DNA BARCODE KERAGAMAN GENETIK, DAN KONSERVASI FAUNA INDONESIA Oleh M. Syamsul Arifin Zein Peneliti Madya Bidang Genetika Molekuler Laboratorium Genetika Bidang Zoologi Pusat Penelitian Biologi LIPI
All Birds DNA barcoding Initiative (ABBI) of Inaugural Workshop (USA, 2005)
Second International Barcode of Life Conference (Taiwan, 2007)
Zein MSA et al. 2007. Initiative DNA Barcoding Research in Indonesia. Second International Barcode of Life Conference, Taipei, Taiwan.
Sutrisno H. 2007. Molecular Phylogeny of Indo-Australian Glyphodes and its Allied Genera (Lepidoptera: Crambidae) Inferred from Mitochondrial COI and COII and Nuclear EF-Iα Gene Sequences. Second International Barcode of Life Conference.Taipei, Taiwan.
ILUSTRASI DNA BARCODE Dasar pemikiran, Tujuan, dan Hasil
Apa yang disebut DNA Barcode ??? Barcoding: adalah pendekatan standar untuk mengidentifikasi tumbuhan dan hewan dengan urutan minimal sekuen DNA, yang disebut barcode DNA. (Barcoding is a standardized approach to identifying plants and animals by minimal sequences of DNA, called DNA barcodes)
Barcode DNA: Sebuah urutan DNA pendek, dari sebuah wilayah yang seragam pada genom, yang digunakan untuk mengidentifikasi spesies. (A short DNA sequence, from a uniform locality on the genome, used for identifying species).
DASAR PEMIKIRAN STANDARISASI DNA BARCODE
Mempercepat pembangunan perpustakaan referensi urutan DNA yang konsisten dan komprehensif Mempercepat pengembangan teknologi yang ekonomis untuk identifikasi spesies
TUJUAN AGAR SIAPAPUN, DIMANAPUN, KAPANPUN DAPAT MENGIDENTIFIKASI DENGAN CEPAT DAN AKURAT SPESIES DARI SPESIMEN APAPUN KONDISINYA
DNA BARCODE FAUNA....????? DNA GENOME INTI
DNA MITOKONDRIA
DNA INTI: Exon dan intron
Exon adalah sekuens DNA yang ditranskripsi menjadi RNA dan ditranslasi menjadi polypeptida (coding region)
Intron adalah sekuens DNA yang tidak diubah menjadi RNA dan protein (Non coding region)
DNA MITOKONDRIA
Genom DNA mitokondria berbentuk sirkuler, berisi 13 gen penyandi protein, 22 gen transfer RNA (tRNA), 2 gen ribosoma (rRNA), dan daerah kontrol (control region/DLoop) dengan panjang sekitar 16.775 pasang basa (DESJARDIN dan MORAIS, 1990).
Mengapa barcode DNA Fauna dengan DNA mitokondria ????? Mitokondria: Merupakan organel yang memproduksi energi dalam sel tumbuhan dan hewan, Dua puluh tahun penelitian telah menetapkan utilitas urutan DNA mitokondria dalam membedakan antara spesies hewan yang berhubungan erat.
Perbedaan antara spesies lebih besar
Jumlah copy: Ada 100-10,000 lebih banyak salinan mitokondria dibandingkan DNA inti per sel, membuat pemulihan, terutama dari sampel kecil atau sebagian rusak, lebih mudahdan lebih murah Relatif sedikit perbedaan dalam spesies Dalam kebanyakan kasus, kecilnya perbedaan intraspesifik dan besarnya perbedaan interspesifik merupakan sinyal batas genetik yang berbeda antara sebagian besar spesies, memungkinkan identifikasi yang tepat dengan barcode DNA mitokondria Gen di DNA mitokondria Semua merupakan daerah coding ( tidak diselingi intron dan extron seperti pada gen inti), sehingga dapat amplifikasi langsung. Sedangkan pada gen inti sering terganggu dengan daerah non coding (intron) yang sering amplifikasi sulit dan tak terduga.
Results so far suggest that a mitochondrial gene will enable identification of most animal species.
Mengapa Standarisasi DNA Barcode Fauna menggunakan COI ? Menggunakan Gen Protein DNA Mitokondria:
Mendefinisikan wilayah standar dan membuat perbandingan antara urutan gen penyandi protein yang mudah, karena gen protein umumnya tidak memiliki insersi dan delesi seperti yang ada di dalam gen ribosom. Mitokondria Gen penyandi protein pada DNA mitokondria umumnya mengandung perbedaan lebih tinggi dari gen ribosom dan dengan demikian lebih mungkin untuk membedakan antara spesies yang berhubungan erat.
KESEPAKATAN INTERNASIONAL DNA BARCODE FAUNA Menggunakan Gen COI DNA Mitokondria: Gen Cytochrome c oxidase subunit I (COI) merupakan reprensentatif dari semua gen penyandi protein DNA mitokondria Segmen dekat terminus 5’ dari COI sepanjang sekitar 650 pasang basa merupakan daerah yang digunakan sebagai barcode DNA untuk fauna (Herbert et al. 2003)
COI terbukti memiliki variasi intraspesifik rendah, tetapi interspesifik divergensinya tinggi antara taksa yang berdekatan (closely allied taxa) (Ward et al. 2005; Hajbabaei et al. 2006a). Primer Universal Standard: (amplifikasi muda dan hasil sekuen baik).
An Internal ID System for All Animals The Mitochondrial Genome
DNA
D-Loop
Small ribosomal RNA
Cytochrome b ND1
ND6
Typical Animal Cell
COI
ND5
mtDNA
L-strand H-strand ND4 ND4L ND3
Mitochondrion
COII COIII
ATPase subunit 8 ATPase subunit 6
ND2
DNA BARCODE PADA MAMALIA
Universal Primer Mamalia: FORWARD: LepF1-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATATTG G3” VF1-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC ACA ARG AYA3” VF1d-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC ACA ARG AYA TYG G3” VFli-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC AAA GAA TGG3”
REVERSE: LepR1-tl: 5”cag gaa aca gct atg cta aac ttc tgg atg tcc aaa aaa tca3” VR1-tl: 5”cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt ggc cra ara ayc a3” VR1d-tl: 5”cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt ggc caa aga atc a3” VRli-tl: 5”cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt gcc aaa ac3” (Ivanova et al. 2006). Mix 1:1:1:3 Primer untuk sekuensing: (Messing 1983) M13F: 5”tgt aaa acg acg gcc agt3” M13R:5”cag gaa aca gct atg ac3”
Hasil amplifikasi primer universal
Capillary Sequence Read
Barcode menegaskan kesatuan dari spesies Homo sapiens Perbandingan menunjukkan bahwa kita berbeda satu sama lain dengan hanya 1 atau 2 nukleotida dari 648, sementara kita berbeda dari simpanse pada 60 lokasi dan gorila di 70 lokasi.
Teknik Molekuler untuk Identifikasi Spesies Ordo Cetartiodactyla Menggunakan DNA Barcode (Zein MSA&Fitriana YS,2012) ZooIndonesia:21(02):1-8.
112 spesimen, 4 famili, 10 marga and 15 spesies
Jarak genetik: intraspesies : interspesies : intragenera : intergenera : intrafamily : interfamili :
0-0,7% (0,13±0,05%) 2-28% 8,8-27,4 (1,36±0,037%) 8,8-27,4% 5,8-11,9% (7,8±2,85) 18,6-26,3%
Hasil rekonstruksi pohon filogeni Cetartiodactyla menunjukkan semua spesies membentuk sebuah cluster kohesif yang jelas berbeda.
BARCODING DNA PADA SURVEI KOMUNITAS KELELAWAR PEMAKAN SERANGGA DI INDONESIA (DNA Barcoding in Surveys Microbat Communities in Indonesia) (Zein and Fitriana)
Evaluasi pada 136 individu 6 Famili 45 spesies Sekuen divergensi intraspesifik gen CO1 0.000 0,260.
Hipposideros papua.MG 3540 66
Hipposideros papua.MG 3542
88
Hipposideros papua.MG 3539
100
Hipposideros papua.MG 3538
100
Hipposideros papua.MG 3537 Hipposideros muscinus.MG 2967
50
Hipposideros muscinus.MG 2968
100 59
Hipposideros sabanus.MG 2745 Hipposideros cervinus.MG 2844 Hipposideros ater.MG 1687
58
Hipposideros
Hipposideros ater.MG 1685
100
75 Hipposideros ater.MG 1686
82
Hipposideros diadema.MG 1237
97
Hipposideros diadema.MG 1556
100
Hipposideros diadema.MG 3545 Hipposideros diadema.MG 3650
100 44
Hipposideros larvatus.MG 2839
64
Hipposideros larvatus.MG 2840 100 Hipposideros larvatus.MG 2847
Hipposideros larvatus.MG 3299 Pipistrellus javanicus.MG 113 35
Pipistrellus
Asseliscus tricuspidatus.MG 3551
57
Asseliscus tricuspidatus.MG 3547
100
Asseliscus
Asseliscus tricuspidatus.MG 3529
96
Asseliscus tricuspidatus.MG 3530
100
Megaderma spasma.MG 2793
100
Megaderma spasma.MG 2794 Megaderma spasma.MG 106
100
Megaderma
Megaderma spasma.MG 2897
66
18
100 Megaderma spasma.MG 2902 100 Miniopterus pusillus.MG 3378 100
Miniopterus pusillus.MG 3379 Miniopterus
100
Miniopterus schreibersi.MG 3367 Miniopterus australis.MG 1710 62 Miniopterus australis.MG 3533 86
Miniopterus australis.MG 3534
100
Miniopterus australis.MG 3711
98
100
Miniopterus
Miniopterus australis.MG 3532 Miniopterus australis.MG 2845 92 Miniopterus schreibersi.MG 3536
13
100 98
Miniopterus schreibersi.MG 3699
Miniopterus
Miniopterus schreibersi.MG 3700
78
Pipistrellus javanicus.MG 152 Miniopterus schreibersi.MG 90
100
Miniopterus
Miniopterus schreibersi.MG 1018
84
99
Pipistrellus
100
Miniopterus schreibersi.MG 1709 Miniopterus magnater.MG 3247 Miniopterus
Miniopterus medius.MG 2843
100
Miniopterus medius.MG 2841
100 79
Miniopterus medius.MG 2842 Mosia nigrescens.MG 3681
Mosia
Scotophilus kuhlii.MG 761 51
Scotophilus kuhlii.MG 763 100
Scotophilus kuhlii.MG 765
Scotophilus
69 Scotophilus kuhlii.MG 796
Scotophilus kuhlii.MG 805 Mops sarasinorum.MG 1528 48
Mops sarasinorum.MG 1529
41
Mops sarasinorum.MG 1513
81
Mops
Mops sarasinorum.MG 1519
100
Mops sarasinorum.MG 1511 Hipposideros diadema.MG 543
100
Hipposideros
Chaerephon plicata.MG 2851 100
70
Chaerephon plicata.MG 2852 Chaerephon
48 Chaerephon plicata.MG 2850 70 Chaerephon plicata.MG 2853
Otomops formosus.MG 2539
Otomops
76 Emballonura alecto.MG 2895 92 100
Emballonura alecto.MG 2894 Emballonura alecto.MG 2482 Emballonura alecto.MG 2498
100
Emballonura
99 Emballonura alecto.MG 2521
Emballonura alecto.MG 2795
26
100 Emballonura alecto.MG 2801 15
Taphozous melanopogon.MG 2368 Phoniscus atrox.MG 3787 Phoniscus
2
100 Phoniscus atrox.MG 3788
Kerivoula hardwickei.MG 3759
Harpiocephalus
Kerivoula intermedia.MG 3798
47
Kerivoula hardwickei.MG 4127
44
Pipistrellus javanicus.MG 2469
96 6
Kerivoula
Kerivoula papillosa.MG 3797
51
Pipistrellus
Tylonycteris robustula.MG 1081
99
Tylonycteris
Pipistrellus javanicus.MG 3295
25
Pipistrellus 100
Pipistrellus javanicus.MG 3301
19
Nyctophilus sp.MG 2671
Nyctophilus
Tylonycteris robustula.MG 1653 Harpiocephalus harpia.MG 3767 27
Myotis muricola.MG 3290
48 100
Myotis muricola.MG 2462
58
70
Myotis muricola.MG 1712 Myotis muricola.MG 2439 Myotis muricola.MG 472
100
Myotis 93 Myotis muricola.MG 2747 100
Myotis muricola.MG 2748
51 78
Myotis muricola.MG 474 Myotis muricola.MG 464
73 Myotis muricola.MG 471
0.02
Tylonycteris
Harpiocephalus
Taphozous
Hasil Koreksi Identifikasi Lapangan dengan DNA Barcode No. Spesimen Identifikasi lapangan
Blast DNA barcode
Kofirmasi
MG 3786 Rhinolophus philippinensis Rhinolophus trifoliatus R. trifoliatus MG 3367 Miniopterus scheibersi Minioterus australis M. australis MG 3379 Miniopterus pussilus Miniopterus australis M. australis MG 3378 Miniopterus pussilus Miniopterus australis M. australis MG 472 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola MG 474 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola MG 464 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola MG 464 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola MG 2747 Myotis ater Myotis muricola M. muricola MG 2748 Myotis ater Myotis muricola M. muricola MG 2895 Emballonura monticola Emballonura alecto M. alecto MG 2894 Emballonura monticola Emballonura alecto M. alecto ___________________________________________________________________________
Barcoding DNA Kelelawar Pemakan Buah (Chiroptera: Pteropodidae) Berdasarkan Sekuen Gen COI DNA Mitokondria (Zein MSA & Fitriana YS)
Evaluasi pada: 120 spesimen, 17 genera, 43 species Hasil menunjukkan intraspesific divergensi sekuen gen CO1 0- 13.4%. Ada 3 spesies menunjukkan divergensi sekuen yang tinggi : Rousettus celebensis (13.4%), Chironax melanocephalus (7.9%), dan Thoopterus nigrescens (2.9%), Yang lain sekuen divergensinya rendah Spesies pada genus Dobsonia (Dobsonia viridis, Dobsonia moluccensis, Dobsonia crenulata); Cynopterus (Cynopterus minutus, Cynopterus brachyotis, Cynopterus titthaecheilus, Cynopterus sphinx), dan genera Rousettus (Rousettus celebensis Rousettus amplexicaudatus) menunjukkan closely allied taxa/kesalahan identifikasi spesies. Harus ada konfirmasi ulang diskripsi spesies yang telah dilakukan
DNA BARCODE PADA BURUNG
Interspesifik Lebih rendah dari 1% Anas puna and Anas versicolor. Distance: 0.43 - 0.72%
Anas cyanoptera 1 Anas cyanoptera 2 Anas platalea Anas puna 1 Anas puna 2 Anas versicolor 1 0.25%
Anas versicolor 2
Intraspesifik lebih besar dari 2%
Upucerthia dumetaria (up to 5%)
Troglodytes aedon (up to 4,5%)
Myophobus fasciatus (up to 4,35%)
M. tuberculifer
COI also discriminates between closely related cryptic species. E.g. Myarchus spp.
Criptic species
M. ferox
M. tyrannulus
M. tuberculifer 1 M. tuberculifer 2 M. tuberculifer 3 M. swainsoni 1 M. swainsoni 2
M. swainsoni
1%
M. tyrannulus 1 M. tyrannulus 2 M. tyrannulus 3 M. tyrannulus 4
Lessonia rufa
Urutan sekuen COI pada geografis terpisah, membenarkan perlakuan sebagai spesies yang berbeda. Misalnya Lessonia spp. Lessonia oreas 1%
L. oreas 1 L. oreas 2 L. oreas 3 L. oreas 4 L. oreas 5 L. oreas 6 L. rufa 1 L. rufa 2 L. rufa 3 L. rufa 4
Genus Cinclodes
C. fuscus
1%
C. fuscus 1 C. fuscus 2 C. fuscus 3 C. fuscus 4 C. fuscus 5 C. atacamensis 1 C. atacamensis 2 C. atacamensis 3 C. patagonicus 1 C. patagonicus 2
Genus Leptasthenura
L. fuliginiceps L. platensis L. aegithaloides
L. aegithaloides
1%
L. fuliginiceps 1 L. fuliginiceps 2 L. fuliginiceps 3 L. aegithaloides 1 L. aegithaloides 2
L. aegithaloides 3 L. aegithaloides 4 L. aegithaloides 5
Straneck 1993
Serpophaga munda
Serpophaga subcristata Serpophaga griseiceps 1%
Serpophaga subcristata
S. subcristata 1 S. subcristata 2 S. griseiceps 1 S. griseiceps 2
The Data Barcode Standard 1. Minimum 500 bp, <1% ambiguous base calls 2. Double stranded sequence 3. Trace files and associated quality scores 4. Primers used to generate sequence 5. Linkages to:
• • • • • •
A morphological voucher specimen Structured reference to collections Geospatial reference information Valid species name Who performed the identification Literature citations
How Barcoding is Done From specimen to sequence to species C NO DI 3I I Collecting Voucher Specimen
DNA extraction
CO1 gene
N N D 1D 2
DNA sequencing
Trace file Database of Barcode Records
Membangun perpustakaan referensi barcode :
Spesimen voucher diidentifikasi dengan baik Sampel Jaringan Ekstrak DNA Amplifikasi PCR Sekuensing DNA Data submission to GenBank
Pengawetan Jaringan Sampel: 1. Nitrogen cair (paling baik) 2. DMSO 3. Alkohol absolut (pure grade)
Ekstraksi DNA PCR Sekuensing
Mamalia Burung Insekta
Fauna Lainnya
Kekuatan
Penawaran alternatif alat identifikasi taksonomi untuk situasi di mana morfologi tidak meyakinkan. Fokus pada satu atau sejumlah kecil gen memberikan efisiensi yang lebih besar Biaya sekuensing DNA juga menurun karena kemajuan teknis. Potensi kapasitas yang tinggi dan dapat memproses sampel dalam jumlah besar. Setelah database referensi didirikan, dapat diterapkan oleh non-spesialis Beberapa aspek yang paling menarik mengandalkan teknologi masa depan, misalnya, sequencer genggam
What barcode users would do with the reference libraries
Inspection stations at every port and international airport for: Agricultural pest control Illegal trade in endangered species Violations of trade quotas Water quality surveys Food inspection Public health monitoring and diagnoses
Beberapa Hasil Penelitian Menggunakan DNA Barcode
Peta lokasi koleksi material DNA diberbagai tempat di Indonesia
Terima Kasih
