DNA MITOKONDRIA GAJAH SUMATERA SERTA HUBUNGANNYA DENGAN SPESIES DAN SUBSPESIES GAJAH LAIN
TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung
Oleh
NENENG YUSRI PARIKESIT NIM: 20506010 Program Studi Kimia
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2008
DNA Mitokondria Gajah Sumatera serta Hubungannya dengan Spesies dan Subspesies Gajah Lain
Oleh :
Neneng Yusri Parikesit NIM : 20506010
Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung
Bandung, Tanggal 27 Juni 2008 Mengetahui / Menyetujui, Pembimbing,
Achmad Saifuddin Noer, Ph.D NIP. 130 875 577
Surat Pernyataan Pelimpahan Hak Cipta dan Keaslian Karya Tulis
Yang bertanda tangan di bawah ini: Nama NIM
: Neneng Yusri Parikesit : 20506010
Menyatakan bahwa Penulis Tesis dengan judul: DNA Mitokondria Gajah Sumatera serta Hubungannya dengan Spesies dan Subspesies Gajah Lain Di bawah bimbingan Achmad Saifuddin Noer, Ph.D. Adalah benar-benar tesis tersebut hasil karya tulis berdasarkan data eksperimen perhitungan/permodelan Penulis selama melakukan Tugas Akhir Magister di Program Studi Kimia ITB.
Bandung, 27 Juni 2008
Neneng Yusri Parikesit
ABSTRAK DNA Mitokondria Gajah Sumatera serta Hubungannya dengan Spesies dan Subspesies Gajah Lain Oleh Neneng Yusri Parikesit 20506010 Sepanjang 55 juta tahun terdapat 500 spesies gajah yang dikenal, namun sekarang di dunia hanya tinggal dua spesies yang masih hidup yaitu, gajah Afrika dan gajah Asia yang hanya tersisa empat subspesies salah satunya adalah gajah Sumatera yang termasuk dalam daftar hewan langka yang dilindungi di Indonesia, keberadaannya diambang kepunahan karena populasinya yang terus menurun dari tahun ke tahun akibat perusakan habitat dan perburuan liar. Sampai saat ini belum ada satupun informasi yang berkaitan dengan DNA mitokondria hewan langka yang nyaris punah tersebut. Sistim genetik unik mtDNA yang menjadikannya berbeda dengan DNA inti di antaranya adalah pola pewarisannya yang spesifik yaitu, hanya diturunkan dari ibu (matternally inherited). Hal ini dapat dijadikan alat untuk menelusuri hubungan kekerabatan antara individu segaris keturunan ibu. Selain itu, pada mtDNA terdapat daerah yang tidak mengode protein disebut daerah D-loop yang mempunyai tingkat polimorfisme tertinggi dan dapat digunakan untuk menentukan identitas suatu individu berkaitan dengan penelusuran asal usul. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan urutan nukleotida DNA mitokondria gajah Sumatera bagian D-loop dan mengetahui hubungan kekerabatannya dengan spesies lain yaitu gajah Afrika (Loxodonta africana), Mammoth (Mammuthus primigenius) dan dengan subspesies lain dari gajah Asia yaitu gajah India (Elephas maximus indicus). Metoda yang dilakukan pada penelitian ini terdiri atas lima tahap dimulai dari pengumpulan sampel, amplifikasi mtDNA, elektroforesis, penentuan urutan nukleotida dan analisis hasil sequensing. Sampel yang digunakan yaitu gajah Sumatera (Elephas maximus sumatrensis) yang merupakan subspesies gajah Asia, yang terdapat di Kebun Binatang Bandung. Pengambilan sampel rambut tiga gajah tersebut dibantu oleh petugas Kebun Binatang Bandung. Amplifikasi mtDNA dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction menggunakan pasangan primer P22F/P22R yang dirancang atas dasar urutan D-loop Elephas maximus indicus menggunakan program Genmon dan Primer selectTM. Elektroforesis dilakukan pada gel agarosa. Sebagai penanda (marker) digunakan plasmid pUC19/HinfI. Untuk keperluan penentuan urutan nukleotida, sampel hasil PCR dilakukan dengan menggunakan metode Dideoksi Sanger. Analisis hasil sequencing dilakukan dengan membandingkan urutan nukleotida sampel terhadap urutan Mammoth, gajah Afrika dan gajah India yang masing-masing didapat dari GenBank. Proses pembandingan dilakukan menggunakan program SeqmanTM dan untuk menyusun pohon pilogenik digunakan program MegalignTM versi 4.0.0 dari DNAstar.
i
Sampel akar rambut yang telah dilisis dan dijadikan templat untuk PCR menunjukan hasil amplifikasi berupa pita fragmen DNA berukuran 0,4 kb dengan bantuan elektroforesis gel agarosa. Sekuensing fragmen tersebut menghasilkan 419 pb, 415 pb, dan 412 pb masing-masing untuk sampel GL-1, AG-1, dan IG-1. Analisis homologi urutan nukleotida mtDNA gajah Sumatera menunjukkan adanya tiga mutasi terhadap gajah India, yaitu A15718C, T15820C, dan adanya delesi C pada posisi 15737. Terhadap gajah Afrika terdapat enam mutasi, yaitu C15716T, A15734C, T15818C, T15862A, C16029T dan T pada posisi 15735 mengalami delesi. Terhadap Mammoth mengalami lima mutasi, yaitu A15739C, T15823C, C15898T, dan C16034T, dan delesi T pada posisi 15740. Analisis pohon pilogenik menunjukan gajah Sumatera paling dekat hubungan kekerabatannya dengan gajah India. Sementara Mammoth dan gajah Afrika berada pada posisi lainnya. Pita fragmen DNA yang berukuran 0,4 kb sesuai dengan fragmen yang disimulasikan oleh primer P22F dan P22R. Hasil sequensing masing-masing sampel GL-1, AG-1, dan IG-1 menunjukan bahwa pita yang disequensing merupakan daerah D-loop gajah. Analisis urutan nukleotida gajah Sumatera yang menunjukkan adanya mutasi terhadap gajah India, gajah Afrika, dan Mammoth mengkonfirmasi bahwa secara genetika molekul gajah Sumatera merupakan subspesies tersendiri. Analisis pohon pilogenik mengindikasikan bahwa gajah Sumatera lebih dekat hubungan kekerabatannya dengan gajah India hal ini dikarenakan gajah Sumatera dan gajah India merupakan satu spesies yang sama yaitu merupakan spesies gajah Asia. Gajah Asia dan Mammoth hubungan kekerabatannya lebih dekat dibandingkan dengan gajah Afrika, hal ini diduga bahwa Mammoth merupakan nenek moyang dari gajah Asia ini diperkuat dengan adanya penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa mammoth merupakan kerabat dekat (sister species) dengan gajah Asia. Sementara itu dengan gajah Afrika kekerabatannya jauh karena menurut data penelitian sebelumnya bahwa nenek moyang Mammoth dan gajah Asia terpisah garis keturunan dengan nenek moyang gajah Afrika. Metoda dengan menggunakan sampel akar rambut gajah pada penelitian ini telah berhasil dilakukan, maka metoda ini dapat diterapkan pada penelitian gajah selanjutnya. Urutan nukleotida daerah D-loop yang telah didapatkan dapat menjadi database untuk kepentingan selanjutnya. Kata kunci : Elephas maximus sumatrensis, mtDNA, D-loop
ii
ABSTRACT Sumatran Elephant Mitochondrial DNA and its Relation with Other Elephant Species and Subspecies By Neneng Yusri Parikesit 20506010 For 55 million year there had been around 500 elephant species, but now there are only two living species in the world, namely the African elephant and the Asian elephant. Furthermore, there are only four subspecies of the Asian elephant exist, one of them is the Sumatran elephant which is included in the list of animal conservation in Indonesian,. This animal almost extinct because their population decrease from year to year due to habitats damaged and wild hunt. Until recently, there is no information about mitochondrial DNA nucleotide sequence of this animal. Unique system of genetic motochondrial DNA making differ from nucleus DNA there is specific inheriting pattern, namely only alighted from mother (matternally inherited). mtDNA is a powerful tool for tracking ancestry through females., and mtDNA also posses a noncoding region namely D-loop. This region shows the highest of level polymorfism. The aims of this research is to obtain nucleotide sequence of the Sumatran elephant mitochondrial DNA and to investigate its relation with other species which are the African elephant (Loxodonta africana), and the Mammoth (Mammuthus primigenius) as well as with other subspecies which is the Indian elephant (Elephas maximus indicus). The research methods consist of five level start from sample collecting, mtDNA amplification, electrophoresis, sequensing determination and sequensing result analysis. Sample that used in this research is Sumatran elephant (Elephas maximus sumatrensis) which represent Asian elephant subspesies, that can take in Bandung Zoo. Intake of hair sampel the three elephant assisted by officer of Bandung Zoo. MtDNA amplified with Polymerase Chain Reaction technique used couple of primer P22F/P22R that designed based on sequence of D-loop Elephas maximus indicus use Genmon and Primer selectTM program. Electrophoresis conducted at agarosa gel. As marker use plasmid pUC19/HinfI. For determination nucleotida sample sequence of PCR result conducted with using Dideoxy Sanger method. Analysis of sequencing result conducted with comparing nucleotida sequence of sample to nucleotida sequence of Mammoth, African elephant and Indian elephant which is each got from GenBank. Comparing process use SeqmanTM program and to compile phylogenetic tree use MegalignTM program version 4.0.0 from DNAstar. Hair sample was lysis and made template for PCR showed amplification result in the form band of DNA fragmen 0.4 kb constructively electrophoresis of agarosa gel. The Fragment Sekuensing yield 419 bp, 415 bp, and 412 pb for GL-1, AG-1, and IG-1 respectively. Homology analysis of nucleotide sequence Sumatran elephant compared to Indian elephant showed three mutation that is, A15718C,
iii
T15820C, and deletion of C base on position 15737. If compared to African elephant showed six mutation that is, C15716T, A15734C, T15818C, T15862A, C16029T and deletion of T base on position 15735. If compared to Mammoth showed five mutation that is, A15739C, T15823C, C15898T, C16034T, and deletion of T base on position 15740. Phylogenetic tree analysis showed that Sumatran elephant nearest relation with Indian elephant. Whereas Mammoth and African elephant reside in other on course. Fragment band of DNA have measurement 0,4 kb as according to fragment which is simulation by P22F and P22R Primer. Result of sequensing each sample of GL1, AG-1, and IG-1 showed that band which is sequens is true represent area of elephant D-loop. Sequence analysis of nukleotida Sumatran elephant that showing mutation to Indian elephant, African elephant, and Mammoth confirms that by genetika molecule represent Sumatran elephant is separate subspesies. Phylogenetic tree analysis indicates that nearer relation between Sumatran elephant and Indian elephant because of Sumatran elephant and Indian elephant represent one is same species namely Asian elephant species. Mammoth more closely related to the Asian elephant than to the African elephant, its estimated that Mammoth represent ancestors of Asian elephant is supported by previous research which express that mammoth represent species sister with Asian elephant. Beside that African elephant is far relation with both of Asian elephant and Mammoth because according to previous research suggests that M.primigenius and E. maximus diverged soon after their common ancestor split from the L. africana lineage. Method at this research which use sample of hair follicles of elephant have succeeded to conducted, that way can be used for the futher research with the same method. Nucleotide sequence of D-loop region which have been got can become database for futher interest. Keywords : Elephas maximus sumatrensis, mtDNA, D-loop
iv
PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS
Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya.
Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Direktur Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung.
v
Bacalah, dan Tuhanmulah yang paling Pemurah; yang mengajar (manusia) dengan perantaraan kalam. Dia mengajarkan kepada manusia apa yang tidak diketahuinya. (Al’Alaq, ayat : 3 sampai 5)
Dipersembahkan kepada Mamah, Papah, A Jacki, A Ilyas dan Nafi Terima kasih atas segala pengorbanannya yang tidak mungkin akan dapat tergantikan
vi
KATA PENGANTAR
Dengan memanjatkan puji dan syukur kehadirat Illahi, atas berkat rahmat dan karunia-Nya, penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul ”DNA Mitokondria Gajah Sumatera serta Hubungannya dengan Spesies dan Subspesies Gajah Lain”, sebagai syarat dalam meraih gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Bapak Achmad Saifuddin Noer, Ph.D, atas segala bimbingan dan masukkannya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini.
Ucapan terima kasih juga disampaikan sebesar-besarnya kepada: 1. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Dr. Akhmaloka atas segala ijin yang diberikan. 2. Kepada Ibu Dr. Dessy Natalia, sebagai Ketua Program Studi Magister Kimia Institut Teknologi Bandung. 3. Ketua Program Studi S1 Kimia Institut Teknologi Bandung Dr. Indra Noviandri. 4. Seluruh staf pengajar Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung, atas segala bimbingannya dan masukannya. 5. Bapak Drs. Romli S. Bratakusuma selaku pemilik Yayasan Taman Margasatwa Tamansari Badung, Bapak drh. Fathul Bari dan Bapak Yayat Ruhiyat salaku kurator mamalia, dan Bapak Koko Sukmana, Bapak djubidin, Bapak Djeje Ginanjar dan Bapak Yayat Supriatna staf bagian kandang gajah yang telah memberi ijin dan secara terbuka memberikan dukungan dan bantuan kepada penulis selama pengambilan sampel. 6. Bu Sony, Bu Tini, Pak Handi, Pak Wandi, dan Pak Aep serta seluruh staf administrasi Program Studi Institut Teknologi Bandung 7. Bapak Tidi Dhalika, Ir, M.S. dan Bapak Diding Latifudin Ir, M.Si, sebagai dosen penulis ketika menempuh kuliah di jurusan Teknologi Hasil Ternak Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran 8. Pak Yayat, Pak Edi, Pak Dadan, dan Bu Eshar atas segala bantuannya.
vii
9. Papa, Mama, kakak-kakak, Adik dan Mas Wi tercinta atas doa, semangat, dan dukungannya. 10. Teman-teman Magister Kimia Angkatan 2006, Rina, Tina, Tunjung, Muchtar, Ana, Sisi, Keni terima kasih buat kebersamaannya. 11. Teman-teman seperjuangan. Pak Purkan, Pak Tanto, Pak Johanes, Bellinda, Euis, Bu Fernita, Bu Hera. 12. Teman-teman laboratorium Biokimia, Indira, Dwita, Karin, Puti, Bu Prima, Bu Hira, Bu Ati, Bu Puspa, Bu Vera, Bu Santi, Bu Lulus, Pak Savante, Pak Ari, Pak Rafi, Dini, Frisda, Imandut, Imance, Ferra, Edo, Bambang, Dea, Mira, Septin, Edu, Ogi, Ryan.
Beribu terima kasih, penulis ucapkan atas segala masukan, dukungan, semangat, dan bantuannya, sungguh merupakan sesuatu yang tak ternilai. Mohon maaf apabila tidak disebutkan satu - persatu karena keterbatasan tempat. Namun sekali lagi penulis ucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya, semoga mendapat balasan yang setimpal dari Allah SWT.
Bandung, 27 Juni 2008 Hormat,
Penulis
viii
DAFTAR ISI ABSTRAK ............................................................................................................ i ABSTRACT ......................................................................................................... iii PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS .................................................................. v PERUNTUKAN.................................................................................................... vi KATA PENGANTAR .......................................................................................... vii DAFTAR ISI......................................................................................................... ix DAFTAR LAMPIRAN......................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xii DAFTAR TABEL................................................................................................. xiii DAFTAR SINGKATAN DAN ISTILAH ............................................................ xiv Bab I
Pendahuluan ............................................................................................. 1
I.1. Latar Belakang.......................................................................................... 1 I.2. Rumusan Masalah..................................................................................... 2 I.3. Tujuan Penelitian ...................................................................................... 3 I.4. Batasan Penelitian..................................................................................... 3 I.5. Metode Penelitian ..................................................................................... 3 I.6. Sistematika Penulisan ............................................................................... 3 Bab II Tinjauan Pustaka ....................................................................................... 5 II.1. Gajah ....................................................................................................... 5 II.1.1. Gajah Afrika (Loxodonta africana)...................................................... 5 II.1.2. Gajah Asia (Elephas maximus) ............................................................ 6 II.1.2.1. Gajah Srilanka ................................................................................... 7 II.1.2.2. Gajah India ........................................................................................ 7 II.1.2.3. Gajah Sumatera ................................................................................ 7 II.1.2.4. Gajah Borneo.................................................................................... 8 II.1.2. Peta Penyebaran Populasi Gajah ........................................................ 9 II.1.3. Pola Hidup Gajah ..............................................................................10 II.2. Mitokondria ..........................................................................................10 II.2.1. Struktur Mitokondria .........................................................................10 II.2.2. Fungsi Mitokondria ...........................................................................12
ix
II.2.3. DNA Mitokondria .............................................................................13 II.2.4. Sifat DNA Mitokondria .....................................................................14 II.2.4.1. Pola Pewarisan Secara Maternal .....................................................14 II.2.4.2. Laju Mutasi mtDNA ........................................................................15 II.2.4.3. Kode Genetik mtDNA .....................................................................16 II.3. Polymerase Chain Reaction ...................................................................17 II.4. Direct Sequencing dengan metode Dideoksi-Sanger .............................17 Bab III Metode Penelitian ...................................................................................19 III.1. Alat........................................................................................................19 III.2. Bahan ....................................................................................................20 III.3. Penyiapan Sampel ................................................................................20 III.4. Diagram Alir Penelitian ........................................................................21 III.5. Cara Kerja Penelitian ...........................................................................22 III.5.1.Penyiapan Template DNA .................................................................22 III.5.2.Sintesis Primer ....................................................................................22 III.5.3.Amplifikasi DNA ................................................................................22 III.5.4.Analisis Hasil PCR..............................................................................23 III.5.5.Penentuan Urutan Nukleotida .............................................................24 III.5.6.Analisis Hasil Sequencing...................................................................24 Bab IV
Hasil dan Pembahasan...........................................................................26
IV.1. Pengumpulan Sampel ..........................................................................26 IV.2. Penyiapan templat mtDNA ...................................................................26 IV.3. Amplifikasi Fragmen 450 pb mtDNA dengan Metode PCR ................27 IV.4. Analisis Hasil PCR ...............................................................................29 IV.5. Hasil Sequencing dan Urutan Nukleotida Sampel................................30 IV.6. Mutasi-Mutasi pada Sampel .................................................................31 IV.7. Analisis Pohon Pilogenetik ...................................................................38 Bab V Kesimpulan ..............................................................................................40 DAFTAR PUSTAKA ...........................................................................................41 LAMPIRAN..........................................................................................................45
x
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran A
Elektroforegram Sampel AG-1 (Yamon) Menggunakan Primer P22F ............................................................................................ 44
Lampiran B
Elektroforegram Sampel IG-1 (Yani) Menggunakan Primer P22F ............................................................................................ 46
Lampiran C
Elektroforegram Sampel GL-1 (Ira) Menggunakan Primer P22F ............................................................................................ 47
Lampiran D
Urutan nukleotida fragmen 403 pb sampe AG-l pada posisi 15717-16120 ............................................................................... 48
Lampiran E
Urutan nukleotida fragmen 403 pb sampe IG-1 pada posisi 15717-16120 ............................................................................... 49
Lampiran F
Urutan nukleotida fragmen 403 pb sampe GL-1 pada posisi 15717-16120 ............................................................................... 50
Lampiran G
Tabel Kode Genetik mtDNA ...................................................... 51
xi
DAFTAR GAMBAR Gambar II.1
Gajah Afrika (Loxodonta africana africana)..............................
6
Gambar II.2
Gajah Asia (Elephas maximus indicus).......................................
7
Gambar II.3
Gambar Peta Penyebaran Populasi Gajah ...................................
9
Gambar II.4
Struktur Mitokondria................................................................... 11
Gambar II.5
Jalur metabolik dalam mitokondria............................................. 12
Gambar II.6
DNA Mitokondria Mammoth (Mammuthus primigenius).......... 13
Gambar II.7
Pola pewarisan mtDNA .............................................................. 15
Gambar III.1
Diagram Alir Penelitian .............................................................. 21
Gambar IV.1
Skema penempelan dan arah primer PCR P22F dan P22R pada templat mtDNA.......................................................................... 28
Gambar IV.2
Fragmen 0,4 kb mtDNA hasil PCR menggunakan primer P22F dan P22R ..................................................................................... 29
Gambar IV.3
Elektroforegram hasil sampel IG-1 menggunakan primer P22F
Gambar IV.4
Urutan nukleotida sampel IG-1 hasil sekuensing menggunakan
30
primer P22F................................................................................. 31 Gambar IV.5
Mutasi sampel ............................................................................. 32
Gambar IV.6
Homologi urutan nukleotida pada fragmen 403 pb ketiga sampel urutan nukleotida gajah Sumatera dengan urutan nukleotida gajah Asia, Gajah Afrika dan Mammoth ................. 33
Gambar IV.7
Mutasi mtDNA gajah Sumatera terhadap gajah Asia ................. 34
Gambar IV.8
Mutasi mtDNA gajah Sumatera terhadap gajah Afrika .............. 35
Gambar IV.9
Mutasi mtDNA gajah Sumatera terhadap Mammoth ................ 36
Gambar IV.10 Skema pola mutasi yang terjadi sepanjang 403 pb pada tiga urutan nukleotida gajah Sumatera terhadap gajah Asia, gajah Afrika dan Mammoth.................................................................. 37 Gambar IV.11 Pohon filogenetik yang dianalisis menggunakan program MegalignTM ................................................................................. 38
xii
DAFTAR TABEL
Tabel II.1
Perbedaan kodon mtDNA manusia dengan Kodon Universal.... 16
Tabel IV.1
Data fisik sampel mtDNA gajah Sumatera ................................. 26
xiii
DAFTAR SINGKATAN DAN ISTILAH Singkatan
Pertama kali digunakan halaman
A
Adenine
13
ATP
Adenosine Triphosphate
2
C
Cytosine
13
dATP
Deoxyadenosine triphosphate
23
dCTP
Deoxycytidine triphosphate
23
ddH2O
akua bidestilasi
20
dGTP
Deoxyguanosine triphosphate
23
DNA
Deoxyribose Nucleic Acid
1
dNTP
Deoxynucleotide triphosphate
23
dTTP
Deoxythymidine triphosphate
23
EDTA
Etilendiamintetraasetat
18
EtBr
Etidium Bromida
20
G
Guanine
13
H
Heavy
13
Kb
kilo basa
22
L
Light
13
mtDNA
mitochondrial DNA
1
pb
pasang basa
2
PCR
Polymerase Chain Reaction
3
RNA
Riboxynucleic Acid
2
rRNA
RNA ribosom
2
rpm
rotasi per menit
22
T
Thymine
13
TAE
Tris Asetat EDTA
23
tRNA
RNA transfer
2
xiv
