DOKTORI ÉRTEKEZÉS. A sejtszaporodás reakciókinetikai modelljei

DOKTORI ÉRTEKEZÉS

A sejtszaporodás reakciókinetikai modelljei

Novák Béla

Budapesti Mûszaki Egyetem Mezõgazdasági Kémiai Technológia Tanszék

1998

TARTALOM

Rövidítések és nomenklatúra_____________________________________________ 3 1. Bevezetés___________________________________________________________ 5 2. A sejtciklus _________________________________________________________ 8 2.1. A sejtciklus fiziológiája_____________________________________________ 8 2.1.1. Kromoszómás ciklus _________________________________________________________________8 2.1.2. Növekedési ciklus __________________________________________________________________10 2.1.3. A növekedési és kromoszómás ciklus összehangolása ___________________________________11 2.1.4. Ellenõrzési mechanizmusok az eukarióta sejtciklusban__________________________________13

2.2. A sejtszaporodást szabályozó molekulák _____________________________ 14 2.2.1. Ciklin-függõ protein-kinázok és ciklinek ______________________________________________14 2.2.2. Az Anafázis Serkentõ Komplex (APC)_________________________________________________17

2.3. A DNS-replikáció két lépéses iniciációja______________________________ 18

3. A matematikai leírás szükségessége ____________________________________ 21 3.1. A reakciókinetika alkalmazhatósága _________________________________ 21

4. A primitív eukarióta sejt ciklusa _______________________________________ 23 4.1. Hiszterézis a primitív eukarióta sejtciklus modellben____________________ 31

5. A sztöhiometrikus Cdk inhibitor szerepe ________________________________ 32 5.1. A sarjadzó élesztõ sejtciklusának modellje ____________________________ 37

6. A CDK foszforilezés szerepe___________________________________________ 42 6.1. Az embrionális sejtciklus __________________________________________ 46 6.2. Küszöbértékek, bistabilitás és hiszterézis mitózis kontrollban_____________ 52 6.3. Embrionális fejlõdésmenet_________________________________________ 56 6.4. Ellenõrzési pontok az embrionális ciklusban___________________________ 59

7. A CDK inhibitor és a CDK foszforilezés együttes hatása ___________________ 62 7.1. A hasadó élesztõ sejtciklusának modellezése _________________________ 62 7.2. Mitózis kontroll _________________________________________________ 67 7.3. A G1/S kontroll__________________________________________________ 71 7.4. S-fázisú ciklin szerepe ____________________________________________ 74

8. Emlõssejtek ciklusának modellje_______________________________________ 78 9. Összefoglalás ______________________________________________________ 90 10. Irodalomjegyzék ___________________________________________________ 94 11. Köszönetnyilvánítás _______________________________________________ 101

2

Rövidítések és nomenklatúra Az értekezésben elõforduló néhány fontosabb rövidítés: ACT APC apoACT AS ATP cdc Cdk CDK CEG CKI cut cycA cycB cycE DE DEG G1 fázis G2 fázis GF hus M fázis MPF pre-MPF preRC postRC Rb S fázis SCF TRI ts

-

az APC aktivátora anafázis serkentõ komplex (Anaphase Promoting Complex) az aktivátor (ACT) inaktív formája aminosav adenozin-trifoszfát cell division cycle Ciklin dependens kináz katalitikus alegysége Cdk/ciklin komplex Cyclin Egyensúlyi Görbe sztöchiometrikus CDK inhibitor korai szeptumképzés (cell untimely torn) ciklin-A ciklin-B ciklin-E differenciálegyenlet Dimer Egyensúlyi Görbe a sejtciklus mitózis és a DNS-szintézis közti szakasza a sejtciklus DNS-szintézis és mitózis közti szakasza növekedési faktor (Growth Factor) hidroxi-urea sensitive mitózis M-fázist serkentõ faktor (M-phase Promoting Factor) az MPF inaktív (tirozin fozforilezett) elõformája pre-replikációs komplex poszt-replikációs komplex retinoblasztoma fehérje DNS-replikáció szakasza foszforilezett fehérje ubikvitinezésére specializálódott ligáz enzim; elnevezése a komponensei alapján: Skp1 - Cullin - F-box protein. - Cdk/ciklin/CKI hármas komplex (trimer) - temperature sensitive

Reakciókinetikai nomenklatúra: Az egyes komponensek koncentrációját nem szögletes zárójellel, hanem a dõlt betûvel jelölöm. Ettõl csak akkor tértem el, amikor a komponenseket ikonok reprezentálják.

3

Genetikai és molekuláris biológiai nomenklatúra 1: Az egyes gének és mutánsok jelölése mindig három, dõltbetûs kóddal történik, amit általában egy szám követ. A sarjadó és a hasadó élesztõ genetikai nomenklatúrája azonban eltérõ: - a vadtípusú gént a hasadó élesztõ esetében "+" felsõ index (ezt az egyszerûség kedvéért elhagytam), a sarjadzó élesztõnél pedig csupa nagybetûs kód jelöli. - a hasadó élesztõ recesszív mutánsainak jelölése "-" felsõ index-vel, míg a sarjadzó élesztõnél kisbetûs kóddal történik. Egy adott gén hiányát görög ∆ (deléció) jelöli. Az egyes géntermékeket ugyanúgy jelöljük, mint a megfelelõ gént, de a kód nem dõltbetûs és nagybetûvel kezdõdik. Alábbiakban összefoglalom az értekezésben elõforduló legfontosabb géntermékeket (fehérjéket): Cdc18 Cdc2 Cdc25 Cdc28 Cdc6 Cdk2 Clb2 Cln2 Cln3 Mik1 Rum1 Sic1 Wee1

1

- a DNS replikáció kezdetét szabályozó “engedély fehérje” a hasadó élesztõben - a hasadó élesztõ ciklin függõ (dependens) protein kináza (Cdk1) - Cdc2-t aktiváló tirozin-foszfatáz a hasadó élesztõben - a sarjadzó élesztõ ciklin függõ (dependens) protein kináza (Cdk1) - a DNS replikáció kezdetét szabályozó “engedély fehérje” a sarjadzó élesztõben - magasabbrendû eukarióták második Cdk alegysége - a sarjadzó élesztõ legfontosabb mitózisos ciklinje - a sarjadzó élesztõ G1 fázisú ciklinje - a sarjadzó élesztõ G1 fázisú ciklinje - Cdc2-t inaktiváló tirozin-kináz a hasadó élesztõben (ld. Wee1) - a hasadó élesztõ G1 fázisban mûködõ Cdk inhibitora (Replication uncoupled from mitosis) - a sarjadzó élesztõ G1 fázisban mûködõ Cdk inhibitora - Cdc2-t inaktiváló legfontosabb tirozin-kináz a hasadó élesztõben

Egyes cikkek címeiben a szerzõk ortográfiája eltér az itt alkalmazott és azóta kialakított jelölésmódtól, ezért az

irodalomjegyzékben eltérések tapasztalhatók ettõl a nomenklatúrától.

4

1. Bevezetés

1. Bevezetés Az élet strukturális alapegysége a sejt és az élet lényege a sejtek önreprodukáló képességén alapul. A sejtbiológia ezen két alaptételének tükrében az élet szempontjából alapvetõ jelentõségû az a folyamat, amelyen a sejtek keresztül haladnak születésüktõl osztódásukig. Ez a folyamat a sejtszaporodás “alapreakciója”, mely szerint egy sejt tápanyagok felhasználása révén reprodukálja önmagát (1. ábra). Természetesen ez egy bonyolult többlépéses “reakció” és mindazon folyamatokat, melyek egy szaporodó sejt két egymást követõ osztódása között bekövetkeznek sejtciklus 2 kifejezéssel szokás összefoglalni (Mitchison, 1971).

tápanyagok

+

+

salakanyagok

1. ábra: A sejtszaporodás mint kémiai reakció. Sejtszaporodási reakcióknak a sebességét a mindennapi életben gyakran kell befolyásolni: amikor nem kívánatos (rákos) sejtszaporodással állunk szemben, akkor a reakció megfékezése a cél. Amikor viszont a sejteket egy biotechnológiai folyamatban saját céljaink elérése érdekében használjuk, akkor a reakciót a maximumig szeretnénk gyorsítani. Történetileg két alapvetõ szakaszt különböztethetünk meg a sejtciklus biológiai kutatásában. A korai (fiziológiai) szakaszban a sejtciklust szabályozó rendszer élettana került igen alapos megfigyelések és mérések tárgyává. A jelenleg is tartó molekuláris szakaszban pedig a szabályozási rendszer molekuláris részleteit tárják fel genetikai analízissel, gén-klónozással és szekvenálással. 2

A Földön található élõsejtek mindegyike két nagy csoport egyikébe sorolható: prokarióta (elõsejtmagvas: baktériumok és kékalgák) és eukarióta (valódi sejtmagvas: növény, gomba és állat) sejtek. Ebben a dolgozatban csak az eukarióta sejtek sejtciklusával foglalkozom.

1. Bevezetés

A fiziológiai szakaszban a kontroll rendszert úgy tekintették mint egy fekete dobozt és a doboz megzavarása után annak válaszát vizsgálva hipotézisek születtek a láthatatlan belsõ szerkezet mûködésére vonatkozóan. A fiziológiai vizsgálatok feltárták a sejtciklus szabályozásának legfontosabb törvényszerûségeit. A molekuláris szakaszban a fekete dobozt részeire szedték a laboratóriumi asztalokon és a molekuláris analízis eredményeként megtudtuk, hogy az eukarióta sejtciklus különleges protein-kinázok szabályozása alatt áll (Murray & Hunt, 1993). A molekuláris sejtbiológia talán egyik legnagyobb sikere az eukarióta sejtciklust szabályozó molekulák felfedezése és általános elõfordulásuk felismerése az eukarióták világában az élesztõktõl a humán sejtekig. Ez azonban bizonyos ellentmondást eredményez, mert molekulák tekintetében a szabályozási rendszer törzsfejlõdésileg konzervált ugyan, de fiziológiai szinten alapvetõ eltérés mutatkozik az egyes sejttípusok között sejtciklusuk szabályozását illetõen. A sejtciklus szabályozás megértésével kapcsolatban egy másik probléma is szembeötlõ. A szabályozási rendszer nagyon sok elemû, és ezek a szabályozási szignálok igen komplex hálózatában állnak egymással kölcsönhatásban, ezért a szabályozási rendszer mûködésének megértése nem könnyû feladat. Éppen ezért a kémiai reakciókinetika egy természetes eszköz ezen komplikált sejtciklus szabályozó mechanizmusok vizsgálatára. A sejtciklus kutatás egy elkövetkezõ szakaszában ugyanis a molekuláris darabokból kiindulva rekonstruálnunk kell majd az intakt szabályozó rendszert és igazolni, hogy a molekuláris mechanizmus valóban magyarázatot tud adni a sejtciklus minden fiziológiai tulajdonságára. Figyelembe véve a sejtciklus szabályozásának bonyolultságát ez az ún. szintetikus szakasz könnyebb és precízebb lesz a molekuláris hálózat matematikai modelljeinek kidolgozásával, mert a molekuláris gépezet és az intakt sejtek fiziológiája közti szakadék így áthidalható. Kutatómunkám szinte tudományos pályafutásom kezdete óta a sejtosztódási ciklus szabályozásának vizsgálatára irányul. Ebben a témában készítettem és védtem meg egyetemi doktori és kandidátusi értekezéseimet, valamint habilitációs téziseimet. Az 1990-es évek elején azonban jelentõs változás következett be az általam alkalmazott megközelítési módszerben. Az addig szinte kizárólagos kísérletes vizsgálódást fokozatosan felváltotta a matematikai modellezés módszere. Ebben az irányváltoztatás-ban alapvetõen a sejtszaporodást szabályozó molekuláris hálózatokról alkotott ismereteink rohamos fejlõdésnek indulása és a kvantitatív leírás szükségességének felismerése játszott szerepet. Ebben a dolgozatban a sejtszaporodást irányító molekuláris hálózatok reakciókinetikai leírásával kapcsolatos eredményeimet foglaltam össze.

6

1. Bevezetés

A fentieknek megfelelõen az alábbiakban röviden ismertetem az eukarióta sejtciklus legfontosabb élettani ismérveit és a sejtciklust szabályozó molekulákat3. Ezt követõem pedig röviden összefoglalom az elmúlt évek alatt általam kidolgozott matematikai sejtciklus modelleket. A modellek ismertetése nem a publikációk kronológiáját követi, hanem az egyszerûbb modellektõl halad a bonyolultabbak irányába. Ez azt jelenti, hogy a modellek tárgyalási sorrendje megegyezik a sejtciklus szabályozás fejlõdésének (evolúciójának) általam feltételezett irányával.

3

Az irodalmi hivatkozások számát megpróbáltam bizonyos korlát (kb. 120) alatt tartani, ezért ahol csak lehetett összefoglaló cikkekre hivatkoztam, amit a szövegben az elsõ szerzõ neve elõtt ld. jelöléssel tüntettem fel.

7

2. A sejtciklus

2. A sejtciklus 2.1. A sejtciklus fiziológiája A sejtek molekulákból épülnek fel, és a sikeres sejtreprodukció alapvetõ feltétele a sejtet alkotó molekulák számának megduplázása (növekedés) és térbeli szétosztása (osztódás). A sejtet alkotó molekulák között információ tároló szerepe miatt kitüntetett szerepe van a genetikai örökítõ anyagnak, a dezoxiribonukleinsavnak (DNS). Éppen ezért a sejtszaporodási folyamat legfontosabb eseményei a dezoxiribonukleinsav (DNS) mennyiségének megduplázásával és felezõ osztásával kapcsolatosak.

2.1.1. Kromoszómás ciklus A genetikai információt hordozó DNS a sejtek többségében (haploid sejtek) csak egyetlen példányban van jelen. A genetikai információ utódsejtekbe történõ pontos átvitele megköveteli a DNS molekula pontos lemásolását és a másolatok precíz elosztását az utódsejtek között. A DNS mennyiségének pontos megduplázódását a molekula templát-irányított szintézise (replikációja) biztosítja. A DNS replikációja a molekula meghatározott pontján indul meg (replikációs origó), és onnan egyszerre két ellentétes irányban halad. Az egyszerûbb prokarióta sejtekben egyetlen (kör alakú) DNS molekula található egyetlen replikációs kezdõponttal. Ezzel szemben a valódi sejtmagvas (eukarióta) sejtekben a jóval nagyobb DNS mennyiség több kromoszóma között oszlik meg. Eukarióta sejtekben még így is annyi DNS jut egyetlen kromoszómába, hogy annak korlátozott idõ alatt történõ lemásolása (replikációja) megkívánja, hogy a másolás több ponton (replikációs origók) induljon el. A DNS-replikáció a sejtciklusnak csak egy részére korlátozódik, és ezt a szakaszt eukarióta sejteknél S fázisnak szokás nevezni. A DNS lemásolását követõen kerül sor a kromoszóma másolatok (ún. leánykromatidák) szétválasztására (szegregálására). Ez a folyamat a magosztódás (mitózis vagy M fázis) alatt (illetve pontosabban annak egy része, ún. anafázisa, során) történik. Eukarióta sejtekben a leánykromatidák térbeli szétválasztását a sejt belsõ vázát alkotó dinamikus mikrotubulusok végzik. Mivel az eukarióta sejtek több kromoszómát tartalmaznak, ezért azok szegregációját csak egyszerre és csak a DNS-replikáció befejezõdését követõen szabad elkezdeni. Amennyiben ez a szabály nem érvényesül, annak az utódsejtekre nézve kromoszóma vesztés a

8

2. A sejtciklus

következménye. Ezen elv érvényesülése érdekében a lemásolt DNS-eket ún. kohéziós faktorok (ragasztó fehérjék) tartják össze a szegregáció megkezdéséig (Michaelis et al., 1997). A genetikai állomány állandó értéken tartása megköveteli, hogy a DNS lemásolását követõen illetve a kromoszómák szegregációját megelõzõen újabb DNS-replikációra ne kerüljön sor. Fenti két szabályból következik, hogy eukarióta sejtekben a DNS-replikáció és a kromoszóma szegregáció mindig felváltva kell, hogy bekövetkezzék (2. ábra). Egyik esemény sem következhet be újra, mielõtt a másik le nem játszódott. A sejtciklus kutatás egyik kulcskérdése, hogy ez a két folyamat milyen - feltehetõen különbözõ - jelek hatására indul el, és mi az a mechanizmus ami e két folyamat alternálását biztosítja?

DNS replikáció

kromoszóma szegregáció

2. ábra: Kromoszómás ciklus. A DNS replikáció és a kromoszóma szegregáció (mitózis) mindig alternálva következnek be a mitózisos ciklus alatt. Az egyszerûség kedvéért csak egyetlen kromoszóma van feltüntetve (piros vonal) és azon is csak két replikációs origó. A zöld vonal és folt a sejtvázat (citoszkeleton) jelöli.

9

2. A sejtciklus

A DNS-replikáció és kromoszóma szegregáció váltakozásának szabálya csak az ún. mitózisos ciklusra érvényes és ezen szabály alól két fontos esetben adódik kivétel (Murray & Hunt, 1993): 1. az ún. endoreplikációs ciklusok alatt periódusos DNS-szintézis történik kromoszó-ma szegregáció nélkül, ami a genetikai állomány feldúsulásához vezet. 2. Két egymást követõ kromoszóma szegregáció lejátszódhat közbeesõ DNS-replikáció nélkül diploid sejtek meiózisa során4. A DNS-replikáció és kromoszóma szegregáció alternálásának szabálya azt jelenti, hogy a DNS újra replikációja (re-replikáció) gátolt kell legyen a DNS-replikáció megkezdésétõl a kromoszómák szegregációjának befejezéséig.

2.1.2. Növekedési ciklus Bár a sejtszaporodás legfontosabb eseményei a sejtmagban játszódnak le, ezek szigorú kölcsönhatásban állnak a citoplazmában végbemenõ folyamatokkal (Mitchison, 1971). A citoplazma nagysága határozza meg a sejt méretét ill. tömegét. A citoplazmát a sejtek sejtosztódáskor osztják el az utódsejtek között és a sejtosztódásra mindig a sejtmagosz-tódást követõen kerül sor. A citoplazmát alkotó molekulák többsége nagy példányszám-ban van jelen, ezért sejtosztódáskor bekövetkezõ szétosztásuknál nincs szükség különösebb precizitásra, ezért az véletlenszerû folyamat. E molekulák általában folyamatosan szintetizálódnak két egymást követõ osztódás között és mennyiségük nem feltétlenül duplázódik meg pontosan ez alatt az idõ alatt. Ez nem is szükségszerû, amennyiben hosszú távon az átlagos értéktõl való eltérések kompenzálják egymást. A citoplazmát alkotó molekulák folyamatos szintézise eredményeként a citoplazma tömege és a sejt térfogata növekszik, sejtosztódáskor pedig csökken (növekedési ciklus 5). Mivel a folyamatosan szaporodó sejtek egy meghatározott átlag érték körül tartják tömegüket (térfogatukat és méretüket), ezért feltételezhetõ a citoplazma növekedését a sejtosztódással összehangoló mechanizmus létezése.

4

A diploid, kétszeres DNS tartalommal (2n) rendelkezõ sejtek DNS replikációt követõen négyszeres DNS tartalommal (4C) rendelkeznek, ami két egymáskövetõ magosztódásban csökken az egyszeres (1C) értékre. 5 A növekedési ciklus (sejtnövekedés és sejtosztódás) nem olyan esszenciális része a sejtciklusnak mint a kromoszómás ciklus: vannak ugyanis olyan sejtciklusok (embrionális), melyek alatt a sejtek nem növekednek, sõt bizonyos esetekben (Drosophila) még a sejtosztódás is elmaradhat. 10

2. A sejtciklus

2.1.3. A növekedési és kromoszómás ciklus összehangolása A citoplazma növekedésének üteme a sejttömeg megduplázódásához szükséges idõvel jellemezhetõ (duplázódási idõ). A citoplazma tömeget (sejtméret) úgy lehet egy állandó érték körül tartani, ha két egymást követõ sejtosztódás közt a sejttömeg duplázódás idejével azonos idõ telik el (Fantes & Nurse, 1981). A két idõtartam azonosságának nem szükségszerû minden egyes sejtciklus alatt fennállnia, de hosszú távon érvényesülnie kell. A növekedés és a sejtosztódás összehangolását kifejezõ szabály ilyetén történõ megfogalmazása figyelembe veszi az egyedi sejtek ciklusidejében tapasztalható különbségeket és csak azt követeli meg, hogy a populáció átlagos ciklusideje (generációs idõ) legyen azonos a sejttömeg duplázódás idejével. A szaporodó sejtek átlagos sejttömegének állandósága a kromoszómás és a növekedési ciklus összehangoltságára utal (Mitchison, 1971). Mivel sejtosztódásra mindig csak a kromoszómák szegregációját követõen kerül sor, ezért a kromoszómás ciklus periódus ideje is azonos a sejttömeg duplázódás idejével. Hogyan tudják a sejtek összehangolni a kromoszóma replikáció és szegregáció folyamatát a citoplazma növekedésével? A legkülönbözõbb sejttípusok vizsgálata azt mutatja, hogy a DNS-replikáció és magosztódás (mitózis) együttes ideje (kromoszómás ciklus) sokkal kevesebb idõt vesz igénybe mint a citoplazma mennyiségének megduplázása (ld. Johnston et al., 1977). A kromoszómás ciklus tehát gyorsabban tud lejátszódni, mint a növekedési ciklus. A két ciklus összehangolt mûködése alapján feltételezhetõ, hogy a lassabb növekedési ciklus lefékezi a gyorsabb kromoszómás ciklust. Ez a fékezõ hatás számos sejttípussal végzett precíz fiziológiai kísérlet alapján az lehet, hogy a sejteknek egy kritikus citoplazma tömeget kell elérniük ahhoz, hogy a kromoszómás ciklus egy bizonyos eseménye: DNS-replikáció (Killander & Zetterberg, 1965) vagy mitózis (Fantes & Nurse, 1977) lejátszódhasson (3. ábra). Valószínûleg mind a DNS-replikáció mind a kromoszóma szegregáció megkezdése egy kritikus sejttömeg eléréséhez van kötve minden eukarióta sejtben (Fantes & Nurse, 1981). A kritikus sejtméret elérésének sebesség-meghatározó volta miatt a kromoszómás ciklus eseményei között szünetek tapasztalhatók (4. ábra): n G1 fázis a mitózis és a DNS-replikáció között, n G2 fázis a DNS-szintézis és az azt követõ magosztódás között. Fontos megjegyezni, hogy a sejtek fejlõdésük során a sejtnövekedés és sejtosztódás összehangolásának szabályától jelentõsen eltérhetnek (Murray & Hunt, 1993). Így például:

11

2. A sejtciklus

1. a petesejtek elõalakjait reprezentáló oociták fejlõdésük során (oogenezis) jelentõsen növelik citoplazmájuk méretét anélkül, hogy osztódnának, aminek eredményeként a szomatikus (testi) sejteknél sokkal nagyobb méretet érnek el. 2. Az elõzõ folyamat ellensúlyozásaként pedig a petesejt megtermékenyítését követõen a korai embrióban gyors sejtosztódások játszódnak le (embrionális sejtciklus ) citoplazma növekedés nélkül, aminek eredményeként a sejtek mérete visszaáll a testi sejtekre jellemzõ értékre.

2

sejttömeg növekedés

1 2

1

DNA sejtmag

G1

sejtosztódás

S

G2

M

3. ábra: A kromoszómás és a növekedési ciklus összehangolása. A két ciklus összehangolása úgy valósul meg, hogy a lassabb növekedési ciklus fékezi (illetve megállítja) a gyorsabb kromoszómás ciklust méretkontroll mechanizmusok révén. Ennek eredményeként szünetek (gap) keletkeznek az S és M fázisok között: G1 fázis az M és S fázisok, valamint G2 fázis az S és M fázisok között. Természetesen a fenti kivételek nem a sejtnövekedés és az sejtosztódás összehangoltságára vonatkozó szabály érvényességét vonják kétségbe, hanem csak az azt szabályozó mechanizmus átmeneti felfüggesztésére utalnak.

12

2. A sejtciklus

sejtosztódás mitózis (M fázis)

G1

G2

DNS replikáció (S fázis) 4. ábra: Az eukarióta sejtciklus .

2.1.4. Ellenõrzési mechanizmusok az eukarióta sejtciklusban A DNS-replikáció és a kromoszóma szegregáció felváltva történõ bekövetkezése, valamint a kromoszómás ciklus ezen folyamatainak a citoplazma növekedésével történõ koordinálására az eukarióta sejtek ún. ellenõrzési mechanizmusokat (“surveillance mechanisms”) használnak (Nasmyth, 1996b). Három ilyen ellenõrzési mechanizmust ismerünk az eukarióta sejtciklusban: 1. A G1 ellenõrzési mechanizmus segítségével a sejtek eldöntik, hogy a környezet megfelelõ-e a sejtciklus végrehajtására és méretük elegendõ nagy-e a DNS-replikáció megkezdéséhez. Amikor e feltételek mindegyike teljesül, akkor a sejtek végérvé-nyesen elkötelezik magukat a sejtciklus végrehajtására és a DNS-replikáció megkez-désével befejezik a G1 fázist. A sejtciklus ezen irreverzibilis lépését alacsonyabbrendû eukariótákban (élesztõk) Start-nak (Hartwell et al., 1974), míg emlõs sejteknél restrikciós pontnak (Pardee, 1989) nevezzük. 2. A G2/M átmenet ellenõrzési mechanizmusa a DNS-replikáció sikeres befejezõdésének (nem replikált DNS esetén a sejtek nem lépnek mitózisba), valamint annak ellenõrzésére szolgál, hogy a citoplazma nagysága megfelelõ-e a mitózis megkezdéséhez. 3. A meta/anafázis ellenõrzési mechanizmus a kromoszómák magorsó fonalakhoz való tapadásának ellenõrzésére szolgál. Amennyiben a sejtben egyetlen kromoszóma is szabad tapadási hellyel (kinetokór) rendelkezik, úgy a leánykromatidák szétválasz-tása (anafázis) elmarad illetve késlekedik. 13

2. A sejtciklus

2.2. A sejtszaporodást szabályozó molekulák A sejtek szaporodását egy komplikált molekuláris mechanizmus szabályozza, aminek számos részlete még ma sem ismert. De mint minden más összetett kémiai reakciómecha-nizmus esetén különös jelentõsége van a sebesség-meghatározó lépések ismeretének. Az elmúlt 10 évben a molekuláris biológiai módszerek alkalmazásának köszönhetõen fény derült azon molekulákra, melyek képzõdése sebesség-meghatározó a sejtszaporodás szempontjából.

2.2.1. Ciklin-függõ protein-kinázok és ciklinek A molekuláris vizsgálódás eredményeként megtudtuk, hogy a sejtszaporodást irányító komplikált biokémiai reakciórendszer legfontosabb elemei más fehérjéket foszforilezõ ún. protein kinázok. Ezek olyan enzimek, melyek ATP (adenozin-trifoszfát) segítségével más fehérjéket foszforileznek, és ezáltal azok tulajdonságait (pl. aktivitás) megváltoztatják. A protein-kinázok által foszforilezett fehérjékrõl pedig protein foszfatázok távolítják el a foszfátcsoportot. A sejtciklus szabályozásában különleges protein-kinázok vesznek részt, melyek csak akkor aktiválódnak, ha hozzájuk egy ciklinnek nevezett szabályozó (regulációs) alegység kapcsolódik (5. ábra). Éppen ezért ezeket a protein-kinázokat összefoglalóan ciklin-függõ protein-kinázoknak (Cyclin dependent protein kinase) vagy röviden Cdk-nak nevezzük (Morgan, 1995). A sejtszaporodás (sejtciklus) egy komplikált soklépéses folyamat, amelynek szabályozásában több Cdk/ciklin komplex is részt vesz a sejt fejlettségétõl függõen. Minden eukarióta sejtre érvényes szabály azonban, hogy mind a DNS-replikáció mind a mitózis megindítása Cdk aktivitást igényel. A magasabbrendû eukarióta sejtekben több különbözõ Cdk alegység is található, melyek különbözõ ciklinekkel alkotott komplexei irányítják a sejtciklust (Sherr, 1996). Ezzel szemben alacsonyabbrendû eukariótákban (pl. az élesztõgombák) csak egyféle Cdk alegység található és az elégséges a sejtciklus szabályozáshoz (Stern & Nurse, 1996). Az élesztõkben elsõként felfedezett, de az eukarióta sejtekben általánosan elõforduló Cdk-t, Cdk1-nek nevezzük, míg a többi Cdk-t egynél nagyobb arab számmal jelöljük (Cdk2, Cdk3 stb.).

14

2. A sejtciklus

ciklin Cdk

P

+ A

+

P P P

A

P P

ciklin Cdk A

P P P

5. ábra: A ciklin függõ protein kináz (Cdk) ciklinnel alkotott komplexe bizonyos fehérjéket foszforilez ATP felhasználása mellett. A katalitikus Cdk alegység (sárga) csak ciklin (kék) kapcsolódása esetén képes a szubsztrátfehérje (rózsaszín) foszforilezésére.

15

2. A sejtciklus

A ciklineknek is több típusa ismeretes. Az elsõként felfedezett A és B-típusú ciklinek a mitózis szabályozásában játszanak szerepet (Evans et al., 1983). Az egyes ciklinek csak meghatározott Cdk alegységekkel lépnek kapcsolatba, és a különbözõ Cdk/ciklin komplexek eltérõ fehérjék foszforilezésére képesek és eltérõ sejtkompartmentekben találhatók (Nigg, 1995). Így például a B-típusú ciklinek Cdk1-gyel alkotott komplexe felelõs a magosztódás elindításáért minden eukarióta sejtben, ezért MPF-nek (M-phase Promoting Factor) nevezzük (Nurse, 1990). A ciklin és a Cdk kapcsolódásával kialakult aktív Cdk/ciklin komplex képes a sejtciklus egy bizonyos eseményének elindítására6. Az esetek többségében a Cdk alegység koncentrációja nem vagy csak keveset változik a sejtciklus alatt. Ezzel szemben a ciklinek koncentrációja általában periodikusan változik a sejtciklus alatt, ezért is kapták a ciklizáló fehérje elnevezést7. Mivel a ciklin kapcsolódása elengedhetetlenül szükséges a Cdk aktiválódásához, ezért a ciklin mennyiségének (koncentrációjának) szabályozásával a Cdk aktivitása befolyásolható. A ciklin fehérje koncentrációja pedig mind képzõdésének (szintézis), mind lebomlásának (degradáció) sebességével szabályozható. A sejtek tehát egyrészt a regulációs alegység (ciklin) koncentrációjának változtatásával tudják szabályozni az aktív Cdk/ciklin komplex koncentrációját (6. ábra). A Cdk aktivitása azonban nemcsak a ciklinek koncentrációján keresztül szabályozódik (6. ábra). A Cdk-k aktív centruma foszforilezhetõ treonin és tirozin oldalláncokat tartalmaz, melyek foszforilezése más protein-kinázok hatására gátolja a Cdk-t szubsztrátjainak (foszforilezendõ fehérje és ATP) megkötésében (Morgan, 1995). Az aktív centrum foszforilezett aminosavainak defoszforilezése protein foszfatáz hatására pedig aktiválja a Cdk/ciklin komplexet. Az Cdk/ciklin komplex átmeneti inaktiválása nemcsak a katalitikus alegység kovalens módosításával (foszforilezés) történhet, hanem gátló (inhibitor) fehérje kapcsolódásával is (6. ábra). Az utóbbi években felfedezett ún. ciklin dependens kináz inhibitorok (CKI) a Cdk/ciklin komplexhez történõ kapcsolódásukkal gátolják annak kináz aktivitását .

6

Tulajdonképpen a Cdk és a ciklin kapcsolódásának eredményeként még nem alakul ki az aktív dimer, mert ahhoz elõbb a Cdk alegység egy treonin oldalláncának foszforilezõdnie kell (Solomon, 1993). Tekintve azonban, hogy ez a foszforilezés nem szabályozott és nagyon gyorsan lejátszódik a komplex képzést követõen, ezért ennek figyelembevételétõl az egész dolgozatban eltekintek. Számos eredeti munkánkban (Novák & Tyson, 1993b; Novák & Tyson, 1995) található olyan modell, amelyben nem éltünk ezzel az egyszerûsítõ feltételezéssel. 7 Ma már ismerünk olyan ciklin fehérjéket is, melyek koncentrációja nem változik periódusosan a sejtciklus alatt, de szekvenciájuk hasonlóságot mutat a többi ciklin fehérjével (pl. Cln3 a sarjadzó élesztõben és Puc1 a hasadó élesztõben, valamint a D-típusú ciklinek emlõs sejtekben). Mivel ezeket a fehérjéket is ciklinnek nevezzük, ezért az eredeti nomenklatúrát kiterjesztették egy rokon szekvenciát mutató fehérjecsaládra, mely mind periódusos mind nem periódusos fehérjéket is tartalmaz (Hunt, 1991). 16

2. A sejtciklus

aminosavak

szintézis

ciklin

degradáció

Cdk ciklin + ATP

Cdk

ciklin

Cdk

foszfatáz

ATP

ciklin

Cdk

ciklin

Cdk

ciklin ADP +

CKI

inaktív

kináz

CKI

P

P

inaktív

6. ábra: A Cdk/ciklin komplex aktivitásának szabályozása.

2.2.2. Az Anafázis Serkentõ Komplex (APC) A mitózisos sejtciklus normális lejátszódásához a Cdk/ciklin komplexeken túlmenõen szükség van az Anafázis Serkentõ Komplex (APC) is (Irniger et al., 1995). A magosztódás alatt a két pólusról kiinduló mikrotubulusok által a kromoszómákra kifejtett húzóerõk kiegyenlítik egymást és a leánykromatidák nem válnak szét az összetartó (“ragasztó”) fehérjék következtében (Murray & Hunt, 1993). A leánykromatidák szétválását ezen összetartó fehérjék hirtelen lebontása váltja ki. E fehérje lebontását a proteoszóma végzi, ami ubikvitinezett (pontosabban poliubikvitinezett) fehérjéket ismer fel. Az ubikvitin fehérjékhez történõ kapcsolása egy három lépéses folyamat eredménye, melynek utolsó lépését a fehérjére specifikus ubikvitin ligáz végzi (Hershko, 1997). A leánykromatidákat összetartó ragasztófehérjéket ubikvitinezõ ligáz enzimkomplexet Anafázis Serkentõ Komplexnek (APC = Anaphase Promoting Complex) nevezzük, mivel aktiválódása a leánykromatidák szétválását (anafázis) váltja ki (Zachariae et al., 1996). Az APC egy nagyon bonyolult fehérjekomplex, amelynek komponenseit (alegységeit) eddig sarjadzó és hasadó élesztõn kívül, kagyló és humán sejtekben is jellemezték (ld. King et al., 1996). Ezek összehasonlító vizsgálata arra a korántsem meglepõ eredményre vezetett, hogy az APC komponensei is konzerváltak az evolúció során. 17

2. A sejtciklus

2.3. A DNS-replikáció két lépéses iniciációja Amint azt korábban láthattuk, az eukarióták mitózisos ciklusának sikere megköveteli, hogy a DNS-replikáció és a kromoszóma szegregáció felváltva következzenek be. Ebbõl a követelménybõl pedig egyenesen következik, hogy a DNS-replikáció kezdõpontjai két egymást követõ kromoszóma szegregáció között egyszer és csakis csak egyszer aktiválódhatnak. Milyen mechanizmus biztosítja az origók egyszeri aktiválódását? Az eukarióta DNS-replikáció szabályozására korábban kidolgozott “licensing factor” modellt (Blow & Laskey, 1988) az elmúlt években felváltotta az iniciáció két lépéses modellje (Wuarin & Nurse, 1996), aminek lényege a következõ. A replikációs origó aktiválódásának az alábbi két feltétele van (7. ábra): 1. Az origón kialakuljon egy ún. pre-replikációs komplex (preRC), ami tulajdonképpen engedélyt jelent egy elkövetkezõ replikációra, valamint 2. Cdk aktivitás hatására a replikáció elindul, és egyúttal a preRC-k poszt-replikációs komplexé (postRC) alakulnak. A modell legfontosabb állítása azonban, hogy a preRC-k kialakulását a Cdk aktivitás gátolja. A Cdk aktivitás tehát szükséges a replikáció megindulásához és a preRC àpostRC lépéshez, de gátolja a postRC-k visszaalakulását preRC-kké. Ebbõl következik, hogy a DNSreplikáció megindulásához a Cdk aktivitás szükséges ugyan, de nem elégséges. A replikáció iniciációját megelõzõen ugyanis a Cdk aktivitásnak le kell csökkennie, hogy a preRC-k kialakulhassanak (Stern & Nurse, 1996). Amikor pedig a Cdk aktivitás növekedésnek indul és kritikus értéket ér el, akkor a replikáció elindul az origók aktiválódása következtében. A Cdk aktivitás tehát gátolja a DNS-replikáció iniciációjának elsõ lépését, de serkenti a másodikat, ezért ez a mechanizmus a DNS komplett replikációját eredményezi, mert a Cdk aktivitás jelenlétében minden origó csak egyszer aktiválódik. A pre- és postRC-t nagyon sok fehérje alkotja (Rowles & Blow, 1997), de az itteni tárgyalás szempontjából csupán annak a fehérjének van jelentõsége, amely megkülön-bözteti ezeket a komplexeket. Ez az ún. engedély fehérje (licensing factor) ugyancsak konzervált az evolúció során: a sarjadzó élesztõben a Cdc6, míg a hasadó élesztõben Cdc18 fehérjék feleltethetõk meg az engedély fehérjének (Stillman, 1996). Mindkét fehérje gyorsan bomlik Cdk aktivitás jelentében, mert a Cdk hatására foszforilezõdnek (ld. Jallepalli & Kelly, 1997) és foszforilezett formáikat egy SCF-nek8 nevezett komplex ubikvitinezi, majd pedig a proteoszóma által gyorsan lebomlanak. Cdk aktivitás hiányában viszont mindkét fehérje stabil. A Cdk aktivitás tehát az engedély fehérje degradációjával gátolja meg a DNS újrareplikálását. 8

Az SCF ubikvitin ligáz a sarjadzó élesztõben felfedezett komponenseirõl kapta a nevét: Skp1, Cdc53 és F-box fehérje (pl. Cdc4 és Grr1). Ez a komplex foszforilezett fehérjéket jelöl meg ubikvitinezéssel lebontás céljából (ld. Krek, 1998). 18

2. A sejtciklus

postRC

preRC P

P

LF P

Origó

P P LF

P LF P

P

+

P

P

Cdk Ciklin

7. ábra: A DNS replikáció két lépéses iniciációjának modellje. Az egyszerûség kedvéért csak egyetlen replikációs kezdõpont (origó) van feltüntetve. Az origó aktiválódását engedélyezõ fehérje (Licensing Factor = LF) csak Cdk aktivitás hiányában képes kapcsolódni az origóhoz, mert a Cdk/ciklin komplex foszforilezi és ennek következtében gyorsan lebomlik. A replikáció megindulása viszont Cdk aktivitás megjelenését igényli, mert a Cdk/ciklin komplex feltehetõen foszforilezi a replikációs apparátus egy vagy több fehérjéjét (ld. fekete kör). Ahhoz, hogy a sejtek a DNS-üket újrareplikálhassák, a Cdk aktivitásnak le kell csökkennie. Mivel az eukarióta sejtek DNS-üket csak kromoszóma szegregációt (amit az APC indít el) követõen replikálhatják újra, ezért a Cdk aktivitás csökkenés az APC aktiválódásának kell függvénye legyen. Ez a kapcsolat egyszerûen úgy valósul meg, hogy az APC a ragasztó fehérjékkel egyidejûleg ubikvitinezi a B-típusú ciklineket is (8. ábra), ezért az APC-t szokás cikloszómának is nevezni (Sudakin et al., 1995). A ragasztó fehérjék lebomlása a kromoszómák szegregációját eredményezi, míg a ciklinek lebomlása a DNS-replikáció Cdk általi gátlását oldja fel (Nasmyth, 1996b). A DNS replikációs origók állapota alapján az eukarióta sejtciklusnak két jellegzetes állapota különböztethetõ meg (Nasmyth, 1996b): 1. G1 állapot: a replikációs origókon preRC-k alakulnak ki, mert a Cdk aktivitás alacsony. 2. S/G2/M állapot: Cdk aktivitás hatására megindul a DNS-replikáció és a preRC-k postRC-kké alakulnak át.

19

3. A matematikai leírás szükségessége

kromoszóma szegregáció

C AP

Cdk Ciklin

ciklin lebontás

szegregációs apparátushoz nem tapadt kromoszómák

Cdk +

8. ábra: Az Anafázis Serkentõ Faktor (APC) kettõs szerepe a mitózisban. Az APC mind a kromoszómákat (piros vonalak) összetartó “ragasztó fehérjéket” (sárga vonalak), mind a mitózisos ciklineket (sárga ellipszoid) ubikvitinezi és ezáltal gyors lebontásra készteti.

20


3. A matematikai leírás szükségessége Mivel a sejtciklus különbözõ eseményeit általában különbözõ Cdk-k különbözõ ciklinekkel alkotott komplexei indítják el, ezért könnyû elképzelni, hogy egy igen komplex biokémiai reakciórendszerrõl van szó. A sejtciklust irányító biokémiai gépezet, tehát nem más mint Cdkk, ciklinek, CKI-k, valamint egyéb protein-kinázok és foszfatázok szövevényes hálózata. Ez a biokémiai gépezet nagyon hasonló a különbözõ fejlettségû eukarióta (valódi sejtmagvas) sejtekben, ami különös fontosságot ad megismerésének. Igaz, hogy a magasabbrendû sejtek szabályozó rendszere több komponenst használ az összetettebb feladatok megoldása érdekében, de a mechanizmus lényegében nagyon hasonló az egyszerûbb eukarióta sejtekéhez (pl. élesztõk). A sejtciklust szabályozó molekuláris hálózat bonyolultsága felveti a rész és egész problémájának kérdését. Nevezetesen egy ilyen komplikált reakciórendszer esetén miként lehet a részekbõl (molekulák) megjósolni az egész rendszer (a sejt) fiziológiai viselkedését. Ezen kérdés megválaszolásának pedig különös jelentõsége van, amikor ellenõrizni szeretnénk, hogy molekuláris ismereteink összhangban állnak-e az egész sejtet leíró fiziológiai kísérletek eredményeivel.

3.1. A reakciókinetika alkalmazhatósága A kémiában az ilyen és ehhez hasonló nehézségek feloldására jól bevált módszer van: a kémiai reakciókinetika módszere. Ennek lényege és alkalmazásának fõbb lépései a következõk: 1. a feltételezett reakciómechanizmus alapján sebességi egyenleteket kell felírni, vagyis egy differenciálegyenletet minden egyes kémiai komponens koncentrációjának idõbeli változási sebességére, 2. az egyenletek megoldásával kiszámolható a feltételezett mechanizmus várható viselkedése, 3. amit összevetve a kérdéses reakció kísérletes megfigyelésével, 4. a mechanizmus addig módosítandó, amíg a kísérletek és az elmélet között megfelelõ egyezést nem szolgáltat. Miért ne lehetne ezt a módszert a sejtciklust szabályozó reakcióhálózat mechanizmusá-nak felderítésében is alkalmazni? 1991-ben John Tyson professzorral (Virginia Polytechnic Institute and State University, Biológia Tanszék) közös munkába kezdtünk, amelynek célja az eukarióta sejtciklus matematikai modellezése a molekuláris biológiai ismeretek alapján a kémiai reakciókinetika módszerével. 21


A biológiában azonban ez a megközelítés korántsem olyan elterjedt. Talán senki sem tagadja a sejtciklus modellezésének szükségességét, de a legtöbben azt túl korainak tartják, mondván még rengeteg molekuláris részletet nem ismerünk. Szerintünk a helyzet éppen fordított: a sejtciklus szabályozási rendszerrõl összegyûjtött ismereteink már most túllépték azt a mértéket, hogy a róluk történõ gondolkodásunkat egyszerûen intuícióink irányítsák. A probléma ugyanis igen hasonló egy olyan kirakós játékhoz (“puzzle”), amelynek a fedõképét nem ismerjük, és biztosak lehetünk abban is, hogy bizonyos darabok hiányoznak a dobozból, továbbá az egyes elemek összeillesztésére nem áll rendelkezésünkre egy sima felület. A reakciókinetika módszere asztallapként használható fel a sejtciklus “puzzle” kirakásában, mely azzal a további elõnnyel is jár, hogy a szabályozási rendszer dinamikai aspektusai is megjeleníthetõk.

22

4. A primitív eukarióta sejt ciklusa

4. A primitív eukarióta sejt ciklusa Mint minden más komplikált biológiai folyamattal, így a sejtciklus szabályozásával kapcsolatban is felmerül a kérdés, hogyan alakulhatott ki egy ilyen komplikált szabályozó rendszer az evolúció során a sejtek szaporodásának irányítása érdekében? Más szavakkal fogalmazva, mi lehetett az a minimális szabályozó rendszer, amely eleget tesz az eukarióta sejtciklus követelményeinek. A kérdés megválaszolásához célszerû pontosan összefoglalni ezeket a követelményeket: 1. A kromoszómás ciklus (kromoszóma replikáció és szegregáció) összehangolt a citoplazma növekedésével. 2. A DNS-replikáció és kromoszóma szegregáció felváltva következnek be. 3. A kromoszóma szegregáció csak a kromoszómák teljes replikációját követõen és szegregációs apparátushoz történt tapadásukat követõen indul meg. Feltételezhetõ, hogy a legegyszerûbb, primitív eukariótának csupán egyetlen Cdk/ciklin komplexe volt (továbbiakban CDK) és ez a komplex valószínûleg a mai Cdk1/ciklin-B komplexhez (MPF) volt nagyon hasonló (Nasmyth, 1995; Stern & Nurse, 1996). Alátámasztja ezt a feltételezést, hogy a mitózis serkentõ Cdk1/ciklin-B komplex (MPF) mind a hasadó mind a sarjadzó élesztõben alkalmas a DNS-replikációhoz szükséges Cdk aktivitás biztosítására (Amon et al., 1994; Fisher & Nurse, 1996). Kim Nasmyth (1995) feltételezte, hogy a legegyszerûbb eukarióta sejtciklus szabályozó rendszer, amely eleget tesz a fenti követelményeknek, egyetlen CDK és az APC antagonisztikus kölcsönhatásán alapulhatott (9. ábra). Miként valósul meg a CDK és az APC antagonisztikus kölcsönhatása? Az APC nemcsak a kromoszómákat összetartó fehérjé(ke)t, hanem a ciklineket is megjelöli ubikvitines lebontás céljából (Holloway et al., 1993; Irniger et al., 1995). Mivel a ciklin lebontás eredményeként a Cdk elveszti az aktivitását, ezért az APC negatív hatást gyakorol a CDK-ra. De hogyan gyakorol a CDK negatív hatást az APC-re ? Az APC nagyon sok különbözõ fehérjét ubikvitinez és ehhez különbözõ szubsztrátokat felismerõ fehérjékre van szüksége. A B-típusú ciklinek APC általi felismeréséhez sarjadzó élesztõben a Hct1-re (Homologue of Cdc twenty) van szükség (Schwab et al., 1997; Visintin et al., 1997). A homológ fehérjét hasadó élesztõben Srw1-nek illetve Ste9-nek (Kitamura et al., 1998; Sipiczki, 1988; Yamaguchi et al., 1997) nevezik. Ha ezeknek a ciklin felismerõ fehérjéknek az aktivitását a CDK foszforilezéssel gátolja, akkor megkapjuk a kívánt negatív hatást. Az ábrákon a továbbiakban az egyszerûség kedvéért az APC-t a ciklin felismerõ fehérjékkel együtt APCnek fogom jelölni. 23


replikáció preRC + Cdk Ciklin

+

lebontja

LF hozzáadása

-

-

LF lebontása

inaktiválja

+ AP

C

+

+

postRC

szegregáció

9. ábra: Az APC és a CDK versengése hozza létre a sejtciklus két alapvetõ állapotát. Az APC a ciklin komponens lebontása révén gátolja a CDK aktivitást, a CDK pedig valószínûleg az APC ciklin felismerõ fehérje-alegységének foszforilezésével gátolja az APC aktivitását. Ezen antagonisztikus hatások eredményeként alakulhat ki a sejtciklus két alternatív állapota, amiket az különböztet meg, hogy a replikációs origókhoz engedély fehérje (LF) kötõdik-e vagy sem.

Ennek tükrében a CDK és az APC kölcsönhatása (10. ábra) két differenciálegyenlettel (DE) írható le (Novák et al., 1998b): d CDK = k1 . mass - [v2’ (1- APC) + v2” . APC) ] . CDK dt

(1a)

d APC (k3’ + k3” . ACT) (1 - APC) (k4’ + k4” . CDK) APC = dt J3 + 1 - APC J4 + APC

(1b)

ahol CDK(t) a Cdk/ciklin komplexek (CDK) sejtmagbeli koncentrációját, az APC(t) pedig az APC aktív hányadát jelenti. k1 a ciklinek szintézisének sebessége egységnyi citoplazma térfogatban, míg a “mass” a citoplazma tömegére (térfogatra) utal. Az ACT az APC-t a CDK-val szemben aktiváló enzimre utal, aminek aktivitását egyelõre konstansnak tekintjük. Feltételezzük, hogy a ciklinek a sejt citoplazmájában annak tömegével arányosan szintetizálódnak (k1 . mass), gyorsan asszociálódnak a feleslegben lévõ Cdk alegységekkel és a Cdk/ciklin dimerek (CDK) gyorsan transzportálódnak a sejtmagba. A sejttömeg ilyetén történõ bevezetése a CDK DE-be a citoplazma növekedés és a kromoszómás ciklus összekapcsolását eredményezi (ld. késõbb). A CDK aktivitás ebben az egyszerû modellben csak az APC-függõ ciklin degradáció eredményeként csökken. A ciklin lebontás sebessége az

24


APC aktív (APC) és kevésbé aktív (1 - APC) formák közti megoszlásának függvénye (a két forma összkoncentrációját egységnyinek tételezzük fel). v2’ és v2” a kevésbé aktív és az aktív forma aktivitására (“turnover” szám) utal. Az APC aktiválódási és inaktiválódási sebességét Michaelis-Menten kinetikával írjuk le: k3” és k4” az ACT és a CDK maximális aktivitásaira utalnak, míg a k3’ és k4’ az aktiválás és az inaktiválás háttér enzimeinek Vmax értékeit fejezik ki, míg J3 és J4 a Michaelis állandók.

APC

AP

+

sejtmag

inaktív

C aktív

+

lebontott ciklin

Cdk Ciklin Cdk

Cdk Cdk Ciklin

asszociáció (gyors)

Ciklin

szintézis

AS

10. ábra: Az APC -CDK antagonizmusa a primitív eukarióta sejtben. A ciklin alegységek a citoplazmában szintetizálódnak és a Cdk-val való kapcsolódás után gyorsan a sejtmagba (zöld kompartment) transzportálódnak. A sejtmagban az APC lebontja a Cdk/ciklin dimer ciklin alegységét és felszabadítja az inaktív katalitikus alegységet. Ez egészen addig tart, amíg a Cdk/ciklin komplex (CDK) a sejtmagban el nem ér egy kritikus koncentrációt, ami elégséges az APC inaktiválásához.

A két DE tulajdonságai legegyszerûbben a fázissíkon tanulmányozhatók. A fázissíkon kitüntetett szerepe van az ún. egyensúlyi görbéknek, melyek mentén ellentétes irányú folyamatok sebességei éppen kiegyensúlyozzák egymást. A CDK egyensúlyi görbe: k1 . mass CDK = v2’ (1 - APC) + v2” . APC és az APC egyensúlyi görbe:

CDK =

(k3’ + k3” . ACT ) (1 - APC) . J4 + APC k4’ . k4” APC J3 + 1 - APC k4” 25

(2a)

(2b)


tulajdonképpen nullklínák, melyek mentén az 1a-1b DE-k baloldala nullával egyenlõ. Az APC nullklína szigmoid alakú, a Cdk nullklína pedig egy hiperbola. A felhasznált paraméter értékeknél a két egyensúlyi görbe három steady state-ben is metszheti egymást (11. ábra). Ezek közül a két szélsõ steady state stabil (csomópont), a középsõ pedig instabil (nyeregpont).

G1

APC

stabil csomópont

nyeregpont

S/M stabil csomópont

CDK

11. ábra: Az APC - CDK szabályozó fázissík diagramja. Az APC (piros) és a CDK (kék) nullklína három pontban (steady state) is metszhetik egymást. A bal felsõ steady state-ben az APC aktív és a CDK aktivitás alacsony (G1 állapot), míg a jobb alsó steady state-ben (S/M állapot) pedig éppen fordítva (APC inaktív és a CDK aktivitás nagy). A két stabil steady state a primitív sejtciklus két alapvetõ állapotát reprezentálja: 1. G1 állapot: alacsony Cdk és nagy APC aktivitás, amikor a preRC -k kialakulhatnak, 2. S/M állapot: nagy Cdk és alacsony APC aktivitás, amikor a DNS-replikáció és a kromoszómák magorsófonalakhoz való kapcsolódása történik. A modellben a sejttömeg (“mass”) egy bifurkációs paraméter, és emiatt a modell a méretkontroll tulajdonságával rendelkezik. A citoplazma tömegének (térfogatának) növekedésével a CDK egyensúlyi görbe felfelé mozdul el, aminek eredményeként az alacsony Cdk aktivitású steady state megszûnik (12. ábra). A kritikus méret felett pedig a nagy CDK aktivitású steady state az egyedüli állapot. Ez a nyereg-csomó bifurkáció a sejtciklus Start

26


eseményének felel meg. A Start esemény elõtt a G1 ellenõrzési mechanizmus egy stabil steady state-ben tartja az APC - CDK szabályozót.

inaktív

aktív

APC

AP

1.2

0.8

G1

C

+

APC APC

Cdk Ciklin 0.4

+ S/M 0.0 0.01

0.1 CDK (nuclear) CDK (sejtmagban)

növekedés

1

12. ábra: A Start a primitív eukarióta sejtben. A sejtnövekedéssel párhuzamosan a CDK a sejtmagban akkumulálódik, ezért a CDK nullklína (kék) felfelé mozdul el (ld. szaggatott vonal), aminek következtében a G1 stabil steady state összeolvad a nyeregponttal és ezáltal megszûnik. A nagy CDK aktivitású S/M állapotból a kis CDK aktivitású állapotba az APC aktiválódásával jut a rendszer, amire a mitózis meta/anafázis határán kerül sor. Az APC mitózis alatti aktiválódásának molekuláris részletei azonban még nem tisztázottak (ld. CohenFix & Koshland, 1997), ezért ennek leírására kidolgoztunk egy lehetséges mechanizmust (Novák et al., 1998b). Feltételezünk egy mitózis aktivátor fehérjét9 (ACT), mely az APC aktiválására képes, valamint azt, hogy APC aktiváló hatásának kifejtéséhez az aktivátornak aktiválódnia kell (13. ábra). Könnyû belátni, hogy a ciklusos mûködés megkívánja, hogy az aktivátor összkoncentrációja (ACTT ) fluktuáljon a sejtciklus alatt (nagy legyen az értéke a mitózisnál és alacsony a Start-nál). Ennek érdekében feltételeztük, hogy az aktivátor inaktív formája folyamatosan szintetizálódik, lebomlása viszont APC függõ folyamat10. Mindezek figyelembevételével az aktivátor dinamikája leírható az alábbi két DE-vel: 9

Ez az aktivátor a hasadó élesztõ Slp1 (Kim et al., 1998), a sarjadzó élesztõ Cdc20 (Hwang et al., 1998) és az ecetmuslica fizzy (Dawson et al., 1995), valamint az emlõs p55CDC-nak felel meg (Weinstein, 1997). Tulajdonképpen ezek a fehérjék ugyancsak az APC szubsztrátfelismerõ fehérjéi, melyek a B-típusú ciklinektõl eltérõ APC szubsztrátok felismerését szolgálják. Feltehetõen ezen fehérjék által felismert egyik APC szubsztrát fehérje lebontása vezet a B-típusú ciklinek lebontását segítõ Hct1 (Srw1/Ste9) fehérjék aktiválódásához. 10 Egy alternatív megoldás, hogy az ACT szintézise CDK függõ, lebomlása viszont nem szabályozott (konstitutív) folyamat. 27


d ACTT = kas - [kad’ (1 - APC) + kad” . APC ] . ACTT dt d ACT = kaa (ACTT - ACT) - kai . ACT - [kad’ (1-APC) + kad” . APC] ACT dt

(1c) (1d)

ahol ACTT = ACT + apoACT.

kas magorsóhoz nem tapadt kromoszómák

+ kai

k3

kaa

+

APC

ACT AP

k4 +

k1

degradált aktivátor

+

nem-replikált DNS

inaktív

kad

apoACT

C

+

aktív

Cdk

Cdk Ciklin

k2

degradált ciklin

13. ábra: Az aktivátor (ACT) szerepe az APC - CDK szabályozóban. Az aktivátor (ACT) illetve pontosabban annak inaktív formája (apoACT) folyamatosan szintetizálódik és lebontása APC függõ. Amíg a DNS replikáció be nem fejezõdött és a kromoszómák mindegyike nem tapadt a mitózisos orsóhoz, addig az ACT inaktiválási sebessége gyors, ezért nem képes aktiválódni. Az aktivátor molekulák megoszlása aktív (ACT) és inaktív (apoACT) formák között a DNSreplikáció (kais) és a mitózisos ellenõrzési pont (kaim) függvénye (kai = kais + kaim ). Ha a sejtben nem replikált DNS vagy a kromoszómákon szabad mikrotubulus kötõhely (kinetokór) van jelen, akkor az aktivátor inaktiválási reakciója (kai) gyors és az egyensúly az inaktív forma irányába van eltolva. A fázissíkon jól bemutatható az aktivátor hatása (14. ábra). Ha a szabályozó rendszer az S/M állapotba jutott, akkor az aktivátor koncentrációja növekszik, mert az APC inaktív, és az aktívátor lassan bomlik. Elõször azonban az aktivátor molekulák inaktív formában akkumulálódnak, mert a k ai értéke nagy. Amikor a DNS replikálódott és a kromoszómák 28


kivétel nélkül a mitózisos orsóhoz tapadtak, akkor a kai értéke leesik, és ezért az ACT aktív formájának koncentrációja gyorsan megnövekszik. Ez a hatás az APC egyensúlyi görbét jelentõs mértékben jobbra tolja el, mert megnövekszik az a kritikus CDK koncentráció mely az APC inaktiválásához szükséges. Láthatóan az S/M steady state (ismét nyereg-csomó bifurkációval) eltûnik, és a G1 steady state újraképzõdik. A szabályozási rendszer ennek megfelelõen a G1 steady state-be tart: az APC aktiválódik és a CDK aktivitás csökken. Ez a sejtciklus meta/anafázis átmenete és feltételezhetjük, hogy az APC aktiválódás hatására a sejt elosztódik (tömege felezõdik).

1.2 apoACT

G1

+

0.8 APC APC

ACT APC

inaktív

0.4

APC

aktív

S/M 0.0 0.01

0.1

1

(nuclear) CDKCDK (sejtmagban)

14. ábra: Az APC aktiválódása a meta/anafázis határán. Ha az APC, CDK, ACTT és ACT DE-ket (1a-1d egyenletek) kiegészítjük a sejtnövekedést leíró alábbi DE-vel: d mass = µ . mass (1e) dt akkor ezen öt DE (1a - 1e) numerikus megoldásával a primitív eukarióta sejtciklusa szimulálható (15. ábra)11. A szimuláció jól mutatja, hogy a modell rendelkezik az eukarióta sejtciklus minden jellegzetes tulajdonságával: 1. A két osztódás között eltelt idõ azonos a sejttömeg duplázódás idejével (ln2/µ) és ez a megállapítás eltérõ növekedési sebességekre is érvényes. 2. A CDK aktivitás kis és nagy értékek között változik, mely lehetõvé teszi a DNS komplett replikációját, és a kromoszóma replikáció és szegregáció alternálását. 11

A szimulációval kapcsolatos további részletek (pl. paraméter értékek, valamint kai idõbeli változása) megtalálhatók az eredeti publikációban (Novák et al., 1998b). 29


2

sejttömeg 1

1.2

Cdk AP

Ciklin

C

0.8

0.4

0.0 1.6

ACTT 1.2 0.8 0.4 ACT

0.0 0

40

80

120

160

200

240

Time (min)

15. ábra: A primitív APC-CDK szabályozó mechanizmus numerikus szimulációja. A szimulációval kapcsolatos technikai részleteket illetõen ld. Novák et al., (1998b).

30


4.1. Hiszterézis a primitív eukarióta sejtciklus modellben Könnyen bizonyítható, hogy a sejtciklus minimális szabályozó rendszere a hiszterézis tulajdonságával rendelkezik (Novák et al., 1998b). Ennek illusztrálására a sejttömegnek az aktivátor aktivitásához viszonyított arányát: mass k3’ + k3” . ACT használhatjuk bifurkációs paraméterként. A 16. ábra az APC steady state értékeit mutatja a bifurkációs paraméter függvényében. A görbe felsõ és alsó ága a stabil csomópontokat, míg a középsõ ága instabil nyeregpontot reprezentál. A szaporodó sejtek ezen a hiszterézis körön forognak az óramutató járásával egyezõen. Az újszülött sejtek a felsõ ágon tartózkodnak és a sejtnövekedés következtében jobbra haladnak, amíg el nem érik a bifurkációs pontot. Ekkor egy nyereg-csomó bifurkáció eredményeként a G1 steady state megszûnik és az egyetlen stabil állapot az S/M steady state lesz (Start átmenet). Majd a sejtek mindaddig az alsó ágon maradnak, amíg a DNS teljesen nem replikálódik és a kromoszómák a mitózisos orsóhoz nem tapadnak. Ekkor az ACT aktiválódik (a nevezõ megnõ és a bifurkációs paraméter lecsökken) és a rendszer visszaugrik a felsõ ágra (meta/anafázis átmenet).

növekedés 1 AP

C

csomópo

nt

0.8

APC APC

0.6

0.4

nt po g ere ny

meta/ana

Start

0.2

APC

csomópont 0

DNS replikáció és kromoszóma-mikrotubulus kapcsolat -0.2 0

2

4

6

mass/activator sejttömeg / aktivátor

16. ábra: Hiszterézis a primitív eukarióta modellben.

31

8

10


Sokan a sejtciklust egy határciklusos oszcillációval modellezik (Goldbeter, 1991; Halzimanikatis et al., 1995; Obeyesekere et al., 1995; Obeyesekere et al., 1992), ami elvileg helytelen. A sejtciklus szabályozás sokkal inkább egy hiszterézis körön történõ forgásnak felel meg, amit a növekedési és a kromoszómás ciklus eseményei kontrollálnak. A sejtciklusnak ez a minimális szabályozórendszere rendelkezik mindhárom ellenõrzési mechanizmussal és ezek mûködésének eredményeként két stabil steady state állapot (G1 és S/M állapotok) alakul ki a ciklusban. A primitív eukarióta sejtciklusból hiányzik a harmadik stabil állapot (G2 fázis), ami a legtöbb mai eukarióta sejtciklusra jellemzõ. Ennek az a magyarázata, hogy a primitív eukarióta sejtben a Start-ot követõen a DNS-replikáció és a mitózis (kromoszómák magorsóhoz történõ tapadása) egyszerre kezdõdik meg, vagyis az S és a korai M fázisok átlapolnak12.

5. A sztöhiometrikus Cdk inhibitor szerepe Az eddig tárgyalt legegyszerûbb modellben a Cdk aktivitás szabályozására csak a ciklin szintézis és lebontás szolgáltatott lehetõséget. A sejtek azonban a már elkészült aktív Cdk/ciklin komplex aktivitását is szabályozni tudják (ld. 2.2.1. pont). Ennek egyik módja, egy ún. Cdk inhibitor (CKI) szintézise, amely sztöhiometrikusan kapcsolódik a komplexhez, és gátolja annak protein-kináz aktivitását. Magasabbrendû eukariótákban többféle CKI-t is ismerünk (Sherr & Roberts, 1995), alacsonyabbrendû eukariótákban viszont kevesebb mûködik. Mivel a legõsibb Cdk/ciklin komplex feltehetõen a Cdk1/ciklin-B volt, ezért ennek inhibitora alakulhatott ki elõször. Cdk1/ciklin-B komplexre specifikus inhibitort mind a hasadó (Rum1), mind a sarjadzó (Sic1) élesztõben felfedeztek (Moreno & Nurse, 1994; Schwob et al., 1994), és ezek analógjai egymásnak (Sanchez-Diaz et al., 1998). Az alábbiakban a CKI elnevezés ezekre az egymással analóg inhibitorokra illetve ezek õsére utal. Egy ilyen gátló fehérjének a CDK - APC antagonizmushoz való hozzáadása az alábbi evolúciós elõnyöket jelenthette a sejtek számára: 1. A genetikai anyag (DNS) információ tartalmának növelésével párhuzamosan a sejtméret növelésére is szükség volt. A CDK CKI általi gátlása pedig jelentõsen növeli azt a sejtméretet, ahol az APC inaktiválódása bekövetkezhet (Start esemény), amint azt látni fogjuk.

12

Az S- és M-fázisok ilyetén történõ átlapolására még a mai eukarióta sejtekben (pl. sarjadzó élesztõ) is találunk példát.

32

5. A sztöchiometrikus Cdk inhibitor szerepe

2. Szexuális folyamatok (pl. párosodás) kezdeményezésére mindig a G1 fázisból kerül sor, amikor a DNS még nem replikált. Sejtnövekedést biztosító környezetben az APC inaktiválása (Start) csak a CDK gátlása esetén kerülhetõ el. A CKI kialakulása tehát a szexuális folyamatok fejlõdésének nyitott lehetõséget13. A CKI-vel kiegészített CDK - APC modellt a 17. ábra mutatja. A CKI lebontásánál a Rum1-gyel és Sic1-gyel kapcsolatos molekuláris ismereteket használtuk fel. Mindkét CKI ubikvitin függõ gyors lebontást szenved a proteoszómák által (Benito et al., 1998; Verma et al., 1997). Ezen fehérjék ubikvitinezése azonban nem lebontási szekvencia függõ (mint a Btípusú ciklineké), hanem a molekula foszforilezését igényli. A foszforilezett fehérjét egy APCtõl teljesen független ubikvitinezõ rendszer ismeri fel, amit a sarjadzó élesztõben jellemzett három komponensének kezdõbetûi alapján SCF -nek (Skowyra et al., 1997) nevezünk (Skp1 - Cullin - F-box protein).

kas magorsóhoz nem tapadt kromoszómák

+

kaa

kai k3

+

APC

ACT AP

k4 +

k1

C

aktív

+

Cdk

Cdk Ciklin

k2

kir Cdk Ciklin

k5

degradált ciklin

ki +

degradált CKI

CKI

CKI


+

nem-replikált DNS inaktív

kad

apoACT

k6 17. ábra: Az APC - CDK szabályozó egy G1 fázisban mûködõ CKI-val kiegészítve.

13

A CKI szerepét a szexuális folyamatokban alátámasztja, hogy a hasadó élesztõ Rum1 hiányos sejtjei (rum1∆ mutáns) szinte megkülönböztethetetlenek a vadtípustól, kivéve hogy sterilek, azaz nem képesek párosodni (Moreno & Nurse, 1994; Stern & Nurse, 1998). 33


Ennek megfelelõen az ubikvitinezést megelõzõen mindkét CKI CDK függõ foszforilezést szenved (Benito et al., 1998; Verma et al., 1997). Ha feltételezzük, hogy a CKI által gátolt CDK is képes foszforilezni a CKI-t (erre ma még nincs közvetlen bizonyíték, ld. késõbb), akkor CDK és a CKI antagonisztikus fehérjék. CKI megjelenését követõen tehát a CDK APC korábban ismertetett antagonizmusához egy újabb társult, ami a szabályozási rendszer mûködését megbízhatóbbá tette. Ha feltételezzük, hogy a CDK és a CKI komplexképzése gyors és reverzibilis folyamat (L = ki/kir - kötési egyensúlyi állandó), akkor összkoncentrációik idõbeli változási sebessége leírható az alábbi egyenletekkel (a levezetés megtalálható Novák et al., 1998b: Függelékében): d CDK T = k1 . mass - [v2’ (1- APC) + v2” . APC] (CDK T - TRI) dt - [k2’ (1- APC) + k2” . APC] TRI d CKIT = k5 - [k6’ + k6” (CDK T -TRI)] CKIT dt TRI =

2 L ⋅ CDK T ⋅ CKIT 1 + L ⋅ CDK T + L ⋅ CKIT + (1 + L ⋅ CDK T + L ⋅ CKIT ) 2 − 4 L2 ⋅ CDK T ⋅ CKIT

(3a) (3b)

(3c)

ahol CDK T (= CDK + TRI ) a ciklinek, CKIT (= CKI + TRI ) pedig az inhibitor összkoncentrációja, míg TRI a Cdk/ciklin/CKI trimer koncentrációja. Ennek a két DE-nek a vizsgálatára ismét a fázissíkot használhatjuk, ahol a sejttömeg (“mass”) és az aktivátor (ACT) értékét ismét paraméternek tekintjük. Mindkét egyensúlyi görbe Nalakú, ami a szabályozó molekulák közti antagonizmusok következménye. A CKI egyensúlyi görbe N-alakját az magyarázza, hogy a CKI gátolja a CDK-t, amely viszont foszforilezéssel kezdeményezi annak lebontását (18. ábra). A CDK nullklína N-alakját (19. ábra) pedig a CDK - APC antagonizmus magyarázza: az átló (CDK T = CKIT ) felett CDK T > CKIT és az APC inaktív (mert a CDK gátolja azt), ezért a CDK T steady state koncentráció közelítõleg: k1 / v2’. Ezzel szemben az átló alatt CDKT < CKIT , ezért az APC aktív, vagyis CDK T = k1 / k2”.

34


CDKT

0.5

Cdk Ciklin

CKI

-

0.25

CKI

+

Cdk Ciklin

Cdk Ciklin 0 0 . 000 1

0.25

0.5

0.75

1

CKIT

18. ábra: A CKIT egyensúlyi görbe (nullklína). A CKIT nullklína N-alakját a CKI/Cdk/ciklin trimer koncentrációjának maximuma okozza.

Az N-alakú egyensúlyi görbék szélsõ ágai stabilak, középsõ ágaik pedig instabilak. Az egymástól távol esõ két stabil ág az antagonizmus egyértelmû jele. A két egyensúlyi görbe metszéspontjai által meghatározott stabil steady state-ek ismét a sejtciklus G1 és S/M állapotainak felelnek meg. A Start elõtt álló kisméretû sejtek esetén a nullklínák három helyen metszik egymást, de a sejtnövekedés hatására a stabil G1 steady state megszûnik (ld. 19. ábra). A nullklínák változása a teljes sejtciklus alatt Novák et al. (1998b) 8. ábráján található meg. Amikor a CDK mind a CKI-vel mind az APC-vel antagonisztikus kölcsönhatásban áll, akkor a G1 állapot stabilitási tartománya jelentõsen kiterjed, mivel a CDK-nak két “ellenséget” (APC és CKI) kell egyszerre legyõznie. Ilyen esetben különös jelentõsége van az olyan Cdk/ciklin komplex(ek)nek, melyek: 1. koncentrációja és aktivitása érzéketlen mind az APC mind a CKI hatására és 2. képesek az APC és a CKI inaktiválására illetve foszforilezésére.

35


pre-Start

post-Start

0.75

0.75

S/G2/M S/G2/M

C D KT

0.5

C D KT

0.5

0.25

0.25

G1

0

0 0

0.25

0.5

0.75

0

C K IT

0.25

0.5

0.75

C K IT

19. ábra: Start átmenet a CKI-val kiegészített APC - CDK szabályozóban. Start elõtt álló sejtekben (baloldali ábra) a CKIT (piros) és a CDK T (zöld) egyensúlyi görbék három helyen is metszik egymást, és a szabályozó rendszer a bal alsó stabil steady state-ben tartózkodik. A sejtnövekedés hatására ez a steady state eltûnik (jobb oldali ábra) és a szabályozó rendszer az egyetlen megmaradt stabil steady state (S/G2/M) irányába mozdul el.

Ilyen tulajdonságú Cdk/ciklin komplexekre mindkét elõbb említett élesztõben ismerünk példát: n sarjadzó élesztõben a Cln1, Cln2 és Cln3-nak a Cdk1-gyel (Cdc28) alkotott komplexeit a Sic1 nem gátolja, viszont ezek a Cdk1/Cln1-3 komplexek képesek foszforilezni a Sic1-et és ezáltal kezdeményezni annak lebomlását (Schwob et al., 1994). Mivel egyik Cln sem rendelkezik lebontási szekvenciával, ezért az APC-nek egyik sem szubsztrátja, viszont a Cdk1/Cln1-3 komplexek bizonyítottan képesek az APC inaktiválására is (Amon et al., 1994). n hasadó élesztõben a Puc1 a sarjadzó élesztõ Cln3 homológja (Forsburg & Nurse, 1991). A Cdc2/Puc1 kinázt (Cdc2 a hasadó élesztõben a Cdk1) biokémiailag még nem vizsgálták részletesen, de minden okunk meg van annak feltételezésére, hogy tulajdonságaiban hasonlít a Cdc28/Cln3 komplexre, vagyis a Rum1 és az APC nem gátolja. A hasadó élesztõ másik starter kináza a Cdc2/Cig1 komplex lehet, amely ugyancsak érzéketlen a Rum1 gátlására (Correa-Bordes & Nurse, 1995; Martin-Castellanos et al., 1996). A 17. ábrán látható és a 3a-3c, valamint az 1b-1e egyenletekkel leírható szabályozási rendszer numerikus szimulációja megtalálható Novák et al. (1998b) 7. ábráján.

36


5.1. A sarjadzó élesztõ sejtciklusának modellje A CKI-val kiegészített primitív eukarióta modell nagyon közel áll a mai modern sarjadzó élesztõ sejtciklus szabályozásához. A sarjadzó élesztõben hat különbözõ B-típusú ciklin gén (CLB1-6) található (Nasmyth, 1996a). Mind a hat B-típusú ciklin inaktiválása esetén (clb1-6 mutáns) a sejtciklus gátlódik és a sejtek nem képesek a DNS-szintézis megkezdésére, jóllehet mindhárom Cln (Cln1-3) aktív (Schwob et al., 1994). Ez is jól mutatja, hogy a három Clnkináz csak az indító (“starter”) szerepét tölti be, de önmagukban nem képesek DNSreplikáció megindítására. A hat CLB közül azonban pusztán a CLB2 jelenléte elegendõ (a három Cln mellett) a sejtciklus normális lejátszódásához, jelezvén a CLB2 kitüntetett szerepét. Egy ilyen clb1 clb3-6 mutáns sejtciklus szabályozásának modelljéhez könnyen eljuthatunk az elõzõ pont modelljébõl az alábbi kiegészítésekkel. 1. A Clb2 szintézise bizonyítottan nem konstans a sejtciklus alatt, mert a Clb2-kináz aktíválja azt a transzkripciós faktort (Mcm1), amely a CLB2 gén átírását szabályozza. 2. A starter kinázok közül a Cln3 koncentrációja konstans, a CLN2 transzkripciója viszont szigorúan szabályozott mind pozitív mind negatív hatásokkal. Nevezetesen a Cln3 kináz aktiválja a CLN2 gén transzkripciós faktorát (SBF), a Clb2 kináz pedig inaktiválja azt (Amon et al., 1993). Tulajdonképpen a Cln2 kináz is aktíválja az SBF-et (pozitív visszacsatolás), de ez a hatás bizonyítottan gyenge (Dirick et al., 1995). Mindezek alapján a sarjadzó élesztõ sejtciklusát szabályozó molekuláris hálózatot a 20. ábra mutatja. Ha az APC és CDK (most Clb2/Cdc28) szabályozási modellt kiegészítjük starter kinázokkal és a fentebb leírt transzkripciós kontrollokkal, akkor az 1. táblázatban szereplõ modellhez jutunk, ahol TRI a Clb2/Cdc28 és a Sic1 alkotta trimer (L - a komplex kötés egyensúlyi állandója). Az eddigiekhez képest mindössze annyiban tértünk el, hogy: 1. a Sic1 (CKI) degradációjánál Michaelis-Menten kinetikát használunk 2. az ACT szintézisét szabályozzuk a CDK (Clb2) aktivitással és nem pedig a lebomlását az APC-vel (vö. 1c-1d és 4g-4h egyenleteket).

37


.

.

d SBF Va (ε 3 Cln3 + ε 2 Cln2) (1 - SBF) (Vi’ + Vi” (Clb2T - TRI)) SBF = dt Ja + 1 - SBF Ji + SBF

(4a)

d Cln2 . . = (k7’ + k7 SBF) mass - k8 Cln2 dt

(4b)

.

.

kmcmr MCM1 d MCM1 kmcm Clb2 (1 - MCM1) = dt Jmc1 + 1 - MCM1 Jmc2 + MCM1

(4c)

d Clb2T . . . = (k1’ + k1 MCM1) mass - [v2’ (1- APC) + v2” APC) ] Clb2T dt

(4d)

.

k6” Sic1T d Sic1T . . . = k5 - k6’ Sic1T - (γ3 Cln3 + γ2 Cln2 + Clb2T -TRI) dt Km2 + Sic1T

(4e)

.

d APC (k3’ + k3” ACT) (1 - APC) = )dt J3 + 1 - APC .

.

- (k4’ + k4” (Cln3 + φ 2 Cln2 + φ B2 Clb2))

APC J4 + APC

(4f)

d ACTT . . = kas’ + kas” (Clb2T - TRI) - kad ACTT dt

(4g)

d ACT . . = kaa (ACTT - ACT) - kai ACT - kad ACT dt

(4h)

ahol TRI =

2 L ⋅ Clb2 T ⋅ Sic1T 1 + L ⋅ Clb2 T + L ⋅ Sic1T + (1 + L ⋅ Clb2 T + L ⋅ SIc1T ) 2 − 4 L2 ⋅ Clb2 T ⋅ Sic1T

(4i)

1. táblázat: A clb5 clb6 hiányos sarjadzó élesztõ mutáns sejtciklusának matematikai modellje.

38


k as

ka d

apoACT +

inaktív

k3

replikálatlan DNS és magorsóhoz nem tapadt kromoszómák

ACT

APC

AP

k4

+

Cdc28

+

Cln2

k1

k ai

kaa

C

aktív

+

lebontott Clb2

+

MCM

lebontott ACT

k2

Cdc28

Clb2 Cdc28 L

Clb2

Sic1

+

k5

Sic1

Sic1

Cdc28

k6

+

lebontott Sic1

P

gyors

-

k7

Cdc28

SBF +

k8

Cln2

lebontott Cln2

+

Cdc28

Cln3

20. ábra: A sarjadzó élesztõ clb5 clb6 mutánsának sejtciklusát irányító molekuláris hálózat.

39


Ha feltételezzük, hogy a transzkripciós faktorok (SBF, MCM1) valamint az APC átalakulása gyors az aktív és inaktív formák között, akkor steady state koncentrációjuk az alábbi egyenletek megoldásaként adódik: SBF = G(Va (ε Cln3 + ε Cln2), Vi’ + Vi” (Clb2T - TRI), Ja, Ji ) . MCM1 = G( kmcm Clb2, kmcmr, Jmc1, Jmc2 ) . . . . APC = G(k3’ + k3” ACT, k4’ + k4” Cln3 + ε A2 Cln2 + ε AB2 Clb2, J3, J4 ) .

.

ahol G(a,b,c,d) az ún. Goldbeter & Koshland (1981) függvény: G( a, b, c, d ) =

2ad b − a + bc + ad + ( b − a + bc + ad )2 − 4( b − a )ad

Ha az ACT-t és a “mass”-t paraméterként kezeljük és a maradék DE-ek (4b, 4d és 4e) baloldalát nullával egyenlõvé tesszük, akkor a 4i egyenlet felhasználásával egy négy ismeretlenes (Cln2, Clb2T , Sic1T és TRI) nem-lineáris algebrai egyenletet kapunk, melynek numerikus megoldásával a Cln2 és a Clb2 nullklínák számíthatók. Ezt a fázissík portrét a 21. ábra mutatja, ahol mindkét nullklína N-alakú. Kis méretû G1 fázisú sejtekben a két nullklína öt pontban metszi egymást A G1 steady state-ben mind a Cln2 mind a Clb2 kináz aktivitások kicsik. A sejtnövekedés eredményeként azonban a Cln2 nullklína felfelé mozdul el, ezért a G1 steady state megszûnik, és a kontroll rendszer az S/M steady state felé halad (ld. a trajektóriát), majd a következõ események játszódnak le (Tyson et al., 1995): 1. SBF transzkripciós faktor aktiválódásának eredményeként a Cln2 koncentráció megnõ, 2. a megnövekedett Cln2 aktivitás foszforilezi a Sic1-et (CKI) és kikapcsolja az APC-t, aminek eredményeként 3. a Clb2 aktivitás megnõ, aktiválja saját transzkripcióját (Mcm1), gátolja a Cln2 transzkripcióját (SBF), tehát annak koncentrációja csökken. Ezzel a modellel kvantitatív részletekbe menõen szimulálni tudtuk a sarjadzó élesztõvel végzett fiziológiai kísérleteket, és számos sejtciklus mutáns viselkedését (Chen et al., 1998).

40

6. A CDK foszforilezés szerepe

3.00

3.00

S/M

S/M

0.50

0.50

Clb2T

2.50

Clb2T

2.50

0.25

0.25

G1 0.00 0.00

0.25

0.50

Cln2

0.00 0.00

0.25

Cln2

21. ábra: A sarjadzó élesztõ Start kontrolljának fázissík portréja.

41

0.50


6. A CDK foszforilezés szerepe Az eddig tárgyalt modellekben a Cdk aktivitás a Start eseményt követõen gyorsan növekszik, ami a DNS-replikáció és a mitózis párhuzamos megkezdéséhez, illetve részben átlapoló bekövetkezéséhez vezet. “Kis” DNS tartalommal rendelkezõ alacsonyabbrendû eukariótákban (pl. sarjadzó élesztõ) erre még ma is találni példát (Nasmyth, 1996a). A DNS tartalom evolúció alatti növekedése azonban megkövetelte a DNS egyre tökéletesebb “csomagolását” a mitózis alatt (pro- és metafázis). A DNS intenzív csomagolása viszont nem kompatibilis a DNS-replikáció párhuzamos bekövetkezésével, mivel a molekula kondenzálása gátlólag hat a replikációra. Ennek következtében az intenzív kromoszóma kondenzációt végzõ sejtek elõször DNS-replikációt végeznek, majd egy jól meghatározott szünet (G2 fázis) után lépnek csak mitózisba. A DNS-replikációt és a mitózist elválasztó G2 fázis a mitózist serkentõ Cdk1/ciklin-B komplex (MPF) átmeneti gátlásával valósul meg (Nurse, 1991). A Cdk1 katalitikus alegység aktív centruma ugyanis foszforilezhetõ aminosav oldalláncokat tartalmaz, melyek foszforilezése gátolja a Cdk-t szubsztrátjainak (foszforilezendõ fehérje és ATP) megkötésében. Jóllehet két szomszédos aminosav oldallánc (egy treonin és egy tirozin) foszforilezése következhet be (Morgan, 1995), az egyszerûség kedvéért ezeket nem különböztetjük meg, hanem csak egy gátló tirozin foszforilezést veszünk figyelembe (22. ábra). Az MPF-et a Cdk1 aktív centrumában foszforilezõ és inaktíváló tirozin kináz enzimet Wee1nek nevezzük (Nurse, 1990). Ha ugyanis az enzimet kódoló gént hasadó élesztõben mutációval inaktíváljuk, akkor a sejtek kisebb méretnél (wee = törpe) osztódnak (Nurse, 1975). A Wee1 tirozin kináz által létrehozott inaktív MPF-et (preMPF) pedig a Cdc25 tirozin foszfatáz aktiválja, amit ugyancsak a hasadó élesztõben fedeztek fel elõször (ld. Millar & Russell, 1992). Ennek mutációja sejtciklus (mitózis) gátlást eredményez, mivel Cdc25 hiányában az MPF nem aktiválódhat. Az MPF aktiválódását a G2 fázis végén enzimes szabályozási mechanizmusok teszik teljessé és irreverzibilissé (22. ábra): mind a Wee1 mind a Cdc25 ugyanis foszforilezéssel szabályozott enzimek, és az MPF mindkét enzim foszforilezésére képes (ld. Coleman & Dunphy, 1994). Amíg azonban a Wee1 MPF általi foszforilezése gátolja annak aktivitását, addig a Cdc25 foszforilezése aktíválja azt (Coleman & Dunphy, 1994). A két enzim MPF általi szabályozása pozitív visszacsatolási mechanizmust eredményez a mitózis szabályozásában (Novák & Tyson, 1993b).

42


kas

kad

apoACT

magorsóhoz nem tapadt kromoszómák

+

kai

kaa


Cdk Ciklin

+

+

k3 inaktív

APC

ACT C AP

k4 +

+

Cdk

k1

Cdk Ciklin +

P Wee1

aktív

kw kwr

+

kwee kcdc25 Wee1

Cdc25

k2

degradált ciklin

k25 k25r

Cdc25

P +

P

+

Cdk Cyclin

nem-replikált DNS 22. ábra: A Cdk alegység tirozin foszforilezésével kiegészített APC - CDK szabályozó. A Cdk/ciklin komplexet a Wee1 tirozin-kináz foszforilezéssel gátolja, a Cdc25 tirozinfoszfatáz pedig defoszforilezéssel aktiválja. Mindkét enzim aktivitását a Cdk1/ciklin-B komplex foszforilezéssel szabályozza: a Wee1-nek a defoszforilezett formája, míg a Cdc25nek a foszforilezett formája aktívabb (az aktívabb formák vannak a reakciót reprezentáló nyílhoz közelebb rajzolva). Az APC a Cdk/ciklin dimerek mindkét formáját egyforma hatékonysággal bontja le, de a tirozin-foszforilezett dimerek lebontása az ábrán nincs feltüntetve. A G2 fázis kialakulását követõen a nem-replikált DNS által szabályozott ellenõrzési mechanizmus hatáspontja meg kellett változzon illetve új hatáspontjai kellett, hogy kialakuljanak. Ha ugyanis a nem-replikált DNS csak a mitózis meta/anafázis átmenetét szabályozná az ACT-n keresztül, akkor a DNS-replikáció gátlásakor a sejtek mitózisba lépnének és a kromoszóma kondenzáció miatt nem tudnák befejezni a replikációt még az eredeti gátlás megszûnésekor sem. Éppen ezért G2 fázissal rendelkezõ sejtekben a nemreplikált DNS a mitózisba lépést kell hogy szabályozza illetve meggátolja. A legegyszerûbb módja ennek az MPF inaktív formában való tartása tirozin foszforilezéssel. Fenti gondolatmenet alátámasztására szolgáljon az alábbi két példa (ld. pl. Osmani & Ye, 1997): n A G2 fázissal nem rendelkezõ sarjadzó élesztõben a nem-replikált DNS az APC aktiválódását gátolja, míg 43


n a jelentõs G2 fázissal rendelkezõ hasadó élesztõben az MPF aktiválódását gátolja, annak tirozin foszforilezett formában (preMPF) tartásával. Annak ellenére, hogy számos kísérletes evidencia támasztja alá, hogy a nem-replikált DNS gátolja az MPF defoszforilezését, az elsõdleges hatáspont a mitózis kontroll mechanizmusában még ma sem ismert (Lew & Kornbluth, 1996; Marlovits et al., 1998). A 22. ábrán látható molekuláris mechanizmusban az általunk évekkel ezelõtt javasolt elképzelést (Novák & Tyson, 1993a; Novák & Tyson, 1993b) mutatja, miszerint a nem-replikált DNS aktiválja az MPF pozitív visszacsatolási mechanizmusa ellen mûködõ foszfatázokat. A 22. ábrán látható szabályozási rendszer dinamikája az 1b-1e egyenletek mellett (az 1d egyenletben kaa-t (kaa’+ kaa”· CDK A) taggal helyettesítjük) az alábbi DE-kkel írható le: d CDK T = k1 . mass - k2 . CDK T dt

(5a)

d CDK A = k1 . mass - k2 . CDK A - kwee . CDK A + kcdc25 (CDK T - CDK A) dt

(5b)

d Wee1 kwr (1 - Wee1) kw . CDK A . Wee1 = dt Jwr + 1 - Wee1 Jw + Wee1

(5c)

d Cdc25-P k25 . CDK A (1 - Cdc25-P) = dt J25 + 1 - Cdc25-P

(5d)

k25r . Cdc25-P J25r + Cdc25-P

ahol k2 = v2’ (1- APC) + v2” . APC kwee = vwee’ (1 - Wee1) + vwee” . Wee1 kcdc25 = v25’ (1 - Cdc25-P) + v25” . Cdc25-P kwr = kwr’ + ks k25r = k25r’ + ks

(5e) (5f) (5g) (5h) (5i)

CDK T az aktív Cdk/ciklin komplex (CDK A) és a tirozin foszforilezett dimerek (preMPF) koncentrációinak összege, vagyis az össz-ciklin koncentráció. A Wee1 és a Cdc25 enzimek összkoncentrációit egységnyinek tételezzük fel. A teljes modell két dimenziósra redukálható a szabályozott enzimek (Wee1, Cdc25 és APC) kvázi steady state állapotban való feltételezésével (ld. Novák et al., 1998b függelékét). A fázissík ábrázoláshoz használt két dinamikus változó a CDK A (aktív MPF) és a CDK T (ciklinT ), melyek nullklínái az alábbi egyenletekkel adottak: CDK T = CDK A . (1 +

kwee + k2 kcdc25 44

)-

k1 . mass kcdc25

(6a)


CDK T =

k1 . mass k2

(6b)

ahol k2, kwee és kcdc25 nem állandók, hanem az APC illetve a CDKA függvényei. Ha a ciklinek szintézise (k1) és degradációja (k2) sokkal lassabb a dimerek foszforilezésénél (kwee) és defoszforilezésénél (kcdc25), akkor az MPF nullklína (6a. egyenlet) közelítõleg: kwee CDK T = CDK A . (1 + ) (6c) kcdc25 ami nem más mint azon pontok halmaza, ahol a Cdk/ciklin dimerek foszforilezése és defoszforilezése egyensúlyban van: kwee . preMPF = CDK A kcdc25 Éppen ezért ezt a 6c egyenlettel definiált görbét dimer egyensúlyi görbének (DEG) nevezzük (Novák & Tyson, 1993b). A DEG N-alakjáért az inaktív MPF (preMPF) forma egyensúlyi koncentrációjának maximumos lefutása felelõs (ld. Novák & Tyson, 1993b: 3. ábra). Az össz-ciklin koncentráció (CDK T ) 6b egyenlettel adott egyensúlyi görbéjét pedig ciklin egyensúlyi görbének (CEG) nevezzük (Novák & Tyson, 1993b). Az egyensúlyi görbék metszéspontjai most akár három stabil steady state-et is szolgáltathatnak, melyek az alábbi ellenõrzési pontoknak felelnek meg (23. ábra): 1. G1 ellenõrzési pont: aktív APC, kis ciklin koncentráció és kis MPF aktivitás. 2. G2 ellenõrzési pont: inaktív APC, nagy ciklin koncentráció, de a Cdk/ciklin dimerek többsége tirozin-foszforilezett, ezért kisebb az MPF aktivitás. 3. mitózisos (meta/anafázis) ellenõrzési pont: inaktív APC, nagy ciklin koncentráció és nagy MPF aktivitás. Ebben a modellben is érvényes, hogy a sejt növekedésével párhuzamosan a ciklin egyensúlyi görbe felfelé és balra mozdul el. Ennek eredményeként a méret növekedésével mind a G1, mind a G2 ellenõrzési pontok eltûnnek. A méretkontroll tehát mindkét ellenõrzési pontban szerepet játszhat. A valóságban azonban mindig csak az egyik ellenõrzési pontban játszott szerepe lehet sebesség-meghatározó. Ennek a modellnek a numerikus szimulációja, valamint a fázissík portrék változása a sejtciklus alatt Novák et al. (1998b) 10. és 11. ábráján látható.

45


23. 2

CDK T

1.6

M

S/G2

1.2 0.8 0.4

G1

0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

CDKA

ábra: A tirozin foszforilezéssel kiegészített APC - CDK szabályozó fázissík diagramja.

6.1. Az embrionális sejtciklus Az afrikai karmosbéka (Xenopus laevis) embrionális sejtciklusának szabályozása volt tulajdonképpen az elsõ biokémiailag tisztázott sejtciklus szabályozási rendszer. Ennek a sikernek alapvetõen az a magyarázata, hogy a Xenopus embriókból sikerült olyan citoplazmás kivonatot készíteni (Murray, 1991), mellyel a sejtciklus eseményei kémcsõben (in vitro) reprodukálhatók (24. ábra). A biokémiai részletek ismertetése elõtt azonban érdemes röviden összefoglalni az embrionális sejtciklus fiziológiáját, mivel az embriók (megtermékenyített petesejtek) sejtciklusa jellegzetesen különbözik a többi ún. testi vagy szomatikus sejt ciklusától (Murray & Hunt, 1993). Ennek az eltérésnek az az alapvetõ oka, hogy az embrióban a megtermékenyítést követõ elsõ osztódások alatt nincs sejtnövekedés, hanem csak sejtosztódás (ld. 2.1. pont). Ennek eredményeként a gyorsan osztódó embrióban a sejtek egyre kisebbek lesznek, amire azért van lehetõség, mert a megtermékenyítés elõtt álló petesejtek sokkal nagyobbak a normális sejteknél. Ezeket az ún. korai embrionális ciklusokat a citoplazma mérete nem szabályozza, mert annak nagysága kritikus érték feletti. Az embrionális sejtciklus során tehát a méretkontroll mechanizmusok hiányoznak.

46


aktivált petesejt

centrifugálás

citoplazma kivonat sejttörmelék

S Cdc2

P Cdc2 Cyclin

M

S Cdc2

Cdc2

P Cdc2 Cyclin

Cyclin

M Cdc2 Cyclin

MPF aktivitás oszcillál

24. ábra: In vitro “sejtciklusok”. Az Afrikai karmosbéka (Xenopus laevis) embriójának korai sejtciklusai kb. 30 percet vesznek igénybe. Az aktivált petesejtekbõl készített sejtmentes kivonatban az MPF periodikusan aktiválódik, akárcsak az intakt embrióban. Az ellenõrzési mechanizmusokban a méretkontroll mellett a kromoszómák állapotának ellenõrzése játszik alapvetõ szerepet. A korai embriókban ez az ellenõrzés sem mûködik, mert a DNS mennyiség (a citoplazmához viszonyítva) olyan kicsi, hogy a szabályozási rendszer érzéketlen annak állapotára (ld. Murray & Hunt, 1993). Az embrionális sejtciklusok az ellenõrzési pontok hiánya következtében igen gyorsak. A Xenopus embrióban pl. a megtermékenyítést követõ 2. - 12. sejtciklusok mindegyike csak 30 percet vesz igénybe. A 12. ciklust követõen (midblasztula átmenet) a sejtciklusok hossza jelentõsen megnõ az ellenõrzési pontok mûködésbe lépésének következtében (Newport & Kirschner, 1982). A sejtmentes kivonatban a kromoszóma replikáció és szegregáció ciklusok kicsit lassabban (kb. 60 - 70 perc alatt) játszódnak le, de a “sejtciklus fázisok” aránya hasonló. Nevezetesen, mind az embrióban mind a kivonatban a DNS-replikáció azonnal követi a mitózist, vagyis nincs G1 fázis. A DNS-replikációt és a mitózist rövidebb (embrió) illetve hosszabb (sejtmentes kivonat) G2 fázis választja el.

47


Az embrionális ciklusok alatt nincs sejtnövekedés, de fehérjeszintézis folyik a petesejt által biztosított mRNS templátok felhasználásával. Az embrionális ciklusok lejátszódásához szükséges fehérjék többsége azonban rendelkezésre áll, ezért nincs szükség a szintézisükre. Tulajdonképpen a ciklin-B az egyetlen fehérje, aminek a szintézisére szükség van (Murray & Kirschner, 1989). Ennek megfelelõen a ciklin-B-t leszámítva minden fehérje koncentrációját (pl. ACT) állandónak tételezhetjük fel, vagyis eltekinthetünk a szintézisek és lebontási folyamatok kinetikai leírásától. Ha feltételezzük, hogy a Cdk1 (Cdc2) és a ciklin-B komplex képzõdés gyors (szabad ciklin koncentráció közelítõleg nulla), és a Cdk1 mennyisége nem limitáló, akkor a 25. ábrán látható molekuláris mechanizmus leírható az alábbi DE-kkel: d ciklinT = k1 - k2 . ciklinT dt

(7a)

d MPF = k1 - k2 . MPF - kwee . MPF + kcdc25 (ciklinT - MPF) dt

(7b)

d ACT k aa . MPF (ACTT - ACT) k ai . ACT = dt Jaa + ACTT - ACT Jai + ACT

(7c)

d APC (k3’ + k3” . ACT) (1 - APC) k4 . APC = dt J3 + 1 - APC J4 + APC

(7d)

d Wee1 kwr (1 - Wee1) kw . MPF . Wee1 = dt Jwr + 1 - Wee1 Jw + Wee1

(7e)

d Cdc25-P k25 . MPF (1 - Cdc25-P) k25r . Cdc25-P = dt J25 + 1 - Cdc25-P J25r + Cdc25-P

(7f)

ahol k2, kwee, kwr, kcdc25 és k25r az 5e-5i egyenlettel adottak14 A fenti egyenletek azonosak az elõzõ pont DE-vel az alábbi különbségekkel: 1. az ACT összkoncentrációja (ACTT ) most konstans (ld. fentebb), de a két forma egymásba alakulásának leírásánál Michaelis-Menten kinetikát használunk (ld. 7c egyenlet), 2. a sejttömeg (mass) nem játszik szerepet, mivel az embrióban az MPF-nek nem kell a sejtmagban akkumulálódnia, hogy aktiválódjon, 3. az APC inaktiválódását nem Cdk függõnek (k4’ + k4” . CDK), hanem állandónak tekintjük (k4).

14

Az itt ACT-nek ill. APC-nek jelölt komponenseket korábban (Novák & Tyson, 1993b) IE (Intermedier Enzim) ill. UbE (Ubikvitinezõ Enzim) neveztük. 48


P

Cdk1

gyors

Cdk1 apoACT

kai kaa

k2

k2

k3

P Wee1

kwr

+

C AP

kw

ACT

k4

APC

+

Wee1 P

Cdk1

Cdk1

Ciklin B

Ciklin B

P Cdc25

k25r

MPF

+

k25

Cdc25

k ass

Cdk1

Ciklin B

k2

k1 aminosavak

25. ábra: A mitózis-kontroll molekuláris mechanizmusa Xenopus embrióban. A harmadik változtatást az indokolja, hogy az embrióban nemcsak a Cdk1/ciklin-B komplex van jelen, amely inaktiválni képes az ciklin lebontó mechanizmust, hanem más Cdk/ciklin komplexek is. Ezek közül talán legfontosabb a Cdk2/ciklin-E dimert megemlíteni, amely a midblasztula átmenet elõtt állandó és nagy koncentrációban van jelen (Rempel et al., 1995). Valószínûleg ez a komplex képes az APC mitózist követõ gyors inaktiválására és ez magyarázhatja a G1 fázis hiányát a korai embrionális ciklusok alatt15. Nagyon fontos észrevenni, hogy ezen változás eredményeként az MPF ciklin lebontásra gyakorolt hatása most pozitív, vagyis az MPF most serkenti a saját lebontását (negatív visszacsatolás), mert aktiválja az APC aktivátorát (ACT).

15

Meg kell azonban jegyezni, hogy az ábrán látható komponensek (ACT és APC) Xenopus megfelelõinek azonosításával problémák adódnak. Az embrionális ciklusok alatt ugyanis Hct1 nem mutatható ki az embrióban (Lorca et al., 1998). Ez könnyen érthetõ, ha meggondoljuk, hogy a Hct1 felelõs a G1 állapot stabilitásáért és az embrionális ciklusból ez a fázis hiányzik. Az embrionális ciklusok alatt azonban a B-típusú ciklinek lebomlanak, hiszen éppen így fedezték fel õket. Ebbõl következik, hogy a mitózisos ciklinek lebontásának kell legyen a Hct1-tõl független mechanizmusa is. A legtöbb adat arra utal, hogy az embrióban a ciklinek a Cdc20-tól (ACT a modellben) függõ módon bomlanak le. 49


A fenti differenciálegyenlet-rendszer az elõzõ pontban alkalmazott MPF - ciklin (totál) fázissíkon vizsgálható. A paraméterek megfelelõ megválasztásával a két egyensúlyi görbe az N-alakú dimer egyensúlyi görbe középsõ (instabil) ágán metszi egymást, ami egy instabil steady state-et reprezentál (26. ábra ). Ezt az instabil fókuszpontot egy határciklus veszi körül, amelynek következtében mind a ciklin mind az MPF idõben spontán oszcillálnak. Az MPF, preMPF és össz-ciklin koncentráció egy típusos oszcillációját a 27. ábra mutatja be és részletesebb kép az oszcillációról Novák & Tyson (1993b) 9. ábráján és Marlovits et al. (1998) 2. ábráján található. Láthatóan az oszcillációt a pozitív visszacsatolási mechanizmusok hajtják és a szubsztrát (ciklin) elfogyása korlátozza. Ezek a jellegzetességek a mitózis kontroll modellje és a “Brüsszelátor” nevû absztrakt oszcillációs mechanizmus (Lefever et al., 1967) közti hasonlóságra utalnak. Ez a hasonlóság a nullklínák hasonlóságában is kifejezésre jut a fázissíkon (ld. 26. ábra). Annak ellenére, hogy a mitózis kontroll modellje nagyon hasonlít a “Brüsszelátor”-ra, annál sokkal komplexebb dinamikai viselkedésekre képes (Novák & Tyson, 1993b). Ezen dinamikai sajátságok feltárása azonban azt kívánja, hogy a szabályozott enzimek (Wee1, Cdc25, ACT és APC) kvázi-stacionárius feltételezését vessük el, és az összes DE-t oldjuk meg numerikusan számítógép segítségével. A pozitív visszacsatolási mechanizmusokon túlmenõen a mitózis kontroll szabályozó rendszere ugyanis egy további steady state-et destabilizáló hatással rendelkezik. Ez nevezetesen egy negatív visszacsatolási kör, ami ugyancsak oszcillációk létrejöttéhez vezet. Hogy melyik destabilizáló szignál a domináló, az az MPF foszforilezés/defoszforilezés és a ciklin szintézis/degradáció folyamatok relatív sebességeinek arányától függ (ld. Novák & Tyson, 1993b: 11. ábra): n ha a ciklinek összkoncentrációja lassabban változik, mint ahogy Cdk/ciklin dimerek foszorilezõdnek és defoszforilezõdnek, akkor a pozitív visszacsatolásos oszcilláció a jellemzõ. n ha viszont a ciklin szintézis sebessége gyorsabb, mint a dimerek foszforilezése és defoszforilezése, akkor a negatív visszacsatolásos oszcilláció a jellemzõ.

50


Brüsszelátor +

P Cdk Ciklin

Cdk

Y

Cdk

Ciklin

+

AS

Ciklin

+

X

10 0.5

Z=X+Y

ciklin

0.4

0.3

0.2

5

0.1

0 0.01

0.1

0 0.1

1

MPF

1

X

10

26. ábra: A mitózis-kontroll modell és a Brüsszelátor fázissík diagramjai.

30 total Ciklin

20 P

Cdk Ciklin

Cdk Ciklin

10

0 0

60

120

180

idõ (min)

27. ábra: Az MPF és a ciklin oszcillációja a Xenopus sejtmentes kivonat modelljében. Az ábra azon modell szimulációjával készült, melyben a sebességi állandók nagy részét kísérleti eredményekbõl meghatároztuk (Marlovits et al., 1998). Ilymódon az ordináta értékek nM-ban kifejezett koncentrációkat jelentenek mindhárom komponensre. 51


A negatív visszacsatolással hajtott oszcillációkra jellemzõ, hogy a tirozin-foszforilezett dimer csak kis koncentrációban van jelen (Novák & Tyson, 1993b). Feltehetõen az intakt embrióban a nagyobb ciklin szintézis sebesség miatt a negatív visszacsatolás, míg a sejtmentes kivonatban a pozitív visszacsatolás fontosabb az oszcillációk létrejötte szempontjából. Alátámasztja ezt a feltételezést, hogy az embrióban a Cdk1 (Cdc2) tirozin-foszforilezése nem mutatható ki a midblasztula átmenet elõtt (Ferrell et al., 1991). A negatív visszacsatolással hajtott oszcillációkból való átmenet a pozitív visszacsatolással hajtott oszcillációkba a midblasztula átmenetnél jól szimulálható a modellel (ld. Novák & Tyson, 1993b: 13. ábra).

6.2. Küszöbértékek, bistabilitás és hiszterézis mitózis kontrollban Az N-alakú DEG következtében a mitózis kontroll modelljében a ciklin koncentrációnak küszöbértéket kell elérnie, hogy az MPF aktiválódjon. Az MPF aktiválódás ciklin küszöbértékét Mark Solomon és mtsai (1990) kísérletesen igazolták az alábbi protokoll alkalmazásával: ciklin szintézisre nem képes (fehérjeszintézisben gátolt) Xenopus kivonathoz (melyben a Cdc2 monomer formában van jelen), nem lebontható (lebontási szekvencia hiányos) ciklin-B-t adott és figyelte az MPF aktiválódását. Alacsony ciklin koncentrációknál az MPF nem aktiválódott, kritikus érték felett viszont csak egy kezdeti lag szakaszt követõen jelent meg az aktivitás (28. ábra). Ezen kísérletek numerikus szimulációja látható a 29. ábrán16. Ebben a kísérleti rendszerben a ciklin koncentráció állandó, ezért a CEG vízszintes. A Solomon által tapasztalt MPF aktiválódáshoz szükséges küszöbérték a DEG lokális maximumának felel meg (30. ábra). Alacsony ciklin koncentrációnál (steady state a DEG balágán) a dimerek tirozinfoszforilezettek és az MPF nem aktiválódik. Küszöbérték feletti ciklin koncentrációnál az MPF aktiválódik, de csak egy lag szakasz után. A lag szakaszt a dimerek átmeneti tirozinfoszforilezése okozza (31. ábra). A modell tehát magyarázza az MPF ciklin általi aktiválódás mindkét jellegzetességét: ciklin küszöb és lag szakasz.

16

A lag szakasz 29. és a 30. ábrán látható szimulációjánál egy sokkal részletesebb modellt használtunk (Novák & Tyson, 1993b), amelyben többek között nem használtuk azt az egyszerûsítõ feltételezést, hogy a szabad ciklin és a szabad Cdk1 asszociációja pillanatszerûen gyors folyamat. 52


Lag szakasz

Küszöbérték 120 15 100

80

MPF

MPF

10 60

40 5 20

0

0 0

10

20

Ciklin

30

0

10

(nM)

20

30

40

id õ (min)

28. ábra: Az MPF in vitro aktiválódása nem lebontható ciklin hatására. Az MPF aktiválódása csak egy bizonyos ciklin küszöbérték felett következik be (baloldali ábra), és csak egy kezdeti lag szakaszt követõen (jobboldali ábra). A baloldali ábra Solomon et al. (1990), míg a jobboldali Clarke et al.(1992) kísérleti adatai alapján készült. A jobboldali alsó ábrán a küszöbérték alatti (piros) és küszöbérték feletti (zöld) ciklin koncentrációt is alkalmaztak. 1

MPF

0.3

0.8

1.0 0.2

0.9 0.1

0.8 0 0

0.6

0.1

0.2

0.3

0.7

0.4

MPF

ciklin

0.6 0.5 0.4

0.4

0.2 0.3 0.2 0 0

10

20

30

idõ (min)

29. ábra: Az MPF ciklin indukált in vitro aktiválódásának szimulációja. A szimulációval kapcsolatos részleteket illetõen ld. Novák & Tyson (1993b). A görbék feletti számok a ciklin koncentrációját jelzik a konstans Cdk-hoz viszonyítva. A kis ábra a végsõ MPF koncentráció értékeket mutatja a ciklin koncentráció függvényében. A két ábra közvetlenül összehasonlítandó a 28. ábra két ábrájával.

53


0.3

ciklin

0.2

P Cdk Ciklin Cdk

0.1

Ciklin

0 0.01

0.002

MPF

0.1

1

30. ábra: A Solomon kísérletek (Solomon et al., 1990) fázissík ábrázolásban. A pozitív visszacsatolási mechanizmusok következtében a Wee1 és Cdc25 aktivitásainak aránya csökken az MPF koncentrációval. A DEG görbe N-alakját pedig a tirozin foszforilezett forma maximuma okozza. Ciklin szintézis és lebontás hiányában a CEG vízszintes és az MPF aktiválódás ciklin küszöbértéke a DEG lokális maximuma.

0.8

Ciklin

0.6

Cdk Ciklin

P

Cdk Ciklin

0.4

0.2

0 0

5

10

15

20

time id õ (min) (min)

31. ábra: Az MPF aktiválódás lag szakaszát a Cdk tirozin foszforilezése okozza. A 29. ábra 0.8 ciklin értékkel végzett szimulációja látható, de az aktív MPF mellett a szabad ciklin koncentráció és a tirozin foszforilezett dimer koncentrációja is fel van tüntetve.

54


A modellben a lag szakasz hossza a ciklin koncentráció függvénye (ld. Novák & Tyson, 1993b: 1159. oldal), a kísérletekben viszont a lag hosszát a ciklin koncentrációtól függetlenül állandónak találták (Solomon et al., 1990). Nagyon valószínû azonban, hogy a kísérletekben küszöbértéket csak kevéssé meghaladó ciklin koncentrációt (amelynél a lag jelentõsen hosszú) nem használtak, nagy ciklin koncentrációknál pedig a lag hosszában tapasztalható kis különbségek a kísérletek felbontása alatt vannak (ld. 29. ábra és Novák & Tyson, 1993b: 1159. oldal). Vízszintes CEG (konstans ciklin koncentráció) esetén köztes ciklin koncentrációknál a mitózis kontroll két alternatív stabil steady state állapottal (bistabilitás) rendelkezik (32. ábra): 1. interfázisú állapot: alacsony MPF aktivitás és a dimerek többsége tirozin-foszforilezett. 2. mitózisos állapot: nagy MPF aktivitás, kevés tirozin-foszforilezett dimer.

interfázis

mitózis

ciklin

0.3

0.2

0.1

0 0.002

0.01

0.1

1

MPF

32. ábra: Bistabilitás a mitózis kontroll modellben. Konstans ciklin koncentráció mellett a mitózis kontroll két alternatív stabil steady state állapottal rendelkezik, amelyeket egy instabil nyeregpont választ el. Hogy a szabályozórendszer melyik stabil steady state irányába halad, azt a kezdeti feltételeken keresztül a rendszer múltja determinálja. A bistabilitásból következõen a mitózis kontroll a hiszterézis tulajdonságával is rendelkezik (Novák & Tyson, 1993a; Novák & Tyson, 1993b; Tyson et al., 1996): az MPF aktiválása nagyobb ciklin koncentrációt igényel, mint az MPF aktívan tartása. Ennek megfelelõen az MPF inaktiváláshoz tartozó ciklin küszöbérték (DEG lokális minimuma) kisebb az MPF aktiválásához szükséges (DEG lokális maximuma). A mitózis kontroll hiszterézis tulajdonságát 55


alátámasztó kísérletet még nem publikáltak, de Jonathan Moore (Duke University) az általunk javasolt protokoll (Novák & Tyson, 1993b: 1159. oldal) alkalmazásával hiszterézist igazoló eredményeket kapott.

6.3. Embrionális fejlõdésmenet A spontán határciklusos oszcilláció a mitózis kontroll modelljét csak a paraméterek egy szûk tartományában jellemzi. A határciklusos oszcilláció mellett alapvetõen három különbözõ viselkedés fordulhat elõ (Novák & Tyson, 1993a: 2. ábra és Novák & Tyson, 1994: 12.3. ábra): 1. interfázisú állapot: egyetlen stabil steady state kis MPF aktivitással. 2. mitózisos állapot: egyetlen stabil steady state nagy MPF aktivitással. 3. bistabilitás: stabil interfázisú és stabil mitózisos állapotok egy instabil állapottal (nyeregpont) elválasztva. Az egyes viselkedésformák elõfordulása egy két paraméteres bifurkációs diagramon Novák & Tyson (1993a) 3. ábráján látható, amely tulajdonképpen négy paramétertõl való függést fejez ki. Ezek a különbözõ viselkedési formák jó párhuzamba állíthatók a Xenopus fejlõdésmenetének különbözõ stádiumaival (ld. 33. ábra ). Az éretlen oocita tulajdonképpen egy interfázisú stabil steady state-ben tartózkodik, míg az érett petesejt egy nagy MPF aktivitású steady state-ben van (ld. 34. ábra). Könnyû észrevenni, hogy az éretlen oocita G2 állapota egy MPF-vel gerjeszthetõ steady state-et reprezentál (35. ábra): megfelelõ nagyságú külsõ MPF adagolására a kontroll rendszer nem azonnal tér vissza a steady state-be, hanem csak az endogén MPF aktiválását követõen (a szimulációkat ld. Novák & Tyson, 1993a: 4. ábráján és Novák & Tyson, 1993b: 6. ábráján). Mivel az érett petesejt citoplazmája sok MPF-et tartalmaz, ezért MPF forrásként felhasználható az éretlen oocita befecskendezéséhez. Tulajdonképpen ez a citoplazma befecskendezéses kísérletet vezetett az MPF felfedezéséhez, jóval azelõtt, hogy annak molekuláris természetérõl bármit is tudtunk volna (Masui & Markert, 1971). A mitózis kontroll rendszer gerjeszthetõsége nagyon fontos szerepet játszhat a mitózisos hullámok terjedésében (ld. Novák & Tyson, 1993a: 119. oldal). Ecetmuslica embriójában és bizonyos nyálkagombákban a sejtmagok egy közös citoplazmában helyezkednek el (syncitium vagy sokmagvú plazmódium) elhatároló sejtmembránok nélkül, és a mitózisba lépésükben ugyanolyan hullámterjedés figyelhetõ meg, mint a Belouszov - Zsabotyinszkij reakció oxidációs hullámai. A kétparaméteres bifurkációs diagramon felvázolható az a fejlõdési útvonal, melyen a béka oociták fejlõdésük során végigmennek (ld. Novák & Tyson, 1993a: 6. ábra). 56


megtermékenyítés

hormonális jel

G2 fázisú oocita 4

Meiózis I

korai embrionális sejtciklusok

Meiózis II

DNS MPF

3 2 1

idõ

33. ábra: A békapete meiózisos érési folyamata. A petesejt egy kétlépéses folyamat eredményeként alakul ki: 1. a petefészek éretlen petesejtek (oocita) millióit termeli, melyek a sejtciklus DNS replikációt követõ G2 fázisában állnak meg alacsony MPF aktivitással. Mivel ezek diploid sejtek (2n), ezért a DNS tartalom a haploid érték (1C) négyszerese (4C). 2. A meiózisos érési folyamat eredményeként a DNS tartalom negyedére csökken. Ezt a folyamatot hormonális inger (progeszteron) indítja. Az érett petesejt a második magosztódás metafázisában áll meg nagy MPF aktivitással. A meiózis II a spermium általi megtermékenyítéssel fejezõdik be.

57


oocita

Meiózis I

Meiózis II megtermékenyítés

hormonális jel

M fázis gátlás

G2 fázis gátlás

0.5

0.4

G2

ciklin

ciklin

0.4

0.3

0.3

0.2

0.2

0.1

0.1

0 0.01

M

0.5

0.1

MPF

1

0 0.01

0.1

MPF

1

34. ábra: A béka oocita fejlõdésmenetének különbözõ stádiumai a fázissíkban. Az éretlen oocita (baloldali ábra) esetén a két nullklína a DEG balszárán (interfázisú ág) metszi egymást, ami kis MPF aktivitású steady state-et jelent. Az érett oocita esetén (jobboldali ábra) viszont a DEG mitózisos ágán van a metszéspont, ami nagy MPF aktivitású steady stateet jelent.

58


hormonális jel

G2 fázisú oocita

Meiózis I

Meiózis II

0.5

ciklin

0.4

G2

0.3

0.2

0.1

0 0.01

0.1

1

MPF

35. ábra: Az éretlen oocita G2 állapota aktív MPF-fel ger-jeszthetõ. Az érett oocita citoplazmája nagy mennyiségû aktív MPF-et tartalmaz, melynek küszöbérték feletti mennyiségének befecs-kendezése az éretlen oocitába az abban lévõ nagymennyiségû inaktív preMPF aktiválódását eredményezi. Ennek következ-tében az éretlen oocita hormonális jel nélkül is meiózis I-be lép.

6.4. Ellenõrzési pontok az embrionális ciklusban A korai embrionális sejtciklust egy olyan citoplazmás óra irányítja, amely DNS hiányában is tökéletesen mûködik (Hara et al., 1980). Ennek a citoplazmás órának a matematikai modellje egy határciklusos oszcilláció (Novák & Tyson, 1993a; Novák & Tyson, 1993b), és az embrionális ciklusok jelentik az egyetlen esetet az élõvilágban, ahol határciklus irányítja a sejtszaporodást. A határciklus (instabil steady state) az ellenõrzési pontok (stabil steady state) teljes hiányát jelenti, ami bizonyos veszélyeket jelent a sejtciklus végrehajtásában. Ha a kromoszómák normálisan reagálnak a határciklusos oszcilláció lüktetésére, és replikációjukat és szegregációjukat semmilyen körülmény nem korlátozza, akkor az embrionális ciklus sikeres.

59


Amennyiben azonban ez a feltétel nem teljesül, akkor az embrió elpusztul mert a citoplazmás óra nem vesz tudomást a kromoszómák állapotáról. Az a tény, hogy a korai embrionális ciklus alatt nincsenek ellenõrzési pontok, nem jelenti azt, hogy a kromoszómák állapotát “figyelõ” ellenõrzési mechanizmusok hiányoznának. Pusztán arról van szó, hogy a DNS-nek a citoplazmához viszonyított aránya (nukleocitoplazmás arány) túl kicsi, ezért túl gyenge az a jel, ami a sejtciklus szabályozó hálózat felé terjed, és nem képes azt leállítani. A sejtmentes kivonatok DNS tartalmának jelentõs növelésével mind a G2 fázisú (Dasso & Newport, 1990), mind a meta/anafázisú ellenõrzési pont elõhívható (Minshull et al., 1994). Ha a DNS tartalom növelésével párhuzamosan DNS-szintézis gátlószert is adagolnak, akkor a nem replikált DNS folyamatosan gátlójelet küld a sejtciklus órához, és jelentõs hatást gyakorol a határciklus periódusidejére (Dasso & Newport, 1990). A ciklusidõ jelentõsen növekszik a DNS tartalommal, és kb. 500 sejtmag/µl értéknél az MPF oszcilláció megszûnik. DNSszintézis gátlószer hiányában a hatás sokkal gyengébb (36. ábra). Feltételeztük, hogy a nem replikált DNS hatására aktiválódnak azok a foszfatáz enzimek (ld. 5h-5i egyenleteket), melyek az MPF pozitív visszacsatolásos mechanizmusa ellen dolgoznak a Wee1 és a Cdc25 enzimeken (37. ábra). Megmutattuk, hogy ha ezen enzimek aktivitása arányos a nem-replikált DNS koncentrációjával, akkor az MPF aktiválódás ciklin küszöbértéke is növekszik a nem-replikált DNS mennyiségével. Éppen ezért egy bizonyos kritikus nem-replikált DNS tartalomnál a steady state stabilitása egy nyereg-csomó-hurok bifurkációval megváltozik. Mivel nyereg-csomó-hurok bifurkációnál a határciklus periódusideje végtelenhez tart, miközben amplitúdója csak alig változik, ezért a feltételezés a modellben Dasso & Newport (1990) kísérletei eredményeinek jó leírását szolgáltatta (ld. Novák & Tyson, 1993b: 12. ábra). A nem-replikált DNS hatására megállított Xenopus kivonatban az MPF tirozin-foszforilezett formában (preMPF) akkumulálódik. Ennek ellenére a nem-replikált DNS elsõdleges hatáspontja a mitózis kontroll molekuláris hálózatában még ma sem teljesen tisztázott. Bizonyos kísérletek adatai arra utalnak, hogy nem-replikált DNS hatására a tirozin-kináz aktivitása fokozódik, és ez vezet az interfázisú megálláshoz (Smythe & Newport, 1992). Ezzel szemben (Kumagai & Dunphy, 1995) nem tapasztaltak semmi változást sem a tirozin-kináz (Wee1 és Myt1) sem a tirozin-foszfatáz (Cdc25) aktivitásában nem-replikált DNS hatására. Megmutattuk, hogy mindkét kísérlet összhangban van azzal a feltételezéssel, hogy a nemreplikált DNS aktiválja a tirozin-kinázt és a tirozin-foszfatázt defoszforilezõ enzimeket (ld. Marlovits et al., 1998: 4. és 5. ábra).

60

7. A CDK inhibitor és a CDK foszforilezés együttes hatása

spermium sejtmagok +/- DNS szintézis gátlószer

M

S oszcilláló sejtmentes kivonat

36. ábra: A nem-replikált DNS menynyiségének hatása az MPF oszcillációjára. Dasso & Newport (1990) oszcilláló sejtmentes kivonathoz nö-vekvõ mennyiségû spermium DNS-t adtak DNS szintézis gát-lószer jelenlétében (piros) és hiá-nyában (zöld), és meghatározták az MPF oszcilláció perióduside-jét (ciklusidõ).

200

+ inhibitor

120

- inhibitor

80

40

0 0

500

sejtmag / µl

nem-replikált DNS

P

1000

P

1500

Wee1

+

+

37. ábra: A nem-replikált DNS gátolja az MPF aktiváló-dását. Feltételeztük, hogy a nem-repli-kált DNS jelenlétében az MPF foszforilezéssel szemben mûkö-dõ foszfatázok aktivitása foko-zódik. Ez a hatás az MPF aktiválódási ciklin küszöb (DEG maximuma) növekedéséhez és kritikus érték felett az instabil steady state megszûnéséhez vezet.

Wee1 Cdk Ciklin

P

Cdc25

Cdk Ciklin +

+

Cdc25

-rep li DNS kált

0.6

nem

0.5

0.4

ciklin

ciklusidõ (min)

160

0.3

0.2

0.1

0 0.01

0.1

1

MPF

61


7. A CDK inhibitor és a CDK foszforilezés együttes hatása Ha az APC-Cdk primitív eukarióta sejtciklus szabályozó rendszerhez mind a sztöchiometrikus inhibitort (CKI) mind a Cdk gátló tirozin-foszforilezést “hozzáadjuk”, akkor egy olyan modellhez jutunk, mely alkalmas a hasadó élesztõ (Schizosaccharomyces pombe) sejtciklusának (38. ábra) leírására.

7.1. A hasadó élesztõ sejtciklusának modellezése A hasadó élesztõ egyetlen Cdk-ja (Cdk1) a cdc2 gén terméke. A Cdc2-nek pedig három különbözõ B-típusú ciklin partnere van (Cig1, Cig2 és Cdc13), melyek közül a Cdc13 a legfontosabb (ld. Fisher & Nurse, 1995). A negyedik ciklin, a Puc1 a sarjadzó élesztõ Cln3jával mutat hasonlóságot (Forsburg & Nurse, 1991). A négy ciklin közül a Cdc13 egyértelmûen a legfontosabb, amelynek hiányában a sejtek nem képesek a mitózis megkezdésére (Hayles et al., 1994). Ezzel a szemben a cig1 és a cig2 együttes hiánya sem okoz semmiféle észlelhetõ változást a sejtciklusban (Fisher & Nurse, 1996). A 39. ábrán látható molekuláris mechanizmus egy ilyen cig1 cig2 hiányos hasadó élesztõ (cig1∆ cig2∆) sejtciklus szabályozási hálózatát mutatja. Láthatóan ez a molekuláris mechanizmus rendelkezik az eukarióta sejtciklus mindhárom ellenõrzési pontjával: 1. A G1/S ellenõrzési pont esszenciális eleme a Rum1 Cdk inhibitor (Moreno & Nurse, 1994), amely antagonisztikus kölcsönhatásban áll a Cdc13/Cdc2 kinázzal: a Rum1 gátolja a kináz aktivitását, ami viszont foszforilezéssel serkenti a Rum1 lebontását. 2. A G2/M ellenõrzési pont két pozitív visszacsatolással szabályozott: a Cdc13/Cdc2 aktiválja a Cdc25-öt (Kovelman & Russell, 1996) és gátolja a Wee1-et. A hasadó élesztõnek azonban a Wee1 tirozin-kináz mellett van egy másik enzime is (Mik1), amely a Wee1-hez hasonlóan képes az MPF inaktiválására (Lundgren et al., 1991). Feltételezzük, hogy a nem-replikált DNS aktiválja a Wee1-et és Mik1-et, továbbá inaktiválja a Cdc25öt, ezért többféleképpen is gátolja a mitózis bekövetkezését. 3. A meta/anafázis ellenõrzési pont a Cdc13/Cdc2 és az APC (Srw1/Ste9) antagonisztikus kölcsönhatásán alapul. A hasadó élesztõben az Srw1/Ste9 felelõs a Cdc13 APC általi felismeréséért és lebontásáért (Kitamura et al., 1998; Yamaguchi et al., 1997). Az APC aktiváló enzimnek az slp1 (Kim et al., 1998) géntermék felel meg, aminek most nem a lebontását, hanem a szintézisét szabályozzuk a Cdk aktivitással.

62


vadtípus

S

sejtméret

G1 M G2

wee1sejtméret G1 M S G2

38. ábra: A hasadó élesztõ sejtciklusa. A felsõ ábra a vadtípus, míg az alsó a wee1- mutánsok sejtciklusát mutatja. A sejtek középén lévõ zöld folt a sejtmagot illusztrálja,.

63


apoACT

kas

k3

km r

Cdc25

k2 5 r

G2/M

P

Meta/Ana

Cdc2 Puc1

k2

Cdc2 Cdc13 ki

k2 5

aktív

P

kw

k w e e Wee1

Mik1

Cdc2 Cdc13 k c d c 2 5

Wee1

kw r

C AP

k4

k ir

Cdc2

lebontott Cdc13

P

lebontott Rum1

k6

Cdc25

Cdc2 Cdc13 k2 c

k1* mass

k5

Rum1

P

APC

Mik1 P

km

ACT

Rum1

replikálatlan DNS

magorsóhoz nem tapadt kromoszómák

Rum1

inaktív

kai

kaa

Cdc2 Cdc13

lebontott ACT

ka d

k6 Cdc2 Cdc13

Cdc2 Puc1

gyors

G1/S

39. ábra: A hasadó élesztõ sejtciklusát irányító molekuláris hálózat. A különbözõ színûre satírozott hátterek a molekuláris mechanizmus különbözõ ellenõrzési mechanizmusait foglalják össze. A 39. ábrán látható mechanizmus leírható a 2. táblázatban megadott egyenletrendszerrel (Novák et al., 1998a), ahol feltételeztük, hogy a tirozin-foszforilezett dimer ( P-q ) nem m teljesen inaktív (Borgne & Meijer, 1996), hanem az aktív MPF protein-kináz aktivitásának egy részével (α) rendelkezik (ld. 8q egyenlet). A hasadó élesztõ cig1∆ cig2∆ sejtjeinek sejtciklus szimulációját a 40. ábra mutatja. Láthatóan a G1 fázis, amikor az APC aktív, nagyon rövid és a Rum1 ezen idõ alatt nem is tud akkumulálódni, összhangban a kísérleti eredményekkel (Correa-Bordes & Nurse, 1995). A sejtciklus nagy részét a G2 fázis tölti ki, amikor a Cdc2/Cdc13 dimerek tirozin-foszforilezett formában akkumulálódnak. A hasadó élesztõ vadtípusú sejtjeinek sejtciklusában a sebességmeghatározó lépés a G2 ellenõrzési ponton való keresztül haladás, amivel alábbiakban részletesebben foglalkozom.

64


d .  q  = k1 mass - kwee  q  + kcdc25  P-q  - ki  q  [•] + dt  m  m  m m +  •q  ( kir + k6 ) - k2  q   m m d  P-q  = kwee  q  - kcdc25  P-q  - k2  P-q  dt  m  m  m  m d  q  = ki [•]  q  -  •q  (k6 + k2c + kir) dt  •m  m   m d [•] = k5 - k6 [•] - ki  q  [•] +  •q  ( kir + k2c ) dt m  m . k25 MPF (1- Cdc25-P) k25r . Cdc25-P d Cdc25-P = dt J25 + 1 - Cdc25-P J25r + Cdc25-P . . d Wee1 kwr (1 - Wee1) kw MPF Wee1 = dt Jwr + 1 - Wee1 Jw + Wee1 . km Mik1 d Mik1 kmr (1 - Mik1) = dt Jmr + 1 - Mik1 Jm + Mik1 d ACTT = kas . MPF - kad . ACTT dt d ACT ACTT - ACT kai . ACT = (kaa’ + kaa” . MPF) - kad . ACT dt Jaa + ACTT - ACT Jai + ACT d APC 1 - APC = (k3’ + k3” . ACT) dt J3 + 1 - APC APC - (k4’ . Puc1 . mass + k4” . MPF) J4 + APC d mass = µ . mass dt

(8a) (8b) (8c) (8d) (8e) (8f) (8g) (8h) (8i)

(8j) (8k)

ahol k2, kwee, kwr, kcdc25 és k25r az 5e-5i egyenlettel adottak és a többi reakciósebességi függvény definíciója: k2c = k2’ (1 - APC) + k2” . APC k6 = k6’ + k6” (Puc1 . mass + MPF) kmr = kmr’ + ks kai = kai’ + km . MPF =  q  + α  P-q  m  m

(8l) (8m) (8n) (8p) (8q)

2. táblázat: A cig1 cig2 hiányos (cig1∆ ∆ cig2∆ ∆) hasadó élesztõ sejtciklus szabályozásának matematikai modellje. Az egyenletek felírásánál az egyszerûség kedvéért feltételeztük, hogy a Cdc25 állandó koncentrációban van jelen a sejtciklus alatt, ami nem helytálló (Moreno et al., 1990). A Cdc25 szint fluktuációjának figyelembevétele azonban nem okoz kvalitatív változást a modell viselkedésében (Novák & Tyson, 1994; 1995).

65


G1

S+G2+M

G1

S+G2+M

2.0

mass 1.5

1.0

MPF

P Cdc2 Cdc13

Rum1

1.0

0.5

0.0 1.5 Cdc13 1.0

AP

C

0.5

0.0 0

50

100

150

200

idõ (min) 40. ábra: A hasadó élesztõ cig1∆ ∆ cig2∆ ∆ mutánsának sejtciklus szimulációja. Mivel a cig1∆ cig2∆ mutánsok ciklusa szinte teljesen azonos a vadtípuséval, ezért a továbbiakban ezeket a cig1cig2 hiányos sejteket vadtípusúnak tekintem. Ez azt jelenti, hogy az elkövetkezõ tárgyalásban minden sejt cig1 cig2 hiányos, de ezt az egyszerûség kedvéért nem tüntetem fel, ezért minden genotípushoz hozzáértendõ.

66


7.2. Mitózis kontroll A vadtípus sejtciklusában tehát a Rum1 koncentrációja alacsony, különösen a G2 fázisban, amikor a sejtek a G2 ellenõrzési pont sebesség-meghatározó lépésén haladnak keresztül. Ha az egyszerûség kedvéért a Rum1 koncentrációját nullának tételezzük fel, akkor a 8a-8b egyenletek ugyanarra a formára hozhatók mint az aktív MPF és az össz-ciklin koncentrációt leíró 5a-5b DE-k. Ez azt jelenti, hogy a vadtípusú hasadó élesztõ mitózis-kontrollja a már tárgyalt MPF - össz-ciklin fázissíkon vizsgálható a DEG és a CEG segítségével. A G2 ellenõrzési pont az MPF - totál ciklin síkon egy stabil steady state formájában jelentkezik, a DEG és a CEG metszéspontjában a DEG balszárán (ld. 23. ábra). Ezt az ellenõrzési pontot két teljesen független mechanizmus tartja fent: 1. A nem replikált DNS a Wee1 és Mik1 aktiválásával és a Cdc25 inaktiválásával megnöveli a DEG-et (ld. 37. ábra és Novák et al., 1998a: 4. ábra). 2. Kis sejtméretnél a CEG alacsony, ezért a DEG balszárán (interfázisú ág) létezik egy stabil steady state. Ennek megfelelõen két feltételnek kell teljesülnie ahhoz, hogy a G2 fázisú stabil steady state megszûnjön és a sejtek mitózisba lépjenek: 1. DNS-replikációnak be kell fejezõdnie, 2. a sejteknek el kell érniük egy kritikus méretet. A hasadó élesztõ sejtek akkor és csak akkor hagyják el a stabil G2 állapotot, ha mindkét fenti feltétel teljesül. A vadtípusú sejtekben a második feltétel a sebesség-meghatározó, vagyis a G2 fázis hosszát a sejtnövekedés szabályozza. Hogy a nem-replikált DNS hatása nem sebesség-meghatározó a vadtípusú sejtekben, arról egyszerûen meggyõzõdhetünk, ha a szimulációban a k s értékét nullának vesszük, vagyis a mitózis kontroll enzimeit érzéketlenné tesszük a nem-replikált DNS szintjére. Ez az eset tulajdonképpen a hasadó élesztõ hus (hidroxi-urea sensitive) mutánsait (Enoch et al., 1992) szimulálja. Gátlószer hiányában ezek a mutánsok teljesen normális sejtciklust mutatnak és a vadtípussal azonos méretnél osztódnak (Novák & Tyson, 1995: 1. táblázat). A DNS-szintézist gátló hidroxi-urea jelenlétében viszont nem képesek a mitózis gátlására, és a gátlószerrel nem kezelt vadtípussal egyidõben M-fázisba lépnek (ld. Novák & Tyson, 1995: 13. ábra és 1. táblázat). Mivel a DNS-ük nem replikált, ezért a mitózis eredményeként képzõdõ harántfal (szeptum) kettévágja a nem osztódó sejtmagot (cut fenotípus). A mitózisos katasztrófa ezen formáját kondicionális mitózisos katasztrófának nevezzük, mivel csak a sejtciklus gátlása esetén fordul elõ (ld. Novák & Tyson, 1995: 295. oldal).

67


A G2/M átmenetet három genetikai elem (Wee1, Cdc25 és a Mik1) szabályozza, melyek sebesség-meghatározó szerepe igen különbözõ. Az MPF inaktiválásáért alapvetõen a Wee1 felelõs, mert jóval aktívabb mint a Mik1 tirozin-kináz. Ennek megfelelõen a mik1 gén inaktiválása (mik1- mutáns) nincs hatással az osztódáskori méretre (ld. Novák & Tyson, 1995: 1. táblázat), ezzel szemben a wee1 gén inaktiválása felére csökkenti az osztódáskori méretet. Ezekben a wee1- mutánsokban a G1 fázis jelentõsen meghosszabbodik a ciklusidõ változatlan értéke mellett, tehát a G2 fázis rovására (ld. 41. ábra). A wee1- mutánsokban a G1/S átmenet jelenti a sebesség-meghatározó lépést a sejtciklusban (ld. késõbb). A Cdc2 tirozin-15 oldallánca azonban a wee1- mutánsokban is foszforilezõdik a Mik1 által (ld. 41. ábra). A wee fenotípus (vadtípushoz képest fele akkora sejt) a Cdc25 túltermelésével is elõidézhetõ (Novák & Tyson, 1995; Russell & Nurse, 1986) és a Cdc2 tirozin-foszforilezettségének jelentõs csökkenését eredményezi (Gould et al., 1990; Novák & Tyson, 1995: 12. ábra). Tehát mind a wee1 inaktiválása mind a Cdc25 túltermelése kisméretû sejteket eredményez, melyek látszólag egyformák ugyan, de a sejtméret csökkenés hátterében eltérõ mechanizmusok állnak. Ezek az eltérések nyilvánvalóvá válnak, ha ezen mutánsokban a DNSszintézist pl. hidroxi-ureával meggátoljuk: 1. a wee1- mutánsok tirozin-foszforilezéssel inaktívan tartják az MPF-et, és nem lépnek mitózisba (Novák & Tyson, 1995: 1. táblázat és Tyson et al., 1997: 7.9. ábra), 2. cdc25op sejtek pedig az MPF aktiválása révén mitózisba lépnek (kondicionális mitózisos katasztrófa), akárcsak a hus- mutánsok (Novák & Tyson, 1995: 15. ábra és 1. táblázat és Tyson et al., 1997: 7.9. ábra). Az eltérõ viselkedés magyarázata a G2 ellenõrzési pont megtartásában illetve elvesztésében keresendõ (Novák & Tyson, 1995). Mindkét tirozin-kináz együttes hiánya esetén (wee1- mik1 dupla mutáns) a Cdc13/Cdc2 kináz aktivitás olyan gyorsan növekszik a Start-ot követõen, hogy mitózist iniciáló értéket ér el már az S-fázis alatt (42. ábra). Ennek eredményeként a sejtek kromoszóma kondenzáció révén mitózisba lépnek a DNS-replikáció alatt, ami az utódsejteket szétválasztó harántfal kialakulásában is jelentkezik. Mivel a DNS nem másolódott le teljesen, így a pólusok felé nem vándorolhat, és a sejt közepén elhelyezkedõ sejtmagot a szeptum kettévágja (cut fenotípus). Ezt neveztük nem kondicionális mitózisos katasztrófának, mert a sejtek a kromoszómás ciklus lassítása nélkül is túl korán mitózisba lépnek és elpusztulnak.

68


wee1G1

S+G2+M

G1

1.0

S+G2+M

mass

0.5

MPF P Cdc2 Cdc13 Rum1

0.5

0.0 1.0 AP

C

Cdc13

0.5

0.0 0

50

100

150

200

idõ (min) 41. ábra: A hasadó élesztõ wee1- mutánsának sejtciklus szimulációja.

69


wee1ts mik1∆ G1

S+G2+M

2.0

G1

S+M

mass

1.5 1.0 0.5

MPF

P Cdc2 Cdc13

Rum1 Rum1

1.0

0.5

0.0 1.5

Cdc13 1.0

AP

C

0.5

0.0 0

50

100

idõ

150

(min)

42. ábra: A wee1ts mik1∆ ∆ mutáns sejtciklusának szimulációja. Ez a mutáns egy hõmérséklet-érzékeny (ts) wee1 allélt hordoz, ami alacsonyabb hõmérsékleten aktív Wee1 fehérjét termel, míg magasabb hõmérsékleten inaktívat. Éppen ezért a sejtek alacsony hõmérsékleten a vadtípushoz hasonlóak, mert a mik1 elvesztése nem okoz észlelhetõ változást. Ezzel szemben a hõmérséklet emelést követõen (amit a nyíl jelez) a Wee1 inaktiválódása következtében nem-kondicionális mitózisos katasztrófát mutatnak. 70


Érdekes módon a tirozin-kinázok hatását ellensúlyozó Cdc25 foszfatáz túltermelése csökkenti ugyan a sejtméretet és lerövidíti a G2 fázist (ld. fentebb), de nem vezet olyan végzetes eredményre, mint a tirozin-kinázok együttes hiánya (nem kondicionális mitózisos katasztrófa), hanem csak kisméretû sejteket (wee fenotípus) eredményez. A wee1 mutáció és a Cdc25 túltermelés sejtméret-csökkentõ hatása additív (Novák & Tyson, 1995; Russell & Nurse, 1986; Tyson et al., 1997) és nem kondicionális mitózisos katasztrófát eredményez. Ez a megfigyelés a genetikusokat arra a következtetésre vezette, hogy a Wee1 és a Cdc25 a Cdc2/Cdc13 aktiválódásának konszekutív reakcióit katalizálják. A matematikai modell azonban megmutatja, hogy ez a genetikai megfigyelés nincs ellentmondásban azzal a jól megalapozott biokémiai ténnyel, hogy a Wee1 és a Cdc25 ellentétes biokémiai folyamatokat katalizálnak. A hasadó élesztõ mitózis kontrolljának modelljét részletesen megvizsgáltuk számos fiziológiai kísérlet szimulációjával, mint például: 1. DNS-szintézis átmeneti gátlásának hatása a sejtciklusra (Novák & Tyson, 1995: 7. ábra); 2. a sejtek születéskori méretének hatása a ciklusidõre (Novák & Tyson, 1995: 8. ábra); 3. a növekedési sebesség növelésének és csökkentésének hatása a ciklusidõre (Novák & Tyson, 1995: 9. ábra). A növekedési sebesség hatása a Nim1 kinázon keresztül érvényesül (Coleman et al., 1993; Parker et al., 1993; Wu & Russell, 1993), amit az itt tárgyalandó egyszerûsített modellben nem vettünk figyelembe, de máshol viszont igen (Novák & Tyson, 1995).

7.3. A G1/S kontroll A vadtípusú hasadó élesztõsejtek a mitózist követõen olyan nagyok, hogy elegendõ Cdc13/Cdc2 és Puc1/Cdc2 aktivitást tartalmaznak ahhoz, hogy nagyon rövid G1 fázis alatt inaktiválják az APC-t és foszforilezzék a Rum1-et. Éppen ezért a vad típusú sejtek sejtciklusában a G1/S átmenet nem sebesség-meghatározó. A G1/S átmenet kétféleképpen tehetõ sebesség-meghatározó lépéssé a hasadó élesztõ sejtciklusában: 1. a G2/M átmenet domináló szerepének megszüntetésével, ami a wee1 mutációjával érhetõ el, 2. Puc1 ciklin hiányos sejtekkel (puc1∆), mivel a G1/S átmenethez szükséges kritikus méret jelentõsen növekszik.

71


Ad. 1: A wee1- mutánsokban a sejtnövekedés és a sejtosztódás koordinálása a Start-nál következik be (ld. 41. ábra). A Start kontroll illusztrálására a Rum1 - Cdc13 fázissík használható (ld. Novák et al., 1998a: 7. ábra), ami teljesen azonos a 7. pontban tárgyalt CKIT - ciklintotal fázissíkkal. Ennek megfelelõen a kisméretû wee1- mutánsok egy stabil steady state-ben tartózkodnak, amit nagy Rum1 és kicsi Cdc13 szint, valamint aktív APC jellemez. A sejtnövekedés eredményeként ez a stabil steady state egy kritikus méret felett nyereg-csomó bifurkációval megszûnik, és az egyetlen stabil állapotot az S/G2/M steady state jelenti, amit kis Rum1 és nagy Cdc13 szint, valamint inaktív APC jellemez. Ad. 2: Mivel a Puc1/Cdc2 komplex fontos “starter kináz” szerepet tölt be a Start-nál a Rum1 és az APC foszforilezésében, ezért hiányában a Cdc13/Cdc2 komplexnek kell egyedül ellátnia ezeket a feladatokat. Mivel mind a Rum1, mind az APC a Cdc13 “ellenfelei” (az APC csökkenti a Cdc13 szintjét, a Rum1 pedig gátolja a Cdc13/Cdc2 aktivitását), ezért a Cdc13kináz meglehetõsen hatástalan a G1-ben. Ennek következtében a Puc1 hiányos sejtekben a Start kritikus méret jelentõsen megnövekszik (Novák et al., 1998a: 10. ábra). A matematikai modellel tett jóslatot, miszerint a puc1∆ cig1∆ cig2∆ tripla mutánsban a Cdc13 és a Rum1 szintje ellentétes fázisban oszcillál, Sergio Moreno (University of Salamanca, személyes közlés) kísérletesen igazolta. Ennek azért van különös jelentõsége, mert alátámasztja a modell egyik alapvetõ feltételezését a Rum1 és a Cdc13 antagonizmusáról, amit eddig közvetlen kísérletekkel (a Cdc13 kináz foszforilezni képes a Rum1-t) eddig még nem igazoltak. Mely molekulák felelõsek a G1/S ellenõrzési pontért? Mind a puc1∆ mind a wee1- mutánsok hosszú G1 fázisa megszüntethetõ a rum1 gén tönkretételével (rum1∆). Mivel a puc1∆ rum1∆ duplamutánsok intakt G2/M kontrollal rendelkeznek, ezért méretük a vadtípuséval egyezik (ld. Novák et al., 1998a: 3. táblázat). Látszólag tehát úgy néznek ki, mint a vadtípusú sejtek. Hogy nem rendelkeznek G1/S ellenõrzési ponttal, az onnan látszik, hogy párosodási faktor jelenlétében nem képesek a G1 fázis megnyújtására. A matematikai modell ezen jóslatát ugyancsak Sergio Moreno (személyes közlés) laboratóriuma igazolta. A rum1 elvesztése wee1- mutánsokban, amelyek nem rendelkeznek mitózis méret-kontrollal, a sejtméret drámai csökkenését eredményezi (43. ábra). Jóllehet a modell szerint ezek a duplamutáns sejtek képesek a sejtnövekedés és a sejtosztódás összehangolására, de az nagyon kis sejtméretnél (0.32 a Start-nál) következik be (ld. Novák et al., 1998a: 3. táblázat). A sejtnövekedés és a DNS osztódási ciklus eme összehangolása a Start átmenetnél következik be, és azon a kriptikus APC-Cdk antagonisztikus kölcsönhatáson alapul, amit a legprimitívebb eukarióta sejtciklusban is feltételeztünk. A rum1∆ wee1- duplamutánsok közismerten elvesztik életképességüket (Moreno & Nurse, 1994). Mivel azonban ezeknek a sejteknek az osztódási mérete (0.48) kisebb mint a vadtípus (2.0) egynegyede, vagy mint a

72


wee1- mutáns (1.0) fele, ezért valószínû, hogy ez a kis sejtméret a hasadó élesztõsejtek életképességének elvesztését eredményezi.

wee1ts rum1∆ 1.5

1.0

mass

0.5

0.0

MPF P Cdc2 Cdc13

0.5

0.0 1.0 AP

C

0.5

Cdc13

0.0 0

100

200

300

400

idõ (min)

43. ábra: A wee1ts rum1∆ ∆ mutáns sejtciklusának szimulációja. A wee1 inaktiválását követõen (nyíl) a sejtek elvesztik mitózis méretkontrolljukat, ezért egyre kisebbek lesznek. Mivel Rum1 hiányában a G1/S méretkontroll csak nagyon kis sejtméretnél tudja biztosítani a kiegyensúlyozott növekedést, ezért a sejtek néhány osztódás után elpusztulnak.

73


Mindezek alapján megállapítható, hogy a matematikai modell által tett jóslatok többségét Sergio Moreno laboratóriuma kísérletesen alátámasztotta illetve megerõsítette. Tulajdonképpen jelenleg már csak a modell azon jóslása várat kísérletes igazolásra, amely a Wee1 tirozin-kináz Start szerepével kapcsolatos. A jelenlegi álláspont szerint a Wee1 tirozinkináz nem játszik szerepet a hasadó élesztõ Start kontrolljában (Hayles & Nurse, 1995). Ez a megállapítás azon a megfigyelésen alapul, miszerint a Cdc2 tirozin-foszforilezése nem mutatható ki a G1 fázisban. Ez a megállapítás mind a tirozin-foszforilezett forma mennyiségét (ld. Novák et al., 1998a: 6. ábra) mind a Start méretet illetõen (ld. Novák et al., 1998a: 3. táblázat) jó egyezésben van a modellel. A modell azonban jól mutatja, hogy ez a tény egyszerûen a szubsztrát hiányának (Cdc13/Cdc2 komplex) és nem a Wee1 aktivitás hiányának következménye.

7.4. S-fázisú ciklin szerepe A hasadó élesztõ sejtekben a Cdc2/Cdc13, mint egyetlen Cdk/ciklin komplex képes a DNSreplikáció és kromoszóma szegregáció váltakozó bekövetkezését és a mitózisos ciklust szabályozni (Fisher & Nurse, 1996; Moreno, személyes közlés). Vegyük azonban észre, hogy ilyenkor a DNS-replikáció Cdk aktivitás igénye a kevés Cdc13/Cdc2-vel, valamint a kis aktivitású tirozin-foszforilezett komplex-szel biztosított (40. ábra). Ez a kép, miszerint a DNSreplikáció CDK aktivitás igénye kisebb mint a mitózisé, összhangban áll a ma elfogadott elképzelésekkel (Fisher & Nurse, 1996; Stern & Nurse, 1996). Ennek ellenére az õsi sejtek számára elõnyt jelenthetett, ha a mitózisos Cdk/ciklin komplex tirozin-foszforilezését követõen (vagy már elõtte) egy olyan ciklinre tettek szert, mely a Cdk-val kapcsolódva segítette azt az S-fázis megindításában, mivel ez a komplex tirozin-foszforilezéssel nem gátlódott. Természetesen ez a második ciklin gén egyszerûen az eredeti B-típusú ciklin gén duplázódásával jöhetett létre. Ilyen S-fázisra specializálódott B-típusú ciklineket mind a sarjadzó (CLB5, CLB6) mind a hasadó élesztõben (cig2) ismerünk. Mindkét élesztõben ezen ciklinek a Cdk1-gyel (Cdc28 illetve Cdc2) kapcsolódnak és komplexeik periódusos kináz aktivitást mutatnak a sejtciklus alatt. A mitózisos ciklinekkel ellentétben, azonban a kináz aktivitás maximuma a DNSreplikáció idejére esik. Ezen S-fázisú ciklinek hozzáadása az eddig kifejlesztett modellekhez nem okoz különösebb nehézséget, ha ismerjük szintézisük és lebomlásuk törvényszerûségeit. Ennek megfelelõen mind a sarjadzó élesztõre (Chen et al., 1998) mind a hasadó élesztõre (Novák & Tyson, 1997) kidolgoztunk olyan modelleket, melyekben figyelembe vettük e ciklinek kapcsolódását a Cdk1-hez is. Ezeket a modelleket azonban komplexitásuk 74


következtében e helyen nem kívánom részletesen tárgyalni. Itt csak egy olyan cdc13 hiányos (és cig1 puc1 hiányos, azaz cdc13∆ cig1∆ puc1∆) hasadó élesztõ sejtciklus szabályozását ismertetem, amelyben a Cig2 a Cdc2 egyetlen ciklin partnere. Ha feltételezzük, hogy a Cig2/Cdc2 és Rum1 asszociációja trimerré (TRI) és annak disszociációja sokkal gyorsabb, mint a szintézis és lebontási folyamatok, akkor a 44. ábrán látható molekuláris mechanizmus leírható az alábbi két differenciál-egyenlettel: d Cig2T . . . . = k7 - k8 Cig2 - k8’ TRI = k7 - k8 Cig2T - (k8’ - k8) TRI dt d Rum1T (Rum1T - TRI ) (Cig2T - TRI ) . = k5 - k6’ Rum1T - k6 dt Km6 + Rum1T - TRI ahol TRI =

2 L ⋅ Cig 2 T ⋅ Rum1T 1 + L ⋅ Cig 2 T + L ⋅ Rum1T + (1 + L ⋅ Cig 2 T + L ⋅ Rum1T ) 2 − 4 L2 ⋅ Cig2 T ⋅ Rum1T

a Cig2/Cdc2/Rum1 mindenkori egyensúlyi koncentrációja (L - kötés egyensúlyi állandója). A Rum1 foszforilezését most Michaelis-Menten kinetikával írjuk le és azt feltételezzük, hogy csak a szabad Rum1 foszforilezõdik a Cig2/Cdc2 által. Láthatóan a Cig2/Cdc2 komplexet a Rum1 a Cdc13/Cdc2 komplexhez hasonlóan gátolja (Benito et al., 1998), jóllehet Correa-Bordes & Nurse (1995) szerint ez a gátlás gyengébb. Abból a megfigyelésbõl kiindulva, hogy a Cig2/Cdc2 kináz maximuma a S-fázisban észlelhetõ (Benito et al., 1998; Mondesert et al., 1996), feltételeztük, hogy a Cig2 degradáció szabályozása alapvetõen különbözik a Cdc13-étól. Feltételezzük továbbá, hogy k8 >> k8’ , vagyis a Cig2 sokkal gyorsabban bomlik a dimerbõl, mint a Rum1-gyel alkotott trimerbõl (a Rum1 stabilizálja a Cig2-t a Cdc2/Cig2 dimerben).

75


AS

Rum1

lebontott Rum1

Rum1

8’

Rum1

5 6

lebontott Rum1 P

gyors

+

Cdc2

8

Cig2

6’

Cdc2

8

Cig2

lebontott Cig2

Cdc2

lebontott Cig2

7 AS

44. ábra: A Cdc13 hiányos (cdc13∆ ∆) hasadó élesztõsejtek sejtciklus szabályozási hálózata. Ennek a modellnek a Rum1T - Cig2 T fázissík diagramja Novák & Tyson (1997) 3B. ábráján található: a Rum1 nullklína most is a megszokott N-alakot mutatja, aminek egyszerûen az a magyarázata, hogy a Rum1 ugyanolyan antagonizmusban van a Cig2 kinázzal, mint a Cdc13 kinázzal. A Rum1 - Cdc13 fázissíkhoz képest a döntõ különbség a Cig2 nullklína alakjában van, amely most monoton növekvõ: a Rum1 növekedésével növekszik a Cig2 összkoncentrációja, mivel a Rum1 stabilizálja a Cig2-t. Ennek következtében nincs stabil (steady state) állapot alacsony Rum1 koncentráció tartományban. Mit jelent ez a sejtciklus szabályozásban? A 45. ábra mutatja a modell numerikus szimulációját. A Rum1 és a Cig2kináz ellentétes fázisban oszcillálnak. Mivel a Cig2/Cdc2 komplex a DNS-replikációhoz elegendõ, a mitózishoz viszont nem, ezért ezek a mutánsok periódusos DNS-replikációt, vagyis endoreplikációs ciklust végeznek (Novák & Tyson, 1997), összhangban a kísérleti eredményekkel (Fisher & Nurse, 1996). Két egymáskövetõ DNS-replikáció azokat elválasztó mitózis nélkül azért lehetséges, mert stabil steady state hiányában az alacsony Rum1 koncentráció tartományban az S- és M-fázisok alternálását biztosító ellenõrzési mechanizmus nem mûködik.

76


Rum1

cdc13∆ 0.4

Cig2

0.2

0.0 G1

S+G2

G1

S+G2

G1

Cdc2 Cig2

0.1

0.0 0

100

200

300

400

500

Time i d õ ((min) perc)

45. ábra: A Cdc13 hiányos (cdc13∆ ∆) hasadó élesztõsejtek sejtciklusának numerikus szimulációja. A Cdc2/Cig2 periódusos aktiválódása DNS replikációt eredményez, de mitózist nem, ezért a sejtek endoreplikációs ciklust végeznek.

77

8. Emlõssejtek ciklusának modellje

8. Emlõssejtek ciklusának modellje Végül, de nem utolsósorban bemutatom, hogy az egyszerûbb eukarióta sejteken nyert modellezési tapasztalataink alapján megkísérelhetõ a sokkal komplexebb sejtciklus szabályozással rendelkezõ emlõssejtek szaporodásának leírása. Többsejtû szervezetekben a sejtszaporodást növekedési faktorok (Growth Factor = GF) kontrollálják. A növekedési faktorok hiányában a korai G1 fázisban lévõ sejtek nem képesek a G1 fázis befejezésére, helyette ún. nyugalmi szakaszba (G0 fázisba) lépnek. A G1 fázis egy pontján túljutott sejtek azonban már elkötelezettek a sejtosztódásra és a sejtciklusukat még növekedési faktorok hiányában is képesek befejezni. Ezt a G1 fázisú elhatározási pontot Pardee (1989) restrikciós pontnak nevezte. A restrikciós pont nemcsak a növekedési faktorok megvonásával, hanem a fehérjeszintézis sebességének (kb. 50 %-os) csökkentésével is elõhívható. Magasabbrendû eukarióta sejtekben a mitózis bekövetkezéséhez a Cdk1/ciklin-B komplex mellett szükség van a Cdk1/ciklin-A komplexre is (Sherr, 1996). A ciklin-A a ciklin-B-hez hasonló lebontási szekvenciával rendelkezik, ezért az APC-nek ez is szubsztrátja, és a mitózis végén a ciklin-B-vel együtt lebomlik, valamint egyikük sem mutatható ki a mitózist követõ G1 fázisban. Ezen hasonlóságok miatt a Cdk1 e két különbözõ ciklinnel alkotott komplexét egy egyszerû modellben nem érdemes megkülönböztetni. A DNS-szintézis CDK aktivitás igénye azonban már sokkal komplikáltabb: a DNS-replikációhoz mind E-típusú mind A-típusú ciklinekre szükség van (Sherr, 1996). A ciklin-A az S-fázis alatt viszont a Cdk2-vel lép kapcsolatba és nem a Cdk1-gyel, akárcsak a ciklin-E. Mivel a Cdk katalitikus alegységekrõl feltételezzük, hogy a ciklinekhez képest feleslegben vannak jelen, így a Cdk/ciklin komplexek képzõdési sebességét nem befolyásolják, ezért a Cdk2/cycA is összevonható a Cdk1/cycA/B-vel. Feltehetõen a fentebb tárgyalt Cdk/ciklin komplexek mindegyike képes az APC inaktiválására. A ciklin-E/Cdk2 komplex aktivitásának megjelenése több ponton is szabályozódik. Egyrészt a ciklin-E szintézise egy szabályozott folyamat, amiért az E2F transzkripciós faktor felelõs (ld. Planas-Silva & Weinberg, 1997). A ciklin-E lassan képzõdik a G1 fázisban, mert a retinoblasztoma fehérje (Rb) kötõdik az E2F-hez és inaktívan tartja azt. A ciklin-E szintézisének megindulása és az E2F felszabadulása az Rb inaktiválását követeli meg, ami foszforilezéssel történik. Az Rb molekulán 15 olyan aminosav oldallánc található, amelyet a CDK-k foszforilezni és ezáltal az Rb-t inaktiválni képesek (ld. Planas-Silva & Weinberg, 1997). A Cdk2/ciklin-E komplex foszforilezi az Rb-t és ezáltal fokozza a saját képzõdését (pozitív visszacsatolás). A foszforilezett Rb-t az 1. típusú protein-foszfatáz (PP1)

78


defoszforilezi és aktiválja. A PP1 ugyancsak foszforilezéssel szabályozott: a Cdk2/ciklin-E bizonyítottan képes a PP1 inaktiválására, ami szintén pozitív visszacsatolást eredményez. A Cdk2/ciklin-E komplex aktivitását a p27 sztöchiometrikus Cdk inhibitor gátolja. Érdekes módon, akárcsak a Rum1 és Sic1 esetében, a gátolt kináz képes az inhibitor foszforilezésére és a foszforilezett forma gyorsan lebomlik. Ez tehát a harmadik pozitív visszacsatolás a mechanizmusban. A D-típusú ciklinek legfontosabb Cdk partnere a Cdk4, és a Cdk4/ciklin-D komplex kizárólagos szerepe az Rb foszforilezés megindításában van (starter kináz). A Cdk4/ciklin-D komplex jelzi a sejt számára a növekedési faktorok jelenlétét: növekedési faktorok esetén a komplex többé-kevésbé konstans koncentrációban jelen van az egész sejtciklus alatt (Sherr, 1996). Azonban a növekedési faktorok elvonása esetén azonnal leáll a ciklin-D szintézise és a ciklin-D pillanatszerûen eltûnik rövid felezési ideje miatt. Ha a sejt egyszer leállította a ciklin-D szintézisét, akkor nagyon hosszú idõbe telik annak visszaállítása, amikor a növekedési faktorok újra megjelennek. Növekedési faktorok hatására ugyanis a gének két csoportban aktiválódnak (Murray & Hunt, 1993): 1. korai válasz gének (ERG): röviddel a növekedési faktorok megjelenését követõen aktiválódnak és többségük transzkripciós faktort kódol. 2. késõi válasz gének (LRG): csak több órával a növekedési faktor megjelenését követõen aktiválódnak. Mivel a ciklin-D szintézis szabályozásának pontos molekuláris részletei még nem tisztázottak, ezért erre kidolgoztunk egy lehetséges mechanizmust. Egy GF függõ ERG serkenti egy LRG képzõdését, ami egyébként autokatalitikusan termelõdik. Az LRG viszont gátolja az ERG képzõdését. Amint látni fogjuk, ez az egyszerû mechanizmus kellõ magyarázatot szolgáltat arra az alapvetõ hiszterézis jelenségre, miszerint a ciklin-D szintézis gépezete könnyen összeomlik GF hiányában, de nehezen áll helyre azok újra megjelenésekor.

79


GF +

ERG LRG +

+ Cdk4

Cdk1

p27

CycA/B

P

+

PP1

P

Rb

Cdk4

CycD

P

+ PP1

p27

+

Cdk4

CycD

+

+

P

p27

Cdk2 CycE

gyors

P

+

Rb

+

+ Cdk1

Rb

-

E2F

CycA/B

E2F

CycE E2F

+

Cdk2

Cdk2

CycE

+

gyors

Cdk2

P

+

+

P

DNS replikáció

+

APC ACT

+

apoACT

+ Cdk1

AP

C

CycA/B

mitózis

Cdk1

+

46. ábra: Az emlõssejtek sejtciklusát szabályozó molekuláris hálózat. 80

+


Fentiek alapján az emlõs sejtek sejtciklus szabályozásának egy egyszerûsített molekuláris mechanizmusát a 46. ábra mutatja, amihez az alábbi kiegészítéseket kell még fûzni: 1. A Cdk1 cycA-val és cycB-vel alkotott, valamint a Cdk2/cycA komplexét egyetlen komponens (Cdk1/cycA/B) reprezentálja. 2. Feltételezzük, hogy a Cdk2/cycE és a Cdk1/cycA/B ugyanazon szubsztrátok foszforilezésére képesek. 3. A Cdk4/cycD viszont csak az Rb-t foszforilezi. 4. Az Rb gátlás alól felszabadult E2F transzkripciós faktort a Cdk2/cycA kináz foszforilezéssel inaktiválja. 5. Rb defoszforilezett formája gátolja a sejtek növekedését (fehérjeszintézisét) az 1. és 3. típusú RNS polimeráz gátlása révén (White, 1997). A 46. ábrán látható molekuláris mechanizmus leírható a 3. táblázat egyenleteivel, ahol a Cdk/ciklin komplexek elnevezése a ciklin komponens alapján történt. Az E2F és az Rb különbözõ foszforilezett formái kapcsolódásából kialakult komponensek nomenklatúráját a 47. ábra mutatja. 1. Feltételezzük, hogy nemcsak az Rb defoszforilezett formája (Rb) köt az E2F-fel és az E2F-P-vel (E2F:Rb), hanem az Rb foszforilezett formája is, de sokkal kevésbé ( kERP << kER ). 2. Feltételezzük, hogy Rb foszforilezett/defoszforilezett formái egyensúlyban vannak (9q egyenlet), mivel a foszforilezés/defoszforilezés reakciók gyorsabbak a többi reakcióhoz viszonyítva. A 48. ábra a 9a-9u egyenletek numerikus megoldása alapján az exponenciálisan szaporodó emlõssejtek sejtciklusát mutatja. Láthatóan a modell rendelkezik a kiegyensúlyozott növekedés tulajdonságával, amit az APC cycE általi és sejtmérettõl függõ inaktiválása okoz. Az p27T (= p27 + cycD: p27+cycE:p27) és az Rb hipofoszforilezett formája (Rbhypo) koordinált viselkedést mutatnak: mitózist követõen mindkét komponens koncentrációja hirtelen megnõ, mert nincs a sejtben CDK aktivitás, ami foszforilezze õket. Kb. 3,5 - 4 órával a sejtosztódás után leesik a koncentrációjuk, amit Cdk2/cycE általi foszforilezés okoz. A cycE kináz leglassabban inaktiválódó szubsztrátja az APC. Az APC inaktiválását (G1/S átmenet) követõen (osztódás után 7 órával) megindulhat a cycA/B akkumulációja, ami DNSreplikációt, majd késõbb mitózist eredményez.

81


d ERG kSE =ε. - k . ERG dt 1 + (LRG/V0)2 DE

(9a)

d LRG kLV . ERG + kSL . (LRG/L0)2 =ε. ) - kDL . LRG dt 1 + (LRG / L0)2

(9b)

d cycD = ε . k9. LRG + k6 . cycD: p27 + kdr. cycD: p27 - kd . cycD . p27 - k10. cycD (9c) dt d cycD: p27 = kd. cycD . p27 - kdr . cycD: p27 - k6. cycD: p27 - k10 . cycD: p27 dt d cycE k8 . cycE = ε . (k7’ + k7” . E2FA ) . MASS - k8’ . cycE dt KME +cycET . . . - ke cycE p27 + ker cycE:p27 + k6 . cycE:p27 d cycE: p27 = ke . cycE . p27 - ker . cycE: p27 - k6 . cycE: p27 dt cycE: p27 - k8’. cycE: p27 - k8. KME +cycET d p27 = ε . k5 - k6 . p27 - kd . cycD . p27 + kdr . cycD:p27 + k10 . cycD:p27 dt cycE:p27 - ke. p27 . cycE + ker . cycE:p27 + k8’. cycE:p27 + k8. KME+cycET

(9d)

(9e)

(9f)

(9g)

d E2Ft = kE2S . (E2FT - E2Ft ) - (kE2D’ + kE2D” . cycB) . E2Ft dt (9h) d E2F:Rb = kER . (E2FT - E2F:Rb - E2F:Rb-P) . (Rbhypo - E2F:Rb ) - kERr . E2F:Rb (9i) dt d E2F:Rb-P = kERP (E2FT - E2F:Rb - E2F:Rb-P) . (RbT - Rbhypo - E2F:Rb-P) dt - kERPr. E2RBP 2 d cycB . k1’ + k1” (cycB/u0) =ε - k2 . cycB 2 dt 1 + (cycB/u0)

d ACTT = ε (kas’ + kas” . cycB) - kad . ACTT dt d ACT = kaa . (ACTT - ACT ) - kai . ACT - kad . ACT .dt

82

(9j) (9k)

(9l) (9m)


d APC 1 - APC = ( k3’ . ACT + k3”. ACT ) dt J3 + 1 - APC ( k4’ + k4” (ϕD . cycDT + ϕE . cycE +ϕB. cycB))

APC J4 + APC

(9n)

d mass . . = ε µ . H(Rbhypo /RbT ) mass dt (9o)17

ahol PP1A =

PP1T 1 + k13 . ( φ E . cycE + φ B . cycB)

Rbhypo = 1+

E2FA =

k11

.

(9p)18

RbT ( ε D cycDT + ε E . cycE + ε B . cycB) v12’ (PP1T - PP1A)+ v12” . PP1A .

(E2FT - E2F:Rb - E2F:Rb-P) E2F E2FT

(9q)19

(9r)20

Reakciósebességi függvények: k6 = k6’ + k6” ( ηE . cycE + ηD . cycDT +ηB . cycB) k8 = k8”. (ψ E . cycE + ψ B . cycB) k2 = v2’. (1 - APC ) + v2”. APC

(9s)21 (9t) (9u)

2. táblázat: Az emlõssejtek sejtciklusát szabályozó molekuláris mechanizmus (ld. 46. ábra) matematikai leírása.

17

H(Rbhypo /RbT ) egy Heavyside függvény, melynek értéke nulla vagy egy, attól függõen, hogy az Rbhypo /RbT arány egy kritikus érték felett van vagy alatta. 18 a PP1 defoszforilezett (aktív) formája. 19 Rb defoszforilezett formáinak összege, beleértve az E2F és az E2F-P-vel alkotott komplexeket is (legalsó három komponens a 47. ábrán). 20 az E2F szabad (Rb-val nincs komplexben), defoszforilezett (aktív) formája. 21 cycDT = cycD + cycD:p27 83


E2Ft P

P

E2F:Rb-P

P

Rb

P

P

Rb

P

E2F

E2F

P

P P

Rb

P

E2F

E2F

P

Rb

Rb

Rb

E2F:Rb

E2F

E2F

P

47. ábra: Az E2F és az Rb különbözõ foszforilezett formáinak kapcsolódása és a komponensek elnevezésének nómenklatúrája.

84


4 mass

3 2

p27

2

Cdk2 CycE

1

0 2

CycE

total

Rb

1

0 3 2 Cdk1

C AP

CycA/B

1 0 0

4

8

12

16

20

24

28

48. ábra: Az emlõssejtek sejtciklusának numerikus szimulációja.

85


De hol van a restrikciós pont a G1 fázisban és hogyan szabályozódik? Ezt a kérdést Zetterberg et al. (1995) a növekedési faktorok átmeneti megvonásával, illetve a fehérjeszintézis átmeneti és részleges (50%-os) gátlásával vizsgálták, immáron klasszikusnak számító kísérleteikben (Zetterberg & Larsson, 1985). A 49. ábra a fehérjeszintézis sebességének egy órán keresztüli 50 %-os gátlásának hatását mutatja. A LRG szintje leesik, ezért a cycD szintézis leáll, és a cycD koncentrációja nullára csökken. Ennek következtében az Rb szinte teljesen defoszforilezett (Rbhypo/RbT ≅ 1) lesz és leállítja a sejtnövekedést (H = 0). Hiába áll vissza azonban a fehérjeszintézis sebessége egy óra múlva a normális értékre, a cycD szintje még további 8 órán keresztül alacsony marad. Ennek az a magyarázata, hogy az ERG csak bizonyos idõkéséssel tudja bekapcsolni a LRG-t. Ha ez megtörtént, akkor a sejtciklus további lefutásában nem észlelhetõ a GF átmeneti hiánya. A sejtek azonban 9 órával (1 h gátlás + 8 h késlekedés) késõbb osztódnak (23. óránál 14. óra helyett) a nem kezelt kontrollnál. Ez a 8 órás késlelkedési szakasz, mely alatt nincs sejtnövekedés (mert az Rb teljesen defoszforilezett) jelenti a G0 fázist. A következõ (második) sejtciklus hossza normális (14 óra) értékû. A 50. ábra a fehérjeszintézis gátlás átmeneti (1 órás) hatását mutatja 10 órával a sejtosztódás követõen. Jóllehet a LRG és a cycD koncentrációja most is gyorsan nullára csökken, de a sejtszaporodás negatív szabályozói (p27, Rb és APC) nem tudnak felülkerekedni a pozitív szabályozókon (cycA-E). Ezért a sejtek normális idõben (14 óránál elosztódnak). Osztódást követõen azonban a cycD hiánya következtében az Rb teljesen defoszforilezõdik, ezért a sejtnövekedés leáll. 5 órával osztódást követõen azonban a cycD szint helyreáll. A 51. ábra a sejtciklus fehérjeszintézis egy órán át tartó 50%-os gátlásának hatását mutatja a sejtciklus különbözõ pontján álló sejtek elsõ és második osztódására. A szimulációs eredmények nemcsak kvalitatívan de kvantitatívan is egyeznek a Zetterberg & Larsson (1985) kísérlet eredményeivel. Láthatóan minden sejt reagál a GF átmeneti hiányára. A sejtciklus elején (elsõ 3.5 órában) tartózkodó sejtek csak egy 8 órás G0 fázist követõen folytatják az elsõ ciklusukat. A restrikciós ponton (RP) tehát sejtosztódást követõen kb. 3.5 óra múlva haladnak át a sejtek. A GF megvonás pillanatában a 3.5 óránál “idõsebb” (restrikciós ponton már túljutott) sejteknek a következõ (második) sejtciklusa hosszabbodik meg. Ez azt jelenti, hogy a restrikciós ponton túljutott sejtek is érzékelik a GF hiányát, és G0 fázisba lépnek. Esetükben a sejtciklus késleltetése azonban kevesebb mint 9 óra (és a sejtciklus pozíciótól függ), mert a G0 fázis egy része lejátszódik az elsõ ciklus alatt.

86


4 mass

3 2 1 LRG

ERG

0 2 p27

Cdk2 CycE

1

0 Cdk1

3

Rb

CycA/B

2 1 C AP

0 0

10

20

30

40

49. ábra: A fehérjeszintézis sebessége átmeneti és részleges gátlásának hatása az emlõs sejtciklusra. Az osztódást követõ második és harmadik óra között a 3. Táblázat modelljében a riboszómás fehérjeszintézis hatásfokát (ε) 50%-ra csökkentettük.

87


4 mass

3 2 1

LRG

ERG

0 2 p27

Cdk2 CycE

1

0 3

Rb

Cdk1 CycA/B

2 1 AP

C

0 0

10

20

30

50. ábra: A fehérjeszintézis sebessége átmeneti és részleges gátlásának hatása az emlõs sejtciklusra. Az osztódást követõ 10. és 11. óra között a 3. táblázat modelljében a riboszómás fehérjeszintézis hatásfokát (ε) 50%-ra csökkentettük.

88


30

30

1. ciklus

2. ciklus

20

ciklusidõ (óra)

ciklusidõ (óra)

20

10

0

10

0 0

5

10

0

sejtosztódás óta eltelt idõ (óra)

5

10

sejtosztódás óta eltelt idõ (óra)

51. ábra: A fehérjeszintézis sebessége átmeneti és részleges gátlásának hatása a sejtciklus különbözõ pontján álló emlõssejtek elsõ (baloldali ábra) és második (jobboldali ábra) sejtciklusára. Ez az ábra közvetlenül összehasonlítható Zetterberg & Larsson (1995) 9. ábrájával. A sárga egyenes egyenlete: 9 h + sejtciklus pozíció.

89

9. Összefoglalás

9. Összefoglalás A szaporodó sejtek osztódásukat megelõzõen egy bonyolult “fejlõdési” folyamaton mennek keresztül, amit sejtciklusnak nevezünk. A sejtciklust egy fehérjékbõl álló komplikált biokémiai reakcióhálózat szabályozza és irányítja. A molekuláris biológiai módszerek alkalmazásának köszönhetõen az elmúlt években megismertük a sejtciklust szabályozó legfontosabb molekulákat, melyek törzsfejlõdésileg konzerváltak az eukarióta sejtek körében. A magasabbrendû eukarióták azonban több komponenst használnak a sejtszaporodásuk szabályozásában, mint az alacsonyabbrendû sejtek, ezért bennük a szabályozási hálózat különösen bonyolult. A szabályozó rendszer bonyolultsága felveti annak kérdését, hogy miként lehet a molekulák ismeretébõl megjósolni az egész rendszer (a sejt) viselkedését (sejtszaporodás). Ezen kérdés megválaszolásának különös jelentõsége van, amikor ellenõrizni szeretnénk, hogy molekuláris ismereteink összhangban állnak-e az egész sejt viselkedését jellemzõ fiziológiai kísérletek eredményeivel. A kémiai reakciókinetika diszciplínája egy olyan egzakt tudományos módszert biztosít számunkra, amellyel ez a komplex szabályozási hálózat precíz matematikai formába önthetõ. A kémiai reakciókinetika segítségével megjósolhatók a sejtek szaporodását irányító molekuláris hálózat kvantitatív következményei, és így azok összevethetõk a kísérleti eredményekkel. A reakciókinetika alkalmazása tehát egy olyan szintetikus megközelítési módszert szolgáltat számunkra, amely a redukcionista molekuláris biológiai megközelítést összekapcsolja az élõ sejt integrált fiziológiájával. A kémiai reakciókinetika segítségével modelleket állítottam fel a Földön valaha élt legegyszerûbb eukarióta sejt és a ma élõ legkomplexebb (emlõs) sejt ciklusának szabályozására, valamint számos köztes állapotra (pl. élesztõk). A reakciókinetikai modellek alapján megadtam egy lehetséges evolúciós sorrendet a sejtciklus szabályozásában résztvevõ komponensek idõbeli megjelenési sorrendjére. A sejtszaporodás reakciókinetikai leírását a modern molekuláris biológiai eredmények tükrében az elsõk között alkalmaztam, és a kapott modelleket a legrészletesebben vizsgáltam. Mindezek alapján eredményeim a következõ pontokban foglalhatók össze: 1. Az eukarióta sejtszaporodás ellenõrzési mechanizmusokkal szabályozódik, melyek biztosítják a sejtciklus események (DNS-replikáció, magosztódás stb.) megfelelõ sorrendben, megfelelõ idõben és megfelelõ sejtméretnél történõ bekövetkezését. Az ellenõrzési mechanizmusok a sejtciklus szabályozó gépezetét a kromoszómák állapotának és a sejttömeg nagyságának függvényében befolyásolják. Igazoltam, hogy az ellenõrzési mechanizmusok a szabályozási rendszer steady state-jeit stabilizálják (ellenõrzési 90

9. Összefoglalás

pontok). Ezek a stabil steady state állapotok a megfelelõ körülmények fennállása esetén azonban bifurkációval megszûnnek. A bifurkáció esetén a steady state stabilitása megváltozik illetve átadja helyét egy másik steady state-nek. A sejtciklus átmenetek többsége nyereg-csomó bifurkáció, amikor egy stabil steady state egy instabil nyeregponttal olvad össze. Az átmenet (bifurkáció) elõtt azonban két (alternatív) stabil steady state-el rendelkezik a rendszer, ami bistabilitást (általánosan alternatív steady state-ek) eredményez. A bistabilitás következtében a két állapot közti átmenet a hiszterézis tulajdonságával rendelkezik. Az eukarióta sejtek szaporodása tulajdonképpen alternatív steady state állapotok közti átmenetek sorozataként fogható fel. Ezen átmenetek irreverzibilitását pedig a hiszterézis tulajdonság magyarázza. 2. Megmutattam, hogy a legegyszerûbb és ezért feltételezhetõen a legprimitívebb euka-rióta sejt ciklusa két alternatív steady state: n alacsony CDK aktivitású G1 fázis és n nagy CDK aktivitású S/M fázis változásaként értelmezhetõ. A két stabil állapotot a CDK és a ciklin lebontó gépezet (APC) antagonisztikus versengése hozza létre. A két stabil állapot közti két irreverzibilis átmenet a sejtciklus n G1/S átmenete vagy Start eseménye, illetve n a kromoszómák szétválasztása (mitózis meta/anafázis átmenete). 3. Megmutattam, hogy a mitózist (M fázis) serkentõ Cdk/ciklin komplex (M fázis serkentõ faktor = MPF) átmeneti gátlásával egy köztes CDK aktivitással rendelkezõ harmadik állapot ékelõdik a kis és nagy CDK aktivitású állapotok közé. Ennek eredményeként a sejtciklus az alábbi három szakaszra osztható: n alacsony CDK aktivitású G1 fázis, n köztes CDK aktivitású S- és G2 fázis, melyek között pusztán az a különbség, hogy a DNS replikáció folyik-e (S) vagy már befejezõdött (G2) és n magas CDK aktivitású M fázis (mitózis). A sejtciklus ezen három jellegzetes állapota közti három irreverzibilis átmenetet, azaz n a G1/S átmenetet n a G2/M átmenetet n és a mitózis meta/anafázis átmenetét ellenõrzési mechanizmusok szabályozzák.

91

9. Összefoglalás

4. A sejtciklus modellek használhatóságát néhány konkrét sejttípus sejtciklusának kvantitatív részletekben történõ leírásával igazoltam. Mivel a kiválasztott sejttípusok-ban különbözõ ellenõrzési mechanizmusok játszanak sebesség-meghatározó szerepet (sarjadzó élesztõ: G1/S átmenet, hasadó élesztõ: G2/M átmenet, embrionális sejtcik-lus: nincs ellenõrzési pont), ezért megállapítható, hogy az eukarióta sejtszaporodás minden egyes átmenetét részletesen leíró modellekkel rendelkezünk. 5. A sejtciklus kutatás legproblematikusabb területe a harmadik ellenõrzési mechaniz-mus, a mitózis meta/anafázis átmenetének szabályozása. Ennek részleteire kidolgoz-tam egy feltételezett mechanizmust, amit az azóta megjelent kísérleti eredmények alátámasztanak. 6. A G1/S átmenet és ellenõrzési pont egy részletes modelljét, ami a CDK, az APC és egy CDK inhibitor (CKI) antagonisztikus kölcsönhatásain alapul részletesen vizsgál-tam a sarjadzó élesztõ sejtciklusában. A kinetikai leírás megkövetelte a sejtciklus szabályozásért felelõs molekulákat kódoló RNS molekulák szabályozott szintézisének (transzkripció) kinetikai leírását. Figyelembe véve ezen sajátosságokat, a sarjadzó élesztõ modelljével kvantitatív pontossággal leírható: n a növekedési sebesség sejtméretre gyakorolt hatását vizsgáló klasszikus fiziológiai kísérletek, valamint n mindazon sejtciklus mutánsok viselkedése, melyek manapság a molekuláris genetikusok rendelkezésére állnak. 7. Az embrionális sejtciklusokat a megtermékenyített béka (Xenopus) petesejtekkel és azok sejtmentes kivonataival végzett kísérletek szimulációival vizsgáltam. Ezen sejtciklusok alatt nincs G1 fázis és a G2/M átmenet jelenti a sebesség-meghatározó lépést. Megmutattam, hogy ezen korai embrionális ciklusok alatt a szabályozási rendszer nem rendelkezik stabil steady state állapottal, hanem csak egy instabil steady state-tel, amit egy határciklusos oszcilláció vesz körül. Ennek következtében a sejtciklus szabályozó rendszer óramûszerûen mûködve (oszcillál az interfázis és mitózis állapotok között) indítja el a magosztódást. Bizonyítottam, hogy a modell rendelkezik az MPF aktiválódás minden jellegzetességével: n ciklin küszöb: a ciklin koncentrációnak kritikus értéket kell meghaladnia az MPF aktiválódásához, n lag szakasz: küszöbértéket meghaladó ciklin koncentrációnál is bizonyos idõ szükséges az MPF aktiválódásához, amit annak autokatalitikus jellege magyaráz.

92

9. Összefoglalás

8. A kinetikai modell alapján mechanizmust javasoltam a nem replikált DNS G2/M ellenõrzési pontban játszott mechanizmusára. Ennek lényege, hogy a DNS replikáció alatt aktiválódnak azon protein-foszfatázok, melyek az MPF autokatalitikus aktiváló-dását akadályozzák. 9. A hasadó élesztõ sejtciklusában a G2/M átmenet jelenti a sebesség-meghatározó lépést. Kvantitatív részletekbe menõen szimuláltam a hasadó élesztõ sejtciklusának legalapvetõbb fiziológiai és genetikai jellegzetességeit. Fiziológiai: n az átmeneti sejtciklus gátlás hatása a ciklusidõre, n a növekedési sebesség növelése és csökkentése által okozott mitózis gátlás és serkentés. Genetikai: az M fázis S fázistól való függését és az osztódáskori sejtméret változását: n számos sejtciklus mutánsban (wee1-, mik1∆, nim1∆, hus- stb.), n a mitózis-kontroll fõbb szabályozó elemeinek túltermelése esetén (wee1op, cdc25op, nim1op stb.), OP n valamint többszörös sejtciklus mutánsok esetén (wee1- cdc25 , wee1- mik1∆ stb.). 10. A hasadó élesztõ sejtciklusának leírására készült legújabb modellünk az elsõ olyan kvantitatív sejtciklus modell, mely az eukarióta sejtciklus mindhárom ellenõrzési mechanizmusát leírja. Jóllehet a hasadó élesztõ sejtciklusában a G2/M átmenet a sebességmeghatározó, de annak genetikai úton történõ tönkretételével (wee1- mutánsok) a G1/S ellenõrzési pont elõhívható. A modell szimulációjával olyan sejtciklus mutánsok viselkedését jósoltuk meg, melyek akkor még nem álltak rendelkezésre. Sergio Moreno (University of Salamanca) laboratóriuma ezeket az eredményeket a mutánsok elkészítésével és vizsgálatával messzemenõkig alátámasztotta. 11. A rendelkezésre álló molekuláris biológiai ismeretek alapján kidolgoztam az emlõs sejtek G1 fázisában mûködõ ún. restrikciós pont kinetikai modelljét, amellyel sikerült szimulálni és értelmezni: n a növekedési faktorok sejtszaporodásra gyakorolt hatását (Zetterberg & Larsson kísérlet) és n számos olyan mutációt, melyek nem kontrollált (rákos) sejtszaporodásra vezetnek.

93

10. Irodalomjegyzék

10. Irodalomjegyzék Amon, A., Irniger, S. & Nasmyth, K. (1994). Closing the cell cycle circle in yeast: G2 cyclin proteolysis initiated at mitosis persists until the activation of G1 cyclins in the next cycle. Cell 77: 1037-1050. Amon, A., Tyers, M., Futcher, B. & Nasmyth, K. (1993). Mechanisms that help the yeast cell cycle clock tick: G2 cyclins transcriptionally activate G2 cyclins and repress G1 cyclins. Cell 74: 993-1007. Benito, J., Martin-Castellanos, C. & Moreno, S. (1998). Regulation of the G1 phase of the cell cycle by periodic stabilization and degradation of the p25rum1 CDK inhibitor. EMBO J. 17: 482-497. Blow, J. & Laskey, R. (1988). A role for the nuclear envelope in controlling DNA replication within the cell cycle. Nature 332: 546-548. Borgne, A. & Meijer, L. (1996). Sequential dephosphorylation of p34cdc2 on Thr-14 and Tyr-15 at the prophase/metaphase transition. J. Biol. Chem. 271: 27847-27854. Chen, K., Csikász-Nagy A., Gyõrffy B., Novák B. & Tyson, J.J. (1998): Kinetic analysis of a molecular model of the budding yeast cell cycle. (publikálás alatt). Clarke, P. R., Leiss, D., Pagano, M. & Karsenti, E. (1992). Cyclin A- and cyclin Bdependent protein kinases are regulated by different mechanisms in Xenopus egg extracts. EMBO J. 11: 1751-1761. Cohen-Fix, O. & Koshland, D. (1997). The metaphase-to-anaphase transition: avoiding a mid-life crisis. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 800-806. Coleman, T. & Dunphy, W. (1994). Cdc2 regulatory factors. Curr. Opin. Cell Biol. 6: 877-882. Coleman, T., Tang, Z. & Dunphy, W. (1993). Negative regulation of the wee1 protein kinase by direct action of the nim1/cdr1 mitotic inducer. Cell 72: 919-929. Correa-Bordes, J. & Nurse, P. (1995). p25rum1 orders S phase and mitosis by acting as an inhibitor of the p34cdc2 mitotic kinase. Cell 83: 1001-1009. Dasso, M. & Newport, J. W. (1990). Completion of DNA replication is monitored by a feedback system that controls the initiation of mitosis in vitro: studies in Xenopus. Cell 61: 811-823. Dawson, I., Roth, S. & Artavanis-Tsakonas, S. (1995). The Drosophila cell cycle gene fizzy is required for normal degradation of cyclins A and B during mitosis and has homology to the CDC20 gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 129: 725737. Dirick, L., Bohm, T. & Nasmyth, K. (1995). Roles and regulation of Cln-Cdc28 kinases at the start of the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 14: 4803-4813. Enoch, T., Carr, A. & Nurse, P. (1992). Fission yeast genes involved in coupling mitosis to completion of DNA replication. Genes Dev. 6: 2035-2046. Evans, T., Rosenthal, E. T., Youngbloom, J., Distel, D. & Hunt, T. (1983). Cyclin: a protein specified by maternal mRNA in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division. Cell 33: 389-396. 94


Fantes, P. & Nurse, P. (1977). Control of cell size at division in fission yeast by a growthmodulated size control over nuclear division. Exp. Cell Res. 107: 377-386. Fantes, P. A. & Nurse, P. (1981). Division timing: controls, models and mechanisms. In The Cell Cycle (P. C. L. John , Ed.), pp. 11-33. Cambridge University Press, Cambridge, UK. Ferrell, J. E., Jr., Wu, M., Gerhardt, J. C. & Martin, G. S. (1991). Cell cycle tyrosine phosphorylation of p34cdc2 and a microtubule-associated protein kinase homolog in Xenopus oocytes and eggs. Mol. Cell. Biol. 11: 1965-1971. Fisher, D. & Nurse, P. (1995). Cyclins of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Semin. Cell Biol. 6: 73-78. Fisher, D. & Nurse, P. (1996). A single fission yeast mitotic cyclin B p34cdc2 kinase promotes both S-phase and mitosis in the absence of G1 cyclins. EMBO J. 15: 850-860. Forsburg, S. & Nurse, P. (1991). Identification of a G1-type cyclin puc1+ in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature 351: 245-248. Goldbeter, A. (1991). A minimal cascade model for the mitotic oscillator involving cyclin and cdc2 kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 9107-9111. Goldbeter, A. & Koshland, D. E., Jr. (1981). An amplified sensitivity arising from covalent modification in biological systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6840-6844. Gould, K. L., Moreno, S., Tonks, N. K. & Nurse, P. (1990). Complementation of the mitotic activator, p80cdc25, by a human protein-tyrosine phosphatase. Science 250: 1573-1576. Halzimanikatis, V., Lee, K. H., Renner, W. A. & Bailey, J. E. (1995). A mathematical model for the G1/S transition of the mammalian cell cycle. Biotechn. Lett. 17: 669-674. Hara, K., Tydeman, P. & Kirschner, M. (1980). A cytoplasmic clock with the same period as the division cycle in Xenopus eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 462-466. Hartwell, L. H., Culotti, J., Pringle, J. R. & Reid, B. J. (1974). Genetic control of the cell division cycle in yeast. Science 183: 46-51. Hayles, J., Fisher, D., Woollard, A. & Nurse, P. (1994). Temporal order of S phase and mitosis in fission yeast is determined by the state of the p34cdc2-mitotic B cyclin complex. Cell 78: 813-822. Hayles, J. & Nurse, P. (1995). A pre-start checkpoint preventing mitosis in fission yeast acts independently of p34cdc2 tyrosine phosphorylation. EMBO J. 14: 2760-2771. Hershko, A. (1997). Roles of ubiquitin-mediated proteolysis in cell cycle control. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 788-799. Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W. & Murray, A. W. (1993). Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell 73: 1393-1402.

95


Hunt, T. (1991). Summary: Put out more flags. In The Cell Cycle. Cold Spring Harbour Symposia on Quantitative Biology (D. Beach, B. Stillman, & J. D. Watson , Eds.), Vol. 56, pp. 757-769. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY. Hwang, L. H., Lau, L. F., Smith, D. L., Mistrot, C. A., Hardwick, K. G., Hwang, E. S., Amon, A., & Murray, A. W. (1998). Budding yeast Cdc20: a target of the spindle checkpoint. Science 279: 1041-1044. Irniger, S., Piatti, S., Michaelis, C. & Nasmyth, K. (1995). Genes involved in sister chromatid separation are needed for B-type cyclin proteolysis in budding yeast. Cell 81: 269-278. Jallepalli, P. V. & Kelly, T. J. (1997). Cyclin-dependent kinase and initiation at eukaryotic origins: a replication switch? Curr. Opin. Cell Biol. 9: 358-363. Johnston, G. C., Pringle, J. R. & Hartwell, L. H. (1977). Coordination of growth with cell division in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Exp. Cell Res. 105: 79-98. Killander, D. & Zetterberg, A. (1965). Quantitative cytochemical studies on interphase growth. 1. Determination of DNA, RNA and mass content of age determined mouse fibroblasts in vitro and of intercellular variation in generation time. Exp. Cell Res. 38: 272-284. Kim, S. H., Lin, D. P., Matsumoto, S., Kitazono, A. & Matsumoto, T. (1998). Fission yeast Slp1: an effector of the Mad2-dependent spindle checkpoint. Science 279: 10451047. King, R. W., Deshaies, R. J., Peters, J. M. & Kirschner, M. W. (1996). How proteolysis drives the cell cycle. Science 274: 1652-1659. Kitamura, K., Maekawa, H. & Shimoda, C. (1998). Fission yeast Ste9, a homolog of Hct1/Cdh1 and Fizzy-related, is a novel negative regulator of cell cycle progression during G1-phase. Mol. Biol. Cell 9: 1065-1080. Kovelman, R. & Russell, P. (1996). Stockpiling of Cdc25 during a DNA replication checkpoint arrest in Schizosaccharomyces pombe. Mol. Cell. Biol. 16: 86-93. Krek, W. (1998). Proteolysis and the G1–S transition: the SCF connection. Curr. Opin. Gen. Dev. 8: 36-42. Kumagai, A. & Dunphy, W. (1995). Control of the Cdc2/cyclin B complex in Xenopus egg extracts arrested at a G2/M checkpoint with DNA synthesis inhibitors. Mol. Biol. Cell 6: 199-213. Lefever, R., Nicolis, G. & Prigogine, I. (1967). On the occurence of oscillations around the steady state in systems of chemical reactions far from equilibrium. J. Chem. Phys. 47: 1045-1047. Lew, D. J. & Kornbluth, S. (1996). Regulatory roles of cyclin dependent kinase phosphorylation in cell cycle control. Curr. Opin. Cell Biol. 8: 795-804. Lorca, T., Castro, A., Martinez, A. M., Vigneron, S., Morin, N., Sigrist, S., Lehner, C., Doree, M. & Labbe, J. C. (1998). Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts. EMBO J. 17: 3565-3575. Lundgren, K., Walworth, N., Booher, R., Dembski, M., Kirschner, M. & Beach, D. (1991). mik1 and wee1 cooperate in the inhibitory tyrosine phosphorylation of cdc2. Cell 64: 1111-1122. 96


Marlovits, G., Tyson, C., Novák, B. & Tyson, J. (1998). Modeling M-phase control in Xenopus oocyte extracts: the survaillance mechanism for unreplicated DNA. Biophys. Chem. 72: 169-184. Martin-Castellanos, C., Labib, K. & Moreno, S. (1996). B-type cyclins regulate G1 progression in fission yeast in opposition to the p25rum1 cdk inhibitor. EMBO J. 15: 839849. Masui, Y. & Markert, C. L. (1971). Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. J. Exp. Zool. 177: 129-146. Michaelis, C., Ciosk, R. & Nasmyth, K. (1997). Cohesins: chromosomal proteins that prevent premature separation of sister chromatids. Cell 91: 35-45. Millar, J. & Russell, P. (1992). The cdc25 M-phase inducer: an unconventional protein phosphatase. Cell 68: 407-410. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. & Murray, A. (1994). A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell 79: 475-486. Mitchison, J. M. (1971). The Biology of the Cell Cycle. Cambridge Univiversity Press, Cambridge, UK. Mondesert, O., McGowan, C. & Russell, P. (1996). Cig2, a B-type cyclin, promotes the onset of S in Schizosaccharomyces pombe. Mol. Cell. Biol. 16: 1527-1533. Moreno, S. & Nurse, P. (1994). Regulation of progression through the G1 phase of the cell cycle by the rum1+ gene. Nature 367: 236-242. Moreno, S., Nurse, P. & Russell, P. (1990). Regulation of mitosis by cyclic accumulation of p80cdc25 mitotic inducer in fission yeast. Nature 344: 549-552. Morgan, D. (1995). Principles of CDK regulation. Nature 374: 131-134. Murray, A. (1991). Cell cycle extracts. Meth. Cell Biol. 36: 581-605. Murray, A. & Hunt, T. (1993). The Cell Cycle. An introduction. W. H. Freeman & Co., New York. Murray, A. W. & Kirschner, M. W. (1989). Cyclin synthesis drives the early embryoniccell cycle. Nature 339: 275-280. Nasmyth, K. (1995). Evolution of the cell cycle. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B (Biol Sci.) 349: 271-81. Nasmyth, K. (1996a). At the heart of the budding yeast cell cycle. Trends Genet. 12: 405412. Nasmyth, K. (1996b). Viewpoint: putting the cell cycle in order. Science 274: 1643-1645. Newport, J. & Kirschner, M. (1982). A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell 30: 675-686. Nigg, E. A. (1995). Cyclin-dependent protein kinases: Key regulators of the eukaryotic cell cycle. Bioessays 17: 471-480. Novák, B., Csikász-Nagy, A., Gyõrffy, B., Chen, K. & Tyson, J. (1998a). Mathematical model of the fission yeast cell cycle with checkpoint controls at the G1/S, G2/M and metaphase/anaphase transitions. Biophys. Chem. 72: 185-200.

97


Novák, B., Csikász-Nagy, A., Gyõrffy, B., Nasmyth, K. & Tyson, J. (1998b). Model Scenarios for the evolution of the eukaryotic cell cycle. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B (Biol. Sci.) (in press) Novák, B. & Tyson, J. (1993a). Modeling the cell division cycle: M-phase trigger, oscillations, and size control. J. Theor. Biol. 165: 101-134. Novák, B. & Tyson, J. (1993b). Numerical analysis of a comprehensive model of M-phase control in Xenopus oocyte extracts and intact embryos. J. Cell Sci. 106: 1153-1168. Novák, B. & Tyson, J. J. (1994). Mathematical modeling of the cell division cycle. In Mathematical Population Dynamics: Analysis of Heterogeneity. (O. Arino, D. E. Axelrod, & M. Kimmel , Eds.), pp. 155-170. Wuerz Publishing, Winnipeg, Canada. Novák, B. & Tyson, J. (1995). Quantitative analysis of a molecular model of mitotic control in fission yeast. J. Theor. Biol. 173: 283-305. Novák, B. & Tyson, J. (1997). Modeling the control of DNA replication in fission yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 9147-9152. Nurse, P. (1975). Genetic control of cell size at cell division in yeast. Nature 256: 547-551. Nurse, P. (1990). Universal control mechanism regulating onset of M-phase. Nature 344: 503-508. Nurse, P. (1991). The Florey Lecture, 1990. How is the cell division cycle regulated? Phil. Trans. R. Soc. Lond. B (Biol. Sci.) 332: 271-276. Obeyesekere, M. N., Herbert, J. R. & Zimmerman, S. O. (1995). A model of the G1 phase of the cell cycle incorporating cyclin E/cdk2 complex and retinoblastoma protein. Oncogene 11: 1199-1205. Obeyesekere, M. N., Tucker, S. L. & Zimmerman, S. C. (1992). Mathematical models for the cellular concentrations of cyclin and MPF. Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 782-789. Osmani, S. & Ye, X. (1997). Targets of checkpoints controlling mitosis: lessons from lower eukaryotes. Trends Cell Biol. 7: 283-288. Pardee, A. B. (1989). G1 events and regulation of cell proliferation. Science 246: 603-608. Parker, L., Walter, S., Young, P. & Piwnica-Worms, H. (1993). Phosphorylation and inactivation of the mitotic inhibitor Wee1 by the nim1/cdr1 kinase. Nature 363: 736738. Planas-Silva, M. D. & Weinberg, R. A. (1997). The restriction point and control of cell proliferation. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 768-772. Rempel, R. E., Sleight, S. B. & Maller, J. L. (1995). Maternal Xenopus Cdk2-Cyclin-E complexes function during meiotic and early embryonic-cell cycles that lack a G(1) phase. J. Biol. Chem. 270: 6843-6855. Rowles, A. & Blow, J. (1997). Chromatin proteins involved in the initiation of DNA replication. Curr. Opin. Gen. Dev. 7: 152-157. Russell, P. & Nurse, P. (1986). cdc25+ functions as an inducer in the mitotic control of fission yeast. Cell 45: 145-153.

98


Sanchez-Diaz, A., Gonzalez, I., Arellano, M. & Moreno, S. (1998). The Cdk inhibitors p25rum1 and p40SIC1 are functional homologues that play similar roles in the regulation of the cell cycle in fission and budding yeast. J. Cell Sci. 111: 843-851. Schwab, M., Lutum, A. S. & Seufert, W. (1997). Yeast Hct1 is a regulator of Clb2 proteolysis. Cell 90: 683-693. Schwob, E., Bohm, T., Mendenhall, M. & Nasmyth, K. (1994). The B-type cyclin kinase inhibitor p40SIC1 controls the G1 to S transition in S. cerevisiae. Cell 79: 233-244. Sherr, C.J. (1996). Cancer cell cycles. Science 274: 1672-1677. Sherr, C. J. & Roberts, J. M. (1995). Inhibitors of mammalian G(1) cyclin-dependent kinases. Genes Dev. 9: 1149-1163. Sipiczki M. (1988): The role of sterility genes (ste and aff) in the initiation of sexual development in Schizosaccharomyces pombe. Mol. & Gen. Genet. 213: 529-534. Skowyra, D., Craig, K., Tyers, M., Elledge, S. & Wade, J. (1997). F-Box proteins are receptors that recruit phosphorylated substrates to the SCF ubiquitin-ligase complex. Cell 91: 209-219. Smythe, C. & Newport, J. W. (1992). Coupling of mitosis to the completion of S phase in Xenopus occurs via modulation of the tyrosine kinase that phosphorylates p34cdc2. Cell 68: 787-797. Solomon, M. J. (1993). Activation of the various cyclin/cdc2 protein kinases. Curr. Opin. Cell Biol. 5: 180-186. Solomon, M. J., Glotzer, M., Lee, T. H., Philippe, M. & Kirschner, M. W. (1990). Cyclin activation of p34cdc2. Cell 63: 1013-1024. Stern, B. & Nurse, P. (1996). A quantitative model for the cdc2 control of S phase and mitosis in fission yeast. Trends Genet. 12: 345-350. Stern, B. & Nurse, P. (1998). Cyclin B proteolysis and the cyclin-dependent kinase inhibitor rum1p are required for the pheromone-induced G1 arrest in fission yeast. Mol. Biol. Cell 9: 1309-1321. Stillman, B. (1996). Cell cycle control of DNA replication. Science 274: 1659-1663. Sudakin, V., Ganoth, D., Dahan, A., Heller, H., Hershko, J., Luca, F., Ruderman, J. & Hershko, A. (1995). The cyclosome, a large complex containing cyclin-selective ubiquitin ligase activity, targets cyclins for destruction at the end of mitosis. Mol. Biol. Cell 6: 185-197. Tyson, J. J., Chen, K. & Novák, B. (1997). The eukaryotic cell cycle: Molecules, mechanisms and mathematical models. In Mathematical Modeling: Ecology, Physiology, and Cell Biology. (H. G. Othmer, F. R. Adler, M. A. Lewism, & J. C. Dallon , Eds.), pp. 127-147. Prentice Hall, Upper Saddle River, New York, USA: Tyson, J. J., Novák, B., Chen, K. & Val, J. (1995). Checkpoints in the cell cycle from a modeler’s perspective. In Progress in Cell Cycle Research (L. Meijer & H. Y. L. Tung , Eds.), pp. 1-8. Plenum Press, New York, USA. Tyson, J. J., Novák, B., Odell, G. M., Chen, K. & Thron, C. D. (1996). Chemical kinetic theory as a tool for understanding the regulation of M-phase promoting factor in the cell cycle. Trends Biochem. Sci. 21: 89-96.

99


Verma, R., Anna, R. S., Huddleston, M. J., Carr, S. A., Reynard, G. & Deshaies, R. J. (1997). Phosphorylation of Sic1p by G1 Cdk required for its degradation and entry into S Phase.Science 278: 456-460. Visintin, R., Prinz, S. & Amon, A. (1997). CDC20 and CDH1: A family of substratespecific activators of APC-dependent proteolysis. Science 278: 460-463. Weinstein, J. (1997). Cell Cycle-regulated expression, phosphorylation, and degradation of p55Cdc. A mammalian homolog of CDC20/Fizzy/Slp1. J. Biol. Chem. 272: 2850128511. White, R. J. (1997). Regulation of RNA polymerases I and III by the retinoblastoma protein: a mechanism for growth control? Trends Biochem. Sci. 22: 77-80. Wu, L. & Russell, P. (1993). Nim1 kinase promotes mitosis by inactivating Wee1 tyrosine kinase. Nature 363: 738-741. Wuarin, J. & Nurse, P. (1996). Regulating S phase: CDKs, licensing and proteolysis. Cell 85: 785-787. Yamaguchi, S., Murakami, H. & Okayama, H (1997). A WD repeat protein controls the cell cycle and differentiation by negatively regulating Cdc2/B-type cyclin complexes. Mol. Biol. Cell 8: 2475-2486. Zachariae, W., Shin, T., Galova, M., Obermaier, B. & Nasmyth, K. (1996). Identification of subunits of the anaphase-promoting complex of Saccharomyces cerevisiae. Science 274: 1201-1204. Zetterberg, A. & Larsson, O. (1985). Kinetic analysis of regulatory events in G1 leading to proliferation or quiescence of Swiss 3T3 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 53655369. Zetterberg, A. & Larsson, O. (1995). Cell cycle progression and cell growth in mammalian cells: kinetic aspects of transition events. In Cell cycle control. (C. Hutchison & D. M. Glover, Eds), pp.206-227, Oxford University Press, Oxford, UK. Zetterberg, A., Larsson, O. & Wiman, K. (1995). What is the restriction point? Curr. Opin. Cell Biol. 7: 835-842.

100

11. Köszönetnyilvánítás

John Tyson professzorral (Department of Biology, Virginia Tech) folytatott közös munka mindig nagy élményt jelentett és jelent számomra. Nagyon köszönöm azt a stimuláló és baráti légkört, ami tudományos együttmûködésünket jellemzi. Hálával tartozom Murdoch Mitchison professzornak (Institute of Cell, Animal and Population Biology, University of Edinburgh), aki bevezetett a sejtciklus kutatás rejtelmeibe. Szeretnék köszönetet mondani Édesapámnak, dr. Novák Ervinnek, valamint kollegáimnak és tanítványaimnak a Budapesti Mûszaki Egyetemen (különösen dr. Sveiczer Ákos), akik e dolgozat átolvasásával és kritikai megjegyzéseikkel sokat segítették munkámat. Végezetül a Családomnak, Feleségemnek és gyermekeimnek tartozom a legnagyobb köszönettel türelmükért és segítõ megértésükért, amivel munkámat mindig segítik.

101

DOKTORI ÉRTEKEZÉS. A sejtszaporodás reakciókinetikai modelljei

Recommend Documents