Deprese, antidepresiva a membrány. RNDr. Zdeněk Fišar, CSc

Deprese, antidepresiva a membrány

Praha 2009

RNDr. Zdeněk Fišar, CSc.

Deprese, antidepresiva a membrány OBSAH PŘEDMLUVA ....................................................................................................................................................... 3 1.

ÚVOD DO PROBLEMATIKY.......................................................................................................... 4 1.1. SYNAPTICKÝ PŘENOS NERVOVÉHO SIGNÁLU .......................................................................................... 5 1.1.1. Neurony a chemické synapse........................................................................................................... 5 1.1.2. Složení, stavba a struktura membrán .............................................................................................. 6 1.1.3. Dynamika buněčných membrán ...................................................................................................... 9 1.1.4. Membránové receptory pro neurotransmitery .............................................................................. 10 1.1.5. Nitrobuněčné signální cesty .......................................................................................................... 12 1.1.6. Membránové přenašeče pro neurotransmitery.............................................................................. 16 1.1.7. Membránové lipidy a přenos signálu přes chemickou synapsi ..................................................... 17 1.2. HYPOTÉZY PORUCH NÁLADY (AFEKTIVNÍCH PORUCH)......................................................................... 21 1.2.1. Východiska hypotéz ....................................................................................................................... 21 1.2.2. Serotoninové hypotézy................................................................................................................... 22 1.2.3. Membránové (biofyzikální) hypotézy............................................................................................. 23 1.2.4. Postreceptorové hypotézy.............................................................................................................. 24 1.2.5. Biologické markery ....................................................................................................................... 25 1.3. ANTIDEPRESIVA A STABILIZÁTORY NÁLADY ........................................................................................ 27 1.4. MEMBRÁNOVÝ PŘENAŠEČ PRO SEROTONIN PŘI DEPRESI A JEJÍ LÉČBĚ .................................................. 31 1.5. INTERAKCE ANTIDEPRESIV S LIPIDOVÝMI MEMBRÁNAMI ..................................................................... 34 1.5.1. Modelové membrány (liposomy) ................................................................................................... 34 1.5.2. Interakce antidepresivum-lipidová membrána.............................................................................. 35 1.5.3. Lokalizace antidepresiv v membráně ............................................................................................ 37

2.

SHRNUTÍ K SOUBORU PUBLIKOVANÝCH PRACÍ ............................................................... 39 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6. 2.7.

VAZBA IMIPRAMINU K FOSFOLIPIDOVÝM DVOJVRSTVÁM MĚŘENÁ METODOU VAZBY RADIOLIGANDU. 39 INTERAKCE TRICYKLICKÝCH ANTIDEPRESIV S FOSFOLIPIDOVÝMI DVOJVRSTVAMI .............................. 42 ROZDĚLENÍ ANTIDEPRESIV MEZI PLASMU A ČERVENÉ KREVNÍ BUŇKY ................................................. 45 VLIV ANTIDEPRESIV S RŮZNÝMI FARMAKOLOGICKÝMI ÚČINKY NA UPTAKE SEROTONINU DO KREVNÍCH DESTIČEK ............................................................................................................................................. 47 VLIV DLOUHODOBÉHO PODÁVÁNÍ ANTIDEPRESIV NA LIPIDOVÉ SLOŽENÍ MOZKOVÝCH MEMBRÁN....... 49 UPTAKE SEROTONINU DO KREVNÍCH DESTIČEK U DOSUD NELÉČENÝCH DEPRESIVNÍCH PACIENTŮ PŘED A PO LÉČBĚ CITALOPRAMEM ................................................................................................................... 51 CELKOVÁ DISKUSE............................................................................................................................... 54

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK................................................................................................................ 59 LITERATURA.................................................................................................................................................... 61

Citace: Fišar Zdeněk: Deprese, antidepresiva a membrány. Multimediální podpora výuky klinických a zdravotnických oborů :: Portál 1. lékařské fakulty Karlovy Univerzity v Praze [online] Dostupný z WWW: . ISSN 1803-6619

2

Předmluva Není dosud jasné, co je primární příčinou vzniku většiny duševních poruch a jaké jsou molekulární mechanismy vedoucí k terapeutickým účinkům používaných psychofarmak. Pokrok v této oblasti je spojen s hlubším poznáním normálních funkcí mozku. Při formulaci a ověřování hypotéz o molekulárních mechanismech provázejících vznik nebo léčbu poruch nálady vycházíme hlavně z pozorování mechanismů účinků látek s antidepresivními účinky. Místem primárního účinku většiny antidepresiv je plazmatická membrána. Vzhledem k amfifilním vlastnostem těchto léčiv dochází nejen k vazbě na specifická vazebná místa membránových proteinů, ale i k významným interakcím s lipidovou částí buněčných membrán, průniku antidepresiv do buňky a interakcím s nitrobuněčnými elementy. Protože terapeutické účinky antidepresiv se projevují až po delší době jejich podávání, je nutné poznat i jimi vyvolané adaptivní buněčné změny vedoucí ke změnám funkce neurotransmiterových systémů v mozku. V současné době jsou primární biochemické účinky antidepresiv známy mnohem lépe, než jejich účinky dlouhodobé, což je to dáno složitostí buněčných systémů zahrnutých do mechanismů dlouhodobých účinků různých antidepresiv. Pokroky v pochopení těchto mechanismů umožňuje mezioborový výzkum využívající především biochemické, genetické, molekulárně biologické, biofyzikální a farmakologické modely a metody. Předložená publikace vznikla na základě mé habilitační práce „Deprese, antidepresiva a buněčné a modelové membrány“, kterou jsem obhájil na 1. lékařské fakultě Univerzity Karlovy v Praze v květnu 2006. V první části jsou shrnuty literární poznatky o depresi a její léčbě se zaměřením na interakce antidepresivech s membránami. V druhé části jsou shrnuty výsledky studia mechanismů účinků antidepresiv a jejich interakcí s modelovými i buněčnými membránami, které jsem publikoval v letech 2004-2006 v 6 rozsáhlejších vědeckých článcích. Praha, říjen 2009

Zdeněk Fišar

3

Zdeněk Fišar

1. ÚVOD DO PROBLEMATIKY Poznatky o molekulární podstatě poruch nálady (afektivních poruch) jsou získávány hlavně na základě studia mechanismů účinků antidepresiv, stabilizátorů nálady a jiných látek ovlivňujících náladu. Předpokládá se, že poruchy nálady jsou způsobeny narušením neurotransmise v mozku, především poruchami v přenosu signálu přes chemické synapse, a antidepresiva uskutečňují své terapeutické účinky specifickým ovlivněním funkce membránových a nitrobuněčných složek zapojených do tohoto přenosu. Synaptický přenos nervového signálu umožňují specifické membránové proteiny (receptory, iontové kanály, přenašeče, enzymy) a přímé i adaptivní účinky antidepresiv na jejich funkce jsou studovány jak in vitro na izolovaných membránách a buňkách, tak in vivo na zvířecích modelech nebo ex vivo na lidských krevních buňkách. Významnou úlohu mají v přenosu signálu i membránové lipidy a steroly, o nichž je známo, že netvoří pouze strukturní základ buněčných membrán, ale jsou substráty pro některé druhé posly, neurotransmitery a volné mastné kyseliny a ovlivňují aktivitu řady proteinů přes změnu jejich pohyblivosti v membráně nebo přes specifické interakce lipid-protein. Vzhledem k chemickým vlastnostem antidepresiv dochází nejen k jejich vazbě na specifická proteinová vazebná místa, ale i k jejich akumulaci v lipidové části buněčných membrán. Dosud nejsou známy všechny důsledky těchto interakcí pro účinnost nebo pro vedlejší účinky farmakoterapie. Interakce antidepresivum-membránové molekuly jsou proto studovány na modelových fosfolipidových dvojvrstvách, na rekonstituovaných systémech (proteoliposomech), na izolovaných membránách i na celých buňkách. Nepřímo lze interakce léčivo-buněčná membrána charakterizovat pomocí sekundárních reakcí, nebo přes ovlivnění procesů vyvolaných jinými biologicky aktivními látkami. Metody používané pro toto studium využívají často látky značené radionuklidy, jadernou magnetickou rezonanci, diferenciální skanovací kalorimetrii, elektronovou paramagnetickou rezonanci, neutronovou difrakci a v neposlední řadě fluorescenční spektroskopii. V našich experimentech jsme používali hlavně tritiem značená antidepresiva, neurotransmitery nebo fosfolipidy a fluorescenční sondy. Tento přístup nám umožnil studovat interakce membránaléčivo s minimálními vedlejšími efekty informačních molekul (sond, značek) na vlastnosti membrán. Tato práce je příspěvkem k poznání úlohy membránových lipidů a funkce membránového přenašeče pro serotonin při depresivní poruše a její léčbě. Vycházel jsem ze skutečnosti, že značná část makromolekul podílejících se na přenosu signálu je vázána v buněčných membránách a vyžaduje pro svou správnou funkci interakce s určitými membránovými lipidy. V úvodní části jsou stručně shrnuty hlavní poznatky o synaptickém přenosu nervového signálu a o synaptických membránách. Následují základní informace o biochemických hypotézách afektivních poruch a o mechanismech působení antidepresiv. Podrobněji jsou uvedeny dosud známé poznatky o úloze membránového přenašeče pro serotonin při depresi a její léčbě a možnosti studia interakcí antidepresiv s membránovými lipidy. Více infomací lze nalézt např. v monografii (Fišar a kol. 2009). Ve druhé části následuje stručné shrnutí k pracím, které jsem v poslední době publikoval na téma interakcí antidepresiv s modelovými i buněčnými membránami. Komentáře a shrnutí k jednotlivým publikacím jsou řazeny dle složitosti zkoumaných objektů, od modelových membrán ke krevním buňkám, laboratorním zvířatům a lidským subjektům; zakončeny jsou celkovou diskusí.

4

Deprese, antidepresiva a membrány

1.1. Synaptický přenos nervového signálu 1.1.1. Neurony a chemické synapse Neurony obsahují podobné buněčné složky jako jiné buňky, tj. plazmatickou membránu, jádro, jadérko, jadernou membránu, neuroplazmu a organely. Důležitou složku neuronů tvoří cytoskelet - heterogenní síť vláknitých struktur, kterou tvoří navzájem interagující a propojené sítě z mikrotubulů, neurofilament a mikrofilament. Jedná se o vysoce dynamický systém napojený na další buněčné struktury, především na membránu. Vzhledem k velké spotřebě energie nutné pro udržování transmembránových iontových gradientů jsou neurony zvláště bohaté na mitochondrie. Polyribosomy lokalizované na drsném endoplazmatickém retikulu poblíž jádra tvoří Nisslovu substanci, která produkuje specifické neuronové proteiny. Kromě běžných buněčných složek mají neurony morfologicky a funkčně odlišné oblasti, které se specializují na přenos signálu: axon, dendrity a synapse. Struktura a funkce neuronů je známa z buněčné biologie (Levitan and Kaczmarek 2002). Synapse jsou specializované oblasti buněčného kontaktu umožňující přenos informace z jednoho neuronu na druhý nebo mezi neurony a receptorovými nebo efektorovými buňkami. Jsou tvořeny presynaptickou částí (obsahující mimo jiné synaptické váčky s neurotransmitery) spolu s přilehlou postsynaptickou (obvykle dendritickou) membránou. Presynaptická a postsynaptická část jsou odděleny synaptickou štěrbinou (20-30 nm). V průměru vytváří každý neuron asi 1000 synaptických zakončení, ale počet synapsí na jednom postsynaptickém neuronu může dosahovat i několika desítek tisíc; pokrývají potom značnou část membrán dendritů i buněčného těla. Může docházet jak k velké konvergenci signálů na jeden neuron od stovek až tisíců presynaptických buněk, tak k divergenci signálu z jednoho presynaptického neuronu na desítky nebo stovky postsynaptických buněk. Účinky přenosu signálu na postsynaptickou část mohou být excitační nebo inhibiční; teprve jejich součet v daném čase určuje, zda vznikne akční potenciál nebo nitrobuněčná odezva. Neuroaktivní látky (mediátory, transmitery, působky) podílející se na přenosu nervového signálu lze dělit na neurotransmitery, neuromodulátory a neurohormony. Neurotransmitery jsou látky uvolňované z neuronu do synaptické štěrbiny a ovlivňující aktivitu (excitovatelnost) pouze jedné nebo několika prostorově blízkých buněk. Zajišťují tak mezibuněčný přenos nervového signálu. Z chemického hlediska se jedná především o monoaminy, aminokyseliny a peptidy. Neurohormony jsou hormony syntetizované a uvolňované nervovým systémem a poté přenášené krví ke vzdáleným cílovým buňkám, jejichž aktivitu ovlivňují. Klasickými neurohormony jsou oxytocin a vasopressin. Rozdělení na neurotransmitery a neurohormony lze považovat za zastaralé, neboť je známo, že řada neuropeptidů působí nejen dálkově jako neurohormony, ale i lokálně jako neurotransmitery. Podobně některé klasické neurotransmitery se mohou uvolňovat do krevního oběhu a působit jako hormony. Zvláštní skupinu látek podílejících se na mezibuněčném přenosu signálu tvoří růstové faktory, které stimulují proliferaci buněk a podporují jejich přežívání. Neurotransmisí se rozumí aktivní, časově omezený a nevratný proces, jehož výsledkem je přenos nervového signálu mezi neurony. Po příchodu depolarizační vlny na presynaptické zakončení je elektrický signál převeden (transdukován) na chemický (uvolnění neurotransmiteru), a ten může být v postsynaptické části převeden buď zpět na elektrický signál, nebo na nitrobuněčnou změnu. Sekrece neurotransmiteru z presynaptické části následuje po vstupu kalcia přes napěťově řízené Ca2+-kanály (Obr. 1). Množství uvolněného mediátoru přitom závisí na koncentraci nitrobuněčného kalcia. Všechny procesy související s přenosem signálu přes chemickou synapsi nejsou dosud známy.

5

Zdeněk Fišar

Obr. 1 Převod signálu přes chemickou synapsi (Fišar a kol. 2009)

1.1.2. Složení, stavba a struktura membrán Mnoho základních buněčných procesů, včetně zpracování informací, nitrobuněčného a mezibuněčného přenosu signálu, se odehrává v plazmatických membránách nebo jiných membránových strukturách. V této kapitole jsou uvedeny pouze základní informace o složení, stavbě a vlastnostech membrán s ohledem na jejich funkci při šíření nervového signálu a na úlohu lipidové dvojvrstvy. Buněčné membrány jsou tvořeny především lipidy, steroly, proteiny, glykolipidy a glykoproteiny. Mají jednotný organizační princip, tj. uspořádání většiny membránových lipidů do dvojné vrstvy (o tloušťce kolem 6 nm) s více či méně zanořenými proteiny (Obr. 2). Značná část buněčných proteinů se vyskytuje pouze v membránách, kde zajišťují řadu specifických procesů spojených s transportními a rozpoznávacími funkcemi membrán (pumpy, nosiče, iontové kanály, receptory, enzymy apod.). Umožňují udržování iontových a metabolických gradientů nezbytných pro většinu buněčných funkcí včetně přenosu nervového signálu.

Obr. 2 Model buněčné membrány (Fišar a kol. 2009)

6

Deprese, antidepresiva a membrány

Lipidová část membrán je směsí fosfolipidů, glykolipidů, sfingomyelinu, kardiolipinu a cholesterolu (Obr. 3), přičemž zastoupení těchto složek je v různých membránách velmi odlišné. Hlavními lipidovými složkami buněčných membrán jsou glycerofosfolipidy, jejichž základem je sn-glycerol-3-fosfát esterifikovaný na uhlících C(1) (sn-1) a C(2) (sn-2) mastnými kyselinami a na fosforylové skupině další skupinou. Nejběžněji se vyskytující glycerofosfolipidy jsou fosfatidylcholin (lecitin), fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylinozitol, fosfatidylglycerol, difosfatidylglycerol (kardiolipin) a kyselina fosfatidová. Podstatnou složkou některých biomembrán jsou sfingolipidy odvozené ze sfingosinu, resp. z jeho N-acyl-derivátů, ceramidů. Nejčastější sfingolipidy jsou sfingomyeliny (sfingofosfolipidy), cerebrosidy (jednoduché sfingoglykolipidy, které nemají fosfátovou skupinu a obvykle ani náboj; v mozkových buňkách se hojně vyskytují galaktocerebrosidy) a gangliosidy (sfingoglykolipidy, které obsahují alespoň jeden zbytek kyseliny sialové; tvoří asi 6% mozkových lipidů a jsou lokalizovány v povrchové vrstvě membrány, kde mají receptorovou funkci). Významnou složkou živočišných membrán je cholesterol, který se vyskytuje hlavně v plazmatických membránách, méně v membránách organel. Cholesterol je hlavní membránový aktivní sterol, který může významně ovlivňovat buněčný růst a aktivitu membránových proteinů (receptorů, přenašečů, iontových kanálů apod.) jak přímými interakcemi, tak i nepřímo, přes změny struktury a fyzikálních vlastností lipidových dvojných vrstev. V mozku je neesterifikovaný cholesterol přítomen ve vysokých koncentracích v plazmatických membránách neuronů a glií. Protože cholesterol neprostupuje hematoencefalickou bariérou, je syntetizován v mozku. Jeho obrat má důležitou úlohu při opravě a přetváření neuronů.

Obr. 3 Membránové lipidy a cholesterol (Fišar a kol. 2009)

7

Zdeněk Fišar Dle známého a stále upřesňovaného modelu tekuté mozaiky (Singer and Nicolson 1972) mají buněčné membrány tyto základní vlastnosti: • strukturní základ membrány je tvořen lipidovou dvojvrstvou, v níž jsou zakotveny integrální a periferní proteiny; • existuje heterogenita lipidového složení v rovině horizontální i vertikální; cholesterol je lokalizován mezi řetězci mastných kyselin; • za fyziologických podmínek je lipidová dvojvrstva v „tekutém“ stavu; • translační a rotační pohyblivost membránových molekul umožňuje specifické procesy v membráně, např. transmembránový přenos signálu. Tento model byl doplněn o existenci nedvojvrstevných struktur v membránách a o výskyt mikrodomén („raftů“) s odlišným zastoupením cholesterolu a určitých fosfolipidů (Mouritsen et al. 1995, Barenholz 2002). Integrální proteiny jsou v lipidové dvojvrstvě „rozpuštěny“ prostřednictvím hydrofobních a elektrostatických interakcí a vodíkových vazeb. Specifické interakce lipid-protein jsou umožněny nejen vazebnými vlastnostmi proteinů, ale i polárními hlavičkami lipidů, zbytky nenasycených mastných kyselin v molekulách lipidů a asymetrií lipidové dvojvrstvy (na vnější straně jsou lokalizovány především fosfatidylcholin, sfingomyelin, galaktocelebrosid; na vnitřní straně hlavně fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylinozitol). Membránové lipidy netvoří jen strukturní základ membrány, ale jsou také substráty fosfolipáz, modulátory funkce řady membránových proteinů a podílejí se na biosyntéze jiných biologicky aktivních molekul, např. druhých poslů, volných mastných kyselin nebo endogenních kanabinoidů. Transportní mechanismy zahrnující receptory, iontové kanály, enzymy, přenašeče a pumpy jsou často regulovány membránovými lipidy a cholesterolem, samotnými i uspořádanými do lipidové dvojvrstvy (Shinitzky 1984, Srivastava et al. 1987, Scanlon et al. 2001, Cornelius 2001, Lee 2003). Celkově lze říci, že úloha membránových lipidů a mastných kyselin v buněčných funkcích není zdaleka poznána. Rovněž existence a úloha hustotních fluktuací nebo oblastí s nenáhodným lipidovým složením (mikrodomén) je teprve studována (Barenholz 2002, Fielding and Fielding 2003). Polární hlavičky membránových lipidů jsou obvykle tvořeny záporně nabitou fosfátovou skupinou s navázanými kladnými, zápornými, zwiterionickými nebo nenabitými skupinami (Obr. 3). Specifické ovlivnění funkcí membránových proteinů těmito polárními hlavičkami lze vysvětlit na základě elektrostatických interakcí, jejichž specificita je dána prostorovým rozložením náboje jak na povrchu proteinu, tak v polárních hlavičkách interagujících lipidů. Obtížnější je vysvětlení vysoké variability v délce a nasycenosti acylových řetězců, protože pro udržení struktury, uspořádanosti a určité fluidity lipidové dvojvrstvy není tato různorodost nezbytná. Pravděpodobným vysvětlením je možnost přizpůsobení se tvaru acylových řetězců hydrofobnímu povrchu membránových proteinů („hydrophobic matching“), což umožňuje specificky ovlivňovat vlastnosti proteinů (Dumas et al. 1999). Proteiny vázající fosfolipidy jsou důležitou složkou přenosu buněčných signálů, přenosu molekul a metabolismu (Hurley et al. 2000). Saturované a mononenasycené mastné kyseliny mohou být syntetizovány v těle de novo, avšak esenciální polynenasycené mastné kyseliny jsou syntetizovány z potravních prekursorů, linolové kyseliny (18:2) pro n-6 skupinu a α-linolenové kyseliny (18:3) pro n-3 skupinu mastných kyselin. V neuronech se vyskytují především arachidonová kyselina (20:4, n-6) a dokosahexaenová kyselina (22:6, n-3) vázané v pozici sn-2 glycerolového základu fosfolipidů. Arachidonát je uvolňován 1. hydrolýzou fosfolipázou A2, 2. kombinovaným působením fosfolipázy C, diacylglycerolkinázy a fosfolipázy A2, 3. hydrolýzou diacylglycerollipázou. Většina arachidonátu je inkorporována ve fosfatidylcholinu, fosfatidylinozitolu a fosfatidyletanolaminu. V mozku tvoří arachidonát až 10% z celkových mastných kyselin. Od kyseliny arachidonové jsou odvozeny také endogenní kanabinoidy, jako 8

Deprese, antidepresiva a membrány anandamid (N-arachidonoyletanolamid) a 2-AG (sn-2-arachidonoylglycerol), které jsou uvolňovány z membránových fosfolipidů v odezvě na synaptickou depolarizaci nebo aktivaci receptorů (Fišar 2009). Úloha cholesterolu, fosfolipidů a esenciálních nenasycených mastných kyselin je již dlouho diskutována v některých biochemických hypotézách afektivních poruch, které vycházejí z předpokladu, že pro správný vývoj a funkci mozkových struktur je nezbytný normální neuronální lipidový metabolismus (viz kap. 1.2). Mechanismy působení n-3 a n-6 nenasycených mastných kyselin při normální nebo patologické funkci neuronální aktivity nejsou dostatečně známy, ale je zřejmé, že dokosahexaenová kyselina je hlavní n-3 mastná kyselina v mozku a že eikosapentaenová kyselina má významnou úlohu jako protizánětlivý prekursor (Peet and Stokes 2005, Young and Conquer 2005). Kyselina arachidonová je u lidí prekursorem prostaglandinů, prostacyklinů, tromboxanů a leukotrienů (Jiang et al. 1998). Obecně mohou být nenasycené mastné kyseliny spojeny s mnoha aspekty funkce neuronů, včetně neurotransmise, fluidity membrán, regulace receptorů, přenašečů a iontových kanálů a genové exprese. 1.1.3. Dynamika buněčných membrán Malé membránové molekuly jsou za fyziologických podmínek vysoce pohyblivé v rovině lipidové dvojné vrstvy (podélná, laterální difúze). Se snížením teploty dochází k uspořádávání membránových molekul a ke snížení jejich laterální i rotační pohyblivosti. Přechod lipidové dvojné vrstvy z fluidního do zatuhlého stavu je přirovnáván k přechodu ze stavu tekutého krystalu do stavu tuhého gelu (Obr. 4). Teplota, při níž dochází k přechodu membrány, nebo její části, ze stavu gelového do stavu fluidního se nazývá teplota fázového přechodu. Na tekutost, resp. fluiditu lipidové dvojné vrstvy má kromě teploty vliv také přítomnost cholesterolu (snižuje tekutost membrán), stupeň nenasycenosti zbytků mastných kyselin, přítomnost glykolipidů a dále řada fyzikálních a chemických činitelů. Příčná difúze (flip-flop, překlápění), tj. přesmyk lipidové molekuly z vnější části dvojné vrstvy do vnitřní nebo naopak, je velmi pomalá (poločas několik dnů); v buňkách může být toto překlápění katalyzováno flipázami. Rovněž nepolární zbytky mastných kyselin v lipidech jsou za fyziologických podmínek vysoce pohyblivé. Celkový tvar molekul membránových lipidů, je určen hlavně konformací jejich uhlovodíkových řetězců. Změny prostorového uspořádání jsou přitom umožněny relativně volnými rotacemi kolem jednoduchých vazeb C−C. Dvojné vazby nenasycených mastných kyselin mají cis (Z) konfiguraci, což způsobuje rigidní ohyb o 30° v uhlovodíkovém řetězci. Větší zastoupení dvojných vazeb potom vede k velmi složitým tvarům molekul. Vyšší obsah zbytků nenasycených mastných kyselin nebo nižší obsah cholesterolu zvyšují pohyblivost molekul v membráně.

Obr. 4 Fázový přechod lipidové dvojné vrstvy (Fišar a kol. 2009)

9

Zdeněk Fišar

K pozorovatelným změnám v distribuci molekul v rovině membrány dochází během milisekund, k rotační reorientaci malých molekul nebo částí makromolekul dochází během nanosekund. Heterogenita membrán způsobuje, že laterální pohyblivost molekul v rovině membrány je menší, než by odpovídalo jejich rotační pohyblivosti. Experimentálně je však často sledován jen jeden typ difúzního pohybu molekul v membráně. Nejčastěji se pro tato měření používají spektroskopické metody (elektronová spinová rezonance, jaderná magnetická rezonance, fluorescence, Ramanův rozptyl). Tyto metody jsou založeny na měření určitého signálu (rezonanční absorpce energie vysokofrekvenčního magnetického pole, fluorescenční nebo rozptýlené záření apod.) molekul, skupin či atomů lokalizovaných v membráně. Tyto zpravodajské skupiny jsou buď membráně vlastní, nebo jsou do ní vneseny (spinové sondy, radionuklidem značené molekuly, fluorescenční sondy a značky, rezonanční značky pro Ramanův rozptyl atd.); jedná se o molekuly citlivé na vlastnosti mikrookolí, které samy výrazně neovlivňují sledovaný systém, ale umožňují detekovat změny jeho vlastností. V prvním přiblížení se lze dívat na vnitřek lipidové dvojvrstvy biologické membrány jako na homogenní neasociovanou izotropní nestlačitelnou kapalinu, jejíž vlastnosti jsou charakterizovány jedinou konstantou. V analogii s mechanikou kontinua je tato konstanta označována jako viskozita nebo fluidita, resp. tekutost. V případě lipidových dvojvrstev bylo zavedeno označení mikroviskozita. Protože viskozitu vnitřního prostředí dvojvrstvy nelze měřit přímo, je experimentálně určován parametr, který je s ní v přímé souvislosti. Je jím obvykle difúzní konstanta, korelační čas nebo relaxační čas. Ve druhém přiblížení bereme biologické membrány jako částečně anizotropní – tj. pohyb v membráně je omezený a rozlišujeme pohyb v rovině lipidové dvojvrstvy a kolmo k ní. Stanovení změn fluidity membrán na základě měření anizotropie ustálené fluorescence vhodné sondy je pro svou jednoduchost velmi rozšířeno. Vzhledem k anizotropii buněčných membrán, ztrácí ale pojem fluidity či mikroviskozity membrán původní fyzikální význam a v těchto měřeních se jedná pouze o kvalitativní postižení změn uspořádání mikrookolí sondy a její pohyblivosti v membráně. Pomocí časově rozlišené fluorescence bylo potvrzeno, že anizotropie fluorescence určená stacionární metodou v sobě obsahuje jak informaci o pohyblivosti membránových molekul, tak informaci o jejich průměrném uspořádání. Podrobnější informace o možnostech fluorescenční spektroskopie při studiu dynamiky buněčných membrán publikoval autor na internetu (FIŠAR, Zdeněk. Fluorescenční spektroskopie v neurovědách [online]. c2003. Dostupný z WWW: ). 1.1.4. Membránové receptory pro neurotransmitery Receptor je makromolekula specializovaná na přenos informace. Lze jej definovat jako specifické vazebné místo s funkčními vztahy. Funkčními vztahy se při synaptickém přenosu nervového signálu rozumí procesy vyvolané vazbou neurotransmiteru nebo jeho agonisty, které vedou ke změně propustnosti synaptické membrány pro určité ionty nebo k jiným specifickým změnám vlastností cílových buněk, jako je regulace obecného metabolického stavu, syntézy, ukládání a uvolňování neurotransmiterů, senzibility receptorů, organizace a struktury cytoskeletu, genové exprese apod. Receptory jsou dynamické systémy, které se mohou přizpůsobovat vnějším podmínkám a vyrovnávat tak např. změny v dostupnosti neurotransmiterů; může být regulován jak počet receptorů, tak jejich vlastnosti. Neurotransmiterové receptory buď obsahují interní iontový kanál, nebo se jedná o receptorový komplex zahrnující kromě proteinu se specifickým vazebným místem i transdukční prvek (obvykle G protein) a efektorový systém (iontový kanál, adenylátcykláza, fosfolipáza C), který zajišťuje buněčnou odezvu.

10

Deprese, antidepresiva a membrány

Obr. 5 Struktura receptorů spojených s G proteiny (Fišar a kol. 2009)

Pro určitý neurotransmiter existuje obvykle více podtypů receptorů, které mohou nebo nemusí mít stejný nebo podobný transdukční prvek a efektorový systém. Na synapsích se mohou vyskytovat postsynaptické i presynaptické receptory, což umožňuje zpětnovazebné a křížové ovlivňování přenosu signálu. Více informací o vlastnostech, klasifikaci a funkci receptorů umožňujících synaptický přenos signálu lze nalézt např. v monografii Fišar a kol. (2009). Interakce neurotransmiteru se specifickým receptorem nastává na jednom nebo více aktivních (specifických) rozpoznávacích místech a vede k aktivaci receptorového systému. Různá léčiva soutěží s neurotransmiterem o obsazení těchto rozpoznávacích míst (kompetitivní látky). Působení některých psychofarmak může být úplně nebo částečně identické jako u fyziologického ligandu; hovoříme o úplných nebo částečných (parciálních) agonistech. Podobně u inhibitorů mluvíme o úplných nebo parciálních antagonistech. Inverzní agonisté vedou k opačnému efektu než plní agonisté. Nehledě ke kompetici, vytvářejí některé látky ireverzibilní vazby se skupinami v rozpoznávacích místech - jsou označovány jako blokátory. Látky, které se vážou k vazebným místům na receptorovém komplexu, tak že nedochází ke kompetici s neurotransmiterem, jsou označovány jako nekompetitivní. Konformační změny vyvolané vazbou nekompetitivních látek však mohou ovlivnit jak vazbu neurotransmiteru k receptoru, tak přenos signálu o jeho vazbě. Biochemické hypotézy afektivních poruch (Fišar 1998) se nejčastěji zabývají narušením přenosu signálů v mozku vyvolaném aktivací receptorů a napojeném na G proteiny a systémy druhých poslů (cyklické nukleotidy, metabolity fosfatidylinozitolu a kyseliny arachidonové, kalcium, oxid dusnatý). Dvě základní přenosové cesty nejčastěji uvažované v patofyziologii afektivních poruch a jejich léčbě jsou adenylátcyklázová a fosfoinozitidová (Fišar and Hroudová 2009). Adenylátcyklázový systém je aktivován nebo inhibován těmito typy a podtypy receptorů (Fišar a kol. 2009): adrenergními α2 a β, serotoninovými 5-HT1,4,6,7, dopaminovými D1 až D5, GABAB, metabotropními glutamátovými mglu2,3,4,6,7,8, histaminovými H2,3, muskarinovými acetylcholinovými M2,4, opioidními a dalšími peptidovými. Receptorem aktivovaná hydrolýza fosfoinozitidů se uskutečňuje přes receptory serotoninové 5-HT2, adrenergní α1, dopaminové D2, metabotropní glutámátové mglu1,5, histaminové H1, muskarinové acetylcholinové M1,3,5 a řadu peptidových. Část přenosové cesty, která se uskutečňuje v plazmatické membráně, může být přímo ovlivněna membránovými lipidy. V receptorových studiích (Bennett and Yamamura 1985) je vazba ligandu k membránovým vazebným místům charakterizována zdánlivou disociační konstantou, Kd, a 11

Zdeněk Fišar vazebnou kapacitou, Bmax. Disociační konstanta je základní veličina pro charakterizaci vztahu struktura-funkce při interakcích neurotransmiteru nebo léčiva se specifickým receptorem. Lze ji použít i pro charakterizaci interakcí léčivo-lipidová dvojvrstva, kdy je však poněkud odlišný způsob interpretace. Vyšší afinita intramembránového vazebného místa může být způsobena jak vhodnější strukturou ligandu vzhledem k požadavkům vazebného místa, tak vyšší koncentrací nebo vhodnější konformací a orientací ligandů lokalizovaných v lipidové dvojvrstvě (Schwyzer 1991, Mason et al. 1991). Pro výpočet parametrů saturovatelné specifické vazby k intramembránovým místům je tedy vhodnější použít koncentraci léčiva v dvojvrstvě místo koncentrace volného ligandu. Spočtená efektivní disociační konstanta potom odpovídá zdánlivé disociační konstantě korigované na akumulaci ligandu (Heirwegh et al. 1992). Vynásobením zdánlivé disociační konstanty hodnotou rozdělovacího koeficientu je ovšem provedena jen velmi hrubá korekce, neboť distribuce léčiva v membráně je nerovnoměrná - v určitých oblastech lipidové dvojvrstvy mohou vznikat mnohem vyšší koncentrace ligandu, než odpovídá průměrné hodnotě. Na druhou stranu nemusí být vazebná místa zanořena v dvojvrstvě stejně hluboko, jako je lokalizována většina léčiva (Mason et al. 1991). Nesmíme však zapomenout, že uvedené korekce platí jen pro vazbu k intramembránovým místům, neboť pro vazebná místa na povrchu membrány (přístupná přímo z vodného prostředí) může mít akumulace léčiva v lipidové dvojvrstvě opačný efekt a projevit se jako úbytek dostupného volného ligandu; disociační konstanta takových míst je nepřímo vztažena k rozdělovacímu koeficientu léčiva v membránách (Boer et al. 1989). 1.1.5. Nitrobuněčné signální cesty Nitrobuněčné signální kaskády jsou hlavními cestami komunikace mezi plazmatickou membránou a řídícími procesy v různých nitrobuněčných složkách. Poznání nových signálních cest v neuronech, nebo objev nových složek a propojení u cest známých, lze považovat za nezbytný základ pro nalezení molekulárně biologických příčin vzniku neuropsychiatrických onemocnění. Signální cesty zahrnuté v patogenezi deprese jsou primárně aktivované především serotoninem, noradrenalinem, dopaminem, glutamátem a kyselinou γ-aminomáselnou (GABA), tj. jsou spojeny s procesy v adenylátcyklázovém nebo fosfoinozitidovém systému a změnami v koncentracích nitrobuněčných iontů, především kalcia. Vzhledem k přímému i zpětnovazebnému propojení různých signálních cest uvnitř neuronu je pozornost věnována signálním cestám spojeným jak s receptory pro monoaminové neurotransmitery, tak s receptory s interním kalciovým kanálem, receptory pro neurotrofiny a Wnt receptory. Podrobnější popis signálních cest lze nalézt např. na webových stránkách http://www.sabiosciences.com/pathwaycentral.php, nebo v literatuře (Fišar and Hroudová (2010). Vzájemné propojení různých signálních cest je uskutečňováno především proteinkinázami, proteinázami a molekulami regulujícími jejich aktivitu. Reverzibilní fosforylace proteinů je pravděpodobně nejdůležitějším molekulárním mechanismem, kterým mimobuněčné signály realizují biologickou odezvu v cílových neuronech. Významná je hlavně fosforylace iontových kanálů, receptorů, enzymů zahrnutých do syntézy neurotransmiterů, proteinů spojených se synaptickými váčky (synapsinů), cytoskeletálních proteinů, inhibitorů fosfatáz a transkripčních faktorů. V biologické psychiatrii je největší pozornost věnována proteinkinázám typu A (PKA) závislým na cyklickém adenozinmonofosfátu (cAMP), proteinkinázám typu C (PKC) aktivovaným diacylglycerolem (DAG) a protenkinázám závislým na vápníku a kalmodulinu (PKCaM). Vzhledem k účinkům dlouhodobého podávání antidepresiv a stabilizátorů nálady a vzhledem k předpokládané úloze přežívání, plasticity a metabolismu neuronů v duševních a neurodegenerativních onemocněních jsou intenzivně studovány také proteinkinázy typu B (PKB, Akt), glykogensyntázakináza-3 (GSK-3) a složky

12

Deprese, antidepresiva a membrány regulující programovou buněčnou smrt (apoptózu), především rodina proteinů Bcl-2 a různé mitochondriální faktory. Adenylátcyklázová cesta Mechanismus aktivace adenylátcyklázového systému po aktivaci příslušného receptoru zahrnuje tyto kroky (Obr. 6): 1. ligand se naváže na receptorové vazebné místo; 2. receptor interaguje s Gs proteiny a aktivuje je; 3. Gαs podjednotky (a zřejmě také Gαolf) se vážou k adenylátcykláze (též označována jako adenylylcykláza) a tím ji přímo aktivují; rovněž volné βγ komplexy aktivují určité podtypy adenylátcykláz; 4. aktivovaná adenylátcykláza katalyzuje změnu ATP na cAMP (reakce vyžaduje Mg2+), dokud nedojde k inaktivaci příslušných podjednotek G proteinu; 5. cAMP aktivuje proteinkinázy závislé na cAMP (proteinkinázy A, PKA), které fosforylují prakticky všechny typy neuronových proteinů; 6. působení cAMP je ukončeno jeho hydrolýzou na 5‘-AMP enzymem fosfodiesterázou (reakce vyžaduje Mg2+). Předpokládalo se, že inhibice adenylátcyklázového systému po aktivaci příslušných receptorů probíhá analogicky jako výše popsaná stimulace, s tím rozdílem, že jsou receptorem aktivovány Gi proteiny, jejichž Gαi podjednotky přímo inhibují adenylátcyklázu. To se však dosud nepodařilo přesvědčivě prokázat, takže se pozornost věnuje možnosti, že βγ komplexy uvolněné z Gi mohou přímo inhibovat adenylátcyklázu nebo mohou ovlivňovat její aktivitu nepřímo přes vazbu volných Gαs podjednotek v membráně.

Obr. 6 Adenylátcyklázová signální cesta (podle Fišar and Hroudová 2010) GPCR – receptor spřažený s G proteiny, ATP – adenozintrifosfát, ADP - adenozindifosfát, cAMP – cyklický adenozinmonofosfát, PDE – fosfodiesteráza, AMP - 5´-adenozinmonofosfát, PKA proteinkináza A, PKC - proteinkináza C, CREB – transkripční faktor, BDNF – mozkový neurotrofní faktor

Guanylátcyklázová cesta Guanylátcykláza (GC, též ozn. jako guanylylcykláza) katalyzuje tvorbu cyklického guanozinmonofosfátu (cGMP) z guanozintrifosfátu (GTP) za přítomnosti Mg2+. Vyskytuje se jak vázaná v membránách, tak volná v cytosolu. Membránově vázaná forma GC je aktivována peptidovými hormony; rozpustná forma GC je aktivována oxidem dusnatým (NO), který je

13

Zdeněk Fišar produkován např. v odezvě na zvýšené koncentrace nitrobuněčného kalcia. cGMP působí jako regulátor vodivosti iontových kanálů, glykogeneze a apoptózy. Fosfoinozitidová cesta Ve fosfoinozitidovém přenosovém systému je stimulován obrat fosfolipidů obsahujících inozitol v těchto krocích (Obr. 7): 1. ligand se naváže na receptorové vazebné místo; 2. receptor interaguje s G proteiny (většinou Gq, někdy také Go nebo Gi) a aktivuje je; 3. podjednotky Gα aktivují fosfolipázu C specifickou pro fosfoinozitidy (PI-PLC; jedná se o fosfodiesterázu), především formu PLC-β; 4. aktivovaná PLC katalyzuje hydrolýzu fosfatidylinozitol-4,5-bifosfátu (PI(4,5)P2, PIP2) a vznikají druzí poslové inozitoltrifosfát (IP3) a diacylglycerol (DAG); 5. DAG aktivuje proteinkinázy C (PKC), které fosforylují enzymy a jiné buněčné proteiny, čímž je aktivují či inhibují; 6. IP3 se váže k nitrobuněčným receptorům, což vede k uvolnění Ca2+ z nitrobuněčných zásob v endoplazmatickém retikulu; 7. Ca2+ aktivuje proteinkinázy a proteinázy závislé na vápníku a kalmodulinu.

Obr. 7 Fosfoinozitidová signální cesta (podle Fišar and Hroudová 2010) GPCR – receptor spřažený s G proteiny, PLC - fosfolipáza C specifická pro fosfoinozitidy; PIP2 fosfatidylinozitol-4,5-bifosfát; IP3 - inozitol-1,4,5-trifosfát; DAG - diacylglycerol; PKC - proteinkináza C, CaM – kalmodulin, CREB – transkripční faktor, BDNF – mozkový neurotrofní faktor

Neurotrofní cesty Neurotrofní (tyrozinkinázová) cesta je aktivována růstovými faktory; není přímo aktivována neurotransmitery, ale napojuje se na řadu signálních cest, včetně výše uvedených (Obr. 8). Neurotrofiny aktivují různé mitogenem aktivované proteinkinázové (MAPK) signální cesty, podle toho, zda působí na buněčném těle nebo na axonovém zakončení. MAPK jsou rodina kináz, které přenášejí signál z buněčné membrány do jádra v odezvě na řadu podnětů včetně stresu. Existují čtyři hlavní skupiny MAPK: ERK („extracellular signal-regulated kinases“), p38, JNK („c-Jun NH2-terminal kinases“, známé také jako stresem aktivované proteinkinázy) a ERK5 (též ozn. jako BMK1, „big-mitogen activated kinase 1“). Každá tato MAPK cesta obsahuje třístupňovou kinázovou kaskádu tvořenou MAPKKK (kináza kinázy MAPK), MAPKK (kináza MAPK) a MAPK (Wada and Penninger 2004). Aktivované MAPK fosforylují specifické substráty na jejich serinových nebo threoninových zbytcích. Vazba neurotrofinu k trk receptoru vede (Obr. 8)

14

Deprese, antidepresiva a membrány 1. k fosforylaci fosfolipázy C (PLC) trk receptorem; PLC potom katalyzuje štěpení fosfatidylinozitol-4,5-bifosfátu (PIP2) na diacylglycerol (DAG) a inozitoltrifosfát (IP3); DAG může aktivovat fosfatidylinozitol-3 kinázu (PI3K) nebo různé proteinkinázy C (PKC); IP3 uvolňuje kalcium z nitrobuněčných zásob a to aktivuje na něm závislé proteinkinázy (PKCaM); 2. k aktivaci molekuly Ras, což vede k aktivaci dvou alternativních cest mitogenem aktivovaných kináz (MAPK), kdy jsou stimulovány kinázy regulované mimobuněčným signálem ERK1,2 nebo ERK5; 3. ke stimulaci PI3K heterodimerů, které aktivují kinázu PDPK1 a ta aktivuje proteinkinázu Akt; Akt např. stimuluje transkripční faktory, inhibuje proapototický faktor BAD a glykogensyntázukinázu-3 (GSK-3).

Obr. 8 Neurotrofní signální cesty (podle Fišar and Hroudová 2010)

Wnt cesta Wnt signální cesta aktivovaná růstovými faktory Wnt zahrnuje procesy mající úlohu v embryogenezi, nádorových onemocněních, ale i v normálních fyziologických procesech (Lie et al. 2005, Clevers 2006, Fuerer et al. 2008). Wnt signály jsou přenášeny přinejmenším třemi nitrobuněčnými cestami, nejlépe je prostudována tzv. kanonická Wnt cesta, která primárně reguluje buněčný osud během vývoje. V poslední době byla tato cesta spojena s terapeutickými účinky lithia při léčbě poruch nálady, pravděpodobně přes aktivaci transkripčních faktorů β-kateninem (Obr. 9). Je studována úloha Wnt cesty také ve vzniku Alzheimerovy nemoci, neboť aktivací Wnt receptoru (WntR) je inhibován enzym GSK-3β, který aktivuje apoptózu a fosforylaci tau proteinu.

15

Zdeněk Fišar

Obr. 9 Kanonická Wnt signální cesta (podle Fišar and Hroudová 2010)

1.1.6. Membránové přenašeče pro neurotransmitery Pro funkci chemické synapse mají významnou úlohu membránové přenašeče (transportní proteiny, transportéry, „carriers“), které zajišťují vychytávání neurotransmiterů ze synaptické štěrbiny a jejich přenos do presynaptického zakončení (transportní proteiny závislé na Na+ a Cl-) nebo do gliových buněk (transportní proteiny závislé na Na+); další typ přenašečů (závislých na pH) umožňuje ukládání neurotransmiterů do zásobních váčků. Transportní proteiny závislé na Na+ a Cl- slouží k přenosu serotoninu (5-hydroxytryptamin, 5-HT), noradrenalinu, dopaminu, γ-aminomáselné kyseliny (GABA), prolinu, glycinu, taurinu, betainu a kreatinu; přenašeče závislé na Na+ transportují glutamát a aspartát (Obr. 10).

Obr. 10 Membránové přenašeče pro neurotransmitery (Fišar a kol. 2009)

16

Deprese, antidepresiva a membrány Předpokládá se, že zpětné vychytávání (reuptake) neurotransmiterů pomocí přenašečů má 3 základní důsledky: 1. koncentrace neurotransmiteru ve štěrbině je snižována rychleji, než při pouhé difúzi, což umožňuje lepší časové rozlišení následných dějů; 2. účinky neurotransmiteru jsou omezeny na menší plochu, což dovoluje funkci anatomicky blízkých chemicky identických ale funkčně odlišných synapsí; 3. neurotransmiter může být po přenosu do presynaptického zakončení znovu použit. Předmětem studia jsou při duševních poruchách především transportní proteiny pro noradrenalin (NET), dopamin (DAT) a serotonin (SERT, 5-HTT) které se oproti ostatním přenašečům vyznačují vysokoafinní vazbou kokainu (inhibice reuptake dopaminu), amfetaminů, metylendioxymetamfetaminu (extáze), metamfetaminu (indukce obráceného transportu serotoninovým a dopaminovým přenašečem) a fencyklidinu (mimo jiné inhibuje uptake 5-HT). NET, SERT nebo oba tyto přenašeče jsou inhibovány řadou různých antidepresiv (viz kap. 1.3). Inhibice zpětného přenosu (reuptake) neurotransmiteru vede ke zvýšení jeho mimobuněčné koncentrace, takže receptory mohou být aktivovány déle a na větší vzdálenost od synapse. Citlivost membránových přenašečů na ionty a napětí může určovat rychlost transmembránového přenosu (uptake) neurotransmiterů. V případě SERT se Na+, Cl- a protonovaný 5-HT+ vážou k přenašeči a tvoří komplex, který poté podléhá konformační změně, při níž dochází k přenosu přes membránu a uvolnění neurotransmiteru a iontů do cytoplazmy (Obr. 11). Poté se nitrobuněčné K+ váže k SERT a podporuje jeho reorientaci tak, aby byl připraven na další transportní cyklus. Nitrobuněčné K+ tedy urychluje vtok 5-HT. Vazba antagonistů k SERT je rovněž závislá na mimobuněčném Na+, např. pro vazbu imipraminu vyžaduje SERT přítomnost 2 iontů Na+ na 1 molekulu imipraminu. Preferovaný stav SERT v živých buňkách je homo-oligomerní forma ze 4 molekul.

Obr. 11 Funkce membránového přenašeče pro serotonin.

1.1.7. Membránové lipidy a přenos signálu přes chemickou synapsi Klasické schéma přenosu signálu přes chemickou synapsi zahrnuje tyto kroky: 1. metabolismus, syntéza a ukládání neurotransmiteru v presynaptickém zakončení;

17

Zdeněk Fišar 2. exocytóza neurotransmiteru (v odezvě na vtok Ca2+ po depolarizaci presynaptické membrány); 3. difúze neurotransmiteru v synaptické štěrbině, jeho interakce s receptorem; 4. aktivace receptoru vedoucí k otevření iontového kanálu, nebo k aktivaci G proteinu, vnitřní guanylátcyklázy nebo vnitřní tyrozinkinázy; 5. metabolismus nebo zpětný přenos neurotransmiteru. Nověji je přenos signálu přirovnáván k 3-dimenzionální síti, v níž se podráždění v jednom bodě přenese do všech dalších a v níž existuje řada kladných i záporných zpětných vazeb. Receptory s tyrozinkinázovou aktivitou se na synaptickém přenosu nepodílejí přímo; jejich agonisty jsou růstové faktory, cytokiny a některé hormony. Nové metody a zdokonalující se přístroje umožňují získávání nových poznatků o převodu (transdukci) signálu z úrovně elektrické (depolarizace membrány) na chemickou (neurotransmitery) a zpět na elektrickou (membránový potenciál) nebo nitrobuněčnou (fosforylace proteinů a související procesy). Tyto nové poznatky lze využít při hledání molekulárních mechanismů vzniku duševních poruch a účinků psychofarmak. Pozornost je věnována nejen buněčným proteinům (neutransmiterovým receptorům a přenašečům, iontovým kanálům, enzymům, transkripčním faktorům), ale i úloze membránových lipidů a cholesterolu. Je známo, že značná část molekul podílejících se na přenosu signálu je lokalizována v buněčných membránách. Jedná se nejen o receptory, iontové kanály a transportní proteiny, ale i o G proteiny, adenylátcyklázy, fosfolipázy a další enzymy. Na funkci těchto membránových proteinů mají značný vliv vlastnosti lipidové dvojvrstvy tvořené především fosfolipidy, glykolipidy a steroly. Integrální proteiny jsou v membránách obaleny vrstvou tzv. „anulárních“ lipidů, na jejichž vazbě k proteinu se podílejí jednak hydrofobní a van der Waalsovy síly uvnitř membrány, jednak Coulombovy interakce a interakce ion-indukovaný dipól mezi nabitými a polárními skupinami v povrchové části membrány. Obecně je vliv lipidů na membránové proteiny dán jednak specifickými interakcemi lipidprotein podmiňujícími aktivitu řady enzymů, jednak nespecifickým ovlivněním dostupnosti vazebných míst (ovlivněním vertikálního pohybu proteinů) nebo vzájemných interakcí jednotlivých podjednotek vícesložkových systémů (změnami pohyblivosti těchto složek v rovině membrány) (Obr. 12). Byla popsána úloha fyzikálního stavu membrány (charakterizovaná fluiditou) ve funkci řady membránových receptorů, enzymů a iontových kanálů. Maximální receptorová odezva závisí nejen na hustotě vazebných míst, ale i na jejich přístupnosti pro agonisty rozpuštěné ve vodné fázi a na rychlosti, s níž může docházet ke vzájemným interakcím mezi jednotlivými membránovými složkami podílejícími se na přenosu signálu.

18

Deprese, antidepresiva a membrány

Obr. 12 Vliv lipidové dvojné vrstvy na funkci membránových proteinů (podle Shinitzky 1984)

Dostupnost i pohyblivost membránových integrálních proteinů závisí jak na fluiditě lipidové dvojné vrstvy, tak na existenci nehomogenit v jejím složení (mikrodomény) a stavbě (nedvojvrstevné struktury). Např. část membránových přenašečů pro noradrenalin se vyskytuje v lipidových raftech (Matthies et al. 2009). Chronické podávání antidepresiv ovlivňuje přenos nervového signálu také zabráněním kumulace Gαs v lipidových raftech bohatých na cholesterol a spojených s cytoskeletem (Donati and Rasenick 2005). Vliv cholesterolu, lipidového složení a dynamických vlastností (mikroviskozity) membrán byl popsán jak pro vlastnosti neurotransmiterových receptorů (acetylcholinových, serotoninových, α1- a β-adrenergních, peptidových, GABA a dalších), tak pro aktivitu řady membránových enzymů a přenašečů (různých ATPáz, proteinkináz C, fosfolipáz C, membránového přenašeče pro serotonin) (Lee 2003, Scanlon 2001, Pfrieger 2003) podílejících se na přenosu nervového signálu. V aktivaci iontových kanálů a různých enzymových a receptorových systémů hrají významnou roli především kyselé fosfolipidy (Tsakiris a Deliconstantinos 1984, Rando 1988, Bernik et al. 1991, Sandermann a Duncan 1991, Gelbmann and Müller 1992, Cohen a Müller 1992, Lee 2009). Rovněž metylace fosfolipidů v synaptických membránách nebo podávání fosfolipidů in vivo může zřejmě ovlivnit adaptaci receptorů na chronické podávání antidepresiv (Sulser et al. 1983, Racagni and Brunello 1984). Tabulka 1 Membránové lipidy a aktivita membránových proteinů (Fišar a kol. 2009) membránový protein Na+K+-ATPáza β-hydroxybutyrátdehydrogenáza proteinkináza C fosfolipáza C serotoninový přenašeč (SERT) tyrozinkináza receptory, iontové kanály iontové kanály

lipid nebo parametr modulují aktivitu proteinu fosfatidylserin fosfatidylserin diacylglycerol, fosfatidylserin fosfatidylinozitol-4,5-bifosfát cholesterol sfingomyelin, fosfatidylcholin fluidita kyselé fosfolipidy

Membránové fosfolipidy se podílejí na přenosu nervového signálu nejen jako strukturní základ membrány, ale i jako substráty fosfolipáz C, D, A2, tj. jako zdroje některých neurotransmiterů (endokanabinoidů) a druhých poslů - diacylglycerolu (DAG),

19

Zdeněk Fišar inozitoltrisfosfátu (IP3, I(1,4,5)P3) a volných mastných kyselin (především kyseliny arachidonové). Předpokládá se např., že poruchy v interakcích lipid-protein způsobené nadměrnou aktivitou fosfolipázy A2 mohou vést ke vzniku afektivních poruch.

20

Deprese, antidepresiva a membrány

1.2. Hypotézy poruch nálady (afektivních poruch) Afektivní poruchy se projevují patickou náladou. Projevují se v epizodách trvajících od několika dnů do několika měsíců. Při bipolárním typu onemocnění dochází ke střídání depresivních a manických epizod, unipolární typ zahrnuje pouze epizody depresivní, nebo pouze manické. Nástup onemocnění je obvykle mezi 20. a 35. rokem. Těžká podoba postihuje asi 1% populace a je obvykle dobře léčitelná. Pro klasifikaci poruch nálady je používána 10. revize Mezinárodní klasifikace nemocí (MKN-10, http://www3.who.int/icd/currentversion/fricd.htm, http://www.pcp.lf3.cuni.cz/pcpout/is/CD/mkn_klin/obsah.htm). Na léčbu antidepresivy odpovídá 65-70% pacientů. Zlepšení nastává po asi 10-20 dnech farmakoterapie a je úplné po asi 8 týdnech. Elektrokonvulzivní terapie je účinná v dalších 1015%. Tedy asi 20% depresivních pacientů je rezistentních ke všem známým formám terapie. Někdy lze použít i fototerapii nebo spánkovou deprivaci. Při periodické depresivní poruše nebo bipolární poruše se dlouhodobě podávají také stabilizátory nálady, jako je lithium, valproát nebo karbamazepin. Neléčená deprese vede ve 25-30% k pokusu o sebevraždu. Molekulární mechanismy a procesy vedoucí ke vniku poruch nálady, ani mechanismy odpovědné za terapeutické účinky antidepresiv a stabilizátorů nálady nejsou dosud dostatečně poznány. 1.2.1. Východiska hypotéz Psychiatrie se snaží popsat a vysvětlit mechanismy vzniku a léčby afektivních poruch pomocí vlastních i mezioborových metod a postupů, tj. na základě poznatků získaných jak klinickým hodnocením nemocných, tak měřením fyziologických, biochemických a biofyzikálních změn. Zdroje poznatků vedoucích k formulaci hypotéz afektivních poruch se nacházejí především v oblasti biologické (genetické faktory, účinky stresu, chronobiologické aspekty), imunoneuroendokrinní (změny aktivity osy hypotalamus-hypofýza-kůra nadledvin, HPA, nebo osy hypotalamus-hypofýza-štítná žláza, HPT, uvolňování cytokinů apod.), neurochemické a biofyzikální (funkce membránových receptorů, iontových kanálů, přenašečů, G proteinů, lipidů, systémů druhých poslů, membránových i nitrobuněčných enzymů). Tabulka 2 Základní biologické přístupy ke studiu poruch nálady (Fišar a kol. 2009) biologické

neurochemické

imunoneuroendokrinní

genetika stres chronobiologie neurotransmitery receptory postreceptorové procesy osa hypotalamus-hypofýza-kůra nadledvin imunitní funkce

náchylnost k poruchám nálady zvýšená citlivost po opakování určitých událostí desynchronizace biologických rytmů dostupnost počet, afinita, senzibilita G proteiny, systémy druhých poslů, fosforylace a defosforylace, transkripce, buněčná energetika zvýšená aktivita při depresi různé změny při depresi

Afektivní poruchy mají ve své patogenezi významnou genetickou složku, zvláště bipolární onemocnění, i když odpovídající geny nebyly dosud nalezeny. Z biochemického a elektrofyziologického hlediska existuje řada důkazů, že se na vzniku afektivních poruch podílejí poruchy v přenosu nervového signálu, především v oblasti chemických synapsí. Svědčí pro to jednak změny koncentrací neurotransmiterů a jejich metabolitů v mozku, mozkomíšním moku a plazmě u některých depresivních pacientů, jednak dosud známé účinky 21

Zdeněk Fišar antidepresiv. Pozornost je věnována především poruchám ve funkci noradrenergních a serotonergních systémů v mozku, ale v různých hypotézách jsou uvažovány i další neurotransmiterové systémy, především glutamátergní, cholinergní, GABAergní, dopaminergní a peptidergní. Na postreceptorové úrovni se předpokládají změny ve funkci G proteinů, druhých poslů, proteinkináz a fosfatáz a transkripčních faktorů. Z hlediska biofyzikálního jsou studovány především interakce antidepresiv s membránami a změny vlastností buněčných membrán při onemocnění a jeho léčbě. Ze zřejmých etických důvodů je studium přenosu signálu a receptorových a postreceptorových procesů na úrovni synapsí zatím omezeno na použití nepřímých postupů a na experimenty s použitím zvířecích a buněčných modelů (synaptosomy, izolované synaptické membrány, leukocyty, destičky, erytrocyty, buněčné kultury, liposomy). Cenné poznatky o fungování mozku in vivo přinášejí zobrazovací a funkční zobrazovací metody (pozitronová emisní tomografie, jednofotonová emisní tomografie, funkční magnetická rezonance, dynamická počítačová tomografie); jejich prostorová rozlišovací schopnost však neumožňuje sledování procesů na jednotlivých synapsích. Většina biochemických hypotéz afektivních poruch se soustřeďuje na změny v dostupnosti neurotransmiterů, ve vlastnostech receptorů a přenašečů pro neurotransmitery a ve vlastnostech molekul podílejících se na přenosu signálu na postreceptorové úrovni (Manji 1992, Lachman a Papolos 1995). Jako určující se jeví narušení funkce serotonergních a noradrenergních systémů v mozku. Vznik a vývoj biochemických hypotéz afektivních poruch jsem podrobně popsal v monografiích (Fišar 1998, Fišar a kol. 2009), zde zmíním jen některé z nich. Tabulka 3 Neurochemické faktory sledované při afektivních poruchách (Fišar a kol. 2009) neurotransmitery receptory

postreceptorové systémy

dostupnost rychlost metabolismu počet nebo hustota afinita senzibilita počet a aktivita G proteinů efektorové enzymy systémy druhých poslů proteinkinázy fosfatázy transkripční faktory růstové faktory energetický stav buňky

1.2.2. Serotoninové hypotézy Serotonin je jedním z nejvýznamnějších neurotransmiterů a podílí se na regulaci spánku, agrese, chuti k jídlu, kardiovaskulární a dýchací aktivity, motorického výstupu, úzkosti, nálady, neuroendokrinní sekrece a analgezie. Serotonergní neurony mají buněčná těla lokalizována především ve skupině jader obklopujících raphe nuclei ve středním mozku, ale inervují všechny oblasti mozku. Serotonin je po uvolnění do synaptické štěrbiny rychle inaktivován především vysokoafinním transportním systémem (viz kap. 1.1.6), který zajišťuje jeho zpětný přenos (reuptake) do presynaptické části. Serotoninové hypotézy afektivních poruch vycházejí z předpokladu, že změny v dostupnosti serotoninu, stavu jeho receptorů nebo funkci jeho transportního proteinu doprovázejí různé poruchy nálady a že jedním z projevů dlouhodobé antidepresivní terapie je zvýšení serotonergní aktivity (Meltzer and Lowy 1987, Siever et al. 1991, Caldecott-Hazard et al. 1991, Charney et al. 1992, Stahl 1992, 1994, Maes and Meltzer 1995). Tyto hypotézy 22

Deprese, antidepresiva a membrány byly formulovány na základě pozorování řady změn a abnormalit serotonergní transmise u depresivních pacientů, jako je: 1. snížený počet vazebných míst SERT (určeno s [3H]-imipraminem, [3H]-citalopramem nebo [3H]-paroxetinem) v mozkové tkáni post mortem sebevrahů a depresivních osob a v destičkách neléčených depresivních pacientů; snížený uptake 5-HT v destičkách; 2. nízké koncentrace hlavního metabolitu serotoninu (5-HIAA) v mozkomíšním moku neléčených depresivních pacientů nebo snížené koncentrace 5-HT a 5-HIAA v post mortem mozcích depresivních a suicidálních pacientů; 3. snížené plazmatické koncentrace tryptofanu u depresivních osob; po redukci příjmu tryptofanu vážný relaps u depresivních pacientů v remisi, kteří odpovídali na serotonergní antidepresiva; 4. zvýšená denzita 5-HT2 vazebných míst v postmortem mozcích depresivních pacientů a sebevrahů, stejně jako v destičkách neléčených depresivních pacientů; desenzibilizace nebo snížený počet 5-HT1A receptorů; 5. glukokortikoidní hyperaktivita; 6. klinická antidepresivní účinnost látek ovlivňujících serotonergní systém (např. všech inhibitorů uptake 5-HT). Nejprve byly formulovány neurotransmiterové hypotézy předpokládající spojení depresivní poruchy s relativním snížením hladin serotoninu a noradrenalinu v mozku. Např. podle tzv. permisivní hypotézy je nedostatečná centrální serotonergní neurotransmise nutnou, ale nikoli postačující podmínkou pro vznik afektivní poruchy; blízkou příčinou pro vznik afektivního stavu je za této situace změna v centrální katecholaminové transmisi. Toto propojení serotonergního a noradrenergního systému je obsaženo i v novějších receptorových hypotézách afektivních poruch. Např. podle obecné katecholaminové hypotézy je supersenzibilita určitých katecholaminových receptorů při nízkých hladinách serotoninu biochemickým základem deprese. V poslední době je věnována pozornost hypotézám postreceptorovým (viz kap. 1.2.4), jejichž rozvoj byl vyvolán nahromaděním důkazů o tom, že snížení odezvy na aktivaci receptorů po chronickém podávání antidepresiv není nezbytně důsledkem down-regulace a desenzibilizace receptorů, tzn. důkazů o tom, že psychotropní látky mohou modulovat postreceptorové zesílení signálu. 1.2.3. Membránové (biofyzikální) hypotézy Z hlediska biofyzikálního jsou zajímavé hypotézy afektivních poruch předpokládající významnou úlohu membránových a plazmatických lipidů ve vzniku onemocnění. Při depresi byla popsána řada abnormalit v lipidové homeostazi (Maes et al. 1997, Chiu et al. 2003). Podle membránových hypotéz afektivních poruch abnormality v zastoupení a vlastnostech fosfolipidů a cholesterolu, které jsou základem struktury buněčných membrán, mohou indukovat změny v interakcích lipid-protein a v důsledku toho změny v různých neurotransmiterových systémech, o nichž se předpokládá, že jsou vztaženy k patofyziologii deprese (např. v serotonergním a noradrenergním systému). Náchylnost pro depresi potom může vzniknout v důsledku změn vlastností lipidové části buněčných membrán v určitých oblastech mozku. Některé tyto hypotézy předpokládají, že narušení interakcí lipid-protein v buněčných membránách při depresi může být způsobeno změnami mikroviskozity membrán v důsledku snížené esterifikace sérového cholesterolu při depresi (Maes et al. 1994), nebo nadměrnou aktivitou fosfolipáz A2, C, D, které jsou hlavními regulátory lipidového složení membrán. Zvýšený obsah volných mastných kyselin v plasmě (Mueller et al. 1970) a snížené koncentrace membránového fosfatidylcholinu v destičkách a erytrocytech depresivních pacientů (Sengupta et al. 1981) zřejmě souvisejí především se zvýšenou aktivitou fosfolipázy

23

Zdeněk Fišar A2 (Hibbeln et al. 1989, Horrobin 2001). Rovněž změněná fluidita membrán a snížená aktivita ATPáz (Rybakowski and Lehmann 1994) v erytrocytech naznačují, že při afektivních poruchách dochází ke změnám ve složení a vlastnostech buněčných membrán. Biofyzikální vlastnosti synaptických membrán (strukturu, uspořádání, mikroviskozitu) určují do značné míry esenciální nenasycené mastné kyseliny (PUFA), cholesterol a glykolipidy. Poměrně malé změny ve struktuře membrán způsobené cholesterolem a zastoupením n-3, n-6 a dalších nenasycených mastných kyselin potom mohou modulovat nejen metabolismus biogenních aminů (Mandell 1984), jejich vazbu (Heron et al. 1980) nebo zpětné vychytávání (Block and Edwards 1987), ale i transdukci signálu, např. vlivem na aktivitu adenylátcykláz a jiných membránových enzymů. V tzv. biofyzikální hypotéze afektivních poruch se uvažuje především o úloze dokosahexaenové kyseliny (22:6, n-3) a arachidonové kyseliny (20:4, n-6) ve funkci neuronálních membrán (Salem and Niebylski 1995, Hibbeln and Salem 1995, Peet et al. 1998, Horrobin 2001, Frasure-Smith et al. 2004). Terapeutická účinnost podávání n-3 polynenasycených mastných kyselin, především eikosapentaenové kyseliny, byla pozorována při léčbě schizofrenie, deprese i jiných duševních poruch (Peet and Stokes 2005, Young and Conquer 2005). Mechanismy působení polynenasycených mastných kyselin při depresi nejsou dostatečně známy, ale lze předpokládat jejich vliv na serotonergní aktivitu v mozku (De Vriese et al. 2004). Úloha n-3 PUFA v imunitě a poruchách nálady podporuje psychoneuroimunologickou hypotézu deprese (Su 2009). Byla formulována také hypotéza o vztahu mezi sérovými lipidy, depresí a aterosklerosou (Penttinen 1995). Podle hypotézy o optimální fluiditě membrán (Shinitzky 1984) závisí maximální receptorová odezva nejen na hustotě receptorových vazebných míst, ale i na jejich přístupnosti pro agonisty rozpuštěné ve vodné fázi a na difúzně kontrolované rychlosti, s níž může docházet ke vzájemným interakcím mezi jednotlivými membránovými složkami podílejícími se na přenosu signálu. Jak dostupnost, tak pohyblivost membránových proteinů přitom závisí na mikroviskozitě lipidové dvojvrstvy. Hypotéza o měnitelné afinitě receptorů (Bevan et al. 1989) vychází z pozorování, že k výrazným změnám v afinitě receptorů vedou rozdíly nejen v chemické struktuře receptoru, ale i v lokálním membránovém mikrookolí a v různých nitrobuněčných procesech. Změny v lipidovém složení plazmatických membrán tedy mohou ovlivňovat přenos signálu a podílet se na terapeutických účincích antidepresiv (Sengupta et al. 1981, Vinokur and Gubachev 1994). V řadě studií bylo popsáno zvýšené riziko deprese a sebevražedného chování u osob se sníženou koncentrací sérového (a zřejmě i membránového) cholesterolu (Kunugi et al. 1997, Vevera et al. 2003). Protože serotonergní systém má významnou úlohu v patofyziologii afektivních poruch a SERT je modulován jak fluiditou, tak přímými interakcemi s cholesterolem, byla formulována hypotéza (Engelberg 1992, Terao et al. 2000), podle níž po snížení koncentrace cholesterolu dochází ke snížení funkce serotonergního systému v důsledku změněné mikroviskozity a propustnosti plazmatických membrán. 1.2.4. Postreceptorové hypotézy S cílem přispět k nalezení biologických proměnných schopných charakterizovat depresivní poruchu nebo predikovat odezvu na antidepresiva jsou v současné době studovány především nitrobuněčné procesy ovlivňované antidepresivy. V současné době nejdiskutovanější postreceptorovou hypotézou je neurotrofní (molekulární a buněčná) hypotéza deprese (Duman et al. 1997), podle níž náchylnost k depresi může vzniknout v důsledku poškození neuronů, např. po chronickém stresu, dlouhodobém zvýšení hladin glukokortikoidů, hypoglykémii, ischémii, účinkem neurotoxinů nebo některých virových infekcí apod. Terapeutické účinky různých antidepresiv se podle této hypotézy uskutečňují přes zvýšení

24

Deprese, antidepresiva a membrány funkce serotonergního a noradrenergního systému vedoucí ke zvýšení plasticity neuronů a následné obnově jejich buněčných funkcí. Zásadní změna v neurobiologickém pojetí poruch nálady tedy spočívá v tom, že jsou spojeny jak s neurochemickými změnami, tak s narušením strukturální plasticity a buněčné odolnosti mozkových buněk. Neuroplasticita zahrnuje různé procesy, na jejichž základě je mozek schopen přijímat různé vnitřní i vnější podněty, přizpůsobovat se jim a odpovídat na ně. V dospělém mozku neuroplasticita zahrnuje změny dendritických funkcí, přetváření synapsí, dlouhodobou potenciaci, růst a větvení („sprouting“) axonů a dendritů, synaptogenezi a dokonce i neurogenezi (Mesulam 1999, Nestler et al. 2002). Pozornost výzkumu se vrací např. k monoaminoxidáze (MAO), enzymu lokalizovaném na vnější membráně mitochondrií, který může být inhibován nejen známými reverzibilními či ireverzibilními inhibitory MAO (MAOI), ale i řadou dalších antidepresiv (Egashira et al. 1996, 1999). Podle zdokonalené monoaminové teorie (Meyer et al. 2006) mohou být zvýšené hladiny monoaminoxidázy typu A brány jako obecný proces snižující monoaminy (bez vztahu k určitým symptomům), zatímco regionální hustota monoaminových transportérů má selektivní vliv na jednotlivé monoaminy (se silným vztahem k určitým symptomům). Zajímavý je bioenergetický a neurochemický model bipolární poruchy, tzv. hypotéza mitochondriální dysfunkce při bipolární afektivní poruše (Stork and Renshaw 2005), podle níž je energetika synapsí při depresivní poruše a její léčbě antidepresivy silně ovlivněna a modulátorem odpovědným za účinnost či neúčinnost různých antidepresiv jsou mitochondrie, které kromě toho, že jsou generátory chemické energie pro buňky, nesou na svém povrchu enzym MAO a ovlivňují tak v synapsích nitrobuněčný metabolismus řady neurotransmiterů a antidepresiv. V časných stádiích mnoha neurodegenerativních onemocnění, která jsou často provázena poruchami nálady, dochází k mitochondriálním dysfunkcím (snížená produkce ATP, oxidační stres, indukce apoptózy). Pro úlohu mitochondriální dysfunkce při bipolární poruše svědčí kromě pozorování změněného energetického metabolismu také účinky stabilizátorů nálady (lithia a valproátu) na mitochondrie, detekce mutací mtDNA v mozku, asociace polymorfismů mtDNA s bipolární poruchou, změněné exprese genů vztažených k mitochondriím v mozku. Na základě těchto pozorování byla formulována hypotéza mitochondriální dysfunkce při bipolární afektivní poruše, podle níž polymorfismy/mutace mtDNA nebo delece mtDNA způsobené mutacemi jaderných genů mohou způsobit mitochondriální dysregulaci kalcia, vedoucí k symptomům bipolární poruchy (Kato and Kato 2000, Kato 2007, 2008). Protože kalciová signální cesta má významnou úlohu v regulaci synaptické plasticity je tato hypotéza v souladu s výše uvedenou neurotrofní hypotézou. 1.2.5. Biologické markery Identifikace biologických znaků poruch nálady a faktorů schopných předpovědět odezvu na léčbu antidepresivy nebyla dosud dostatečně úspěšná. Biologické znaky se hledaly nejprve na úrovni koncentrací neurotransmiterů a jejich metabolitů či prekurzorů. Později se pozornost přesunula k receptorovým systémům a od 90. let minulého století jsou v popředí zájmu nitrobuněčné procesy. Nový přístup pro hledání biologických prediktorů odezvy na psychofarmaka poskytuje hypotéza počátečních podmínek (Rausch 1998), podle níž mohou být rozdíly v odezvě na psychotropní látky dány rozdílnými počátečními stavy systémů odpovědných za neurotransmisi. Dosud byla tato hypotéza testována pro vztah počáteční afinity serotoninového přenašeče a možnost predikce odpovědi na fluvoxamin, fluoxetin a nortriptylin.

25

Zdeněk Fišar

Tabulka 4 Vybrané biologické markery studované u poruch nálady (Fišar and Raboch 2008) plazma/sérum

krevní destičky

lymfocyty/leukocyty

erytrocyty

kortisol (bazální koncentrace; DST test) TSH (bazální koncentrace; TRF stimulační test) T4, prolaktin, ACTH, melatonin cytokiny serotonin, noradrenalin, dopamin tryptofan (bazální koncentrace; ATD test, PCPA test) tyrozin (bazální koncentrace; APTD test, AMPT test) 5-HIAA, MHPG, normetanefrin koncentrace antidepresiv BDNF ω-3 a ω-6 PUFA neopterin, tetrahydrobiopterin homocystein, kyselina listová (folát) SERT (kinetika přenosu; vazba imipraminu a paroxetinu) serotonin, NO MAO-B 5-HT2A; α2-adrenoceptory BDNF, GSK-3 specifické poruchy u enzymů mitochondriálního dýchacího řetězce, kinetika spotřeby kyslíku, aktivita citrátsyntázy, mutace a polymorfismy mtDNA polymorfismus a mutace genů pro SERT, MAO, BDNF, TPH, COMT, enzymy cytochromu P450, glykoprotein P, nukleární proteiny PXR a CAR, neuronální NO syntházu a další G proteiny, β-arrestin1 IDO 5-HT1A; β-adrenoceptory membránový přenašeč pro noradrenalin SERT (kinetika přenosu; vazba imipraminu a paroxetinu) CREB, BDNF, NGF, Bcl-2, GSK-3, NO specifické poruchy u enzymů mitochondriálního dýchacího řetězce pyruvátdehydrogenáza, fumaráthydratáza ATPázy membránové lipidy (ω-3 a ω-6 PUFA); cholesterol membránový přenos tryptofanu, tyrozinu, L-trijodthyroninu kalcium kyselina listová

DST: dexametazonový supresní test; TSH: thyreostimulační hormon; TRF: faktor uvolňující thyrotropin; T4: thyroxin; ACTH: adrenokortikotropní hormon; ATD test: vyčerpání tryptofanu; PCPA test: snížení syntézy 5-HT vlivem p-chlorfenylalaninu; APTD test: vyčerpání fenylalaninu/tyrozinu; AMPT test: snížení koncentrací NA a DA vlivem α-methylp-tyrozinu; 5-HIAA: 5-hydroxyindoloctová kyselina; MHPG: 3-metoxy-4hydroxyfenylglykol; PUFA: polynenasycené mastné kyseliny; IDO: indolamin-2,3dioxygenáza; SERT: serotoninový přenašeč; NO: oxid dusnatý; MAO monoaminoxidáza; 5HT: serotonin; BDNF: mozkový neurotrofní faktor; GSK-3: [glykogensyntáza]kináza-3; TPH: tryptofanhydroxyláza; COMT: katechol-O-methyltransferáza; CREB: transkripční faktor aktivovaný v odezvě na zvýšení hladin cAMP; NGF: nervový růstový faktor; Bcl-2: rodina proteinů zahrnutá v regulaci apoptózy

26

Deprese, antidepresiva a membrány

1.3. Antidepresiva a stabilizátory nálady Antidepresiva se používají především k léčbě deprese; jejich dlouhodobé podávání (týdny, měsíce) upravuje patologicky zhoršenou náladu. Ačkoli jsou používána v léčbě afektivních poruch již více než 50 let, přesný mechanismus jejich terapeutického působení není znám. Antidepresiva jsou chemicky různorodou skupinou psychofarmak s různými primárními biochemickými účinky. Významnou skupinu antidepresiv tvoří látky primárně inhibující zpětné vychytávání neurotransmiterů ze synaptické štěrbiny (reuptake inhibitor, RUI), zvláště serotoninu, noradrenalinu nebo dopaminu (monoaminové neurotransmitery). Kromě klasických tricyklických antidepresiv (TCA), která reuptake serotoninu a noradrenalinu inhibují neselektivně, patří do této skupiny selektivní inhibitory reuptake serotoninu (SSRI), selektivní inhibitory reuptake noradrenalinu (NRI), duální inhibitory zpětného vychytávání serotoninu i noradrenalinu (SNRI) nebo noradrenalinu i dopaminu (NDRI). Druhou skupinou antidepresiv zvyšujících účinky monoaminových neurotransmiterů jsou inhibitory MAO, enzymu lokalizovaného na vnější membráně mitochondrií a katalyzujícícho deaminaci těchto neurotransmiterů v cytoplazmě. Inhibice zpětného vychytávání nebo inhibice enzymu MAO však není jediným mechanismem, jímž antidepresiva zvyšují funkci serotonergního a noradrenergního systému v mozku; některá jsou antagonisty α2-adrenergních, serotoninových 5-HT2 a 5-HT3 a jiných receptorů, např. noradrenergní a specifická serotonergní antidepresiva (NaSSA). Některá antidepresiva blokují jak serotoninové 5-HT2A receptory, tak reuptake serotoninu; jsou klasifikována jako duální serotonin 2A antagonisté/inhibitory reuptake (SARI). Tabulka 5 Rozdělení antidepresiv podle primárního biochemického účinku inhibitory katabolismu neurotransmiterů (IMAO) blokátory reuptake neurotransmiterů (SRI/NRI, SSRI, SNRI) agonisté receptorových systémů (5-HT1A) antagonisté receptorových systémů (α2-AR, 5-HT2) inhibitory či stimulátory nitrobuněčných složek transdukce signálu (G proteinů, adenylátcykláz, fosfolipáz, proteinkináz, fosfatáz, ATPáz, proteinů závislých na membránových fosfolipidech, transkripčních nebo růstových faktorů) nebo buněčné energetiky

Nejdůkladněji prostudovanou skupinou antidepresiv jsou TCA, která jsou používána nejdéle a jejichž terapeutické účinky jsou dávány do souvislosti s inhibicí reuptake serotoninu a noradrenalinu, u některých i s blokádou 5-HT2A receptorů. Dnes nejčastěji podávanými antidepresivy jsou SSRI, které sice nejsou obecně účinnější než TCA, ale mají menší nežádoucí vedlejší účinky. Primární biochemické účinky antidepresiv nejsou dostačující pro vysvětlení jejich terapeutických účinků, ke kterým dochází až po dlouhodobé léčbě (2-4 týdny). Klíčovou úlohu v léčebných účincích antidepresiv mají adaptivní změny v neurotransmisi, jejichž přesné určení ztěžuje jednak vzájemná provázanost nitrobuněčných procesů, jednak skutečnost, že odezva na stejné antidepresivum je rozdílná u osob se stejnými depresivními symptomy a obecně je farmakoterapie úspěšná pouze ve 2/3 případů. Dosud neexistuje biochemický, biofyzikální, endokrinní nebo genetický test schopný předpovědět náchylnost k afektivní poruše nebo správnou terapeutickou odpověď na podávání určitého antidepresiva. Všeobecně se předpokládá, že klinické účinky antidepresiv jsou způsobeny jejich schopností indukovat adaptivní změny v monoaminergních neurotransmiterových systémech (hlavně noradrenergních a serotonergních). Zpočátku byly studovány především jejich účinky na změnu dostupnosti monoaminových neurotransmiterů v synapsích, později vliv na změny hustoty a senzibility receptorů a přenašečů a na vlastnosti molekul podílejících se na postreceptorové transdukci signálu (G proteinů, efektorových enzymů, systémů druhých 27

Zdeněk Fišar poslů, proteinkináz a transkripčních faktorů) (Manji 1992, Lachman and Papolos 1995, Fišar 1998, Fišar a kol. 2009). Nejčastěji pozorované změny vyvolané dlouhodobým podáváním antidepresiv jsou regulace snížením počtu (down-regulace) β1-adrenergních receptorů nebo snížení odezvy na agonisty (desenzibilizace) 5-HT1A receptorů. Byly však pozorovány změny i v jiných receptorových systémech. V poslední době je věnována pozornost především neurotrofním teoriím deprese, podle nichž jsou terapeutické účinky antidepresiv uskutečňovány přes aktivaci nitrobuněčných mechanismů zahrnujících zvýšení genové exprese určitých neurotrofinů a jejich receptorů (Duman et al. 1997, Schloss and Henn 2004); konkrétně, transkripční faktor aktivovaný v odezvě na zvýšení hladin cAMP (CREB) je možným nitrobuněčným cílem dlouhodobé léčby antidepresivy a gen pro mozkový-odvozený neurotrofní faktor (BDNF) je možným cílovým genem CREB. CREB může být fosforylován (aktivován) jak protenkinázami aktivovanými cAMP, tak proteinkinázami závislými na Ca2+ a kalmodulinu (Ca2+/CaM) v odezvě na aktivaci receptorů napojených na fosfoinozitidovou cestu nebo glutamátových ionotropních receptorů. Exprese BDNF a jeho receptoru TrkB je po dlouhodobém podávání různých antidepresiv i po elektrokonvulzivní terapii zvýšena, což vede k podpoře plasticity neuronů, jejich přežívání, konektivity a fungování.

Obr. 13 Model pro molekulární mechanismus účinků dlouhodobé léčby antidepresivy (podle Duman et al. 1997) 5-HT – serotonin; NA – noradrenalin; PKA – proteinkináza A; CREB – transkripční faktor aktivovaný v odezvě na zvýšení hladin cAMP; BDNF – mozkový neurotrofní faktor

Pro předcházení vzniku dalších manických a depresivních fází u bipolární afektivní poruchy se používají stabilizátory nálady, jejichž mechanismus účinku rovněž není dosud zřejmý (Švestka a kol. 1995, Vinař 1998, Stahl 2000); v současné době je diskutována především aktivace cytoprotektivního proteinu Bcl-2 a inhibice [glykogensyntázy]kinázy-3 (GSK-3) lithiem a inhibice GSK-3 a histondeacylázy valproátem (Manji et al. 2003, Zarate et al. 2006). Mezi užívané a testované stabilizátory nálady patří lithium, valproát, karbamazepin, lamotrigin a některá antipsychotika druhé generace (olanzapin, quetiapin, aripiprazol). Tyto stabilizátory nálady mají na molekulární úrovni velmi rozmanité účinky a není dosud jasné, které z nich jsou vztaženy k terapeutickým účinkům. Hlavními cíly stabilizátorů nálady jsou neurotrofní faktor BDNF, cesta kináz regulovaných mimobuněčným signálem (ERK), cesty ovlivňované GSK-3 a Bcl-2 (Gould and Manji 2005, Einat and Manji 2006, Shaltiel et al. 2007). Je dlouho známo, že lithium je nekompetitivní inhibitor inozitolmonofosfatázy a navíc lithium i valproát snižují transport myo-inozitolu do buněk; tyto účinky vedou ke snížení aktivity PKC. Lithium zvyšuje buněčnou odolnost také zeslabením excitotoxicity zprostředkované N-metyl-D-aspartátem (NMDA). Zvýšení koncentrací N-acetylaspartátu

28

Deprese, antidepresiva a membrány (NAA, znak životnosti a funkcí neuronů) v šedé hmotě po chronickém podávání lithia potvrzuje jeho silné neuroprotektivní a neurotrofní účinky u lidí. Lithium také zvyšuje hippokampální neurogenezi. Lithium i valproát zvyšují koncentrace Bcl-2 a inhibují GSK-3 (lithium přímo, valproát nepřímo). Valproát aktivuje signální cestu MAPK, inhibuje histondeacylázu (HDAC) a reguluje stresové proteiny endoplazmatického retikula. Aktivace MAPK dráhy má podstatnou úlohu v neurotrofních účincích VPA přes aktivaci genové exprese. Inhibice GSK-3 vede k neuroprotektivním účinkům a podpoře neuroplasticity, neurogeneze a buněčné odolnosti přes regulaci různých signálních drah v buňce a přes změny v genové expresi proteinů zahrnutých do mechanismů apoptózy a synaptické plasticity. Bcl-2 zeslabuje procesy vedoucí k buněčné smrti nebo atrofii sekvestrací kaspáz, inhibicí uvolňování mitochondriálních apoptotických faktorů, jako je Ca2+, cytochrom c (cyt c) nebo apoptózu indukující faktor (AIF). Lithium přes účinky na Bcl-2 a p53 (proapoptotický protein) působí na mitochondrie jako stabilizátor membránové integrity a předchází otevírání MPTP, což je klíčový děj v buněčné smrti, neboť vede přinejmenším k přechodné ztrátě Δψm, vstupu vody do matrixu a vyrovnání koncentrací iontů. ANTIDEPRESIVA

Obr. 14 Neurotrofní a neuroprotektivní účinky antidepresiv, lithia (Li) a valproátu (VPA) (podle Fišar 2006) Antidepresiva účinkují převážně přes monoaminergní receptorové systémy (R-Gs, R-Gq/11). Lithium zvyšuje koncentrace Bcl-2 a inhibuje [glykogensyntázu]kinázu-3 (GSK-3) a inozitolmonofosfatázu. Valproát aktivuje mitogenem aktivovanou proteinkinázovou (MAPK) signální dráhu a inhibuje GSK-3 a histondeacylázu. Inhibice GSK-3 vede k neuroprotektivním účinkům a podpoře neuroplasticity, neurogeneze a buněčné odolnosti přes regulaci různých signálních drah v buňce a přes změny v genové expresi proteinů zahrnutých do mechanismů apoptózy a synaptické plasticity. Bcl-2 zeslabuje procesy vedoucí k buněčné smrti nebo atrofii sekvestrací kaspáz, inhibicí uvolňování mitochondriálních apoptotických faktorů, jako je Ca2+, cytochrom c (cyt c) nebo apoptózu indukující faktor (AIF), zvýšením mitochondriálního uptake Ca2+, zabráněním otevíraní mitochondriálních přechodných pórů (MPTP) a prevencí zrušení vnitřního transmembránového potenciálu Δψm. - aktivace; - inhibice; trkB - receptor s vnitřní tyrozinkinázovou aktivitou; R-Gs, R-Gq/11 receptory spřažené s G proteiny; GluR - glutamátový ionotropní receptor; WntR - receptor pro proteiny Wnt; PI3K - fosfoinozitid-3 kináza; AKT - proteinkináza; Ras - malý G protein; MAPK - kaskáda kináz aktivovaných mitogenem, zahrnující kinázu regulovanou mimobuněčným signálem (ERK); BAD proapototický faktor; AC - adenylátcykláza; cAMP - cyklický adenozinmonofosfát; PKA - proteinkináza typu A (aktivovaná cAMP); CREB - transkripční faktor aktivovaný v odezvě na zvýšení koncentrace cAMP; BDNF - mozkový neurotrofní faktor; PLC - fosfolipáza typu C; IP3 - inozitoltrifosfát; DAG -

29

Zdeněk Fišar diacylglycerol; PKC - proteinkináza typu C; MARKCS - myristoylovaný na alanin bohatý substrát C kinázy; Ca2+/CaM PK - protenkináza aktivovaná kalciem a kalmodulinem; Wnt - glykosylované proteiny bohaté na cystein zahrnuté v nitrobuněčných signálních cestách, které kontrolují cílovou genovou transkripci přes GSK-3 a β-katenin, nebo které jsou vztaženy k uvolňování nitrobuněčného Ca2+.

Pro terapeutickou účinnost současných antidepresiv je nezbytný jejich snadný průchod hematoencefalickou bariérou (Gulyaeva et al. 2003) a schopnost indukovat změny přenosu nervového signálu v mozku. Předpokládá se, že antidepresiva mohou ovlivňovat funkci řady membránových proteinů a to nejen přímou specifickou vazbou, ale i nepřímým ovlivněním interakcí protein-protein a lipid-protein v důsledku akumulace antidepresiv v lipidové části buněčných membrán a tím indukovaných změn ve složení nebo struktuře lipidové dvojvrstvy (Toplak et al. 1990). Fyzikálně-chemické vlastnosti antidepresiv totiž umožňují jejich vazbu v lipidových dvojvrstvách. Koncentrace v lipidových částech biologických membrán potom mohou mnohonásobně převyšovat koncentrace v tělesných tekutinách. Je proto možné, že některé účinky antidepresiv se realizují přes interakce s membránovými fosfolipidy (Bauer et al. 1990; Mason et al. 1991; Seydel et al. 1994, Seydel and Wiese 2002). V rovnovážném stavu se antidepresiva nacházejí jak v mimobuněčném prostoru, tak v buněčných membránách a v cytoplazmě. V plazmě se antidepresiva nacházejí jednak volná, jednak vázaná na albumin, α1-kyselý glykoprotein a lipoproteiny (Riant et al. 1988). Rovnovážná rozdělení některých antidepresiv mezi krevní buňky a plazmu byla studována v podmínkách in vitro (Burch et al. 1981, Amitai et al. 1993) i in vivo (Sikora et al. 1990, Krulík et al. 1991, Fišar et al. 1996). Po dlouhodobém podávání antidepresiv dochází k ustavení jejich koncentrace v krvi a nerovnoměrné distribuci v mozku (Miyake et al. 1990). Existují velké rozdíly mezi plazmatickými hladinami antidepresiv u různých osob v důsledku rozdílů v metabolismu léků, variabilitě distribuce mezi plazmu a tkáně, způsobu podání léku, vlivu věku, kouření a jiných psychofarmak (Nagy and Johansson 1985, Perel et al. 1978); k výraznému kolísání dochází u jednotlivců i v průběhu dne. Kromě podaných antidepresiv jsou obvykle aktivní i jejich metabolity (Sanchez and Hyttel 1999). Různé studie vedly k závěru, že maximálních terapeutických účinností některých antidepresiv u určitých skupin pacientů může být dosaženo v určitém rozsahu ustálených plazmatických hladin, avšak vzájemný vztah mezi plazmatickými koncentracemi a klinickou účinností není jednoduchý (Perel et al. 1978, Risch et al. 1979, Perry et al. 1994, Jerling et al. 1995). Terapeutické rozsahy plazmatických koncentrací antidepresiv leží v oblasti desítek až stovek ng/ml. Lze uzavřít, že působení antidepresiv není omezeno jen na části receptorů, transportních proteinů a enzymů nacházejících se na povrchu buněčných membrán, ale že mohou být ovlivněny i procesy probíhající v hydrofobním vnitřku membrán a rovněž nic nebrání případným interakcím antidepresiv s nitrobuněčnými složkami efektorových systémů a systémů druhých a třetích poslů, včetně procesů v mitochondriích a v jádře (Fišar 2006). Existují hypotézy afektivních poruch (viz kap. 1.2.3) předpokládající, že jak onemocnění samo, tak terapeutické účinky antidepresiv jsou spojeny se změnami v metabolismu membránových lipidů a se změnami ve fyzikálním stavu lipidové dvojvrstvy.

30

Deprese, antidepresiva a membrány

1.4. Membránový přenašeč pro serotonin při depresi a její léčbě Mezi hlavní faktory určující aktivitu serotonergního systému v mozku patří biosyntéza serotoninu z tryptofanu, jeho katabolismus, ukládání do synaptických váčků, uvolňování do synaptické štěrbiny a zpětný přenos (reuptake). Membránovému přenašeči pro serotonin (SERT) je v serotoninových hypotézách afektivních poruch věnována značná pozornost, neboť má klíčovou úlohu v udržování serotonergních funkcí a jeho inhibice je primárním biochemickým účinkem řady antidepresiv, včetně dnes nejčastěji podávaných SSRI. Přibližně 80% vazebných míst pro 5-HT na SERT je při podávání SSRI obsazeno (Meyer et al. 2001). Podávání inhibitorů uptake 5-HT vede k rychlému tří až pětinásobnému zvýšení mimobuněčných koncentrací 5-HT v mozku (Fuller 1994), avšak, jak již bylo uvedeno výše, ke klinickému zlepšení dochází až po několika týdnech. Zvýšené mimobuněčné koncentrace 5-HT tedy teprve indukují žádoucí adaptivní změny. Předpokládá se, že terapeutické účinky antidepresiv jsou podmíněny výsledným zvýšením serotonergní neurotransmise v mozku (Blier and de Montigny 1994). Aktivitu neurotransmiterových systémů v mozku lze měřit nepřímo pomocí různých neuroendokrinních testů, kdy v odezvě na farmakologickou stimulaci či inhibici lze měřit změny hladin hormonů regulovaných příslušným neurotransmiterem. Příkladem je fenfluraminový test, který je používán pro sledování aktivity serotonergního systému v mozku. d-Fenfluramin inhibuje transport 5-HT do synaptických váčků a působí jako substrát pro SERT, čímž jednak inhibuje zpětný přenos 5-HT do presynaptické části, jednak usnadňuje jeho obrácený transport ven. Podání fenfluraminu zvyšuje hladiny uvolněného 5HT v mozku, což vede ke zvýšenému vyplavování prolaktinu z adenohypofýzy. Byla publikována řada důkazů ukazujících, že serotonergní systém v krevních destičkách zrcadlí presynaptický serotonergní systém. Transport 5-HT, jeho ukládání a uvolňování, stejně jako vazebné charakteristiky 5-HT2 receptorů, jsou velmi podobné v destičkách i presynaptických neuronech. Navíc bylo potvrzeno, že SERT a 5-HT2A receptor v plazmatických membránách lidských destiček a neuronů jsou identické (Lesch et al. 1993, Cook et al. 1994). Toto zjištění poskytlo další podporu pro použití destiček jako vhodného modelu pro sledování funkce mozkového serotonergního systému. Zájem o studium uptake 5HT u depresivních pacientů byl v poslední době obnoven poté, co bylo popsáno spojení mezi polymorfismem SERT promotoru a osobnostními rysy a jeho úloha v průběhu poruch nálady. Funkční vlastnosti SERT jsou charakterizovány rychlostí a účinností přenosu serotoninu do buňky. Ukázalo se, že pro charakterizaci kinetiky přenosu serotoninu do buněk lze použít rovnici analogickou rovnici Michaelise a Mentenové s parametry Vmax (maximální rychlost transportu serotoninu do buněk, která odráží existenci saturovatelného množství SERT v membránách) a KM (zdánlivá Michaelisova konstanta odpovídající koncentraci mimobuněčného 5-HT, při níž je rychlost transportu rovna polovině Vmax). Za předpokladu, že rychlostní konstanta disociace komplexu serotonin-přenašeč je větší než rychlostní konstanta odpovídající přenosu serotoninu přes membránu, jeho uvolnění do nitrobuněčného prostoru a návratu SERT do původního stavu, odpovídá konstanta KM přibližně disociační konstantě komplexu serotonin-přenašeč a charakterizuje tedy afinitu SERT. Poměr Vmax/KM lze považovat za kritérium účinnosti transportního systému (zdánlivou účinnost uptake 5-HT) při nízkých (fyziologických) koncentracích mimobuněčného 5-HT (Franke et al. 2000). Pro zjištění mechanismů účinků antidepresiv a předpověď klinické odezvy na jejich podávání při depresi byly sledovány různé periferní parametry serotonergní transmise, jako koncentrace metabolitů 5-HT v mozkomíšním moku, denzita a aktivita SERT nebo koncentrace 5-HT v destičkách a v plazmě. Bohužel, informace o změnách různých serotonergních parametrů v destičkách depresivních osob před a po léčbě antidepresivy jsou často rozporné. Může to být do značné míry způsobeno vlivem předchozí farmakoterapie na

31

Zdeněk Fišar měřené veličiny. Např. vazebná místa pro uptake 5-HT charakterizovaná vazbou [3H]imipraminu k SERT v destičkách depresivních pacientů byla zjištěna snížená, nezměněná i zvýšená (Koyama and Yamashita 1992, Mellerup and Langer et al. 1990, Owens and Nemeroff 1994). Vzhledem k vysoké nespecifické vazbě imipraminu byly nověji použity selektivnější ligandy [3H]paroxetin, [3H]citalopram a [3H]nitroguipazin, s nimiž byly získány konsistentnější výsledky o hustotě a afinitě těchto vazebných míst a byla zjištěna i mimoneuronální exprese SERT (D'haenen et al. 1988, Lawrence et al. 1994, Bakish et al. 1997, Hrdina et al. 1997). Většina studií zabývajících se vazbou inhibitorů k SERT se týká vysokoafinního vazebného místa, avšak bylo charakterizováno i nízkoafinní alosterické vazebné místo, jehož funkce není dostatečně známa (Plenge and Wiborg 2005). Často jsou měřeny parametry kinetiky transportu 5-HT do destiček, o nichž se předpokládá, že odrážejí změny funkce serotonergního systému v mozku (Tuomisto et al. 1979, Meltzer et al. 1981, Meltzer and Lowy 1987, Caldecott-Hazard et al. 1991, Lesch et al. 1993, Bianchi et al. 2002, Rausch et al. 2005). Snížení maximální rychlosti transportu serotoninu do destiček bylo dokonce navrženo jako možný biochemický marker deprese, avšak ukázalo se, že tento marker není dostatečně specifický (Caldecott-Hazard et al. 1991, Lawrence et al. 1994). U depresivních pacientů před léčbou byla popsána jak snížená (Tuomisto et al. 1979, Meltzer et al. 1981, Healy and Leonard 1987, Franke et al. 2000, StainMalmgren et al. 2001), tak nezměněná (Hrdina et al. 1995; Rausch et al. 2003) maximální rychlost Vmax transportu 5-HT do destiček; dokonce byla popsána i zvýšená Vmax u žen trpících depresivní poruchou (Hrdina et al. 1997). Po podávání antidepresiv se Vmax buď nezměnilo (Meltzer et al. 1981, Hrdina et al. 1997) nebo snížilo (Stain-Malmgren et al. 2001, Neuger et al. 2002, Axelson et al. 2005). Rozdíly v těchto studiích mohou být způsobeny rozdílnými metodickými rozdíly, sezónními změnami (Malmgren et al. 1989), zastoupením mužů a žen (Nishizawa et al. 1997, Hrdina et al. 1997, Neuger et al. 1999), individuálními rozdíly v rychlosti nástupu terapeutických účinků (Franke et al. 2003b) nebo různými dobami přerušení podávání antidepresiv. Konsistentnější výsledky byly získány s parametrem KM, který je u depresivních pacientů před léčbou nezměněn (Tuomisto et al. 1979, Meltzer et al. 1981), ale po dlouhodobém podávání různých antidepresiv dochází k jeho významnému zvýšení (Tuomisto et al. 1979, Meltzer et al. 1981, Healy and Leonard 1987, Hrdina et al. 1997, Stain-Malmgren et al. 2001, Neuger et al. 2002). Na základě těchto výsledků se předpokládá, že aktivita SERT v destičkách může být použita pro sledování účinků antidepresiv (především SSRI) na serotonergní systém v mozku a jako znak účinnosti SSRI při léčbě deprese (Bakish et al. 1997, Axelson et al. 2005). Jen málo studií se pokusilo korelovat zdánlivé kinetické parametry uptake 5-HT do destiček s tíží deprese; pokud ano, nebyly většinou nalezeny významné korelace (Meltzer et al. 1981, Kaplan and Mann 1982, Mårtensson et al. 1991, Hrdina et al. 1997). Byla však nalezena významná negativní korelace mezi KM a tíží deprese (Stain-Malmgren 1998, Franke et al. 2000, 2003a). SERT je regulován řadou procesů, např. protenkinázou C (PKC). Rovněž aktivace terminálních serotoninových autoreceptorů zvyšuje kinetiku uptake 5-HT přes vliv na SERT. Víme málo o tom, jak se 5-HT váže k SERT a jak je přenášen přes membránu, nebo o tom jak se vážou antagonisté. Rovněž studium úlohy fosforylace SERT nebo jiné posttranslační modifikace vedoucí ke změnám jeho funkce jsou v začátcích. Je zřejmé, že významnou úlohu mohou mít i složení a vlastnosti lipidové dvojvrstvy (Bhat and Block 1992) a specifické interakce SERT s membránovými lipidy v mikrodoménách (Magnani et al. 2004). Významným modulátorem funkce SERT je především membránový cholesterol, jehož nižší koncentrace vedly v experimentech in vitro ke snížení aktivity SERT (Scanlon et al. 2001). Propojení změn vlastností buněčných membrán způsobených různým obsahem cholesterolu s aktivitou serotonergního systému by mohlo být mechanismem podílejícím se na zvýšení

32

Deprese, antidepresiva a membrány rizika vzniku deprese spojené se suicidálním chováním při nízkých hladinách sérového cholesterolu (Penttinen 1995, Kunugi et al. 1997). Největší pozornost při hledání genetických parametrů souvisejících se vznikem poruch nálady a klinickými účinky dlouhodobého podávání antidepresiv je věnována genovým produktům zahrnutým do syntézy, metabolismu a působení serotoninu, především SERT, který zajišťuje zpětné vychytávání mimobuněčného serotoninu. Specifický genetický lokus pro uptake serotoninu zahrnuje polymorfní oblast a samotný gen pro přenašeč existuje jako krátká („s“) a dlouhá („l“) alela; krátká alella je spojena s nižší transkripční účinností promoteru ve srovnání s dlouhou alelou. Silnější vliv stresu na depresivní symptomy byl pozorován u genotypu „s/s“ nebo „s/l“ oproti „l/l“. Rovněž variace v genu TPH, tedy enzymu kontrolujícího syntézu serotoninu v mozku, pravděpodobně predisponují k poruchám nálady, především k suicidálnímu chování.

33

Zdeněk Fišar

1.5. Interakce antidepresiv s lipidovými membránami Většina antidepresiv jsou amfifilní molekuly (tj. molekuly sestávající z polární a nepolární části) nesoucí za fyziologických podmínek kladný náboj (patří do skupiny CAD, „cationic amphiphilic drug“). Mohou se vázat jak ke specifickým proteinovým vazebným místům, tak k lipidové části membrán (Lieber et al. 1984, Sikora et al. 1990, Fišar et al. 1996). Není známo, zda akumulace antidepresiv v lipidové části buněčných membrán má výrazný vliv na jejich terapeutické účinky, ale interakce protein-lipid-antidepresivum mohou ovlivňovat funkci řady membránových systémů podílejících se na přenosu nervového signálu (Bevan et al. 1989). Pro úlohu membránových lipidů v účincích antidepresiv svědčí také změny ve složení membránových lipidů pozorované po dlouhodobém podávání antidepresiv (Moor et al. 1988, Toplak et al. 1990, Pettegrew et al. 2001). Některá antidepresiva mohou indukovat generalizovanou fosfolipidózu, tj. akumulaci různých fosfolipidů uvnitř buňky (Xia et al. 2000) a s tím související vedlejší nebo toxické účinky. Souhrnně lze říci, že membránové lipidy mohou ovlivňovat účinky antidepresiv jednak změnou dostupnosti antidepresiv pro více či méně specifická vazebná místa v membráně, jednak působením na neurotransmiterové receptory a přenašeče. Přímý vliv lipidů na účinky antidepresiv spočívá jak v řádovém zvýšení jejich koncentrace v bezprostřední blízkosti buněčného povrchu v důsledku elektrostatických vlastností membránových lipidů (výsledného záporného náboje), tak v ovlivnění vazby (akumulace) amfifilních antidepresiv v lipidové části membrán. Nepřímý vliv membránových lipidů na působení antidepresiv je dán skutečností, že aktivita řady membránových proteinů, které jsou zapojeny do přenosu nervového signálu a jsou ovlivněny antidepresivy, silně závisí na interakci s určitými fosfolipidy nebo cholesterolem. Je předmětem dalšího výzkumu jak může farmakologické nebo nutriční ovlivnění vlastností membránových lipidů zlepšit příznaky afektivních poruch nebo účinnost jejich farmakoterapie. 1.5.1. Modelové membrány (liposomy) Pro in vitro studium interakcí léčiv s lipidovou částí buněčných membrán jsou používány izolované buňky, buněčné membrány a modelové membrány. Zvláště liposomy jsou široce používaným modelem lipidové části buněčných membrán a umožňují měřit nejen rozdělovací koeficienty, ale i vazebné parametry různých léčiv v lipidových dvojvrstvách s definovaným složením. Liposomy jsou váčky (vezikuly) uzavírající vodný roztok membránou tvořenou především fosfolipidy. Tvoří se spontánně, když jsou fosfolipidy dispergovány ve vodném prostředí. V závislosti na způsobu přípravy (New 1990) mohou vzniknout liposomy 1. mnohovrstevné (multilamellar vesicles, MLV, vezikuly o velikosti 10-1 až 100 μm, přičemž každý váček je tvořen mnoha koncentrickými vrstvičkami lipidových dvojvrstev), 2. malé jednovrstevné (small unilamellar vesicles, SUV, vezikuly o velikosti cca 25 nm), 3. velké jednovrstevné (large unilamellar vesicles, LUV, vezikuly o velikosti 100 μm). Jako zvláštní skupina se někdy uvádějí jednovrstevné liposomy střední velikosti (intermediate-sized unilamellar vesicles, IUV, vezikuly o velikosti kolem 100 nm). Bylo ověřeno, že liposomy jsou vhodným modelem pro studium vlastností lipidové části buněčných membrán, včetně studia interakcí léčiv s lipidovou částí buněčných membrán (Reith et al. 1984).

34

Deprese, antidepresiva a membrány

Obr. 15 Liposomy

1.5.2. Interakce antidepresivum-lipidová membrána Na vazbě antidepresiv k lipidovým dvojvrstvám se podílejí stejné nekovalentní interakce, jako je tomu u vazeb neurotransmiter-receptor nebo substrát-enzym; jedná se o: 1. interakce mezi elektroneutrálními molekulami nebo jejich částmi, označované jako van der Waalsovy síly; 2. elektrostatické (iontové, Coulombovy) interakce mezi ionty s určitým výsledným nábojem; 3. vodíkovou vazbu; 4. hydrofobní interakce, které spočívají v přiblížení hydrofobních skupin tak, aby se minimalizovala velikost rozhraní mezi vodou a nepolárními skupinami; 5. dipól-dipólové interakce (Keesomovy) mezi molekulami s permanentními dipóly. Coulombovy interakce mezi dipóly a zvláště mezi nabitými skupinami jsou dlouhodosahové, zatímco van der Waalsovy interakce se vzdáleností rychle klesají. Vazba antidepresiv do lipidové dvojvrstvy je chápána jako omezení „dimenzionality“ (Mosior and McLaughlin 1992, Beschiaschvili and Seelig 1992), neboť se nejedná o vazbu ke stabilnímu vazebnému místu, jako je tomu např. u receptorových specifických vazeb. Termodynamická analýza vazebné rovnováhy pro různé amfifilní ligandy vedla k závěru, že hnací silou pro vazbu těchto molekul do lipidové dvojvrstvy je hlavně změna entalpie, tzn. van der Waalsovy interakce (Bäuerle a Seelig 1991). Významnou úlohu v interakcích lipidantidepresivum mají i elektrostatické (coulombické) interakce, neboť jak membránové molekuly, tak antidepresiva nesou za fyziologických podmínek často náboj nebo alespoň obsahují polarizovatelné skupiny. Rozdíly v rozdělovacích koeficientech antidepresiv pro lipidové membrány, jejichž povrch je celkově elektroneutrální (např. fosfatidylcholinové, fosfatidyletanolaminové), nebo nese celkový záporný náboj (např. fosfatidylserinové, fosfatidylinozitolové) ukazují, že záporně nabité fosfolipidy mohou zvyšovat lokální koncentraci antidepresiv i jiných kladně nabitých molekul u povrchu buněčných membrán (Fišar et al. 2004) a ovlivnit tak jejich specifickou vazbu na membránové receptory, přenašeče, iontové kanály nebo enzymy. Studium interakcí amfifilních léčiv s liposomy spočívá především v měření rozdělovacích koeficientů, charakterizujících rovnováhu mezi molekulami léčiv ve vodném roztoku a molekul adsorbovaných na povrch membrány nebo inkorporovaných do hydrofobního vnitřku lipidové dvojvrstvy. Tato adsorpce a inkorporace se obvykle chápala jako nespecifický proces. Novější přístup spočívá v respektování heterogenity fosfolipidové membrány charakterizované polaritou membrány, nábojem a orientací polárních skupin (tzv.

35

Zdeněk Fišar fosfolipidových hlaviček), délkou a nenasyceností acylových řetězců (zbytků mastných kyselin) a konformací jejich dvojných vazeb, asymetrií membrány, existencí mikrodomén a nedvojvrstevných struktur a fluktuacemi hustoty. V důsledku této heterogenity jsou molekuly léčiv distribuovány v lipidových membránách nerovnoměrně (Herbette et al. 1986, Müller et al. 1986). Existuje také možnost vzniku specifických interakcí některých ligandů s acylovými řetězci fosfolipidů (Bäuerle a Seelig 1991, Jørgensen et al. 1991). Celkově mohou vést interakce lék-dvojvrstva ke změnám (Seydel and Wiese 2002) 1. konformace molekul léku, 2. konformace membránových molekul (orientace polárních hlaviček fosfolipidů, transgauche konformace acylových řetězců), 3. plochy a tloušťky membrány, 4. membránového potenciálu, 5. dynamických vlastností lipidové dvojvrstvy (uspořádanost a rotační a translační pohyblivost membránových molekul). Při vysokých koncentracích amfifilních molekul může dojít k destabilizaci lipidových dvojvrstev (Zimmer 1984, Balgavý and Devínsky 1996, Zachowski and Durand 1988, Heerklotz and Seelig 2000, Schreier et al. 2000, Sanganahalli et al. 2000). Označení výsledku interakce lék-lipidová membrána jako „vazba“ bylo předmětem diskusí vzhledem k běžnému významu tohoto označení v klasických interakcích enzym-substrát nebo ve studiích ligand-receptor. Pro odlišení byly používány přívlastky „pseudospecifická“, „nesaturovatelná“ a byl navržen termín „nespecifická akumulace“. Pokud chápeme lipidovou dvojvrstvu jako isotropní prostředí, potom je postačují kvantitativní charakteristikou vazby léku rozdělovací koeficient. Vezmeme-li v úvahu heterogenitu lipidové membrány, je nutno použít veličiny analogické receptorovým studiím (Bennett a Yamamura 1985), jako je vazebná kapacita (Bmax) a disociační konstanta (Kd), které umožňují kvantifikovat vazbu léku do různých oblastí lipidové dvojvrstvy. Teoreticky by mělo být možné určit ze saturačních křivek vazebné parametry i dvou či více různých vazebných míst. Parametry charakterizující vazbu CAD k membránám vycházejí z měření koncentračních závislostí množství volného a vázaného ligandu. Byla pozorována nezávislost rozdělovacích koeficientů na nízkých koncentracích CAD (Mason et al. 1989) a jejich závislost na teplotě, pH a lipidovém složení membrán (Luxnat and Galla 1986, Zachowski and Durand 1988, Austin et al. 1995). Saturovatelnost adsorpčních izoterem pozorovaná při vyšších koncentracích amfifilních léčiv je vysvětlována změnami elektrostatického potenciálu na povrchu membrán v důsledku inkorporace nabitých molekul ligandu do lipidové dvojvrstvy. Elektrostatika nabitých lipidových dvojvrstev byla intenzivně studována a diskutována v mnoha pracích (McLaughlin a Harary 1976, Eisenberg et al. 1979, McLaughlin 1989, Beschiaschvili and Seelig 1990, Cevc 1990, 1993, Stankowski 1991, Seelig et al. 1993, Langner and Kubica 1999, Averbakh and Lobyshev 2000). Pro analýzu výsledků interakcí nabitých molekul s modelovými membránami se pokládá za postačující Sternova teorie používající pro určení vztahu hustoty povrchového náboje a povrchového potenciálu Gouyovu-Chapmanovu teorii elektrických dvojvrstev (Beschiaschvili and Seelig 1992). Gouyova-Chapmanova teorie umožňuje při studiu elektrostatiky nabitých lipidových dvojvrstev určit: • elektrostatický potenciál v blízkosti povrchu membrány a jeho prostorový průběh; • elektroforetickou pohyblivost nabitých lipidových váčků; • koncentrace malých iontů u povrchu membrány; • adsorpci léčiv, hormonů, peptidů a proteinů na povrch membrány; • rozlišení hydrofobního a elektrostatického příspěvku k celkové vazbě ligandu k lipidové dvojvrstvě.

36

Deprese, antidepresiva a membrány Vazba mezi kladně nabitými antidepresivy a negativně nabitými membránami je zvýšena oproti vazbě k celkově elektricky neutrálním membránám. Pomocí Gouy-Chapmanovy teorie lze provést korekci na elektrostatické efekty a popsat interakci antidepresiv s membránami pomocí vazebných parametrů nebo povrchových rozdělovacích koeficientů (Fišar et al. 2004). 1.5.3. Lokalizace antidepresiv v membráně Pro lokalizaci amfifilních molekul v membráně je důležitá polarita a náboj membrán. Statická dielektrická konstanta se od povrchu membrány mění z hodnoty 78 (voda) k hodnotě kolem 2 ve vnitřku membrány a celkový náboj biologických membrán je obvykle záporný. Mnoho procesů probíhajících na rozhraní membrána-voda ovlivňuje hydratace membrán (Cevc 1990). Nositeli záporného náboje u membránových fosfolipidů jsou hlavně fosfátové a karboxylové skupiny, kladný náboj mohou mít aminoskupiny a cholinové hlavičky. Náboj je přitom lokalizován pro fosfátovou a karboxylovou skupinu u atomů kyslíku, pro aminoskupinu u atomů vodíku a pro cholinovou hlavičku u atomů dusíku a vodíku. V důsledku heterogenity membrán jsou v nich antidepresiva rozdělena nerovnoměrně. Zjednodušený model pro vazbu amfifilních molekul k lipidové membráně rozlišuje 4 oblasti (Bauer et al. 1990, Tieleman et al. 1997, Fišar 2005): 1. oblast rozrušené vody - je tvořena molekulami vody, které reagují na přítomnost polárních skupin lipidů; 2. interfáze – je tvořena hlavně atomy polárních hlaviček lipidů; 3. měkký polymer – oblast tvořená částečně uspořádanými uhlovodíkovými řetězci a nízkým volným objemem; 4. dekan – oblast ve střední části lipidové dvojvrstvy charakterizovaná hustotou podobnou dekanu a velkým volným objemem. První dvě oblasti jsou společně chápány jako rozhraní membrána-vodný roztok. Vlastnosti tohoto rozhraní jsou určující pro vazbu amfifilních molekul do membrány. Polární hlavičky fosfolipidů mohou být rozděleny do dvou oblastí: 1. na záporně nabitou fosfátovou skupinu a 2. na kladnou, zápornou, zwiterionickou nebo nenabitou oblast (Langner and Kubica 1999).

Obr. 16 Lokalizace antidepresiv v membráně (Fišar a kol. 2009)

Pro bližší charakterizaci a lokalizaci amfifilních molekul v membráně byl studován vliv vnějšího prostředí (iontů, pH, teploty) a lipidového složení membrán (Zachowski a Durand 1988, Fišar a Krulík 1995, Fišar 2005). Jak rozdělení léčiv, tak vliv na některé vlastnosti 37

Zdeněk Fišar membrán závisí silně na vlastnostech membránových lipidů, zvláště na přítomnosti záporně nabitých fosfolipidů a cholesterolu (Luxnat a Galla 1986). I dosti podobné molekuly mohou přitom interagovat s membránou značně rozdílně. Vliv na složení a vlastnosti lipidové části buněčných membrán byl sledován hlavně pro léčiva ze skupiny fenothiazinů, butyrofenony a tricyklická antidepresiva. Protože fenothiaziny i TCA si jsou strukturně podobné, ale stereochemicky jsou značně odlišné a mají i odlišné terapeutické účinky, byla srovnávána jejich lokalizace v buněčných membránách a vliv na fázové přechody lipidové dvojvrstvy. Ukázalo se, že fenothiaziny mají vyšší rozdělovací koeficienty než TCA, tj. mají vyšší hydrofobicitu a tedy silnější tendenci být inkorporovány dovnitř membrán. Pravděpodobná lokalizace molekul fenothiazinů v membráně je v hydrofobním vnitřku membrány s orientací nepolární části podél uhlovodíkových řetězců. TCA jsou vázána více periferně, v povrchových vrstvách lipidové dvojvrstvy s nepolární částí orientovanou v rovině membrány. Po vazbě do lipidové dvojvrstvy antidepresiva snadno ztrácejí kladný náboj, stávají se nepolárními a akumulují se v hydrofobním vnitřku membrány nebo procházejí na vnitřní stranu membrány, získávají kladný náboj a buď interagují s membránovými proteiny a kyselými fosfolipidy, nebo se uvolňují do nitrobuněčného prostředí a mohou ovlivňovat procesy v cytosolu, organelách nebo buněčném jádře. Heterogenitu vazby antidepresiv v membránách lze charakterizovat pomocí vazebných parametrů a podílu různých nekovalentních interakcí na vazbě (viz kap. 1.5.2).

38

Deprese, antidepresiva a membrány

2. SHRNUTÍ K SOUBORU PUBLIKOVANÝCH PRACÍ 2.1. Vazba imipraminu k fosfolipidovým dvojvrstvám měřená metodou vazby radioligandu Publikace 1: FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava and VELENOVSKÁ, Marie. Binding of imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol. Biophys. 2004, vol. 23, no. 1, p. 77-99. Úvod Tricyklická antidepresiva (TCA) jsou nejdůkladněji prozkoumanou skupinou antidepresiv, neboť se používají k léčbě afektivních poruch již téměř 50 let. Chemicky se jedná o amfifilní molekuly ze skupiny dibenzazepinů nebo dibenzcykloheptanodienů, které za fyziologických podmínek nesou kladný náboj (pKw = 9,4). Jejich primárním biochemickým účinkem vedoucím k terapeutickým účinkům je inhibice funkce membránových přenašečů pro serotonin a noradrenalin v neuronálních membránách. Při ztrátě kladného náboje se molekula TCA stává nepolární a může se akumulovat v hydrofobním vnitřku dvojvrstvy nebo projít na druhou stranu membrány, získat náboj a být lokalizována na vnitřním povrchu nebo se uvolnit do vodné fáze. Nakolik se akumulace TCA v lipidové části buněčných membrán podílí na jejich terapeutických nebo vedlejších účincích není známo. Pro popis adsorpce nebo inkorporace amfifilních léčiv do lipidových dvojvrstev lze použít Gouyovu-Chapmanovu teorii, která umožňuje provést korekci vazebných izoterem na elektrostatické efekty u povrchu membrán. Mohou tak být určeny správné vazebné parametry léčiv k lipidovým dvojvrstvám a rozlišen příspěvek hydrofobních a elektrostatických interakcí k celkové vazbě. Dosud nebyla dostatečně poznána heterogenita vazby a vazebné parametry TCA k lipidovým dvojvrstvám. V našich dřívějších experimentech (Fišar et al. 1991) jsme zjistili, že na vazbu TCA k modelovým membránám má větší vliv lipidové složení dvojvrstvy, než rozdíly mezi jednotlivými TCA, přičemž významnou úlohu mají fosfolipidy nesoucí záporný výsledný náboj. Proto jsme naše experimenty provedli s mnohovrstevnými liposomy připravenými z fosfatidylcholinu (PC), který je celkově elektricky neutrální, nebo fosfatidylserinu (PS), který nese celkový záporný náboj. Zaměřili jsme se na možnost rozlišení mezi slabší povrchovou adsorpcí TCA k liposomům a inkorporací léku dovnitř dvojvrstvy. Z antidepresiv byl testován především imipramin (IMI), ale také desipramin (DMI), didesmetylimipramin (DDMI) a amitriptylin (AMI). Cíle Cílem této práce byla charakterizace vazby TCA k lipidovým membránám. Studie byla rozdělena do tří etap: 1. Určit propustnost fosfolipidových dvojvrstev pro IMI: úkolem bylo zjistit, zda mnohovrstevné liposomy jsou vhodným modelem pro studium interakcí IMI s lipidovou dvojvrstvou, tj. prokázat, že IMI prochází lipidovými dvojvrstvami dostatečně rychle, aby změřené vazebné parametry odpovídaly vazbě ke vnějším i vnitřním dvojvrstvám. 2. Změřit a analyzovat celkovou vazbu IMI k liposomům: úkolem bylo analyzovat vazebné izotermy vazby IMI k liposomům připravených z celkově elektroneutrálních nebo záporně nabitých fosfolipidů pomocí Gouyovy-Chapmanovy teorie a Sternových rovnic. 3. Charakterizovat vysokoafinní vazbu TCA k liposomům: úkolem bylo vypracovat techniku umožňující rozlišit slabou povrchovou adsorpci od silnější vazby IMI do vnitřních oblastí 39

Zdeněk Fišar lipidových dvojvrstev a určit vazebné parametry silné vazby TCA lipidovým membránám a možnosti jejího vytěsňování. Metody Byla měřena rovnovážná vazba TCA k lipidovým membránám. Jako modelové membrány byly použity liposomy typu MLV (viz kap. 1.5.1) připravené z PC nebo PS. Pro měření vazby TCA k MLV jsme použili jsme metodu vazby radioligandu s tritiem značenými antidepresivy, přičemž pro oddělení volného a vázaného radionuklidu byla použita centrifugační nebo filtrační technika. Vazba antidepresiv byla popsána rozdělovacími koeficienty nebo parametry Langmuirových nebo Sternových adsorpčních izoterem. Výsledky Propustnost lipidových dvojvrstev pro IMI Úlohu jsme řešili porovnáním tří typů vzorků odlišujících se tím, ve které fázi přípravy MLV byl přidán tritiem značený IMI, a změřením kinetiky asociace a disociace IMI z liposomů. Zjistili jsme, že inkubace MLV s IMI při 20°C po dobu 30 min. je postačující pro ustavení rovnovážného stavu a rovnoměrného rozdělení IMI v mnohovrstevných liposomech. Měření a analýza celkové vazby IMI k liposomům Vazebné izotermy IMI k dvojvrstvám připraveným z PC a z PS byly změřeny s použitím centrifugační techniky pro oddělení nenavázaného antidepresiva. Při jejich analýze pomocí Sternových rovnic byl vzat v úvahu vliv IMI a monovalentních kationtů v roztoku na povrchový potenciál lipidových dvojvrstev a hustota povrchového náboje lipidových membrán byla korigována na průměrný elektrický náboj IMI a na zvětšení plochy membrány v důsledku inkorporace IMI do dvojvrstvy. Pro různé koncentrace IMI tak byly spočteny parametry jako elektrostatický povrchový potenciál, koncentrace IMI ve vodné fázi v bezprostřední blízkosti povrchu membrán, hydrofobní rozdělovací koeficient nebo zdánlivý celkový rozdělovací koeficient. Zatímco poslední dva uvedené parametry se od sebe pro membrány připravené z celkově elektroneutrálního PC příliš nelišily, záporný náboj PSmembrán způsobil mnohem menší hodnoty hydrofobního rozdělovacího koeficientu a vyšší hodnoty zdánlivého celkového rozdělovacího koeficientu. Koncentrační závislosti sledovaných parametrů byly silně nelineární. Experimentálně určené molární množství IMI vázaného na mol lipidu bylo pro PC menší a pro PS výrazně větší než předpovídá GouyovaChapmanova teorie. Tyto odchylky experimentálních dat od teorie ukazují na významnou úlohu jak elektrostatických odpudivých sil způsobených molekulami IMI vázanými v PCmembránách, tak elektrostatických přitažlivých sil mezi IMI a zápornými náboji v PSmembránách. Vysokoafinní vazba TCA k liposomům Vypracování vhodné techniky pro měření vysokoafinní vazby TCA k MLV obnášela např. porovnání účinnosti filtrace a centrifugace pro oddělení MLV od vodného média, stanovení vazby tritiovaného TCA na používané filtry, určení závislosti vazby TCA k MLV na koncentraci fosfolipidů a další. Vazebné saturační izotermy TCA k dvojvrstvám připraveným z PC, PS nebo hrubého extraktu lipidů z mozku byly měřeny s použitím techniky rychlé filtrace pro oddělení nenavázaného TCA. Vazebné parametry spočtené s použitím GouyovyChapmanovy teorie a zdánlivé vazebné parametry spočtené bez jejího použití se pro PCmembrány významně nelišily, zatímco pro PS-membrány byly velmi rozdílné. Množství navázaného IMI na mol fosfolipidu bylo významně vyšší pro PS-membrány. Tyto výsledky ukazují na významnou úlohu PS v interakcích IMI s membránami. Parametry vazby různých TCA (IMI, DMI, DDMI, AMI) se významně nelišily, což ukazuje na určující úlohu

40

Deprese, antidepresiva a membrány lipidového složení membrán při jejich interakcích s TCA. Analýza vytěsňovacích křivek ukázala, že vazba IMI k PS-membránám je mnohem hůře vytěsnitelná, než vazba k PCmembránám. Závěry • Pro měření interakcí antidepresiv s lipidovými dvojvrstvami lze použít modifikovanou metodu vazby radioligandu, původně vyvinutou pro receptorové studie. Citlivost metody a možnosti analýzy výsledků jsou srovnatelné např. s izotermickou titrační kalorimetrií. • Vyšší hydrofobní rozdělovací koeficienty pro IMI v PC-membránách ve srovnání s PSmembránami lze interpretovat jako důsledek lepší dostupnosti hydrofobního vnitřku PCdvojvrstev pro IMI. • Porovnání hodnot změřených a hodnot korigovaných na základě Gouyovy-Chapmanovy teorie ukázalo, že při nízkých koncentracích IMI (pod 1 μmol/l) je vliv navázaného IMI na povrchový náboj PC-membrán zanedbatelný; určující síly pro vazbu jsou zřejmě síly van der Waalsovy. Oproti tomu pro vazbu IMI k PS-membránám jsou elektrostatické interakce určující i při velmi nízkých koncentracích IMI. • Nelinearita rozdělovacích koeficientů překvapivě pozorovaná i při nízkých koncentracích IMI znamená, že parametry Sternových adsorpčních izoterem (tj. maximální množství léčiva vázaného na mol fosfolipidu a rovnovážná asociační konstanta) popisují vazbu TCA k lipidovým membránám mnohem lépe, než jednoduché rozdělovací koeficienty. • Významně vyšší vazebná kapacita a nižší asociační konstanta pro vazbu IMI k PSmembránám ve srovnání s vazbou k PC-membránám znamená, že fosfolipidové složení může výrazně ovlivňovat rozdělení antidepresiv mezi membránu a vodnou fázi, a že při analýze vazby antidepresiv k záporně nabitým membránám je vhodnější použít jejich koncentraci v bezprostřední blízkosti membrány, než objemovou koncentraci ve vodném roztoku. Model založený na nespecifické akumulaci IMI v blízkosti povrchu membrán následovaný hydrofobní adsorpcí je mnohem realističtější, než model běžně používaný v receptorových studií, který předpokládá stejnou koncentraci ligandu ve větší i menší vzdálenosti od buněčného povrchu. • Vazebné konstanty antidepresiv k lipidové části buněčných membrán jsou mnohem menší, než je tomu pro receptorová vazebná místa, avšak za předpokladu, že každá receptorová molekula je obklopena řádově 106 lipidovými molekulami, je součin počtu lipidových molekul a jejich vazebné kapacity a vazebné konstanty blízký receptorové vazebné konstantě. Významná část IMI je vázána k lipidové části studovaných buněčných membrán a není dostupná pro vazbu k receptorovým vazebným místům přístupným z vodné fáze. Na druhou stranu přítomnost negativně nabitých skupin v blízkosti receptorového vazebného místa může úbytek dostupného IMI i více než kompenzovat. • Pro zjištění možné interference mezi vazbou IMI do lipidové dvojvrstvy a ke specifickým vazebným místům v biologických membránách jsme detailně proměřili silnou (vysokoafinní) část z celkové vazby IMI k membránám z PC nebo PS. Zjistili jsme, že pro toto měření je vhodné použít filtrační techniku oddělení volného a vázaného IMI. Čisté PC-membrány vykazují saturovatelnou vytěsnitelnou (specifickou) vysokoafinní vazbu, která je však z fyzikálního hlediska jen zdánlivá. Nicméně naše zjištění znamená, že v receptorových vazebných studiích, kdy je studována vazba IMI nebo podobného amfifilního ligandu, může docházet k obtížně rozlišitelné interferenci mezi vazbou ke specifickému proteinovému vazebnému místu a touto zdánlivou vysokoafinní vazbou do lipidové dvojvrstvy. Specifikace vazebných sil podílejících se na zdánlivé vysokoafinní vazbě TCA k lipidovým dvojvrstvám je předmětem naší následující publikace (viz Příloha 2).

41

Zdeněk Fišar

2.2. Interakce tricyklických antidepresiv s fosfolipidovými dvojvrstvami Publikace 2: FIŠAR, Zdeněk. Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid bilayer membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 161-180. Úvod V předchozí práci (viz Příloha 1) jsme ukázali, že vazba tricyklických antidepresiv (TCA) k modelovým membránám má kromě nízkoafinní složky charakterizující hlavně slabou povrchovou adsorpci nabitých molekul TCA i zdánlivou vysokoafinní složku, která dosud nebyla popsána a charakterizována. Rovněž jsme ukázali, že vazba TCA k liposomům silně závisí na elektrickém náboji, který je na jejich povrchu a který je dán nábojem fosfolipidů tvořících dvojvrstvy. Fosfatidylcholin (PC) a fosfatidyletanolamin (PE) jsou v širokém rozsahu pH celkově elektricky neutrální, neboť záporný náboj fosfátové skupiny (pKPO4- ≤ 1) je kompenzován kladným nábojem cholinové hlavičky (pKNH3+ = 11,25); při vysokých pH však nesou PC a PE záporný náboj. Fosfatidylserin (PS) může nést kromě záporného náboje fosfátu (pKPO4- ≤ 1) a kladného náboje aminoskupiny (pKNH3+ = 11,5) i záporný náboj na karboxylové skupině (pKCOO- = 5,5). PS tedy nese za normálních podmínek záporný náboj, který se zvyšuje při vyšších hodnotách pH, zatímco při nízkých pH je PS elektricky neutrální. Fosfatidylinozitol (PI) je negativně nabitý v širokém rozsahu pH (pKPO4- = 2,7). Podíl coulombických interakcí na celkové vazbě TCA k liposomům připraveným z různých fosfolipidů lze určit na základě měření pH závislostí těchto vazeb. Mezi nejčastěji používaná a studovaná TCA patří imipramin (IMI), desipramin (DMI), amitriptylin (AMI) a nortriptylin (NOR). Při pH 7,4 nese kolem 99% molekul TCA ve vodě kladný náboj (pKw = 9,4). Hodnoty pK se však mohou lišit u ionizovatelných molekul léčiv lokalizovaných v lipidové dvojvrstvě od molekul léčiv ve vodném roztoku. Snadno lze odvodit vztah mezi posunem pK léčiva v membráně a ve vodě na jedné straně a poměrem rozdělovacích koeficientů nabité a nenabité formy tohoto léčiva na straně druhé. Posun pK lze určit z pH-závislosti vazby léčiva k lipidové dvojvrstvě. Cíle Cílem této práce byla charakterizace zdánlivé vysokoafinní vazby TCA k lipidovým dvojvrstvám. Především jsme chtěli analýzou pH-závislostí vazby určit podíl Coulombových a jiných nekovalentních interakcí v této vazbě, a rozlišit vliv vlastností antidepresiv a vlastností fosfolipidů na vazbu. Metody Byly změřeny pH-závislosti zdánlivé vysokoafinní vazby čtyř různých tricyklických antidepresiv (IMI, DMI, AMI, NOR) k mnohovrstevným liposomům (MLV) připraveným z různých fosfolipidů (PC, PE, PS, PI). Pro měření vazby TCA k MLV byla použita metoda vazby radioligandu s tritiem značenými antidepresivy, přičemž pro oddělení volného a vázaného radionuklidu byla použita filtrační technika. Záchyt MLV na filtrech při různých hodnotách pH byl měřen pomocí tritiem značených fosfolipidů. Výsledky Nejprve byla upřesněna metoda měření stanovením pH-závislostí účinnosti záchytu MLV (obsahujících tritiem značené fosfolipidy) na filtrech. Při vyhodnocení vlastních vazebných experimentů potom byl proveden přepočet na 100% účinnost záchytu.

42

Deprese, antidepresiva a membrány Metodou fluorescenčních sond jsme ověřili, že v rozsahu pH 4 až 11 nedochází k významným změnám v anizotropii fluorescence membránových sond, tj. nedochází k podstatným změnám ani ve struktuře a uspořádání lipidových dvojvrstev, ani v pohyblivosti membránových molekul. Metodou vazby radioligandu byly změřeny pH-závislosti (v rozsahu 2 až 12) vazby tritiovaného IMI, DMI, AMI nebo NOR k liposomům připraveným jak z čistého PC, PE, PS nebo PI, tak ze směsí PC+PE, PC+PS nebo PC+PI. Křivky byly vyhodnoceny na základě známých hodnot pK zásaditých a kyselých skupin na molekulách fosfolipidů a antidepresiv. Zjistili jsme, že: 1. Pro rozlišení vazby nabitých a nenabitých molekul bylo nutné použít velmi nízké (nanomolární) koncentrace TCA. 2. Celková vazba byla závislá jak na pH, tak na lipidovém složení membrán, zatímco nespecifická vazba byla nízká a prakticky konstantní v celém rozsahu pH. 3. Průběhy pH-závislostí vazby k PC-, PE- nebo PI-membránám odpovídaly změně průměrného kladného náboje na molekulách TCA, avšak křivka pro PC byla posunuta směrem k nižším pH. Průběhy závislostí vazby TCA k PS-membránám byly komplexnější a odrážely jak změnu kladného náboje na TCA, tak negativního náboje na PS molekulách. 4. Analýzou pH-závislostí vazby k PC-membránám bylo zjištěno, že poměr rozdělovacích koeficientů nenabité a nabité formy antidepresiva je pro IMI a AMI asi 50, zatímco pro DMI a NOR pouze 13. Pro dvojvrstvy připravené ze směsi PC+PE byl rozdělovací koeficient nenabité formy IMI nebo AMI dokonce 500krát větší než formy nabité, pro DMI nebo NOR jen 250krát větší. 5. pH-závislosti vazby TCA k membránám připraveným z PS nebo PS+PC ukázaly, že při fyziologickém pH je příspěvek nabitých a nenabitých molekul TCA k vazbě přibližně stejný. 6. Vazba TCA k membránám z PI+PC je realizována inkorporací nabitých i nenabitých molekul TCA. Závěry • Ukázali jsme, že pro získání základních údajů o intermolekulových silách podílejících se na zdánlivé vysokoafinní vazbě TCA a lipidovým dvojvrstvám lze použít nejen spektroskopické a kalorimetrické metody, ale i metodu vazby radioligandu. • Velikost zdánlivé vysokoafinní vazby TCA k lipidovým dvojvrstvám závisí silně na fosfolipidovém složení membrán a na pH, ale je velmi podobná pro různá TCA. • Průběhy pH-závislostí vazby TCA k membránám z elektroneutrálních fosfolipidů (PC, PE) lze interpretovat jako důsledek usnadněné inkorporace nenabitých molekul TCA do hydrofobního vnitřku dvojvrstev tvořených PC, PE nebo PC+PE. • Vyšší poměr rozdělovacích koeficientů nenabité a nabité formy pro vazbu IMI a AMI ve srovnání s DMI a NOR ukazuje, že v membránách připravených z PC nebo PC+PE ovlivňuje silně zdánlivou vysokoafinní vazbu nejen náboj, ale i metylace bočního acylového řetězce TCA . • Z měření vazby TCA k membránám obsahujícím PS vyplývá, že na zdánlivé vysokoafinní vazbě se za fyziologických podmínek silně podílí také Coulombovy interakce. Porovnání vazby TCA k membránám obsahujícím PS s membránami obsahujícími PI ukázalo, že existuje určitá specificita vazby TCA k PS, která není určena celkovým záporným nábojem jeho polární hlavičky. Jedná se zřejmě o důsledek rozdílného prostorového rozdělení náboje na povrchu membrán tvořených PS a PI. • Podíl jednotlivých nekovalentních interakcí na zdánlivé vysokoafinní vazbě TCA k lipidovým membránám silně závisí na fosfolipidovém složení membrán, tzn. že určujícím faktorem je rozložení náboje v oblasti polárních hlaviček fosfolipidů. Existuje 43

Zdeněk Fišar však i závislost vazby na typu TCA, především na metylaci či demetylaci jejich acylového řetězce.

44

Deprese, antidepresiva a membrány

2.3. Rozdělení antidepresiv mezi plasmu a červené krevní buňky Publikace 3: FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava; SIKORA, Jan; KALIŠOVÁ, Lucie; VELENOVSKÁ, Marie and NOVOTNÁ, Michaela. Distribution of antidepressants between plasma and red blood cells. Neuro Endocrinol. Lett. 2006, vol. 27, no. 3, p. 307313. Úvod Antidepresiva jsou vesměs amfifilní molekuly, které se dobře rozpouštějí ve vodné fázi a interagují s vazebnými místy na proteinech, ale současně jsou dobře rozpustné i lipidové části buněčných membrán. V rovnovážném stavu se proto nacházejí jak v prostoru mimobuněčném, tak uvnitř buněk a jsou vázány na proteiny (především albumin, α1-kyselý glykoprotein, lipoproteiny) i do lipidových dvojvrstev. Jejich kumulace v lipidových částech membrán může vést ke změnám interakcí protein-protein nebo lipid- protein a mohou indukovat změny fyzikálních vlastností lipidových dvojvrstev. Bylo ukázáno, že koncentrace antidepresiv v mozku jsou ovlivněny expresí a aktivitou Pglykoproteinu, plazmatické koncentrace antidepresiv zase ovlivňují rozdíly v jejich metabolismu, způsob aplikace, věk, kouření nebo jiné psychotropní látky. Rozsah terapeutických koncentrací antidepresiv se pohybuje od desítek do stovek ng/ml, avšak pro řadu antidepresiv nebyla terapeutická okna stanovena. Předpokládá se, že poměry koncentrací antidepresiv v červených krevních buňkách a v plazmě mohou korelovat s jejich terapeutickou účinností lépe, než celkové koncentrace v plazmě. V našich dřívějších experimentech s laboratorními potkany, kdy jsme měřili koncentrace antidepresiv v plazmě, erytrocytech, mozku a mozkových membránách, jsme vícenásobnou regresní analýzou potvrdili významnou korelaci mezi koncentracemi měřenými v homogenátu z mozku a koncentracemi v plazmě a v erytrocytárních membránách. V poslední době byly publikovány studie zabývající se vztahem rozdělení antidepresiv mezi plazmu a červené krevní buňky a možností predikce jejich terapeutických nebo toxických účinků. Rovnovážné rozdělení některých antidepresiv mezi erytrocyty a plazmu bylo studováno in vitro i in vivo, nicméně popis a analýza tohoto rozdělení nejsou postačující a pro většinu antidepresiv nebyly dosud provedeny vůbec. V této studii jsme proto měřili in vitro rozdělení sedmi různých antidepresiv v plné krvi získané od zdravých osob a ve vodné suspenzi membrán izolovaných z erytrocytů (v tzv. ghostech). Cíle Cílem této práce bylo na základě měření a analýzy rozdělení různých antidepresiv v plné krvi a v ghostech určit parametr vhodný pro snadnou a rychlou charakterizaci tohoto rozdělení a stanovit některé možnosti jeho ovlivnění. Metody Rozdělení amitriptylinu, nortriptylinu, imipraminu, desipraminu, didesmetylimipraminu, dothiepinu a citalopramu bylo měřeno in vitro v malých objemech krve nebo ghostů s použitím tritiem značených antidepresiv. V krvi byly měřeny koncentrace antidepresiv v plné krvi, v červených krevních buňkách a v plazmě; v ghostech byly měřeny celkové koncentrace v suspenzi membrán, koncentrace v ghostech a ve vodné fázi. Vhodné experimentální podmínky byly stanoveny na základě proměření závislostí časových, teplotních a koncentračních pro rozdělení amitriptylinu a nortriptylinu. Výsledky

45

Zdeněk Fišar Zavedli jsme novou jednoduchou techniku pro in vitro měření rozdělení léčiv v malých objemech vzorku a použili jsme ji pro studium rozdělení sedmi různých antidepresiv v krvi a v ghostech. Zjistili jsme, že vhodným a dostatečně specifickým parametrem pro charakterizaci rozdělení studovaných antidepresiv v krvi je poměr jejich koncentrací v erytrocytech a v plazmě. V ghostech je tímto vhodným parametrem poměr koncentrací v ghostech a ve vodě. V krvi byl uvedený poměr významně vyšší pro demetylované metabolity tricyklických antidepresiv (nortriptylin, desipramin, didesmetylimipramin) a pro citalopram. Pro imipramin a dothiepin (oba terciární aminy) byl tento poměr prakticky identický. Vazba ke ghostům byla mnohem větší než k neporušeným buňkám pro všechna studovaná antidepresiva. Citalopram vykazoval nejvyšší akumulaci v neporušených červených krevních buňkách a současně nejnižší vazbu k izolovaným membránám, což lze vysvětlit jeho nižší vazbou k plazmatickým proteinům. Závěry • Poměr koncentrace antidepresiva v červených krevních buňkách a v plazmě je parametr citlivý nejen na vazebné vlastnosti plazmatických proteinů a buněčných membrán, ale i na relativně malé změny v molekule antidepresiva, a to jak v jejím aminopropylovém řetězci, tak v oblasti aromatických kruhů. • Poměr koncentrací antidepresiva v červených krevních buňkách a v plazmě je parametr do značné míry charakteristický pro dané antidepresivum. • Vyšší vazbu antidepresiv ke ghostům lze vysvětlit nepřítomností proteinů, které v plazmě vážou značnou část léčiva a snižují tak silně koncentraci volného antidepresiva. • Lze uvažovat o hypotéze, že poměr koncentrací antidepresiva v červených krevních buňkách a v plazmě by mohl být jedním z parametrů užitečným při studiu interindividuálních rozdílů v odezvě na toto antidepresivum.

46

Deprese, antidepresiva a membrány

2.4. Vliv antidepresiv s různými farmakologickými účinky na uptake serotoninu do krevních destiček Publikace 4: FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin and KALIŠOVÁ, Lucie. Effect of pharmacologically selective antidepressants on serotonin uptake in rat platelets. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 1, p. 113-128. Úvod Primární biochemické účinky různých antidepresiv jsou velmi různorodé (viz kap. 1.3). Přesto po dlouhodobém podávání pozitivně ovlivňují klinicky stejné depresivní příznaky. Existují důkazy, že antidepresiva s farmakologicky selektivními primárními účinky ovlivňují neurotransmisi zprostředkovanou jak cílovým neurotransmiterem, tak i jinými neurotransmitery. Mechanismy propojení mezi různými systémy aktivovanými antidepresivy však nejsou dostatečně známy. Existuje shoda v tom, že za terapeutické účinky antidepresiv jsou odpovědné adaptivní buněčné změny v monoaminergních neurotransmiterových systémech. V hypotézách afektivních poruch je pozornost věnována především serotonergní aktivitě v mozku. Tato aktivita je uskutečňována a modulována především serotoninovými receptory a přenašeči a syntézou a metabolismem serotoninu. Důležitou úlohu v serotoninových hypotézách afektivních poruch má membránový přenašeč pro serotonin (SERT), který má určující úlohu v regulaci koncentrace serotoninu uvolněného do synaptické štěrbiny (viz kap. 1.4) a který je inhibován řadou antidepresiv. Vzhledem k závislosti aktivity SERT na interakcích s membránovými lipidy a cholesterolem lze uvažovat o spojení serotoninových a membránových hypotéz afektivních poruch (viz kap. 1.2.2 a 1.2.3). Není dosud známo, zda dlouhodobé podávání antidepresiv s odlišnými primárními biochemickými účinky vede ke společným adaptivním změnám např. v aktivitě SERT. Na základě předpokladu, že parametry kinetiky uptake serotoninu do krevních destiček lze používat pro sledování změn v serotonergní aktivity v mozku (viz kap. 1.4), jsme v této práci sledovali vliv různých antidepresiv na serotonergní systém laboratorních potkanů. Cíle Cílem našich experimentů bylo zjistit jaký vliv má dlouhodobé podávání antidepresiv s různými primárními farmakologickými účinky na zprostředkovaný transport serotoninu do krevních destiček. Porovnáním vlivu akutního a dlouhodobého podávání antidepresiv jsme chtěli zjistit, zda dlouhodobé podávání antidepresiv s různou farmakologickou selektivitou může mít společný vliv na aktivitu SERT. Studie byla provedena ve dvou etapách: 1. Proměření akutních účinků antidepresiv na uptake serotoninu do destiček in vitro. 2. Stanovení vlivu dlouhodobého podávání antidepresiv in vivo na uptake serotoninu do destiček. Metody Laboratorním potkanům byla podávána antidepresiva s různými primárními biochemickými účinky: desipramin (účinný neselektivní inhibitor reuptake noradrenalinu), maprotilin (selektivní inhibitor reuptake noradrenalinu), citalopram (selektivní inhibitor reuptake serotoninu), moklobemid (reverzibilní inhibitor monoaminoxidázy) a lithium (stabilizátor nálady s různými účinky na přenos nervového signálu) po dobu 4 týdnů. Destičky byly izolovány z periferní krve a aktivita SERT (charakterizovaná parametry KM, Vmax a Vmax/KM; viz kap. 1.4) byla měřena pomocí tritiem značeného serotoninu. 47

Zdeněk Fišar

Výsledky 1. Krátkodobá in vitro inkubace destiček s antidepresivy vedla k inhibici uptake serotoninu pro citalopram > desipramin > maprotilin, zatímco pro moklobemid a lithium nebyla pozorována významná změna uptake. 2. Dlouhodobé podávání antidepresiv způsobilo adaptivní změny v transmembránovém přenosu serotoninu. Statisticky významné snížení KM oproti hodnotám kontrolní skupiny bylo zjištěno po podávání maprotilinu, citalopramu, moklobemidu a lithia; podávání desipraminu tento parametr neovlivnilo. Změny parametru Vmax nebyly statisticky významné. Poměr Vmax/KM, reprezentující účinnost vychytávání serotoninu z mimobuněčného prostoru, byl zvýšen po podávání všech antidepresiv, především po citalopramu a maprotilinu. Závěry • Pozorované snížení zdánlivé Michaelisovy konstanty KM po podávání většiny antidepresiv lze interpretovat jako zvýšení afinity SERT pro substrát (serotonin). Zda může být tato změna afinity způsobena membránovými lipidy a cholesterolem bylo studováno v naší další práci (viz Příloha 5). • Nejen antidepresiva, která jsou selektivními inhibitory reuptake serotoninu (jako je citalopram), ale i antidepresiva s naprosto odlišnými primárními biochemickými účinky způsobují po dlouhodobém podávání adaptivní změny v přenosu serotoninu, které se projevují zvýšenou účinností vychytávání serotoninu z mimobuněčného prostoru. • Naše výsledky podporují hypotézu afektivních poruch založenou na předpokladu, že důležitým faktorem ve vzniku náchylnosti pro depresi je nedostatečná serotonergní aktivita a že jedním ze společných projevů dlouhodobého podávání různých antidepresiv je zvýšení této aktivity v mozku, které je umožněno mimo jiné i adaptivními změnami v membránovém přenosu serotoninu.

48

Deprese, antidepresiva a membrány

2.5. Vliv dlouhodobého podávání antidepresiv na lipidové složení mozkových membrán Publikace 5: FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin; TVRZICKÁ, Eva and STAŇKOVÁ, Barbora. Effect of long-term administration of antidepressants on the lipid composition of brain plasma membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 221-236. Úvod Je známo, že antidepresiva jsou amfifilní molekuly, které jednak více či méně specificky interagují s neurotransmiterovými receptory, přenašeči nebo katabolizujícími enzymy, jednak se akumulují v lipidové části membrán, především v membránách mozkových buněk. Např. celkové koncentrace imipraminu a jeho aktivního metabolitu desipraminu jsme v naší dřívější práci nalezli v mozkové tkáni laboratorních potkanů téměř 15krát vyšší než v neporušených erytrocytech z periferní krve, a koncentrace v plazmatických membránách izolovaných z mozku téměř 500krát vyšší než v mozkovém cytosolu, více něž 300krát vyšší než v plazmě z periferní krve a 11krát vyšší než v erytrocytárních membránách. Zda má akumulace antidepresiv v lipidové části membrán mozkových buněk úlohu v jejich terapeutických účincích není dostatečně známo, ale v jejím důsledku dochází ke změnám v pohyblivosti, uspořádání a vzájemných interakcích membránových molekul, což může ovlivnit transmembránový přenos signálu. Byla popsána řada abnormalit v lipidové homeostazi při depresi, ale spojitost mezi dlouhodobým podávání terapeutických dávek antidepresiv a změnami lipidového složení mozkových plazmatických membrán dosud nebyla prokázána. V předchozí studii (viz Příloha 4) jsme zjistili, že dlouhodobé podávání antidepresiv s různou farmakologickou selektivitou vede k adaptivním změnám v přenosu serotoninu do destiček. Za pozorované zvýšení účinnosti vychytávání serotoninu z mimobuněčného prostoru bylo odpovědné zvýšení afinity membránového přenašeče pro serotonin (SERT). Podle hypotézy o měnitelné afinitě receptorů (viz kap. 1.2.3) mohou afinitu receptorů ovlivnit jak změny proteinové struktury, tak změny lokálního membránového mikrookolí nebo přímé interakce lipid-protein. Všechna antidepresiva ovlivňují monoaminergní neurotransmisi, což zřejmě vede ke změnám genové exprese v určitých neuronech. Předpokládáme, že důsledkem těchto procesů může být nejen změna denzity receptorů, přenašečů, enzymů apod., ale i regulace lipidového složení mozkových membrán. Studovali jsme proto vliv dlouhodobého podávání vybraných antidepresiv s různými primárními mechanismy působení na fluiditu a lipidové složení plazmatických membrán izolovaných z mozku laboratorních potkanů. Cíle Cílem našich experimentů bylo zjistit jaký vliv má dlouhodobé podávání různých antidepresiv na vlastnosti a lipidové složení plazmatických membrán v mozku. Naše výsledky by měly přispět k podpoře hypotézy o úloze membránových lipidů ve vzniku a léčbě afektivních poruch. Metody Byly měřeny změny v lipidovém složení a mikroviskozitě plazmatických membrán z mozku po dlouhodobém podávání antidepresiv. Laboratorním potkanům byla podávána antidepresiva s různými primárními biochemickými účinky (desipramin, maprotilin, citalopram, moklobemid a lithium) po dobu 4 týdnů. Z mozku těchto potkanů byly izolovány plazmatické membrány a poté byla jednak změřena jejich mikroviskozita metodou fluorescenčních sond (byly použity sondy 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien, DPH, a 1-(4-trimetylamoniumfenyl)-6-fenyl49

Zdeněk Fišar 1,3,5-hexatrien, TMA-DPH), jednak byla izolována a analyzována lipidová část membrán. Celkové lipidy byly určeny vážením, cholesterol byl stanoven plynovou chromatografií a celkové fosfolipidy jako součet koncentrací fosfatidylcholinu, fosfatidyletanolaminu, fosfatidylserinu, fosfatidylinozitolu a sfingomyelinu, přičemž jednotlivé fosfolipidy byly stanoveny dvourozměrnou tenkovrstevnou chromatografií a následným měřením fosforu. Výsledky • Ve srovnání s kontrolami jsme pozorovali významné snížení v zastoupení fosfatidyletanolaminu v plazmatických membránách v mozku potkanů po podávání maprotilinu, citalopramu a moklobemidu. • Obsah membránového cholesterolu byl snížen po desipraminu a zvýšen po citalopramu nebo lithiu. • Došlo ke snížení v zastoupení neutrálních fosfolipidů po všech testovaných antidepresivech kromě desipraminu. • Snížení fosfatidylserinu bylo pozorováno po podávání maprotilinu nebo desipraminu a relativní zastoupení fosfatidylinozitolu bylo sníženo po lithiu. • Byla zjištěna významná negativní korelace mezi obsahem cholesterolu a elektroneutrálních fosfolipidů. • Mikroviskozita membrán byla jen málo snížena po desipraminu a zvýšena po citalopramu. Závěry • Ukázali jsme, že dlouhodobá léčba antidepresivy ovlivňuje lipidové složení plazmatických membrán v mozku. Struktura a dynamické vlastnosti těchto membrán ale nebyly významně změněny oproti kontrolám. • Byla podpořena hypotéza, že změny v mozkové neurotransmisi vyvolané antidepresivy mohou být alespoň částečně spojeny i s adaptivními změnami ve složení lipidové části buněčných membrán, které se mohou transformovat do procesů přímo ovlivňujících transmembránový přenos nervového signálu. • Porovnání výsledků této práce s výsledky zjištěnými v předchozí práci (viz Příloha 4) naznačuje, že zvýšená aktivita transmembránového přenosu serotoninu po dlouhodobém podávání antidepresiv může být způsobena spíše změnami interakcí cholesterol-SERT nebo fosfolipid-SERT, než změnami mikroviskozity membrán.

50

Deprese, antidepresiva a membrány

2.6. Uptake serotoninu do krevních destiček u dosud neléčených depresivních pacientů před a po léčbě citalopramem Publikace 6: FIŠAR, Zdeněk; KALIŠOVÁ, Lucie; PACLT, Ivo; ANDERS, Martin and VEVERA, Jan. Platelet serotonin uptake in drug-naïve depressive patients before and after treatment with citalopram. Psychiatry Res. (odesláno do tisku 4. 8. 2006). Úvod Zdokonalování laboratorních technik zvyšuje naději, že budou nalezeny biologické prediktory úspěšné léčby poruch nálady antidepresivy. Podle serotoninové hypotézy deprese (viz kap. 1.2.2) jsou v patogeneze deprese zahrnuty abnormality v serotonergní neurotransmisi a terapeutické účinky antidepresiv jsou spojeny s adaptivními změnami v monoaminergních systémech. Určující úlohu v udržování serotonergní funkce má membránový přenašeč pro serotonin (SERT, viz kap. 1.4), který je také hlavním cílem působení většiny antidepresiv, včetně selektivních inhibitorů zpětného vychytávání (reuptake) serotoninu (SSRI). Předpokládá se, že serotonergní systém v krevních destičkách zrcadlí změny v aktivitě centrálního serotonergního systému. Destičky jsou proto vhodný model pro studium funkce serotonergního systému v mozku při depresivní poruše a její léčbě antidepresivy. Vlastnosti SERT v krevních destičkách byly studovány dvěma způsoby: 1. vazbou imipraminu, paroxetinu nebo citalopramu k plazmatickým membránám; 2. měřením transportní aktivity SERT v neporušených destičkách. Aktivita SERT je charakterizována parametry kinetiky přenosu serotoninu, tj. maximální rychlostí transportu (Vmax), která kvantifikuje kapacitu přenosového systému, a zdánlivou Michaelisovou konstantou (KM), která je vztažena k afinitě přenašeče (viz kap. 1.4). V řadě prací byly zjištěny změny transportu serotoninu do destiček při depresi, avšak výsledky nejsou jednoznačné. Je to způsobeno především metodickými rozdíly, různým zastoupením mužů a žen ve studovaných souborech, individuálními rozdíly v rychlosti, s níž antidepresiva vykazují své terapeutické účinky, nebo různými dobami vysazení antidepresivní léčby u skupin depresivních pacientů označovaných jako neléčení. Je pouze málo prací, které se pokusily korelovat kinetické parametry přenosu serotoninu s vážností depresivních symptomů.Většinou nebyly nalezeny významné korelace mezi kinetikou přenosu serotoninu a tíží deprese. Byla však zjištěna významná korelace mezi změnou kinetiky přenosu serotoninu a zlepšením depresivních příznaků po léčbě SSRI. V některých pracích byla nalezena negativní korelace mezi parametrem KM a tíží deprese. V této práci jsme publikovali naše výsledky o změnách uptake serotoninu měřených ex vivo v krevních destičkách dosud neléčených depresivních pacientů před léčbou a po několika týdnech podávání citalopramu. Citalopram je silný a velmi selektivní inhibitor zpětného přenosu serotoninu; při jeho podávání dochází k obsazení asi 80% vazebných míst na SERT v mozku a dochází k 3- až 5-násobnému zvýšení mimobuněčných koncentrací serotoninu. Inhibice přenosu serotoninu v podmínkách in vitro je kompetitivní. Studovali jsme přenos serotoninu do krevních destiček u pacientů trpících depresí před a po podávání citalopramu; hodnoty parametrů kinetiky přenosu byly porovnány s hodnotami změřenými v destičkách kontrolních zdravých osob. Do studie byly zařazeny pouze depresivní osoby, které dosud nikdy žádné antidepresivum neužívaly (drug-naïve) a byly diagnostikovány jako depresivní poprvé. Cíle Cílem této studie bylo: 1. zkoumat vztah mezi kinetickými parametry přenosu serotoninu do krevních destiček a tíží deprese hodnocenou pomocí Hamiltonovy psychiatrické stupnice pro 51

Zdeněk Fišar posuzování deprese (HDRS) nebo Beckovy sebeposuzovací stupnice deprese (BDI); 2. studovat vliv léčby citalopramem na kinetické parametry přenosu serotoninu do destiček. Vzhledem ke zvýšené náchylnosti ke vzniku depresivní poruchy u žen a hypotéze, že snížený přenos serotoninu může odrážet specifickou náchylnost k depresi, jsme rovněž hodnotili data pro muže a ženy zvlášť. Metody U depresivních osob před léčbou (N = 26, 15 žen, 11 mužů), u týchž depresivních osob s významným zlepšením stavu po 3-7 týdnech podávání citalopramu (N = 20, 13 žen, 7 mužů) a u kontrol (N = 30, 19 žen, 11 mužů) byla provedena měření kinetiky přenosu (uptake) serotoninu do krevních destiček izolovaných z periferní krve. U zdravých kontrol byl měřen také vliv citalopramu přidaného in vitro k destičkám. Uptake serotoninu byl měřen pomocí tritiem značeného serotoninu. Výsledky • Parametry kinetiky přenosu serotoninu do destiček (Vmax, KM, Vmax/KM) nebyly u osob v depresivní fázi před léčbou významně odlišné od kontrol. • Po léčbě citalopramem se průměrná hodnota Vmax významně nezměnila. Parametr KM byl po léčbě citalopramem významně zvýšen a poměr Vmax/KM významně snížen, což lze vysvětlit jako důsledek kompetitivní inhibice vazby serotoninu k SERT citalopramem. • Průměrná hodnota Vmax byla významně nižší u podskupiny osob s těžší depresí (vyšším počátečním HDRS skóre) ve srovnání s pacienty s lehčí depresí. • Při hodnocení mužů a žen zvlášť, nebyly parametry uptake serotoninu před léčbou významně odlišné od kontrol s výjimkou významně nižší Vmax u žen před léčbou. Po léčbě citalopramem byl významně zvýšený parametr KM (resp. snížený poměr Vmax/KM) u žen i u mužů. Ve srovnání s muži měly před léčbou ženy trpící depresivní poruchou významně nižší Vmax a Vmax/KM. Po léčbě citalopramem vykazovaly ženy významně nižší KM než muži. • Významná pozitivní korelace byla zjištěna mezi Vmax a KM ve všech vyhodnocovaných skupinách depresivních osob i kontrol. Menší směrnice regresních přímek u osob trpících depresí ukazuje na nižší účinnost uptake serotoninu. • Tíže deprese hodnocená podle počátečního HDRS skóre významně negativně korelovala s Vmax před i po léčbě citalopramem. Závěry • Kinetické parametry uptake serotoninu do krevních destiček u dosud nikdy neléčených osob trpících depresivní poruchou nejsou významně odlišné od kontrol. • Pozitivní korelaci mezi parametry Vmax a KM lze interpretovat jako tendenci k udržení určité účinnosti uptake serotoninu. • Negativní korelace mezi HDRS skóre a Vmax podporuje hypotézu, že počáteční tíže depresivní poruchy může být vztažena k nižší hodnotě Vmax. • Významná negativní korelace mezi účinností uptake serotoninu a počátečním klinickým hodnocením tíže deprese potvrzuje dřívější zjištění, že uptake serotoninu do destiček může být použit jako znak účinné farmakoterapie depresivní poruchy. • Méně obvyklé pozorování podobných hodnot Vmax u pacientů i kontrol lze vysvětlit skutečností, že v naší studii byly použity vzorky krve od dosud nikdy antidepresivy neléčených osob (což nám umožnilo eliminovat vliv zbylého léčiva v plazmě nebo vliv adaptivních změn vyvolaných podáváním antidepresiva na výsledky), zatímco ve většině předchozích studií byly jako „neléčené“ označovány osoby po různé době vysazení

52

Deprese, antidepresiva a membrány

• •

podávání antidepresiva. Navíc autoři obvykle nepoužili poměr Vmax/KM pro správnou charakterizaci účinnosti uptake serotoninu. Naše výsledky potvrdily kompetitivní inhibici uptake serotoninu citalopramem jak in vitro, tak in vivo. Nepotvrdili jsme zcela dřívější výsledky, že ženy v depresivní fázi mají významně nižší Vmax oproti zdravým ženám, ale naše výsledky potvrzují, že při depresi a její léčbě existují značné rozdíly v uptake serotoninu dané pohlavím. Byla podpořena hypotéza, že nižší uptake serotoninu může odrážet zvýšenou náchylnost ke vzniku depresivních poruch u žen.

53

Zdeněk Fišar

2.7. Celková diskuse Soubor předložených prací se týká studia mechanismů účinků antidepresiv, především jejich vlivu na lipidovou část membrán a funkci membránového přenašeče pro serotonin. Experimenty byly provedeny s modelovými membránami, s krevními buňkami a mozkovou tkání pokusných zvířat a s buňkami lidské periferní krve. Cílem našich experimentů bylo popsat interakce antidepresiv s lipidovými dvojvrstvami, analyzovat rozdělení antidepresiv v krvi a přispět k poznatkům o vlivu dlouhodobého podávání různých antidepresiv na vlastnosti a lipidové složení plazmatických membrán a na transport serotoninu do buněk. Dosažené výsledky přispěly k poznání vztahu membránových změn a kinetiky transmembránového přenosu serotoninu při depresi a její léčbě a byly použity pro upřesnění a propojení serotoninových a membránových hypotéz afektivních poruch. Existuje značná akumulace antidepresiv v lipidových membránách. Úlohu membránových lipidů v mechanismech účinku antidepresiv jsme se snažili objasnit jak pokusy s modelovými membránami, tak studiemi s izolovanými buněčnými membránami či živými buňkami. V experimentech s modelovými membránami (liposomy) jsme zjistili, že vazbu antidepresiv k neutrálním nebo záporně nabitým lipidovým membránám lze velmi dobře studovat s použitím metody vazby radioligandu (Fišar et al. 2004). Přitažlivými elektrostatickými silami mezi kladně nabitými molekulami imipraminu a záporně nabitými povrchy membrán připravenými z fosfatidylserinu (PS) lze vysvětlit významně vyšší vazbu k PS-membránám ve srovnání s vazbou k membránám z fosfatidylcholinu (PC). Elektrostatické vlastnosti buněčných membrán mají tedy klíčovou úlohu v ustavení rovnovážné koncentrace antidepresiva v bezprostřední blízkosti buněčného povrchu, přičemž tato koncentrace může být řádově vyšší, než je koncentrace volného antidepresiva ve vodné fázi. V důsledku zvýšené koncentrace antidepresiv u povrchu membrány a v důsledku jejich chemických vlastností dochází k akumulaci antidepresiv v lipidové části buněčných membrán a k možnosti obsazení proteinových vazebných míst s relativně nízkou afinitou (která by podle koncentrace volného antidepresiva být obsazena neměla). Po korekci na elektrostatické efekty pomocí GouyovyChapmanovy teorie byly vazebné izotermy popsány jak povrchovými rozdělovacími koeficienty, tak vazebnými parametry, jako je rovnovážná asociační konstanta a vazebná kapacita. Analýza saturačních vazebných izoterem ukázala, že vazba antidepresiv k lipidovým dvojvrstvám je silně heterogenní a lze rozlišit zdánlivá nízkoafinní a vysokoafinní vazebná místa. Kapacita jak celkové, tak zdánlivé vysokoafinní vazby je významně vyšší u PSmembrán ve srovnání s PC-membránami. Proměřením a analýzou pH-závislostí jsme charakterizovali podíl elektrostatických a jiných nekovalentních interakcí na zdánlivé vysokoafinní vazbě různých tricyklických antidepresiv (TCA) k lipidovým dvojvrstvám (Fišar 2005). Zjistili jsme, že rozhodující vliv na zapojení jednotlivých nekovalentních interakcí v této vazbě má nejen fosfolipidové složení membrán, ale i metylace bočního acylového řetězce v molekulách TCA. Za zdánlivou vysokoafinní vazbu TCA k membránám připraveným z PC nebo fosfatidyletanolaminu (PE) jsou odpovědny především van der Waalsovy síly a hydrofobní interakce (realizující inkorporaci nenabitých molekul TCA do hydrofobního vnitřku dvojvrstvy). Důležitou úlohu ve vazbě TCA k PS-membránám mají i coulombické interakce a interakce ion-indukovaný dipól, neboť jsme pozorovali významnou vazbu jak nabitých, tak nenabitých molekul TCA k těmto membránám. Důležité je zjištění, že elektrostatické interakce mezi TCA a záporně nabitými povrchy lipidových membrán závisí nejen celkovém náboji fosfolipidů, ale i na jeho prostorovém rozložení, např. existuje určitá specificita vazby TCA k PS-dvojvrstvám. Není dosud objasněno do jaké míry se akumulace antidepresiv v blízkosti buněčných povrchů a v samotných membránách podílí na jejich terapeutických nebo vedlejších účincích.

54

Deprese, antidepresiva a membrány Může však docházet ke změnám rotační a laterální difúze, uspořádání a vzájemných interakcí membránových molekul, což ovlivňuje transmembránový přenos signálu. Naše výsledky podpořily hypotézu o úloze membránových lipidů v mechanismech účinků antidepresiv, zvláště úlohu fosfatidylserinu, který silně ovlivňuje vazbu antidepresiv k lipidové části membrány a o němž je známo, že specificky působí na funkci řady membránových proteinů zapojených do přenosu nervového signálu přes chemickou synapsi. Studovali jsme rozdělení různých antidepresiv ex vivo v lidské krvi mezi erytrocyty a plazmu (Fišar et al. 2006). Rovnovážné rozdělení antidepresiv mezi erytrocyty a plazmu silně závisí na teplotě, ale nezávisí na koncentraci antidepresiv v oblasti jejich terapeutických koncentrací. Vysoké hodnoty poměru koncentrací erytrocyty/plazma byly zjištěny pro demetylované metabolity tricyklických antidepresiv a pro citalopram. Poměr koncentrací antidepresiv v erytrocytech a v plazmě je parametr citlivý jak na typ antidepresiva, tak na vazebné vlastnosti plazmatických proteinů a buněčných membrán. Za rozdílnou vazbu antidepresiv k erytrocytům jsou odpovědné různé části jejich molekul (aromatické kruhy i aminopropylové řetězce). Předpokládáme, že účinky antidepresiv jsou poměrem jejich koncentrací v erytrocytech a v plazmě vystiženy lépe než samotnými plazmatickými koncentracemi a tento poměr může být použit jak pro studium změn při onemocnění a jeho léčbě, tak pro studium interindividuálních rozdílů v odpovědi na podávání téhož antidepresiva. Ve výše uvedených experimentech jsme potvrdili, že rozdělení léčiv v krvi se výrazně liší pro různá antidepresiva a na specificitě jejich vazby k buněčným membránám se podílí nepolární i nabité části molekul. Výsledky podpořily hypotézu, že schopnost přestupu antidepresiv z plazmy do membrán a zpět může ovlivňovat jejich terapeutické účinky a že poměr koncentrací antidepresiv v erytrocytech a v plazmě by mohl být jedním ze snadno měřitelných parametrů použitelných při predikci účinnosti léčby daným antidepresivem nebo při charakterizaci podtypu onemocnění. Na rozdílných poměrech koncentrací antidepresiv v plazmě a v erytrocytech se mohou podílet jak změny složení erytrocytárních membrán, tak změny v plazmatických proteinech. Předpokládáme, že detailní studium změn ve fosfolipidovém a cholesterolovém složení erytrocytárních membrán a ve vazebných parametrech plazmatických proteinů pro antidepresiva u osob neodpovídajících na farmakoterapii (farmakorezistentních) by mohlo pomoci ve snaze určit příčiny rozdílné odpovědi jednotlivých osob na podávání téhož antidepresiva. Cílem našich dalších experimentů byla snaha upřesnit adaptivní mechanismy související s dlouhodobým podáváním antidepresiv. Zaměřili jsme se na změny lipidového složení plazmatických membrán, na změny jejich dynamických vlastností a na ovlivnění přenosu (uptake) serotoninu zprostředkovaného membránovým přenašečem (SERT). Nejprve jsme testovali hypotézu, že dlouhodobé podávání antidepresiv s různými primárními biochemickými účinky má vliv na kinetiku přenosu serotoninu do krevních destiček. Výsledky ukázaly, že nejen antidepresiva, která jsou selektivními inhibitory reuptake serotoninu (citalopram), ale i ta, která jsou inhibitory reuptake noradrenalinu (desipramin, maprotilin), inhibitory monoaminoxidázy (moklobemid) nebo stabilizátory nálady (lithium) způsobují po dlouhodobém podávání změny v serotonergním systému destiček laboratorních potkanů (Fišar et al. 2005a). Za předpokladu, že destičky jsou dobrým modelem pro serotonergní aktivitu v mozku, by pozorované zvýšení účinnosti vychytávání mimobuněčného serotoninu mohlo být společným adaptivním účinkem dlouhodobého podávání antidepresiv s různou farmakologickou selektivitou. Naše výsledky podporují serotoninovou hypotézu afektivních poruch, která vychází z předpokladu, že nedostatečná serotonergní aktivita je významný vulnerabilní faktor ve vzniku deprese a jedním z projevů dlouhodobého podávání antidepresiv je zvýšení serotonergní aktivity. Na tomto zvýšení se

55

Zdeněk Fišar zřejmě podílí změna zpětného přenosu (reuptake) serotoninu, která může být dána jak více či méně specifickou inhibicí SERT, tak změnou jeho afinity pro serotonin. Zvýšení afinity SERT vede při nezměněné maximální rychlosti transportu k úplnějšímu vychytávání serotoninu z mimobuněčného prostoru a k možnosti jeho opakovaného využití v neurotransmisi. Pozorovaná změna kinetiky přenosu serotoninu po podávání antidepresiv laboratorním potkanům byla způsobena především změnou zdánlivé Michaelisovy konstanty KM odpovídající zvýšení afinity SERT pro serotonin. O tomto parametru je známo, že je ovlivněn i přímou interakcí s membránovým cholesterolem. Proto jsme v další práci testovali hypotézu, že změna lipidového složení plazmatických membrán v mozku může být jednou z adaptivních buněčných změn indukovaných dlouhodobým podáváním různých antidepresiv. Zjistili jsme, že podávání výše uvedených antidepresiv skutečně ovlivňuje lipidové složení buněčných membrán v mozku (Fišar et al. 2005b). Pozorované snížení relativního zastoupení fosfolipidů v mozkových plazmatických membránách bylo přitom dáno zvýšením obsahu cholesterolu (především po podávání citalopramu). Je obtížné interpretovat vztah mezi změnami v lipidovém složení mozkových plazmatických membrán a terapeutickými účinky antidepresiv, protože membránové lipidy ovlivňují řadu buněčných procesů s velmi odlišnými fyziologickými účinky. Nicméně, na základě našich výsledků se lze domnívat, že terapeutické účinky lithia a antidepresiv, která jsou selektivními inhibitory reuptake serotoninu nebo noradrenalinu, mohou souviset se zvýšením relativního zastoupení cholesterolu v buněčných membránách a s tím souvisejícími změnami funkce membránových proteinů, např. transportních proteinů pro serotonin nebo noradrenalin. Zvýšení membránového cholesterolu přitom může být specifické pro mozek, neboť v dřívějších pracích jsme ukázali, že v plazmatických membránách izolovaných z jater, srdce a ledvin nedošlo po dlouhodobém podávání antidepresiv k významným změnám poměru cholesterolu k celkovým fosfolipidům. Výraznější ovlivnění membrán mozkových buněk může být dáno skutečností, že koncentrace antidepresiv v mozku jsou mnohem vyšší než v periferii. Mikroviskozita plazmatických membrán z mozku laboratorních potkanů charakterizovaná anizotropií fluorescence membránových sond se po dlouhodobém podávání antidepresiv významně nezměnila; zvýšení relativního zastoupení cholesterolu se tedy neprojevilo v očekávaném snížení fluidity membrán. Z našich výsledků nelze jednoznačně usoudit na příčinu tohoto výsledku, neboť jsme neměřili časově rozlišenou fluorescenci. Po dlouhodobém podávání antidepresiv tedy nedochází k podstatným změnám v dynamických vlastnostech plazmatických membrán a fluidita membrán pravděpodobně nemá přímou úlohu v mechanismech jejich terapeutických účinků. Dlouhodobé podávání antidepresiv ovlivňuje výrazně parametry uptake serotoninu do destiček a relativní zastoupení cholesterolu a jednotlivých fosfolipidů, ale jen minimálně ovlivňuje stavbu a dynamické vlastnosti plazmatických membrán v mozku. Chceme-li tedy v dalších studiích analyzovat u depresivně nemocných změny v parametrech uptake serotoninu, je nezbytné získat potřebné vzorky před započetím farmakoterapie, kdy lze případné změny považovat za znaky onemocnění a nikoli za důsledek působení léčiv. Oproti tomu případné změny fluidity buněčných membrán by bylo možné považovat za charakteristiky depresivního onemocnění i v případě, že by byly měřeny až v průběhu podávání antidepresiv. Naše výsledky ukazují, že změna serotonergní aktivity po dlouhodobém podávání různých antidepresiv laboratorním potkanům může být dána zvýšením afinity SERT, způsobeném spíše změnami interakcí cholesterol-transportní protein nebo fosfolipid-transportní protein, než změnami mikroviskozity membrán. Podpořili jsme hypotézu, že dlouhodobé podávání antidepresiv může způsobit změny v lipidovém složení buněčných membrán, které se mohou transformovat do procesů přímo ovlivňujících serotonergní neurotransmisi v mozku.

56

Deprese, antidepresiva a membrány

V experimentech s laboratorními potkany jsme zjistili, že dlouhodobé podávání různých antidepresiv ovlivňuje výrazně parametry uptake serotoninu do destiček a relativní zastoupení cholesterolu a jednotlivých fosfolipidů. Výsledky získané na modelových zvířatech ale mohou být obtížně přenositelné na depresivní osoby. Studovali jsme proto kinetické parametry přenosu serotoninu do krevních destiček u dosud nikdy neléčených osob trpících depresivní poruchou před a po několika týdnech léčby citalopramem (Fišar et al., odesláno do tisku). Tíže deprese byla hodnocena pomocí Hamiltonovy psychiatrické stupnice pro posuzování deprese (HDRS). Charakteristiky přenosu serotoninu nebyly u depresivních osob před léčbou významně odlišné od zdravých kontrol. Zdánlivá Michaelisova konstanta (KM) byla po léčbě citalopramem významně zvýšena, maximální rychlost přenosu (Vmax) nezměněna a účinnost přenosu serotoninu (Vmax/KM) významně snížena, což odráží kompetitivní inhibici vazby serotoninu k SERT tímto antidepresivem. Potvrdili jsme významnou pozitivní korelaci mezi Vmax a KM, což zřejmě odráží tendenci k udržení určité hodnoty účinnosti uptake serotoninu jak u zdravých osob, tak u osob trpících depresí. Byla zjištěna významně nižší Vmax a Vmax/KM u žen před započetím léčby citalopramem, čímž jsme podpořili hypotézu, že nižší uptake serotoninu může odrážet náchylnost k depresivní poruše danou pohlavím. Významná negativní korelace mezi účinností uptake serotoninu a počátečním HDRS skóre znamená, že uptake serotoninu do destiček lze použít jako znak účinné farmakoterapie depresivní poruchy. Počáteční tíže deprese významně negativně korelovala s Vmax, což podporuje hypotézu, že počáteční tíže depresivní poruchy může být vztažena k nižším hodnotám Vmax. Anizotropie fluorescence sondy DPH charakterizující omezenost pohyblivosti malých membránových molekul v lipidové dvojvrstvě byla významně zvýšena u depresivních pacientů před léčbou proti kontrolám. Po několikatýdenní terapii citalopramem, kdy došlo k významnému zlepšení klinického stavu, již nebylo zvýšení mikroviskozity statisticky významné. Interpretace tohoto výsledku je ztížena skutečností, že nebylo použito měření časově rozlišené fluorescence a že obsah cholesterolu, nenasycenost zbytků mastných kyselin a zastoupení jednotlivých druhů fosfolipidů a glykolipidů mohou mít opačný vliv na anizotropii fluorescence DPH a vzájemně se kompenzovat. Pro podrobnou analýzu změn dynamických vlastností buněčných membrán v důsledku podávání antidepresiv bude nutno provést měření jak lipidového složení membrán tak změn v obsahu nenasycených mastných kyselin. Nicméně naše výsledky zatím ukazují, že na změny dynamických vlastností lipidových dvojvrstev má větší vliv depresivní porucha než antidepresiva. Naše výsledky demonstrují obtížnou přenositelnost údajů získaných na zvířecích modelech na člověka s depresivní poruchou, neboť ve srovnání s kontrolní skupinou byla účinnost vychytávání mimobuněčného serotoninu po dlouhodobém podávání citalopramu u laboratorních potkanů zvýšená, zatímco u depresivních osob snížená. Rozhodující úlohu v tomto rozporu má zřejmě vliv depresivní poruchy a rozdílná rychlost realizace adaptivních změn vyvolaných antidepresivem. Jak u zvířecího modelu, tak u lidí byly za změny v kinetice vychytávání serotoninu po dlouhodobém podávání citalopramu zodpovědné především změny KM, tj. změny afinity SERT. Vzhledem k vysoké lipofilitě citalopramu předpokládáme, že významnou úlohu v těchto změnách mají interakce lipid-protein. Navíc je známo, že membránový cholesterol moduluje funkční vlastnosti SERT přes specifické interakce potřebné pro stabilizaci přenašeče v jeho optimálně aktivní formě. Úlohu cholesterolu v aktivitě SERT u člověka in vivo jsme potvrdili v jiné naší studii, nezařazené do tohoto souboru, v níž jsme nalezli významně vyšší účinnost uptake serotoninu do destiček a vyšší afinitu SERT (nižší KM) u osob s hypercholesterolemií ve srovnání se skupinou zdravých kontrol nebo depresivních

57

Zdeněk Fišar osob. Zdá se, že vyšší cholesterol může indukovat snížení KM a naopak. Tyto úvahy jsou značně spekulativní, neboť nejsou dostupné údaje o změnách membránového cholesterolu nebo fosfolipidového složení v lidském mozku v průběhu léčby antidepresivy. Změny afinity transportního proteinu pro serotonin mohou být způsobeny jak kompetitivní inhibicí antidepresivem, tak změnami interakcí cholesterol-protein nebo fosfolipid-protein v membránách. Společné účinky různých antidepresiv na této úrovni přenosu signálu by mohly spočívat ve zvýšení mimobuněčných koncentrací 5-HT daných inhibicí SERT nebo snížením afinity SERT pro 5-HT. Zatímco specifickou inhibici SERT uskutečňují inhibitory reuptake serotoninu, snížení afinity SERT je možné přes ovlivnění lipidového složení membrán a interakcí lipid-SERT, tedy přes změny vlastností lipidové dvojvrstvy, které je možné vyvolat i jinými antidepresivy. Literatura k Celkové diskusi FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava and VELENOVSKÁ, Marie. Binding of imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol. Biophys. 2004, vol. 23, no. 1, p. 77-99. FIŠAR, Zdeněk. Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid bilayer membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 161-180. FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin and KALIŠOVÁ, Lucie. Effect of pharmacologically selective antidepressants on serotonin uptake in rat platelets. Gen. Physiol. Biophys. 2005a, vol. 24, no. 1, p. 113-128. FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin; TVRZICKÁ, Eva and STAŇKOVÁ, Barbora. Effect of long-term administration of antidepressants on the lipid composition of brain plasma membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005b, vol. 24, no. 2, p. 221-236. FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava; SIKORA, Jan; KALIŠOVÁ, Lucie; VELENOVSKÁ, Marie and NOVOTNÁ, Michaela. Distribution of antidepressants between plasma and red blood cells. Neuro Endocrinol. Lett. 2006, vol. 27, no. 3, p. 307-313. FIŠAR, Zdeněk; KALIŠOVÁ, Lucie; PACLT, Ivo; ANDERS, Martin and VEVERA, Jan. Platelet serotonin uptake in drug-naïve depressive patients before and after treatment with citalopram. Psychiatry Res. (odesláno do tisku 4.8.2006).

58

Deprese, antidepresiva a membrány

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK 2-AG – sn-2-arachidonoylglycerol 5-HT - 5-hydroxytryptamin, serotonin AMI - amitriptylin ATP - adenozin-5´-trifosfát, adenozintrifosfát Bcl-2 - akronym pro „B-cell lymphoma/leukemia-2 gene“, rodina proteinů zahrnutá v regulaci apoptotické buněčné smrti; stejné označení má jeden člen této rodiny s antiapoptotickými účinky BDNF - mozkový neurotrofní faktor („brain-derived neurotrophic factor“) BDI - Beckova sebeposuzovací stupnice deprese Bmax - vazebná kapacita CAD - amfifilní molekuly nesoucí za fyziologických podmínek kladný náboj („cationic amphiphilic drug“). CaM - kalmodulin cAMP - cyklický adenozinmonofosfát cGMP - cyklický guanozinmonofosfát CREB - transkripční faktor aktivovaný v odezvě na zvýšení hladin cAMP („cAMP response element-binding protein“) DAG - sn-1,2-diacylglycerol (obvykle 1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol), diacylglycerol DAT - transportní protein pro dopamin DDMI - didesmetylimipramin DMI - desipramin DPH - 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien ERK - kináza regulovaná mimobuněčným signálem G protein - protein vázající guaninové nukleotidy GA - gangliosid GABA - 4-aminomáselná kyselina (též γ-aminomáselná kyselina) GC - guanylátcykláza GPCR - receptor spřažený s G proteiny GSK-3 - [glykogensyntáza]kináza-3 HDAC - histondeacyláza HDRS - Hamiltonova psychiatrická stupnice pro posuzování deprese HPA - hypotalamus-hypofýza-kůra nadledvin HPT - hypotalamus-hypofýza-štítná žláza IMI - imipramin IP3, I(1,4,5)P3 - inozitol-1,4,5-trisfosfát, inozitoltrisfosfát IUV - jednovrstevné liposomy střední velikosti („intermediate-sized unilamellar vesicles“) Kd - zdánlivá disociační konstanta KM - zdánlivá Michaelisova konstanta LUV - velké jednovrstevné liposomy („large unilamellar vesicles“) MAO - monoaminoxidáza MAOI - inhibitor MAO MAPK - proteinkináza aktivovaná mitogenem MARKCS - myristoylovaný na alanin bohatý substrát C kinázy MKN - mezinárodní klasifikace nemocí MLV - mnohovrstevné liposomy („multilamellar vesicles“) NaSSA - noradrenergní a specifická serotonergní antidepresiva NDRI - inhibitory zpětného vychytávání noradrenalinu i dopaminu NET - transportní protein pro noradrenalin 59

Zdeněk Fišar NMDA - N-methyl-D-aspartát NO - oxid dusnatý NOR - nortriptylin NRI - selektivní inhibitory reuptake noradrenalinu PA - kyselina fosfatidová PC - fosfatidylcholin PDE - fosfodiesteráza PE - fosfatidyletanolamin PI - fosfatidylinozitol PI3K - fosfoinozitid-3-kináza PIP2 - fosfatidylinozitol-4,5-bifosfát PKA - proteinkináza typu A PKB (Akt) - proteinkináza typu B PKC - proteinkináza typu C PKCaM - proteinkináza závislá na vápníku a kalmodulinu PLC - fosfolipáza C PS - fosfatidylserin RUI - inhibitory zpětného vychytávání (reuptake) neurotransmiterů SARI - duální serotonin 2A antagonisté/inhibitory reuptake SERT (též 5-HTT) - specifický serotoninový transportní protein SM - sfingomyelin SNRI - duální inhibitory reuptake serotoninu i noradrenalinu SSRI - selektivní inhibitor reuptake serotoninu SUV - malé jednovrstevné liposomy („small unilamellar vesicles“) TCA - tricyklická antidepresiva TMA-DPH - 1-(4-trimetylamoniumfenyl)-6-fenyl-1,3,5-hexatrien, Vmax - maximální rychlost transportu serotoninu do buněk VPA - valproát

60

Deprese, antidepresiva a membrány

LITERATURA Amitai Y., Kennedy E.J., DeSandre P., Frischer H.: Distribution of amitriptyline and nortriptyline in blood: role of alpha-1-glycoprotein. Ther. Drug Monit. 1993; 15: 267-273. Austin R.P., Davis A.M., Manners C.N.: Partitioning of ionizing molecules between aqueous buffers and phospholipid vesicles. J. Pharm. Sci. 1995, 84: 1180-1183. Averbakh A., Lobyshev V.I.: Adsorption of polyvalent cations to bilayer membranes from negatively charged lipid: estimating the lipid accessibility in the case of complete binding. J. Biochem. Biophys. Methods 2000; 45: 23-44. Axelson D.A., Perel J.M., Birmaher B., Rudolph G., Nuss S., Yurasits L., Bridge J., Brent D.A.: Platelet serotonin reuptake inhibition and response to SSRIs in depressed adolescents. Am. J. Psychiatry 2005; 162: 802-804. Bakish D., Cavazzoni P., Chudzik J., Ravindran A., Hrdina P.D.: Effects of selective serotonin reuptake inhibitors on platelet serotonin parameters in major depressive disorder. Biol. Psychiatry 1997; 41: 184-190. Balgavý P., Devínsky F.: Cut-off effect in biological activities of surfactants. Adv. Colloid Interface Sci. 1996; 66, 23-63. Barenholz Y.: Cholesterol and other membrane active sterols: from membrane evolution to “rafts”. Prog. Lipid Res. 2002; 41: 1-5. Bauer M., Megret C., Lamure A., Lacabanne C., Fauran-Clavel M.-J.: Differential scanning calorimetry study of the interaction of antidepressant drugs, noradrenaline and 5-hydroxytryptamine with a membrane model. J. Pharm. Sci. 1990; 79, 897-901. Bäuerle H.-D., Seelig J.: Interaction of charged and uncharged calcium channel antagonists with phospholipid membranes. Binding equilibrium, binding enthalpy, and membrane location. Biochemistry 1991; 30, 72037211. Bennett J.P.Jr., Yamamura H.I.: Neurotransmitter, hormone, or drug receptor binding methods. In: Neurotransmitter Receptor Binding (Yamamura H.I., Enna S.J. and Kuhar M.J., Eds.), 2nd edition, New York: Raven Press, 1985, pp. 61-89. Bernik, D.L., Rivas, E.A., Arnaiz, G.R.D.: Fusion between rat-brain synaptosomes and phosphatidylserine liposomes. Neurochem. Int. 1991; 19: 611-618. Beschiaschvili G., Seelig J.: Peptide binding to lipid bilayers. Binding isotherms and ζ-potential of a cyclic somatostatin analogue. Biochemistry 1990; 29, 10995-11000. Beschiaschvili G., Seelig J.: Peptide binding to lipid bilayers. Nonclassical hydrophobic effect and membraneinduced pK shifts. Biochemistry 1992; 31, 10044-10053. Bevan, J.A., Bevan, R.D., Shreeve, S.M.: Variable receptor affinity hypothesis. FASEB J. 1989; 3:1696-1704. Bhat, G.B., Block, E.R.: Serotonin transport in reconstituted endothelial cell plasma membrane proteoliposomes: effect of hypoxia. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1992; 6: 633-638. Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato E, Crespi F.: Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp. Brain Res. 2002; 143: 191-197. Blier P., de Montigny C.: Current advantages and trends in the treatment of depression. TiPS 1994; 15, 220-226. Block, E., Edwards, D.: Effects of plasma membrane fluidity on serotonin transport by endothelial cells. Am. J. Physiol. 1987; 253: C672-C678. Boer R., Grassegger A., Schudt C., Glossmann H.: (+)-Niguldipine binds with very high affinity to Ca2+ channels and to a subtype of alpha 1-adrenoceptors. Eur. J. Pharmacol. 1989; 172: 131-145. Burch J.E., Roberts S.G., Raddats M.A.: Binding of amitriptyline and nortriptyline in plasma determined from their equilibrium distributions between red cells and plasma, and between red cells and buffer solution. Psychopharmacology 1981; 75: 262-272. Caldecott-Hazard S., Morgan D.G., DeLeon-Jones F., Overstreet D.H., Janowsky D.: Clinical and biochemical aspects of depressive disorders: II. transmitter/receptor theories. Synapse 1991; 9: 251-301. Cevc G.: Membrane electrostatics. Biochim. Biophys. Acta 1990; 1031, 311-382. Cevc G.: Electrostatic characterization of liposomes. Chem. Phys. Lipids 1993; 64, 163-186. Charney D.S., Delgado P.L.: Current concepts of the role of serotonin function in depression and anxiety. In: Serotonin Receptor Subtypes: Pharmacological Significance and Clinical Implications (Langer S.Z., Brunello N., Racagni G., Mendlewicz J., Eds.), Int. Acad. Biomed. Drug Res., vol. 1., Basel: Karger, 1992, pp. 89-104 Chiu C.-C., Huang S.-Y., Su K.-P., Lu M.-L., Huang M.-C., Chen C.-C., Shen W.W.: Polyunsaturated fatty acid deficit in patients with bipolar mania. Eur. Neuropsychopharmacol. 2003; 13: 99-103. Clevers H.: Wnt/β-catenin signaling in development and disease. Cell 2006; 127: 469-480. Cohen S.A., Müller W.E.: Age-related alterations of NMDA-receptor properties in the mouse forebrain – partial restoration by chronic phosphatidylserine treatment. Brain Res. 1992; 584: 174-180.

61

Zdeněk Fišar Cook E.H. Jr., Fletcher K.E., Wainwright M., Marks N., Yan S.-Y., Leventhal B.L.: Primary structure of the human platelet serotonin 5-HT2A receptor: identify with frontal cortex serotonin 5-HT2A receptor. J. Neurochem. 1994; 63: 465-469. Cornelius F.: Modulation of Na,K-ATPase and Na-ATPase activity by phospholipids and cholesterol. I. Steadystate kinetics. Biochemistry 2001; 40, 8842-8851. De Vriese S.R., Christophe A.B., Maes M.: In humans, the seasonal variation in poly-unsaturated fatty acids is related to the seasonal variation in violent suicide and serotonergic markers of violent suicide. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 2004; 71: 13-18. D'haenen H., De Waele M., Leysen J.E.: Platelet [3H]paroxetine binding in depressed patients. Psychiatry Res. 1988; 26: 11-17. Donati R.J., Rasenick M.M.: Chronic antidepressant treatment prevents accumulation of gsalpha in cholesterolrich, cytoskeletal-associated, plasma membrane domains (lipid rafts). Neuropsychopharmacology 2005; 30: 1238-1245. Duman R.S., Heninger G.R., Nestler E.J.: A molecular and cellular theory of depression. Arch. Gen. Psychiatry 1997; 54: 597-606. Dumas F., Lebrun M.C., Tocanne J.-F.: Is the protein/lipid hydrophobic matching principle relevant to membrane organization and functions? FEBS Lett. 1999; 458, 271-277. Egashira T., Takayama F., Yamanaka Y.: Effects of long-term treatment with dicyclic, tricyclic, tetracyclic, and noncyclic antidepressant drugs on monoamine oxidase activity in mouse brain. Gen. Pharmacol. 1996; 27(5): 773-778. Egashira T., Takayama F., Yamanaka Y.: The inhibition of monoamine oxidase activity by various antidepressants: differences found in various mammalian species. Jpn. J. Pharmacol. 1999; 81(1): 115-121. Einat H., Manji H.K.: Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder. Biol. Psychiatry 2006; 59: 1160-1171. Eisenberg M., Gresalfi T., Roccio T., McLaughlin S.: Adsorption of monovalent cations to bilayer membranes containing negative phospholipids. Biochemistry 1979; 18: 5213-5223. Engelberg H.: Low serum cholesterol and suicide. Lancet. 1992; 339: 727-729. Fielding C.J., Fielding P.E.: Relationship between cholesterol trafficking and signaling in rafts and caveolae. Biochim. Biophys. Acta 2003; 1610: 219-228. Fišar Z., Krulík R.: Buněčné membrány a jejich interakce s antidepresivy. Biol. listy 1995; 60: 81-96. Fišar Z., Krulík R., Fuksová K., Sikora J.: Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol. Biophys. 1996; 15: 51-64. Fišar Z.: Biochemické hypotézy afektivních poruch. Praha, Galén, 1998, 103 s. Fišar Z.: Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid bilayer membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005; 24: 161-180. Fišar Z.: Bipolární afektivní porucha a plasticita neuronů. Referátový výběr z psychiatrie 2006; 5:13-20. Fišar Z., Raboch J.: Depression, antidepressants, and peripheral blood components. Neuroendocrinol. Lett. 2008; 29: 17-28. Fišar Z.: Phytocannabinoids and endocannabinoids. Current Drug Abuse Reviews 2009; 2(1): 51-75. Fišar Z. a kol.: Vybrané kapitoly z biologické psychiatrie. 2. přepracované a doplněné vydání, Praha, Grada, 2009, 384 s. Fišar Z., Hroudová J.: Intracellular signalling pathways and mood disorders. Folia Biologica 2010, in press. Franke L., Schewe H.-J., Müller B., Campman V., Kitzrow W., Uebelhack R., Berghöfer A., MüllerOerlinghausen B.: Serotonergic platelet variables in unmedicated patients suffering from major depression and healthy subjects. Relationship between 5HT content and 5HT uptake. Life Sci. 2000; 67: 301-315. Franke L., Schewe H.J., Uebelhack R., Berghöfer A., Müller-Oerlinghausen B.: Platelet-5HT uptake and gastrointestinal symptoms in patients suffering from major depression. Life Sci. 2003a; 74: 521-531. Franke L., Schewe H.-J., Uebelhack R., Müller-Oerlinghausen B.: High platelet-serotonin uptake activity is associated with a rapid response in depressed patients treated with amitriptyline. Neurosci. Lett. 2003b; 345: 105-108. Frasure-Smith N., Lesperance F., Julien P.: Major depression is associated with lower omega-3 fatty acid levels in patients with recent acute coronary syndromes. Biol. Psychiatry 2004; 55: 891-896. Fuerer C., Nusse R., Ten Berge D.: Wnt signalling in development and disease. EMBO Rep. 2008; 9: 134-138. Fuller R.W.: Uptake inhibitors increase extracellular serotonin concentration measured by brain microdialysis. Life Sci. 1994; 55: 163-167. Gelbmann C.M., Müller W.E.: Chronic treatment with phosphatidylserine restores muscarinic cholinergic receptor deficit in the aged mouse brain. Neurobiol. Aging 1992; 13: 45-50. Gould T.D., Manji H.K.: Glycogen synthase kinase-3: a putative molecular target for lithium mimetic drugs. Neuropsychopharmacology 2005; 30: 1223-1237.

62

Deprese, antidepresiva a membrány Gulyaeva N., Zaslavsky A., Lechner P., Chlenov M., McConnell O., Chait A., Kipnis V., Zaslavsky B.: Relative hydrophobicity and lipophilicity of drugs measured by aqueous two-phase partitioning, octanol-buffer partitioning and HPLC. A simple model for predicting blood-brain distribution. Eur. J. Med. Chem. 2003; 38: 391-396. Healy D., Leonard B.E.: Monoamine transport in depression: kinetics and dynamics. J. Affect. Disord. 1987; 12: 91-103. Heerklotz H., Seelig J.: Titration calorimetry of surfactant-membrane partitioning and membrane solubilization. Biochim. Biophys. Acta 2000; 1508: 69-85. Heirwegh K.P., De Smedt H., Vermeir M.: Analysis of membrane-bound acceptors. A correction function for non-specific accumulation of poorly water-soluble hydrophobic or amphipathic ligands based on the ligand partition concept. Biochem Pharmacol. 1992; 43: 701-704. Herbette L.G., Chester D.W., Rhodes D.G.: Structural analysis of drug molecules in biological membranes. Biophys. J. 1986; 49: 91-94. Heron D., Shinitzky M., Hershkowitz M., Samuel D.: Lipid fluidity markedly modulates the binding of serotonin to mouse brain membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980; 77: 7463-7467. Hibbeln J.R., Palmer J.W., Davis J.M.: Are disturbances in lipid-protein interactions by phospholipase-A2 a predisposing factor in affective illness? Biol. Psychiatry 1989; 25: 945-961. Hibbeln J.R., Salem N.Jr.: Dietary polyunsaturated fatty acids and depression: when cholesterol does not satisfy. Am. J. Clin. Nutr. 1995; 62: 1-9. Horrobin D.F.: Phospholipid metabolism and depression: the possible roles of phospholipase A2 and coenzyme A-independent transacylase. Hum. Psychopharmacol. 2001; 16: 45-52. Hrdina P.D., Bakish D., Chudzik J., Ravindran A., Lapierre Y.D.: Serotonergic markers in platelets of patients with major depression: upregulation of 5-HT2 receptors. J. Psychiatry Neurosci. 1995; 20: 11-19. Hrdina P.D., Bakish D., Ravindran A., Chudzik J., Cavazzoni P., Lapierre Y.D.: Platelet serotonergic indices in major depression: up-regulation of 5-HT2A receptors unchanged by antidepressant treatment. Psychiatry Res. 1997; 66: 73-85. Hurley J.H., Tsujishita Y., Pearson M.A.: Floundering about at cell membranes: a structural view of phospholipid signaling. Curr. Opin. Struct. Biol. 2000; 10: 737-743. Jerling M.: Dosing of antidepressants-the unknown art. J. Clin. Psychopharmacol. 1995; 15: 435-439. Jørgensen K., Ipsen J.H., Mouritsen O.G., Bennett D., Zuckermann M.J.: The effects of density fluctuations on the partitioning of foreign molecules into lipid bilayers: application to anaesthetics and insecticides. Biochim. Biophys. Acta 1991; 1067: 241-253. Kaplan R.D., Mann J.J.: Altered platelet serotonin uptake kinetics in schizophrenia and depression. Life Sci. 1982; 31: 583-588. Kato T., Kato N.: Mitochondrial dysfunction in bipolar disorder. Bipolar Disord. 2000; 2: 180-190. Kato T.: Mitochondrial dysfunction as the molecular basis of bipolar disorder: therapeutic implications. CNS Drugs 2007; 21: 1-11. Kato T.: Role of mitochondrial DNA in calcium signaling abnormality in bipolar disorder. Cell Calcium 2008; 44: 92-102. Koyama T., Yamashita I.: Biological markers of depression: WHO multi-center studies and future perspective. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 1992; 16: 791-796. Krulík R., Exner J., Fuksová K., Píchová D., Beitlová D., Sikora J.: Radioimmunoassay of dibenzazepines and dibenzcycloheptanodienes in body fluids and tissues. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1991; 29: 827-832. Kunugi H., Takei N., Aoki H., Nauko S.: Low serum cholesterol in suicide attempters. Biol. Psychiatry 1997; 41: 196-200. Lachman H.M., Papolos D.F.: A molecular model for bipolar affective disorder. Med. Hypoth. 1995; 45: 255264. Langner M., Kubica K.: The electrostatics of lipid surfaces. Chem. Phys. Lipids 1999; 101: 3-35. Lawrence K.M., Katona C.L.E., Abou-Saleh M.T., Robertson M.M., Nairac B.L., Edwards D.R., Lock T., Burns R.A., Harrison D.A., Horton R.W.: Platelet 5-HT uptake sites, labelled with [3H]paroxetine, in controls and depressed patients before and after treatment with fluoxetine or lofepramine. Psychopharmacology (Berl). 1994; 115: 261-264. Lee A.G.: Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta 2003; 1612, 1-40. Lee A.G.: The effects of lipids on channel function. J. Biol. 2009; 8: 86. [ Lesch K.-P., Wolozin B.L., Murphy D.L., Riederer P.J.: Primary structure of the human platelet serotonin uptake site – identity with the brain-serotonin transporter. J. Neurochem. 1993; 60: 2319-2322. Levitan I.B., Kaczmarek L.K.: The Neuron. Cell and Molecular |Biology. 3rd Edition, Oxford: Univ. Press, 2002

63

Zdeněk Fišar Lie D.C., Colamarino S.A., Song H.J., Désiré L., Mira H., Consiglio A., Lein E.S., Jessberger S., Lansford H., Dearie A.R., Gage F.H.: Wnt signalling regulates adult hippocampal neurogenesis. Nature 2005; 437: 13701375. Lieber M.R., Lange Y., Weinstein R.S., Steck T.L.: Interaction of chlorpromazine with the human erythrocyte membrane. J. Biol. Chem. 1984; 259: 9225-9234. Luxnat M., Galla H.-J.: Partition of chlorpromazine into lipid bilayer membranes: the effect of membrane structure and composition. Biochim. Biophys. Acta 1986; 856: 274-282. Maes M., Delanghe J., Meltzer H.Y., Scharpé S., D'Hondt P., Cosyns P.: Lower degree of esterification of serum cholesterol in depression: relevance for depression and suicide research. Acta Psychiatr. Scand. 1994; 90: 252-258. Maes M., Meltzer H.Y.: The serotonin hypothesis of major depression. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress (Bloom F.E., Kupfer D.J., Eds.), New York: Raven Press, 1995; pp. 933-944. Maes M., Smith R., Christophe A, Vandoolaeghe E., Van Gastel A., Neels H., Demedts P., Wauters A., Meltzer H.Y.: Lower serum high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) in major depression and in depressed men with serious suicidal attempts: relationship with immune-inflammatory markers. Acta Psychiatr. Scand. 1997; 95: 212-221. Magnani F., Tate C.G., Wynne S., Williams C., Haase J.: Partitioning of the serotonin transporter into lipid microdomains modulates transport of serotonin. J. Biol. Chem. 2004; 279: 38770-38778. Malmgren R., Åberg-Wistedt A., Mårtensson B.: Aberrant seasonal variations of platelet serotonin uptake in endogenous depression. Biol. Psychiatry. 1989; 25: 393-402. Mandell A.J.: Non-equilibrium behavior of some brain enzyme and receptor systems. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1984; 24: 237-274. Manji H.K.: G proteins: implications for psychiatry. Am. J. Psychiatry 1992; 149: 746-760. Manji H.K., Quiroz J.A., Sporn J., Payne J.L., Denicoff K., Gray N.A., Zarate C.A.Jr., Charney D.S.: Enhancing neuronal plasticity and cellular resilience to develop novel, improved therapeutics for difficult-to-treat depression. Biol. Psychiatry 2003; 53: 707-742. Mårtensson B., Wagner A., Beck O., Brodin K., Montero D., Åsberg M.: Effects of clomipramine treatment on cerebrospinal fluid monoamine metabolites and platelet [3H]-imipramine binding and serotonin uptake and concentration in major depressive disorder. Acta Psychiatr. Scand. 1991; 83: 125-133. Mason R.P., Campbell S.F., Wang S.-D., Herbette L.G.: Comparison of location and binding for the positively charged 1,4-dihydropyridine calcium channel antagonist amlodipine with uncharged drugs of this class in cardiac membranes. Mol. Pharmacol. 1989; 36, 634-640. Mason R.P., Rhodes D.G., Herbette L.G.: Reevaluating equilibrium and kinetic binding parameters for lipophilic drugs based on a structural model for drug interaction with biological membranes. J. Med. Chem. 1991; 34: 869-777. Matthies H.J., Han Q., Shields A., Wright J., Moore J.L., Winder D.G., Galli A., Blakely R.D.: Subcellular localization of the antidepressant-sensitive norepinephrine transporter. BMC Neurosci. 2009; 10: 65. McLaughlin S.: The electrostatic properties of membranes. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1989; 18: 113136. Mellerup E., Langer S.Z., et al.: Validity of imipramine platelet binding sites as a biological marker of endogenous depression. A World Health Organization Collaborative Study. Pharmacopsychiatry 1990; 23: 113-117. Meltzer H.Y., Arora R.C., Baber R., Tricou B.J.: Serotonin uptake in blood platelets of psychiatric patients. Arch. Gen. Psychiatry 1981; 38: 1322-1326. Meltzer H.Y., Lowy M.T.: The serotonin hypothesis of depression. In: Psychopharmacology: The Third Generation of Progress (Meltzer H.Y., Ed.), New York: Raven Press, 1987; 513-526. Mesulam M.M.: Neuroplasticity failure in Alzheimer's disease: bridging the gap between plaques and tangles. Neuron 1999; 24: 521-529. Meyer J.H., Wilson A.A., Ginovart N., Goulding V., Hussey D., Hood K., Houle S.: Occupancy of serotonin transporters by paroxetine and citalopram during treatment of depression: a [11C]DASB PET imaging study. Am. J. Psychiatry 2001; 158: 1843-1849. Meyer J.H., Ginovart N., Boovariwala A., Sagrati S., Hussey D., Garcia A., Young T., Praschak-Rieder N., Wilson A.A., Houle S.: Elevated monoamine oxidase a levels in the brain: an explanation for the monoamine imbalance of major depression. Arch. Gen. Psychiatry 2006; 63: 1209-1216. Miyake K., Fukuchi H., Kitaura T., Kimura M., Sarai K., Nakahara T.: Pharmacokinetics of amitriptyline and its demethylated metabolite in serum and specific brain regions of rats after acute and chronic administration of amitriptyline. J. Pharmaceutical Sci. 1990; 79: 288-291. Moor M., Honegger U.E., Wiesmann U.N.: Organspecific, qualitative changes in the phospholipid composition of rats after chronic administration of the antidepressant drug desipramine. Biochem. Pharmacol. 1988; 37: 2035-2039.

64

Deprese, antidepresiva a membrány Mosior M., McLaughlin S.: Electrostatics and reduction of dimensionality produce apparent cooperativity when basic peptides bind to acidic lipids in membranes. Biochim. Biophys. Acta 1992; 1105: 185-187. Mouritsen O.G., Jørgensen K.: Micro-, nano- and meso-scale heterogeneity of lipid bilayers and its influence on macroscopic membrane properties. Mol. Membr. Biol. 1995; 12: 15-20. Mueller P.S., Davis J.M., Bunney W.E.Jr., Weil-Malherbe H., Cardon P.V.: Plasma free fatty acids concentration in depressive illness. Arch. Gen. Psychiatry 1970; 22: 216-221. Müller H.-J., Luxnat M., Galla H.-J.: Lateral diffusion of small solutes and partition of amphipaths in defect structures of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta 1986; 856: 283-289. Nagy A., Johansson R.: Plasma levels of imipramine and desipramine in man after different routes of administration. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1985; 290: 145-160. Nestler E.J., Barrot M., DiLeone R.J., Eisch A.J., Gold S.J., Monteggia L.M.: Neurobiology of depression. Neuron 2002; 34: 13-25. Neuger J., El Khoury A., Kjellman B.F., Wahlund B., Åberg-Wistedt A., Stain-Malmgren R.: Platelet serotonin functions in untreated major depression. Psychiatry Res. 1999; 85: 189-198. Neuger J., Wistedt B., Åberg-Wistedt A., Stain-Malmgren R.: Effect of citalopram treatment on relationship between platelet serotonin functions and the Karolinska scales of personality in panic patients. J. Clin. Psychopharmacol. 2002; 22: 400-405. New R.R.C.: Preparation of liposomes. In: Liposomes. A Practical Approach (New R.R.C., Ed.), Oxford: Oxford Univ. Press, 1990, pp. 33-104. Nishizawa S., Benkelfat C., Young S.N., Leyton M., Mzengeza S., de Montigny C., Blier P., Diksic M.: Differences between males and females in rates of serotonin synthesis in human brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997; 94: 5308-5313. Owens M.J., Nemeroff C.B.: Role of serotonin in the pathophysiology of depression: focus on the serotonin transporter. Clin. Chem. 1994; 40: 288-295. Peet M., Murphy B., Shay J., Horrobin D.: Depletion of omega-3 fatty acid levels in red blood cell membranes of depressive patients. Biol. Psychiatry 1998; 43: 315-319. Peet M., Stokes C.: Omega-3 fatty acids in the treatment of psychiatric disorders. Drugs 2005; 65: 1051-1059. Penttinen J.: Hypothesis: low serum cholesterol, suicide, and interleukin-2. Am. J. Epidemiol. 1995; 141: 716718. Perel J.M., Stiller R.L., Glassman A.H.: Studies on plasma level/effect relationships in imipramine therapy. Commun Psychopharmacol 1978; 2: 429-439. Perry P.J., Zeilmann C., Arndt S.: Tricyclic antidepressant concentrations in plasma: an estimate of their sensitivity and specificity as a predictor of response. J. Clin. Psychopharmacol. 1994; 14: 230-240. Pettegrew J.W., Panchalingam K., McClure R.J., Gershon S., Muenz L.R., Levine J.: Effects of chronic lithium administration on rat brain phosphatidylinozitol cycle constituents, membrane phospholipids and amino acids. Bipolar Disord. 2001; 3: 189-201. Pfrieger F.W.: Role of cholesterol in synapse formation and function. Biochim Biophys Acta 2003; 1610: 271280. Plenge P., Wiborg O.: High- and low-affinity binding of S-citalopram to the human serotonin transporter mutated at 20 putatively important amino acid positions. Neurosci. Lett. 2005; 383: 203-208. Racagni G., Brunello N.: Transynaptic mechanisms in the action of antidepressant drugs. Trends Pharmacol. Sci. 1984; 5 (12): 527-531. Rando R.R.: Regulation of protein kinase-C activity by lipids. FASEB J. 1988; 2: 2348-2355. Rausch J.L.: An hypothesis of initial conditions: receptor-effector systems as determinants of psychopharmacologic drug response. Int. J. Neuropsychopharmacol. 1998; 1: 137-151. Rausch J.L., Moeller F.G., Johnson M.E.: Initial platelet serotonin (5-HT) transport kinetics predict nortriptyline treatment outcome. J. Clin. Psychopharmacol. 2003; 23: 138-144. Rausch J.L., Johnson M.E., Li J., Hutcheson J., Carr B.M, Corley K.M., Gowans A.B., Smith J.: Serotonin transport kinetics correlated between human platelets and brain synaptosomes. Psychopharmacol. (Berl.) 2005; 180: 391-398. Reith M.E.A., Sershen H., Lajtha A.: Binding of imipramine and cocaine to a model lipid membrane: comparison with binding to brain membranes. Neurochem. Res. 1984; 9: 965-977. Riant P., Urien S., Albengres E., Renouard A., Tillement J.P.: Effects of the binding of imipramine to erythrocytes and plasma proteins on its transport through the rat blood-brain barrier. J. Neurochem. 1988; 51: 421-425. Risch S.C., Leighton Y.H., Janowsky D.S.: Plasma levels of tricyclic antidepressants and clinical efficacy: review of the literature - part I. J. Clin. Psychiatry 1979; 40: 9-21. Rybakowski J.K., Lehmann W.: Decreased activity of erythrocyte membrane ATPases in depression and schizophrenia. Neuropsychobiol. 1994; 30: 11-14.

65

Zdeněk Fišar Salem N.Jr., Niebylski C.D.: The nervous system has an absolute molecular species requirement for proper function. Mol. Membr. Biol. 1995; 12: 131-134. Sanchez C., Hyttel J.: Comparison of the effects of antidepressants and their metabolites on reuptake of biogenic amines and on receptor binding. Cell. Mol. Neurobiol. 1999; 19: 467-489. Sandermann H., Duncan T.M.: Lipid-dependent membrane enzymes – kinetic modeling of the activation of protein-kinase-C by phosphatidylserine. Biochim. Biophys. Acta 1991; 1069: 235-240. Sanganahalli B.G., Joshi P.G., Joshi N.B.: Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane dynamics-a fluorescence spectroscopic study. Life Sci. 2000; 68: 81-90. Scanlon S.M., Williams D.C., Schloss P.: Membrane cholesterol modulates serotonin transporter activity. Biochemistry 2001; 40: 10507-10513. Schloss P., Henn F.A.: New insights into the mechanisms of antidepressant therapy. Pharmacol. Ther. 2004; 102: 47-60. Schreier S., Malheiros S.V.P., de Paula E.: Surface active drugs: self-association and interaction with membranes and surfactants. Physicochemical and biological aspects. Biochim. Biophys. Acta 2000; 1508: 210-234. Schwyzer R.: New principle in QSAR: membrane requirements. J. Recept. Res. 1991; 11: 45-57. Seelig J., Nebel S., Ganz P., Bruns C.: Electrostatic and nonpolar peptide-membrane interactions. Lipid binding and functional properties of somatostatin analogues of charge z = +1 to z = +3. Biochemistry 1993; 32: 9714-9721. Sengupta N., Datta S.C., Sengupta D.: Platelet and erythrocyte membrane lipid and phospholipid patterns in different types of mental patients. Biochem. Med. 1981; 25: 267-275. Seydel J.K., Coats E.A., Cordes H.P., Wiese M.: Drug membrane interaction and the importance for drug transport, distribution, accumulation, efficacy and resistance. Arch. Pharm. (Weinheim) 1994; 327: 601-610. Seydel J.K., Wiese M.: Drug-Membrane Interactions. Analysis, Drug Distribution, Modeling. Weinheim: WileyVCH, 2002. Shaltiel G., Chen G., Manji H.K.: Neurotrophic signaling cascades in the pathophysiology and treatment of bipolar disorder. Curr. Opin. Pharmacol. 2007; 7: 22-26. Shinitzky M.: Membrane fluidity and receptor function. In: Membrane Fluidity (Kates M., Manson L.A., Eds.), New York: Plenum Publ. Corp., 1984, pp. 585-601. Siever L.J., Kahn R.S., Lawlor B.A., Trestman R.L., Lawrence T.L., Coccaro E.F.: II. Critical issues in defining the role of serotonin in psychiatric disorders. Pharmacol. Rev. 1991; 43: 509-525. Sikora J., Krulík R., Beitlová D., Příhoda P.: Plasma levels of antidepressants after their withdrawal. Endocrinol. Exp. 1990; 24: 221-227. Singer S.J., Nicolson G.L.: The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 1972; 175: 720731. Srivastava L.K., Kazmi S.M., Blume A.J., Mishra R.K.: Reconstitution of affinity-purified dopamine D2 receptor binding activities by specific lipids. Biochim. Biophys. Acta 1987; 900: 175-182. Stahl S.M.: Serotonin receptors and the mechanism of action of antidepressant drugs: postmortem, platelet, and neuroendocrine studies in depressed patients. In: Serotonin IA Receptors in Depression and Anxiety (Stahl S.M., Gastpar M., Keppel Hesselink J.M., Traber J., Eds.), New York: Raven Press, 1992, pp. 119-134 Stahl S.M.: 5HT1A receptors and pharmacotherapy. Is serotonin receptor down-regulation linked to the mechanism of action of antidepressant drugs? Psychopharmacol. Bull. 1994; 30: 39-43. Stahl S. M. (2000): Essential Psychopharmacology. Neuroscientific Basis and Practical Applications. Second Edition, Cambridge Univ. Press, Cambridge Stain-Malmgren R., Khoury A.E., Ǻberg-Wistedt A., Tham A.: Serotonergic function in major depression and effect of sertraline and paroxetine treatment. Int. Clin. Psychopharmacol. 2001; 16: 93-101. Stankowski S.: Surface charging by large multivalent molecules. Extending the standard Gouy-Chapman treatment. Biophys. J. 1991; 60: 341-351. Stork C., Renshaw P.F.: Mitochondrial dysfunction in bipolar disorder: evidence from magnetic resonance spectroscopy research. Mol. Psychiatry. 2005; 10(10): 900-919. Su K.P.: Biological mechanism of antidepressant effect of omega-3 fatty acids: how does fish oil act as a 'mindbody interface'? Neurosignals 2009; 17: 144-152. Sulser F., Janowsky A.J., Okada F., Manier D.H., Mobley P.L.: Regulation of recognition and action function of the norepinephrine (NE) receptor-coupled adenylate cyclase system in brain: implications for the therapy of depression. Neuropharmacol. 1983; 22: 425-431. Švestka a kol.: Psychofarmaka v klinické praxi. Praha: Grada , 1995. Terao T., Nakamura J., Yoshimura R., Ohmori O., Takahashi N., Kojima H., Soeda S., Shinkai T., Nakano H., Okuno T.: Relationship between serum cholesterol levels and meta-chlorophenylpiperazine-induced cortisol responses in healthy men and women. Psychiatry Res. 2000; 96: 167-173. Tieleman D.P., Marrink S.J., Berendsen H.J.C.: A computer perspective of membranes: molecular dynamics studies of lipid bilayer systems. Biochim. Biophys. Acta 1997; 1331: 235-270.

66

Deprese, antidepresiva a membrány Toplak H., Zuehlke R., Loidl S., Hermetter A., Honegger U.E., Wiesmann U.N.: Single and multiple desipramine exposures of cultured cells. Changes in cellular anisotropy and in lipid composition of whole cells and of plasma membranes. Biochem. Pharmacol. 1990; 39: 1437-1443. Tsakiris S., Deliconstantinos G.: Influence of phosphatidylserine on (Na+/K+)-stimulated ATPase and acetylcholinesterase activities of dog brain synaptosomal plasma-membranes. Biochem. J. 1984; 220: 301307. Tuomisto J., Tukiainen E., Ahlfors U. G.: Decreased uptake of 5-hydroxytryptamine in blood platelets from patients with endogenous depression. Psychopharmacology 1979; 65: 141-147. Vevera J., Žukov I., Morcinek T., Papežová H.: Cholesterol concentrations in violent and non-violent women suicide attempters. Eur. Psychiatry 2003; 18: 23-27. Vinař O.: Psychofarmaka. Minimum pro praxi. Praha: Triton, 1998. Vinokur V.A., Gubachev Iu.M.: The effect of antidepressants on lipid metabolism and the clinical course in IHD. Ter. Arkh. 1994; 66: 76-80. Wada T., Penninger J.M.: Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation. Oncogene 2004; 23: 28382849. Xia Z., Ying G., Hansson A.L., Karlsson H., Xie Y., Bergstrand A., DePierre J.W., Nässberger L.: Antidepressant-induced lipidosis with special reference to tricyclic compounds. Prog. Neurobiol. 2000; 60: 501-512. Young G., Conquer J.: Omega-3 fatty acids and neuropsychiatric disorders. Reprod. Nutr. Dev. 2005; 45: 1-28. Zachowski A., Durand P.: Biphasic nature of the binding of cationic amphipaths with artificial and biological membranes. Biochim. Biophys. Acta 1988; 937: 411-416. Zarate C.A.Jr., Singh J., Manji H.K.: Cellular plasticity cascades: targets for the development of novel therapeutics for bipolar disorder. Biol. Psychiatry 2006; 59: 1006-1020. Zimmer G.: Fluidity of cell membranes in the presence of some drugs and inhibitors. In: Membrane Fluidity (Kates M.and Manson L.A., Eds.), Plenum Publ. Corp., 1984, pp. 169-203.

67