1.
MIKROBIOLOGIAI MUNKAVÉDELMI RENDSZABÁLYOK
A mikrobiológiai gyakorlatok során a laboratóriumokra vonatkozó általános rendszabályokat kell követni (savak, lúgok, mérgezı anyagok használata, elektromos- és gázkészülékek kezelése). A bakteriológiai laboratóriumokban dolgozók a mikroorganizmusok többféle terjesztı közegével kerülhetnek érintkezésbe. Bár a mikrobiológiai gyakorlatok során patogén baktériumokkal nem dolgozunk, a mikrobiológiai munka minden fázisa egészségkárosodási lehetıséget rejt magában. Ezért ismerniük kell azokat a módszereket, eljárásokat és rendszabályokat, amelyek a biztonságos munkavégzéshez nélkülözhetetlenek. Az alábbi rendszabályok merev, feltétel nélküli betartásával kell a magunkat és társainkat érintı veszélyforrásokat kiküszöbölni: 1) Minden mikrobiológiai preparátumot és tenyészetet potenciális fertızési forrásnak kell tekinteni! 2) Patogén laboratóriumban enni, inni, élelmiszert tárolni, laboratóriumi edényzetet e célra használni, valamint dohányozni tilos. 3) A mikrobiológiai munka során ügyelni kell arra, hogy lehetıség szerint ne fertızıdhessen a felszerelés, a bútorzat, testünk bármely része vagy a légtér. Ezért: A fertızı munkafolyamat alatt védıöltözet viselése kötelezı. A gyakorlatok során a hosszú hajat fel kell tőzni, mivel balesetveszélyes (gázlángnál könnyen meggyullad). A mikrobatenyészetek csak megfelelıen lezárt edényzetben tárolhatók. Mikroorganizmusokat tartalmazó tápközegeket a lefolyóba önteni szigorúan tilos! A munka befejezése után a munkafelület fertıtlenítése és fertıtlenítıszeres kézmosás kötelezı. Ha a vizsgálati anyag, baktériumtenyészet elcseppen, kifolyik, vagy a beoltott táptalajt, ill. fertızött anyagot tartalmazó üvegnemő eltörik, a laboratórium padlójára, ill. tárgyaira jutott anyagot és a szétszóródás helyét, környezetét Neomagnol (100 cm3 vízben 1 tabletta) oldattal
1
leöntve (vagy abba beáztatva) kell fertıtleníteni. Takarítani csak 1 órás fertıtlenítés után szabad. 4) A mikrobatenyészetekkel érintkezett eszközöket (pipetták, tárgylemezek, fedılemezek, stb.) használat után azonnal fertıtlenítıoldatot tartalmazó edénybe kell tenni. A tenyészeteket tartalmazó edények és eszközök csak sterilezés után mosogathatók el. 5) Szilárd és folyékony táptalajokat gyakran oltókacs segítségével inokuláljuk (oltjuk). Ez lényegében egy 5-6 cm hosszú és 0,6-0,7 mm vastag nem korrodálódó acél (esetleg platina-irídium drót) mely egyik végével nyélbe illeszthetı, míg a másik vége kacsszerően hajlított. A kacson megtapadt mikrobákat általában Bunsen-égı lángjánál leégetéssel semmisíthetjük meg. Ennek technikája: a fertızött kacsot elıször a gázláng hideg magjában megszárítjuk a mikroorganizmusok szétfreccsenésének megelızése érdekében, majd a kacsot a lángban egyre feljebb emeljük, és átizzítjuk (1. ábra). 6) Folyékony táptalajból üvegbottal történı szélesztéskor a baktériumokat tartalmazó cseppek szétszóródása miatt fokozott figyelemmel kell eljárni. 7) Élı kórokozót vagy toxint tartalmazó vizsgálati anyagokat kizárólag ballonnal ellátott vattaszőrıs pipettával vagy automata pipettával szabad felszívni; a pipettát használat után fertıtlenítı oldatba kell meríteni. 8) Élı tenyészetek keverı géppel történı homogenizálásától óvakodni kell. Ha ez mégis szükséges, csak dugóval vagy jól záró kupakkal ellátott üvegedényben szabad a keverést elvégezni.
2
1. ábra: A száraz és a baktériumokkal terhelt oltókacs leégetése a Bunsen-égı lángjában. A láng hımérséklete annak különbözı pontjain °C-ban megadva. 9) Bármely sérülést, fertızıdést az oktatónak azonnal jelenteni kell! Ha fertızı anyag sértetlen bırre került, azt a ruházat eltávolítása után 0,2 %-os Neomagnol-oldattal vagy ezzel átitatott vattával le kell mosni, majd vízcsap alatt szappannal alaposan meg kell mosakodni. Ha a fertızı anyag a szembe jutott, mindkét szemet vízcsap alatt langyos 3
vízzel vagy steril élettani konyhasó-oldattal - a dörzsölést kerülve - ki kell mosni. Baktérium szuszpenziók szájba szívása vagy lenyelése esetén a szájat elıször vízzel alaposan ki kell öblíteni, majd 0,02-0,05 %-os KMnO4oldattal vagy Hyperol (100 cm3 vízben 1 tabletta) oldatával vagy 1 %os hidrogénperoxiddal 1-2 percig öblögetni, gargarizálni. Ezután még szájfertıtlenítı tabletta is szopogatható. A fertızı anyag lenyelése esetén egy kávéskanálnyi húskivonatot kell lassan szétoszlatni a szájban, majd lenyelni. A gyomorban meginduló fokozott fehérjeemésztés a baktériumokat is elpusztíthatja. Vizet vagy folyadékot a gyomornedv hígulása miatt itatni nem szabad. Az elkövetkezı órákban többször szájöblítést kell végezni. Szükség esetén orvoshoz kell fordulni. Ha fertızıanyag a szem kötıhártyájára jutott, akkor öblítjük a szemet áramló langyos vízzel vagy steril fiziológiás konyhasó oldattal. Ezt követıen csepegtessünk a szemhéj alá antibiotikumot tartalmazó szemcseppet, és ha szükséges forduljunk szemorvoshoz. Ha valahol a bırfelület sérült meg és fertızıdött, úgy azt jódtinktúrával kell ecsetelni, utána öblíteni (pl. Neomagnol 0,1%-os oltával, amit gézzel vagy vattával lehet a bırfelületre felvinni és 3 percig rajt hagyni), majd újra jódtinktúrát vigyünk rá. A jódtinktúrával kezelt felületi sérüléseket, a jód elpárolása után Chlorocid kenıccsel kenjük be.
4
2. 2.1.
MIKROBIOLÓGIAI LABORATÓRIUM A MIKROBIOLÓGIAI LABORATÓRIUM FELÉPÍTÉSE, FİBB MUNKAFOLYAMATAI
Mikrobiológiai laboratórium alatt nemcsak szőken azt a helyiséget kell érteni, ahol a mikroorganizmusokkal kapcsolatos vizsgálatok zajlanak, hanem a vele szerves egységet képezı járulékos helyiségeket is, mint a mintaelıkészítı, a mérlegszoba, a mosogató, táptalajkészítı és a sterilezı. A laboratórium kialakítását általában a helyi adottságok, lehetıségek befolyásolják. Ezek figyelembevételével kell olyan elrendezést kialakítani, amely lehetıvé teszi a biztonságos munkavégzést. Ennek érdekében a szőkebben értelmezett mikrobiológiai munka céljára szolgáló steril övezetet el kell különíteni a már elszaporodott mikroorganizmusokat tartalmazó edények és eszközök kezelését szolgáló helyiségektıl. Mikrobiológiai vizsgálatokkal foglalkozó laboratóriumokban az alábbi fıbb munkafolyamatok zajlanak: Táptalajfızés és sterilezés: a vizsgálatokhoz szükséges táptalajok és hígítófolyadékok elkészítése és a bennük lévı eredeti mikroflóra elpusztítása. Mintaelıkészítés: a lezárt minták – szennyezés és fertızésmentes (aszeptikus) felnyitása, mikrobiológiai minta vétele, aprítás, homogenizálás, alaphígítás elkészítése stb. Leoltás: az elıkészített mikrobiológiai mintából illetve annak megfelelı mennyiség különbözı mikrobacsoportok hígításaiból elıírt meghatározása érdekében történı megfelelı tápközegekbe való oltása. Inkubálás: a beoltott táptalajok a mikroba számára optimális hımérsékleten történı tárolása a mikroorganizmus elszaporodásáig. Kiértékelés: az elszaporodott tenyészetek vizsgálata alapján mikroorganizmusok számának, vagy jelenlétének megállapítása.
a
Identifikálás: a kitenyésztett baktériumok azonosítása morfológiai, biokémiai, szerológiai stb. vizsgálatokkal. 5
Sterilezés: A kiértékelt tenyészetekben és a vizsgálathoz felhasznált eszközökön lévı mikrobák elpusztítása (121 °C, 30 perc). Mosogatás: Az elızetes használat után már sterilezett edényzet elmosása, új edényzet és eszközök elıkészítése. Eszközök sterilezése: száraz üvegedények és eszközök felületén levı mikroorganizmusok elpusztítása. Törzsfenntartás: a különbözı célokat szolgáló mikroorganizmusok (pl. tejipari kultúrák, referenciatörzsek stb.) színtenyészeteinek folyamatos fenntartása, szükség esetén elszaporítása. A fenti mőveleteken kívül - a laboratórium jellegétıl függıen (kutató, oktató stb.) nagyon sok egyéb munkafolyamat is lehetséges, amelyre itt nem térünk ki. Az említett mőveletek közül a mintaelıkészítés és a leoltás mindenképpen olyan körülményeket igényel, amelyek kizárják a vizsgált anyag utólagos fertızıdését, ezért ezt egy külön, erre a célra szolgáló helyiségben célszerő elvégezni. Hasonló módon a steril munkavégzés igénye miatt külön helyiség szükséges a törzsfenntartó mőveletekhez. A beoltott tápközegek inkubálása és kiértékelése fertızési forrást jelent, ezért ezt a steril munkafolyamatoktól elkülönítetten kell végezni. Általában a táptalajfızést és sterilezést is külön helyiségben végzik, mivel az egyes táptalajkomponensek fertızési veszélyt jelentenek. A kiértékelt tenyészetek és használt eszközök sterilezését a laboratórium többi részétıl megfelelıen elválasztott helyiségben kell végezni. A laboratórium belsı munkarendjének és a helyiségek funkciójának kialakításakor úgy kell eljárni, hogy a szennyezett edények és eszközök ne kerülhessenek érintkezésbe a steril eszközökkel. 2.2.
A MIKROBIOLÓGIAI LABORATÓRIUM BERENDEZÉSEI
2.2.1. A táptalajkészítés és -tárolás berendezései Mérlegek: a táptalajkomponensek bemérésére szolgálnak
6
Desztilláló berendezés vagy ioncserélı gyantát tartalmazó patron: egyszer desztillált vagy ioncserélt víz elıállítására Fızılap, vagy vízfürdı: a táptalajkomponensek mielıbbi oldódásának elısegítésére Hımérsékletkompenzációs pH mérı: a megfızött táptalajok sterilezés elıtti, szobahımérsékletre vonatkoztatott pH-jának mérésére használják Automata adagoló: több, azonos mennyiségő folyadék kiadagolására szolgáló berendezések Hőtıszekrény: az elkészített steril táptalajok, hőtendı reagensek és fenntartandó törzsek, valamint a beérkezett minták tárolására. A fenntartandó törzseket és a beérkezett mintákat mindig külön hőtıszekrényben kell tárolni. 2.2.2. Mintaelıkészítés berendezései A mintaelıkészítés során a behozott élelmiszermintákat megfelelı jelzéssel látjuk el, majd elkészítjük az alaphígítást (lásd késıbb). Hőtıszekrény: a beérkezett mintákat a feldolgozásig hőtve kell tárolni, hőtést igénylı, romlandó minták esetében. Gázégı: a minta kiméréséhez használt fémeszközök (csipesz, szike, olló stb.) sterilezésére szolgál. Mérleg: a minta kiméréséhez Homogenizáló berendezés: régebben általánosan az un. forgókéses homogenizáló berendezéseket használták, ma már fıleg az élelmiszermikrobiológiában - a Stomacher-készülék alkalmazása az általános, amely a sugársterilezett polietilén zsákba tett mintát mechanikusan homogenizálja. Ez a módszer különösen elınyös, ha a baktériumok kvantitatív meghatározására van szükség. Fagyasztó: a bevizsgált mintából minden esetben le kell fagyasztani (-75 -80 °C) annyit, hogy szükség esetén a vizsgálat újra elvégezhetı legyen. 7
2.2.3. Az oltás berendezései Az oltás során végezzük az elkészített élelmiszerminták törzsoldatainak hígítását és tápközegekbe oltását. Ezeket a munkákat is sterilen kell végeznünk. A laborban keletkezı kis légörvények kivédésére I.- II.- III.kategóriájú biológiai biztonsági szekrényeket alkalmazunk. Biológiai biztonsági szekrények: I. Az elsı kategóriájú biológiai biztonsági szekrények általában nyitott elıterőek. Nem védik meg a munkafolyamatot a dolgozótól sem a külsı környezettıl, és erısen szennyezett levegıjő laboratóriumban használhatatlanok (2. ábra). II. Második kategóriájú biológiai biztonsági szekrénytípus gyakorlati megvalósításához az a megfigyelés vezetett, miszerint a High Efficiency Particulate Air (HEPA) szőrın keresztül megközelítıen 0,5 m/s sebességgel áthajtott levegı a folyás irányában egy bizonyos távolságra részecskementes levegıjő környezetet tud biztosítani. Ezt a szőrt, rétegezett, nem keveredı (turbulenciamentes) légáramlást nevezzük „laminar flow”-nak. Elınye, hogy kis helyigényő, munkatere lehetıvé teszi a steril munkát. A légáramlás iránya szerint megkülönböztetünk vízszintes (horizontális) (3. ábra) és függıleges (vertikális) (4. ábra) légáramlású lamináris boxokat.
8
2. ábra: Elsı kategóriájú biológiai biztonsági szekrények és annak továbbfejlesztése A: A levegı a szekrény elıterének munkanyílásán át áramlik be, áthalad a munkafelületen és távozik a dekontaminációs készüléken (általában egy nagy hatékonyságú szőrı) továbbá az elszívó ventillátoron át. B: A nyitott elıteret egy hosszanti fedılappal zárják, melyen keresztül a kezek számára kerek lyukat vágnak. C: a belsı térbe már csak rögzített kesztyőkkel lehet benyúlni. Ez esetben a levegı áramlását erısen lassítják, mikor is a szekrény belsı terében negatív nyomás jön létre. A horizontális légáramlású szekrények közel steril munkakörülményeket nyújtanak, de nem védik meg a dolgozót, aki ki van téve az aeroszolok hatásának. Az ilyen szekrények mikrobiológiai laboratóriumi munkára nem alkalmasak. Az egyszerő vertikális légáramlású készülékek ez a hibát kiküszöbölik és a munkafolyamatok számára is védelmet nyújtanak. A fülke az áramoltatott levegı elvén mőködik, kb. a levegıkiszívás 70%-a recirkulálódik. A levegı a munkatérbıl a negatív nyomás hatására fertızötten visszatér a ventillátorba és onnan újra a HEPA szőrıkbe. Ezenkívül a benyúlónál a ventilátor felé a külsı térbıl is áramlik levegı. III: A harmadik kategóriájú biológiai biztonsági szekrények (5. ábra) már hermetikusan zárt belsı térrel mőködnek és alkalmasak nagyon veszélyes 9
fertızı anyagok kezelésére. A munkálatok a belsı térben rögzített, karhosszúságú gumikesztyők segítségével folynak. A szekrénybe az anyagok bevitele légzáró zsilipen keresztül lehetséges, míg az anyagok eltávolítása autoklávon vagy folyékony fertıtlenítıszerrel töltött merítı tankon át történik. Rázókeverı: folyékony minták és a minták hígításainak homogenizálására szolgáló berendezés
3. ábra: Vízszintes légáramlású lamináris fülke
10
4. ábra: Függıleges légáramlású lamináris fülke
5. ábra: A harmadik kategóriájú biológiai biztonsági szekrény vázlata. Az inkubálás berendezései Az inkubálás a mikrobiológiai gyakorlatban annyi jelent, mint mikroorganizmusokat elszaporítani a számukra optimális hımérsékleten.
11
Termosztátok: a mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló, kívánt hımérsékletre beállítható szekrények. A régebbi típusoknál a hımérséklettartást egy szabályozott hıfokú külsı vízköpeny biztosítja. A modernebb berendezések állandó légcirkulációval egyenletes belsı légeloszlást tesznek lehetıvé. Vízfürdı: a légtermosztátoknál sokkal jobb hıátadás révén gyorsabb hıkiegyenlítıdést és pontosabb hımérséklettartást tesznek lehetıvé. Rázógépek: folyadéktenyészetek folyamatos oxigénellátását is biztosítják a rázatás révén. Fıleg aerob mikroorganizmusok tenyésztésénél használják. Kialakításuktól függıen egyszerre több lombik rázatását is lehetıvé teszik. Vízfürdıs változatban, vagy légtermosztáttal egybeépítetten elterjedten alkalmazzák mikroorganizmusok laboratóriumi léptékő szaporítására. 2.2.4. A kiértékelés és az identifikálás berendezései A kiértékelés során történik a kitenyésztett mikroorganizmusok számának megállapítása - ha szükséges - az azonosítási vizsgálatok elvégzése után. Félautomata telepszámláló berendezés: Sok esetben szükséges, hogy az agar-agar lemezen kinıtt baktérium és gombatelepeket gyorsan és hiánytalanul megszámoljuk. Ezt könnyíti meg egy érzékeny, elektromos heggyel felszerelt készülék, mely kapcsolatban van egy számláló berendezéssel. Az érzékeny hegynek a táptalajhoz, illetve baktérium telephez való érintésére a számláló mőködésbe jön. A mőködési elve hasonló a TitriPlaque készüléknek is. Itt a Petri-csésze egy alulról megvilágítható üvegkarikára kerül, mely fölé egy karos nagyító (lupe) hajlik. Segítségével a fejlıdési fázis kezdetén lévı telepek is leszámolhatók. A számlálást segíti elı a Thoma- és Bürker-kamra is. (Részletesebben a baktériumok számának meghatározása c. fejezetben.) Természetesen a mikrobiológiai laboratórium berendezései közül nem maradhat ki a mikroszkóp sem, ennek részletes ismertetése a 6. fejezetben található.
12
2.2.5. A sterilezés berendezései Autoklávok: táptalajok és szennyes edények gızzel való sterilezésére szolgáló eszközök. Általában 1,5-2,5 bar nyomású gızzel végezve a hıkezelést, a sterilezendı anyag minıségétıl függıen alkalmazott 110130 °C hımérsékleten a legellenállóbb baktérium endospórák is elpusztulnak. Hılégsterilezı: száraz eszközök (lombikok, üveg pipetták, edények) sterilezésére kialakított szárítószekrény típusú berendezések. Mivel a mikrobák száraz hıvel szemben sokkal ellenállóbbak, mint nedves hıvel szemben, a hılégsterilezıket általában 170-180 °C hımérsékleten, 2 órán át üzemeltetve érik el a kellı hatást. Gázégı: a laboratóriumi munka során használt fémeszközök (oltókacs, oltótő, csipesz) sterilezésére szolgál. Klasszikus formája a Bunsen-égı, ennek továbbfejlesztett változata az elektromos gyújtású biztonsági szeleppel ellátott gázégı. 2.2.6. A mosogatás berendezései Mosogató kagylók: ideálisan legalább 4 rozsdamentes acélból készített kagyló szükséges. Az egyiket a beáztatásra, a másikat a mosogatásra, a harmadikat a csapvizes öblítésre és a negyediket desztillált vizes öblítésre használjuk. 2.3.
A MIKROBIOLÓGIAI MŐVELETEK ESZKÖZEI
A mikrobiológiai laboratóriumi eszközök nagy része azonos a kémiai laboratóriumokban alkalmazottakkal (lombikok, kémcsövek stb.); az alábbiakban csupán a speciálisan mikrobiológiai célt szolgáló eszközök rövid áttekintését adjuk. A mintavétel és elıkészítés eszközei Szilárd mintákból a mintavétel steril szike, olló és csipesz segítségével történik. A folyékony minták beméréséhez 10 vagy 20 cm3-es steril pipettát használunk. A mintákat sugárzással sterilezett polietilén tasakban homogénezzük. Tenyésztıedények 13
A mikroorganizmusok szaporítására szolgáló üvegedények. Folyékony tenyészetek készítése céljából általában Erlenmeyer-lombikokat vagy perem nélküli kémcsöveket használunk. A tenyésztés során ezeket fém-, mőanyag- vagy papírdugóval le kell zárni. A kémcsı szájának leégetésekor a kémcsıben felmelegedı és kifele tóduló levegı örvénymentes. Folyadéktenyészetekben a gázképzıdés kimutatására szolgál a szájával lefelé fordított Durham féle fermentációs csı. Szilárd tenyészetek esetén kémcsöveket vagy Petri-csészéket alkalmazunk. Aerob mikroorganizmusok szilárd táptalajon való tömegtenyésztésére és szövettenyészetek készítésére a szögletes alakú, fekvı helyzető Roux (ejtsd: rú) -palackot használjuk. Oltóeszközök Mikroorganizmusok tenyészeteinek, telepeinek továbboltására, tápközegbe vitelére, vagy felületi szélesztésre szolgáló eszközök. Legelterjedtebb képviselıi az oltókacs, az oltótő, a pipetta és a szélesztıbot. Ez utóbbi kiválóan helyettesíthetı steril kémcsıvel vagy Wasserman-csıvel. Újabban egyre elterjedtebben használják a cserélhetı mőanyag heggyel ellátott automata adagoló pipettákat is.
14
6. ábra: Laboratóriumi üvegeszközök: 1. perem nélküli kémcsı, 2. Wasserman-csı, 3. Erlenmeyer-lombik, 4. Álló lombik 5. Táptalaj üveg 6. Roux-palack, 7. Petri-csésze, 8. Durham-csı A mikroszkópos vizsgálat eszközei A mikroszkópi preparátumot 75x25 mm oldalhosszúságú, általában 1,5 mm vastagságú tárgylemezek felületén készítjük. Ezek lefedésére szolgálnak a 18-26 mm élhosszúságú négyzet alakú, 0,16-0,18 mm vastagságú fedılemezek. A tárgylemezek megfogására szolgál a tárgylemez-csipesz. A rögzített preparátumok festésére festıkádat vagy festıtálcát használunk. Folyadéktenyészetekben lévı mikroorganizmusok megszámlálását teszik lehetıvé az ismert térfogatú osztással ellátott számlálókamrák, mint pl. a Bürker-kamra. 1. GYAKORLAT Rajzolja le a laboratórium alaprajzát (elıkészítı helyiségekkel együtt) a következı oldalon található négyzetrácsozott területre! Tüntesse fel a következı eszközök, berendezések számát az alaprajzon! Egy szám több helységben is helyet kaphat: 1. 4 termosztát különbözı hımérsékletekre beállítva 2. mikroszkóp, Gram festés eszközei 3. tiszta üvegáru 4. 2 autokláv 5. kézmosó medence 6. kontaminálódott eszközök tárolására alkalmas asztal 7. piszkos, de nem kontaminálódott eszközök tárolására alkalmas asztal-mosogatógép 8. győjtıedény a törött üvegek számára 9. tárgy és fedılemezek 10. címkézı szalag 11. biológiailag fertızött anyag győjtésére alkalmas zsák 12. lamináris fülke 13. ioncserélı 14. papír kéztörlı tartó 15. könyvek 16. hőtı 17. mélyfagyasztó 18. fertıtlenítıszer
15
16
2.4.
KÜLÖNBÖZİ BIOLÓGIAI BIZTONSÁGI SZINTŐ MIKROBIOLÓGIAI LABORATÓRIUMOK
A mikrobiológiai laboratóriumok speciális, nem ritkán egyedül állóan különleges munkahelyek, melyekben a személyzet egy határozott vagy elıre nem kiszámítható fertızı betegségek veszélyének lehet ill. van kitéve. I. Az alapszintő laboratóriumok azok, melyekben olyan élı szervezetekkel, mikrobákkal dolgoznak, amelyek felnıtt egészséges személyekben, természetüknél fogva nem idéznek elı megbetegedést. Az ilyen laboratóriumokban az 1. ill. bizonyos körülmények között már a 2. biológiai biztonsági szint (biosafety levels: 1. táblázat elérése a követelmény. Alapszintőnek tekinthetjük azt a labort is, mely már alkalmas bizonyos fertızı ágensek vagy potenciálisan fertızı anyagok vizsgálatára, de ez esetben a kockázat szintje még alacsony és a labor személyzetét a standard alapszintő laboratóriumi gyakorlat fenntartásával megfelelıen megvédhetjük. A munka az ilyen laboratóriumokban általában nyitott munkaasztalnál folyik, bár bizonyos feladatokat külön biztonsági fülkében hajtanak végre. A felszerelés, a biztonsági berendezések és a végrehajtott munkálatok megfelelnek az oktatói laboratóriumok követelményeinek. II. Fokozott fertızési veszéllyel járó mikrobiológiai laboratóriumok esetében már a 3. biológiai biztonsági szint elıírásai érvényesek. Ezt a típusú laboratóriumot az alapszintőtıl elsısorban is az itt már feltétlenül igényelt speciális szellıztetési rendszer és a laboratórium megközelítésének (ki- és bejárat) szabályozása különböztetik meg. A 3. biológiai biztonsági szint megvalósulhat klinikai-, diagnosztikai-, oktatási-, kutató- és olyan termelıi laboratóriumokban, ahol mind bennszülött, mind exotikus kórokozókkal dolgoznak és ahol a fertızés súlyos, sıt halálos következményekkel járhat. A Mycobacterium tuberculosis-sal már csak ilyen laborokban folyhat munka. III. A rendkívül veszélyes fertızı anyagok vizsgálatára alkalmas mikrobiológiai laboratórium nagymértékben specializált különleges óvintézkedések szerint mőködı laboratórium, amelyben a személyzet biztonságosan dolgozhat nagyon veszélyes anyagokkal, olyan mikrobákkal, amelyek potenciálisan súlyos járványos megbetegedések terjedését kezdeményezhetik. A 4. biológiai biztonsági szint 17
követelményeit kell érvényesíteni. A kolera, az AIDS kórokozója és az Ebola tipikusan ilyen fertızı ágensek. 1. táblázat: A fertızı ágensekkel szemben javasolt biológiai biztonsági szintek összefoglaló áttekintése Szint Szakmai gyakorlat és technikák Biztonsági felszerelések 1. Standard mikrobiológiai Csupán azok az elsıdleges munkaeszközök, melyek a gyakorlat nyitott munkaasztalon folytatott tevékenységhez szükségesek. 2. A 1. szint gyakorlata plusz: Már I. és II. osztályú biológiai laboröltözék, valamennyi biztonsági szekrények és olyan fertızı hulladék felszerelések használata is, dekontaminálása, a belépés melyek a munka során aeroszolokkal megszigorítása, védı kesztyők, keletkezı a szükséges veszély jelzések szemben a kezelıszemélyzet kiírása kitettségét megakadályozza. 3. A 2. szint gyakorlata plusz: I. és II. osztályú biológiai speciális laboratóriumi ruházat, biztonsági szekrények használata mindenféle fertızı ellenırzött bejárás a laborba anyaggal végrehajtott munkához 4. A 3. szint gyakorlata plusz: a Maximális biztonságot nyújtó laboratóriumba a belépés védelmi berendezés, így III. elıtéren keresztül, a távozáskor osztályú biológiai biztonsági zuhanyzó használata, a szekrények, vagy I. és II. munkatérbıl minden hulladék osztályúak azonban kombinálva csak dekontaminálva távolítható a dolgozó egész testét védı, el. biztosított légállású, pozitív légnyomású személyi védıöltözet 2.4.1. Mikroorganizmusok kockázati szint szerinti besorolása A világ egyik legnagyobb mikrobiológiai törzsgyőjteménye, az American Type Culture Collection (ATCC) a mikroorganizmusokat és a velük kapcsolatos termékeket a szállításuknál és kezelésüknél megkövetelendı biológiai biztonsági szintjük,- biosafety level (BSL) - szerint osztályozta, 18
és az általuk képviselt kockázat szerint 4 osztályba sorolta azokat. (Biosafety Levels, 2002) BSL-1: Biológiai hatóanyagok, melyek ismereteink szerint nem, vagy csak igen kis mértékő potenciális kockázatot jelentenek a velük foglalkozó személyekre és a környezetre. BSL-2: Biológiai hatóanyagok, amelyek mérsékelt potenciális kockázatot jelentenek a személyekre és a környezetre nézve. BSL-3: Biológiai hatóanyagok, amelyek potenciálisan komoly, vagy életveszélyes betegségeket okozhatnak. Ezek a hatóanyagok a levegıvel is terjedhetnek. BSL-4: Veszélyes és különleges biológiai hatóanyagok, amelyek a legnagyobb kockázatot jelentik a személyekre és a környezetre nézve. Általában halálos fertızést okoznak
19
3.
STERILEZÉS
Sterilezés alatt értjük a használt anyagok, eszközök teljes csíra- és spóramentesítését. A sterilezésre sokféle eljárás, módszer létezik. Ezekre szükség is van, mivel némely sterilezési eljárás bizonyos anyagokat nemkívánatos mértékben károsíthat, ezért a sterilezési eljárást mindig nagyon körültekintıen kell megválasztani. A sterilezés történhet fizikai vagy kémiai módszerekkel vagy ezek kombinált alkalmazásával. A fizikai módszerek közé tartozik a hıvel, sugárzással (UV-sugárzás, radioaktív sugárzás) és szőréssel történı sterilezés. A kémiai sterilezı anyagok lehetnek gázok vagy folyadékok. 3.1.
STERILEZÉS FIZIKAI MÓDSZEREKKEL
3.1.1. Sterilezés hıvel 3.1.1.1 Sterilezés nyílt lángban Nyílt lánggal gyorsan elérhetı a sterilitás a láng magas hımérséklete miatt. Alkalmazhatóságának is ez szab határt, mert csak nem gyulladó és nem bomló eszközök sterilezhetık vele. Az oltótőt, oltókacsokat, csipeszt izzítással sterilezzük, míg a tárgylemezt, fedılemezt és a táptalajt tartalmazó edény dugóját leégetéssel szabadítjuk meg a mikrobáktól.
3.1.1.2 Sterilezés nedves hıvel Nedves hıvel való sterilezéskor rövidebb idı alatt és alacsonyabb hımérsékleten érünk el ugyanolyan eredményt, mint száraz hıvel történı sterilezéskor. Táptalajok csak nedves hıben sterilezhetık. Ezen kívül minden olyan esetben ezt a módszert kell alkalmazni, amikor a sterilezendı eszközök vagy anyagok magasabb hımérsékleten károsodnak. a. Pasztırözés A pasztırözésnek több változata alakult ki. A 60-65 °C-on 30 percen át, a 70-75 °C-on 15 másodpercen át történı hıkezelés vagy a pillanatpasztırözés (85 °C, néhány másodperc) alkalmas a kezelt folyadékok csíraszámának jelentıs csökkentésére, de nem érhetı el vele sterilitás. Az ultrapasztırözés, amely során a kezelt folyadékot néhány másodpercre 135-150 °C-ra hevítik, már minden mikrobát elöl. b. Sterilezés áramló gızben A sterilezés áramló gızben légköri nyomáson 100 °C-on 30 percen át történik. A behatási idıt attól a pillanattól kell számítani, amikor a sterilezendı eszköz vagy anyag elérte a 100 °C-os hımérsékletet. A sterilezésnek ez a módja végezhetı autoklávban (fúvatás), vagy Kochfazékban. Ezt az eljárást kell alkalmazni szénhidrátot vagy ennél magasabb hımérsékletre érzékeny anyagot tartalmazó táptalajok sterilezésekor. c. Frakcionált sterilezés (tindallozás) Az Bacillus és Clostridium nemzetségbe tartozó baktériumok igen nagy ellenállóképességgel rendelkezı endospóráinak elpusztítására szolgál áramló gızben. Általában hıérzékeny anyagok és eszközök sterilezésekor alkalmazzák. A bakteriális endospórák azt a hıkezelést,
20
amin minden vegetatív baktérium elpusztul, túlélhetik. Ezért a sterilezendı anyagot vagy eszközt 3 napon át napi fél órára áramló gızbe kell helyezni. Az elsı napon a hevítés elpusztítja a vegetatív baktériumokat, a további hıkezelések pedig a spórákból kicsírázó baktériumokat. d. Kifızés A hıvel való sterilezés egyik legrégibb formája. Mőszerek, laboratóriumi eszközök és ruhanemők sterilezésére alkalmazható. A forrásban lévı víz 10-15 perc alatt elöli az összes mikrobát. A kifızés hatékonysága 2% szóda vagy bármilyen felületaktív detergens hozzáadásával növelhetı. e. Sterilezés gızzel, nyomás alatt (autoklávozás) A nedves hıvel való hıkezelés során a legellenállóbb spórás baktériumok elpusztításához 121 °C hımérséklet szükséges legalább 15 percig. Ahhoz, hogy ezt a hımérsékletet elérjük, a sterilezést megfelelı túlnyomáson szükséges végezni (105 Pa). Ennek eszköze az autokláv. Az autoklávok szelepekkel ellátott, hermetikusan zárható duplafalú nyomásálló készülékek, amelyekben gızt fejlesztünk. Az autokláv légtelenített zárt terében a nyomás a hevítés során növekszik, növelve ezzel a keletkezı gız hımérsékletét. Az üzemeltetés lépései: • Vízfeltöltés (desztillált vagy ioncserélt vízzel) • Felfőtés • Légtelenítés (levegı eltávolítása a légtelenítı szelepen át (5 perc), ha elérte a 100 °C-ot, ekkor a rakomány még csak 50-60 °C-os) • Hımérséklet-kiegyenlítés (a rakománynak el kell érnie az elıírt 121 °C, vagy 134 °C hımérsékletet) • Csírátlanítás (1AT – 121°C 30 perc pl. táptalajoknál; 2AT – 134 °C 10 perc) • Túlnyomás megszüntetése, ha a sterilezésre szánt anyagok hımérséklete már 80 °C alá süllyedt, szárítás Autoklávokban sterilezzük a táptalajokat, ha azok más módszert nem igényelnek. Sterilezésénél figyelembe vesszük a táptalajok alkotóelemeinek hıérzékenységét (lebomlanak-e?) és tárolóedényben levı mennyiségét. 1000 cm3-nél nagyobb volumenben táptalajokat ne sterilezzünk és ügyeljünk arra is, hogy az edényeket, lombikokat, kémcsöveket soha ne töltsük a közeggel színültig, mert térfogatukat változtatva kinyomhatják a dugókat és ki is futhatnak, másrészt a zárókupakos lombikokon a kupakot autoklávozás elıtt eresszük meg utána szorítsuk vissza. Autoklávokban sterilezzük továbbá az elpusztításra szánt tenyészeteket is. Ez utóbbiakat biztonsági okokból a kívánt hımérséklet elérése után nem 15, hanem 30 percen át kell sterilezni. Csomagolás nélkül eszközt, anyagot sterilezni nem szabad. A fentebb megadott behatási idık mindig attól a perctıl számítanak, amikor az autokláv munkaterében a hımérséklet már arra a fokra melegedett, mely megfelel az elérni kívánt túlnyomásnak. Az autokláv megbízható mőködését Geobacillus stearothermophilus-t tartalmazó ampullák segítségével ellenırizhetjük. 3.1.1.3 Sterilezés száraz hıvel A száraz hıvel történı sterilezést hılég-szekrényben végezzük. A hılég-szekrény termosztátos rendszerő, meghatározott hımérsékletre beállítható elektromos szekrény.
21
A hılég-sterilezıket elsısorban üvegáruk, fémeszközök és egyéb, magasabb hımérsékletet elbíró eszközök sterilezésére használjuk. A száraz hı felhasználható víztelenített anyagok, mint olajoknak, poroknak, zsíroknak kenıcsöknek a sterilezésére. Száraz hıvel a sterilezés tovább tart, mint nedvessel, tekintettel arra, hogy az elıbbi a mikroorganizmusokkal szemben kevésbé hatékony. Az üzemeltetés lépései: Elıkészítés, csomagolás (alumínium fólia, fémtok), munkatér megtöltése Felfőtés Hımérséklet kiegyenlítés Csírátlanítás Lehőtés Gravitációs (termikus hımozgás) típusú és cirkulációs (mechanikus levegımozgás) rendszerő hılég-sterilezıket különböztetünk meg. A cirkulációs hılég-sterilezıben azonos hımérsékleten mindig rövidebb a csírátlanításhoz szükséges idı (2. táblázat). 2. táblázat: A csírátlanítási szakasz hossza különbözı hıfokon 160°C
180 °C
200 °C
Gravitációs
120 perc
60 perc
30 perc
Cirkulációs
45 perc
25 perc
10 perc
3.1.2. Sterilezés sugárzással 3.1.2.1 Sterilezés ionizáló sugárzással (γγ) A nagy energiájú ionizáló sugárzások közül ipari méretekben a jó áthatolóképességő, rendszerint kobalt-izotópból származó gamma-sugárzást használják injekciós tők, fecskendık, kötszerek, gyógyszerek és egyes élelmiszerek (főszerek) sterilezésére. A gamma-sugárzás elınye, hogy a csomagoláson is áthatol, hátránya, hogy - mint minden radioaktív sugárzás - permanens, és minden irányba szóródik, ezért csak speciális körülmények között alkalmazható. 3.1.2.2 Sterilezés UV fénnyel A nem ionizáló sugárzások közül az. ultraibolya sugárzást használjuk csíramentesítésre Az UV-sugárzás teljes spektruma (136-400 nm) károsítja a sejteket, de a legjobb baktericid (baktériumölı) hatást a 250-280 nm hullámhosszú sugarakkal érhetjük le, ami fıként a DNSmolekulák károsításával magyarázható. Az UV (germicid)-lámpákat elterjedten alkalmazzák kórházakban, laboratóriumokban a légtér és felületek csíramentesítésére. Alkalmazhatóságának határt szab, hogy hatékonysága a fényforrástól távolodva négyzetes arányban csökken, áthatolóképessége kicsi, és hatékonyságát a felületeken található szennyezıdések a sugárelnyelés révén jelentısen csökkentik. Mindemellett tekintettel kell lenni arra, hogy az UV-sugárzás károsítja a szemet, és karcinogén hatása van, ezért az UVlámpa üzemeltetésekor lehetıség szerint a helyiséget el kell hagyni. Amennyiben erre nincs mód, UV-fényt szőrı szemüveget kell viselni.
22
3.1.3. Sterilezés szőréssel Folyékony és gáz halmazállapotú anyagok szőréssel is sterilezhetık. A szőrök pórusainak átmérıjét úgy kell megválasztani, hogy azon a baktériumok és más sejtes elemek ne juthassanak át. A bakteriológiában használt szőrık pórusátmérıje 0,22-0,65 µm között változik, a virológiai laboratóriumokban használt membránszőrık pórusnagysága azonban ennél lényegesen kisebb, 25-100 nm közötti, ami alkalmassá teszi ezeket a szőrıket a vírusok nagyság szerinti differenciált visszatartására (ultraszőrés). Korábban a szőrıket égetett agyagból, kovaföldbıl vagy mázatlan porcelánból készítették, ma már ezek helyett üvegszálból készített szőrıket, Seitz-féle szőrıket, vagy membránfiltereket használnak. A Seitz-féle szőrık azbesztbıl préselt korongok, egyszer használatosak. Az üvegszőrık szőrıfelülete préselt üveghab vagy üvegszál. Elınyük, hogy többször használhatók, használat után felületüket kénsavas és vizes öblítéssel a visszamaradt anyagoktól meg kell tisztítani. A membránszőrık cellulóz-észterbıl készült vékony filterek. Egyszer használatos szőrık. Elınyük, hogy pórusátmérıjük szabályozható, egy-egy szőrınél valamennyi pórus azonos mérető, a szőrés rajtuk keresztül gyors, a szőrendı folyadékból keveset adszorbeálnak, felhasználásuk sokrétő. Kaphatók ipari szőrésre megfelelı mérető és laboratóriumban használatos formában is (fecskendıre rögzíthetı, vákuumszőrésre alkalmas stb). A membránszőrık segédeszközként felhasználhatók kis baktériumtartalmú folyadékok csíraszámának meghatározásakor is. Errıl a kérdésrıl részletesebben az "Ivóvíz összes csíraszámának meghatározása membránszőréses módszerrel" címő fejezetben lesz szó.
3.2.
STERILEZÉS KÉMIAI MÓDSZEREKKEL
A kémiai anyagok széles köre alkalmas a baktériumok gátlására. Az anyagok egy része csupán szaporodásában gátolja a baktériumokat (bakteriosztatikus hatás), más része viszont elöli (baktericid hatás). Az, hogy egy anyag sztatikus vagy cid hatású, az anyagi minıségen kívül függ a koncentrációtól és a hatóidıtıl is. Értelemszerően kémiai sterilezésre csak cid hatású anyagok alkalmasak. Ezekkel szembeni követelmény, hogy hatásuk széles spektrumú legyen, emberre, állatra és növényre ártalmatlanok, környezetkímélık, könnyen kezelhetıek és gazdaságosak legyenek. Ezek a vegyi anyagok a baktériumok fehérjéit denaturálják, enzimreakcióikat gátolják, mutagének, vegyülnek a sejt anyagaival. A kémiai sterilizálást táptalajok készítésénél nem lehet használni, mivel a kitenyésztendı mikrobák szaporodását is gátolják. A kémiai sterilezésre használt anyagok hatása a koncentráció és az idı függvénye. Alkalmazhatók nehézfémsók (HgCl2, AgNO3), oxidálószerek (KMnO4, H2O2), halogének (klór, jód), szerves oldószerek (pl. 70%-os etanol, dimetilszulfoxid), a fenol 3%-os vizes oldata (karbol), a formalin 3%-os vizes oldata; gáz (etilénoxid). A neomagnol (benzolszulfonkloramid-nátrium) 0,1%-os vizes oldatában a keletkezı NaOCl a fehérjék aminocsoportjait klórozza. Megfelelı koncentrációban sporocid. Hatástalanítja a toxinokat is. A folyékony szereket fıként felületek sterilezésére és kézfertıtlenítésre használják. A gáz halmazállapotú fertıtlenítıszerek jelentıségét az un. gázsterilizáló berendezések adják. Ezek fıként etilén-oxiddal mőködnek. Az etilén-oxid elınye, hogy 650-1200 mg/1 koncentrációban 40-55 °C-on (hideg sterilezés) 2-6 óra alatt sterilez, így hıérzékeny eszközök (pl. hıre lágyuló mőanyagok) csíramentesítésére is alkalmas. Hátránya, hogy az etilén-oxid
23
belélegezve tüdıödémát okoz, ezért alkalmazása nagy körültekintést igényel. Az így sterilezett anyagokat etilén-oxid mentesíteni kell szellıztetéssel. Plazmasterilezés A plazmasterilezı eljárás alacsony, mintegy 46 ± 4°C hımérsékleten, elektromos erıtér hatására létrehozott hidrogénperoxid plazma-állapotát alkalmazza alacsony páratartalmú közegben csíramentesítésre. A gázalakú plazmát általában az anyag negyedik halmaz-állapotának tekintik, amely ionfelhıbıl, elektronokból és semleges atomi részecskékbıl áll. Az anyagnak ez a halmazállapota elektromos erıtér, vagy mágneses erıtér hatására jön létre. (A természetes úton létrejövı plazmára példa a jól ismert természeti jelenség, mely a Föld északi pólusán észlelhetı, az aurora borealis, azaz az északi fény.) Az alacsony hımérséklető H2O2 plazma aktív szabad gyökei hatékonyan elpusztítják a vírusokat, baktériumokat, spórákat, steril állapotot hozva létre. A folyamat végén vízpára és O2 marad vissza, a rakomány száraz, azonnal használható, illetve a hatékony csomagolás révén szállítható és a kívánt ideig tárolható. 4.
ESZKÖZÖK TISZTÍTÁSA ÉS ELİKÉSZÍTÉSE
A már használt edényeket, ha bennük mikroorganizmus tenyészet van, elıbb autoklávban csírátlanítani kell és csak azután szabad kinyitni, kiönteni és elmosni. Az elıször használatba kerülı üvegárut a könnyen leadható alkáli tartalmától mentesíteni kell. E célból 3%-os sósavban fél órán át forraljuk, majd alaposan kiöblítjük. 4.1.
ÜVEGEDÉNYEK TISZTÍTÁSA
A tisztítás mosogatással történik, amelynek 5 munkafázisa van: 1. Kiöntés: az autoklávból kiszedett kémcsövekbıl, lombikokból kiöntjük a bennük lévı anyagot a szennyvízkiöntıbe. 2. Áztatás: az eszközöket melegvizes detergens oldatban áztatjuk. A pipettákat a pipettamosó készülékben áztatjuk. Erısen szennyezett üvegedényeknél és a pipettáknál az elızetes krómkénsavas áztatás is szükséges. 3. Mosogatás: a mosogatás szintén detergens oldatban történik. 4. Öblítés: a felületaktív anyagok, mindenekelıtt a mosogató-tisztitószerekben levı detergensek az üveghez nagyon erısen tapadnak, így a bakteriológiai vizsgálatokat zavarhatják. Az elmosott üvegedényeket elıször meleg csapvízbe alaposan kiöblítjük, majd ezt követıen a többszöri desztillált vizes (vagy ionmentesített vizes) öblítés. 5. Szárítás. 4.2. TÁRGY ÉS FEDİLEMEZEK TISZTÍTÁSA A mikroszkópi vizsgálathoz használt tárgy vagy fedılemezekrıl legjobb, ha vizsgálat után azonnal letöröljük az immerziós olajat benzines vattával. Azután ULTRÁS vízben áztatjuk. Kerüljük a nagy lúgkoncentrációjú oldatban való áztatást, mert homályossá teszi azokat. A tárgylemezeket rendszerint még külön krómkénsavban is áztatjuk. A fedılemezeket nem szükséges. Ezután a lemezeket a szokásos módon melegvizes detergens oldatban elmossuk. Mosás után desztillált vízzel alaposan leöblítjük a fedı – és tárgylemezeket. A megszáradt fedılemezeket
24
felhasználásig kis mőanyagdobozban tartjuk. A tiszta tárgylemezeket szokás alkoholba téve tárolni a felhasználásig. 5.
MINTAVÉTEL ÉS MINTAELİKÉSZÍTÉS
A mintavétel az a mővelet, aminek során valamilyen nagyobb egységbıl azzal azonos összetételő, tulajdonságú és állapotú, de kisebb mennyiségő, a vizsgálat mindenkori céljának megfelelı részt, a mintát elkülönítik. Azt a nagyobb egységet, amelybıl a mintát elkülönítették, mintavételi alapnak nevezzük. A mintavételt megfelelı szakmai képesítéssel és gyakorlattal rendelkezı szakembernek kell végeznie. A nem szakember által vett minta vizsgálatának eredményét csak tájékoztató jellegő eredményként fogadhatjuk el. A mintákat minden esetben úgy kell vennünk, hogy az jól reprezentálja az adott területet, réteget, stb. egyáltalában a megmintázandó objektumot. Ezért a mintavételezést rendkívül körültekintıen, elıre elkészített terv szerint kell elvégezni. A mikrobiológiai vizsgálatra történı élelmiszerminta, talaj- és vízminta vételnél, és az ahhoz kapcsolódó tevékenységeknél gondoskodni kell arról, hogy a minta mikrobiológiai összetétele ne változzon meg Ennek feltétele, hogy a mintavétel során használt eszközök és tartályok megfelelı tisztaságúak és sterilek legyenek. Közös edény használata kémiai és mikrobiológiai vizsgálathoz csak úgy lehetséges, ha a mikrobiológiai szempontokat figyelembe veszik. A mikrobiológiai vizsgálatokhoz az edényt, vagy tasakot csak kb. 5/6-áig töltjük meg élelmiszerrel, hogy a röviddel a vizsgálat elıtt szükséges összekeverést megkönnyítsük. A mintákat fényt át nem eresztı, szigetelt tartóban kell szállítani, hogy a mintavétel után a minta csíratartalmának változását lehetıleg elkerüljük. Minden esetben gondoskodni kell a minta megfelelı hőtésérıl (4 °C) közvetlenül a mintavételtıl egészen a vizsgálatig. Talajmintát a helyszínen sterilizált (borszesz, alkoholos vatta, vagy gázégıvel alaposan leégetett) ásóval, talajmintavevıvel vegyük. A mintákat elıre (laboratóriumban) sterilizált bádog, vagy üvegedényekben szállítsuk a feldolgozás helyére. Víz- és ételminták esetében is ügyelnünk kell a sterilitásra. Célszerő ha pl. a vízcsapot, mintavevı eszközöket a helyszínen gázlánggal sterilizáljuk és a mintákat az elıre, alufóliával bevont (azzal együtt) sterilezett edényekbe vesszük. A minták számát a körülmények és a célkitőzés határozzák meg. Érdemes minden mintavételi helyrıl két (párhuzamos) mintát venni. Ez az átlagolást elısegíti, illetve a biztonságot növeli. A vízminta vételét helyszíni szemlével kell összekötni. A helyszíni szemle alkalmával meg kell állapítani a vízszolgáltató berendezések minden egészségügyi szempontból fontos mőszaki adatát, a víz esetleges kezelési módját, és meg kell vizsgálni a víznyerı hely környezetét az esetleges szennyezıdési lehetıségek szempontjából. Fertıtlenített víz mintázása esetén mérni kell a fertıtlenítıszer maradékkoncentrációját. A mintavétel során a sterilitás szabályait be kell tartani. Vízcsapról történı mintavétel esetében a csapot le kell égetni, és a vizet legalább 5 percig folyatni kell. Robbanásveszély esetén a leégetést alkoholos vattával való gondos törlés helyettesítheti. Vízmintavételre csak fehér, átlátszó, tisztára mosott és sterilezett üvegeket szabad használni. Mintavételkor az üveget nem szabad teljesen színültig tölteni, legalább 5 ml légteret kell a dugó alatt hagyni, hogy a mintát rázással homogenizálni lehessen. A mintákat olyan jelzéssel kell ellátni, ami tartalmazza: • a mintavétel helyét és idejét, • a minta sorszámát, egyéni jelét, • a mintavevı(k) névaláírását. A mintákat a laboratóriumba érkezésük után lehetıleg azonnal vizsgálat alá kell vetni. Ha ez nem lehetséges, akkor hőtıszekrényben 4 ° C-on kell tárolni. A mintavétel és a vizsgálat
25
ideje között gondos hőtés esetén sem telhet el több, mint 24 óra Ha ezen feltételek nem betarthatók, akkor a mikrobiológiai vizsgálatot le kell mondani. A mintaelıkészítés során a beküldött mintából aszeptikus körülmények között vesszük ki a vizsgálandó mintarészt. A reprezentatív minta legalább 200 g illetve cm3 legyen. A szilárd halmazállapotú mintát fel kell aprítani és összekeverni. Az elıkészített mintából 10 ± 0,1 g-ot a vizsgálathoz steril Stomacher-tasakba kell mérni, majd 9-szeres mennyiségő hígítóoldattal kiegészíteni, és a minta állagától függıen beállított fokozattal és idıtartammal homogenizálni. A hígítófolyadék hımérséklete 10-20 °C legyen. A beküldött folyékony mintát a vizsgálati minta kivétele elıtt alaposan át kell keverni, majd rövid ideig állni hagyni, hogy a légbuborékok felszállhassanak. Sőrőn folyó minta esetén azt elıre sterilezett, vagy alkoholban zsírtalanított és alaposan lelángolt, majd lehőlt fém spatulával vagy kanállal meg kell keverni. Ezt követıen a minta, steril pipettával kimért 10 ± 0,1 cm3 mennyiségébıl el kell készíteni a törzsoldatot (kiindulási hígítás) a szilárd mintáknál leírtakkal azonos módon. Az elkészített törzsoldat képezi a további vizsgálathoz az alapot.
26
