DNA kwaliteitsanalyse in het kader van authenticiteitstudies van voedermiddelen Leen Van Houdt(1), Jos Parmentier(1), Marc De Loose(2), Isabel Taverniers(2) (1)
KaHo Sint-Lieven – Departement Gent, Vakgroep Life Sciences, Gebr. Desmetstraat 1, B-9000 Gent (2) Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO), Eenheid Technologie en Voeding, Burg. Van Gansberghelaan 115 bus 2, B-9820 Merelbeke
Inleiding In het kader van het onderzoek naar de authenticiteit in voedsel en veevoeders zijn wetenschappers op zoek naar betrouwbare methodologieën voor het identificeren van species, gebaseerd op parameters die weinig of geen veranderingen ondergaan gedurende de verwerking van voedingsingrediënten (Lüthy, 1999). Proteïne-gebaseerde analyses zijn gelimiteerd wanneer het gaat over verwerkte producten door de degradatie van de proteïnen. Vandaar dat DNA-gebaseerde technieken zoals de polymerasekettingreactie (PCR) aangewend worden als een alternatieve en betrouwbare methode voor species-identificatie (Rönning et al. 2005). Een succesvolle DNA zuivering is cruciaal. De geschiktheid van het geïsoleerde DNA als analytisch materiaal hangt af van verscheidene parameters zoals (1) de concentratie, (2) de zuiverheid en (3) de integriteit. Deze parameters zijn op hun beurt afhankelijk van de matrix waarin het DNA zich bevindt, van de behandeling die het te analyseren staal heeft ondergaan alsook van de gebruikte isolatie- en zuiveringstechniek (Terry et al. 2002). Met uitzondering van de ruwe ingrediënten, ondergaan vele voedings- en voedermiddelen variërende verwerkingsprocedures zoals fysische, chemische en enzymatische behandelingen. Deze procedures kunnen het DNA in het staal beschadigen. Fysische en chemische behandelingen zorgen ervoor dat het DNA op willekeurige plaatsen breekt zodat de gemiddelde lengte van DNA moleculen daalt. Ook langdurige hittebehandelingen resulteren in een degradatie van het DNA (Terry et al. 2002). Voor PCR identificatiestudies is het noodzakelijk dat de doelsequentie amplificeerbaar is; dit wordt enerzijds beïnvloed door de algemene structurele integriteit van het DNA en anderzijds door de aanwezigheid van inhibitoren in de matrix of in de gebruikte extractiereagentia (Smith en Maxwell 2007). In de voorgestelde studie werd de extraheerbaarheid van DNA uit een uitgebreide reeks van voedermiddelen geëvalueerd. Vervolgens werd de kwaliteit van het geïsoleerde DNA geanalyseerd in het kader van PCR identificatiestudies voor het opsporen van vijf plantenspecies, namelijk maïs, tarwe, soja, gerst en koolzaad.
Resultaten DNA extractie uit ruwe ingrediënten, voedermiddelen en mengsels Naast de ruwe ingrediënten maïs, tarwe, soja, gerst en koolzaad, die gebruikt werden als controlestalen in de analyse, werden 37 ingrediënten van mengvoeders (voedermiddelen) en vier mengsels van voedermiddelen met gekende samenstelling (zie tabel 1 en 2) onderworpen aan DNA extractie om vervolgens geanalyseerd te worden via PCR. Het is cruciaal om te evalueren of uit de verschillende voedermiddelen genoeg DNA geïsoleerd kan worden, waarvan de kwaliteit voldoende hoogstaand is voor een PCR identificatiestudie. Verder werd nagegaan of de kwantiteit en kwaliteit van het DNA uit verschillende voedermiddelen gelijkaardig is. Voor de DNA isolatie uit telkens 100 mg van de fijn vermalen voedermiddelen (in duplo) werd gebruik gemaakt van de DNeasy plant mini kit (Qiagen). De kwantiteit van het geïsoleerde DNA en één aspect van de kwaliteit, namelijk de integriteit of intactheid van het DNA, werd nagegaan door middel van agarosegel elektroforese. Figuur 1 toont een agarosegel, waarop de kwantiteit en intactheid van het geïsoleerde DNA van de ruwe ingrediënten, 10 voedermiddelen en 4 mengsels van enkele van deze voedermiddelen beoordeeld kan worden.
Het is opvallend dat er grote verschillen optreden in kwantiteit en intactheid van het geïsoleerde DNA vanuit de verschillende stalen, wat verduidelijkt wordt door het bespreken van enkele stalen. De volledige dataset omtrent opbrengst en integriteit van alle geanalyseerde DNA extracten werd samengevat in tabel 1 en 2. Uit de vermalen tarwe (Fig1. lanen 9,10) kon een grote hoeveelheid DNA geïsoleerd worden met een hoog moleculair gewicht (goede intactheid). Uit het Indisch sojameel (Fig1. lanen 17,18) kon slechts een zeer geringe hoeveelheid DNA bekomen worden, dat sterke degradatie vertoont, terwijl uit het palmpitschroot (Fig1. lanen 15,16) zelfs geen detecteerbare hoeveelheid DNA kon geëxtraheerd worden. Mengsel C (Fig1. lanen 37,38) bevat voor 50% voedermiddelen waaruit geen of zeer weinig DNA geïsoleerd kan worden (namelijk 40 % koolzaadschroot (geëxtraheerd) + 5 % palmpitschroot + 5 % zonnepitschroot). Toch is de DNA opbrengst van mengsel C hoog, wat toe te schrijven is aan de aanwezigheid van 50% gemalen tarwe. De gewichtspercentages van verschillende voedermiddelen in een mengsel stemmen dus niet noodzakelijk overeen met een evenredige verdeling van DNA opbrengst van deze verschillende voedermiddelen in een mengsel. Hieruit blijkt dat bij het analyseren van mengvoeders voorzichtigheid nodig is bij de interpretatie van de DNA kwantiteit en kwaliteit.
Analyse van de amplificeerbaarheid De amplificeerbaarheid van het geïsoleerde DNA, die gerelateerd is met de kwaliteitsparameters zuiverheid (afwezigheid van PCR inhibitoren) en integriteit (gemiddelde lengte DNA moleculen), werd geëvalueerd door middel van PCR met het universele, plant-specifieke primerpaar PLANT 1/2 (ucp-c en ucp-d in Taberlet et al., 1991). Dit primerpaar laat amplificatie toe van chloroplast DNA van alle plantenspecies, indien het gebruikte DNA voldoende zuiver is en geen PCR-inhibitoren bevat enerzijds, en op voorwaarde dat het DNA niet te sterk gedegradeerd is anderzijds. In Figuur 2 werden de resultaten van een PCR met primers PLANT 1/2 zichtbaar gemaakt via agarosegel elektroforese. De amplificeerbaarheid van het DNA blijkt relatief goed gecorreleerd te zijn met de kwantiteit en intactheid, al is de correlatie niet strikt. Bijvoorbeeld, het ondetecteerbare DNA uit palmpitschroot blijkt toch amplificeerbaar te zijn (Fig2. lanen 15,16), terwijl het gedegradeerde zonnepitschroot DNA niet amplificeerbaar is (Fig2. lanen 13,14), mogelijks door de aanwezigheid van PCR-inhibitoren. Een overzicht van de resultaten kan teruggevonden worden in tabel 1 en tabel 2.
Species-identificatie via PCR Een set van 11 primerparen werd samengesteld en gebruikt voor de identificatie van vijf verschillende plantenspecies, maïs, tarwe, soja, gerst en koolzaad. Eerst werd de specificiteit van de gebruikte primerparen bevestigd door analyse van de DNA extracten uit ruwe grondstoffen (controlestalen). Enkel wanneer DNA van het species overeenkomstig met het gebruikte species-specifieke primerpaar aanwezig was in de reactie, werd amplificatie vastgesteld. Vervolgens werd de identificatiestudie uitgevoerd op de DNA extracten van voedermiddelen, waarbij geëvalueerd werd of species identificatie van de voedermiddelen mogelijk is met het geselecteerde set van 11 primerparen. Ook werd bij elk voedermiddel nagegaan of er sporen van een andere plantenspecies in aanwezig zijn, wat zeker van belang is bij verwerkte producten. In de identificatiestudie van voedermiddelen bleek echter primerpaar Hor 1&2 niet voldoende specifiek te zijn voor gerst. Er rijzen zeker problemen met tarwe-bevattende stalen, maar er is ook een vermoeden van aspecifieke signalen bij andere species. Vandaar dat de interpretatie van de resultaten met Hor 1&2 niet betrouwbaar zijn en buiten beschouwing worden gelaten. Verder kan vrij algemeen gesteld worden dat het moeilijk is om de verschillende granen (tarwe, gerst) van elkaar te onderscheiden met het gebruikte set van primers. Uit de analyse blijkt dat in 15 van de 21 voedermiddelen bestaande uit maïs, koolzaad, soja, tarwe of gerst, het species geïdentificeerd kon worden (zie donker omrande kaders in tabel 1). In twee voedermiddelen (beide stalen koolzaadschroot) geeft slechts één van de twee gebruikte speciesspecifieke primerparen amplificatie van het geïsoleerde DNA (wat resulteert in de +/- score die aangeeft dat de aanwezigheid van koolzaad twijfelachtig is). De voedermiddelen waarbij geen speciesidentificatie mogelijk was (maïskiemen, opgeconcentreerde maïsgluten (°) en DDGS (tarwemaïs 75-25)), vertoonden een zeer geringe kwantiteit en kwaliteit (intactheid en amplificeerbaarheid) van het geïsoleerde DNA. Figuur 3 is een agarosegel waarop een deel van de analyse met het maïs-specifieke primerpaar IVR1 F&R is af te lezen. Hier blijkt duidelijk dat het voedermiddel „maïsmeel (*)” (laan 7, 8) het
plantenspecies maïs bevat, aangezien een PCR-amplificatieproduct van de verwachte grootte zichtbaar is. Echter, er wordt hetzelfde PCR-product gevonden, zij het met een geringere intensiteit, voor het voedermiddel „koolzaadschroot (geëxtraheerd)” (laan 11,12). Dit wijst vermoedelijk op een contaminatie van dat koolzaadschroot met maïs (wat bevestigd wordt met het tweede maïsspecifieke primerpaar). Deze contaminatie is zelfs terug te vinden in de analyse van mengsel C. Alhoewel er aan mengsel C geen maïs-bevattend voedermiddel werd toegevoegd, kan toch aangetoond worden dat er maïs in het mengsel aanwezig is. Dit is wellicht toe te schrijven aan de aanwezigheid van 40% koolzaadschroot (geëxtraheerd) in mengsel C. Uit dit resultaat blijkt dat enige voorzichtigheid nodig is bij de interpretatie van de analyse van een mengvoeder aangezien ook rekening gehouden moet worden met mogelijke contaminatie. Naar analogie met de resultaten van „koolzaadschroot (geëxtraheerd)”, rijst de vraag of in bepaalde voedermiddelen of mengsels ervan (A-D) een spoor van contaminatie kan teruggevonden worden. Als de resultaten van primerpaar Hor 1&2 buiten beschouwing gelaten worden, kan gesteld worden dat vijf voedermiddelen vermoedelijk sporen van andere plantenspecies bevatten, namelijk maïsvoermeel (+/- voor soja), koolzaadschroot (geëxtraheerd) (+ voor maïs en soja), lijnmeelschroot (+ voor maïs), sorgho (+ voor maïs en soja) en triticale (+ voor tarwe). Echter, de DNA amplificatie met tarwe-specifieke primers voor triticale is volledig te verklaren door het feit dat het een graan is, ontstaan als kruising tussen tarwe en rogge (het scoort tevens ook als enig staal positief voor een rogge-specifiek primerpaar). In dit geval is dus geen contaminatie met tarwe aantoonbaar. Voor de mengsels (zie tabel 2) zijn de sporen van contaminatie toe te schrijven aan het voedermiddel koolzaadschroot (geëxtraheerd), dat er voor zorgt dat mengsel C maïs blijkt te bevatten (+) en mengsels C en D mogelijks ook soja (+/-?). Het is duidelijk dat de analyse van mengsels bemoeilijkt wordt, enerzijds door de mogelijke aanwezigheid van contaminanten in individuele voedermiddelen en anderszijds door de geringe extraheerbaarheid van kwalitatief geschikt DNA uit bepaalde voedermiddelen. Veronderstel dat aan een mengvoeder als enig tarwe- en maïsbevattend voedermiddel DDGS (75-25 tarwe-maïs) werd toegevoegd. Uit de analyseresultaten van dat mengvoeder zal blijken dat tarwe en maïs niet aantoonbaar zijn. Echter, de algemene DNA kwaliteitsanalyse van dat mengvoeder kan positief zijn, indien het mengvoeder ook voedermiddelen bevat waaruit veel kwalitatief hoogstaand DNA geïsoleerd kan worden. Meer nog, het verschil in DNA opbrengst en kwaliteit van de verschillende voedermiddelen in een mengvoeder zou bijvoorbeeld ook in GGO-detectie kunnen leiden tot een misinterpretatie van de GGO-status, afhankelijk van de samenstelling van het mengvoeder.
koolzaad
gerst
soja
tarwe
tarwe/gerst
maïs
DNA extract: opbrengst en integriteit amplificeerbaarheid met PLANT1/2
Tabel 1: Samenvatting analyse voedermiddelen
controlestalen (ruwe ingrediënten; zaden) Hongaarse maïs onbehandelde tarwe
+ ++/+ ++/+ ++/+
+ -
+
+
-
-
-
Ruwe Braziliaanse sojabonen
++
++
-
-
-
+
-
-
Franse brouwgerst
++
++
-
+
-
-
+
-
koolzaad
++
++
-
-
-
-
-
+
- (SG) - (SG)
+ -
+ -
-
-
-
+/-
-
voedermiddelen met maïs, tarwe, soja, gerst of koolzaad maïsdistillers maïskiemen Braziliaanse maïs
+
++
++
-
-
-
-
maïsmeel
++
++
++
-
-
-
-
-
maïsvoermeel
++
++
++
-
-
+/-
-
-
opgeconcentreerde maïsgluten (°) maïsglutenpellets (Franse maïs)
-
+/++
++
-
-
-
+
-
maismeel (*)
+/-
++
+
-
-
-
+/-
-
-
+/-
-
-
-
-
-
-
tarwekortmeel
++
++
-
+
+
-
+/-
-
tarwenameel
++
++
-
+
+
-
+/-
-
zuivere tarwegluten (Frans) Oekraïnse tarwe (vermalen)
+ (G) ++ ++ ++
-
+ +
+ +
-
+ +/-
-
sojameel HIPRO
+/- (G) ++
-
-
-
++
-
-
++
-
-
+
-
-
sojameel (Argentinië)
+/- (G) ++
-
-
-
++
+/-
-
sojapellets (Argentinië)
+/- (G) ++
-
-
-
++
+/-
-
Indisch sojameel
+(SG) ++
-
-
-
+
-
-
Scottisch malt distillers
- (SG) +/-
-
-
-
-
+
-
koolzaadschroot (Duitsland)
+/- (G) ++
-
-
-
-
-
+/-
DDGS (75-25 tarwe maïs)
sojahullen
koolzaadschroot (geëxtraheerd)
-
-
+
+
-
-
+
-
+/-
lijnzaad lijnmeelschroot
+ +(G)
++ +
+
-
-
-
? -
-
lijnzaadschilfers
+(G)
++
-
-
-
-
-
-
lijnmeelpellets
+(G)
+
-
-
-
-
?
-
citruspulp
-
+/-
-
-
-
-
-
-
palmpitschilfers
-
+
-
-
-
-
-
-
sorgho luzernepellets
++ +(G)
++ -
+ -
-
+/-
+ -
-
-
zonnepitschroot
+(G)
-
-
-
-
-
-
-
zonnepitschroot
+(G)
-
-
-
-
-
-
-
bietenpulppellets
-
-
-
-
-
-
-
-
voedererwten
++
++
-
-
-
-
?
-
palmpitschroot rijstevoermeel
+
+ -
-
-
-
-
-
-
triticale
++
++
-
+,+/-
+
-
+/-
-
haver
+
++
-
-
-
-
-
-
voedermiddelen zonder maïs, tarwe, soja, gerst of koolzaad
Legende Tabel 1: ++ duidelijk positieve extractie/amplificatie + positieve extractie/amplificatie +/- twijfelachtige extractie/amplificatie - negatief; geen extractie/amplificatie ? moeilijk te interpreteren (SG) sterk gedegradeerd (G) gedegradeerd De aanwezigheid van maïs wordt gescoord met primerparen IVR1-F + IVR1-R( Hurst et al. 1999) en ZEIN 3 + ZEIN 4 (Hernandez et al. 2004); van tarwe en/of gerst met Puro AP20F + Puro AR (Alary et al. 2007); van tarwe met LPTBd-1F + LTPBd-2R (Alary et al. 2007) en WMS159CYL + WMS159R (Röder et al., 1998); van soja met LE 1 + LE 2 (Hurst et al. 1999) en GMO 3 + GMO 4 (Meyer et al., 1996); van gerst met HOR 1 + HOR 2 (Hernandez et al. 2005). (Bijkomend wordt gebruik gemaakt van primerpaar Puro AP2s + Puro AM1S (Alary et al. 2007), dit geeft geen amplificatie in aanwezigheid van gerst of tarwe DNA, maar resulteert wel in amplificatie bij aanwezigheid van rogge DNA.) De aanwezigheid van koolzaad wordt gescoord met primerparen PEP 1 + PEP 2 (ILVO, Technologie en voeding, Dr. I Taverniers en Dr. M. De Loose) en CRUKZ 1 + CRUKZ 2 (Taverniers, 2005). Wanneer de aanwezigheid van een species geëvalueerd wordt aan de hand van twee primerparen en beide paren geven niet exact dezelfde interpretatie, dan worden de resultaten als volgt samengevat: ++ en + +; + en +/- +; +/- en - -
koolzaad
gerst
soja
tarwe
tarwe/gerst
maïs
amplificeerbaarheid met PLANT1&2
DNA extract: opbrengst en integriteit
Tabel 2: Samenvatting analyse mengsels van voedermiddelen
mengsels van geselecteerde voedermiddelen mengsel A mengsel B mengsel C mengsel D
+ + ++ +
+ + + +
+ + + +
+ + + +
+ + + +
+ + +/-? +/-?
+/-? +/-? +? +?
+ + +
Legende Tabel 2: zie ook legende tabel 1 mengsel A: 25% maïsmeel (*) + 25 % Oekraïnse tarwe + 25 % DDGS (75-25 tarwe-maïs) + 25 % Indisch sojameel mengsel B: 12,5% maïsmeel (*) + 25 % Oekraïnse tarwe + 20 % Indisch sojameel + 25 % koolzaadschroot (geëxtraheerd) + 10 % palmpitschroot + 7,5 % zonnepitschroot mengsel C: 50 % Oekraïnse tarwe + 40 % koolzaadschroot (geëxtraheerd) + 5 % palmpitschroot + 5 % zonnepitschroot mengsel D: 15% maïsmeel (*) + 30 % Oekraïnse tarwe + 30 % koolzaadschroot (geëxtraheerd) + 25 % zonnepitschroot (de opgegeven percentages zijn gewichtspercentages)
Figuur 1: Agarosegel (1%) ter evaluatie van de kwantiteit en intactheid van geïsoleerd DNA
Legende Figuur 1: I – 100 bp DNA Ladder (Invitrogen); 1,19 – geen DNA; 2,20 – maïs; 3,21 – tarwe; 4,22 – soja; 5,23 – gerst; 6,24 – koolzaad, 7,8 – maïsmeel (*); 9,10 – vermalen tarwe; 11,12 – koolzaadschroot (geëxtraheerd); 13,14 – zonnepitschroot; 15,16 – palmpitschroot; 17,18 – Indisch sojameel; 25,26 – rijstevoermeel; 27,28 – triticale; 29,30 – haver; 31,32 – DDGS (75% tarwe25% maïs); 33,34 – mengsel A; 35,36 – mengsel B; 37,38 – mengsel C; 39,40 – mengsel D
Figuur 2: Agarosegel (1,5%) met PCR-stalen na amplificatie met primerpaar Plant 1/2
Legende Figuur 2: I – 100 bp DNA Ladder, 1,40 – controles: geen template DNA, 2,19 – maïs; 3,20 – tarwe; 4,21 – soja; 5,22 – gerst; 6,23 – koolzaad, 7,8 – maïsmeel (*); 9,10 – vermalen tarwe; 11,12 – koolzaadschroot (geëxtraheerd); 13,14 – zonnepitschroot; 15,16 – palmpitschroot; 17,18 – Indisch sojameel; 24,25 – rijstevoermeel; 26,27 – triticale; 28,29 – haver; 30,31 – DDGS (75% tarwe25% maïs); 32,33 – mengsel A; 34,35 – mengsel B; 36,37 – mengsel C; 38,39 – mengsel D
Figuur 3: Agarosegel (2,5%) met PCR-stalen na amplificatie met het maïsspecifieke primerpaar IVR1 F&R
Legende Figuur 3: I – 100 bp DNA Ladder, 1,40 – controles: geen template DNA, 2,19 – maïs; 3,20 – tarwe; 4,21 – soja; 5,22 – gerst; 6,23 – koolzaad, 7,8 – maïsmeel (*); 9,10 – vermalen tarwe; 11,12 – koolzaadschroot (geëxtraheerd); 13,14 – zonnepitschroot; 15,16 – palmpitschroot; 17,18 – Indisch sojameel; 24,25 – rijstevoermeel; 26,27 – triticale; 28,29 – haver; 30,31 – DDGS (75% tarwe25% maïs); 32,33 – mengsel A; 34,35 – mengsel B; 36,37 – mengsel C; 38,39 – mengsel D
Materiaal en methoden: De DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) werd gebruikt om het DNA vanuit de verschillende matrices op te zuiveren. Er werd 30 g van de verschillende matrices afgewogen en tot een fijn poeder vermalen door gebruik te maken van een keukenrobot (Braun MR 5550 M BC-HC). DNA extractie werd telkens in duplo uitgevoerd op 100 mg via het Qiagen protocol waaraan enkele wijzigingen werden aangebracht (600 µl AP1; 30 min incubatie bij 65°C, 195 µl AP2; lysaat centrifugeren gedurende 15 min). Elutie gebeurt in twee keer 50 µl buffer AE. Voor het beoordelen van kwantiteit en integriteit van het geëxtraheerde DNA werd van alle DNA extracten 7 µl geanalyseerd via agarosegel elektroforese gevolgd door kleuring met Ethidium bromide. Bij het uitvoeren van de PCR analyses in de iCyclerTM Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories) werd gebruik gemaakt van een universeel primerpaar PLANT 1 + PLANT 2, 2 (ucp-c en ucp-d in Taberlet et al., 1991); en een set van 11 geselecteerde primerparen met gekende specificiteit (zie legende tabel 1). Aan de reactiemengsels in onderstaande tabel (tabel 3) werd telkens 1 µl geëxtraheerd DNA toegevoegd voor het uitvoeren van de PCR. Tabel 3. samenstelling PCR reacties primerpaar PLANT 1&2 IVR1 F&R ZEIN 3&4 Puro AP20F&AR LPTBd 1F&2R WMS159 CYL&R LE 1&2 GMO 3&4 HOR 1&2 PEP 1&2 CRKUZ 1&2 Puro AP2s&AM1S
Water*** 20,15 20,10 19,625 19,30 19,40 20,175 19,625 20,10 20,20 20,10 20,10 19,30
PCR reacties: mix voor 1 staal (24µl) [µl] PCR Buffer* MgCl2* dNTP’s** (10x) (50mmol/l) (20mmol/l) 2,5 0,75 0,25 2,5 0,75 0,25 2,5 1,25 0,25 2,5 1,50 0,25 2,5 1,50 0,25 2,5 0,75 0,25 2,5 1,25 0,25 2,5 0,75 0,25 2,5 0,75 0,25 2,5 0,75 0,25 2,5 0,75 0,25 2,5 1,50 0,25
Primers (100µmol/l) 0,10 0,10 0,125 0,10 0,05 0,0625 0,125 0,125 0,075 0,125 0,125 0,10
Taq-polymerase* (5U/µl) 0,15 0,20 0,125 0,25 0,25 0,20 0,125 0,15 0,15 0,15 0,15 0,25
* Taq DNA Polymerase, Invitrogen Life Sciences; ** DNA Polymerisation Mix, GE Healthcare Life Sciences; *** Water, DNase, RNase, protease free, Acros organics.
Tabel 4. PCR programma per primerpaar Programma 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Initiële denaturatie Denaturatie Annealing Elongatie Cycli Finale elongatie Koelen LPTBd 1F&2R 95°C / 10 min 95°C / 30 sec 58°C / 40 sec 72°C / 45 sec 35 72°C / 5 min 14°C / ∞ PEP 1&2 95°C / 3 min 95°C / 20 sec 62°C / 30 sec 72°C / 30 sec 35 72°C / 3 min 14°C / ∞
PLANT 1&2 94°C / 4 min 94°C / 30 sec 55°C / 30 sec 72°C / 1 min 35 72°C / 3 min 14°C / ∞ WMS159 CYL&R 95°C / 4 min 96°C / 1 min 60°C / 1 min 72°C / 2 min 35 72°C / 10 min 14°C / ∞ CRKUZ 1&2 95°C / 4 min 95°C / 30 sec 62°C / 30 sec 72°C / 30 sec 35 72°C / 3 min 14°C / ∞
IVR1 F&R 95°C / 3 min 95°C / 30 sec 64°C / 30 sec 72°C / 30 sec 35 72°C / 6 min 14°C / ∞ LE 1&2 95°C / 5 min 95°C / 30 sec 60°C / 30 sec 72°C / 50 sec 40 72°C / 5 min 14°C / ∞ Puro AP2s&AM1S 95°C / 10 min 95°C / 30 sec 58°C / 40 sec 72°C / 45 sec 35 72°C / 5 min 14°C / ∞
ZEIN 3&4 95°C / 3 min 96°C / 1 min 60°C / 1 min 72°C / 1 min 40 72°C / 3 min 14°C / ∞ GMO 3&4 95°C / 3 min 95°C / 30 sec 62°C / 30 sec 72°C / 30 sec 35 72°C / 3 min 14°C / ∞
Puro AP20F&AR 95°C / 10 min 95°C / 30 sec 58°C / 40 sec 72°C / 45 sec 35 72°C / 5 min 14°C / ∞ HOR 1&2 95°C / 4 min 95°C / 20 sec 62°C / 1 min 72°C / 6 min 40 14°C / ∞
Het resultaat van de PCR analyse werd beoordeeld via agarosegel elektroforese en kleuring met Ethidium bromide.
Referenties: Alary R., Buissonade C., Joudrier P., Gautier M.F. (2007) Detection and discrimination of cereal and leguminous species in chestnut by duplex PCR. Eur Food Res Technol 225, 427-434. Hernandez, M., Duplan, M.L., Berthier, G., Vaïtilgom, M. , Hauser, W., Freyer, R., Pla, M., Bertheau, Y. (2004). Development and comparison of four real-time polymerase chain reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays L.. J. Agric. Food Chem. 52, 4632-4637. Hernandez M., Esteve T., Pla M. (2005) Real Time Polymerase Chain Reaction Based Assays for Quantitative Detection of Barley, Rice, Sunflower and Wheat. J. Agric. Food Chem. 53, 7003-7009. Hurst, C., Knight, A. Bruce, I. (1999) PCR detection of genetically modified soya and maize in foodstuffs. Molecular breedup 5, 579-586. Lüthy, J. (1999). Detection strategies for food authenticity and genetically modified foods. Food Control 10, 359-361. Meyer, R., Chardonnens, F., Hübner, P. and Lüthy, J. (1996). Polymerase chain reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food. Z. Lebensm. Unters Forsch. 203, 339-344. Röder MS, Korzun V, Wendehake K, Plaschke J, Tixier MH, Leroy P, Ganal MW. (1998). A microsatellite map of wheat. Genetics. 149, 2007-2003. Rönning, S. B., Rudi, K., Berdal, K. G. en Holst-Jensen, A. (2005). Differentiation of important and closely related cereal plant species (Poaceae) in food by hybridization to an oligonucleotide array. J. Agric. Food Chem. 53, 8874-8880. Smith, D. S. en Maxwell P.W. (2007). Use of quantitative PCR to evaluate several methods for extracting DNA from corn flour and cornstarch. Food Control 18, 236-242. Taberlet, P., L. Gielly, G. Patou, and J. Bouvet. (1991). Universal primers for amplification of three noncoding regions of chloroplast DNA. Pl. Mol. Biol. 17, 1105-1109. Taverniers I (2005) Development and implementation of strategies for GMO quantification in an evolving European context. PhD thesis, 346 pp, Ghent University. ISBN 90-5989-049-3 Terry CF., Harris N, Parkes HC (2002) Detection of genetically modified crops and their derivatives: Critical steps in sample preparation and extraction. J AOAC Int 85, 768-774.
