MIKROBIOLOGIAI MUNKAVÉDELMI RENDSZABÁLYOK A bakteriológiai laboratóriumokban dolgozók a mikroorganizmusok többféle terjesztı közegével kerülhetnek érintkezésbe. Bár a mikrobiológiai gyakorlatok során patogén baktériumokkal nem dolgozunk, a mikrobiológiai munka minden fázisa egészségkárosodási lehetıséget rejt magában. Ezért ismerniük kell azokat a módszereket, eljárásokat és rendszabályokat, amelyek a biztonságos munkavégzéshez nélkülözhetetlenek. Az alábbi rendszabályok merev, feltétel nélküli betartásával kell a magunkat és társainkat érintı veszélyforrásokat kiküszöbölni: 1) Minden mikrobiológiai preparátumot és tenyészetet potenciális fertızési forrásnak kell tekinteni! 2) Patogén laboratóriumban enni, inni, élelmiszert tárolni, laboratóriumi edényzetet e célra használni, valamint dohányozni tilos. 3) A mikrobiológiai munka során ügyelni kell arra, hogy lehetıség szerint ne fertızıdhessen a felszerelés, a bútorzat, testünk bármely része vagy a légtér. Ezért: • A fertızı munkafolyamat alatt védıöltözet viselése kötelezı. • A mikrobatenyészetek csak megfelelıen lezárt edényzetben tárolhatók. • Mikroorganizmusokat tartalmazó tápközegeket a lefolyóba önteni szigorúan tilos! • A munka befejezése után a munkafelület fertıtlenítése és fertıtlenítıszeres kézmosás kötelezı. • Ha a vizsgálati anyag, baktériumtenyészet elcseppen, kifolyik, vagy a beoltott táptalajt ill. fertızött anyagot tartalmazó üvegnemő eltörik, a laboratórium padlójára, ill. tárgyaira jutott anyagot és a szétszóródás helyét, környezetét Neomagnol-oldattal leöntve (vagy abba beáztatva) kell fertıtleníteni. Takarítani csak 1 órás fertıtlenítés után szabad. 4) A tenyészeteket tartalmazó edények és eszközök csak sterilezés után mosogathatók el. 5) Kaccsal végzett átoltásokat megelızıen a kacson maradt fertızı anyagot elıször a Bunsen-égı lángjának alsó részében meg kell szárítani a mikroorganizmusok szétfreccsenésének megelızése érdekében, majd fel kell izzítani. ' 6) Folyékony táptalajból üvegbottal történı szélesztéskor a baktériumokat tartalmazó cseppek szétszóródása miatt fokozott figyelemmel kell eljárni. 7) Élı kórokozót vagy toxint tartalmazó vizsgálati anyagokat kizárólag ballonnal ellátott vattaszőrıs pipettával vagy automata pipettával szabad felszívni; a pipettát használat után fertıtlenítı oldatba kell meríteni. 8) Élı tenyészetek keverı géppel történı homogenizálásától óvakodni kell. Ha ez mégis szükséges, csak dugóval vagy jól záró kupakkal ellátott üvegedényben szabad a keverést elvégezni. 9) Bármely sérülést, fertızıdést az oktatónak azonnal jelenteni kell! Ha fertızı anyag sértetlen bırre került, azt a ruházat eltávolítása után 0,2 %-os Neomagnol-oldattal vagy ezzel átitatott vattával le kell mosni, majd vízcsap alatt szappannal alaposan meg kell mosakodni. Ha a fertızı anyag a szembe jutott, mindkét szemet vízcsap alatt langyos vízzel vagy steril élettani konyhasó-oldattal - a dörzsölést kerülve - ki kell mosni. Baktérium szuszpenziók szájba szívása vagy lenyelése esetén a szájat elıször vízzel alaposan ki kell öblíteni, majd 0,02-0,05 %-os KMnO4-oldattal 1-2 percig öblögetni. Vizet vagy folyadékot a gyomornedv hígulása miatt itatni nem szabad. Felszíni sérüléseket jódtinktúrával kell ecsetelni.
MIKROBIOLÓGIAI LABORATÓRIUM A MIKROBIOLÓGIAI LABORATÓRIUM FELÉPÍTÉSE, FİBB MUNKAFOLYAMATAI Mikrobiológiai laboratórium alatt nemcsak szőken azt a helyiséget kell érteni, ahol a mikroorganizmusokkal kapcsolatos vizsgálatok zajlanak, hanem a vele szerves egységet képezı járulékos helyiségeket is, mint az elıkészítı, a mérlegszoba, a mosogató és a sterilezı. A laboratórium kialakítását általában a helyi adottságok, lehetıségek befolyásolják. Ezek figyelembevételével kell olyan elrendezést kialakítani, amely lehetıvé teszi a biztonságos munkavégzést. Ennek érdekében a szőkebben értelmezett mikrobiológiai munka céljára szolgáló steril övezetet el kell különíteni a már elszaporodott mikroorganizmusokat tartalmazó edények és eszközök kezelését szolgáló helyiségektıl. Mikrobiológiai vizsgálatokkal foglalkozó laboratóriumokban az alábbi fıbb munkafolyamatok zajlanak: • Táptalaj fızés és sterilezés: a vizsgálatokhoz szükséges táptalajok és hígítófolyadékok elkészítése és a bennük lévı eredeti mikroflóra elpusztítása. • Mintaelıkészítés: mikrobiológiai minta vétele, aprítás, homogenizálás, alaphígítás elkészítése stb. • Leoltás: az elıkészített mikrobiológiai mintából illetve annak megfelelı hígításaiból elıírt mennyiség különbözı mikrobacsoportok meghatározása érdekében történı megfelelı tápközegekbe való oltása. • Inkubálás: a beoltott táptalajok a mikroba számára optimális hımérsékleten történı tárolása a mikroorganizmus elszaporodásáig. • Kiértékelés: az elszaporodott tenyészetek vizsgálata alapján a mikroorganizmusok számának, vagy jelenlétének megállapítása. • Identifikálás: a kitenyésztett baktériumok azonosítása morfológiai, biokémiai, szerológiai stb. vizsgálatokkal. • Sterilezés: A kiértékelt tenyészetekben és a vizsgálathoz felhasznált eszközökön lévı mikrobák elpusztítása (121 °C, 30 perc). • Mosogatás: Az elızetes használat után már sterilezett edényzet elmosása, új edényzet és eszközök elıkészítése. • Eszközök sterilezése: száraz mikroorganizmusok elpusztítása.
üvegedények
és
eszközök
felületén
levı
• Törzsfenntartás: a különbözı célokat szolgáló mikroorganizmusok (pl. tejipari kultúrák, referenciatörzsek stb.) színtenyészeteinek folyamatos fenntartása, szükség esetén elszaporítása. A fenti mőveleteken kívül - a laboratórium jellegétıl függıen (kutató, oktató stb.) nagyon sok egyéb munkafolyamat is lehetséges, amelyre itt nem térünk ki. Az említett mőveletek közül a mintaelıkészítés és a leoltás mindenképpen olyan körülményeket igényel, amelyek kizárják a vizsgált anyag utólagos fertızıdését, ezért ezt egy külön, erre a célra szolgáló helyiségben célszerő elvégezni. Hasonló módon a steril munkavégzés igénye miatt külön helyiség szükséges a törzsfenntartó mőveletekhez. A beoltott tápközegek inkubálása és kiértékelése fertızési forrást jelent, ezért ezt a steril munkafolyamatoktól elkülönítetten kell végezni. Általában a táptalajfızést és sterilezést is külön helyiségben végzik, mivel az egyes táptalajkomponensek fertızési veszélyt jelentenek. A kiértékelt tenyészetek és használt eszközök sterilezését a laboratórium többi részétıl megfelelıen elválasztott helyiségben kell végezni. A laboratórium belsı munkarendjének és a helyiségek funkciójának kialakításakor úgy kell eljárni, hogy a szennyezett edények és eszközök ne kerülhessenek érintkezésbe a steril eszközökkel. III. STERILEZÉS Sterilezés alatt értjük a használt anyagok, eszközök teljes csíra- és spóramentesítését. A sterilezésre sokféle eljárás, módszer létezik. Ezekre szükség is van, mivel némely sterilezési eljárás bizonyos anyagokat nemkívánatos mértékben károsíthat, ezért a sterilezési eljárást mindig nagyon körültekintıen kell megválasztani. A sterilezés történhet fizikai vagy kémiai módszerekkel. A fizikai módszerek közé tartozik a hıvel, sugárzással (UV-sugárzás, radioaktív sugárzás) és szőréssel történı sterilezés. A kémiai sterilezı anyagok lehetnek gázok vagy folyadékok. STERILEZÉS FIZIKAI MÓDSZEREKKEL 1. Sterilezés hıvel
1.1. Sterilezés nyílt lángban Nyílt lánggal gyorsan elérhetı a sterilitás a láng magas hımérséklete miatt. Alkalmazhatóságának is ez szab határt, mert csak nem gyulladó és nem bomló eszközök sterilezhetık vele. Oltótők és kacsok, valamint csipeszek sterilezésére, szájának lelángolására használjuk a mikrobiológiai munka közben. 1.2. Sterilezés száraz hıvel
A száraz hıvel történı sterilezést hılégszekrényben végezzük. A hılégszekrény termosztátos rendszerő, meghatározott hımérsékletre beállítható elektromos szekrény. A hılég-sterilizátorokat elsısorban üvegáruk, fémeszközök és egyéb, magasabb hımérsékletet elbíró eszközök sterilezésére használjuk. A spórás baktériumok biztos elpusztításához 180 °C-on 120 perces kezelés szükséges. 1.3. Sterilezés nedves hıvel Nedves hıvel való sterilezéskor rövidebb idı alatt és alacsonyabb hımérsékleten érünk el ugyanolyan eredményt, mint száraz hıvel történı sterilezéskor. Táptalajok csak nedves hıben sterilezhetık. Ezen kívül minden olyan esetben ezt a módszert kell alkalmazni, amikor a sterilezendı eszközök vagy anyagok magasabb hımérsékleten károsodnak. 1.3.1. Pasztırözés A pasztırözésnek több változata alakult ki. A 60-65 °C-on 30 percen át, a 70-75 °C-on 15 másodpercen át történı hıkezelés vagy a pillanatpasztırözés (85 °C, néhány másodperc) alkalmas a kezelt folyadékok csíraszámának jelentıs csökkentésére, de nem érhetı el vele sterilitás. Az ultrapasztırözés, amely során a kezelt folyadékot néhány másodpercre 135150 °C-ra hevítik, már minden mikrobát elöl. 1.3.2. Sterilezés áramló gızben A sterilezés áramló gızben légköri nyomáson 100 °C-on 30 percen át történik. A behatási idıt attól a pillanattól kell számítani, amikor a sterilezendı eszköz vagy anyag elérte a 100 °C-os hımérsékletet. A sterilezésnek ez a módja végezhetı autoklávban (fúvatás), vagy Koch-fazékban. Ezt az eljárást kell alkalmazni szénhidrátot vagy ennél magasabb hımérsékletre érzékeny anyagot tartalmazó táptalajok sterilezésekor. 1.3.3. Frakcionált sterilezés (tindallozás) Az Bacillus és Clostridium nemzetségbe tartozó baktériumok igen nagy ellenállóképességgel rendelkezı endospóráinak elpusztítására szolgál áramló gızben. Általában hıérzékeny anyagok és eszközök sterilezésekor alkalmazzák. A bakteriális endospórák azt a hıkezelést, amin minden vegetatív baktérium elpusztul, túlélhetik. Ezért a sterilezendı anyagot vagy eszközt 3 napon át napi fél órára áramló gızbe kell helyezni. Az elsı napon a hevítés elpusztítja a vegetatív baktériumokat, a további hıkezelések pedig a spórákból kicsírázó baktériumokat. 1.3.4. Kifızés A hıvel való sterilezés egyik legrégibb formája. Mőszerek, laboratóriumi eszközök és ruhanemők sterilezésére alkalmazható. A forrásban lévı víz 10-15 perc alatt elöli az összes
mikrobát. A kifızés hatékonysága 2 % szóda vagy bármilyen felületaktív detergens hozzáadásával növelhetı. 1.3.5. Sterilezés gızzel, nyomás alatt A nedves hıvel való hıkezelés során a legellenállóbb spórás baktériumok elpusztításához 121 °C hımérséklet szükséges legalább 15 percig. Ahhoz, hogy ezt a hımérsékletet elérjük, a sterilezést megfelelı túlnyomáson szükséges végezni (105 Pa). Ennek eszköze az autokláv. Az autoklávok szelepekkel ellátott, hermetikusan zárható duplafalú nyomásálló készülékek, amelyekben gızt fejlesztünk. Az autokláv zárt terében a nyomás a hevítés során növekszik, növelve ezzel a keletkezı gız hımérsékletét. Autoklávokban sterilezzük a táptalajokat, ha azok más módszert nem igényelnek, valamint az elpusztításra szánt tenyészeteket is. Ez utóbbiakat biztonsági okokból a kívánt hımérséklet elérése után nem 15, hanem 30 percen át kell sterilezni. 2. Sterilezés sugárzással 2.1. Sterilezés ionizáló sugárzással (γ); A nagy energiájú ionizáló sugárzások közül ipari méretekben a jó áthatolóképességő, rendszerint kobalt-izotópból származó gamma-sugárzást használják injekciós tők, fecskendık, kötszerek, gyógyszerek és egyes élelmiszerek (főszerek) sterilezésére. A gamma-sugárzás elınye, hogy a csomagoláson is áthatol, hátránya, hogy - mint minden radioaktív sugárzás - permanens, és minden irányba szóródik, ezért csak speciális körülmények között alkalmazható. 2.2. Sterilezés UV fénnyel A nem ionizáló sugárzások közül az. ultraibolya sugárzást használjuk csíramentesítésre Az UV-sugárzás teljes spektruma (136-400 nm) károsítja a sejteket, de a legjobb baktericid (baktériumölı) hatást a 250-280 nm hullámhosszú sugarakkal érhetjük le, ami fıként a DNS-molekulák károsításával magyarázható. Az UV (germicid)-lámpákat elterjedten alkalmazzák kórházakban, laboratóriumokban a légtér és felületek csíramentesítésére. Alkalmazhatóságának határt szab, hogy hatékonysága a fényforrástól távolodva négyzetes arányban csökken, áthatolóképessége kicsi, és hatékonyságát a felületeken található szennyezıdések a sugárelnyelés révén jelentısen csökkentik. Mindemellett tekintettel kell lenni arra, hogy az UV-sugárzás károsítja a szemet, és karcinogén hatása van, ezért az UVlámpa üzemeltetésekor lehetıség szerint a helyiséget el kell hagyni. Amennyiben erre nincs mód, UV-fényt szőrı szemüveget kell viselni. 3. Sterilezés szőréssel Folyékony és gáz halmazállapotú anyagok szőréssel is sterilezhetık. A szőrök pórusainak átmérıjét úgy kell megválasztani, hogy azon a baktériumok és más sejtes elemek ne juthassanak át. A bakteriológiában használt szőrık pórusátmérıje 0,22-0,65 µm között
változik, a virológiai laboratóriumokban használt membránszőrık pórusnagysága azonban ennél lényegesen kisebb, 25-100 nm közötti, ami alkalmassá teszi ezeket a szőrıket a vírusok nagyság szerinti differenciált visszatartására (ultraszőrés). Korábban a szőrıket égetett agyagból, kovaföldbıl vagy mázatlan porcelánból készítették, ma már ezek helyett üvegszálból készített szőrıket, Seitz-féle szőrıket, vagy membránfiltereket használnak. • A Seitz-féle szőrık azbesztbıl préselt korongok, egyszer használatosak. • Az üvegszőrık szőrıfelülete préselt üveghab vagy üvegszál. Elınyük, hogy többször használhatók, használat után felületüket kénsavas és vizes öblítéssel a visszamaradt anyagoktól meg kell tisztítani. • A membránszőrık cellulóz-észterbıl készült vékony filterek. Egyszer használatos szőrık. Elınyük, hogy pórusátmérıjük szabályozható, egy-egy szőrınél valamennyi pórus azonos mérető, a szőrés rajtuk keresztül gyors, a szőrendı folyadékból keveset adszorbeálnak, felhasználásuk sokrétő. Kaphatók ipari szőrésre megfelelı mérető és laboratóriumban használatos formában is (fecskendıre rögzíthetı, vákuumszőrésre alkalmas stb). A membránszőrık segédeszközként felhasználhatók kis baktériumtartalmú folyadékok csíraszámának meghatározásakor is. Errıl a kérdésrıl részletesebben az "Ivóvíz összes csíraszámának meghatározása membránszőréses módszerrel" címő fejezetben lesz szó. STERILEZÉS KÉMIAI MÓDSZEREKKEL A kémiai anyagok széles köre alkalmas a baktériumok gátlására. Az anyagok egy része csupán szaporodásában gátolja a baktériumokat (bakteriosztatikus hatás), más része viszont elöli (baktericid hatás). Az, hogy egy anyag sztatikus vagy cid hatású, az anyagi minıségen kívül függ a koncentrációtól és a hatóidıtıl is. Értelemszerően kémiai sterilezésre csak cid hatású anyagok alkalmasak. Ezekkel szembeni követelmény, hogy hatásuk széles spektrumú legyen, emberre, állatra és növényre ártalmatlanok, környezetkímélık, könnyen kezelhetıek és gazdaságosak legyenek. A kémiai sterilezésre használt anyagok lehetnek folyékony vagy gáz halmazállapotúak. A folyékony szereket fıként felületek sterilezésére és kézfertıtlenítésre használják. A gáz halmazállapotú fertıtlenítıszerek jelentıségét az un. gázsterilizáló berendezések adják. Ezek fıként etilén-oxiddal mőködnek. Az etilén-dioxid elınye, hogy 500 mg/1 koncentrációban 20 °C-on (hideg sterilezés) 4-5 óra alatt sterilez, így hıérzékeny eszközök (pl. hıre lágyuló mőanyagok) csíramentesítésére is alkalmas. Hátránya, hogy az etilén-oxid belélegezve tüdıödémát okoz, ezért alkalmazása nagy körültekintést igényel. IV. MINTAELİKÉSZÍTÉS A mikrobiológiai vizsgálatra történı élelmiszerminta, talaj- és vízminta vételnél, és az ahhoz kapcsolódó tevékenységeknél gondoskodni kell arról, hogy a minta mikrobiológiai összetétele ne változzon meg Ennek feltétele, hogy a mintavétel során használt eszközök és tartályok megfelelı tisztaságúak és sterilek legyenek. Közös edény használata kémiai és mikrobiológiai vizsgálathoz csak úgy lehetséges, ha a mikrobiológiai szempontokat figyelembe veszik. A mikrobiológiai vizsgálatokhoz az edényt, vagy tasakot csak kb. 5/6-
áig töltjük meg élelmiszerrel, hogy a röviddel a vizsgálat elıtt szükséges összekeverést megkönnyítsük. A mintákat fényt át nem eresztı, szigetelt tartóban kell szállítani, hogy a mintavétel után a minta csíratartalmának változását lehetıleg elkerüljük. Minden esetben gondoskodni kell a minta megfelelı hőtésérıl (4 °C) közvetlenül a mintavételtıl egészen a vizsgálatig. A mintákat a laboratóriumba érkezésük után lehetıleg azonnal vizsgálat alá kell vetni. Ha ez nem lehetséges, akkor hőtıszekrényben 4 ° C-on kell tárolni. A mintavétel és a vizsgálat ideje között gondos hőtés esetén sem telhet el több, mint 24 óra Ha ezen feltételek nem betarthatók, akkor a mikrobiológiai vizsgálatot le kell mondani. A beküldött mintából aszeptikus körülmények között vesszük ki a vizsgálandó mintarészt. A reprezentatív minta legalább 200 g illetve ml legyen. A szilárd halmazállapotú mintát fel kell aprítani és összekeverni. Az elıkészített mintából 10 ± 0,1 g-ot a vizsgálathoz steril Stomacher-tasakba kell mérni, majd 9-szeres mennyiségő hígítóoldattal kiegészíteni, és a minta állagától függıen beállított fokozattal és idıtartammal homogenizálni. A hígítófolyadék hımérséklete 10-20 °C legyen. A beküldött folyékony mintát a vizsgálati minta kivétele elıtt alaposan át kell keverni, majd rövid ideig állni hagyni, hogy a légbuborékok felszállhassanak. Sőrőn folyó minta esetén azt elıre sterilezett, vagy alkoholban zsírtalanított és alaposan lelángolt, majd lehőlt fém spatulával vagy kanállal meg kell keverni. Ezt követıen a minta, steril pipettával kimért 10 ± 0,1 ml mennyiségébıl el kell készíteni a törzsoldatot (kiindulási hígítás) a szilárd mintáknál leírtakkal azonos módon. Az elkészített törzsoldat képezi a további vizsgálathoz az alapot.
