A részletes kutatási terv felépítése: 1.A vonatkozó nemzetközi irodalom alapján milyen szempontok vezettek a projekt megfogalmazásához. A világ népessége folyamatosan nő, mely növekedés nem kiegyensúlyozott. Magyarországon és a fejlett világban negatív irányú demográfiai változások figyelhetők meg, melyek időzített bombát jelentenek társadalmi és gazdasági szempontból egyaránt. A helyzet komoly feladat elé állítja a politikai döntéshozókat és a reprodukció valamennyi területének szakembereit is. A reprodukció endokrinológiája nagy fejlődésen ment át az elmúlt évtizedekben, melynek eredményeként nemcsak elméleti ismereteink bővültek, hanem a mindennapi klinikai gyakorlat számára is forradalmian új lehetőségek nyíltak meg. Az asszisztált reprodukciós módszerek egyre növekvő effektivitására, valamint a szülés körüli élettani és kórélettani folyamatok behatóbb megismerése eredményeként imponálóan javuló perinatális eredmények ellenére az asszisztált reprodukciós módszerek eredményessége nem haladja meg az élettani reprodukciós rátát, s messze elmarad az elméletileg lehetséges sikerességtől. A súlyos egyéni és társadalmi terhet jelentő fejlődési rendellenességek korai felismerésében és az un préimplantációs genetikában korábban nem ismert, új lehetőségek nyíltak meg, melyek hozzájárulhatnak egy egészségesebb társadalom megteremtéséhez. Ez utóbbi módszerrel kapcsolatosan megfogalmazott kritikák erősödése, továbbá a laboratóriumi diagnosztika módszereinek érzékenységében észlelt több nagyságrendbeli javulás felvetette egy, a fejlődő embrió anyagcseréjének közvetlen környezetét biztosító tápoldat vizsgálatának szükségességét olyan markerek irányában, melyek az embrió viabilitását, implantációs képességét és genetikai intaktságát mutathatják. A fenti szempontokhoz az is hozzá tartozik, hogy mindeközben világszerte növekszik a meddőségi kezelésekre jelentkezők, és így az asszisztált reprodukciós kezelések száma is. Jelenleg közel 3-4% az így született gyermekek aránya az összes születéshez képest, és ez az érték tovább emelkedik. Az asszisztált reprodukciós eljárások, elsősorban az in vitro fertilizáció (IVF) elterjedésével számolnunk kell ezen kezelések mellékhatásainak gyakoribb előfordulásával is. Komoly erőfeszítések zajlanak a sikerességi ráta további emelése és a mellékhatások egyidejű minimalizálása érdekében. Ennek okán az intraovariális reguláció fontosságát az utóbbi években számos tanulmány elemezte. Több fehérje szerepét vizsgálták a patogenezisben, újabb adatok azonban olyan anyagok szerepét hangsúlyozzák, mint az aktivin, inhibin, insulin-like growth factor (IGF) I és II, epidermal growth factor, IGF-binding protein, intraovariális reninangiotenzin rendszer, oxytocin, opiátok. Mostanra ezek az adatok kiegészültek a citokinek és interleukinek, valamint számos (neuro)parakrin faktor intraovariális szerepével. Keveset tudunk azonban ezen anyagoknak a petefészek működés szabályozásának zavarával járó kórfolyamatokban, mint például a policisztás petefészek szindrómában, vagy az ovariális hiperstimulációs szindrómában (OHSS) betöltött szerepéről. Bár a hiperstimuláció pontos mechanizmusa ismeretlen, annyi bizonyos, hogy perifériás arteriolás értágulattal, fokozott ér permeabilitással és trombocita aktivációval jár. A folyamatban részt vesz a renin-angiotenzin rendszer, citokinek, mint az interleukin-8 (IL-8), tumor nekrózis faktor alfa (TNF-α), endothelin-1, és vascular endothelial growth factor (VEGF). Az aktivált trombocitákból további anyagok szabadulnak fel, melyek az OHSS tüneteiért felelősek (hisztamin, szerotonin, platelet derived growth factor és lysophosphatidic acid (LPA)). Nincs egyelőre végleges elképzelésünk a tüszőfolyadékban található faktorok (acetilkolin, szerotonin, hisztamin) szerepéről az intraovariális regulációban és azok
lehetséges kapcsolatáról az LPA receptorokkal, de munkacsoportunk korábbi eredményeiből jól ismert, hogy a granulóza sejt funkciót jelentősen módosító hatásuk van. Ugyanakkor régóta ismert, hogy az ovuláció gyulladásos jellegű élettani folyamatában jelentős szerepet töltenek be a trombociták. Másrészről bizonyítást nyert a pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide (PACAP) gyulladásos folyamatokban játszott élettani szerepe a tumor nekrózis faktor alfa (TNF-α) szint csökkentésén keresztül, mely az endokrin rendszerrel szoros összefüggésben van. Ez alapján logikusnak tűnik a feltételezés, hogy ezen utóbbi funkció szaporodásbiológiai vetülettel is bír. Korábbi tanulmányok már rámutattak arra, hogy VEGF mRNS expressziója összefüggésben van a petefészkek vazoproliferációjával, valamint számos adat utal arra, hogy a nitrogén oxid szintetáz endogén inhibitora az asszimetrikus dimetilarginin (ADMA) módosítja az endotel sejtek VEGF szintjét. Az intraovariális szabályozó mechanizmusok vizsgálatára rendelkezésre álló eszközeink behatároltak. Lehetőség van in vitro szuperfúziós rendszerekben, például granulóza sejtekben mérni az érintett peptidek mennyiségét, vagy humán váladékból, például in vitro fertilizációs kezelés során „melléktermékként” nyert tüszőfolyadékból, vagy az embriót körülvevő tápoldatból meghatározni ezen anyagok koncentrációját. Ugyancsak igen jelentős szempont, hogy a természetes és az ember által befolyásolt környezetünkben (köztük az agrártermelésben) már jelen lévő, vagy megjelenő mérgező anyagok környezeti kockázati tényezőt jelentenek. Az állat és az ember szervezetébe döntően a takarmánnyal, illetve táplálékkal jutnak be. Ezek veszélye részben ismertté vált, az egészségre kifejtett káros hatásuk „mikéntje” azonban még mindig sok szempontból ismeretlen. Korábban elsősorban az akut toxicitásra, a rákkeltő és a fejlődési rendellenességet okozó hatások felderítésére helyezték a fő hangsúlyt. Napjainkban egyre nagyobb jelentőséget kap az ún. reprodukciós és/vagy genetikai toxicitás kiszűrése. A reprodukciós/genetikai hatással kapcsolatos modell vizsgálatokat elsősorban nőstényeken végzik/végezték. Mára azonban a szakemberek többsége felismerte, hogy a hímek legalább olyan érzékenyek az őket ért környezeti terhelő hatásokra, mint a nőstények. Ezt támasztja alá a WHO nemrég közzétett tanulmánya, mely szerint az elmúlt 15-20 évben, a környezetünkben felszaporodó toxikus anyagok (pl. vegyszerek, gyógyszer- és vegyszermaradvány anyagok, élelmiszerekben megjelenő toxikus anyagok, elektrotechnikai eszközök hatása, elektromágneses sugárzás, stb.) és a helytelen életvitel (alkohol és kábítószer fogyasztás, dohányzás, stb.) hatására a férfiak spermájában a spermiumok koncentrációja a felére csökkent. Ennek tudható be, hogy a WHO a 15-20 évvel ezelőtti ajánlásával szemben a normális ejakulátumban ma már csak 15 millió/mL-ben határozza meg a spermiumok számát. Ez a szám néhány évtizeddel ezelőtt még 30-40 millió/mL volt. A donor sperma bankok adatai szerint így is minden 10 férfiból csak kb. 2-3 felel meg a „könnyített követelményeknek”. Korábban a meddő házaspárok vizsgálatánál többségben voltak azok az esetek, amikor az eredmények azt mutatták, hogy a női partnerre vezethető vissza gyermektelenség. Ma már 40-40%-ban részesedik mindkét fél, és 20% azon házaspárok aránya, akiknél mindkét fél érintett a meddőségben. A környezetterhelő toxikus anyagok közül a mikroszkópikus méretű penészgombák által termelt mikotoxinok folyamatosan bekerülnek az élelmiszerláncba, egyelőre nem kiiktatható táplálékszennyezők. Kb. 20 olyan mikotoxin van, amelynek kifejezett állat- vagy humán-egészségügyi hatása van. Ezek a következők: rákkeltő hatás (afltoxinok, fumonizinek, ochratoxin A), immunszupresszív, lipidperoxidációt és apoptózist fokozó hatás, reprodukciós zavarok (zearalenon, trichotecének) és idegrendszeri zavarok (ochratoxin A, fumonizinB1). Általában több mikotoxin együttes hatásával kell számolni (multitoxikus hatás), az ezek közötti szinergista, antagonista, vagy additív hatások ma még kevéssé ismertek. A mikotoxinok növényi eredetű élelmiszerekkel, élvezeti cikkekkel (pl. korpában gazdag kenyérrel, müzlivel, gyümölcslevekkel, sörrel, kávéval) közvetlenül bejutnak az emberi 2
szervezetbe. Az ember mikotoxikózisairól aránylag keveset tudunk, annak ellenére, hogy már évszázadokkal korábban leírtak súlyos „járványokat”. Még a 2000-es évekből is vannak adatok tömeges, elhalálozással járó humán akut aflatoxikózisokról (a legutolsó 2008-ból), a legsúlyosabbat Kenyában írták le, 2004-ben. Elsősorban a gabonafélék fertőződnek penészgombával és szennyeződnek mikotoxinokkal. A gabonafélék nagyarányú szennyezettsége azért is különösen érdekes Magyarországon, mert ezek képezik az abrakevő állatok (sertés, ló, baromfi) takarmányának alapját, a humán táplálkozásban a fő energiaforrás, amelyből a hazai lakosság meglehetősen sokat fogyaszt. A fejlett országokban az alacsony dózisú expozíció, azaz az idült mikotoxikózis előfordulásával kell számolni, amely főként szaporodásbiológiai zavarokban, vagy csökkent ellenálló-képességben nyilvánul meg. Eddigi vizsgálatainkban az ovariális hiperstimulációs szindróma és ebben kulcsszerepet játszó VEGF, illetve ennek működésére ható aszpirin hatását elemeztük in vitro fertilizációs kezelés során. Tanulmányoztuk a pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) jelenlétét és koncentrációját a follikuláris folyadékban és azt, hogy a különböző arginin származékoknak milyen szerepe van az in vitro fertilizáció kimenetelére. Az ezen vizsgálatokból nyert bíztató eredmények vezettek arra a következtetésre, hogy szükég van az embriót anyagcseréjének vizsgálatán keresztül az embrió minőségére utaló markerek megismerésére is. Az IVF során beültetett embryok csupán 20–25% jut el a sikeres, szüléssel végződő terhességig. A kompetens embriók kiválasztása, ill az uterus receptivitásának jellemzése az asszisztált reprodukció fejlődésének alapvető feltétele. Az implantáció sikerének kritériumai; a receptív endometrium, az egészséges blastociszta és a feto-maternális párbeszéd megfelelő szinkronja. Utóbbi kommunikációt cytokinek, chemokinek, növekedési faktorok valósítják meg. Fontos szerepet játszanak ebben a kommunikációban az endometriális interleukin-18 (IL-18), IL-15, a tumor necrosis factor weak inducer of apoptosis (TWEAK) továbbá a follikuláris folyadékban található granulocyta colony-stimulating factor (G-CSF, CSF3). A preimplantációs factor (PIF) felfedezése Barnea és mtsai nevéhez fűződik. Számos rendelkezésre álló adat utal a sikeres beágyazódás és a PIF termelés összefüggésére. Állatkísérletben kimutatták, hogy a kétsejtes egér embriók már termelnek PIF-et és a PIF koncentrációja összefüggést mutat az embrió minőségével. A PIBF a progesteron-indukálta gének egyike, amely a cytokintermelésre kifejtett hatásán keresztül egérmodellben anti-abortív tulajdonsággal rendelkezik. A molekula receptora GPI-horgonyzott fehérje, amely az IL-4R alfa láncával kombinálódva a Jak/STAT jelátviteli úton keresztül valósítja meg biológiai hatásait. Korábban kimutattuk, hogy a megtermékenyített petesejt felülúszója nem terhesektől származó lymphocytákban IL-10 termelést indukál, ami a PIBF hatásának tudható be. Egérben PIBF hiányában gátolt az implantáció. A későbbiekben a molekula a trophoblast invázió szabályozásában játszik szerepet. Barnea és mtsai. adatai szerint a PIF negatív petesejtek beültetése nem eredményezett terhességet, míg sikeres terhességben a beültetett petesejtek 33%-a PIF pozitív volt. Ledée és mtsai. számos cytokin koncentrációját határozta meg a follikuláris folyadékban. Egyedül a GCSF koncentrációja mutatott összefüggést a terhesség létrejöttével. A klinikai gyakorlatban, korábban a magzati nem meghatározásának egyetlen biztos módszere a chorionboholy, vagy magzatvíz-mintavétel során nyert magzati eredetű sejtek DNS vizsgálata volt. A beavatkozás azonban nem veszélytelen, a mintavételt követő spontán 3
vetélések száma eléri az 1%-ot. A témában nagy áttörést, Dennis Lo és munkacsoportjának 1997-ben tett felfedezése jelentette: sikerrel mutattak ki fiú magzatot hordó anyai vérből szabad magzati DNS-t, ezzel utat nyitva a non-invazív prenatális diagnosztika felé. Az intrauterin életben a méhlepényen keresztül biológiailag jelentős sejt- és DNS-transzport zajlik. Az anyai vérkeringésbe bekerülő magzati sejtek magzati magvas vörösvérsejtek, magzati lymphocyták és trophoblastsejtek. A szabad magzati eredetű DNS ezen sejtek nekrózisával, apoptózisával és aktív DNS kiválasztásával kerül az anya vérplazmájába. Jelenléte már a vérzéskimaradást követő 16-22. héten kimutatható az anya vérkeringéséből, aránya az összes szabad DNS mennyiségének mintegy 2,3%. Mennyisége a terhesség előrehaladásával növekszik, majd szülést követően 2 órán belül eliminálódik a keringésből. Mára bizonyított, hogy a szabad magzati DNS mennyisége az első trimeszter határán, valamint a második trimeszter elején elegendő a magzati nem biztonságos nem-invazív meghatározására. A magzati nem meghatározásának jelentőségét a nemhez kötötten öröklődő betegségek adják. Az ultrahangvizsgálat csak az első trimeszter utolsó heteitől mutatja ki megbízhatóan a magzat nemét, a DNS-vizsgálat jó néhány héttel hamarabb jelezheti az Y kromoszóma jelenlétét. Ez az időnyereség fontos azoknak a kismamáknak, akiknek a családjában X kromoszómához kötött betegség (pl.:Duchenne muscularis dystrophia, haemophilia A, stb…) fordult elő. További lehetőség a magzati genom célzott vizsgálatára, a magzati fejlődés során, vagy csak a trofoblasztokban átíródó, komplex önszabályozó alhálózatot alkotó, mRNS-ek, valamint mikro-RNS-ek elemzése. A magzat genetikai állományának vizsgálatán túl fontos kérdés lehet azon tényezők definiálása és vizsgálata is, amelyek szövődménymentes terhesség esetén a szabad magzati DNS mennyiségét befolyásolják (pl.: etnika hovatartozás, anyai testsúly). Mindezek mellett változatlanul érvényesül az implantáció vizsgálatakor egy elsősorban etikai alapú gát, mely bizonyos vizsgálatok elvégzését nem tesz lehetővé humán vonatkozásban (evidencia). Az állatkísérletes modell alkalmazása ezért szükséges része a projekt egyéb vizsgálatai közben felmerülő, emberen nem vizsgálható kérdések megválaszolásának. Minél többet tudunk a gének szerepéről, annál világosabbá válik a fehérjék és azok módosításainak szerepe a patológiás folyamatokban. A proteomika összetett fehérje- és peptidkeverékek minőségi és mennyiségi vizsgálatát jelenti. A proteom kutatás elméleti alapja egyszerű: a különböző minták fehérje készletét összehasonlítva olyan markereket fedezhetünk fel, amelyek egyértelműen jellemzőek az adott fiziológiás körülményekre. Tehát az adott pillanatban minőségi és lehetőleg mennyiségi vizsgálatot kell végezni az adott fiziológiás állapotú sejt vagy az azt körülvevő médium teljes fehérjeállományáról és azt össze kell vetni a kísérletesen manipulált, vagy beteg sejt proteomjával. Így a különbséget okozó fehérjék vagy fehérje töredékek mennyiségi és minőségi analízise, pontos szekvenciájának és kovalens módosításainak meghatározása diagnosztikai célokat szolgálhat. A valóságban a megoldás azért bonyolult, mert több tízezer fehérje vagy peptid egyszerre történő analíziséről van szó. Ma a legelterjedtebb módszer az, hogy valamilyen elválasztás technikai módszerrel a több tízezer fehérje, peptid közül kiválasztják azt a nagyobb csoportot (szubproteomot), amelyben az összehasonlítani kívánt peptidek, fehérjék megtalálhatók Az előzőekben leirt, modern, de klasszikus laboratóriumi módszereken alapuló kutatások alapján feltételezhető hogy sikerül a préimplantácios tápoldatból biomarkereket izolálni amelyek segítségül szolgálhatnak az embrió viabilitisának és ezen keresztül az asszisztált reprodukciós módszerek hatékonyságának a prognosztizálására. Ahhoz hogy ezeket a biomarkereket a klinikai gyakorlatban is használni lehessen a meghatározási módszernek a következő minimális előfeltételnek kell eleget tenni: a. igen kis mennyiségű (1-5 µl) implantációs tápoldatból lehessen meghatározni, b. a meghatározásnak igen érzékenynek 4
kell lenni (fmol/l), c. rövid idő alatt (˂30 perc) és d. specifikusan kell mérni. Ezeknek a követelményeknek csak mikroáramlási és nano-biotehnológián alapuló lab-on-a-chip módszer tud eleget tenni. Az elektronikai ipar fejlődésével a múlt század 60-as 70-es éveiben a legkülönbözőbb chip-módszerek jelentek meg, amelyek szilícium felhasználásán alapultak. A 80-as 90-es években John Terry és Andreas Manz egymástól függetlenül jutottak el ahhoz a gondolathoz, hogy az orvos-biológiai laboratóriumokba is be kellene vezetni a szilícium megmunkálásán alapuló chip módszereket (Terry et al., 1979, Manz et al., 1990). Ezen úttörő gondolatok alapján a hollandiai Twentei Egyetemen Piet Bergveld és munkatársai vezették be l a 90-es évek elején az irodalomba a „Lab-on-a-Chip (LOC)” tehnológia fogalmát (Bergveld, 2003 ). Ezek az eszközök nagyon hasonlítanak az elektronikus chipekhez, a mikro-csatornát úgy is fel lehet fogni, mint a mikrohullámot. A vizsgálandó folyadékok keresztüláramlanak a szerkezeten, így a folyadék alkotóira bontható szét, és azok külön vizsgálhatók. Így egy négyzetcentiméternyi chipben számos anyag vizsgálható. Ezen munka alapján napjainkban egyre több u.n. point-of-care módszert (POCT) használunk a mindennapi klinikai diagnosztikában (ld. www.lab-on-a-chip, www.http://fluidicmems.com/list-ofmicrofluidics-lab-on-a-chip-andbiomems-companies/). A litográfiai módszerekkel készített szilikát és szilícium mikroáramlási chipeken túlmenőleg egyre gyakrabban használnak sokkal egyszerűbben előállítható és ezáltal sokkal olcsóbb műanyag polimer (pl. PDMS-Polydimethylsiloxane) mikroáramlási chipeket. A mikroáramási rendszereknek (microfluidics) számtalan előnye van a klasszikus laboratóriumi módszerekkel szemben. 10-100 µm keresztmetszetű mikro csatornákban az áramlás nem turbulens, hanem lamináris (mikro csatornában a „Reynolds szám” nagyon alacsony), ami előfeltétele az állandó áramlásnak a csatornában, ami magától érthetően alapvető feltétele a mennyiségi meghatározásnak (Kenis et al., 1999). Ilyen mikro csatornákban vagy a még keskenyebb nanocsatornákban lamináris áramlási körülmények között lehet igen kis távolságon nagy koncentrációkülönbségeket elérni, ami lehetőséget ad nemcsak kvalitatív, hanem kvantitatív meghatározásokra is igen kis térfogatban (Eijkel and van den Berg, 2005). A mikrométeres keresztmetszetű csatornákban a folyadék felület/térfogat arány sokkal kedvezőbb, ami lehetővé teszi mikroliteres minták elválasztását és izolálását. Az átlagos átfolyási sebesség ezekben a csatornákban mm/sec ami lehetővé teszi a meghatározások gyors kivitelezését. A mikro-áramlásos rendszerű chipek fő előnye a kis méret, és kevés reagens igény. A kis méret lehetővé teszi néhány mikroliter volumenű minta vagy sejt vizsgálatát, néhány mikroliter reagens hozzáadásával. Méretüknek köszönhetően a folyadékok felület/térfogat aránya jóval nagyobb, mint a makro-skálás rendszereknél, ezt az előnyt mind a preparálás, mind az analízis során kihasználhatjuk. Másik előny, hogy a rendszer automatizálható, így az emberi munka igény minimális. További előny az integráltság, nincs szükség az analízishez mintapreparálásra, melyhez korábban számos egység műszer kellett és a rendszer párhuzamosan több folyamatot tud egyszerre végezni. Végezetül a chipek tömegméretű gyártása az árak csökkentéséhez vezethet. Mikrocsatornákban izolált biológiai anyagok analizálása nanotechnológiai módszerekkel (nano-vezetékes érzékelők) szignifikánsan érzékenyebb és specifikusabb mérési módszereket eredményez biológiailag aktív anyagok rövid idő alatt a beteg közvetlen közelében (POCT) történő meghatározására. 2. A munkahipotézis rövid bemutatása, a tervezett kutatások specifikus céljainak leírása. 5
Célunk az asszisztált reprodukciós technikák hatásfokának jelentős emelése az embrió potenciális károsodása nélküli vizsgálatokkal. Több külföldi szerző által is felvetett klinikai gyakorlati igény alapján merült fel az az alapkutatási cél, melynek lényege a fejlődő embrió anyagcseréjének közvetlen környezetét biztosító tápoldat vizsgálata, olyan markerek irányában, melyek az embrió viabilitását mutathatják. Ezen módszerek segítségével lehetővé válik az embrió minőségének vizsgálata anélkül, hogy magát az embriót bármilyen vizsgálatnak és ezáltal potenciális károsodásnak vetnénk alá. A project altevékenysége során laboratóriumi és tömegspektrometriai vizsgálatokkal detektált és azonosított fehérjék, peptidek és azok kémiai módosulásainak és metabolitjainak jelenlétét és koncentrációját az embrionális tápoldatban összevetjük az in vitro fertilizációs eljárás klinikai paramétereivel (embrió mikroszkópos megjelenése, biokémiai és klinikai terhesség létrejötte). Az eredmények megfelelő statisztikai elemzését követően lehetőség nyílik olyan következtetések levonására, melyek alapján a biomarkerek előfordulása és szintjük szerint osztályozhatóak lesznek az embriók. Ezen eredmények alapján a cél, hogy a projekt altevékenysége során kifejlesztésre kerülő lab-on-chip módszer alkalmas legyen az embrió megtapadásának és viabilitásának prognosztizálására.A beültetése alkalmas embriók közöl így kiválasztahtó lesz a várhatóan legnagyobb eséllyel megtapadó és ezáltal terhességhez vezető embrió. Az állatkísérletek nem nélkülözhetőek a reprodukciós toxicitás vizsgálatokban. A toxikus anyagok által okozott káros hatások kimutatása élettani monitorozással, állat modell kísérletekben lehetővé teszi az emberi szervezetre gyakorolt, de azon nem vizsgálható negatív hatások becslését, segíti a tudományosan megalapozott humán kockázatkezelést- és elemzést. Figyelembe kell azonban venni azt, hogy nincs ideális humán modell állat, több állatmodell együttes alkalmazása szükséges következtetések levonásához. Reprodukciós vizsgálatokban főként egereket és patkányokat használnak. Ugyanakkor különböző vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy toxicitás vizsgálat tekintetében a nyúl több paraméter esetében közvetlenül emberre vonatkozatható eredményeket szolgáltathat. Ugyancsak célunk, hogy új immunológiai biomarkerek azonosításával, ill. a mások által felvetett markerek hasznosságának saját rendszerünkben történő vizsgálatával az implantáció zavarainak megértése, mellyel a gyakorlatban is hasznosítható diagnosztikus eszközökhöz jutunk. Célunk olyan immunológiai biomarkerek azonosítása, ill. az irodalomban leírt markerek olyan kombinációinak azonosítása, amelyek az egészséges embriót jellemzik, és előre jelezhetik a sikeres terhességet. Az adott részfeladat célja, hogy megvizsgáljuk a PIF, a granulocyta kolonia stimuláló factor és a PIBF az embrió tenyésztőfolyadékában mérhető koncentrációjának összefüggését a sikeres beágyazódással és a terhesség létrejöttével. Az embrió viabilitását, implantációs képességét mind az anyai, mind az embrió genetikai háttere, esetleges mutációk, funkcionális polimorfizmusok, s az újabb kutatási eredmények szerint, mikro-RNS-ek, nagymértékben befolyásolják. A prediszponáló embrionális és anyai genetikai tényezők vizsgálata azonban, a laboratóriumi diagnosztika módszereinek fejlődése ellenére, a mai napig kihívás elé állítja a kutatókat. Procedurális nehézségek, mint: az embrió potenciális károsodása nélküli mintavételezés, mennyiségi korlátok, kontaminációs problémák, nukleinsav izolálási nehézségek, genetikai analízisre használt metodikák alacsony standardizáltsága olyan tényezők, amelyek nagymértékben befolyásolják a vizsgálat kimenetelét s eredményességét.
6
A project keretében célul tűztük ki, szabad magzati DNS kimutatását, anyai keringésből és a magzati nem nem-invazív meghatározását, Y-kromoszómán elhelyezkedő SRY valamint DYS-14 gének alapján. Vizsgálni kívánjuk a módszer megbízhatóságát és reprodukálhatóságát, különös tekintettel a terhességi korra, mintagyűjtésre/feldolgozásra, a valósidejű PCR technika érzékenységére, standardizálására. A minőségi meghatározáson túl célul tűztük ki fiú magzat esetén, a szabad magzati DNS és az összes szabad anyai DNS mennyiségi analízisét, arányának változását a terhességi kor függvényében; totál szabad DNS mennyiségi analízise humán β-globin gén alapján. Ezen módszer a későbbiekben alapjául szolgálhat DNS expressziós vizsgálatokhoz, továbbá a vizsgálatban használt „nemspecifikus” (Y kromoszómához kötött) DNS markerek révén, a magzati nem meghatározáshoz. A tanulmány további céljaként a fejlődő embrió anyagcseréjének közvetlen környezetét biztosító tápoldatból, magzati nukleinsav izolálását, a módszer optimalizálását, s a magzati DNS, Light Cycler valós idejű PCR technikával történő azonosítását, határoztuk meg. A módszer optimalizálása révén lehetőség nyílik a továbbiakban génexpressziós vizsgálatok tervezésére; a viabilitási markerek DNS-RNS szintű vizsgálatára. Ezen eredmények alapján célunk, egy olyan genetikai profil meghatározása, amely alaklmas lehet az embrió megtapadásának és viabilitásának prognosztizálására. A beültetésre alkalmas embriók közöl így kiválasztható lesz a várhatóan legnagyobb eséllyel megtapadó és ez által terhességhez vezető embrió. Jelenlegi ismereteink és az ezekre alapuló feltételezéseink alapján a megtermékenyített petesejt beágyazódása, életképessége és egészséges fejlődése szempontjából alapvető fontosságú a folyamatok proteomikai hátterének alapos és szisztematikus vizsgálata. A normál és pathológiás folyamatok molekuláris mechanizmusának döntő hányada az élő szervezetet alkotó fehérjék és peptidek szintjén zajlik le. Nincs ez másképpen az embiógenezis során sem. A jelen projekt proteomikai részfeladatának alapvető célja a megtermékenyítés utáni proteomikai változások vizsgálata és leírása. Véleményünk szerint eredményeink alapján pontosabban megismerhetőek a megtermékenyített petesejt beágyazódásának és viabilitásának molekuláris paraméterei, valamint alapvető információkat nyerhetünk az emriógenezis molekuláris hátteréről és a folyamat során bekövetkező proteomikai változásokról. Munkánk során a proteinek és peptidek minőségi és mennyiségi vizsgáltaihoz a legreprodukálhatóbb robotizált mintaelőkészítési eljárásokat és a legmodernebb tömegspektrometriás módszereket használjuk. Célunk a kutatásban felsorolt vizsgálatok által igazolt prognosztikai marker ismeretében rutin vizsgálatra alkalmas microfluidic chip kidolgozása. Ennek előfeltétele egy jól definiálható anyag kimutatása, amely alkalmas az embrió megtapadásának és viabilitásának prognosztizálására. Ennek ismeretében lehetőség nyílna arra, hogy célzottan lab-on-a-chip módszerrel point-of-care meghatározást lehessen kidolgozni a Twentei Egyetem Lab-on-a-Chip csoportjának együttműködésével. A miniatürizálás kifejlesztésével a klinikai diagnosztika előtt új lehetőségek nyílottak meg. A chipek kifejlesztésével az analitikus módszerekben funkcionális mikro-laboratóriumok jöttek létre. Ezek leginkább az úgynevezett point of care analízisre és a sejtkutatásra fókuszálnak, a jövőben pedig a személyre szabott gyógyítás lehetőségét vetítik előre. A point-of-care (POC) teszt egy olyan laboratóriumi vizsgálatot takar, ami a beteg közvetlen közelében, vagy legalábbis ahhoz nagyon közel történhet. A POC tesztek lényege a komplex, nagyon kis volumenű oldatok gyors és hatékony elemzése, egy könnyen kezelhető, alacsony árfekvésű, miniatürizált úgynevezett lab-on-chip (LOC) eszközzel. A POC eszközökben zajló jelenlegi fejlesztések széles területet nyitnak meg az orvostudományban, korai diagnózisok felállításában, melyeket hatékonyabb terápia követhet. 7
A mai, már hagyományosnak tekintett POC tesztek, úgymint a vérgáz analízis, enzimek, ionok, cukor, laktát, szívizom markerek, meghatározásával szemben egyre növekvő a sejtszintű analízis igénye, mely új módszerek kidolgozásának szükségességét vetette fel. A lítium az egyik legfontosabb készítmény a mániás depressziós betegeknél. Hátránya a viszonylag szűk terápiás spektruma, mely miatt folyamatos vérszint ellenőrzés szükséges. Éppen ezért igen nagy előny lenne egy POC teszt kifejlesztése ebből a szempontból. A fémionok kimutatásának gold standardja az abszorpciós spektroszkópia. Ma a lítiumot szelektív elektróddal mérik, ami a legalkalmasabb lenne a miniatürizáláshoz. Ezzel ellentétben, dán kollégáinkkal kollaborálva kifejlesztettünk egy kapilláris elektroforézis labon-chip tesztet, melyben a detektor egy vezetőképességet érzékelő platina film réteg. Ennek a módszernek a fő előnye, a többivel szemben, hogy több mintát lehet egy teszttel analizálni, ráadásul gyorsan, és a mintát nem kell külön preparálni. A POC tesztekkel szemben egyébként is fontos elvárás, hogy ujjbegyből vett mintából legyen képes mérni, előzetes preparálás nélkül. Kifejlesztettünk egy mikrofolyadék tesztet a spermium koncentráció meghatározására, ami a férfi fertilitás legfontosabb paramétere. Ez a chip egy olyan elektródapárt tartalmaz, amelynél a spermium áthaladása elektromos impedancia méréssel történik. Más sejtek áthaladásakor is impedancia különbség lép fel az elektródok között, ami interferálhat a hímivarsejt számmal, azonban demonstráltuk, hogy az impedancia különbség mértéke a sejtek méretével korrelál, így a sejtek egymástól megkülönböztethetők. A leírt chip meghatározás az első lépés a teljes sperma analízis irányában.
3. Irodalmi hivatkozások alapján az alkalmazni kívánt módszerek bemutatása. A project humán oldalán végzett vizsgálatokhoz szükséges állatkísérletes modellek beállíta, hogy anyagokat szolgáltasson a projekt fő vonulatát képező - és végső soron céljaink szerint emberi vonatkozásban alkalmazható módszerhez vezető - vizsgálatokhoz. 1., Első sorban azok a vizsgálatok jönnek itt szóba, ahol az embriók direkt vizsgálata szükséges a mért anyag forrásának bizonyítására így fehérje, peptid, és DNS meghatározások(8). 2., Másrészt az implantáció előtt álló embrió és a deciduálisan átalakult méhbelhártya külön –külön és együttesen történő inkubálásával történő embrió-endometrium párbeszédre szolgáltathat adatokat.(3,5,6,7,12). 3., Az embrió biopszia mintájára nyert állati blasztomérek direkt vizsgálati lehetőségét ugyancsak az állatmodell teheti lehetővé.(8) 4., Olyan anyagok alkalmazása az embriók tenyésztésénél, melyek károsíthatják,vagy gátolják az embriók fejlődését ( PIF ellenanyag, habituális vetélők széruma), ugyancsak állati embriók tenyésztését igényli (9,13,14). 5.,Végül terveink szerint olyan állat embrióinak vizsgálata, amelyek obligát diapauzát mutatnak és ezzel olyan lehetőséget kínálnak, mely embernél mai feltételezések szerint nem létezik, ugyanakkor vizsgálati lehetőséget nyújt a „két féle -„,az implantáció képességével rendelkező és azt hiányoló – blasztula stádiumú embrió vizsgálatára. Ezeknél a specieszeknél - az embrió hónapokig nő és fejlődik, anélkül hogy implantálódna a méhben, nem megtapadt, lebegő állapotban van és kiöblíthető (14) 8
- ezt követően megtörténik az implantáció. A diapauza jelensége felkínál ezzel egy olyan lehetőséget, ahol az embriók 2 fejlődési stádiuma között egyetlen lényegi különbség van, nevezetesen az implantációs potenciál hiányának, vagy meglétének külön-külön vizsgálhatósága egy fajon belül. Az eddigi vizsgálatok alapján eddig tisztázatlan módon a jelzés európai őznél az embrióból jön (10,11). Az in vitro fertilizáció kezdeteitől az egéren végzett modellezés a leginkább elfogadott módszer (1,2). A humán embrió tenyésztés minőségi kontrolljának elfogadott módja, miután a két speciesnél állnak legközelebb egymáshoz az igényelt laboratóriumi körülmények. A hozzáférhető kísérleti állatok között a legolcsóbb. A humán kezeléseknél alkalmazott ovuláció indukciós kezelés alap gyógyszerek szükségesek az egér ösztrus és ovuláció kiváltáshoz is. A nagyszámú embrió nyerhető rövid idő alatt a célzott vizsgálatokhoz. Az embriók nagyobb száma lehetővé teszi ugyanazon tápoldat mennyiségben az egyes és csoportos tenyésztést is. Állatkísérletek módszertana: 1. A 8-12 hetes nőstény egereket ösztruszba hozzuk Follikulus Stimuláló Hormon (FSH) készítménnyel, majd Lutenizáló Hormonnal (LH). A második injekció megadását követően azonnal a 8-12 hónapos hím mellé helyezzük a nőstényeket. Másnap reggel a párosodás tényét a hüvelyi dugó jelenlétével, vagy hiányával vizsgáljuk. Dugó jelenléte esetén a vizsgálandó egereket a következő napon, 48 órával az LH injekciót követően collum elongátio módszerrel megöljük, és eltávolítjuk mindkét petevezetőt, petefészket, és a két uterus szarv rövid szakaszát. A petevezetők ampulláris szájadékát kanüláljuk stereo mikroszkóp alatt, és az így kiöblített embriókat összegyűjtve fejlettségi stádium és alaki jellemzők (blasztomér aequalitás, rögösödés, degenerációs jelek) osztályozzuk, majd indító tápoldatba helyezve 5% CO2 és levegő keverék termosztátban inkubáljuk. A tenyésztés ezen szakaszában a humán tevékenységnél bevált módon csepp kultúrát alkalmazunk. A tenyésztés G1 tápoldatban 37 C fokon történt 24 órán keresztül, ekkor ellenőrizzük első ízben. Ismételt osztályozás és számolás. Ezt követően G2 tápoldatba helyezzük az embriókat, és tovább tenyésztjük, majd 24 h-ként ellenőrzés és tápoldat csere történik. A tenyésztés eredményeit rögzítjük., majd értékeljük. A lecserélt médiumokat fagyasztva tároljuk a további vizsgálatokhoz. A szolgáltatandó vizsgálati anyagokat mindig a későbbiekben alkalmazandó módszerek igényei szerint jelöljük, tároljuk és szállítjuk. Itt jegyezzük meg, hogy a kísérleti állatok nevelése, táplálása a kísérleti állatokkal történő szabályoknak megfelelően történik a kísérletek végzésének helyén, a PTE Mikrobiológiai Intézetében. 2. A projekt altevékenységének célja egyes mikotoxinok (T-2, fumonizin B1 FB1) hatásának vizsgálata baknyulak (modell állat) reprodukciós folyamataira, hosszantartó, alacsony dózisú toxin expozíció során. A hím ivarsejtre kifejtett direkt hatás vizsgálatánál a mikotoxinnal különböző koncentrációban kiegészített tápfolyadékban végezzük a spermiumok in vitro tenyésztését (2-5 nap). A toxinnak a spermiumokra kifejtett hatásait és annak következményeit morfológiai, motilitás és vitalitás vizsgálatokkal ellenőrizzük, illetve határozzuk meg.
9
A közvetett hatást toxinexpozíciónak kitett hím állatokban vizsgáljuk az ejakulátum minőségét meghatározó spermatológiai paraméterek, az ondóplazma egyes összetevőinek, az alap, valamint a GnRH indukált tesztoszteron termelés és a spermiumok termékenyítőképességének meghatározása alapján. Új módszerként tervezzük bevezetni a mikotoxinok DNS károsító hatásának spermiumokban, comet assay-vel történő kimutatását. 1. Feladat: In vitro vizsgálatok Az in vitro vizsgálatok során azt kívánjuk tanulmányozni, hogy a mikotoxinok hogyan befolyásolják a spermiumok vitalitását/túlélését in vitro körülmények között. A spermiumokat toxinnal különböző mértékben kiegészített (szennyezett) tápfolyadékban tenyésztjük. A tenyésztő médium toxintartalmának megfelelően több csoportot alakítunk ki. A többnapos tenyésztés alatt folyamatosan ellenőrizzük a spermiumok vitalitását, illetve túlélését a tápfolyadékokban. Meghatározásra kerülő spermatológiai paraméterek: komplex spermatológiai vizsgálatok (spermiumszám, spermiumok morfológiájának és az akroszómának az ellenőrzése, élő/elhalt sejtek arányának megállapítása, membrán funkciós teszt, DNS állapotának vizsgálata, számítógépes spermium motilitás analízis (CASA). A toxinok hatására a sejtben/spermiumokban bekövetkező változások kimutatása céljából a mitokondriumok (a sejt energia státuszát mutatja) és a reaktív oxigén gyökök (ROS) eloszlását is tanulmányozni kívánjuk speciális immunfluorescens festést követően. 2. Feladat: In vivo vizsgálatok Azonos genotípusú (nem beltenyésztett), életkorú és közel azonos testsúlyú baknyulak takarmányát eltérő koncentrációjú T-2 és FB1 mikotoxinnal egészítjük ki. A toxinbevitel időtartama >65 nap, így a spermiogenezis 6 ciklusában lehetőség nyílik az eltérő fejlődési stádiumban lévő sejtek mindegyikének vizsgálatára. Az egyes vizsgálati időpontokban 4-8 ejakulátum/nap vizsgálatára kerül sor. Meghatározásra kerülő paraméterek: komplex spermatológiai vizsgálatok (spermiumszám, spermiumok morfológiájának és az akroszómának ellenőrzése, élő/elhalt sejtek arányának megállapítása, membrán funkciós teszt, DNS állapotának vizsgálata, számítógépes sperma motilitás analízis (CASA); a járulékos hím nemi mirigyek által termelt szeminális plazma vizsgálata. A here hormon termelésének változását GnRH teszttel (alap és GnRH indukált tesztoszteron koncentráció mérése) ellenőrizzük. A kísérlet végén az állatok boncolását követően sor kerül a here és a mellékhere kórszövettani vizsgálatára. 3. Feladat: Fertilitás vizsgálatok Toxinnal kezelt állatokból vett ondóval, indukált szuperovulációt követően, mesterségesen termékenyítünk nőstény nyulakat. Az inszeminálást követő 26-28. órában a petevezető kimosását követően a nem termékenyült petesejtek elkülöníthetőek a 2-4 sejtes stádiumú zigótáktól (vagy 48 óra múlva, ≥16 sejtes blastocysta). Ugyancsak toxinnal kezelt állatokból vett ondóval termékenyített nyulakban végig kísérjük a vemhességet, és vizsgáljuk a megszületett kisnyulak számát, súlyát, életképességét. 10
4. Feladat: A comet assay-nek spermiumokra történő adaptálása A DNS károsodásának közetlen becslésére alkalmas gyors módszert, a comet assay-t (single cell gel electrophoresis, SCGE) (Singh et al., 1988) elterjedten alkalmazzák a táplálékban lévő anyagoknak a szervezetben a DNS stabilitására gyakorolt hatásának vizsgálatára (Hoelzl és mtsai, 2009). A teszt alkalmas humán spermiumok DNS károsodásának monitorozására (pl. asszisztált reprodukciós beavatkozások során). Laboratóriumunkban toxin epozíciónak kitett, vagy egészséges sertésekből izolált limfocitákon vizsgáljuk egyes mikotoxinok DNS károsító hatását. A projekt keretében sor kerülne a módszernek állati (elsőként nyúl) spermiumokra történő adaptálására.
Humán vizsgálat módszertana: Az in vitro fertilizációra vonatkozó kötelező vizsgálatok elvégzése után szuperovulációs kezelést indítunk (cervikális kenetvizsgálat, szérum hormon vizsgálatok (follikulus stimuláló hormon, luteinizáló hormon /FSH, LH/, prolaktin, ösztradiol, progeszteron, tesztoszteron, thyroidea-stimuláló hormon) a spontán ciklus 3-5. és 21. napján, human immun-deficiencia vírus and hepatitis-B felületi antigén szűrés, andrológiai vizsgálat, illetve a méhűr alkalmasságát igazoló hiszteroszkópos vizsgálat). A szuperovulációs kezelés szupressziós részét a GnRh agonista triptorelin (Decapeptyl; Ferring) adásával végezzük „rövid” (a menzesz első napjától), illetve hosszú (a stimulációt elötti menzesz 21. napjától) protokoll alkalmazásával. A stimuláció a betegre egyénileg szabott dózisú rekombináns FSH, adással történik, a dózis 100 és 225 egység napi adása között mozog a tüszőéréstől függően. A kezdő adagot a Body Mass Index (BMI) és a kor határozza meg. Azon betegeknél, akik korábban kedvezőtlenül reagáltak a stimulációs kezelésre, a napi dózist maximum 300–350 egységgel kezdjük, és szükség esetén LH tartalmú készítménnyel egészítjük ki. A tüszőérést a menstruációs ciklus 6. napjától másnaponta ultrahang vizsgálattal ellenőrizzük. A tüszők méretétől függően az alkalmazott gonodotropin mennyiségét egyénileg változtatjuk. Amennyiben legalább két tüsző mérete eléri a 17 mm-t 250 µg hCG (Ovitrelle; Serono) adásával ovuláció indukciót végezünk. A hCG adás után 36 órával rutin intravénás narkózisban ultrahang vezérelt transzvaginális follikulus punkciót végezünk, az embrió(k) beültetése 3-5 nappal a follikulus punkció után történik. A fertilizáció típusa az andrológiai státusztól, az anyai életkortól, a korábbi IVF ciklusok számától függ. Az Intracytoplazmatikus spermium injekcióra (ICSI) kiválasztott petesejtek denudációja hyaluronidáz segítségével történik. A metafázis II érettségű petesejtek (poláris test jelenléte) ICSI fertilizációja 3-6 órával a petesejt nyerés után történik.G-MOPS TM (Vitrolife, Göteborg, Sweden) tápoldatban. A többi petesejtet a konvencionális IVF módszerrel termékenyítjük meg egy bikarbonát puffer tápoldatban (G-IVF TM, Vitrolife, Göteborg, Sweden). Az embrió a fertilizáció után 24 óra múlva G-1TMv5 (Vitrolife, Göteborg, Sweden) a tápoldatba kerül. A 3. naptól a blasztociszta stádiumig az embrió G-2TMv5 (Vitrolife, Göteborg, Sweden) tápoldatban fejlődik. A beteg kérésének és a jogi szabályozásnak megfelelően egy, két, esetleg három embrió beültetését végezzük el, a számfeletti embrió(ka)t pedig lefagyasztjuk. A beavatkozás sikerét 2 héttel a beültetés után vérvétellel (se-bhCG), három után UH vizsgálattal ellenőrizzük. 11
Az in vitro fertilizációs eljárás folyamata során a tápoldatcserekor (3.nap), beültetéskor (3.vagy 5.nap), cryopreservciókor (3.vagy 5.nap) amúgy feleslegessé váló tápoldatot kesőbbi analízis céljából lefagyasztjuk. Az embrióval kapcsolatban a projektben semmilyen direkt vizsgálat nem történik, a tápoldat cseréjét az IVF eljárás igényli. A lefagyasztott mintából későbbi felolvasztás után a viabilitást a HCG, HPL, AFP, terhességi fehérjék (PAP, PP) apoptózis faktorok, illetve a projekt másik altevékenysége során proteomikai módszerekkel beazonosított anyagok meghatározásával vizsgáljuk. Proteomika: A tömegspektrometriás eljárások a legérzékenyebb és legmegbizhatóbb analitikai módszerek közé tartoznak, így komplex klinikai minták proteomikai vizsgálatára optimális megoldást nyujthatnak. A mátrix-segítette lézerdeszorpciós ionizációval ellátott repülési idő analizátoros tömegspektrometria (MALDI TOF MS) az egyik legáltalánosabban használható fehérjeanalitikai módszer. Segítségével széles tömeg és polaritás tartományban lehet vizsgálatokat végezni. A kimutatási határ rutinszerűen femtomol nagyságrendű. A készülékkel megvalósítható tandem tömegspektrometria (TOF/TOF) is, melynek során az ionforrásból kilépő részecskéket két módon fragmentálhatjuk: közvetlenül az ionforrás után (PSD) vagy argongáz segítségével egy erre a célra kialakított ütközési cellában (CID, ETD). Így meghatározható a peptidek pontos elsődleges szerkezete és annak módosulása valamint megismerhetővé válik eddig még nem ismert peptidek és proteinek szekvenciája (De Novo Sequencing). A MALDI TOF tömegspektrometria mellett gyakran használt módszer az elektrospray ionforrással ellátott ioncsapdás tömegspektrometria (ESI IT MS) és az ESIkvadrupól-repülési idő analizátoros (ESI-QTOF MS). Ezek a módszerek kíválóan kiegészítik egymást. Napjainkban a pontos tömeg meghatározás és mennyiségi vizsgálat egyidejű elvégzése érdekében a QTOF MS alklamazása egyre jobban előtérbe kerül (3, 4). Napjaink egyik legígéretesebb peptid és protein biomarker diagnosztikai alkalmazása a MALDI TOF/TOF tömegspektrometriára épülő képalkotó módszer (MALDI Imaging), melynek során egy speciális mintatartóra 10-20 mikronos szövettani metszetet és mátixot szárítunk. Ezt követően a mintáról előre meghatározott szisztémában és lézerintenzitással több ezer tömegspektrumot vesszünk fel, amelyeket a megfelelő szoftver az egyes m/z értékekhez tartozó intenzitások eloszlását képként jeleníti meg (4-12). A módszer óriási előnye, hogy párhuzamosan alkalmazható az egyéb (in vivo fluoreszcens, mágneses magrezonancia spektroszkópia, konfokális mikroszkópia stb.) képalkotási módszerekkel, így olyan új tudományos és diagnosztikai eredményeket szolgáltathat, amelyek forradalmasítják a klinikai diagnosztika mai módszertanát. Ezen módszerrel mind a humán embriót körülvevő tápoldatot, mind az egér és a nyúl fertilitási kísérletekből származó petesejtek és embriók vizsgálatát in-vivo, ex-vivo és in-vitro elvégezzük.
DNS izolálás: Plazma és vérminta előkészítése. (ref.: Fiona et al.: Microfluidics Digital PCR Reveals a Higher than Expected Fraction of Fetal DNA in Maternal Plasma; Clinical Chemistry 54:10 2008.) A protokoll érzékenységének meghatározásához egészséges, Y-kromoszómát hordozó férfi perifériás vérmintájából izolált DNS-t használunk; izolálás: QIAampl DNA 12
Blood Mini Kit (Qiagen) felhasználásával. Fiú magzatot hordó anyai plazmából történő DNS izoláláshoz QIAamp DSP Virus Kit-et használunk. (ref: Ilona Hromadnikova et al.: The efefct of DYS-14 copy number variatons on extracellular fetal DNA quantification in maternal circulation; DNA and Cell Biology, 2009.) Valós idejű PCR analízis: Az SRY, DYS-14 és β-globin gének genetikai analíziséhez TaqMan alapú, valósidejű PCR módszert használunk. A módszer előnye a hagyományos PCR reakcióval összehasonlítva, hogy nyomon követhető a PCR vizsgálat időbeli lefutása, lehetővé teszi a reakciótermék gyors minőségi és mennyiségi meghatározását és a rendszer felépítéséből adódóan csökkenti a kontamináció lehetőségét. (ref.: Ilona Hromadnikova et al.: The efefct of DYS-14 copy number variatons on extracellular fetal DNA quantification in maternal circulation; DNA and Cell Biology, 2009. Barbara Pertl et al.: Detection of male and female fetal DNA in maternal plasma by multiplex fluorescent polymerase chain reaction amplification of short tandem repeats. Hum Genet; 2000. Hiroshi Honda et al.: Successful Diagnosis of Fetal Gender Using Conventional PCR Analysis of Maternal Serum. Clinical Chemistry 2001. YM Dennis et al.: Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. The Lancet. Bernhard Zimmermann et al.: Optimized Real-Time Quantitative PCR Measurement of Male Fetal DNA in Maternal Plasma. Clinical Chemistry 2005. Elles M. J. Boon1 et al.: Y chromosome detection by Real Time PCR and pyrophosphorolysis-activated polymerisation using free fetal DNA isolated from maternal plasma. Prenat Diagn 2007.) Tápfolyadékból történő DNS detektálás: A feltételezhetően kis mennyiségű szabad DNS jelenléte miatt a DNS izolálást és PCR amplifikációt egy lépésben lehetővé tevő F-547X Sample Phusion blood Direct PCR Kit-et használjuk (Thermo Scientific). Az amplifikátum kimutatása géles valamint valósidejű PCR rendszerekben történik, humán β-globin gén alapján.
Immunológia: A G-CSF kimutatására ELISA módszert szándékozunk használni, a gyártó által javasolt metodika szerint. A PIF kimutatása Luminex technikával történik, a PIBF kimutatására ELISA technikát kívánunk használni. Chip fejlesztés: A korábbi tapasztalatok alapján kapilláris elektroforézis technikát kivánunk alkalmazni a biomarkerek izolálására (Vrouwe et al. 2007). Ez egy már széles körben alkalmazott, kipróbált technika. Detektorként ebben az esetben vezetőképesség mérő platinafilmet kivánunk használni. Más POCT-ben alkalmazható módszerekkel szemben ennek nagy előnye, hogy egy készülékkel többféle analit mérhető ezen kívül gyors, és minta előkészítést nem igényel.A chipen 8 m mély és 56 m széles csatornák futnak. A készülék lényegi része az ún. double-T injektor. Ide fut be a minta bevezető csatorna, a háttér elektrolit bemenet, majd egy 200 m hosszú szakasz után, mely még része a double-T injektornak, innen fut ki a hulladék 13
kimenet. A kiágazás után következik a 2 cm hosszú elválasztó csatorna, melynek végén található a detektor, azaz a vezetőképesség mérő platina elektródpár. Az izoláció két lépésből áll. (1. ábra) A mozgó határfelület lépésben a mintabemenetre 1000 V feszültséget, az elválasztó csatorna végére szintén 1000 V feszültséget és a háttér elektrolitra 800 V feszültséget kapcsolnak, a hulladék kimenethez csatlakozik a null/földvezető. Így a minta a double-T injektoron keresztül a hulladék kimenet felé halad. Majd miután elérte az injektort, megváltoztatják a feszültségviszonyokat, és a második, azaz a zóna elektroforetikus lépés következik. Az elválasztó csatorna vége lesz a föld, a háttér csatorna végére 1000 V feszültséget, a mintacsatornára és a hulladékcsatornára 600-600 V feszültséget kapcsolnak. Így érik el, hogy a double-T injektor 200 m hosszú szakaszába jutott ionok különböző sebességgel a detektor felé vándorolnak, a mintacsatornában levő ionok visszafelé haladnak, a hulladékcsatornába jutott ionok folytatják útjukat a hulladék kimenet felé. Az elválasztó csatornában az különböző ionok külön zónákban elválnak egymástól és így haladnak, ezt nevezik zóna elektroforézisnek. Ezzel a módszerrel jó felbontású elválasztás nyerhető.
1.Ábra: A biomarker izolálására használt mikroáramlási chip felépitése (1.a mintabevitel helye 2. Reservoir 3. Injektor csatorna 4. T-injektor 5. Reservoir 6.elektródok A-B: magasfestültségü injektor anód és katód C-D: nagyfeszültségü szeparációs anód és katód E: elektrodok a konduktivitás mérésére) Az izolált biomárkerek mérésére nano-drótot kivánunk alkalmazni. Ezek az érzékelők olyan nanométeres átmérőjű vezetékek, amelyek nagyon kis mennyiségű biológiai minta érzékelésére és koncentrációjának mérésére alkalmasak. Ilyenek létrehozása esetén nem alkalmazhatók a hagyományos foto litográfiai eljárások, egyszerűen azért, mert azok felbontása nem éri el a nanométeres tartományt. Az nanostruktúrák létrehozására irányuló módszereket 2 csoportba oszthatjuk. A „Top down” módszerek során a többrétegű lapkába marják bele a kívánt szerkezetet speciális módszerekkel. A „Bottom up” módszerek esetén a kívánt szerkezetet úgy növesztik, képzik a felületre kristályosítással, polimerizációval. 14
A MESA Intézetben kidolgozott top-down (200 nm-10nm) szilikon-szén (Si-C) nanodrótot ami DNS kimutatására lett kidolgozva (Masood et al, 2010) alkalmassá kivánjuk tenni fehérje biomarkerek kimutatására. Ezt követően a kialakitott nanodrótot specifikus hormonmérésre kivánjuk alkalmazni.
2.Ábra: top-down (200 nm-10nm) szilikon-szén (Si-C) nanodrótot (Masood et al., 2010) a. bottom-up b. top-down rectangular c. bottom up trapezoid d. top-down triangular nanodrot e-g:.a triangularis szilikon-szén nanodrót különböző képei: e. scanning elektronmikroszkópos(HRSEM) képe- a viszintes vonal 1µm f. AFM (atomic force mycroscop) kép g. transzmissziós elektronmikroszkópos képe – a viszintes vonal 20 nm)
4. A tervezett tevékenységek, azok ütemezésének, egymáshoz és más projektelemekhez való kapcsolódásainak részletes bemutatása. A munka effektív menetében sorrendben a következő lépéseket kell uralnunk, egymásra lépcsőzve a részeredményeket. -A különböző csoportok tenyésztő folyadékaiban vizsgáljuk majd azokat a korábban már leírt markereket, melyek részben a Mikrobiológiai intézetben (immunológiai vizsgálatok PIF, LIF, GCSF), részben a Biokémiai és a Laboratóriumi Medicina Intézeteiben történnek. -A fenti körülmények között a tápoldathoz hormonálisan álterhes állapotba hozott egér endometrium, valamint a valódi gravid decidua hozzáadásával ugyanazok a vizsgálatok történhetnek meg, mii a pusztán embriót tartalmazó méduiumokból is megtörténnek. Ezek a vizsgálatok az emriók és endometrim „párbeszéd”-re szeretnének adatokat nyerni. -A 2 fenti vizsgálat sorozat elvégzése az embrióosztódást egyértelműen gátló habituális vetélő, infertilis nők szérumának a tápoldathoz történő hozzáadásával. Ezek a vizsgálatok azt célt szolgálják, hogy egyrészt a vizsgálat, mely emberi embrióval nem végezhető megtörténhessen, másrészt a feltételezetten gátló, vagy serkentő ágensek hatása bizonyítható és titrálható legyen, mely elengedhetetlen előfeltétele a későbbiekben esetleg emberi viszonylatban is alkalmazható készítmény (-ek) elő vizsgálatainak. - Az embriókból önálló sejt kinyerését tervezzük abból a célból, hogy a projektben részt vevő társ intézmények vizsgálataira átadhassuk. 15
Az állatkísérletes vizsgálatok lehetővé teszik. egy további munkamódszer, alkalmazását, nevezetesen az embriót alkotó blasztomérek direkt vizsgálatát. Ezzel a tevékenységgel nincs még gyakorlatunk. Ugyanakkor a pályázatban részt vevő szülészeti és nőgyógyászati klinikán komoly mikro manipulációs gyakorlattal rendelkező humán és tárgyi erőforrás áll rendelkezésre. Ez kollaboráció formájában kivitelezhető. Az eljárás bevezetése, nevezetesen az állati embriók biopsziáját mindenképpen be kell állítanunk, mert nem csak a fő projektben részletezett miniatürizálás, chip, és nano technika igényét elégíti ki. Az itt kialakult technikai tudás a későbbekben emberi iszonyok között is hasznosul, hiszen az embrió biopszia módszere teszi lehetővé a genetikai okok miatt elvégzett terhesség megszakítások számának csökkentését. Elérendő célunk, hogy a korábbiakban részletesen leírtak mentén folyamatosan tudjuk biztosítani a vizsgálati mintákat (tápoldat, vizelet, szérum, plazma, telje embrió, blasztomér). Ezek a vizsgálati anyagok szükségesek a humán eredetű anyagok mellett (tápoldat, szérum, plazma, vizelet) a tervezet más résztvevőinek munkájához, különösen az immunológia, proteomika, chip technika és DNS vizsgálatok vonatkozásában. A proteomikai részfeladat során, a projekt első szakaszában elvégezzük a módszerek optimalizálását és elkezdjük az állatmodell kísérletekből származó minták vizsgálatait. Ebben a szakaszban elsősorban MALDI TOF MS technikával feltérképezzük a minták fehérje összetételét. Ezzel párhuzamosan elvégezzük a MALDI-val azonosított proteinek és peptidek ESI-QTOF MS mennyiségi vizsgálatait. A második szakaszban elkezdjük a humán préimplantációs tápoldatból történő célzott minőségi és mennyiségi ESI-QTOF tömegspektrometriás elemzéseket. Ebben a fázisban a nemzetközi együttmüködő partnereinkkel (University of Sussex, The George Washington University) karöltve elindítjuk a képalkotási tömegspektrometriás vizsgálatainkat. Immunológiai módszerek beállítása: Nem tudható, hogy a vizsgálni kívánt molekulák milyen koncentrációban fordulnak elő az embrió tenyésztőfolyadékában, ezért az első néhány hónapot arra szánjuk, hogy mérés körülményeit standardizáljuk. A tenyésztés egymást követő napjaiból származó minták vizsgálata során meghatározzuk az optimális mintavételi időpontot. A továbbiakban nagyszámú mintában mérjük az említett molekulák koncentrációját. A kapott eredményeket nem csupán a bekövetkező terhességek, hanem a projekt más elemeiben nyert adatok vonatkozásában értékeljük. Valószínűtlen, hogy egyetlen paraméter önmagában alkalmas lenne a beágyazódásra leginkább alkalmas petesejt jellemzésére. A projekt fő értéke, hogy számos, eltérő paraméter vizsgálatát tűzi ki célul, így várható, hogy a több oldalról történő megközelítés olyan ismereteket eredményez, amelyek lehetővé teszik a jó és a beteg embrió elkülönítését, Szabad DNS izolálás anyai vérplazmából (módszer optimalizálása): A szabad DNS forrása nem beteg és nem terhes egyénekben nagy valószínűséggel a keringő lymphocyták és más magvas vérsejtek. Ehhez adódik, terhesség esetén, az anyai vérben fellelhető szabad magzati DNS, amely feltételezhetően 3 forrásból ered, mint 1. magzati haematopoetikus eredet; 2. lepényi eredet 3. direkt magzati transzplacentáris DNS-transzfer. Az izolálási eljárás során az anyai vérplazmában levő totál szabad DNS-t nyerjük ki. Az izoláláshoz QIAamp DSP Vírus Kit-et használunk, amelynek vizsgálati protokollját, az eljárás hatékonyságának fokozásához a minta típusának megfelelően módosítunk és optimalizálunk (inkubációs idők hossza-hőfoka stb…) 16
Anyai vérben keringő szabad magzati DNS meghatározása Y kromoszóma specifikus génszakaszok alapján: A módszer érzékenységének meghatározása egészséges, Y-kromoszómát hordozó egyén DNS mintája alapján, SRY és DYS-14 gének detektálásával. Az anyai vérplazmából izolált totál szabad DNS-ből a magzati DNS elkülönítésére fiú magzatot hordó anyák esetén van lehetőség. Magzati DNS detektálására az Y-kromoszóma specifikus SRY és DYS-14 gén specifikus primereket és fluoreszcens próbákat használunk, valós idejű PCR rendszerben. A minta „épségének”és a PCR analízis hatékonyságának ellenőrzésére a humán β-globint használjuk referencia génként. Anyai vérben keringő totál és magzati szabad DNS kvantifikálás (módszer optimalizálása). A kvantitatív analízishez ismert koncentrációjú SRY, DYS-14, valamint humán β-globin standardsorokat veszünk fel. Az eredményeket genomi ekvivalenciában határozzuk meg. Magzati szabad DNS izolálás és detektálás tápoldatból (optimalizálás). Hat sejtes, beültetésre váró, embrió tápközegéből történő szabad DNS izolálási protokoll optimalizálása, valamint a DNS izolátum detektálása és kvantifikálása. A minta jellegéből adódóan várhatóan a rendkívül kis mennyiségű szabad DNS miatt direkt DNS izoláló/PCR amplifikációs rendszert használunk (F-547X Sample Phusion blood Direct PCR Kit, Thermo Scientific) Az amplifikátum további vizsgálata valós idejű PCR rendszerben, TaqMan alapú analízissel a humán β-globin alapján történik. A mikroáramlási chip kidolgozását meg kívánjuk kezdeni modell kísérletekkel 2013 januárjában hogy az izolálási lépés kész legyen amire előzőkben kifejtett részprojektek eredményei alapján kiderül hogy mely biomarkerek mérése lesz szükséges. Már ez a fázis is intenzív együtműködést kíván a hollandia Twentei Egyetem Nanotechnologiai Intézetével (MESA Institute for Nenotechnology). Ezzel párhuzamosan meg kívánjuk kezdeni a nano-drót funkcionalizálására a kísérleteket. A rendszert alkalmassá kell tenni fehérjék kvantitatív meghatározására. 2014-ben meg kívánjuk kezdeni a szükséges antiszérumok és egyéb reagenciák tesztelését. Terveink szerint 2014 végére végre kívánjuk hajtani az első „proof of principe” kísérleteket a biomarkerek lab-on-a-chip detektálására. Időbeni ütemezés: A projekt mind időben, mind az egyes tevékenységek megvalósításában szorosan egymásra épül. A megvalósítás előfeltétele, hogy az embriológiai tápoldaton teljes körű (proteomikai, genetikai, immunológiai) vizsgálatokat végezzünk, ezek értékelésének pedig előfeltétele az állatkísérletes modellek beállítása. Az életképesség vizsgálata elengedhetetlen az eredmények értékelésénél, a chip fejlesztés pedig a gyakorlati alkalmazás miatt szükséges. A projekt első negyedévében, ahhoz, hogy a humán vizsgálatokat elkezdhessük cél egyrészt az állatkísérletes modell elindítása, a módszer rutin beállítása (1.1., 1.2.). Ezzel párhuzamosan elkezdjük a humán tápoldat gyűjtését (2.1.), egyelőre fagyasztva tárolását, valamint a nukleinsav analízishez szükséges módszer beállítását (4.1.). Az állatkísérletből nyert minták és adatok alapján ezt követően (2013. I. negyedév) megkezdjük az egér embriók tenyésztését (1.3.), a nyúl embriók in vitro vizsgálatát, a humán mintákból (2.2.) biokémiai analízist, az állat mintákból (3.1.) proteomikai vizsgálatot végzünk. 17
A fagyasztott humán tápoldat mintákból, a beállított módszerek segítségével megkezdjük (4.2.) a DNS izolálás, majd 2013. III. negyedévétől a DNS analízis. Eközben természetesen az izolálás folyamatosan zajlik. 2013. februárjától ugyancsak indulhat a nyert mintákból az immunológiai analízis (5.1., 5.2., 5.3.), melynek módszerbeállítása már megtörtént. Ezek egymásra is ható markerek, ezért vizsgálatuk szétválasztása nem lehetséges. 2013. III.negyedévében a 3.3. altevékenység során már tudunk statisztikai összefüggéseket vizsgálni (terhességek, szülések is történnek eddigre az indulás ideje után), ami a többi vizsgálathoz iránymutató lehet, hiszen láthatóak lesznek a pozitív és negatív korrelációk az egyes biomarkerek, és az asszisztált reprodukció kimenetele között. Ebben az időszakban indítjuk el a nyúlembriók in vivo vizsgálatát, majd a fertilitás vizsgálatukat is. A fenti vizsgálatokból 2013. novemberére várhatók olyan eredmények, melyek segítségével a chip fejlesztés megindulhat. Ennek első lépése a reagens vizsgálata (6.1.), majd 2014. januártól a chip fejlesztése (6.2.). 2014 I. negyedévében történik a nyúlmodell segítségével a DNS károsodásra vonatkozó gyorsteszt ( comet assay) adaptálása. 2014 I. negyedévében megkezdjük a fehérjék detektálását a humán mintákból (3.2.), a II. negyedévben pedig azok mennyiségi meghatározását is (3.3.). Ebben az évben már csak a nyúl és a humán vizsgálatok zajlanak, ezek eredményei egymást is befolyásolhatják, így egy időben történő vizsgálat javasolt a projekt befejezéséig.
Gantt 5. A kutatás várható eredményeinek, szakmai tartalmának és megvalósulási formáinak részletes bemutatása (indikátorok kibontása). - Az egereknél el kell érnünk a szuperovulációt megfelelő hormonkezeléssel, kiválasztva a legmegfelelőbb készítményt, megfelelően az évszaknak. Ezzel tudjuk biztosítani a megfelelő számú tenyészthető egér embriót a további vizsgálatokhoz. és in vitro tenyésztéséhez. El kell érni, hogy a kísérletenkénti visszanyert egér embriók száma a természetes szaporulati embrió számot lényegesen meghaladja, ami kb 15-20/szuperovulált egér mennyiséget jelent (1. indikátorunk). - Co2 termosztát, vagy előre gyártott gázkeverékkel (5%CO2-5%O2-90%N) átáramoltatott embrió inkubátor beállítása, mely folyamatosan biztosítja a közel 100%-os relatív páratartalmat 37C fokon. Beállítva a humán tevékenységnél megkövetelt minőségű tenyésztő edényeket és tápoldatokat. Ezek megbízható beüzemelésével érhető el, hogy az embriók 80 90%-ban tovább osztódjanak. Ezeket a tenyésztéseket addig végezzük, amíg a továbbfejlődő embriók aránya egy aránylag stabil százalékos arányra áll be, melyre azt mondhatjuk, hogy 18
laboratóriumunk körülményei között ez jellemző (2. indikátor). A későbbiekben bármely célzottan létrehozott változás (gátló, vagy serkentő ágens hatása csak ezt követően vizsgálható. - A kísérleti állatok méhszarvainak eltávolítása és dissectioja segítségével nyert méh belhártya inkubálása, majd az inkubációs oldat, valamint magának a szövetmintának a vizsgálata a következő időrendi lépésünk. A méh belhártya minta egyrészt álterhes, másrészt gravid alanyokból származik. Előbbieket hormonálisan előkészített, de párosodásból kihagyott egerekből nyerjük a sárgatest fázis azonos szakában, mikroszkópos vizsgálattal bizonyítva az ovuláció megtörténtét. Az így nyert szövet és tápoldat mintákat a társ projekt intézmény igényei szerint kezelve tároljuk, majd adjuk át. Indikátornak az endometrium 2-3 napos „életben teartását” tekintjük. - 2-8 sejt stádiumban lévő egér embriók mechanikus” hatchig”-je után kinyert blasztomérek külön vizsgálhatók. Ezt a tevékenységet a tenyésztő tápoldatban, mikro manipulációs technikával, társintézettel történő közvetlen együttműködésben tervezzük. Az eredményesség mutatójának azt tekintjük, ha a visszamaradt embriók, melyekből blasztomért távolítottunk el tovább osztódik. Tapasztalatunk még nincs az eljárásban A tenyésztés eredményeinek rögzítésére szolgáló táblázat
Soro Dátu Eg. Embr. zat m Törzs No
Zygota
össze s
24 óra múlva, 1. ellenőr zés
1
2 sejtes >2 sejt
. 48 h múlva a másodi k ellenőr őrzéskor zéskor
3-4 5-8 8-12 sejt sejt sejt
mo 16 mor rul sejt ula a blastula
72 óra múlva, 3. ellenőrz éskor
febr. BALB 07 C eg.1 eg.2 másik eg.1 eg.2
19
A proteomikai részfeladat által szolgáltatott eredmények alapján leírhatjuk a megtermékenyített petesejt beágyazódásának és viabilitásának főbb molekuláris paramétereit. Ezeknek a proteineknek és peptideknek alapvető fontoságuk lehet az embriogenezis különböző szakaszaiban, így ismeretük nagyban hozzájárulhat a sikeres embrió beültetések számának növeléséhez. A tömegspektrometriás képalkotási módszerek alkalmazásával az azonosított proteinek és peptidek pontos lokalizációja is meghatározható, így az embrionális fejlődés molekuláris változásai pontosabban leírhatók lesznek. A nemzetközi kooperációs partenerekkel együttmüködve kifejlesztett in-vivo képalkotási tömegspektrometriás technikákat szabadalmaztatni kívánjuk. A projekt proteomikai eredményeire támaszkodva minimálisan 3 szakdolgozat, 2 PhD, 5 konferencia előadás vagy poszter illetve 3 nemzetközi referált közlemény tervezünk. Humán chorio-gonadotropin (hCG) szerepe a terhességben Az intakt humán chorio-gonadotropin (hCG) 244 aminosavból álló dimer protein. A hCG a placentában képződik a terhesség alatt. Nem terhes nők esetében a trofoblaszt eredetű, vagy trofoblaszt komponenseket tartalmazó csírasejtes tumorok, illetve egyes nem trofoblaszt eredetű tumorok termelhetik. Az emberi chorio-gonadotropin (hCG) az LH-hoz, FSH-hoz és TSH-hoz hasonlóan a glikoproteinek családjába tartozik és két alegységből áll (α- és β-lánc), melyek a teljes hormonban egymáshoz kapcsolódnak. Az α-láncok mind a négy fenti glikoprotein hormonban látszólag azonosak, míg a β-láncok struktúrája erősen különböző, és ezek a láncok felelősek a különböző specifikus hormonális funkciókért. A hCG biológiai funkciója, hogy a sárgatest fennmaradását biztosítsa a terhesség ideje alatt. Hatással van a szteroid hormonok termelődésére is. Ismert, hogy a vérszérumban a dimer molekulák mellett a hCG szabad β-alegysége és a hCG "csonka" formái, a β-core fragmentum is kis mennyiségben kimutatható. Ugyanakkor a terhes nők széruma elsősorban a teljes hCG molekulát tartalmazza. A hCG mérés klinikai jelentősége Általánosan elterjedt vizsgálati módszer a hCG összes formájának együttes meghatározása, ez az un. HCG+β(vagy másképpen totál β-hCG) vizsgálat. Elsősorban a terhesség korai felismerésére és monitorozására használjuk. A fogamzás után 10-12 nap múlva a terhesség a méréssel gyakorlatilag 100%-ban kimutatható. Más paraméterekkel együtt a teszt segítségével a 21-es triszómia (Down-szindróma) kockázata becsülhető. A kromoszóma rendellenesség diagnosztizálásához további vizsgálatok is szükségesek, így a hCG+β mérésén kívül az AFP és más paraméterek (pl. a terhesség pontos ideje, az anya testsúlya) ismerete is fontos. A terhesség második trimeszterében fel lehet mérni a 21-es triszómia (Down-szindróma) kockázatát. 21-es triszómiás terhességek esetén az anya szérumában az AFP koncentrációja lecsökken, miközben a hCG+β koncentrációja körülbelül a normál középérték kétszeresére nő. A hCG+β mérése hasznos még a magzat intrauterin elhalásának gyanújakor, illetve méhen kívüli terhesség esetében is. A mérés analitikai teljesítőképessége A Laboratóriumi Medicina Intézetben a HCG+β vizsgálatot immunkémiai módszerrel végezzük. Lehetőség van radioaktív és kemilumineszcenciás kimutatásra is. A vizsgálati minta
20
lehet vérszérum, magzatvíz és más testfolyadék. A módszer mérési tartománya 0,1-10000 mIU/ml. Az inter-assay precizitás a koncentrációtól függően 2-5% között mozog.
A nemzetközi irodalom áttekintése után is, legjobb tudomásunk szerint, az aszisztált reprodukciós módszerek point-of-care diagnosztikájára, és hatékonyságának prognosztizálására nem áll rendelkezésre módszer. Ezért amennyiben sikerül lab-on-a-chip módszert kidolgoznunk biomerkerek detektálására, egy ilyen módszer szabadalmaztatása lehetséges. Az eredményektől függően megfontolás tárgyát képezheti, hogy a módszer szabadalmaztatási folyamatát elkezdjük, mielőtt az módszerrel nyert eredményeket szakfolyóiratokban publikálnánk.
6. A kutatási infrastruktúra és a személyi állomány rendelkezésre állása, az esetleges fejlesztések szükségessége, a projekt támogatásának hasznosulása.
A tervezett állatkísérletes vizsgálatok helye a PTE Mikrobiológiai Intézete. Az intézet régi hagyományokkal rendelkezik mind a rutin, mind a kísérletes állatkísérletek terén. Az intézet vezetője komoly, nemzetközileg is elismert immunológiai eredményekkel rendelkezik (17,18), és vezeti a pályázat másik rész projektjét képező immunológiai vizsgálatait is. A két rész terület egy helyen történő futtatása lehetővé teszi a napi, közvetlen kapcsolatot, ami a tapasztalatok szerint növeli a hatásfokot. Az intézet rendelkezik az állatkísérletes vizsgálatokhoz szükséges kísérleti egerek megfelelő elhelyezéséhez és gondozásához mind a tárgyi, mind a személyi feltételekkel. A kísérleti állatokkal kapcsolatban álló minden munkatársat az együtt érző,” csak a feltétlenül szükséges ártalmat okozni” elv jellemez. Az állatkísérletes tevékenység fő vonulatát képező szuperovulációs kezelések, az embrió kinyerés, valamint az egér embriók tenyésztésében rendelkezünk régi tapasztalatokkal (4,5) A munkában részt vevő PhD hallgató jelenleg külföldi tanulmányúton vesz részt, ahol PIF vizsgálatokkal kapcsolatos tapasztalatokat gyűjti. A kísérletek szak asszisztense ugyancsak régi tapasztalatokkal rendelkezik mind az egér-, mind az immunológiai vizsgálatok terén. A kísérletek kis eszköz és apparatív szempontból részben megfelelő, amennyiben alkalmas a tevékenység ütemezésében első és második lépcsőben jelzett tevékenységekhez. A későbbi, bonyolultabb vizsgálatokhoz azonban feltétlenül szükséges fejleszteni a lehetőségeket. Itt gondolunk elsősorban az egér endometrium kinyerésére és inkubálására. Ugyanez vonatkozik a blasztomérek elkülönítésére. Jelenleg adott tárgyi szükségletek és fogyóeszközök: - Hormon készítmények a kísérleti állatok oltásához - Boncoláshoz szükséges kis eszközök - A petevezetők öblítéshez, vagy disszekciójához szüksége esközök 21
- Az öblítéshez és embrió gyűjtéshez alkalmas mikroszkóp - Tenyésztéshez szükséges szövettenyésztő minőségű edények - Tápoldatok - A manipulációhoz szükséges laminal boksz - CO2 termosztát 5% CO2/körlevegő alatti tenyésztéshez Hiányzó és a bonyolultabb, ezzel értékesebb munkához feltétlenül szükséges, beszerzendő felszerelések, és azok indoklása: - Melegíthető plate A laminal boxban végzet manipulációknál a tápoldat, fecskendő, tenyésztő edény melegen tartásához szükséges, hogy elkerüljük az embriók lehűlését. - Stereo mikroszkóp (Nikon, Leitz), Az egér embriók pontos osztályozása és csoportosításához a fejlettség, még inkább a fénymikroszkópos minőségi állapotot kifejező score megállapításához. A degenerációs jelek, aneuploidiák felfedésére, a fertilizáció megtörténtének vizsgálatára szükséges eszköz. - CO2 termosztát, illetve embrió inkubátor. Az eszköz előre gyártott gázkeverékkel átáramoltatott, így az aktuális igénynek megfelelő módban használható. A proteomikai vizsgáltokhoz szükséges összes műszer és egyéb infrastruktúra a rendelkezésünkre áll a PTE ÁOK Bikémiai és Orvosi Kémiai Intézetének Analitikai Biokémia Tanszékén illetve a Science Building Proteomikai Osztályán. A viabilitási vizsgálatokhoz szükséges eszközöket a Reprodukciós Központunk laboratóriumi berendezései, szükséges plussz eszköz: embrió termosztát (eddigi módszer során az embriókat párosával tenyésztettük, az most nem kivitelezhető, mert a tápoldat úgy közös lenne, így viszont a jelenlegi kapacitás kevés), -80 Celsius kapacitású tároló hűtő. A laboratóriumi vizsgálatok a Laboratóriumi Medicina Intézetben ELISA módszerrel történnek.
Az immunlógiai részfeladaton nyolc diplomás és két asszisztens fog dolgozni. Bogdán Ágnes Ph.D. hallgató a Luminex méréseket fogja végezni. Az asszisztencia járatos a sejttenyésztési, ELISA, Western blot és állatkísérletes technikákban. A csoport tagjai tapasztalattal rendelkeznek a molekuláris és immunológiai módszertanban. A laboratórium felszerelése alkalmas a munka kivitelezésére. A témában íródott doktori (PhD) értekezések. A témához kapcsolódó tudományos diákköri munkák. A témához kapcsolódó kongresszusi előadások és poszterek. A témához kapcsolódó közlemények száma. Külföldi és hazai munkacsoportokkal és vállalatokkal való kooperáció. A terv a hollandiai Twentei Egyetem Lab-on-Chip intézetének az együttműködésével valósulhatna meg (www.utwente.nl/ewi/bios). Az együttműködés keretében lehetőségünk 22
nyílna a „MESA Institute for Nanotechnology” (www.utwente.nl/maseplus) „clean-room” laboratóriumainak használatára, ami a nanotechnológiai módszerek kidolgozására alapkövetelmény. Az infrastruktúra, amit a MESA intézet biztosítana számunkra, Magyarországon ma nem hozzáférhető és reálisan nem is megvalósítható. A MESA intézet a világ egyik legnagyobb nanotechnologiai intézete. Az intézetnek több mint 500 tudományos munkatársa van, akik közül 275 Ph.D. hallgató. A 2011-ben átadott uj épületben a nanotechnologia valamennyi laboratóriuma képviselt, több mint 1250 m2 „clean-room” kapacitással. Az intézet évi költségvetése több mint 45 millio Euro. Az intézetnek több mint 40 high-tech spin-off cége funkcionál az intézettel szorosan együtmüködve. Évente 75-100 Ph.D. disszertáció, több mint 1000 publikáció peer reviewed nemzetközi folyóiratokban valamit 5-10 szabadalom jelenik meg a MESA+ intézetből. A jelen projektben tervezett vizsgálatok csak a MESA+ intézettel történő együtmüködéssel valósulhatnak meg. Ezen együtmüködés távlatilag is igen fontos lehet a PTE tudományos munkájában, mivel lehetőséget biztositana arra hogy bekapcsolódjunk a nano-bio kutatások nemzetközi élvonalába. A kidolgozott mikroáramlási chip távlati ipari hasznositására nagy segitséget jelenthet számunkra a BIOS/MESA lab-on-a-chip tehnológiara specializált spin-off vállalkozása a Medimate BV (www.medimate.com). A Medimate vállalattal évek óta kapcsolata van a PTE Laboratóriumi Intézetének. professzor docens tudományos munkatárs tudományos s.munkatárs Phd hallgató adminsztrátor tengerentúli konferencia európai konferencia hazai konferencia szolgáltatás publikációs költség rendezvényszervezés
7. A hivatkozott irodalmak bibliográfiai adatok bemutatása. Bodis J., Varnagy A., Sulyok E., Kovács GL., Martens-Lobenhoffer J., Bode-Böger SM. Negative association of L-arginine methylation products with oocyte numbers.Human Reproduction 2010 Dec;25(12):3095-100.
23
Brubel R., Reglodi D., Jambor E., Koppan M., Varnagy A., Biro Z., Kiss P., Gaal V., Matkovits A., Farkas J., Lubics A., Bodis J., Bay C., Veszpremi B., Tamas A., Nemeth J., Mark L. Investigation of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide in human gynecological and other biological fluids by using MALDI TOF mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry 2011 Jan 24:189-194. doi: 10.1002/jms.1884. [Epub ahead of print] Varnagy A., Bodis J., Kovacs LG., Rauh M., Rascher W. Metabolic hormones in follicular fluid undergoing IVF. The Journal of Reproductive Medicine, (2011. accepted) Koppan M., Varnagy A., Reglodi D., Brubel R., Nemeth J., Tamas A., Mark L., Bodis J. Correlation between oocyte number and follicular fluid concentration of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in women after superovulation treatment. Peptides (submitted) Bedair M., Summer L.W., Current and emerging mass-spectrometry technologies for metabolomics. Trac-Trends Anal Chem, 2008, 27: 238-250 Hu C.X., van der Heijden R., Wang M., van der Greef J., Hankemeier T., Xua G.W., J., Analytical strategies in lipidomics and applications in disease biomarker discovery. Chromatogr B-Anal Technol Biomed Life Sci, 2009, 877: 2836-2846 Kumar C., Mann M., Bioinformatics analysis of mass spectrometry-based proteomics data sets, FEBS Lett, 2009, 583: 1703-1712 Mann M., Kelleher N.L., Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105: 18132-18138 Langstrom B., Andren P.E., Lindhe O., Svedberg M., Hall H., In vitro imaging techniques in neurodegenerative diseases. Mol Imaging Biol, 2007, 9: 161-175 Rohner T.C., Staab D., Stoeckli M., MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev, 2005, 126: 177-185 Trim P.J., Henson C.M., Avery J.L., McEwen A., Snel M.F., Claude E., Marshall P.S.,West A., Princivalle A.P., Clench M.R., Matrix-assisted laser desorption/ionization-ion mobility separation-mass spectrometry imaging of vinblastine in whole body tissue sections. Anal Chem, 2008, 80: 8628-8634 Wiseman J.M., Puolitaival S.M., Takáts Z., Cooks R.G., Caprioli R.M., Mass spectrometric profiling of intact biological tissue by using desorption electrospray ionization. Angew Chem Int Ed, 2005, 44: 7094-7097 Seeley E.H., Caprioli L.M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. PNAS, 2008, 105(47): 18126-18131 Chen R, Li L., Mass spectral imaging and profiling of neuropeptides at the organ and cellular domains. Anal Bioanal Chem., 2010, 397: 3185-3193 Hankin J.A., Barkley R.M., Murphy R.C.,J, Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Am Soc Mass Spectrom, 2007 18:1646–1652 24
Puolitaival S.M., Burnum K.E., Cornett D.S., Caprioli R.M., Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J Am Soc Mass Spectrom, 2008, 19: 882–886 Trimpin S., Herath T.N., Inutan E.D., Wager-Miller J., Kowalski P., Claude E., Walker J.M., Mackie K., Automated solvent-free matrix deposition for tissue imaging by mass spectrometry. Anal Chem, 2010, 82: 359–367 Barbara Pertl Akihiko Sekizawa Osamu Samura Irmgard Orescovic Peter T. Rahaim Diana W. Bianchi. Detection of male and female fetal DNA in maternal plasma by multiplex fluorescent polymerase chain reaction amplification of short tandem repeats. Hum Genet (2000) 106 :45–49. Hiroshi Honda, Norio Miharu, Yoko Ohashi, and Koso Ohama. Successful Diagnosis of Fetal Gender Using Conventional PCR Analysis of Maternal Serum Clinical Chemistry 47:1 2001 Fiona M. F. Lun, Rossa W. K. Chiu, K. C. Allen Chan, Tak Yeung Leung, Tze Kin Lau. Microfluidics Digital PCR Reveals a Higher than Expected Fraction of Fetal DNA in Maternal Plasma. Clinical Chemistry 54:10 2008 Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum Y M Dennis Lo, Noemi Corbetta, PauCl haFmberlain, Vik Rai, Ian L Sgaernt, Christopher WGRedman, James S. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. The Lancet Bernhard Zimmermann, Ahmad El-Sheikhah, Kypros Nicolaides. Optimized Real-Time Quantitative PCR Measurement of Male Fetal DNA in Maternal Plasma. Clinical Chemistry 51:9 1598–1604 2005 Elles M. J. Boon1, H´el`ene B. Schlecht, Peter Martin, Geoff Daniels, Rolf H. A. M. Vossen. Y chromosome detection by Real Time PCR and pyrophosphorolysis-activated polymerisation using free fetal DNA isolated from maternal plasma. Prenat Diagn 2007; 27: 932–937. Levente Lázár, Bálint Nagy, Attila Molvarec, János Rigó.A vérplazma összes szabad DNS, valamint szabad magzati DNS mennyisége praeeclampsiával szövődött és szövődménymentes terhességek esetében. Orvosi Hetilap, 2010. Wataganara, T., Metzenbauer, M., Peter, I. et al.: Placental volume, as measured by 3dimensional sonography and levels of maternal plasma cell-free fetal DNA. Am. J. Obstet. Gynecol., 2005, 193 , 496–500. Terry SC, Herman JH, Angell JB. A gas chromatograph air analyzer fabricated on a silicon wafer. IEEE Trans. E. Dev. 1979, 26: 1880-1996. Manz A, Graber N, Widmer HM. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing. Sensors and Actuators B, 1990, I: 244-248. Bergveld P. Thirty years of ISFETOLOGY. What happened in the past 30 years and what may happen in the next 30 years. Sensors and Actuators B 2003, 88: 1-20.
25
Kenis PJA, Ismagilov RF, Whitesides GM. Microfabrication inside capillaries using multiphase laminar flow patterning. Science 1999, 285: 83-85. Eijkel JCT and van den Berg A. Nanofluidics: what is it and what can we expect from it? Microfluidics Nanofluidics 2005, 1: 249-267. Vouwe EX, Luttge R, Vermes I, van den Berg A. Microchip capillary electrophoresis for point-of-care analysis of litthium. Clin Chem 2007; 53: 117-123. Han C, Zhang Q, Ma R, Xie L, Qiu T et al. Integration of single oocyte trapping, in vitro fertilization and embryo culture in a microwell-structured microfluidic device. Lab on a Chip 2010; 10: 2848-2854. Masood MN, Chen S, Carlen ET, vandenBerg A. All-(111) surface silicon nanowires: Selective functionalization for biosensing application. ACS Applied Materials & Interfaces 2010 2: 3422-3428. Segerink LI, Sprenkels AJ, Bomer JG, Vermes I, van den Berg A. A new floating electrode structure for generating homogeneous electrical fields in microfluidic channels. Lab on a Chip 2011 ; 11: 1995-2001 (DOI :10.1039/c0lc11489h ) Van der Meer AD, Vermeul K, Poot AA, Feijen J, Vermes I. Flow cytometric analysis of the uptake of low-density lipoprotein by endothelial cells in microfluidic channels. Cytometry PartA 2010 77A : 971-975. Segerink LI, Sprenkels AJ, terBraak PM, Vermes I, vandenBerg A. On-chip determination of spermatozoa concentration using electrical impedance measurements. Lab on a Chip 2010, 10 :1018-1024. DOI : 10.1039/b923970g VanderMeer FD, Poot AA, Duits MHG, Feijen J, Vermes I. Microfluidic techology in vascular research. Journal of Biomedicine and Biotechnology ;Hindawi Publishing Corporation ;Volume 2009 ;DOI# 10.1155/2009/823148 ;Artical ID 823148, 10 pages ISSN 1110-7243. Vass K, Vermes I, Kovács GL. Possible applications of Lab-on-a-Chip technology in the field of laboratory medicine. Clin Exp Lab Med 2009 ; 35: 84-89. Komen J, Wolbers F, Franke HR, Andersson H, Vermes I, van den Berg A. Viability analysis and apoptosis induction of breast cancer cells in a microfluidic device : effect of cytostatic drugs. Biomed Microdevices 2008,10:727-737. Vouwe EX, Luttge R, Vermes I, van den Berg A. Microchip capillary electrophoresis for point-of-care analysis of litthium. Clin Chem 2007; 53: 117-123. Wolbers F, Andersson H, Vermes I, van den Berg A. Miniaturisation in the biotechnology laboratory. Biotechnology International 2006; Wolbers F, terBraak P, LeGac S, Luttge R, Andersson H, Vermes I, vandenBerg A. Evaluation of the viability of HL60 cells in contact with commonly used microchip materials. Elecrophoresis 2006; 27: 5073-5080. 26
Wolbers F, Andersson H, Vermes I, van den Berg A. Miniaturisation in clinical diagnostics. Clinical Laboratory International 2006; 30:22-25. Wolbers F, terBraak PM,LeGac S, Luttge R, Andersson H, Vermes I, vandenBerg A. Evaluation of the viability of HL60 cells in contact with commonly used microchip materials. KF Jensen, J Han, DJ Harrison and J Voldman (Eds.) Micro Total Analysis Systems 2005, vol 2, pp. 1288-1290. 2005. Valero A, Merino F, Wolbers F, Luttge R, Vermes I, Andresson H, van den Berg A. Apoptotic cell death dynamics of HL60 cells studied using a micrfofluidic cell trap device. Lab on a Chip 2005; 5: 49-55. Emmelkamp J, Wolbers F, Andersson H, DaCosta RS, Wilson BC, Vermes I, van den Berg A. The potential of autofluorescence for the detection of single living cells for label-free cell sorting in microfluidic system Elecrophoresis 2004; 25: 3740-3745. Wolbers F, Haanen C, Andersson H, van den Berg A, Vermes I. Analysis of apoptosis on chip: Why the move to chip technology ? In:”Lab-on-Chips for Cellomics. Micro and Nanotechnologies for Life Science” by H. Andersson & A. van den Berg (eds) Kluwer Academic Publ. Dordrecht, pp. 197-224; 2004 Wolbers F., Andersson H, van den Berg A, Vermes I. Apoptosis induced kinetic changes in autofluorescence of cultured HL60 cells-possible application for single cell analysis on chip. Apoptosis 2004; 9: 727-733. Patrizio, P., Sakkas, D., 2009. From oocyte to baby: a clinical evaluation of the biological efficiency of in vitro fertilization. Fertil. Steril. 91,1061–1066. Guzeloglu-Kayisli, O., Kayisli, U.A., Taylor, H.S., 2009. The role of growth factors and cytokines during implantation: endocrine and paracrine interactions. Semin. Reprod. Med. 27, 62–79. Red-Horse, K., Drake, P.M., Fisher, S.J., 2004. Human pregnancy: the role of chemokine networks at the fetal–maternal interface. Expert Rev. Mol. Med. 6, 1–14. Salamonsen, L.A., Hannan, N.J., Dimitriadis, E., 2007. Cytokines and chemokines during human embryo implantation: roles in implantation and early placentation. Semin. Reprod. Med. 25, 437–444. van Mourik, M.S., Macklon, N.S., Heijnen, C.J., 2009. Embryonic implantation: cytokines, adhesion molecules, and immune cells in establishing an implantation environment. J. Leukoc. Biol. 85, 4–19. Barnea ER. Preimplantation factor negates embryo toxicity and promotes embryo development in culture. Reprod Biomed Online. 2011 Oct;23(4):517-24. Epub 2011 Jun 26. Szekeres-Bartho, J., Kilar, F., Falkay, G.,Csernus, V., Torok, A., Pacsa, A.S. Progesteronetreated lymphocytes of healthy pregnant women release a factor inhibiting cytotoxicity and prostaglandin synthesis. Am. J. Reprod. Immunol. Microbiol. 9, 15, 1985. (1.943)
27
Szekeres-Bartho, J., Autran, B., Debre, P., Andreu, G., Denver, L., Chaouat, G. Immunoregulatory effects of a suppressor factor from healthy pregnant women s lymphocytes after progesterone induction. Cell. Immunol. 122, 281,1989. Polgar, B., Gy. Kispal, M. Lachmann, C. Paar, E. Nagy, P. Csere, E. Miko, L. Szereday, P. Varga, J. Szekeres-Bartho. 2003. Molecular cloning and immunological characterization of a novel cDNA coding for PIBF. J Immunol. 171: 5956-5963. Szekeres-Bartho, J., Faust, Zs., Varga, P., Szereday, L., Kelemen, K. The immunological pregnancy protective effect of progesterone is manifested via controlling cytokine production. Amer.J. Reprod. Immunol. 35, 348, 1996. Szekeres-Bartho, J., Wegmann, T.G., A progesterne-dependent immunomodulatory protein alters the Th1/Th2 balance J. Reprod. Immunol. 31, 81-95, 1996. Raj Raghupathy1 PhD FRCPath, Esraa Al Mutawa1 MSc, Ma’asoumah Makhseed2 MBChB, MRCOG, Fawaz Azizieh1 PhD, Julia Szekeres-Bartho3 MD, DSc Modulation of Cytokine Production by Dydrogesterone in Lymphocytes from Women with Recurrent Abortion Brit. J. Ob. Gyn. 2005 Aug;112(8):1096-101. Szekeres-Bartho, J. , Chaouat, G. Lymphocyte-derived progesterone induced blocking factor corrects resorption in a murine abortion system. Amer. J. Reprod. Immunol. 23, 26, 1990. Szekeres-Bartho, J., Kinsky, R., Chaouat, G. A progesterone-induced immunologic blocking factor corrects high resorption rate in mice treated with antiprogesterone. Am. J. Ob. Gyn. 163, 1320, 1990. Szekeres-Bartho, J., Kinsky, R., Chaouat, G. The effect of a progesterone induced immunologic blocking factor on NK-mediated resorption. Amer. J. Reprod. Immunol 24, 105, 1990. Szekeres-Bartho,J., G. Par, Gy. Dombay, Smart, Y. C. Z. Volgyi. The anti-abortive effect of PIBF in mice is manifested by modulating NK activity. Cell. Immunol. 177, 194, 1997. N. Kozma, M. Halasz, B. Polgar, Tobias G Poehlmann, Udo R. Markert, T. Palkovics, M Keszei, K Kiss, J. Szeberenyi, G. Par, L. Grama, J. Szekeres-Bartho. PIBF activates STAT6 via binding to a novel IL-4 receptor. J Immunol. 2006 Jan 15;176(2):819-26. Kelemen, K.,, Paldi, A., Tinneberg, H., Torok, A., Szekeres-Bartho, J. Early recognition of pregnancy by the maternal immune system. Amer. J. Reprod. Immunol. 39, 351, 1998. Miko E1*, Halasz M1*, Jericevic-Mulac B.2, Wicherek L3, Arck P4, Arató G4, Skret Magierlo J5, Rukavina2, D., Szekeres-Bartho J. PIBF and trophoblast invasiveness. J. Reprod. Immunol. 2011 May 30. [Epub ahead of print] Lédée N, Petitbarat M, Rahmati M, Dubanchet S, Chaouat G, Sandra O, Perrier-d'Hauterive S, Munaut C, Foidart JM. New pre-conception immune biomarkers for clinical practice: interleukin-18, interleukin-15 and TWEAK on the endometrial side, G-CSF on the follicular side. J Reprod Immunol. 2011 Mar;88(2):118-23. Epub 2011 Feb 18. Review.
28
B Polgár, E Nagy, É Mikó, P Varga, J Szekeres-Barthó Urinary PIBF (Progesterone Induced Blocking Factor) concentration is related to pregnancy outcome Biology of Reproduction 2004 Nov;71(5):1699-705.) Ackerman S.B., Swanson R.J.,Stokes C.K.,Veck L.L.: Culture of mouse preimplantation embryosas a quality control assay for human in vitro fertilisation. Gamete Res. 24, 245250,1984 Ad hoc comitee of American Fertility Society:Minimal Standards of programs of in vitro fertilisation. Fertil. Steril. 41, 1984 Bindon,B.M.:Mechanism of the inhibition of implantation in suckling mice J Endocrinol , 44, 357-362, 1969 Bognár, Z.,Pácsa, S.,Csaba,I.: Az in vitro fertilizáció és embriótenyésztés minőségi kontrollja. I.Egér zigóta és 2-4 sejtes embriók in vitro tenyésztése. Kísérletes Orvostudomány 40,452-457,1988 Bognár, Z., Pácsa,S., Csaba, I.: Az in vitro fertilizáció és embriótenyésztés minőségi kontrollja. II. A pH, osmolaritás, tenyésztő edények, a relatív páratartalom és a vízminőség jelentősége. Kísérletes Orvostudomány 40, 458-463, 1988 Brosens J.J., GellersenB..:Something new about early pregnancy: decidual biosensoring and natural embryo selection. Ultrasound Obstet Gynecol. 2010 Jul ;36 (1):1-5 Chen J.R., Cheng J.G., Shatzer T., Sewell L., Hernandez L.,Stewart C.L.: Leukemia inhibitory factor can substitute for nidatory estrogen and is essential to inducing a receptive uterus for implantation but is not essential for subsequent embryogenesis. Endocrinology [2000, 141(12):4365-72] Gellersen B.,Reimann B.K., Samalecos A.,Aupers S., Bamberge A M.:Invasiveness of human endometrial stromal cells is promoted by decidualization and by trophoblast-derived signals.: Hum Reprod. 2010 Jan 29;: Harman R.M.,Cowan R.,G., Ren Y., Quirk S.,M Reduced signaling through the hedgehog pathway in the uterine stroma causes deferred impl implantation and embryonic loss Reproduction 2011 May 141 (5):665-674 Hondo E., Stewart.C.L.:: Profiling gene expression in growth-arrested mouse embryos in diapause Genome Biol. 2005; 6(1): 202 Lemons AR, Naz RK.: Birth control vaccine targeting leukemia inhibitory factor. Mol Reprod Dev. 2012 Feb;79(2):97-106 Lopes F.L., Desmarais J.A., Murphy B.D.: Embryonic diapause and its regulation. Reproduction. 2004 Dec ;128 (6):669-78 Renfree M: Initiation of development of diapausing embryo by mammary denervation during lactation in a marsupial. Nature 278, 549 - 551 (05 April 1979)
29
Salker M., Teklenburg G., Molokhia M., Lavery, S., Trew G., Aojanepong, T.,Mardon, H.,J. Lokugamage, A.U.,. Rai, R., Landles, C., Roelen B.A.J., Quenby S., Kuijk E.W., Kavelaars, A.,Cobi J. Heijnen C.J.: Regan L., Nick S., Macklon N. S., Brosens J.J.: Natural Selection of Human Embryos: Impaired Decidualization of Endometrium Disables EmbryoMaternal Interactions and Causes Recurrent Pregnancy Loss. PLoS One. 2010; 5(4): e10 Stamatkin C.W.,Roussev R..G., Stout M., Absalon-Medina V., Ramu S., Goodman C., Coulam C.B., Gilbert O.R., Godke R.A., Barnea E.R.: PreImplantation Factor (PIF) correlates with early mammalian embryo development-bovine and murine models Reprod Biol Endocrinol. 2011; 9: 63. Stewart CL, Kaspar P, Brunet LJ, Bhatt H, Gadi I, Kontgen F, Abbondanzo SJ. :Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukaemia inhibitory factor. Nature. 1992;359:76–79 Szekeres-Bartho, J., Kinsky, R., Chaouat, G. A progesterone-induced immunologic blocking factor corrects high resorption rate in mice treated with antiprogesterone. Am. J. Ob. Gyn. 163, 1320, 1990. Szekeres-Bartho, J., Kinsky, R., Chaouat, G. The effect of a progesterone induced immunologic blocking factor on NK-mediated resorption. Amer. J. Reprod. Immunol 24, 105, 1990. Ettlin, R.A., Bechter, R., Lee, I.P., Hodel, C. (1984): Aspects of testicular toxicity induced by anticancer drugs. In: Disease, Metabolism and Reproduction in the Toxic Response to Drugs and Other Chemicals. Archives of Toxicology, (Suppl. 7) 151-154. Foote, R.H., Carney, E.W. (2000): The rabbit as a model for reproductive and developmental toxicity studies. Reprod. Toxic., 14. 477-493. Diekmann, M.A., Green, M.L. (1992) Mycotoxins and reproduction in domestic livestock. J. Anim. Sci., 70. 1615-1627. Kovács F., Banczerowski J-né, Kovács M., Fazekas B.: Életminőség és a mikotoxinok egészségügyi vonatkozásai (1.). Állattenyésztés és Takarmányozás, 1998. 5. 385.-402. Kovács F., Banczerowski J-né, Kovács M., Fazekas B.: Életminőség és a mikotoxinok egészségügyi vonatkozásai (2). Állattenyésztés és Takarmányozás, 1998. 6. 483.-501. Kovács M (szerk.): Aktualitások a mikotoxin kutatásban. Budapest: Agroinform Kiadó, 2010. 156 p. (ISBN:978-963-502-912-9) Malekinejad, H., Schoevers, E.J., Ineke, J.J., Carla, M.Z., Colenbrander, B., Fink-Gremmels, J., Bernard, A.J. (2007): Exposure of oocytes to the Fusarium toxins Zearalenone and Deoxynivalenol causes aneuploidy and abnormal embryo development in pigs. Biol. Reprod., 77. 840-847.
30
Richard, J.L. (2007): Some major mycotoxins and their mycotoxicoses- An overview. International Journal of Food Microbiology, 119. 3-10. Schlatter, J. (2004): Toxicity data relevant for hazard characterization. Toxicology Letters, 153. 83-89. World Health Organisation (1990): International Programme on Chemical Safety. Environmental Health Criteria 105. Selected Mycotoxins: Ochratoxins, Trichothecens, Ergot. Geneva, Switzerland. http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc105.htm#PartNumber:2
31
