatásúak és az antigénprezentáció csökkenéséhez vezettek, továbbá

21

a hisztamin H2R-on keresztül növelte az IL-10 termelést és csökkentette az IL-12 szekréciót is29. Adatok szólnak arról is, hogy a hízósejtek jelenléte és degranulációja fontos szereppel bír DC-k környezetében, jelenlétük Th2 irányú T-sejt polarizációt eredményez113;114. Ugyanakkor olyan közlemény is olvasható, amelyben azt találták, hogy in vitro hisztamin jelenlétében differenciálódott humán DC-k nem jutnak el differenciáltságban olyan szintre, mint azok a DC-k, amelyek nem voltak hisztaminnal kezelve. A hisztaminnal kezelt kultúrák sokkal kisebb arányban tartalmaztak CD1a+ érett DC-ket, mint a kezeletlen csoport. Az is kiderült, hogy ezek a hisztaminnal kezelt DC-k gyenge T-sejt stimulátorok voltak a kontroll csoporttal összevetve115. Egészséges saját szövetekből származó antigéneket a DC-k kereszt-prezentáció segítségével mutatnak be T-sejteknek, és toleranciát indukálnak velük szemben. Ezt a stratégiát választja számos tumor is, annak érdekében, hogy elkerülje az aktív immunválaszt, sőt kimutatták, hogy tumorok olyan citokineket termelnek (TNFα és IL10), amelyek a DC-kre és T-limfocitákra hatva anergiát, azaz válaszképtelenséget váltanak ki116. Immár számos megfigyelés tanúsága szerint a hisztamin-termelés jelentősen felerősödik egy sor különböző daganattípusban117-119. A daganatok által termelt hisztamin szintén hathat negatívan a DC-k antigénprezentációjára, illetve a Th2 polarizációnak kedvezve, támogathatja a tumorsejtek túlélését. Végül a hisztamin aktin polimerizációra gyakorolt hatását, intracelluláris Ca++ mobilizációját és kemotaktikus hatását ugyancsak igazolták éretlen DC-ken. Ezen hatások közvetítésében munkacsoportoktól függően a H1, H3 és H4 receptoroknak is tulajdonítottak szerepet29;120;121. Mivel a H4 receptort csak nemrégiben fedezték fel, irodalmi szempontból nem tekint nagy múltra, így e receptor szerepéről igen csekély információval rendelkezünk. Számos sejttípus esetében leírták a H4 receptor immunregulációban és migrációban betöltött szerepét, ideértve az eozinofil granulocitákat, hízósejteket, T-limfocitákat is. Ugyanakkor funkciójáról DC-ken csak csekély számú adat áll rendelkezésre. Eredmények szólnak arról, hogy a hisztamin H4R-on keresztül serkenti a DC-k migrációját,

és

fontos

szerepet

tölt

be

a

DC-k

T-sejt

polarizációjának

regulálásában108;120. Dendritikus sejtek H4R-án keresztül a hisztamin Th2 polarizációt indukált, hiányában csökkent a T-sejtek IL-4 expressziója és számos egyéb gyulladási

22

citokiné is (IL-6, IL-17). Ugyanakkor a T-sejtek proliferációs képessége nem változott H4R hiányában108.

I.4

A

hisztamin

hatása

a

dendritikus

sejtek

működésére

-

kérdésfeltevés Jelen dolgozat középpontjában a dendritikus sejtek, és azok funkcióinak vizsgálata áll. Elsősorban azt a kérdést kívántuk vizsgálni, hogy a hisztamin, mint közismert gyulladásos, illetve allergiás mediátor hatással van-e a dendritikus sejtek működésére, és ha igen, milyen szerepet tölt be abban. Másodszor azt a kérdést tettük fel, hogy a hisztamin hatásainak közvetítésében mely receptorok játszanak szerepet, illetve célunk volt a legújabban felfedezett hisztamin H4-es receptor szerepét feltérképezni a DC-k működése során. A kérdések megválaszolásához és a hisztamin-hatások elemzéséhez olyan egérmodelleket használtunk fel, amelyek vagy nem rendelkeznek a hisztamint előállítani képes hisztidin-dekarboxiláz enzim génjével (HDC-/-), vagy amelyekben a hisztamin négyes típusú receptorát (H4R-/-) ütötték ki homológ rekombinációval. Az egerekből mágneses szeparációs technikával tisztított DC-k hisztamin-mentes környezetben differenciálódtak, értek, illetve a második rendszerben, bár a hisztamin jelen lehetett a környezetükben, nem rendelkeztek a hisztamin hatások közvetítéséhez szükséges egyik receptorral, a H4R-al. Alapos okunk van feltételezni, hogy mind fiziológiás, mind patológiás körülmények között a hisztamin megtalálható a DC-k környezetében, hiszen számos esetben kimutattak hízósejteket és egyéb hisztamin szekrécióra képes sejteket a DC-k közelében113, sőt, irodalmi adatok tanulsága szerint a DC-k sejtek maguk is képesek hisztamin termelésre108;122. A DC-kről másokkal egyetemben kimutattuk, hogy legalább három hisztamin receptort, H1R-t , H2R-t és H4R-t is expresszálják a felszínükön88;108. Ettől függetlenül, és számos in vitro megfigyelés ellenére, mind a mai napig nem teljesen tisztázott, hogy a különböző hisztamin receptorokon keresztül mediált jelátviteli útvonalaknak van-e tényleges szerepe a DC-k működésében. Figyelemre méltó, hogy a hisztamin az immunrendszer működését valószínűleg mind a periférián, mind a környéki nyirokszervekben, az antigénprezentáció szintjén is hatékonyan befolyásolni képes28. Ráadásul úgy tűnik, hogy az adott környezetből a

23

környéki nyirokcsomókba vándorló DC-k felé elsősorban Th2-típusú hatásokat közvetít, vagyis a celluláris immunválaszt gátolja123. Mindezek

ismeretében,

vizsgálataink

első

lépcsőjében

antigénprezentációs

kísérletekben vetettük össze a hisztamin jelenlétében és hiányában differenciálódott DC-ket, majd megvizsgáltuk azokat a faktorokat is, amelyek az antigénprezentációt befolyásolják és esetlegesen hisztamin szabályozás alatt állnak. Ilyenek voltak a kostimulációs molekulák expressziójára és dendritikus sejt szubpopulációs megoszlásra irányuló kísérleteink, illetve a DC-k citokin termelő képességének vizsgálata. A második lépcsőben megvizsgáltuk, mekkora a jelentősége H4R-nak a fenti hisztamin hatások közvetítésében. Végezetül megvizsgáltuk a hisztamin és H4R szerepét a DC-k migrációjában is.

24

..

II... Célkitűzések

Az itt bemutatott doktori dolgozat célkitűzései röviden a következők voltak: 1. Transzgénikusan módosított, hisztamin-hiányos egerekből izolált dendritikus sejtek antigénprezentációjának vizsgálata 2. Hisztamin-hiányos és vad típusú dendritikus sejtek alpopulációinak és kostimulációs mintázatának összehasonlítása 3. Hisztamin-hiányos dendritikus sejtek citokin termelésének vizsgálata in vitro stimulálás után 4. Hisztamin-hiányos dendritikus sejtek citokin termelésének vizsgálata in vivo aktiválás után 5. Egér eredetű dendritikus sejtek különböző hisztamin receptor expressziójának vizsgálata 6. A H4R szerepének tanulmányozása az antigénprezentációjának folyamatában 7. A H4R szerepének elemzése dendritikus sejtek citokin termelésében 8. A H4R hatásának vizsgálata dendritikus sejtek migrációjára

25

..

III... Anyagok és módszerek

III.1 Anyagok III.1.1 Állatok Kísérleteinkhez kétféle génkiütött (knockout, KO) egérmodellt használtunk, amelyek intézetünk állatházában, SPF körülmények között voltak tartva. Minden kísérlethez 8-10 hetes nőstény egereket használtunk fel. Mindkét egérmodell beltenyésztett, Balb/c egértörzsből származik. Az egyik egértörzs genetikailag hisztamin hiányos (HDC-/-), mert hiányzik belőle a hisztamin előállításáért felelős enzim, a hisztidin-dekarboxiláz (HDC) génje. Mivel ez az egyetlen enzim, amely hisztidinből hisztamint képes előállítani, ennek a génnek a kiütésével az állat többé nem képes hisztamin termelésre. A HDC-/- egértörzset Ohtsu és társai homológ rekombinációval hozták létre intézetünkkel együttműködve54. Annak érdekében, hogy az állatok a táplálék útján se juthassanak hisztaminhoz, már a kísérleteket megelőző két hétben speciális, hisztamin-mentes tápon tartottuk őket. Így, mindezek eredményeként teljes hisztamin hiányt értünk el az egerekben. Kísérleteink második részében olyan egereket használtunk, amelyekből a hisztamin újonnan felfedezett, negyedik receptorát, a H4R-t ütötték ki homológ rekombinációval (H4R-/-)99. Ezt az egértörzset a Lexon Genetics hozta létre, intézetünkhöz a Johnson&Johnson jóvoltából került. Ezt az egértörzset a nem beltenyésztett SV129 törzsből intézetünk keresztezte vissza Balb/c, beltenyésztett törzsbe. Mindkét esetben a kísérletekhez génkiütött egerek mellett Balb/c hátterű vad (wild type, WT) genotípusú egyedeket alkalmaztunk kontrollként.

III.1.2 Primer sejtek, sejtkultúrák •

Izolált dendritikus sejtek:

HDC-/-, H4R-/- és vad típusú egerek lépeiből, mágneses gyöngyök segítségével (MACS® rendszerrel, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Németország) dendritikus sejteket

26

szeparáltunk, ezeket a sejteket használtuk fel későbbi kísérleteinkhez (lsd. még Módszerek című alfejezet). •

CTLL-2:

Limfoblaszt sejtvonal, citotoxikus T-sejt klón. Ez a vonal IL-2 dependens124, ezért kiválóan alkalmas az IL-2 citokin mennyiségi változásának pontos és érzékeny nyomon követésére. •

5/4E8:

Egér T-sejt hibridóma sejtvonal, amely a humán aggrekán peptid epitópjának (ATEGRVRVNSAYQDK)

specifikus

felismerésére

képes

T-sejt

receptorral

125

rendelkezik .

III.1.3 Kísérletek során alkalmazott médiumok •

RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) Kiegészítve:

10% hő-inaktivált FCS (Invitrogen, Gibco, Paisley, USA) 160μg/ml gentamicin (Biochemie Ausztria, Kundl, Ausztria) 2mM glutamin (Sigma-Aldrich, Disenhofen, Németország) 50μM β-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich, Disenhofen, Németország)

•

DMEM (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) Kiegészítve:

10% hő inaktivált FCS (Invitrogen, Gibco, Paisley, USA) 160μg/ml gentamicin (Biochemie Ausztria, Kundl, Ausztria) 2mM glutamin (Sigma-Aldrich, Disenhofen, Németország) 50μM β-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich, Disenhofen, Németország) 1% nem esszenciális aminosavak (Sigma-Aldrich, Disenhofen, Németország) 1% nátrium-piruvát (Sigma-Aldrich, Disenhofen, Németország)

27

III.1.3 Pufferek és egyéb oldatok •

1xPBS

•

MACS puffer:

1xPBS 0,5% BSA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) 2mM EDTA

•

Kollagenáz D oldat:

RPMI médium 2mg/ml Kollagenáz D (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország)

•

MTT oldat:

MTT (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) 5 mg/ml 1xPBS-ben

•

3%-os BSA oldat 1xPBS-ben

•

0,02M EDTA 1xPBS-ben

•

FITC oldat

5mg FITC (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) oldva 2ml dibutil-ftalát–aceton 1:1 arányú elegyében (FITC painting assay-hez)

28

III.1.4 Antitestek, mágneses gyöngyhöz konjugált antitestek, peptidek, ELISA •

Antitestek: Az összes antitest a BD Biosciences Pharmingen-től származik (San Diego, CA, USA) kivéve a DEC 205 antitestet, amelyet a Serotec Ltd-től vásároltunk, (Oxford, Anglia). Fluoreszcensen jelölt antitestek: PE anti-mouse CD11c PerCP anti-mouse CD8α FITC anti-mouse I-A/I-E (MHCII) FITC anti-mouse CD4 FITC anti-mouse CD11b FITC anti-mouse CD40 FITC anti-mouse CD80 FITC anti-mouse CD86 FITC anti-mouse DEC205 Fc-Receptor-Blokkoló: CD32/CD16 Mouse Fc Block Izotípus kontrollok: FITC Rat IgG2a FITC Rat IgG2b PE Rat IgG2a PE Rat IgG2b PE Hamster IgG1a PerCP Rat IgG2a

29

•

Aggrekán peptid:

Humán aggrekán peptid Aminosav sorrend: ATEGRVRVNSAYQDK (Dr. Hudecz Ferenc jóvoltából, Peptidkémiai Kutatócsoport, ELTE, Budapest)

•

CCL19:

Rekombináns egér CCL19 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)

•

GM-CSF:

Rekombináns egér GM-CSF (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA)

•

Mágneses gyöngyök:

CD11c (N418) MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Németország)

•

IFNg ELISA kit:

Quantikine Mouse IFNg Immunoassay Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)

•

IL-12p70 ELISA kit:

Quantikine Mouse IL-12p70 Immunoassay Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)

III.1.5 RNS izoláláshoz, tisztításhoz, átírásához és real time PCR-hez szükséges eszközök •

RNS izolálás:

TRI Reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)

•

DNS emésztés:

DNase I (Promega, Madison, WI, USA) DNase buffer (Promega, Madison, WI, USA) STOP solution (Promega, Madison, WI, USA)

•

Reverz transzkripció: 10x buffer

30

MgCl2 dNTP RNase inhibitor Random hexamer primers Reverse transcriptase (mind: Promega, Madison, WI, USA) •

Taqman Universal PCR Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

•

Taqman real time próbák: mGAPDH, mHGPRT, mCCR7, mCCR6, mCXCR4, mIL12p35, mIL-10, mIFNγ, mIL-4, mT-bet, mGATA-3, mH1R,

mH2R,

mH3R,

mH4R,

(mind:

Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA)

III.1.6 Egyéb reagensek és eszközök •

Hisztamin és antagonistái: Hisztamin (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) Fexofenadin (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) Famotidin (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) Thioperamid (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) JNJ7777120 (R.L. Thurmond jóvoltából, Johnson&Johnson Labs, San Diego, USA)

•

Mikropartikulumok: Polisztirénből készült mikropartikulumok, átlag átmérő 15 μm, normalizáláshoz használtuk fel FACS mérések során, sejtszámolás céljára (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Svédország).

•

CFA, komplett Freund adjuváns (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország)

31

•

LPS (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország)

•

DMSO (Renal Finomvegyszergyár Rt., Budapest)

•

Lefedőanyag:

ProLong® Gold antifade reagent with DAPI (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA)

•

Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország)

•

MS mágneses sejtszeparáló oszlopok (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Németország)

•

Multiwell ELISA leolvasó (Labsystems, Helsinki, Finnország)

•

Nanodrop ND-1000 spektrofotométer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)

•

Gene Ataq Controller standard PCR automata (Pharmacia LKB, Uppsala, Svédország)

•

AbiPrism® 7000 real time PCR automata (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

•

FACSCalibur™ áramlási citométer (BD Biosciences, Pharmingen, San Jose, CA, USA)

•

Transwells® migrációs rendszer 5 µm pórus méret; 6,5 mm átmérő (Costar, Cambridge, MA, USA)

•

Olympus IX81 Fluoreszcens mikroszkóp (Olympus, Tokyo, Japán)

32

III.2 Módszerek III.2.1 Dendritikus sejt izolálás A kísérletekhez egér lépből dendritikus sejteket (DC-ket) szeparáltunk MACS® rendszerrel (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Németország). A szeparálás antigénantitest kölcsönhatáson alapszik, és a DC-k azonosítására alkalmas, mágneses gyöngyökhöz kapcsolt, a CD11c-t felismerő ellenanyagok használatával történik. A lépsejteket ezekkel a speciális gyöngyökhöz kötött ellenanyagokkal inkubáltuk, majd a mintát mágneses térbe helyeztük, és az erre szolgáló mágneses oszlopokon engedtük keresztül. Így a CD11c pozitív DC-k a mágneses tér hatására az oszlopon fennakadtak és elkülönültek a többi lépsejttől. Ezek után az oszlopot eltávolítottuk a mágneses térből, és a DC-ket MACS-pufferrel történt mosással begyűjtöttük. Az eljárás során végig a gyártó ajánlása szerint, a következőképpen jártunk el. Az egerekből kivett lépeket azonnal, egyenként 3 cm-es Petri-csészében, Kollagenáz D oldatba helyeztük, úgy, hogy teljesen elfedje a lépeket a folyadék. A lépekbe 0,5 ml Kollagenáz D oldatot injektáltunk, majd apró darabokra vágtuk és egy órán keresztül 37°C-on inkubáltuk őket. Az emésztés eredményeképp létrejött sejtszuszpenziót 40 μmes szűrőn szűrtük, mostuk MACS pufferben, és úgy állítottuk be a sejtszámot, hogy a végső sejtkoncentráció 108 sejt/400 μl MACS puffer legyen. Ezek után 5 μl Fc receptor blokkolót adtunk annak érdekében, hogy az aspecifikus kötődés esélyét lecsökkentsük, majd 5 perc után a dendritikus sejteket 100μl MACS CD11c mikrogyönggyel jelöltük. 15 perc 4°C-on történő inkubálás után a sejteket mostuk, majd felvettük 500 ml MACS pufferben, és a mágneses térbe helyezett, előnedvesített mágneses MS oszlopokon engedtük keresztül. Az oszlopot ezután háromszor mostuk, majd eltávolítottuk a mágneses térből. A DC-ket 1 ml MACS pufferrel eluáltuk az oszlopról. Ezzel a módszerrel igen nagy tisztasággal szeparálhatók DC-k. Egy lépből átlagosan 2 millió sejt nyerhető ki. A kapott sejtpopuláció tisztaságát áramlási citometriával ellenőriztük; a tisztaság átlagosan 95% feletti volt.

III.2.2 In vitro antigénprezentációs assay A lépekből szeparált DC-k antigénbemutató képességét egy bioassay segítségével vizsgáltuk. A vizsgálathoz HDC-/- és vad egereket, illetve H4R-/- és vad egereket,

33

kísérletenként 5-5 állatot használtunk fel. Minden kísérletben állatonként 6-6 technikai parallellel dolgoztunk. Az assay az alábbi három egymást követő lépésből áll. Antigénprezentáció A szeparált DC-ket 96 lyukú plate-en (103 sejt/lyuk) egy, a humán aggrekán peptidre specifikus, 5/4 E8 T-sejt hibridóma sejtvonallal125 (104 sejt/lyuk) tenyésztettük együtt, 24 órán keresztül aggrekán peptid jelenlétében (1 μg/lyuk), vagy hiányában, DMEM tápfolyadékban. A DC-k felvették az antigént, feldolgozták és bemutatták a T-sejteknek, amelyek ez által aktiválódtak. Az aktiválódás következményeként a T-sejtek IL-2 citokint kezdtek termelni, amely e sejtek intrinsic növekedési faktora. A termelt IL-2 mennyisége arányos az aktiválódott T-sejtek számával és aktiváltsági szintjükkel, és ez által a bemutatás hatékonyságával is. 24 óra múlva a sejtek felülúszójából mértük a termelődött IL-2 mennyiségét. CTLL proliferációs assay A begyűjtött felülúszókat CTLL sejtekhez adtuk, amelyek csak IL-2 jelenlétében képesek szaporodni, osztódási rátájuk pedig egyenesen arányos a rendelkezésükre álló IL-2 mennyiségével124. Ez a rendszer alkalmas az IL-2 citokin igen szenzitív és pontos kimutatására. A CTLL sejteket (5 x 103 sejt/lyuk) 96-os platen, 100 μl felülúszóban és 100 μl friss DMEM médiumban tenyésztettük 72 órán keresztül, majd a sejtproliferáció mértékét MTT assay-vel határoztuk meg. Minden esetben a CTLL sejteket felülúszó nélkül, tisztán 200 μl DMEM médiumban is tenyésztettünk kontrollként. MTT assay A CTLL sejtproliferáció mértékének meghatározására MTT assay-t használtunk. Az assay lényege, hogy az oldott MTT a sejtek mitokondriális dehidrogenázai hatására formazán kristállyá metabolizálódik, amely mennyisége DMSO-ban töténő oldás után spektrofotometriásan meghatározható. Vizsgálataink során a CTLL sejtekhez 72 óra múlva 20 μl MTT oldatot adtunk és három órán keresztül inkubáltuk őket. Centrifugálás után a felülúszót eltávolítottuk. A keletkezett kristályokat ezután 200 μl DMSO-ban oldottuk. A tökéletes oldódás érdekében a plateket rázóberendezésben rázattuk 15 percen keresztül, majd az optikai denzitást spektrofotometriásan, ELISA leolvasó

34

segítségével mértük 540 nm-en (alkalmazott háttér hullámhossz: 690 nm). A kísérletek egy részében az antigénprezentációs assayt különböző hisztamin receptor blokkolók, illetve a hisztamin jelenlétében végeztük. A kezelési koncentráció minden esetben 10-6 M volt. Amennyiben mind hisztaminnal, mind antagonistával kezeltünk, először mindig az antagonistákat adtuk, majd 10 perc múlva hisztamint is a médiumba jutattuk.

III.2.3 Hisztamin és H4R antagonista hatása aktivált dendritikus sejtek in vitro citokin termelésére A mágnesesen szeparált DC-k in vitro citokin termelésének vizsgálatához két független kísérletet végeztünk. Az első kísérletben az elegendő sejtszám elérésének érdekében 6-6 HDC-/-, illetve vad egér lépéből izolált DC-ket egyesítettük. A vizsgálathoz összesen 1818 állatot használtunk fel, 3-3 párhozamost képezve. Az izolált dendritikus sejteket 2x106 sejt/ml koncentrációban, RPMI médiumban vettük fel és 1 éjszakán át 37°C-on tartottuk 10 ng/ml rGM-CSF jelenlétében. Ezután a sejteket 1 μg LPS-sel és/vagy 10-6 M hisztaminnal kezeltük további 24 órán keresztül. A második kísérletsorozatban a fent leírtakkal megegyezően izoláltunk DC-ket ezúttal kizárólag vad típusú egerekből. Az izolált DC-ket 1 μg/ml LPS-sel, 10-6 M hisztaminnal, illetve specifikus H4R antagonistával (JNJ7777120, 10-6 M) kezeltük 24 órán keresztül. A kísérletek végeztével a sejtekből RNS-t izoláltunk, a felülúszót pedig 20°C-on tároltuk, későbbi fehérje mérés céljából.

III.2.4 In vivo dendritikus sejt stimulációs modell Az in vivo kísérletekhez HDC-/-, illetve vad egereket 200 μl PBS-sel (kontroll), illetve CFA emulzióval (amely 0,1 mg Mycobacterum tuberculosis H37 Ra-t tartalmazott) kezeltünk intraperitoneálisan. Csoportonként 10-10 állatot kezeltünk. Az immunizálás 9. napján 2-2 állat lépét egyesítve DC-ket szeparáltunk, majd a sejtekből RNS-t izoláltunk.

35

III.2.5 RNS izolálás, reverz transzkripció és real time PCR RNS izolálás Az RNS izolálást TRI reagens segítségével (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) végeztük, a gyártó előírásai szerint. Az RNS-minták integritását 2%-os agaróz gélelektroforézis

segítségével,

tisztaságát

és

a

preparáció

hozamát

pedig

spektrofotometriásan, 260/280 nm-en állapítottuk meg. DNS emésztés és reverz transzkripció Annak érdekében, hogy teljesen tiszta, DNS-mentes RNS mintákat kapjunk, a mintákat DNase I kezelésnek vetettük alá. Ennek során az RNS mintákat μg-ként 1 μl DNase I és 1 μl 10x pufferrel inkubáltuk 30 percen keresztül 37°C-on, majd a DNS emésztést a gyártó által megadott STOP oldattal állítottuk le úgy, hogy 1 μl oldatot a mintákhoz adva 10 percig 65°C-on tartottuk őket. Ezután 2 μg totál RNS-t PCR automatával cDNS-sé írtunk át a következők szerint: RT reakcióelegy (40 μl): •

4 µl 10x puffer

•

8 µl MgCl2

•

4 µl dNTP

•

2 µl RNase inhibitor

•

1 µl random hexamer primers

•

1 µl reverse transcriptase

•

2 µg RNS

•

Desztillált víz ad 40 μl

Hőmérsékleti program: •

42°C, 45 perc

•

99°C, 5 perc

•

Hűtés

Az átírt cDNS-ekből ezután real time PCR készült.

36

Real time PCR A Taqman rendszeren alapuló quantitatív real time PCR vizsgálatokat AbiPrism® 7000 PCR automatával végeztük, betartva a gyártó instrukcióit. Számos gén expressziós szintjét vizsgáltuk ezzel a rendszerrel, minden esetben a gyártó által garantált, Taqman Universal PCR Mix segítségével. Az alábbi, az AbiPrism real time PCR-platformhoz a kereskedelemben elérhető Taqman próba készleteket használtuk fel: IL-12p35, IFNγ, IL-10, IL-4, T-bet, GATA-3, CCR7, CCR6, CXCR4, H1R, H2R, H3R, H4R. Belső housekeeping kontrollként GAPDH és HGPRT próbakészletet használtunk. A PCR reakciókat 96 lyukú plateken végeztük. A reakció előtt elkészítettük a próbák és a reakcióelegy keverékeit (lyukanként 12,5 μl Taqman Universal PCR Mix és 1,3 μl próba) illetve a reverz transzkripcióból származó cDNS hígított oldatát (lyukanként 2 μl cDNS és 9,2 μl desztillált víz). A reakciót megelőzően a két oldatot a lyukakba pipettáztuk. A teljes térfogat 25 μl/lyuk volt. A real time PCR-protokollt templát nélküli negatív kontrollok jelenlétében végeztük, valamennyi mintából két paralellt mértünk. A kapott eredményeket a komparatív CT (ΔΔCT)-módszer segítségével értékeltük ki, az eredményt minden esetben a megfelelő housekeeping mRNS-szintekre vonatkoztatva.

III.2.6 Áramlási citometriás vizsgálatok A szeparált DC-k tisztaságát, az egyes dendritikus sejt alpopulációk arányát és a sejtek felszínén található egyes kostimulációs molekulák expressziós mintázatát áramlási citometriás vizsgálatokkal határoztuk meg. A DC-k jellemző sejtfelszíni molekuláit fluorokróm-konjugált antitestekkel jelöltük meg. A festést erre alkalmas FACS-csövekben végeztük, jelölésenként maximálisan 106 sejttel. A sejteket mosás után 50 μl PBS-ben jelöltük. Annak érdekében, hogy megakadályozzuk az aspecifikus kötődést, a sejteket először tisztított CD32/CD16 egér Fc receptor blokkolóval inkubáltuk 4°C-on 5 percig, majd mosás nélkül jelöltük a sejteket a megfelelő specifikus antitestekkel és izotípus kontrollokkal. A mérések során kétszínű (FITC és PE), illetve háromszínű (FITC, PE, PerCP) jelöléseket alkalmaztunk. A festési protokoll minden esetben 20 percig sötétben, 4°C-on történő inkubálás, majd mosás volt. Ezután a sejteket 300 μl PBS-ben vettük fel a FACS méréshez. A mintákat

37

áramlási citométerrel mértük, az eredményeket pedig a CELLQuestTM szoftver segítségével analizáltuk ki.

III.2.7 ELISA IFNγ és IL-12 ELISA méréseket végeztünk az in vitro stimulált DC-k 24 órás felülúszóiból. Quantikine Mouse IFNγ Immunoassay Kit-et, illetve Quantikine Mouse IL-12p70 Immunoassay Kit-et használtunk, mindkét esetben a gyártó előírásainak megfelelően.

III.2.8 In vitro migrációs assay A DC-k jellemzően motilis sejtek; miután felveszik az antigéneket, bevándorolnak a környéki nyirokcsomókba, hogy ott bemutathassák azokat T-limfocitáknak. Ezt a folyamatot modelleztük kísérleteink során egy in vitro transwell migrációs assay segítségével. A mágnesesen szeparált DC-ket egy éjszakán keresztül RPMI médiumban pihentettük 10 ng/ml rGM-CSF jelenlétében. Ezután a DC-ket friss RPMI médiumban vettük fel 106/ml koncentrációban GM-CSF nélkül. A migrációhoz előkészítettük a transwell rendszert, a kamrákba inzerteket helyeztünk és RPMI médiummal kezeltük elő 1 órán át (az alsó lyukakba 600 μl, az inzertekbe 200 μl RPMI médium került). Ezután az alsó kamrákba CCL19-et (100 ng/ml), hisztamint (10-6 M), illetve a kettő elegyét tettük. Minden kísérlet során csak RPMI-t tartalmazó kamrákat is hagytunk kontrollként. A felső inzertekbe az RPMI helyére óvatosan 200μl DC-ket tartalmazó sejtszuszpenziót rétegeztünk (2x105 DC/inzert) és a sejteket 37°C-on, termosztátban, 90 percig migráltattuk a membránon keresztül. A kísérletek egy részében a DC-ket H4R antagonistával (JNJ7777120) kezeltük elő (10-6 M) a migrációs assayt megelőző 10 percben, majd a felső inzertekbe helyeztük őket és a fent leírt módon jártunk el. Az inkubációs idő elteltével az inzerteket eltávolítottuk és áramlási citométerrel meghatároztuk a membránon keresztülvándorolt DC-k számát. Az alsó, most már DCket is tartalmazó kamrákba normalizálási célból 2x104 polisztirénből készült mikropartikulumot adtunk, majd a kamrák teljes tartalmát FACS csövekbe helyeztük át, és azonnal megkezdtük a FACS mérést. A mérés során két kaput készítettünk, egyet a

38

partikulumok, egyet pedig a DC-k számára. A mérést addig folytattuk, míg 1x104 partikulumot összegyűjtöttünk. Az ez idő alatt a DC kapuba került sejtszámot (1x104 partikulumra normalizált sejtszám) CELLQuestTM szoftver segítségével határoztuk meg.

III.2.9 Epidermisz preparálás és Langerhans sejtek vizsgálata Epidermisz preparálás A bőrben található DC-ket Langerhans sejteknek (LC-k) nevezik. Ezek a sejtek ugyancsak hatékony antigénbemutató sejtek, amelyek igen nagy migrációs potenciállal rendelkeznek. A LC-k epidermiszben MHCII pozitivitásuk folytán immuncitokémiai reakcióval kimutathatóak. A vizsgálathoz H4R-/- és vad egerek füleit használtuk fel. Miután éles szikével eltávolítottuk az egerek füleit, intenzíven mostuk őket 70%-os etanolban, majd kettéválasztottuk a füleket, dorzális és ventrális oldalra. Ezek után a két oldallal különkülön dolgoztunk tovább. A füleket ezután 0,02 M-os EDTA oldatban inkubáltuk 37°Con 90 percig. PBS-ben történő mosás után lepreparáltuk az epidermiszt a dermiszről, majd 20 percig -20°C-os acetonban fixáltuk az epidermiszeket. Az epidermiszeket ezután többször mostuk PBS-ben, majd tárgylemezre helyeztük. Langerhans sejtek vizsgálata MHCII immuncitokémiai festődés alapján Az epidemisz preparátumokat 1 órán át tartó 3%-os PBS-BSA-val történt blokkolás után, 1:250-es hígításban FITC-cel konjugált MHCII antitesttel inkubáltuk 3 órán keresztül sötétben, 4°C-on. Az ellenanyag eltávolítása után, 3x mostuk a lemezt PBSsel. A mintákra 1 csepp lefedőt cseppentettünk, majd lefedtük őket fedőlemezzel. A mintákat ezután mikroszkóposan analizáltuk és meghatároztuk az adott egységnyi felületre eső LC-k számát, és festődésük intenzitását. Egy epidermisz mintában tíz, random módon kiválasztott, azonos nagyságú területet analizáltunk 40x nagyítás mellett. A mintában található egységnyi területre eső LC-k számát átlagolás után határoztuk meg.

39

III.2.10 In vivo migrációs assay (FITC painting assay) A LC-k in vivo migrációjának vizsgálatára egy FITC painting néven ismert assayt dolgoztak ki, amelyet mi is a leírtak szerint végeztünk, apró módosításokkal126;127. H4R/-

és vad típusú egerek abdominális (hasi) tájékáról eltávolítottuk a szőrzetet, majd 300

μl FITC - dibutil-ftalát - aceton oldatot pipettáztunk a felületre. Az egereket még fél órán át altatásban tartottuk, hogy az aceton elpárologjon és a FITC megfelelő mértékben felszívódjon. 18 órával később az egerekből izoláltuk az inguinális nyirokcsomókat, amelyeket Kollagenáz D oldatba helyeztük, úgy, hogy teljesen elfedje őket folyadék. A nyirokcsomókat apró darabokra vágtuk és fél órán keresztül 37°C-on inkubáltuk. Az emésztés eredményeként létrejött sejtszuszpenziót mostuk, az esetlegesen megmaradt törmelékeket szűréssel eltávolítottuk, majd meghatároztuk az így létrejött szuszpenziót alkotó sejtek számát. Ezután a sejtszuszpenziót Histopaque 1083 grádiens centrifugálás (20 perc, 740 g) segítségével feldúsítottuk mononukleáris sejtekben. Végül a sejteket CD11c PE antitesttel jelöltük és az „áramlási citometriás vizsgálatok” fejezetben leírtak szerint meghatároztuk a FITC+ CD11c+ sejtek, azaz a nyirokcsomóba vándorolt LC-k arányát. Ezen kívül a sejteket mikroszkóp alatt is analizáltuk. III.2.11 Statisztikai elemzések A későbbiekben bemutatott adatok,

eredmények

statisztikai

feldolgozását

a

SigmaStat™ szoftvercsomag (SPSS Inc.) segítségével végeztük el. Az értékelt adatcsoportok és a rájuk ható faktorok számától, az adatcsoportok adatainak eloszlásától és

szórásainak

homogenitásától

függően

kétmintás

t-próbát,

egyfaktoros

varianciaanalízist (One-Way ANOVA), kétfaktoros varianciaanalízist (Two-Way ANOVA), háromfaktoros varianciaanalízis (Three-Way ANOVA) és kétfaktoros, ismétléses varianciaanalízist (Two-Way Repeated Measures ANOVA) használtunk, szükség

szerint.

Post

hoc

tesztként

a

Holm-Sidak

tesztet

alkalmaztunk.

Mintacsoportokat közötti különbségeket 0,05-ös hibaküszöb alatti p-értékek esetén tekintettünk szignifikánsnak.

40

..

IV... Eredmények

IV.1 HDC-/- és vad típusú DC-k antigénprezentáló képességének összehasonlítása Mint ahogyan a bevezetőben említettük, a dendritikus sejtek (DC-k) a legfontosabb antigénprezentáló sejtek. Feladatuk azonban nemcsak egyszerűen az antigének felvétele, feldolgozása és bemutatása T-limfocitáknak, hanem ennél sokkal komplexebb szerepet töltenek be az immunfolyamatokban. A DC-k az antigének természetétől függően megfelelő érési folyamaton mennek keresztül, melynek eredményeként meghatározott kostimulációs szignálokat és citokin mintázatot mutatnak, ezzel meghatározzák a T-sejt válasz jellegét, erejét és irányát. Első kísérleteinkben összehasonlítottuk vad típusú és HDC-/- DC-k antigén-specifikus T-sejt stimuláló képességét egy in vitro antigénpezentációs assay-vel. A szeparált DCket 5/4E8 T-sejt hibridóma sejtvonallal tenyésztettük együtt humán aggrekán peptid jelenlétében, illetve hiányában, 24 órán keresztül. A DC-k felvették és bemutatták az antigént a T-sejtek, amelyek ennek következtében aktiválódtak és ennek jeleként IL-2 citokint termeltek. Az T-limfociták antigénspecifikus IL-2 termelését egy IL-2 dependens CTLL-2 proliferációt követő MTT assay segítségével határoztuk meg. A minták közti eltérések mértékét kétfaktoros, ismétléses varianciaanalízis segítségével határoztuk meg (Two Way RM-ANOVA), post hoc tesztként Holm-Sidak tesztet végezve el. Ez az assay igen érzékeny, ezért alkalmas volt arra, hogy igazoljuk, hogy már 103 darab dendritikus sejt is elegendően hatékonyan mutat be antigéneket és stimulál T limfocitákat ahhoz, hogy azok a rendszer számára mérhető mennyiségű IL-2 citokint termeljenek (p<0,001). Ezen felül azt is kimutattuk, hogy a HDC-/- egerek DC-i a vad típusú sejtekkel összehasonlítva sokkal hatékonyabban mutatták be az antigéneket és stimulálták a T-limfocitákat (p=0,002; 5. ábra).

41

5. ábra Vad (WT) és HDC‐/‐ DC‐k in vitro antigénprezentáló képessége  Az oszlopdiagramon 5 párhuzamos kísérletből származtatott átlag értékek (+SEM) láthatók. Az  ábrán  a  kísérlet  eredményeinek  statisztikai  analíziséből  származó  (Two‐Way  Repeated  Measures ANOVA, és Holm‐Sidak, mint post hoc teszt) fontosabb eredményeket is ábrázoltuk  (**: p<0,01, ***: p<0,001). OD= optikai denzitás. 

IV.2 HDC-/- és vad típusú DC-k áramlási citometriás vizsgálata Számos irodalmi adat is megerősíti, hogy különböző alpopulációba tartozó DC-k eltérő antigénbemutató képességgel rendelkeznek, és más-más módon aktiválják a Tsejteket52;128. Ezért második kísérletünkben szükségesnek tartottuk megvizsgálni a különböző kísérleti csoportokba tartozó szeparált DC-k alpopulációinak megoszlását, amely esetleg magyarázhatja az antigénprezentációs képességükben talált jelentős különbségeket. A DC két fő alpopulációjának megoszlását vizsgáltuk jellemző sejtfelszíni mintázatuk alapján, áramlási citométerrel. A mieloid alpopulációba tartozó DC-ket CD11c, CD11b, és CD4-el történő jelölődésük alapján, a limfoid alpopulációba tartozókat pedig CD11c, CD8α, és DEC205-el megfigyelhető festődésük szerint határoztuk meg. Az alábbiakban bemutatott vizsgálatok kiértékeléséhez legalább három, egymástól független mérést végeztünk. Sem a fő DC marker, a CD11c sejtfelszíni megjelenésében, sem a sejtek MHCII expressziójában nem találtunk eltérést a HDC-/- és vad típusú egerek szeparált DC-jeit analizálva (6.A ábra). Ugyanígy nem találtunk eltérést a DC alpopulációk megoszlásában sem (6.C ábra).

42

A továbbiakban azt is megvizsgáltuk, van-e eltérés a két csoport kostimulációs molekula mintázatában, amely ugyancsak magyarázhatja az antigénbemutatásban tapasztalt eltérést. Három alapvető fontosságú kostimulációs molekula sejtfelszíni expresszióját vizsgáltuk (CD80, CD86, CD40), de ezekben sem találtunk eltérést a HDC-/- és vad DC-k között (6.B ábra). Kísérleti adatainkból megállapíthattuk, hogy a HDC-/- és vad DC-k eltérő antigénbemutató képessége mögött nem a sejtek eltérő fenotípusa, aktiváltsági szintje, vagy kostimulációs mintázata áll.

43

6. ábra Vad típusú (WT) és HDC‐/‐ DC‐k sejtfelszíni molekula expressziója  Az  ábrán  WT  és  HDC‐/‐  egerek  lépeiből  izolált  DC‐k  CD11c  és  MHCII  (A),  CD40,  CD80  és  CD86 kostimulációs molekula (B) illetve jellemző DC alosztály marker (C) expressziója látható.  Az  ábrán  látható  diagramok  3  független  kísérletből  származó  reprezentatív  eredmények.  A  markereket  hordozó  pozitív  sejtek  aránya,  illetve  az  átlagos  marker  intenzitási  értékek  százalékban, illetve mean fluorescence intensity (MFI) értékekben vannak megadva. A pontozott  görbék a megfelelő izotípus kontrollokkal elvégzett festéseket reprezentálják. 

44

IV.3 HDC-/- és vad típusú DC-k in vitro citokin termelésének vizsgálata A DC-k alapvető feladata a T-limfociták antigén függő aktiválása, és az immunválasz típusának meghatározása. Ebben a folyamatban a dendritikus sejtek által termelt citokinek döntő fontosságúak a T-sejtek Th1, Th2, vagy Treg irányba történő polarizálásában, illetve az adaptív immunválasz erősségét is meghatározzák. A következő kísérletekben azt vizsgáltuk, vajon DC-k differenciálódása során a hisztamin jelenléte vagy hiánya megváltoztatja-e a dendritikus sejtek citokin termelését, és

vezethet-e

mindez

a

DC-k

antigénprezentáló

képességének

dramatikus

megváltozásához. Arra is kíváncsiak voltunk, hogy mindezen folyamatokat az exogén módon adott hisztamin milyen mértékben befolyásolja. Ennek érdekében a szeparált vad típusú és HDC-/- DC-ket in vitro 1 μg/ml LPS-sel stimuláltuk,

és

megvizsgáltuk

néhány,

az

immunválaszban

alapvető

citokin

6

expresszióját mRNS szinten. Mivel egy lépből átlagosan 2x10 DC szeparálható, a minták homogenitásának biztosítása érdekében, 3-3 vizsgálati csoportot készítettünk, csoportonként 6-6 lépből szeparált dendritikus sejtekből. 2x106/ml DC-t kezeltünk 24 órán keresztül, majd a sejtekből történt RNS izolálást követően real time PCR-rel határoztuk meg az IL-12p35, IFNγ, IL-10 és IL-4 citokinek mRNS expresszióját. A minták egy részét 10-6 M hisztaminnal is kezeltük. Az eredmények statisztikai elemzéséhez kétfaktoros ismétléses varianciaanalízist végeztünk (Two Way RM ANOVA), a szignifikáns eltéréseket Holm-Sidak teszttel, mint post-hoc teszttel analizáltuk. Az IL-12p35, IFNγ és IL-10 mRNS expressziója könnyen detektálható volt (7. ábra), ellenben az IL-4 citokin expressziós szintje alatta maradt a real time PCR érzékenységi küszöbének (nincs ábrázolva). Kísérleteink során azt találtuk, hogy a tipikusan Th1 citokin, az IFNγ expressziós szintje szignifikánsan magasabb volt a hisztamin hiányában differenciálódott HDC-/- DC-ben, mint a normál, vad típusú sejtekben (p=0,015, 7.A ábra) Az IL-12 és IL-10 expressziójában nem volt különbség a két csoportot vizsgálva. LPS kezelésre mind az IFNγ (p=0,001), mind az IL-10 (p=0,004) emelkedést mutatott, ugyanakkor érdekes módon az IL-12p35 szintje nem változott a kezelés hatására (7.B ábra).

45

7. ábra In  vitro  stimulált  vad  típusú  (WT)  és HDC‐/‐ DC‐k citokin termelése  6  állatból  poolozott  DC‐ket  LPS‐sel  (1  μg/ml),  hisztaminnal  (H)  (10‐6  M),  vagy  a  kettőt  kombinálva  kezeltünk  24  órán  keresztül,  majd  meghatároztuk  az  IFNγ  (A),  IL‐ 12p35  (B)  és  IL‐10  (C)  expressziós  szintjeit real time PCR segítségével.  Az  oszlopdiagramokon  3  független  kísérletből  származtatott  átlag  értékek (+SEM) láthatók.  A kísérlet eredményeinek statisztikai  analíziséből  származó  (Two‐Way  Repeated  Measures  ANOVA,  és  Holm‐Sidak,  mint  post  hoc  teszt)  fontosabb  eredményeket  is  ábrázoltuk (*: p<0,05, **: p<0,01). 

Az LPS-sel szemben, érdekes módon azt tapasztaltuk, hogy a 24 órás in vitro hisztaminkezelés nem csökkentette szignifikánsan egyik vizsgált citokin expresszióját sem (7. ábra).

46

Annak érdekében, hogy az mRNS-szinten tapasztalt változások megbízhatóságát megerősítsük fehérje szinten is, a sejtek felülúszójából a DC-k által termelt citokinek közül az IFNγ és az IL-12 fehérje szintű vizsgálata történt meg, ELISA segítségével. Sajnos a felülúszóban található IL-12p70 fehérje mennyisége 24 óra elteltével a detektálási küszöb alatt volt, ugyanakkor az IFNγ mennyisége, a minták bizonyos részében elegendő volt a mennyiségi összehasonlításhoz. A minták elemzése után megállapíthattuk, hogy igen jelentős eltérés van a vad típusú és HDC-/- DC-k IFNγ expressziós szintje között. A HDC-/- DC-k esetében szignifikánsan magasabb IFNγ-t termelés figyelhető meg fehérje szinten is (p=0,007; 8. ábra). Ez a megfigyelés egybevág az mRNS szinten tapasztaltakkal, és megerősíti azt a megfigyelésünket, hogy a HDC-/- DC-k erőteljesebb Th1 irányú szignált közvetítenek, mint azok a DC-k, amelyek hisztamin jelenlétében differenciálódtak.

8. ábra In vitro stimulált vad típusú (WT) and HDC‐/‐ DC‐k INFγ protein expressziója 6  állatból  poolozott  DC‐ket  LPS‐sel  (1  μg/ml),  hisztaminnal  (H)  (10‐6  M),  vagy  a  kettőt  kombinálva kezeltük 24 órán keresztül, majd a sejtek által termelt IFNγ protein mennyiségét a  sejtek  felülúszójából  IFNγ  ELISA  segítségével  határoztuk  meg.  Az  oszlopdiagramokon  3  független  kísérletből  származtatott  átlag  értékek  (+SEM)  láthatók.  A  kísérlet  eredményeinek  statisztikai  analíziséből  származó  (Two‐Way  Repeated  Measures  ANOVA,  és  Holm‐Sidak,  mint post hoc teszt) fontosabb eredményeket ábrázoltuk (, **: p<0,01, ***: p<0,001), nd = nem  detektálható. 

47

IV.4 HDC-/- és vad típusú DC-k in vivo citokin termelésének vizsgálata Mivel tisztában voltunk a mesterséges körülmények között elvégzett kísérletekből levonható következtetések korlátaival, illetve, hogy megerősítsük a fent említett in vitro eredményeket, in vivo rendszerben is megvizsgáltuk a DC-k citokin termelő képességét hisztamin jelenlétében és hiányában. Ezekben a kísérletekben HDC-/- és vad típusú egereket intraperitoneálisan oltottunk CFA-val, amely Th1 irányú polarizációt eredményez. Az oltást követő 9. napon az egerek lépeiből DC-ket izoláltunk és megmértük bennük a Th1 illetve Th2 válaszokra jellemző citokinek és transzkripciós faktorok expresszióját real time PCR-rel. Csoportonként 5-5 paralellel dolgoztunk, úgy, hogy 10-10 állatból származó DC-ket kettesével egyesítettük, majd analizáltuk a gének expressziós szintjeit. Az ezt követő kétfaktoros varianciaanalízis nyilvánvaló Th1 dominanciát mutatott ki a HDC-/- DC-k citokin profiljában (9. ábra). Az IL-12p35 expressziós szintje mind stimulált, mind stimulálatlan állapotban magasabb volt a HDC-/- DC-kben (p=0,009 és p=0,015), mint a vad típusú sejtekben, ugyanakkor a CFA kezelés nem eredményezett szignifikáns eltérést az IL-12p35 expressziós szintjében. Az IFNγ expresszióját tekintve a HDC-/DC-k ugyancsak magasabb expressziós szinteket mutattak, azonban ez az eltérés csak CFA kezelést követően volt szignifikáns (p=0,023; 9. ábra). Az IL-10 esetében a kontroll, kezeletlen állatokból származó DC-ket összehasonlítva a hisztamin hiánya (HDC-/-) ugyancsak a citokin szignifikáns emelkedését eredményezte (p<0,001), azonban a CFA stimulálást követően ezekben a mintákban jelentősen csökkent az expressziós szintjük (p=0,008), míg a vad állatok DC-iben nem volt megfigyelhető szignifikáns változás. Végül az IL-4 expressziós szintjeit vizsgálva a két kezeletlen mintacsoportban nem volt eltérés, míg CFA kezelést követően a vad DC-kben lecsökkent az IL-4 mRNS expressziója (p=0,021; 9. ábra). Megvizsgáltuk a két legfontosabb Th1 (T-bet) és Th2 (GATA-3) irányú polarizációban szerepet játszó, és DC-kben is bizonyítottan kifejeződő transzkripciós faktor expresszióját is, de esetükben nem találtunk szignifikáns különbséget a vizsgált csoportok expressziós szintjében (ábrával nem szerepeltetve).

48

Ezek az eredmények tehát azt sugallják, hogy a CFA-stimulált DC-k genetikailag hisztamin hiányos, HDC-/- állatokban citokin termelésük révén erőteljes Th1 irányú polarizációt indukálhatnak T-limfocitákban.

9. ábra Vad típusú (WT) and HDC‐/‐ DC‐k in vivo citokin termelése  WT és HDC‐/‐ egereket komplett Freund adjuváns (CFA) emulzióval kezeltünk ip., majd 9 nap  elteltével DC‐ket izoláltunk és mértük az IL‐12p35 (A), IFNγ (B), IL‐10 (C) és IL‐4 (D) mRNS  expressziós szinteket real time PCR segítségével. Az adatok 5 független kísérletből származnak.  Az  ábrákon  az  átlag  értékek  és  SEM‐jeik  láthatóak.  A  szignifikancia  értékeket  Two‐Way  ANOVA statisztikai elemzés segítségével határoztuk meg (*: p<0,05, **: p<0,01, ***: p<0,001). 

49

IV.5 Hisztamin receptorok expressziójának vizsgálata dendritikus sejteken Eddigi eredményeink azt mutatják, hogy a hisztamin igen fontos szerepet játszik a DC-k alapvető funkcióiban. A továbbiakban megvizsgáltuk, hogy az egér lépből szeparált DC-k mely hisztamin receptorokat expresszálják. Real time PCR-rel kimutattuk, hogy a DC-k expresszálnak H1, H2 és az újonnan felfedezett H4 receptort is, azonban H3R expresszió nem volt kimutatható a sejtekben (10. ábra).

H1R

H2R

H4R

10. ábra Vad típusú (WT) DC‐k hisztamin receptorainak expressziója  Reprezentatív  eredmények  a  H1R,  H2R,  H3R  és  H4R  mRNS  expressziót  vizsgáló  real  time  PCR‐es kísérletekből. Az ábrán az adott hisztamin receptor mRNS‐ekre specifikus fluoreszcens  jelek intenzitását ábrázoltuk a real time PCR ciklusszámának függvényében. Az ábrán látható  zöld vonal a jel intenzitás (CT, cycle treshold) meghatározásához választott határértéket jelzi. A  H3R esetében specifikus jel 45 cikluson belül nem volt kimérhető. 

50

IV.6 H4R-/- és vad típusú DC-k antigénprezentációs képességének összehasonlítása A hisztamin hatásainak közvetítése szempontjából a közelmúltban felfedezett hisztamin H4R a figyelem középpontjába került, hiszen ez a receptor típus sokkal nagyobb affinitással köti a hisztamint, mint bármely más hisztamin receptor, ráadásul szinte kizárólagosan az immunrendszer sejtjein található meg, amivel összhangban kimutattuk expresszióját a dendritikus sejtekben is. Szerepét az immunológiai folyamatokban, azonban csak részben tárták fel111. Kísérleteink további részében tehát azt vizsgáltuk, hogy ennek az újonnan felfedezett H4R-nak milyen szerepe van a hisztamin már megismert hatásainak közvetítésében. Elsőként a H4R-nak az antigénprezentációban betöltött szerepét vizsgáltuk, az előzőekben már ismertetett assay-vel, ezekben a kísérletekben azonban H4R génkiütött egerek dendritikus sejtjeit vizsgáltuk. Az assay segítségével tehát összehasonlítottuk H4R-/- és vad típusú szeparált DC-k antigénbemutató képességét. Eredményeinkből megállapíthatjuk, hogy azok a DC-k, amelyek nem rendelkeznek a felszínükön funkcióképes H4R-ral (H4R-/- DC-k) szignifikánsan jobb antigénprezentáló képességgel rendelkeznek, mint a vad típusú DC-k (p<0,001, 11. ábra), tehát feltételezhető, hogy a H4R fontos szerepet játszik a hisztamin antigénprezentációt csökkentő hatásának közvetítésében. Bár a statisztika igen meggyőző szignifikancia szintet állapított meg, azonban mégsem zárhattuk ki a többi hisztamin receptor részvételét ebben a folyamatban.

51

11. ábra Vad típusú (WT) és H4R‐/‐ DC‐k in vitro antigénprezentáló képessége  Az oszlopdiagramon 5 párhuzamos kísérletből származtatott átlag értékek (+SEM) láthatók. A  kísérlet  eredményeinek  statisztikai  analíziséből  származó  (Two‐Way  Repeated  Measures  ANOVA,  és  Holm‐Sidak,  mint  post  hoc  teszt)  fontosabb  eredményeket  is  ábrázoltuk  (***:  p<0,001). OD = optikai denzitás. 

IV.7 DC-k antigénprezentációs képességének összehasonlítása különböző hisztamin receptor blokkolók jelenlétében Mivel az eddigi vizsgálatok során nem tudtuk kizárni a többi hisztamin receptor közreműködését a hisztamin szerepének tisztázása során, a következő kísérletsorozatban ismét a DC-k antigénpzentációját vizsgáltunk, azonban ebben az esetben a hisztamin receptorok működését különböző specifikus hisztamin receptor blokkolókkal (2. táblázat) gátoltuk. Hisztamin receptor H1R H2R H3R/ H4R H4R

Antagonista Fexofenadin Famotidin Thioperamid JNJ7777120

Alkalmazott koncentráció 10-6M 10-6M 10-6M 10-6M

2. táblázat A kísérlethez vad típusú egerekből DC-ket szeparáltunk, majd a sejteket két csoportra osztva két kísérletet végeztünk. Az egyik csoporttal a már leírtak szerint antigénprezentációs assayt végeztünk, de különféle hisztamin receptor antagonisták

52

jelenlétében, annak érdekében, hogy kizárjuk az antagonisták önmagukban kifejtett esetleges hatásait. A másik csoport dendritikus sejtjeivel 10-6 M hisztamin és antagonisták együttes jelenlétében végeztük el az antigénprezentációs kísérletet. Az első kísérletsorozatban, ahol csak hisztamin receptor blokkolókat adtunk a rendszerhez, semmilyen szignifikáns eltérést nem tapasztaltunk, a kontroll és a kezelt minták között, kivéve a Thioperamid (H3R/H4R antagonista) esetében. A csak Thioperamiddal kezelt mintákban csökkent antigénprezentációt mértünk (p=0,014), ennek okát sajnos nem sikerült kiderítenünk, elképzelhető, hogy ez az anyag ebben a koncentrációban valamilyen módon gátló, vagy toxikus hatású a DC-kre nézve. Azokből a kísérletekből azonban, amelyeket hisztamin jelenlétében végeztünk egyértelműen

bebizonyosodott,

hogy

kizárólag

a

H4R

felelős

a

hisztamin

antigénprezentációban bemutatott negatív hatásainak közvetítéséért. Nem volt szignifikáns eltérés sem a H1R, sem a H2R, sem a H3R blokkolása esetében, csak abban az esetben, amikor H4R-t gátoltuk. Azok a DC-k, amelyek a hisztamin mellett specifikus H4R antagonistával, a JNJ7777120-al lettek kezelve, szignifikánsan jobb antigénbemutató képességgel rendelkeztek, mint a kezeletlen DC-k (p=0,003; 12. ábra)

12. ábra H4R antagonista hatása a DC‐k antigénprezentáló képességére  Az  izolált  vad  típusú  DC‐ket  hisztaminnal  (10‐6  M,  H)  kezeltük  elő,  majd  5/4  E8  T‐sejt  hibridóma  sejtvonallal  és  humán  aggrekán  peptiddel,  mint  antigénnel  kultiváltuk  együtt.  A  minták  egy  részében  a  H4R‐okat  specifikus  H4R  antagonistával  (10‐6  M,  JNJ777120)  blokkoltuk. Az antigén‐specifikus T‐sejt válasz erősségét CTLL‐2 proliferációs méréssel, illetve  az  azt  követő  MTT  assay  segítségével  határoztuk  meg. Az  oszlopdiagramon  5  párhuzamos  kísérletből  származtatott  átlag  értékek  (+SEM)  láthatók.  A  kísérlet  eredményeinek  statisztikai 

53

analíziséből származó (Two‐Way Repeated Measures ANOVA, és Holm‐Sidak, mint post hoc  teszt) fontosabb eredményeket is ábrázoltuk (**: p<0,01, ***: p<0,001). OD= optikai denzitás. 

IV.8 A H4R szerepe a hisztamin-mediált Th polarizációban Előző eredményeink azt mutatták, hogy a hisztamin megváltoztatja a dendritikus sejtek citokin profilját, a következőkben megvizsgáltuk a H4R szerepét ebben a folyamatban is. A kísérletek első részében vad és H4R-/- egerekből DC-ket szeparáltunk, majd megmértük néhány DC-k által termelt citokin és transzkripciós faktor expresszióját real time PCR-rel. A vizsgált markerek a következőek voltak: IL-12p35, IFNγ, TNFα, IL-4, és IL-10 a citokinek közül, továbbá a T-bet mint jellemzően Th1, és a GATA-3 mint karakterisztikus Th2 transzkripciós faktorok. Ellentétben a HDC-/- egerek esetében tapasztaltakkal, egyik vizsgált marker esetében sem tapasztaltunk eltérést a stimulálatlan vad és H4R-/- DC-ket vizsgálva, így ebből a kísérletből nem tudtuk a H4R szerepét azonosítani a DC-k T-sejt polarizációra gyakorolt hatásában (nincs ábrázolva). Ezután egy olyan kísérletsorozatot is elvégeztünk, amelyben a H4R-t aktuálisan a DC-k aktiválása során iktattuk ki, majd megvizsgáltuk a sejtek citokin termelő képességét. Ezekben a vizsgálatokban in vitro, LPS-sel aktivált DC-ket kezeltünk a specifikus H4R antagonistával JNJ7777120 (10-6M) és hisztaminnal (10-6M) 24 órán keresztül. Ezek után megvizsgáltuk az IFNγ, az IL12 és az IL-10 citokinek expresszióját mRNS szinten, real time PCR segítségével (13. ábra). A kezelt csoportok közötti különbségek ebben az esetben sem mutattak szignifikáns eltérést az egyfaktoros varianciaanalízist (One Way ANOVA) követő statisztikai elemzést követően. Ugyanakkor a 13. ábrán az a trend látszik, hogy a H4R-nak szerepe lehet a DC-k citokin termelésében, amely elsősorban az IFNγ expresszió esetében mutatkozott meg. A H4 receptor blokkolásával kivédhető volt a hisztamin mérsékelt, ám nem szignifikáns IFNγ expressziót csökkentő hatása. Az IL12p35 esetében ez a hisztamin hatás nem volt számottevő, ugyanakkor az IL-10 esetében a H4R blokkolásával nem volt kompenzálható a hisztamin IL-10 expresszióra gyakorolt mérséklő hatása.

54

13. ábra H4R szerepe a DC‐k citokin termelésében  Izolált DC‐ket in vitro LPS‐sel (1 μg/ml), hisztaminnal (10‐6 M), iletve H4R antagonistával (10‐ 6  M)  kezeltük  és  real  time  PCR  segítségével  mértük  az  IFNγ,  IL‐12p35  és  IL‐10  expressziós  szinteket. Az adatok 3 független kísérletből származnak. Az ábrákon az átlag értékek és SEM‐ jeik láthatóak. A statisztikai elemzést követően (One Way ANOVA) nem találtunk szignifikáns  eltérést a vizsgált csoportok között. 

IV.9 A H4R szerepe a DC-k in vitro migrációjában A DC-k jellegzetes vándorló sejtek. Eozinofileken és hízósejteken elvégzett kísérletek során azt tapasztalták, hogy a H4R szerepet játszhat a migrációs és kemotaktikus folyamatokban, azonban ezt a funkciót egér DC-ken mindezidáig nem igazolták. Kísérleteink során egy in vitro migrációs assay segítségével összehasonlítottuk a vad és H4R-/- DC-k vándorlási képességét. A differenciálódott DC-k a periférián az antigén stimulust követően egy érési folyamaton mennek keresztül, melynek alapvető mozzanata, hogy felszínükön megemelkedik a homingban legfontosabb receptor, a CCR7 expressziója. Ennek következtében a DC-k érzékelni tudják a nyirokcsomók felől jövő CCL19 hívójeleket, bevándorolnak a nyirokcsomókba, és aktiválhatják a rezidens T-limfocitákat. A következő kísérlettel ezt a folyamatot szerettük volna in vitro modellezni. Mágnesesen szeparált DC-ket transwell rendszerben egy 5 μm pórusvastagságú membránon vándoroltattunk keresztül. A vándorlás elősegítése céljából a membrán

55

túlsó oldalában lévő médiumba a DC-k perifériás nyirokcsomókba történő migrációját serkentő kemokint, CCL19-et, vagy más nevén ELC-t adtunk 100 ng/ml koncentrációban. Az alsó kamrák egy részébe 10-6 M hisztamint adtunk, illetve olyan kamrákat is készítettünk, ahol mind CCL19, mind hisztamin jelen volt. 90 perc elteltével az átvándorolt dendritikus sejtek számát áramlási citométerrel határoztuk meg úgy, hogy az sejtek számát a médiumba adott, az áramlási citometriában kalibrációs standardként használható mikropartikulum számra normalizáltuk. Eredményeink azt mutatják, hogy a DC-k migrációs képessége lecsökken H4R hiányában, a statisztikai elemzés (háromfaktoros varianciaanalízis, Three-Way ANOVA) szignifikáns különbséget mutatott a membránon átvándorolt vad típusú és H4R-/- DC-k száma között (p=0,028; 14. ábra). Az elemzés azt is igazolta, hogy a CCL19, mint kemokin serkenti a DC-k migrációját (p<0,001), ugyanakkor érdekes módon mind kemokin hiányában, mind jelenlétében megfigyelhető volt a két vizsgált csoport migrációs képessége közötti különbség (p<0,001 mindkét esetben, 14. ábra).

14. ábra H4R szerepe a DC‐k migrációjában  Az ábrán a transwell rendszer membránján átvándorolt, 1x104 mikropartikulumra normalizált  vad típusú (WT) és H4R‐/‐ DC‐k számát tüntettük fel CCL19 kemokin (100 ng/ml), hisztamin  (10‐6  M),  illetve  mindkettő  jelenlétében.  Az  oszlopdiagramokon  5  párhuzamos  kísérletből  származtatott átlag értékek (+SEM) láthatók. A kísérlet eredményeinek statisztikai analíziséből  származó (Three‐Way ANOVA, és Holm‐Sidak, mint post hoc teszt) fontosabb eredményeket is  ábrázoltuk  

56

Ezek után megvizsgáltuk a H4R specifikus antagonista hatását a dendritikus sejtek migrációjára. Ebben az esetben a DC-k H4 receptorait az assayt megelőzően 10-6 M JNJ7777120-al blokkoltuk, majd a mirációs assay-t a fentieknek megfelelően végeztük el. Ebben a kísérletben szintén 3 párhuzamos mintánk volt, és bár nem kaptunk szignifikáns különbségeket, az a tendencia mutatkozott, hogy a H4R blokkolása során a sejtek migrációs képessége szintén csökkent (15. ábra).

15. ábra H4R blokkolásának hatása DC‐k migrációjára  Az ábrán a transwell rendszer membránján átvándorolt, 1x104  mikropartikulumra normalizált  kontroll és H4R antagonistával (JNJ7777120, 10‐6  M) kezelt DC‐k számát tüntettük fel CCL19  kemokin  (100  ng/ml)  hatására.  Az  oszlopdiagramokon  3  független  kísérletből  származtatott  átlag  értékek  (+SEM)  láthatók.  Az  elvégzett  Two‐Way  RM  ANOVA  statisztikai  elemzés  nem  mutatott szignifikáns eltérést a kezeletlen, illetve antagonistával kezelt csoportok között, csupán  megerősítette, hogy a CCL19 kemokin szignifikánsan kemoattraktáns hatású (p<0,001). 

Végül összehasonlítottuk a DC-k homingjában alapvető receptor, a CCR7 génexpresszióját, illetve két másik DC-k felszínén bizonyított kemokin-receptor a CXCR4 és a CCR6 expresszióját is H4R-/- és vad típusú DC-ken, real time PCR segítségével (16. ábra). A H4R-/- DC-kben szignifikánsan alacsonyabb CCR7 mRNS expressziót mértünk a vad DC-khez képest (p=0,040, 16. ábra), míg a másik két receptor expressziójában nem tapasztaltunk változást. Mindezen eredmények tehát alátámasztják, hogy a H4R közvetítette szignálok a DC-k migrációját pozitívan befolyásolják. Azonban az

57

egyértelmű igazoláshoz nagyobb elemszámmal megismételt migrációs kísérletek szükségesek.

16. ábra Vad (WT) és H4R‐/‐ DC‐k kemokin receptor expressziója   A  vizsgált  DC‐k  CCR7,  CXCR4,  és  CCR6  mRNS  expresszióját  határoztuk  meg,  a  relatív  expressziós  értékek  GAPDH  housekeeping‐re  lettek  normalizálva.  Az  oszlopdiagramokon  5  független  kísérletből  származtatott  átlag  értékek  (+SEM)  láthatók.  A  kísérlet  eredményeinek  statisztikai  analíziséből származó (kétmintás t‐próba) fontosabb eredményeket  is  ábrázoltuk (*:  p<0,05). 

IV.10 Langerhans sejtek számának összehasonlítása H4R-/- és vad típusú egerek fül epidermiszében Mivel a fentiekben elvégzett in vitro kísérletekből azt a következtetést vontuk le, hogy a H4R szerepet játszhat a DC-k migrációjában, ezért ezt a hipotézisünket egy in vivo rendszerben is, a következő fejezetben (IV.11) tárgyalt FITC painting assay segítségével teszteltük. Azonban ahhoz, hogy a későbbiekben vizsgált epidermisz-eredetű Langerhans sejtek (LC-k) vándorlását in vivo analizálhassuk, első lépésben összehasonlítottuk a LC-k számát az epidermiszben H4R jelenlétében és hiányában. H4R-/- és vad típusú egerek füléről epidermiszt preparáltunk, majd MHCII fluoreszcens jelölést követően mikroszkópos vizsgálatot végeztünk. 10-10 területet analizáltunk fülenként és meghatároztuk az egységnyi vizsgált felületen található LC-k számát. Azt tapasztaltuk, hogy a H4R-/- egerek fül epidermiszében az egységnyi felületre eső LC-k

58

száma nem tér el a vad egerekétől jelentős mértékben, így az egérmodell alkalmas a LCk migrációs képességének in vivo összehasonlítására (17. ábra). H4R-/-

WT

68

72

17.ábra LC‐k vad típusú (WT) és H4R‐/‐ egér fül epidermiszben  Reprezentatív  mikroszkópos  képek  az  epidermiszben  található  LC‐kről,  amelyek  jól  láthatóak  MHCII festődésük alapján. A képek bal alsó sarkában szereplő számok azadott minta‐területen  leszámolt LC‐k számát jelzik. 

IV.11 A H4R szerepe a DC migrációban in vivo (FITC painting assay) A legtöbb ismeretünk, amit a DC-k migrációjáról tudunk, a bőrben található DC-k vándorlásának tanulmányozásából származik. Elsősorban a Langerhans sejteknek a nyirokcsomókba történő migrációját tanulmányozták a legbehatóbban. Az erre a célra alkalmazott metodikák közül a FITC painting assay szolgáltatta a legtöbb információt arról, hogyan vándorolnak ezek a sejtek a nyirokszövetekbe. Ebben az assayben egy kontakt-hiperszenzitizáló kezelés során a dibutil-ftalát és a FITC fluorokróm elegye intenzív LC migrációt idéz elő. Kísérleteinkben mi is ezt a módszert választottuk, hogy igazoljuk a H4R szerepét a LC-k migrációjában. A kísérlet során 3-3 vad típusú és H4R/-

egérrel végeztük el az assayt, az egerek hasi területeit 300 μl FITC – dibutil-ftalát –

aceton oldattal kentük be, majd 18 óra elteltével vizsgáltuk az inguinális nyirokcsomókba vándorolt FITC+ LC-k arányát. Kísérleteink eredményei egyértelműen megerősítették, hogy H4R hiányában a DC-k, jelen esetben a LC-k migrációja gátolt. A nyirokcsomókban talált LC-k aránya az elvégzett kétmintás t-próba statisztikai elemzést követően szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a vad egerek esetében (p=0,013; 18. ábra). Mivel korábbi vizsgálataink szerint nincs eltérés a két egértípus LC arányában a

59

bőrben, ezért kizárhatjuk, hogy a kontakt hiperszenzitizáló kezelés után mért különbség hátterében a bőrben alapállapotban található LC-k eltérő száma áll.

3,5%

1,2%

18. ábra Vad típusú (WT) és H4R‐/‐ LC‐k in vivo migrációja   A FITC kezelést követő 24 óra elteltével az inguinális nyirokcsomóba vándorolt FITC+ CD11c+  LC‐k arányát vizsgáltuk. Az ábrán reprezentatív FACS dot plot‐okon láthatóak a kettős pozitív  LC‐k  (A),  illetve  oszlopdiagram  formájában  mutatjaláthatók  a  kapott  eredmények  (B).  A  diagramon  5  független  kísérletből  származtatott  átlag  értékek  (+SEM)  láthatók.  A  kísérlet  eredményeinek  statisztikai  analíziséből  származó  (kétmintás  t‐próba)  fontosabb  eredményeket  ábrázoltuk  (*:  p<0,05).  (C)  Reprezentatív  mikroszkópos  képek  a  nyirokcsomóba  vándorolt  LC‐ kről. 

60

..

V... Megbeszélés

Kísérleteink során már a kezdetektől az immunrendszer „karmester” sejtjeivel, a dendritikus sejtekkel kezdtünk el foglalkozni. Ezek a kis nyúlványos sejtek figyelemre méltó képességekkel rendelkeznek, hiszen nemcsak arra képesek, hogy bemutassák az immunrendszer számára a saját, és a szervezetbe bejutó idegen antigéneket, de irányt is mutatnak, hogy az adott kórokozó esetében milyen típusú és milyen erősségű válaszra van szükség7;11. A dendritikus sejtek felszínükön számtalan receptorral rendelkeznek, ezek nagy része a kórokozók speciális molekuláinak mintázatát ismeri fel (PRR-ek), de emellett számos egyéb sejtfelszíni receptorral is rendelkeznek, amelyek a környezetük érzékelésére és az onnan származó jelek, információk, szignálok vételére képesek, legyenek azok gyulladási mediátorok, citokinek, vagy egyéb szolubilis faktorok26;27;129. Mindezen receptorok segítségével a dendritikus sejtekben olyan jelátviteli folyamatok sora indul be, amely eredményeképp a sejtek az antigén bemutatásán kívül képesek lesznek citokinek, kemokinek és számos egyéb, az immunválasz szempontjából elengedhetetlen szignálmolekula szekréciójára36;37;51. A dendritikus sejtek tehát kapcsolatot teremtenek a természetes és adaptív immunrendszer elemei között, megalapozva a hatékony kórokozókkal szembeni immunológiai védelem, válasz és memória kialakítását. Ez a doktori dolgozat e nagy jelentőségű láncfolyamat egyes elemeibe próbál pontosabb betekintést adni, és feltérképezni egy az immunrendszerben jól ismert molekula, a hisztamin dendritikus sejtekre kifejtett hatásait. Számos irodalmi adat számol be arról, hogy a hisztamin képes befolyásolni a dendritikus sejteket28;56;67;123. Sőt, arról is vannak adatok, hogy a dendritikus sejtek maguk is képesek hisztamin termelésére108;122. Ugyanakkor a meglévő eredmények nagy részét olyan kísérleti adatok alapozzák meg, amelyekben egér, vagy akár humán dendritikus sejteket igen nagy dózisban kezeltek hisztaminnal.

Ezen

kísérletek

sok

esetben

egymásnak

részben

ellentmondó

eredményekkel zárultak, amelynek oka feltehetően a különböző kísérleti rendszerek, különböző kezelési koncentrációk, adagolási módok és a kezelt sejtek eltérő differenciáltsági állapota, eredete lehettek. Ugyanakkor minden említett publikáció

61

megegyezik abban, hogy így, vagy úgy, de a hisztamin nem elhanyagolható befolyásoló faktor a dendritikus sejtek környezetében28;29;115;122;123. Ennél fogva az olyan rendszerek, amelyekben a hisztamin-termelés, vagy a hisztamin jelátvitel egyes lépései genetikai módosítás eredményeként teljesen működésképtelen állapotban vannak, kiváló lehetőségeket nyújtanak ezen kérdések pontosabb tisztázására, az irodalmi publikációk gyakran tagadhatatlanul inkoherens eredményeinek át-, illetve újraértékelésére. Vizsgálatainkban egyrészt olyan egereket használtunk, amelyek genetikailag hisztaminmentesek, így kiváló modellrendszert képeztek a hisztamin hatásainak vizsgálatához. Másrészt egy olyan egértörzset is módunkban állt alkalmazni, amelyből a hisztamin negyedik. receptora volt genetikailag kiütve, így megvizsgálhattuk, hogy a hisztamin mely hatásait közvetíti ezen a receptorán keresztül. Ezeknek a kísérleteknek egy részét ugyanakkor specifikus H4R blokkoló jelenlétében is megismételtük. Az egerek lépeiből mágneses szeparálással izoláltuk a dendritikus sejteket, a minták nagyfokú tisztaságát és homogenitását minden esetben ellenőriztük, ez által a kísérleti csoportok között az egyetlen különbség egyedül az esetleges genetikai háttér, illetve maguk a kezelések lehettek. A dolgozatban használt kísérleti módszerek magukba foglalnak számos in vitro és in vivo vizsgálatot, több funkcionális assayt, mRNS és fehérje szintű analízist. Számos kérdést megpróbáltunk több oldalról is megvizsgálni annak érdekében, hogy még pontosabb válaszokat kaphassunk. Sajnos ez nem minden esetben sikerült teljes mértékben, több kérdés maradt még megválaszolatlan, illetve igényel további vizsgálatokat. A kísérleteink során először is bebizonyítottuk, hogy a hisztamin hiányában differenciálódó dendritikus sejtek jobb antigénprezentációs képességgel rendelkeznek, mint a vad típusú állatokban fejlődő sejtek. Mivel az antigénprezentáció egy igen komplex folyamat, megvizsgáltuk, melyek lehetnek azok az elemek, amelyekre hatva a hisztamin, vagy ápp annak hiánya ilyen különbséget hozhat létre az érett DC-k működésében. Ezért megvizsgáltuk az antigénprezentációban alapvető kostimulációs molekulák expresszióját, de nem találtunk eltérést a két vizsgált csoport között. Összehasonlítottuk a két egértörzsből származó dendritikus sejteket az alapján is, hogy

62

van-e eltérés a dendritikus sejt alpopulációk megoszlása között, de ebben az esetben sem találtunk eltérést. Megállapíthattuk tehát, hogy a HDC-/- és vad típusú DC-k első közelítésben nem mutatnak jelentős fenotípusos eltéréseket egymástól. Összevetve ezeket a megfigyeléseket az irodalomban található adatokkal megállapítható, hogy különbséget tapasztaltunk más csoportok által közölt eredmények és az általunk alkalmazott kísérleti rendszerek eredményei között. Adataink nem támasztják alá azt a korábbi megfigyelést, hogy a hisztamin erőteljesen indukálja a CD86 kostimulációs molekula expresszióját dendritikus sejteken28, mint ahogy azt sem, hogy enyhén serkenti a CD80, CD86 kostimulációs és az MHCI és MHCII antigénprezentációs molekulák expresszióját29. Könnyen lehet, hogy ezen különbségek hátterében az alkalmazott vizsgálati modellek különbségei állnak, hiszen mi a kostimulációs markereket fiziológiás hisztamin koncentrációk mellett in vivo, míg e cikkek szerzői nagy dózisban alkalmazva, in vitro vizsgálták. Ugyanakkor számos adat szól arról, hogy a hisztamin befolyásolja különféle sejtek, így a DC-k citokin termelését is29;56. Eredményeink – összhangban ezen irodalmi adatokkal – alátámasztják, hogy a hisztamin fontos reguláló szerepet tölt be a DC-k citokin profiljának kialakításában. In vitro kísérleteink megmutatták, hogy a hisztamin megváltoztatja a DC-k citokin termelő képességét. Azok a DC-k, amelyek hisztaminmentes környezetben differenciálódtak (HDC-/- egerekből származtak) intenzívebb citokin termeléssel válaszoltak LPS kezelésre, mint azok a sejtek, amelyek differenciálódásába beleszólhattak hisztamin-közvetítette hatások (vad típusú egerek DC-i). Ráadásul, a HDC-/- DC-k LPS kezelést követően jellegzetes Th1 citokin túlsúlyt mutattak, hiszen több IFNγ-t termeltek mind mRNS, mind fehérje szinten, mint vad típusú társaik. Ezzel részben összhangban, egy másik közlemény szerint az in vitro hisztamin-kezelés még erőteljesebb Th2 polarizációt indukált, amennyiben megnövelte a DC-k IL-10, és csökentette a sejtek IL-12 termelését is29;123, mi azonban ilyen erőteljes hatást nem tapasztaltunk. Saját kísérleteinkben a hisztamin in vitro visszajuttatása a rendszerbe nem volt elégséges a HDC-/- genotípus okozta Th1 polarizáció semlegesítéséhez, amiből nyilvánvalóvá vált számunkra, hogy nem az aktiváció során jelenlévő hisztamin jelenléte illetve hiánya az a hatás, ami a DC-k citokin termelő képességét befolyásolta. Sokkal valószínűbb, hogy a szeparált DC-k

63

már differenciálódásuk, érésük során, azaz még in vivo voltak kitéve olyan hisztaminmediált hatás(ok)nak, ami előidézhette ezt a változást. A fenti eredmények értékelése során ugyanakkor természetesen nem szabad figyelmen kívül hagynunk azt a tényt, hogy egy in vitro rendszerben elvégzett kísérlet egyes esetekben nem teljesen pontosan modellezi a valós állapotokat, a sejtek in vitro körülmények között sokszor a valóságtól eltérő módon reagálhatnak különböző kezelésekre, és a kísérleti rendszer maga is nagyban befolyásolhatja a kapott eredményeket. Mindezek tükrében in vivo rendszerben is megvizsgáltuk a hisztamin befolyását a DC-k citokin termelésére. Ismét azt tapasztaltuk, hogy hisztamin hiányában a DC-k Th1 irányú polarizáltságot mutatnak, hiszen a HDC-/- DC-k többet termeltek mindkét vizsgált Th1 citokinből, az IL-12-ből, illetve az IFNγ-ból, mint a vad típusú kontroll sejtek. Érdekes módon az IL10 ugyancsak emelkedett volt a stimulálatlan, HDC-/- DC-kben, ugyanakkor egy Th1 irányú polarizációt kiváltó CFA-kezelés hatására ennek a citokinnek az expressziója lecsökkent a hisztamin hiányos DC-kben, míg a vad egerek DC-jei nem reagáltak szignifikáns IL-10 csökkenéssel a kezelésre. Összehasonlítva mindezt az IFNγ viselkedésével, különösen jól látható kontraszt volt tapasztalható a két, tipikusan Th2, illetve Th1 citokin viselkedése között. Összefoglalva tehát, mind in vitro, mind in vivo kísérleteink alapján meg tudjuk erősíteni azt a feltételezést, hogy a hisztamin meghatározó szerepet játszik a DC-k alapvető szerepének - az antigénprezentációnak - szabályozásában, azonban ez a hatás inkább indirekt módon, az DC-k Th1 típusú citokinek termelésének csökkentése révén valósul meg. Nagyszámú irodalmi adat igazolja ugyanis, hogy mind az IFNγ, mind az IL-12 serkenti az antigénprezentáció folyamatát, azáltal, hogy olyan jelátviteli folyamatokat indukálnak a DC-kben, amelyek fokozzák számos, az antigénprezentációban kulcsfontosságú molekula termelődését, megnövelik a pozitív kostimulációs molekulák expresszióját, illetve serkentik a DC-k érését130-132. Az egyik ilyen molekula az MHC class II transactivator (CIITA). A CIITA az MHCII expresszió fő regulátora, mivel alapvető szerepet tölt be az MHCII prezentációs útvonal szinte valamennyi génjének aktiválásában133. A másik ilyen, az IFNγ által szabályozott molekula az IFN-gammainducible lysosomal thiol reductase (GILT), amely konstitutívan expresszálódik

64

antigénprezentáló sejtekben és szintén elősegíti az MHCII-n keresztül megvalósuló antigénprezentációt. A GILT katalizálja az antigén peptidek diszulfid hídjainak lebontását, amely elengedhetetlen a sikeres prezentációhoz134;135. Mindkét enzim termelődését az IFNγ nagymértékben fokozza. Irodalmi adatok alapján az is ismert, hogy egyes DC-k szuppresszív hatást fejtenek ki az immunválasz során oly módon, hogy nagy mennyiségű IL-10-et termelnek, és a Tlimfocitákat regulatórikus T-sejtekké (Treg) polarizálják. A Treg sejtek nemcsak hogy képtelenek aktív immunválasz kiváltására, de ezzel ellentétes szerepet töltenek be, amennyiben kifejezetten gátolják az immunválasz kialakulását. Ráadásul az IL-10 közvetlenül is gátolja az antigénbemutatás folyamatát azáltal, hogy késlelteti a DC-k érését és kostimulációs molekuláinak expresszióját136-138. Kísérleteink azt mutatták, hogy az IL-10 expressziója szignifikánsan lecsökkent HDC-/- DC-kben CFA stimulációt követően, ami ugyancsak eredményezhet hatékonyabb antigénbemutatást és effektívebb immunválaszt ezekben az egerekben. A hisztaminnak négy különböző receptora ismeretes, amelyekből legalább három a DCken is előfordul. Kísérleteinkkel bebizonyítottuk, hogy a hisztamin legújabban felfedezett, négyes típusú receptora kifejeződik dendritikus sejtekben, és meghatározó szerepet tölt be a DC-k működésében. Megmutattuk, hogy számos hisztamin hatást ez a receptor közvetít a DC-k számára, bár egyes esetekben ezt a hatást nem sikerült egyértelműen, megfelelő szignifikancia-szintekkel alátámasztva igazolnunk. Megmutattuk, hogy H4R hiányában, H4R-/- egerekben fejlődött DC-k ugyancsak jobb antigénprezentációs képességgel rendelkeznek, mint azok, amelyek vad típusú egerekben értek meg, azaz amelyekre a receptor, pontosabban rajta keresztül a hisztamin a gátló hatását kifejtheti. Eredményeink alapján, ez a gátló hatás specifikusan H4R-on keresztül valósul meg, mivel vad típusú DC-knek H4R specifikus antagonistát adagolva ezt a hatást semlegesíteni tudtuk, mindez azonban egyéb hisztamin receptorok blokkolásával nem volt elérhető. Ez a két, knockout egerek és specifikus antagonisták párhuzamos használatán alapuló kísérleti rendszer rávilágított arra is, hogy a H4R-on keresztüli hisztamin hatás mind akut módon, tehát magának a prezentációnak a folyamata alatt, mind pedig már korábban, a DC-k differenciációs periódusa alatt kialakulhat. Figyelemreméltó volt ugyanakkor, hogy a H4R jelenléte vagy hiánya

65

nyugalmi állapotban nem volt befolyással a DC-k citokin termelő képességére, e tekintetben lényeges különbségek csak az LPS-sel végzett stimuláció hatására nyilvánultak meg közöttük. E megfigyeléseket értékelve természetesen nem hagyhatjuk figyelmen kívül, hogy a H4R-/- egerekben, bár a hisztamin termelés maga nincs gátolva, azonban ezekben az állatokban a H4R nemcsak a differenciálódó DC-k felszínéről, hanem minden olyan más sejtről is hiányzik, amely esetleg kapcsolatba kerülhet velük, és hatással lehet a fejlődésükre. A másik oldalról nézve a kérdést, nem zárható ki olyan párhuzamos szabályozó mechanizmusok megléte sem, amelyek egy permanens H4Rhiány esetén részben vagy egészben kompenzálhatják e receptor hiányát, más hisztamin-, vagy egyéb, attól független receptorokra terelve annak feladatait, amelyek a H4R hiányában is közvetíteni tudják a DC-k differenciálódásához alapvetően fontos információkat. Látni kell ugyanakkor azt is, hogy ilyen mechanizmusok, bár elfedhetik egy „krónikus” receptor-hiány főbb tüneteit, nem feltétlenül képesek ugyanerre a receptor hirtelen, „akut” aktivációja esetén. Emiatt, egy H4R knockout egérmodellt vizsgálva, egészen más eredményeket kaphatunk ha az állatot, vagy annak DC-it nyugalmi helyzetben vizsgáljuk, mint akkor, amikor a sejteket olyan szituációban elemezzük, amikor a hisztamin koncentráció hirtelen emelkedik meg a szervezet adott szövetében, egy rövid, behatárolható időtartamra, például helyi gyulladás esetében, és ezáltal hirtelen, masszív H4R aktivációt okoz. Ha egy ilyen akut helyzetben kapcsolunk be, vagy éppen iktatunk ki egy receptort, annak hiánya ekkor könnyebben megmutatkozhat, mivel ebben az esetben nem feltétlenül van mód a receptor szerepének, a hiányzó funkciónak a hirtelen pótlására. Ezt a lehetőséget látjuk felszínre jutni a citokin profil elemzésével folytatott kísérleteinkben, amikor is bár nem tapasztaltunk különbségeket H4R-/- egerek és vad típusú fajtársaik DC-inek citokinprofilja között, azonban ha a vad típusú DC-k H4R-át LPS-sel történő stimuláció alatt, azaz akut módon gátoltuk, akkor már a HDC-/- egerek DC-inek fenotípusára emlékeztető trend volt megfigyelhető citokin termelésükben. Megfigyeltük ugyanis, hogy a H4R-on keresztüli jelátvitel antagonistával történő gátlása növekedést eredményezett az IFNγ expressziójában, azonban az IL-10 szintjére ugyanez a kezelés már hatástalannak bizonyult. Ebben a kísérletben a tapasztalt különbségek a statisztikai analízist követően nem bizonyultak statisztikailag szignifikánsnak, így ez az eredmény nem igazolja egyértelműen azt a feltételezést, hogy

66

a hisztamin H4R-on keresztül befolyásolja a DC-k citokin termelését. Ennek hátterében állhat a nem elégséges elemszám, vagy a nem megfelelő antagonista koncentráció is. Így tehát a H4R szerepét a hisztamin indukált Th polarizációban nem sikerült egyértelműen igazolnunk. A DC-k migrációs képességét vizsgálva azonban már egyértelműen megállapíthattuk, hogy H4R hiányában a sejtek vándorlási képessége csökken. Ez a jelenség a fő homing receptornak, a CCR7-nek a csökkent expressziójával is magyarázható, amely szintén alacsonyabb volt a H4R-ral nem rendelkező DC-kben, bár ettől függetlenül más, a migrációban szerepet játszó faktorok hatása sem kizárt. Ugyanakkor ezt az eredményt szintén nem sikerült alátámasztanunk antagonistával végzett kísérleteinkkel, bár ebben az esetben is, H4R antagonista jelenlétében csökkent a migrált sejtek száma, ám ez a csökkenés mégsem volt olyan arányú, hogy azt meggyőző szignifikancia szinttel alá tudtuk volna támasztani. Ezeket a kísérleteket a jövőben nagyobb elemszámmal, illetve magasabb dózisban alkalmazott antagonistával tervezzük megismételni. Mindazonáltal in vivo, FITC painting assay-vel végzett vizsgálataink is markáns csökkenést mutattak a H4R-/- LC-k migráló képességében, így egyértelműen bebizonyosodott, hogy a H4R alapvető a LC-k migrációja szempontjából. Eredményeinket összefoglalva tehát megállapíthatjuk, hogy a hisztamin jelenléte releváns hatást fejt ki a dendritikus sejtekre, amennyiben gátolja antigénbemutató képességüket, citokin termelésüket és migrációs képességüket. Adataink szerint mindezen folyamatokban meghatározó a hisztamin H4-es receptorának szerepe, bár egyes esetekben nem lehet kizárni más receptorok, illetve egyéb faktorok befolyását sem. E következtetések megbízhatóságának és súlyának helyes értékeléséhez ugyanakkor figyelembe kell vennünk azt a tényt, hogy eredményeink még mindig számos további kérdést vetnek fel, amelyeket a jövőben mindenképp érdemes körüljárnunk. Az első ilyen kérdés maga a dendritikus sejtek kinyerési technikája veti fel. Bár a mágneses szeparálás során kinyert DC-kkel végzett kísérletek sokkal jobban képesek leírni

a

valós,

élő

helyzetben

végbenő

folyamatokat,

mint

egy

in

vitro

differenciáltatással létrehozott DC populáció, ám ez az igen nagyfokú tisztaságot mutató

67

DC populáció mégis tartalmazza a lépben található összes DC alosztályt, és emiatt nem mutathat rá egyértelműen az egyes különböző DC populációk egyedi szerepére a vizsgált folyamatban. Valószínűsíthető, hogy a hisztamin receptorok megoszlása is eltérő lehet a különböző alosztályokban, amelyek köztudottan eltérő antigén prezentációs, citokin produkciós és migrációs képességgel rendelkeznek36;50;139;140, így érdemes lenne a jövőben arra a kérdésre fókuszálnunk, hogy a tapasztalt eltérések melyik alpopulációt érintik leginkább. Az eredmények értékelése után megfogalmazódó második jövőbeli célunk feltérképezni a hisztamin hiányos DC-k megváltozott antigénprezentációs kapacitásának hátterében álló további molekuláris hatásmechanizmusokat. Bár egyértelműen kimutattuk az emelkedett antigénprezentációt a hisztamin-hiányos DC-kben, illetve azt is, hogy ezekben a sejtekben magasabb fokú Th1 citokin szekréció figyelhető meg, ami köztudottan serkentőleg hat az antigénbemutatásra, azonban a jövőben mindenképpen szükséges lenne további kísérletekkel megvizsgálni, mely molekuláris mechanizmusok kapcsolják össze a két jelenséget. A dolgozatban elemeztünk is néhány olyan molekulát, amelyeken keresztül ezen Th1 citokinek, elsősorban az IFNγ vezetésével, serkenthetik az antigénprezentációt, illetve az IL-10 szerepét is, amely irodalmi adatok alapján gátolhatja azt. A jövőben azonban, a folyamat teljes megértésének és akár eddig nem vizsgált, alternatív mechanizmusok jelenlétének feltérképezése érdekében ezt a kérdéskört szükséges lesz még alaposabban is körüljárnunk. A dolgozat új megállapításai: •A genetikailag hisztamin hiányos dendritikus sejtek jobb antigénprezentáló képességgel rendelkeznek, mint vad társaik. •A HDC-/- és vad típusú dendritikus sejtek nem mutatnak eltérést sem az alpopulációk megoszlásában, sem a kostimulációs molekulák expressziójában. •Hisztamin hiányában a dendritikus sejtek citokin termelése Th1 irányba tolódik el. •Lép eredetű dendritikus sejtek H1, H2 és az újonnan felfedezett H4 receptorokat expresszálják mRNS szinten. •

H4R hiányában, azaz H4R-/- egerekben fejlődött dendritikus sejtek ugyancsak

jobb antigénprezentáló képességgel rendelkeznek, mint a vad típusú egerek dendritikus sejtjei.

68

•

H4 receptor blokkolásával kivédhető a hisztamin mérsékelt IFNγ expressziót

csökkentő hatása, míg az IL-10 szintjében a kezelés nem okoz változást. •

H4R hiányában a dendritikus sejtek migrációs képessége csökken.

69

..

VI... Következtetés

A jelen doktori dolgozatban arra kerestük a választ, hogy a hisztamin, mint fontos gyulladási mediátor és immunmodulátor, gyakorol-e bármilyen releváns hatást az immunrendszer fő antigénprezentáló sejtjeinek, a dendritikus sejteknek a működésére, és ha igen, akkor vajon ez a hatás miben nyilvánul meg, és milyen receptorokon keresztül érvényesül. A természetes immunrendszer számos eszközzel rendelkezik a fertőző ágensek felismerésére, ellenőrzés alá vonására, illetve leküzdésére. A dendritikus sejteket e feladatok irányítására, illetve végrehajtására képes, sokoldalú, az immunrendszer számára létfontosságú sejttípusnak ismerhettük meg. A DC-k számtalan olyan tulajdonsággal rendelkeznek, amellyel elősegítik közvetlenül, de akár közvetetten is a természetes védelem kialakulását, ugyanakkor nélkülözhetetlen elemei az adaptív immunválasz indukálásának11;14;15. A doktori dolgozatban a DC-k három alapvető feladatát vizsgáltuk meg, amelyek révén ezek a sejtek teljes joggal nevezhetők az immunrendszer őrszemeinek, érzékelőinek, illetve az immunválasz fontos irányítóinak egyaránt. Az első ilyen feladat a DC-k antigén felvételének, feldolgozásának és bemutatásának speciális mechanizmusa. A második a migráció, amely során a DC-k az antigének felvételének helyszínéről egy meghatározott helyre, a nyirokszövetek T-sejtes zónáiba vándorolnak, és ott immunválaszt indítanak el. Legvégül pedig az a nagyfokú érzékenységük, amellyel az őket a környezet által ért stimulusoknak megfelelően (legyenek azok TLR ligandok, citokinek, gyulladásos mediátorok, immun komplexek), azokat rangsorolva gyors és megfelelő differenciálódáson és érési folyamaton mennek keresztül, citokineket és egyéb molekulákat bocsátanak a környezetükbe, amelynek eredményeként a T-sejtek közreműködésével a lehető legmegfelelőbb választ váltják ki az immunrendszerből. A hisztamin, mint egy közismert immunológiai jelátvivő molekula szerepét vizsgáltuk, és rámutattunk, hogy igen fontos szerepet játszik a DC-k előbb említett mindhárom feladatának modulálásában. Emellett bizonyítékot szolgáltattunk arra is, hogy a H4R a hisztamin receptorainak sorában nagy jelentőségű, amennyiben az immunológiai

70

folyamatokban, így a DC-k működése során a hisztamin számos releváns hatását közvetíti az őt expresszáló sejtek számára. Eredményeink azt bizonyítják, hogy a hisztamin befolyásolja a DC-k antigén prezentációját, T-sejt polarizáló képességét, citokin termelését és migrációját is, és ezekben folyamatokban a H4R a DC-k felszínén lévő hisztamin receptorok közül kiemelt jelentőségűnek tekinthető. Felvetődik a kérdés, hogy a H4R milyen relevanciával bírhat a klinikum, a terápia számára, hiszen számos olyan kórképet ismerünk, ahol bár a hisztamin szerepét igazolták, az eddig rendelkezésre álló, jórészt a hisztamin másik három receptorát célzó receptor-gátlók hatástalanságuk, korlátozott aktivitásuk, vagy mellékhatásaik miatt nem nyújtottak kielégítő eredményt, vagy éppen egyáltalán nem is váltak be a terápiában. A legkézenfekvőbb példa erre az asztmás és az allergiás betegségegyüttes. Az asztma igen gyakori betegség, amely a légutak túlérzékenységével és krónikus gyulladásával jár együtt141. A betegség során a gyulladt tüdőben, nagy számban található meg számos immunsejt, így hízósejtek, eozinofilek és Th2 sejtek. Ismert, hogy asztmában a DC-k is fontos szerepet játszanak, amennyiben Th2 irányba polarizálják a T-sejteket. A hisztamin DC-ket szabályozó hatása egyre inkább igazolódni látszik a folyamatban, sőt azt is kimutatták, hogy a megnövekedett hisztamin-szint igen jól korrelál a betegség súlyosságával108;142;143. A korábban alkalmazott H1R antagonisták azonban sokszor, illetve a betegség előrehaladtával egy idő után már nem csökkentik megfelelő módon a betegség tüneteit, számos mellékhatásuk van, így felvetődik egy másik receptor szerepe is a kórfolyamatban108. Kísérleti eredményeink azt mutatják, hogy a hisztamin a Th1 választ csökkenti és Th2 irányba tereli a T-sejteket, ami az asztma tüneteinek súlyosbodásához vezethet, illetve azt is, hogy ezen hatásokban a H4R a közvetítő receptor a DC-k felszínén. Ezért a H4R antagonisták új terápiás lehetőségeket jelenthetnek az asztma és allergia terápiájában. Egy in vivo egér allergia modellben igazolták is a DC-k és a H4R szerepét. A H4R receptor hiánya, vagy blokkolása csökkentette a Th1 citokinek, az IL-4, IL-5 és IL-13 szintjét, így igazolódni látszik a H4R Th2 polarizáló hatása. A folyamat során a DC-k kaphatnak kulcsfeladatot, hiszen azt találták, hogy DC-k H4R hiányában nem voltak képesek a T sejteket Th2 irányba differenciálni108. Tehát részben mások, részben saját eredményeink révén, fokozatosan közelebb jutva a H4R-mediált hatások megismeréséhez elmondhatjuk, hogy ezen receptor gátlószerei

71

egy új, hatékony lehetőséget jelenthetnek az asztma és az allergia terápiájában. Azonban ez a lehetőség nemcsak e két betegség esetén merül fel, hanem egyéb kóros folyamatok során, is ahol a H4R antagonisták immunregulatorikus és antiinflammatorikus hatásait használhatja ki a jövőben az orvostudomány. Ilyen nagy reményekkel kecsegtető terület a H4R antagonisták alkalmazása például a daganatellenes terápiában is. A malignus progresszió során emelkedett hisztamin termelést mutattak ki számos tumor esetében. A hatékony tumor progresszió többek között annak az eredménye, hogy a tumorsejtek számos mechanizmus révén sikeresen bújnak ki az immunrendszer védelmi rendszere alól, illetve toleranciát indukálnak magukkal, és az általuk megjelenített tumor antigénekkel szemben. Ennek számos oka ismert, például a daganatsejtek nem indukálnak veszély- és kostimulációs szignálokat, nem aktiválják a DC-ket, nem indítanak el bennük érési folyamatokat, így az immunrendszer nem véli kórosnak ezeket a sejteket. A passzív rejtőzködés mellett a tumorsejtek aktívan is manipulálják az immunrendszert, amennyiben számos olyan citokint és egyéb szolubilis molekulát is termelnek, amelyek a környezetükben lévő DC-ket tolerogénné teszik, így ellenük nem indukálódik semmiféle, vagy ha mégis, akkor is csak igen gyenge immunválasz7;144. Mindezek után érthető, hogy a tumorterápiában kiemelkedő szerephez jutnak a DC-k, és számos olyan próbálkozás látott napvilágot, amelyben megpróbálják a DC-ket felhasználni

és

mégiscsak

rábírni

egy

hatékony

antitumor

immunválasz

megindítására145. Ha

mindezen

folyamatokat

a

tumor-hisztamin-DC

kontextusba

helyezzük,

megfigyelhetünk néhány érdekes mozzanatot. Ha visszatérünk az első megállapításhoz, mely szerint a daganatok hisztamint termelnek, egy lehetséges magyarázatát vélhetjük felfedezni

az

elégtelen

immunválasznak

velük

szemben.

Kísérleteink

során

megmutattuk, hogy a hisztamin negatívan befolyásolja az antigénprezentáció folyamatát, így ha a hisztamint a daganat sejtek termelik, ez a hisztamin oly módon befolyásolhatja odavándorolt DC-ket, amely a gyenge prezentációnak és így a tumor túlélésének kedvez. Ráadásul a hisztamin a DC-kre hatva megváltoztatja citokin profiljukat is, amely megint csak legkevésbé sem kedvez a hatékony tumorellenes immunválasznak, ám a tumoroknak maguknak igen. Ezen folyamatokban a H4R aktívan részt is vesz a DC-k felszínén, hiszen bár elősegíti a DC-k migrációját, a DC-k

72

működését mindenképp a tumor számára kedvezően, a gazdaszervezet számára pedig kedvezőtlenül befolyásolják. Mindezek tehát felvetik a H4R antagonisták mint adjuvánsok alkalmazásának lehetőségét egy új, eddig még nem vizsgált területen, a daganetellenes terápiában is. Ugyanakkor ezen összefüggések pontosabb elemzése, és még számos további alapos vizsgálat szükséges ahhoz, hogy a hisztamin H4R közvetítette jelátviteli útvonalat, mint egy esetlegesen új terápiás beavatkozási pontot az orvostudomány biztonsággal felhasználhassa.

73

Összefoglaló A dendritikus sejtek (DC-k), mint a legfontosabb antigénprezentáló sejtek, meghatározó szerepet töltenek be az immunrendszer működésében. Legfőbb feladatuk a legkülönfélébb antigének felvétele, feldolgozása, szállítása és bemutatása a Tlimfocitáknak. A dendritikus sejtek működését számos környezeti tényező befolyásolja. Kísérleteinkben a hisztaminnak, mint fontos környezeti faktornak a DC-kre gyakorolt hatásait vizsgáltuk. Megfigyeléseink szerint hisztamin hiányában (HDC-/- egerekben) a DC-k jobb antigénprezentációs képességgel rendelkeznek, mint hisztamin jelenlétében. Azt is megfigyeltük, hogy a DC-k hisztamin hiányában eltérő citokin mintázattal rendelkeznek; stimulálás hatására Th1 irányú eltolódást (emelkedett IL-12 és IFNγ expresszió) mutatnak. Ezen Th1 típusú citokinek köztudottan serkentik az antigénprezentációt, ezért ez a megváltozott citokin profil magyarázhatja a jobb antigénprezentációs képességet. Mivel a hisztaminnak négy receptora (H1R, H2R, H3R, H4R) is ismert, megvizsgáltuk, melyik receptor az, amely ezeket a hatásokat közvetíti. Eredményeink azt mutatják, hogy DC-k H4R hiányában (H4R-/- egerekben) ugyancsak jobb antigénprezentációs képességgel rendelkeznek. Amennyiben a DC-ken lévő H4R-k működését specifikus antagonistával gátoltuk, szintén emelkedett antigénprezentációt figyeltünk meg, sőt a hisztamin IFNγ expressziójára gyakorolt negatív hatását is ellensúlyozni tudtuk. A továbbiakban megvizsgáltuk a hisztaminnak a migrációra gyakorolt hatását is. Megfigyeltük, hogy H4R hiányában a DC-k migrációja csökken, mind in vitro mind in vivo. Ezek az eredmények összhangban vannak azzal a megfigyelésünkkel, mely szerint a H4R-/- DC-k CCR7 expressziója alacsonyabb, mint a megfelelő vad sejteké. Eredményeink azt mutatják, hogy a hisztamin erősen befolyásolja a dendritikus sejtek antigénprezentáló képességét, citokin profilját és migrációs képességét. Ezen felül azt is bebizonyítottuk, hogy ezen hatások kiváltásában a H4R-nak a dendritikus sejtek felszínén alapvető szerepe van. Eredményeink hozzájárulhatnak H4R-on keresztül ható gyógyszermolekulák kifejlesztéséhez, amelyek új lehetőséget nyitnak meg számos, az immunrendszert érintő betegség kezelésében.

74

Summary Dendritic cells (DCs) are the main antigen presenting cells. Their main function is antigen processing and presentation, which can be affected by several environmental factors such as histamine. Using a genetically histamine-free (histidine-decarboxylase knock out, HDC-/-) mouse model, we examined the effects of histamine on DCmediated antigen presentation and cytokine production. We found that spleen DCs, derived from HDC-/- mice, display a higher efficiency in antigen presentation compared to wild type cells. After flow cytometric analysis of the main DC cell surface markers and costimulatory molecules we found that these two DC groups do not differ in their phenotype or maturation status. We also analyzed their cytokine expression profile by real time PCR. We measured enhanced Th1 cytokine profile (IL-12p35 and IFNγ) in HDC-/- DCs compared to the wild type ones. Beside histamine H1 and H2 receptors, DCs are known to express the newly discovered histamine H4 receptor (H4R) but until recently, its function on DCs has not been completely elucidated. In our experiments, we studied the involvement of H4R in the mediation of the above mentioned histamine effects. In these experiments we studied DCs which either do not have H4R (H4R-/- DCs), or we blocked the H4R functions with the specific H4R antagonist JNJ7777120. We found again increased antigen presentation in H4R-/- DCs, or when we blocked the H4R with its antagonist. Moreover, the selective H4R antagonist was able to compensate the suppressive effect of histamine on the Th1 cytokine IFNγ but not IL-10 production. Finally we found that H4R is essential for DC migration as H4R-/- DCs have decreased migratory capacity both in vitro and in vivo, which is in accordance with our findings that H4R-/- DCs express less CCR7 than their wild type counterparts. These results indicate that histamine plays an essential role in DC functions, as it affects antigen presentation, T cell polarization, cytokine production, and migration of DCs. Our analysis disclosed that H4R is crucial in mediating these effects. These observations suggest new potential applications for the novel H4R ligands in vaccination therapy of several immun-related disorders, such as allergy or cancer.

75

Irodalomjegyzék 1. D'Amico A, Wu L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J Exp Med. 2003;198:293-303. 2. Zenke M, Hieronymus T. Towards an understanding of the transcription factor network of dendritic cell development. Trends Immunol. 2006;27:140-145. 3. Ardavin C. Origin, precursors and differentiation of mouse dendritic cells. Nat Rev Immunol. 2003;3:582-590. 4. Naik SH, Proietto AI, Wilson NS, Dakic A, Schnorrer P, Fuchsberger M, Lahoud MH, O'Keeffe M, Shao QX, Chen WF, Villadangos JA, Shortman K, Wu L. Cutting edge: generation of splenic CD8+ and CD8- dendritic cell equivalents in Fms-like tyrosine kinase 3 ligand bone marrow cultures. J Immunol. 2005;174:6592-6597. 5. Naik SH, Metcalf D, van Nieuwenhuijze A, Wicks I, Wu L, O'Keeffe M, Shortman K. Intrasplenic steady-state dendritic cell precursors that are distinct from monocytes. Nat Immunol. 2006;7:663-671. 6. Shortman K, Liu YJ. Mouse and human dendritic cell subtypes. Nat Rev Immunol. 2002;2:151-161. 7. Schuurhuis DH, Fu N, Ossendorp F, Melief CJ. Ins and outs of dendritic cells. Int Arch Allergy Immunol. 2006;140:53-72. 8. Wilson HL, O'Neill HC. Murine dendritic cell development: difficulties associated with subset analysis. Immunol Cell Biol. 2003;81:239-246. 9. Shortman K, Naik SH. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 2007;7:19-30. 10. Henri S, Vremec D, Kamath A, Waithman J, Williams S, Benoist C, Burnham K, Saeland S, Handman E, Shortman K. The dendritic cell populations of mouse lymph nodes. J Immunol. 2001;167:741-748. 11. Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 1998;392:245-252. 12. de Jong EC, Smits HH, Kapsenberg ML. Dendritic cell-mediated T cell polarization. Springer Semin Immunopathol. 2005;26:289-307. 13. Guermonprez P, Valladeau J, Zitvogel L, Thery C, Amigorena S. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2002;20:621-667.

76

14. Kapsenberg ML. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 2003;3:984-993. 15. Makala LH, Nagasawa H. Dendritic cells: a specialized complex system of antigen presenting cells. J Vet Med Sci. 2002;64:181-193. 16. Prigozy TI, Kronenberg M. Presentation of bacterial lipid antigens by CD1 molecules. Trends Microbiol. 1998;6:454-459. 17. Geijtenbeek TB, van Vliet SJ, Engering A, 't Hart BA, van Kooyk Y. Self- and nonself-recognition by C-type lectins on dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2004;22:33-54. 18. McGreal EP, Miller JL, Gordon S. Ligand recognition by antigen-presenting cell C-type lectin receptors. Curr Opin Immunol. 2005;17:18-24. 19. Kanazawa N. Dendritic cell immunoreceptors: C-type lectin receptors for pattern-recognition and signaling on antigen-presenting cells. J Dermatol Sci. 2007;45:77-86. 20. Akira S, Uematsu S, Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 2006;124:783-801. 21. Hemmi H, Akira S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 2005;86:120-135. 22. Kaisho T, Akira S. Regulation of dendritic cell function through toll-like receptors. Curr Mol Med. 2003;3:759-771. 23. Reis e Sousa. Toll-like receptors and dendritic cells: for whom the bug tolls. Semin Immunol. 2004;16:27-34. 24. Watts C, Zaru R, Prescott AR, Wallin RP, West MA. Proximal effects of Tolllike receptor activation in dendritic cells. Curr Opin Immunol. 2007;19:73-78. 25. Edwards AD, Manickasingham SP, Sporri R, Diebold SS, Schulz O, Sher A, Kaisho T, Akira S, Reis e Sousa. Microbial recognition via Toll-like receptordependent and -independent pathways determines the cytokine response of murine dendritic cell subsets to CD40 triggering. J Immunol. 2002;169:36523660. 26. Reis e Sousa. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr Opin Immunol. 2004;16:21-25. 27. Sporri R, Reis e Sousa. Inflammatory mediators are insufficient for full dendritic cell activation and promote expansion of CD4+ T cell populations lacking helper function. Nat Immunol. 2005;6:163-170. 28. Caron G, Delneste Y, Roelandts E, Duez C, Herbault N, Magistrelli G, Bonnefoy JY, Pestel J, Jeannin P. Histamine induces CD86 expression and

77

chemokine production by human immature dendritic cells. J Immunol. 2001;166:6000-6006. 29. Mazzoni A, Young HA, Spitzer JH, Visintin A, Segal DM. Histamine regulates cytokine production in maturing dendritic cells, resulting in altered T cell polarization. J Clin Invest. 2001;108:1865-1873. 30. Inaba K, Witmer-Pack M, Inaba M, Hathcock KS, Sakuta H, Azuma M, Yagita H, Okumura K, Linsley PS, Ikehara S, Muramatsu S, Hodes RJ, Steinman RM. The tissue distribution of the B7-2 costimulator in mice: abundant expression on dendritic cells in situ and during maturation in vitro. J Exp Med. 1994;180:18491860. 31. Inaba K, Inaba M, Witmer-Pack M, Hatchcock K, Hodes R, Steinman RM. Expression of B7 costimulator molecules on mouse dendritic cells. Adv Exp Med Biol. 1995;378:65-70. 32. Orabona C, Grohmann U, Belladonna ML, Fallarino F, Vacca C, Bianchi R, Bozza S, Volpi C, Salomon BL, Fioretti MC, Romani L, Puccetti P. CD28 induces immunostimulatory signals in dendritic cells via CD80 and CD86. Nat Immunol. 2004;5:1134-1142. 33. Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, Liu YJ, Pulendran B, Palucka K. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2000;18:767811. 34. Kalinski P, Hilkens CM, Wierenga EA, Kapsenberg ML. T-cell priming by type-1 and type-2 polarized dendritic cells: the concept of a third signal. Immunol Today. 1999;20:561-567. 35. Langenkamp A, Messi M, Lanzavecchia A, Sallusto F. Kinetics of dendritic cell activation: impact on priming of TH1, TH2 and nonpolarized T cells. Nat Immunol. 2000;1:311-316. 36. Moser M, Murphy KM. Dendritic cell regulation of TH1-TH2 development. Nat Immunol. 2000;1:199-205. 37. Le Bon A, Schiavoni G, D'Agostino G, Gresser I, Belardelli F, Tough DF. Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 2001;14:461-470. 38. Nathan CF, Murray HW, Wiebe ME, Rubin BY. Identification of interferongamma as the lymphokine that activates human macrophage oxidative metabolism and antimicrobial activity. J Exp Med. 1983;158:670-689. 39. Randolph GJ, Angeli V, Swartz MA. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 2005;5:617-628.

78

40. Randolph GJ, Sanchez-Schmitz G, Angeli V. Factors and signals that govern the migration of dendritic cells via lymphatics: recent advances. Springer Semin Immunopathol. 2005;26:273-287. 41. Sozzani S. Dendritic cell trafficking: more than just chemokines. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16:581-592. 42. Caux C, Ait-Yahia S, Chemin K, de Bouteiller O, Dieu-Nosjean MC, Homey B, Massacrier C, Vanbervliet B, Zlotnik A, Vicari A. Dendritic cell biology and regulation of dendritic cell trafficking by chemokines. Springer Semin Immunopathol. 2000;22:345-369. 43. Dieu-Nosjean MC, Vicari A, Lebecque S, Caux C. Regulation of dendritic cell trafficking: a process that involves the participation of selective chemokines. J Leukoc Biol. 1999;66:252-262. 44. Sozzani S, Allavena P, Vecchi A, Mantovani A. The role of chemokines in the regulation of dendritic cell trafficking. J Leukoc Biol. 1999;66:1-9. 45. Rot A, von Andrian UH. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu Rev Immunol. 2004;22:891-928. 46. Akdis CA, Simons FE. Histamine receptors are hot in immunopharmacology. Eur J Pharmacol. 2006;533:69-76. 47. Sallusto F, Schaerli P, Loetscher P, Schaniel C, Lenig D, Mackay CR, Qin S, Lanzavecchia A. Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation. Eur J Immunol. 1998;28:2760-2769. 48. Jakob T, Ring J, Udey MC. Multistep navigation of Langerhans/dendritic cells in and out of the skin. J Allergy Clin Immunol. 2001;108:688-696. 49. Sallusto F, Mackay CR, Lanzavecchia A. The role of chemokine receptors in primary, effector, and memory immune responses. Annu Rev Immunol. 2000;18:593-620. 50. Maldonado-Lopez R, Moser M. Dendritic cell subsets and the regulation of Th1/Th2 responses. Semin Immunol. 2001;13:275-282. 51. Pulendran B. Modulating TH1/TH2 responses with microbes, dendritic cells, and pathogen recognition receptors. Immunol Res. 2004;29:187-196. 52. Schneider E, Rolli-Derkinderen M, Arock M, Dy M. Trends in histamine research: new functions during immune responses and hematopoiesis. Trends Immunol. 2002;23:255-263. 53. Falus A. Histamine, part of the metabolome. Acta Biol Hung. 2003;54:27-34. 54. Ohtsu H, Tanaka S, Terui T, Hori Y, Makabe-Kobayashi Y, Pejler G, Tchougounova E, Hellman L, Gertsenstein M, Hirasawa N, Sakurai E, Buzas E,

79

Kovacs P, Csaba G, Kittel A, Okada M, Hara M, Mar L, Numayama-Tsuruta K, Ishigaki-Suzuki S, Ohuchi K, Ichikawa A, Falus A, Watanabe T, Nagy A. Mice lacking histidine decarboxylase exhibit abnormal mast cells. FEBS Lett. 2001;502:53-56. 55. Watanabe T, Ohtsu H. L-histidine decarboxylase as a probe in studies on histamine. Chem Rec. 2002;2:369-376. 56. Dy M, Schneider E. Histamine-cytokine connection in immunity and hematopoiesis. Cytokine Growth Factor Rev. 2004;15:393-410. 57. Dale HH, Laidlaw PP. The physiological action of beta-iminazolylethylamine. J Physiol. 1910;41:318-344. 58. Akdis CA, Blaser K. Histamine in the immune regulation of allergic inflammation. J Allergy Clin Immunol. 2003;112:15-22. 59. Barbry P, Champe M, Chassande O, Munemitsu S, Champigny G, Lingueglia E, Maes P, Frelin C, Tartar A, Ullrich A, . Human kidney amiloride-binding protein: cDNA structure and functional expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990;87:7347-7351. 60. Girard B, Otterness DM, Wood TC, Honchel R, Wieben ED, Weinshilboum RM. Human histamine N-methyltransferase pharmacogenetics: cloning and expression of kidney cDNA. Mol Pharmacol. 1994;45:461-468. 61. Romijn JC, Verkoelen CF, Splinter TA. Species-dependent differences of the biochemical properties of diamine oxidase. Int J Biochem. 1986;18:835-839. 62. Zhang X, McIntire WS. Cloning and sequencing of a copper-containing, topa quinone-containing monoamine oxidase from human placenta. Gene. 1996;179:279-286. 63. Bowsher RR, Verburg KM, Henry DP. Rat histamine N-methyltransferase. Quantification, tissue distribution, purification, and immunologic properties. J Biol Chem. 1983;258:12215-12220. 64. Novak I, Falus A. Molecular biology and role of histamine in physiological and pathological reactions. A review. Acta Biol Hung. 1997;48:385-394. 65. Jutel M, Blaser K, Akdis CA. Histamine in chronic allergic responses. J Investig Allergol Clin Immunol. 2005;15:1-8. 66. Jutel M, Blaser K, Akdis CA. Histamine in allergic inflammation and immune modulation. Int Arch Allergy Immunol. 2005;137:82-92. 67. Jutel M, Blaser K, Akdis CA. The role of histamine in regulation of immune responses. Chem Immunol Allergy. 2006;91:174-187.

80

68. Tanimoto A, Sasaguri Y, Ohtsu H. Histamine network in atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 2006;16:280-284. 69. Falus A, Hegyesi H, Lazar-Molnar E, Pos Z, Laszlo V, Darvas Z. Paracrine and autocrine interactions in melanoma: histamine is a relevant player in local regulation. Trends Immunol. 2001;22:648-652. 70. Musio S, Gallo B, Scabeni S, Lapilla M, Poliani PL, Matarese G, Ohtsu H, Galli SJ, Mantegazza R, Steinman L, Pedotti R. A key regulatory role for histamine in experimental autoimmune encephalomyelitis: disease exacerbation in histidine decarboxylase-deficient mice. J Immunol. 2006;176:17-26. 71. Jutel M, Watanabe T, Akdis M, Blaser K, Akdis CA. Immune regulation by histamine. Curr Opin Immunol. 2002;14:735-740. 72. Leurs R, Church MK, Taglialatela M. H1-antihistamines: inverse agonism, antiinflammatory actions and cardiac effects. Clin Exp Allergy. 2002;32:489-498. 73. Milligan G, Bond RA, Lee M. Inverse agonism: pharmacological curiosity or potential therapeutic strategy? Trends Pharmacol Sci. 1995;16:10-13. 74. Hill SJ, Ganellin CR, Timmerman H, Schwartz JC, Shankley NP, Young JM, Schunack W, Levi R, Haas HL. International Union of Pharmacology. XIII. Classification of histamine receptors. Pharmacol Rev. 1997;49:253-278. 75. Leurs R, Traiffort E, Arrang JM, Tardivel-Lacombe J, Ruat M, Schwartz JC. Guinea pig histamine H1 receptor. II. Stable expression in Chinese hamster ovary cells reveals the interaction with three major signal transduction pathways. J Neurochem. 1994;62:519-527. 76. Traiffort E, Leurs R, Arrang JM, Tardivel-Lacombe J, Diaz J, Schwartz JC, Ruat M. Guinea pig histamine H1 receptor. I. Gene cloning, characterization, and tissue expression revealed by in situ hybridization. J Neurochem. 1994;62:507518. 77. Togias A. H1-receptors: localization and role in airway physiology and in immune functions. J Allergy Clin Immunol. 2003;112:S60-S68. 78. Simons FE, Semus J, Goritz SS, Simons KJ. H1-antihistaminic activity of cetirizine and fexofenadine in allergic children. Pediatr Allergy Immunol. 2003;14:207-211. 79. Inoue I, Yanai K, Kitamura D, Taniuchi I, Kobayashi T, Niimura K, Watanabe T, Watanabe T. Impaired locomotor activity and exploratory behavior in mice lacking histamine H1 receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93:1331613320. 80. Morimoto T, Yamamoto Y, Mobarakeh JI, Yanai K, Watanabe T, Watanabe T, Yamatodani A. Involvement of the histaminergic system in leptin-induced suppression of food intake. Physiol Behav. 1999;67:679-683.

81

81. Yanai K, Son LZ, Endou M, Sakurai E, Watanabe T. Targeting disruption of histamine H1 receptors in mice: behavioral and neurochemical characterization. Life Sci. 1998;62:1607-1610. 82. Jutel M, Watanabe T, Klunker S, Akdis M, Thomet OA, Malolepszy J, ZakNejmark T, Koga R, Kobayashi T, Blaser K, Akdis CA. Histamine regulates Tcell and antibody responses by differential expression of H1 and H2 receptors. Nature. 2001;413:420-425. 83. Pattichis K, Louca LL. Histamine, histamine H2-receptor antagonists, gastric acid secretion and ulcers: an overview. Drug Metabol Drug Interact. 1995;12:136. 84. Barocelli E, Ballabeni V. Histamine in the control of gastric acid secretion: a topic review. Pharmacol Res. 2003;47:299-304. 85. Levi R, Capurro N, Lee CH. Pharmacological characterization of cardiac histamine receptors: sensitivity to H1-and H2-receptor agonists and antagonists. Eur J Pharmacol. 1975;30:328-335. 86. Sakai K. Role of histamine H1-and H2-receptors in the cardiovascular system of the rabbit. J Cardiovasc Pharmacol. 1980;2:607-617. 87. Del Valle J, Gantz I. Novel insights into histamine H2 receptor biology. Am J Physiol. 1997;273:G987-G996. 88. Idzko M, la Sala A, Ferrari D, Panther E, Herouy Y, Dichmann S, Mockenhaupt M, Di Virgilio F, Girolomoni G, Norgauer J. Expression and function of histamine receptors in human monocyte-derived dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 2002;109:839-846. 89. Leurs R, Bakker RA, Timmerman H, de Esch IJ. The histamine H3 receptor: from gene cloning to H3 receptor drugs. Nat Rev Drug Discov. 2005;4:107-120. 90. Lovenberg TW, Roland BL, Wilson SJ, Jiang X, Pyati J, Huvar A, Jackson MR, Erlander MG. Cloning and functional expression of the human histamine H3 receptor. Mol Pharmacol. 1999;55:1101-1107. 91. Gomez-Ramirez J, Ortiz J, Blanco I. Presynaptic H3 autoreceptors modulate histamine synthesis through cAMP pathway. Mol Pharmacol. 2002;61:239-245. 92. Torrent A, Moreno-Delgado D, Gomez-Ramirez J, Rodriguez-Agudo D, Rodriguez-Caso C, Sanchez-Jimenez F, Blanco I, Ortiz J. H3 autoreceptors modulate histamine synthesis through calcium/calmodulin- and cAMPdependent protein kinase pathways. Mol Pharmacol. 2005;67:195-203. 93. Drutel G, Peitsaro N, Karlstedt K, Wieland K, Smit MJ, Timmerman H, Panula P, Leurs R. Identification of rat H3 receptor isoforms with different brain expression and signaling properties. Mol Pharmacol. 2001;59:1-8.

82

94. Leurs R, Blandina P, Tedford C, Timmerman H. Therapeutic potential of histamine H3 receptor agonists and antagonists. Trends Pharmacol Sci. 1998;19:177-183. 95. Toyota H, Dugovic C, Koehl M, Laposky AD, Weber C, Ngo K, Wu Y, Lee DH, Yanai K, Sakurai E, Watanabe T, Liu C, Chen J, Barbier AJ, Turek FW, Fung-Leung WP, Lovenberg TW. Behavioral characterization of mice lacking histamine H(3) receptors. Mol Pharmacol. 2002;62:389-397. 96. Coge F, Guenin SP, Rique H, Boutin JA, Galizzi JP. Structure and expression of the human histamine H4-receptor gene. Biochem Biophys Res Commun. 2001;284:301-309. 97. Fung-Leung WP, Thurmond RL, Ling P, Karlsson L. Histamine H4 receptor antagonists: the new antihistamines? Curr Opin Investig Drugs. 2004;5:11741183. 98. de Esch IJ, Thurmond RL, Jongejan A, Leurs R. The histamine H4 receptor as a new therapeutic target for inflammation. Trends Pharmacol Sci. 2005;26:462469. 99. Hofstra CL, Desai PJ, Thurmond RL, Fung-Leung WP. Histamine H4 receptor mediates chemotaxis and calcium mobilization of mast cells. J Pharmacol Exp Ther. 2003;305:1212-1221. 100. Jablonowski JA, Grice CA, Chai W, Dvorak CA, Venable JD, Kwok AK, Ly KS, Wei J, Baker SM, Desai PJ, Jiang W, Wilson SJ, Thurmond RL, Karlsson L, Edwards JP, Lovenberg TW, Carruthers NI. The first potent and selective non-imidazole human histamine H4 receptor antagonists. J Med Chem. 2003;46:3957-3960. 101. Terzioglu N, van Rijn RM, Bakker RA, de Esch IJ, Leurs R. Synthesis and structure-activity relationships of indole and benzimidazole piperazines as histamine H(4) receptor antagonists. Bioorg Med Chem Lett. 2004;14:52515256. 102. Venable JD, Cai H, Chai W, Dvorak CA, Grice CA, Jablonowski JA, Shah CR, Kwok AK, Ly KS, Pio B, Wei J, Desai PJ, Jiang W, Nguyen S, Ling P, Wilson SJ, Dunford PJ, Thurmond RL, Lovenberg TW, Karlsson L, Carruthers NI, Edwards JP. Preparation and biological evaluation of indole, benzimidazole, and thienopyrrole piperazine carboxamides: potent human histamine h(4) antagonists. J Med Chem. 2005;48:8289-8298. 103. Lim HD, van Rijn RM, Ling P, Bakker RA, Thurmond RL, Leurs R. Evaluation of histamine H1-, H2-, and H3-receptor ligands at the human histamine H4 receptor: identification of 4-methylhistamine as the first potent and selective H4 receptor agonist. J Pharmacol Exp Ther. 2005;314:1310-1321.

83

104. Thurmond RL, Desai PJ, Dunford PJ, Fung-Leung WP, Hofstra CL, Jiang W, Nguyen S, Riley JP, Sun S, Williams KN, Edwards JP, Karlsson L. A potent and selective histamine H4 receptor antagonist with anti-inflammatory properties. J Pharmacol Exp Ther. 2004;309:404-413. 105. O'Reilly M, Alpert R, Jenkinson S, Gladue RP, Foo S, Trim S, Peter B, Trevethick M, Fidock M. Identification of a histamine H4 receptor on human eosinophils--role in eosinophil chemotaxis. J Recept Signal Transduct Res. 2002;22:431-448. 106. Bell JK, McQueen DS, Rees JL. Involvement of histamine H4 and H1 receptors in scratching induced by histamine receptor agonists in Balb C mice. Br J Pharmacol. 2004;142:374-380. 107. Dunford PJ, Williams KN, Desai PJ, Karlsson L, McQueen D, Thurmond RL. Histamine H4 receptor antagonists are superior to traditional antihistamines in the attenuation of experimental pruritus. J Allergy Clin Immunol. 2007;119:176183. 108. Dunford PJ, O'Donnell N, Riley JP, Williams KN, Karlsson L, Thurmond RL. The histamine H4 receptor mediates allergic airway inflammation by regulating the activation of CD4+ T cells. J Immunol. 2006;176:7062-7070. 109. Takeshita K, Sakai K, Bacon KB, Gantner F. Critical role of histamine H4 receptor in leukotriene B4 production and mast cell-dependent neutrophil recruitment induced by zymosan in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:1072-1078. 110. Varga C, Horvath K, Berko A, Thurmond RL, Dunford PJ, Whittle BJ. Inhibitory effects of histamine H4 receptor antagonists on experimental colitis in the rat. Eur J Pharmacol. 2005;522:130-138. 111. Zhang M, Thurmond RL, Dunford PJ. The histamine H(4) receptor: a novel modulator of inflammatory and immune disorders. Pharmacol Ther. 2007;113:594-606. 112. Ohtani T, Aiba S, Mizuashi M, Mollah ZU, Nakagawa S, Tagami H. H1 and H2 histamine receptors are absent on Langerhans cells and present on dermal dendritic cells. J Invest Dermatol. 2003;121:1073-1079. 113. Mazzoni A, Siraganian RP, Leifer CA, Segal DM. Dendritic cell modulation by mast cells controls the Th1/Th2 balance in responding T cells. J Immunol. 2006;177:3577-3581. 114. Jawdat DM, Rowden G, Marshall JS. Mast cells have a pivotal role in TNFindependent lymph node hypertrophy and the mobilization of Langerhans cells in response to bacterial peptidoglycan. J Immunol. 2006;177:1755-1762.

84

115. Katoh N, Soga F, Nara T, Masuda K, Kishimoto S. Histamine induces the generation of monocyte-derived dendritic cells that express CD14 but not CD1a. J Invest Dermatol. 2005;125:753-760. 116. Melief CJ. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming? Eur J Immunol. 2003;33:2645-2654. 117. Kolby L, Wangberg B, Ahlman H, Modlin IM, Granerus G, Theodorsson E, Nilsson O. Histidine decarboxylase expression and histamine metabolism in gastric oxyntic mucosa during hypergastrinemia and carcinoid tumor formation. Endocrinology. 1996;137:4435-4442. 118. Darvas Z, Sakurai E, Schwelberger HG, Hegyesi H, Rivera E, Othsu H, Watanabe T, Pallinger E, Falus A. Autonomous histamine metabolism in human melanoma cells. Melanoma Res. 2003;13:239-246. 119. Garcia-Caballero M, Neugebauer E, Campos R, Nunez dC, I, Vara-Thorbeck C. Increased histidine decarboxylase (HDC) activity in human colorectal cancer: results of a study on ten patients. Agents Actions. 1988;23:357-360. 120. Gutzmer R, Diestel C, Mommert S, Kother B, Stark H, Wittmann M, Werfel T. Histamine H4 receptor stimulation suppresses IL-12p70 production and mediates chemotaxis in human monocyte-derived dendritic cells. J Immunol. 2005;174:5224-5232. 121. Jawdat DM, Albert EJ, Rowden G, Haidl ID, Marshall JS. IgE-mediated mast cell activation induces Langerhans cell migration in vivo. J Immunol. 2004;173:5275-5282. 122. Szeberenyi JB, Pallinger E, Zsinko M, Pos Z, Rothe G, Orso E, Szeberenyi S, Schmitz G, Falus A, Laszlo V. Inhibition of effects of endogenously synthesized histamine disturbs in vitro human dendritic cell differentiation. Immunol Lett. 2001;76:175-182. 123. Caron G, Delneste Y, Roelandts E, Duez C, Bonnefoy JY, Pestel J, Jeannin P. Histamine polarizes human dendritic cells into Th2 cell-promoting effector dendritic cells. J Immunol. 2001;167:3682-3686. 124. Gillis S, Ferm MM, Ou W, Smith KA. T cell growth factor: parameters of production and a quantitative microassay for activity. J Immunol. 1978;120:2027-2032. 125. Buzas EI, Brennan FR, Mikecz K, Garzo M, Negroiu G, Hollo K, Cs-Szabo G, Pintye E, Glant TT. A proteoglycan (aggrecan)-specific T cell hybridoma induces arthritis in BALB/c mice. J Immunol. 1995;155:2679-2687. 126. Kripke ML, Munn CG, Jeevan A, Tang JM, Bucana C. Evidence that cutaneous antigen-presenting cells migrate to regional lymph nodes during contact sensitization. J Immunol. 1990;145:2833-2838.

85

127. Thomas WR, Edwards AJ, Watkins MC, Asherson GL. Distribution of immunogenic cells after painting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone. Different sensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology. 1980;39:21-27. 128. Shortman K. Burnet oration: dendritic cells: multiple subtypes, multiple origins, multiple functions. Immunol Cell Biol. 2000;78:161-165. 129. Pulendran B. Variegation of the immune response with dendritic cells and pathogen recognition receptors. J Immunol. 2005;174:2457-2465. 130. Hill JA, Ichim TE, Kusznieruk KP, Li M, Huang X, Yan X, Zhong R, Cairns E, Bell DA, Min WP. Immune modulation by silencing IL-12 production in dendritic cells using small interfering RNA. J Immunol. 2003;171:691-696. 131. Pan J, Zhang M, Wang J, Wang Q, Xia D, Sun W, Zhang L, Yu H, Liu Y, Cao X. Interferon-gamma is an autocrine mediator for dendritic cell maturation. Immunol Lett. 2004;94:141-151. 132. Yamaguchi N, Fujimori Y, Fujibayashi Y, Kasumoto I, Okamura H, Nakanishi K, Hara H. Interferon-gamma production by human cord blood monocytederived dendritic cells. Ann Hematol. 2005;84:423-428. 133. Harton JA, Ting JP. Class II transactivator: mastering the art of major histocompatibility complex expression. Mol Cell Biol. 2000;20:6185-6194. 134. Phan UT, Lackman RL, Cresswell P. Role of the C-terminal propeptide in the activity and maturation of gamma -interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT). Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99:12298-12303. 135. Maric M, Arunachalam B, Phan UT, Dong C, Garrett WS, Cannon KS, Alfonso C, Karlsson L, Flavell RA, Cresswell P. Defective antigen processing in GILTfree mice. Science. 2001;294:1361-1365. 136. Mahnke K, Knop J, Enk AH. Induction of tolerogenic DCs: 'you are what you eat'. Trends Immunol. 2003;24:646-651. 137. Rutella S, Lemoli RM. Regulatory T cells and tolerogenic dendritic cells: from basic biology to clinical applications. Immunol Lett. 2004;94:11-26. 138. Smits HH, de Jong EC, Wierenga EA, Kapsenberg ML. Different faces of regulatory DCs in homeostasis and immunity. Trends Immunol. 2005;26:123129. 139. Maldonado-Lopez R, Maliszewski C, Urbain J, Moser M. Cytokines regulate the capacity of CD8alpha(+) and CD8alpha(-) dendritic cells to prime Th1/Th2 cells in vivo. J Immunol. 2001;167:4345-4350. 140. Colvin BL, Morelli AE, Logar AJ, Lau AH, Thomson AW. Comparative evaluation of CC chemokine-induced migration of murine CD8alpha+ and

86

CD8alpha- dendritic cells and their in vivo trafficking. J Leukoc Biol. 2004;75:275-285. 141. Ngoc PL, Gold DR, Tzianabos AO, Weiss ST, Celedon JC. Cytokines, allergy, and asthma. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2005;5:161-166. 142. Lambrecht BN. Dendritic cells and the regulation of the allergic immune response. Allergy. 2005;60:271-282. 143. Jarjour NN, Calhoun WJ, Schwartz LB, Busse WW. Elevated bronchoalveolar lavage fluid histamine levels in allergic asthmatics are associated with increased airway obstruction. Am Rev Respir Dis. 1991;144:83-87. 144. Spiotto MT, Fu YX, Schreiber H. Tumor immunity meets autoimmunity: antigen levels and dendritic cell maturation. Curr Opin Immunol. 2003;15:725730. 145. Fazle Akbar SM, Abe M, Yoshida O, Murakami H, Onji M. Dendritic cell-based therapy as a multidisciplinary approach to cancer treatment: present limitations and future scopes. Curr Med Chem. 2006;13:3113-3119.

87

Saját publikációk jegyzéke A doktori dolgozat témájában írt közlemények listája:

1. Jelinek I, Laszlo V, Buzas E, Pallinger E, Hangya B, Horvath Z, Falus A. Increased antigen presentation and T(h)1 polarization in genetically histamine-free mice. Int Immunol. 2007;19:51-58. IF: 3,317 2. Buzas EI, Gyorgy B, Pasztoi M, Jelinek I, Falus A, Gabius HJ. Carbohydrate recognition systems in autoimmunity. Autoimmunity. 2006;39:691-704. IF: 1,49 3. Kis Z, Pallinger E, Endresz V, Burian K, Jelinek I, Gonczol E, Valyi-Nagy I. The interactions between human dendritic cells and microbes; possible clinical applications of dendritic cells. Inflamm Res. 2004;53:413-423. IF: 1,45 Egyéb közlemények listája:

1. Horvath Z, Pallinger E, Horvath G, Jelinek I, Falus A, Buzas EI. Histamine H1 and H2 receptors but not H4 receptors are upregulated during bone marrow regeneration. Cell Immunol. 2006 Dec;244(2):110-5. IF: 1,558

88

Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnék köszönetet nyilvánítani mindazoknak, akik ennek a doktori dolgozatnak a megtervezéséhez, az elkészültéhez hozzájárultak. Először is szüleimnek, akik remélem, hogy meg tudták bocsátani, hogy az utóbbi négy évben időm nagy részét már nem velük, hanem mindenféle apró egerekkel és csodálatos kis furcsa sejtekkel töltöttem a laborban. Köszönöm az irántam való türelmüket, és azt, hogy amikor csak kértem, mindig mellettem álltak. Másodszor, köszönetet szeretnék mondani témavezetőmnek, László Valériának, hogy irányításával és támogatásával mindig mellettem állt, és aki nélkül ez a dolgozat sosem készülhetett volna el. Köszönöm neki, hogy nem, is mint „felettesem”, hanem mint gondoskodó „dadusom” vigyázott rám ezekben az években. Köszönöm Falus Andrásnak, hogy megteremtette a sikeres doktori munkámhoz szükséges feltételeteket, és megadta azt az irányítást és támogatást, amire nagyon sokszor szükségem volt. Köszönöm neki, hogy olyan tulajdonságokat is meglátott bennem, amiket én sosem hittem volna magamról. Köszönöm aacheni főnökeimnek, Martin Zenkének és közvetlen témavezetőmnek Thomas Hieronymusnak, hogy bevezettek engem a dendritikus sejtek csodás világába, számtalan metodikát és trükköt tanítottak, amiért örökre hálás vagyok nekik. Harmadszor köszönet illeti azokat, akikkel egy laborban dolgozhattam ez alatt a pár év alatt, és akik a tudásukkal, tanácsaikkal, ötleteikkel és kérdéseikkel, na és különösen az egyéni szemléletükkel különösen sokat lendítettek ezen a munkán. Külön köszönet illeti Horváth Zsuzsannát, akivel sokat szenvedtünk együtt, ugyanakkor életkedvének, lendületének, bátorságának, vagányságának köszönhetően számtalan nagyszerű élménnyel lettünk gazdagabbak. Negyedszer szeretném köszönetemet kifejezni mindazoknak, akikkel a SE Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézete, a MTA-Semmelweis Egyetem Immungenomikai Kutatócsoportja, és az RWTH Institut für Medizinische Technologie, Zellbiologie munkatársaként egy intézetben dogozhattam ez alatt az idő alatt, és akik befogadtak abba a társaságba, amiben már hosszú ideje dolgoztak.

89

És legvégül szeretném megköszönni páromnak, Pós Zoltánnak, hogy mindvégig itt volt mellettem, szeretetével, megértésével és támogatásával hihetetlenül megkönnyítette és megszépítette számomra ezeket az éveket. Ugyanakkor szakmai tanácsai révén rengeteget tanultam tőle nemcsak a szűken vett természettudomány területén, hanem egyéb területeken is, mint például a statisztikai elemzések, ábrák gyártása, vagy az oktatás rejtelmei.

90