Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti
11.Metody molekulové spektrometrie pro kvantitativní analýzu léčiv Vadym Prokopec
[email protected]
11.Metody molekulové spektrometrie pro kvantitativní analýzu léčiv 12.NMR spektrometrie při analýze roztoků
13.Kvantitativní NMR spektrometrie 14.Hmotnostní spektrometrie pro identifikaci farmaceutických látek
Chemometrie
Chemometrie v IČ spektroskopii
Jednoduchý Lambert-Beerův zákon • Použití této metody vyžaduje měření výšky nebo plochy jediného pásu pro každou komponentu • každá komponenta musí mít nejméně dvě koncentrační hodnoty • Pro každou komponentu je vytvářena samostatná kalibrační závislost • Tímto způsobem je možno řešit jednoduché analytické problémy: • pásy jednotlivých komponent se nepřekrývají (pokud ano, tak jen málo) stálá základní linie • závislost mezi absorbancí a koncentrací je lineární nebo téměř lineární
• mezi komponentami není, nebo je velmi malá chemická interakce (maxima pásů se příliš nepohybují) • matrice vzorků je dobře definovaná (v neznámých vzorcích se neobjevují nenadále nové komponenty)
Jednoduchý Lambert-Beerův zákon • Výhody metod vyvinutých podle Lambert-Beerova zákona - jejich matematická podstata je snadno pochopitelná - nevyžadují velké množství standardů
• Nevýhody metod vyvinutých podle Lambert-Beerova zákona - nepoužitelné, pokud se pásy, nebo oblasti komponent významně překrývají - přesné pouze pro koncentrační rozpětí, pro které je kalibrační závislost lineární
Multivariační analýza dat použití mnoha proměnných zároveň základem tabulka - matice dat řádky - vzorky
sloupce - proměnné proměnné - závislé - např. koncentrace
proměnné - nezávislé - spektrální data proměnné - klasifikační(„category“)
- třídění vzorků do skupin
Označení metod multivariační analýzy CLS - classical least squares ILS - inverse least squares MLR - multiple linear regression PCA - principal component analysis • PCR - principal component regression • PLS1 - partial least squares 1 • PLS2 - partial least squares 2 • • • •
Regrese CLS • klasická metoda nejmenších •
• • •
čtverců - „K-matrix“ předpoklad platnosti Lambertova-Beerova zákona při všech frekvencích absorbance je funkcí koncentrace chyby modelu jsou přiřazeny chybám v určení absorbancí použitelná i pro celá spektra všechny komponenty musí být známy a zahrnuty do kalibrace
Regrese CLS • Kalibrační model může být založen na výšce nebo ploše spektrálního pásu může však také použít soubor mnoha bodů ve spektrálním rozsahu širším než je izolovaný pás • Metoda může používat data s překrývajícími se pásy komponent • Úspěch kalibrace je závislý na splnění těchto podmínek : • každá kalibrovaná komponenta má alespoň jednu měřenou oblast (pro komponentu je možno použít současně více oblastí, přičemž každá oblast může být současně použita pro několik komponent) • každá složka přispívající k absorbanci v dané oblasti je zahrnuta jako komponenta do metody • počet kalibračních standardů je minimálně roven počtu komponent • koncentrace komponent v kalibračních standardech se musí měnit nezávisle (nevhodné je generování kalibračních standardů ředěním základního roztoku)
Regrese CLS • Výhody CLS metody:
• - možnost využití pásů komponent, které se významně překrývají • - potřeba menšího množství standardů než PLS nebo PCR metoda • - přesnější výsledky než při použití Beerova zákona, protože jsou využity všechny datové body v analytickém regionu použitém pro výpočet • Nevýhody CLS metody: • - nemůže řešit výskyt neočekávaných nečistot ve vzorku • - interference pro jednu komponentu mohou ovlivňovat ostatní komponenty
Regrese PLS • Výhody PLS metodiky
• - umožňuje kalibrace za použití pásů nebo regionů komponent, které se silně překrývají • - řeší interference neznámých komponent (nečistot) • - k výpočtům jsou použity všechny datové body v analyzovaném regionu • - uživatel nepotřebuje specifikovat zvláštní oblast pro každou komponentu • Nevýhody PLS metodiky • •
- vyžaduje velké množství standardů - pochopení jejího matematického principu je obtížné
Analýza hlavních komponent • analýza samotných spektrálních dat • hledání struktury dat • určení hlavních komponent PC’s transformace spekter do jiného systému souřadnic • uspořádání dat podél PC’s - SCORES • hledání spektrálních intervalů významně přispívajících k distribuci dat - ZÁTĚŽE - loadings
Analýza hlavních komponent transformace souřadnicového systému
Principal Component (PC)
Regrese PCR • regrese hlavních komponent PCA + regresní krok ILS • modely pro více sledovaných analytů zároveň multikomponentní • separátní modely pro jednotlivé komponenty (počítány zároveň) nemusí být známy všechny komponenty • modely pro celá spektra či široké spektrální intervaly
Hledání optimálního počtu hlavních komponent • VYHODNOCENÍ „PRESS“ prediction error sum of squares počítáno pro všechny zvažované počty hlavních komponent
nalezení minima na křivce závislosti „PRESS“ na počtu hlavních komponent
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy
•
•
Graf „skóre“ (ve své podstatě je to rozptylový diagram) ukazuje umístění vzorku podél každé modelované komponenty a může být využit k detekci zákonitostí vzájemného rozmístění vzorků, jejich struktury, seskupování, podobností a odlišností. Obvykle je zobrazována závislost PC1 na PC2, obecně dvou po sobě jdoucích komponent
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy
• Graf „zátěží“ ukazuje, jak se od sebe liší hodnoty dat, když se posouváme podél modelované komponenty • Pro spektroskopická data graf x-zátěží (x-Loadings) popisuje příspěvek měřené intenzity signálu podél spektrální proměnné (vlnočtu) ke struktuře dat ve směru dané hlavní komponenty • Grafy zátěží mohou být využity ke sledování příspěvku jednotlivých proměnných k významným odchylkám v datech a k interpretaci příbuznosti (vzájemného vztahu) proměnných
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy • graf průměrných hodnot skóre
Graf skóre
• každý bod odpovídá sadě spekter pro specifický SERS substrát • souřadnice jsou vztaženy k průměrným hodnotám skóre podél první (PC1) a druhé (PC2) hlavní komponenty • standardní odchylky hodnot skóre pro jednotlivé (odpovídající stejnému substrátu) spektrální podskupiny (podmnožiny) jsou znázorněny chybovými úsečkami.
Postup přípravy B
Postup přípravy A
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy • Jednodimenzionální grafy zátěží pro spektrální data zobrazují příspěvek měřené intenzity signálu podél spektrální proměnné (Ramanův posuv, vlnočet) k variabilitě spektrálních dat podél zvolené hlavní komponenty • 1-D graf pro první hlavní komponentu má hodně společných rysů se SERS spektry 4ABT na povrchu substrátů
• umístění jednotlivé spektrální podskupiny (SERS-aktivního substrátu) podél PC1 je předurčeno porovnáním kompletní spektrální informace (např. vzhled všech zaznamenaných Ramanových pásů, jejich intenzity, tvar spektrálního pozadí, poměr signálu k šumu) v rámci celkového datového souboru.
PC2: rozdíly v intenzitách vybraných pásů
1D grafy zátěží PC1: celková spektrální informace
Strategie při chemometrické analýze spektroskopických dat
Kalibrační standardy
Nejběžnější zdroje chyb
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení obsahu jodobenzenu, 2,4-lutidinu a dibutyloxalátu v třísložkové směsi I
N
CH3
CH3
2,4-lutidin
jodbenzen
CH3
CH2
CH2
CH2
O
C
O
CH3
CH2
CH2
CH2
O
C
O
dibutyloxalát
Příklad kvantitativního stanovení v MIR • MIR spektra měřena na MCT/A detektoru v rozsahu 400 – 4000 cm-1 při rozlišení 1 cm-1 • pro kalibraci použito 6 kalibračních a 2 validační standardy • výpočet podle Beerova zákona z plochy vybraných pásů • měření prováděno v kyvetě z KBr
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Kalibrační tabulka Vzorek č. jodbenzen (%) 2,4-lutidin (%) dibutyloxalát (%) 1 15,2 32,6 52,2 2 23,1 41,0 35,9 3 32,7 26,2 41,1 4 6,1 34,1 59,8 5 19,3 29,1 51,6 6 27,8 38,7 33,5 7 9,9 37,0 53,1 8 11,1 27,5 61,4
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Spektra jednotlivých složek směsi 1, 0
i odo ben z en e
Abs
0, 8 0, 6 0, 4 0, 2
2,4 -lut idin e
Abs
1, 0
0, 5
1, 0
dib uty l ox alat e
Abs
0, 8 0, 6 0, 4 0, 2
4 000
3 000
2 000 W av e num be rs (c m-1 )
1 000
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Výběr vhodného pásu pro stanovení jodbenzenu jodbenzen - substituovaná aromatická sloučenina 2,4-lutidin - substituovaná heterocyklická sloučenina rozdílné umístění mimorovinných deformačních C-H vazeb šestičlenného kruhu v oblasti 850 – 700 cm-1
pro stanovení jodbenzenu výběr pásu 654 cm-1
1, 0
i odo ben z en e 65 4,2 c m-1
Abs
0, 8 0, 6 0, 4 0, 2 2,4 -lut idin e
Abs
1, 0
0, 5
1, 0
dib uty l ox alat e
Abs
0, 8 0, 6 0, 4 0, 2 8 50
8 00
7 50
7 00 W av e num be rs (c m-1 )
6 50
6 00
5 50
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Výběr vhodného pásu pro stanovení 2,4-lutidin charakteristický ostrý pás v (C-C) vibrací pyridinového kruhu při 1607 cm-1 obdobné vibrace aromatického kruhu jodbenzenu posunuty na 1571 cm-1
pro stanovení 2,4-lutidinu výběr pásu 1607 cm-1 i odo ben z en e 157 1,7 c m-1
Abs
1, 0
0, 5
2, 0
2,4 -lut idin e 160 7,4 c m-1
Abs
1, 5
1, 0
0, 5
dib uty l ox alat e
Abs
1, 0
0, 5
1 680
1 660
1 640
1 620
1 600
1 580
1 560
W av e num be rs (c m-1 )
1 540
1 520
1 500
1 480
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Výběr vhodného pásu pro stanovení spektrum dibutyloxalátu má dva karbonylové pásy při 1770 a 1744 cm-1 spektrum jodbenzenu má v této oblasti overtonové pásy substituovaného benzenového kruhu, ty jsou však velmi malé a stanovení dibutyloxalátu významně neovlivní
pro stanovení dibutyloxalátu výběr pásů 1770 a 1744 cm-1 0, 5
i odo ben z en e
Abs
0, 4 0, 3 0, 2 0, 1 2,4 -lut idin e
Abs
1, 0
0, 5
dib uty l ox alat e
177 0,3 c m-1
174 4,7 c m-1
Abs
1, 0
0, 5
1 900
1 850
1 800
1 750 W av e num be rs (c m-1 )
1 700
1 650
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení jodbenzenu – výběr regionu
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení jodbenzenu – kalibrační graf
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení 2,4-lutidinu – výběr regionu
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení 2,4-lutidinu – kalibrační graf
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení dibutyloxalátu – výběr regionu
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení dibutyloxalátu – kalibrační graf
Příklad PCA analýzy NIR spekter
Příklad PCA analýzy NIR spekter
Příklad PCA analýzy Ramanových spekter biologických vzorků
Vzorek: rakovinné buňky epitelové tkáně plic
Příklad PCA analýzy Ramanových spekter biologických vzorků
