Detectie van pneumocystis in broncheoalveolaire lavage Rafke Schoffelen 15-12-2015 IC Radboudumc
Casus • Man, 78 jaar • Behandeld met rituximab en prednison • Verdenking pneumocystis pneumonie (PCP) • Start cotrimoxazol in therapeutische dosering • Broncheoalveolaire lavage (BAL) • Beloop: • Geringe afname ground-glass afwijkingen op HRCT • Sepsis, waarschijnlijk door Pseudomonas >> overleden
Casus Uitslag PCP in BAL: • ‘Directe detectie’ (na enkele uren): negatief • PCR (na 2 dagen): positief
Casus • Na uitslag directe detectie: Recept van cotrimoxazol onderbroken, direct daarna herstart Echter: te lage dosis • Na uitslag PCR (na 2 dagen): Correctie naar therapeutische dosis
Vraagstelling • Indien we de behandeling voor PCP baseren op de uitslag van de PCR, wat is dan de meerwaarde van de directe detectie-methode?
Vraagstelling • Indien we de behandeling voor PCP baseren op de uitslag van de PCR, wat is dan de meerwaarde van de directe detectie-methode? • Welke technieken worden gebruikt? • Wat is de klinische toepassing?
Pneumocystis jiroveci • Gist • Levenscyclus: trofozoïeten en cysten • Vrijwel alleen in longen aanwezig
Thomas CF, Limper AH. Currents insights into the biology and pathogenesis of Pneumocystis pneumonia. Nature Reviews Microbiology 2007; 5, 298-308.
Diagnostiek Materialen: • Kweek >> onmogelijk • Serologie >> (nog) onmogelijk • BAL • Mondspoeling / geïnduceerd sputum • Biopt long / transbronchiaal
Diagnostiek Materialen: • Kweek >> onmogelijk • Serologie >> (nog) onmogelijk • BAL • Mondspoeling / geïnduceerd sputum • Biopt long / transbronchiaal Technieken: • Microscopie (= directe detectie, ‘sneltest’) • Polymerase chain reaction (PCR)
Microscopie Verschillende methodes: • Kleuring nuclei: Giemsa • Kleuring wand van cysten: zilver • Immunofluorescentie mbv monoclonale antilichamen Wehle K, Blanke M. Koenig G, Pfitzer P. The cytological diagnosis of Pneumocystis carinii by fluorescence microscopy of Papanicolaou stained bronchoalveolar lavage specimens. Cytopathology. 1991;2(3):113-20.
Microscopie • Voordelen: Uitslag direct beschikbaar Hoge specificiteit • Nadeel: Lagere sensitiviteit dan PCR • Afhankelijk van hoeveelheid aanwezige cysten/trofozoieten • Nog lager bij HIV-negatieve patienten* en mogelijk ook na start van cotrimoxazol *Limper AH, Offord KP, Smith TF, Martin WJ. Pneumocystis carinii pneumonia: differences in lung parasite number and inflammation in patients with and without AIDS. Am Rev Respir Dis 1989;140:1204-9
PCR Technieken: • Conventinoneel • Nested • Kwantitatief • Verschillende methodes voor DNA-extractie • Verschillende DNA-fragmenten en primers
PCR • Voordelen: Hoge sensitiviteit (79-100%) en specificiteit (86-100%), • afhankelijk van techniek (nested, kwantitatief)* • Nadelen: Uitslag pas na 2 dagen beschikbaar Geen onderscheid tussen colonisatie en infectie
*Khot PD, Fredricks DN. PCR-based diagnosis of human fungal infections. Expert Rev Anti Infect Ther. 2009 Dec;7(10):1201-21. doi: 10.1586/eri.09.104.
PCR techniek
PCR resultaat Agarose gel of PCR of a patiënt suspected of PCP (BAL): •Lane S: 100-bp ladder, molecular base pair standard •Lane 1: Single step PCR: pimer pair pA2102-E/pA2102-H •Lane 2: Nested PCR: primer pairs 1724F/ITS2R + ITS1F/ITS2R1
http://www.cdc.gov/dpdx/pneumocystis/dx.html
Nested PCR
Kwantitatieve PCR = qPCR = real-time PCR
Klinische toepassing Gezien patientencategorie (immunogecomprimiteerd, IC-indicatie) en ernst van de ziekte, wordt bij verdenking (kliniek en beeldvorming) al met behandeling gestart voordat BAL is verricht en uitslag bekend is
Klinische toepassing • Negatieve uitslag microscopie: behandeling niet stoppen • Positieve uitslag microscopie = bevestiging, dus geen PCR nodig • Langere duur uitslag PCR: in de kliniek minder relevant • Positieve uitslag PCR: mogelijk overbehandeling, echter afwegen acceptabele bijwerkingen versus ernstig beloop onbehandelde ziekte
Vragen?
