Univerzita Karlova v Praze 1. lékařská fakulta Psychiatrická klinika
Deprese, antidepresiva a buněčné a modelové membrány
HABILITAČNÍ PRÁCE
Praha 2005
RNDr. Zdeněk Fišar, CSc.
Není dosud jasné, co je primární příčinou vzniku většiny duševních poruch a jaké jsou molekulární mechanismy vedoucí k terapeutickým účinkům používaných psychofarmak. Pokrok v této oblasti je spojen s hlubším poznáním normálních funkcí mozku. Při formulaci a ověřování hypotéz o molekulárních mechanismech provázejících vznik nebo léčbu poruch nálady vycházíme hlavně z pozorování mechanismů účinků látek s antidepresivními účinky. Místem primárního účinku většiny antidepresiv je plazmatická membrána. Vzhledem k amfifilním vlastnostem těchto léčiv dochází nejen k vazbě na specifická proteinová vazebná místa, ale i k významným interakcím s lipidovou částí buněčných membrán. Protože terapeutické účinky antidepresiv se projevují až po delší době jejich podávání, je nutné poznat i jimi vyvolané adaptivní buněčné změny. Jedná se o mezioborový výzkum využívající především biochemické, genetické, molekulárně biologické, biofyzikální a farmakologické modely a metody. Předložená práce shrnuje výsledky studia interakcí antidepresiv s modelovými a buněčnými membránami, které jsem publikoval v letech 1996-2005. Protože řada výsledků má své kořeny i v době dřívější, rád bych zde poděkoval nejen spoluautorům prezentovaných prací, ale i ostatním spolupracovníkům, kteří se podíleli na výzkumu mechanismů účinků antidepresiv. Za podporu, kterou věnovali a věnují výzkumné činnosti naší laboratoře, děkuji prof. MUDr. Jiřímu Rabochovi, DrSc., přednostovi Psychiatrické kliniky, a prof. MUDr. Petru Zvolskému, DrSc., emeritnímu přednostovi Psychiatrické kliniky. Tuto práci věnuji své ženě Andree s díky za stálou podporu, inspiraci a pochopení.
V Praze, 26. září 2005
2
Deprese, antidepresiva a buněčné a modelové membrány OBSAH
1.
ÚVOD DO PROBLEMATIKY...........................................................................................................4 1.1. SYNAPTICKÝ PŘENOS NERVOVÉHO SIGNÁLU ..........................................................................................6 1.1.1. Neurony a chemické synapse ...........................................................................................................6 1.1.2. Složení, stavba a struktura membrán ...............................................................................................7 1.1.3. Dynamika buněčných membrán .....................................................................................................10 1.1.4. Membránové receptory pro neurotransmitery ...............................................................................12 1.1.5. Membránové přenašeče pro neurotransmitery ..............................................................................14 1.1.6. Membránové lipidy a přenos signálu přes chemickou synapsi ......................................................15 1.2. HYPOTÉZY PORUCH NÁLADY (AFEKTIVNÍCH PORUCH)..........................................................................17 1.2.1. Východiska hypotéz........................................................................................................................17 1.2.2. Serotoninové hypotézy....................................................................................................................18 1.2.3. Biofyzikální (membránové) hypotézy .............................................................................................19 1.3. ANTIDEPRESIVA ....................................................................................................................................22 1.4. MEMBRÁNOVÝ PŘENAŠEČ PRO SEROTONIN PŘI DEPRESI A JEJÍ LÉČBĚ ...................................................25 1.5. INTERAKCE ANTIDEPRESIV S LIPIDOVÝMI MEMBRÁNAMI ......................................................................28 1.5.1. Modelové membrány (liposomy) ....................................................................................................28 1.5.2. Interakce antidepresivum-lipidová membrána...............................................................................29 1.5.3. Lokalizace antidepresiv v membráně .............................................................................................31 1.6. LITERATURA .........................................................................................................................................34
2.
SHRNUTÍ K SOUBORU PUBLIKOVANÝCH PRACÍ ................................................................42 2.1. 2.2. 2.3. 2.4.
VAZBA IMIPRAMINU K FOSFOLIPIDOVÝM DVOJVRSTVÁM MĚŘENÁ METODOU VAZBY RADIOLIGANDU .42 INTERAKCE TRICYKLICKÝCH ANTIDEPRESIV S FOSFOLIPIDOVÝMI DVOJVRSTVAMI ...............................47 ROZDĚLENÍ IMIPRAMINU MEZI KREVNÍ BUŇKY, PLAZMU A MOZEK .......................................................50 VLIV ANTIDEPRESIV S RŮZNÝMI FARMAKOLOGICKÝMI ÚČINKY NA UPTAKE SEROTONINU DO TROMBOCYTŮ .......................................................................................................................................52 2.5. VLIV DLOUHODOBÉHO PODÁVÁNÍ ANTIDEPRESIV NA LIPIDOVÉ SLOŽENÍ MOZKOVÝCH MEMBRÁN .......55 2.6. UPTAKE SEROTONINU DO TROMBOCYTŮ U DEPRESIVNÍCH PACIENTŮ BĚHEM LÉČBY ............................58 2.7. TRANSPORT TRIJODTHYRONINU DO ERYTROCYTŮ JAKO MEMBRÁNOVÝ PARAMETR DEPRESE...............60 2.8. FARMAKOLOGICKY INDUKOVANÉ SNÍŽENÍ CHOLESTEROLU VYVOLÁVÁ ČASOVĚ OMEZENÉ ZMĚNY V SEROTONERGNÍ TRANSMISI ................................................................................................................63 2.9. CELKOVÁ DISKUSE ...............................................................................................................................66 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK...........................................................................................................................75 3.
SEZNAM PUBLIKACÍ TVOŘÍCÍCH PODKLAD HABILITAČNÍ PRÁCE.............................77
4.
CITAČNÍ OHLASY ..........................................................................................................................81
5.
PŘÍLOHY...........................................................................................................................................90
3
1. ÚVOD DO PROBLEMATIKY Poznatky o molekulární podstatě poruch nálady (afektivních poruch) jsou získávány především na základě studia mechanismů účinků antidepresiv. Předpokládá se, že poruchy nálady jsou způsobeny narušením neurotransmise v mozku, především poruchami v přenosu signálu přes chemické synapse, a antidepresiva uskutečňují své terapeutické účinky specifickým ovlivněním funkce membránových a nitrobuněčných složek zapojených do tohoto přenosu. Synaptický přenos nervového signálu umožňují specifické membránové proteiny (receptory, iontové kanály, přenašeče, enzymy) a přímé i adaptivní účinky antidepresiv na jejich funkce jsou studovány jak in vitro na izolovaných membránách a buňkách, tak in vivo na zvířecích modelech nebo ex vivo na lidských krevních buňkách. Významnou úlohu mají v přenosu signálu i membránové lipidy a steroly, o nichž je známo, že netvoří pouze strukturní základ buněčných membrán, ale jsou substráty pro některé druhé posly a volné mastné kyseliny a ovlivňují aktivitu řady proteinů přes změnu jejich pohyblivosti v membráně nebo přes specifické interakce lipid-protein. Vzhledem k chemickým vlastnostem antidepresiv dochází nejen k jejich vazbě na specifická proteinová vazebná místa, ale i k jejich akumulaci v lipidové části buněčných membrán. Dosud nejsou známy všechny důsledky těchto interakcí pro účinnost nebo pro vedlejší účinky farmakoterapie. Interakce antidepresivum-membránové molekuly jsou studovány na modelových fosfolipidových dvojvrstvách, na rekonstituovaných systémech (proteoliposomech), na izolovaných membránách i na celých buňkách. Nepřímo lze interakce léčivo-buněčná membrána charakterizovat pomocí sekundárních reakcí, nebo přes ovlivnění procesů vyvolaných jinými biologicky aktivními látkami. Metody používané pro toto studium využívají často látky značené radionuklidy, jadernou magnetickou rezonanci, diferenciální skanovací kalorimetrii, elektronovou paramagnetickou rezonanci, neutronovou difrakci a v neposlední řadě fluorescenční spektroskopii. V našich experimentech jsme používali hlavně tritiem značená antidepresiva, neurotransmitery nebo fosfolipidy a fluorescenční sondy. Tento přístup nám umožnil studovat interakce membránaléčivo s minimálními vedlejšími efekty informačních molekul (sond, značek) na vlastnosti membrán. Naše práce je příspěvkem k poznání úlohy membránových lipidů a funkce membránového přenašeče pro serotonin při depresivní poruše a její léčbě. Vycházeli jsme ze skutečnosti, že
4
značná část makromolekul podílejících se na přenosu signálu je vázána v buněčných membránách a vyžaduje pro svou správnou funkci interakce s určitými membránovými lipidy. V úvodní části jsou stručně shrnuty hlavní poznatky o synaptickém přenosu nervového signálu a o synaptických membránách. Následují základní informace o biochemických a biofyzikálních hypotézách afektivních poruch a o mechanismech působení antidepresiv. Podrobněji jsou uvedeny dosud známé poznatky o úloze membránového přenašeče pro serotonin při depresi a její léčbě a možnosti studia interakcí antidepresiv s membránovými lipidy. V druhé části následuje stručné shrnutí k pracím, které jsem publikoval na téma interakcí antidepresiv s modelovými i buněčnými membránami a jejichž kopie jsou v příloze. Komentáře a shrnutí k jednotlivým publikacím jsou řazeny dle složitosti zkoumaných objektů, od modelových membrán k laboratorním zvířatům a lidským subjektům; zakončeny jsou celkovou diskusí. Následuje seznam publikovaných prací tvořících podklad této habilitační práce, citační ohlasy a přílohy.
5
1.1. Synaptický přenos nervového signálu 1.1.1. Neurony a chemické synapse Neurony obsahují podobné buněčné složky jako jiné buňky, tj. plazmatickou membránu, jádro, jadérko, jadernou membránu, neuroplazmu a organely. Důležitou složku neuronů tvoří cytoskelet - heterogenní síť vláknitých struktur, kterou tvoří navzájem interagující a propojené sítě z mikrotubulů, neurofilament a mikrofilament. Jedná se o vysoce dynamický systém napojený na další buněčné struktury, především na membránu. Vzhledem k velké spotřebě energie nutné pro udržování transmembránových iontových gradientů jsou neurony zvláště bohaté na mitochondrie. Polyribosomy lokalizované na drsném endoplazmatickém retikulu poblíž jádra tvoří Nisslovu substanci, která produkuje specifické neuronové proteiny. Kromě běžných buněčných složek mají neurony morfologicky a funkčně odlišné oblasti, které se specializují na přenos signálu: axon, dendrity a synapse. Struktura a funkce neuronů je známa z buněčné biologie (Fišar a Jirák 2001, Levitan and Kaczmarek 2002). Synapse jsou specializované oblasti buněčného kontaktu umožňující přenos informace z jednoho neuronu na druhý nebo mezi neurony a receptorovými nebo efektorovými buňkami. Jsou tvořeny presynaptickou částí (obsahující mimo jiné synaptické váčky s neurotransmitery) spolu s přilehlou postsynaptickou (obvykle dendritickou) membránou. Presynaptická a postsynaptická část jsou odděleny synaptickou štěrbinou (20-30 nm). V průměru vytváří každý neuron asi 1000 synaptických zakončení, ale počet synapsí na jednom postsynaptickém neuronu může dosahovat i několika desítek tisíc; pokrývají potom značnou část membrán dendritů i buněčného těla. Může docházet jak k velké konvergenci signálů na jeden neuron od stovek až tisíců presynaptických buněk, tak k divergenci signálu z jednoho presynaptického neuronu na desítky nebo stovky postsynaptických buněk. Účinky přenosu signálu na postsynaptickou část mohou být excitační nebo inhibiční; teprve jejich součet v daném čase určuje, zda vznikne akční potenciál nebo nitrobuněčná odezva. Neuroaktivní látky (mediátory, transmitery, působky) podílející se na přenosu nervového signálu lze dělit na neurotransmitery, neuromodulátory a neurohormony. Neurotransmitery jsou látky uvolňované z neuronu do synaptické štěrbiny a ovlivňující aktivitu (excitovatelnost) pouze jedné nebo několika prostorově blízkých buněk. Zajišťují tak mezibuněčný přenos nervového signálu. Z chemického hlediska se jedná především o monoaminy, aminokyseliny a peptidy. Neurohormony jsou hormony syntetizované a uvolňované nervovým systémem a poté přenášené krví ke vzdáleným cílovým buňkám, jejichž aktivitu ovlivňují. Klasickými neurohormony jsou oxytocin a vasopressin. Rozdělení 6
na neurotransmitery a neurohormony lze považovat za zastaralé, neboť je známo, že řada neuropeptidů působí nejen dálkově jako neurohormony, ale i lokálně jako neurotransmitery. Podobně některé klasické neurotransmitery se mohou uvolňovat do krevního oběhu a působit jako hormony. Zvláštní skupinu látek podílejících se na mezibuněčném přenosu signálu tvoří růstové faktory, které stimulují proliferaci buněk a podporují jejich přežití. Neurotransmisí se rozumí aktivní, časově omezený a nevratný proces, jehož výsledkem je přenos nervového signálu mezi neurony. Po příchodu depolarizační vlny na presynaptické zakončení je elektrický signál převeden (transdukován) na chemický (uvolnění neurotransmiteru), a ten může být v postsynaptické části převeden buď zpět na elektrický signál, nebo na nitrobuněčnou změnu. Sekrece neurotransmiteru z presynaptické části následuje po vstupu kalcia přes napěťově řízené Ca2+-kanály. Množství uvolněného mediátoru přitom závisí na koncentraci nitrobuněčného kalcia. Všechny procesy související s přenosem signálu přes chemickou synapsi nejsou dosud známy.
1.1.2. Složení, stavba a struktura membrán Mnoho základních buněčných procesů, včetně zpracování informací, nitrobuněčného a mezibuněčného přenosu signálu, se odehrává v plazmatických membránách nebo jiných membránových strukturách. V této kapitole jsou uvedeny pouze základní informace o složení, stavbě a vlastnostech membrán s ohledem na jejich funkci při šíření nervového signálu a na úlohu lipidové dvojvrstvy. Buněčné membrány jsou tvořeny především lipidy, steroly, proteiny, glykolipidy a glykoproteiny. Mají jednotný organizační princip, tj. uspořádání většiny membránových lipidů do dvojné vrstvy (o tloušťce kolem 6 nm) s více či méně zanořenými proteiny. Značná část buněčných proteinů se vyskytuje pouze v membránách, kde zajišťují řadu specifických procesů spojených s transportními a rozpoznávacími funkcemi membrán (pumpy, nosiče, iontové kanály, receptory, enzymy apod.). Umožňují udržování iontových a metabolických gradientů nezbytných pro většinu buněčných funkcí včetně přenosu nervového signálu. Lipidová část membrán je směsí fosfolipidů, glykolipidů, sfingomyelinu, kardiolipinu a cholesterolu, přičemž zastoupení těchto složek je v různých membránách velmi odlišné. Hlavními lipidovými složkami buněčných membrán jsou glycerofosfolipidy, jejichž základem je sn-glycerol-3-fosfát esterifikovaný na uhlících C(1) (sn-1) a C(2) (sn-2) mastnými kyselinami a na fosforylové skupině další skupinou. Nejběžněji se vyskytující glycerofosfolipidy jsou fosfatidylcholin (lecitin), fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin,
7
fosfatidylinositol, fosfatidylglycerol, difosfatidylglycerol (kardiolipin) a kyselina fosfatidová. Podstatnou složkou některých biomembrán jsou sfingolipidy odvozené ze sfingosinu, resp. z jeho N-acyl-derivátů, ceramidů. Nejčastější sfingolipidy jsou sfingomyeliny (sfingofosfolipidy), cerebrosidy (jednoduché sfingoglykolipidy, které nemají fosfátovou skupinu a obvykle ani náboj; v mozkových buňkách se hojně vyskytují galaktocerebrosidy) a gangliosidy (sfingoglykolipidy, které obsahují alespoň jeden zbytek kyseliny sialové; tvoří asi 6% mozkových lipidů a jsou lokalizovány v povrchové vrstvě membrány, kde mají receptorovou funkci). Významnou složkou živočišných membrán je cholesterol, který se vyskytuje hlavně v plazmatických membránách, méně v membránách organel. Cholesterol je hlavní membránový aktivní sterol, který může významně ovlivňovat buněčný růst a aktivitu membránových proteinů (receptorů, přenašečů, iontových kanálů apod.) jak přímými interakcemi, tak i nepřímo, přes změny struktury a fyzikálních vlastností lipidových dvojných vrstev. V mozku je neesterifikovaný cholesterol přítomen ve vysokých koncentracích v plazmatických membránách neuronů a glií. Protože cholesterol neprostupuje hematoencefalickou bariérou, je syntetizován v mozku. Jeho obrat má důležitou úlohu při opravě a přetváření neuronů. Dle známého a stále upřesňovaného modelu tekuté mozaiky (Singer and Nicolson 1972) mají buněčné membrány tyto základní vlastnosti: •
strukturní základ membrány je tvořen lipidovou dvojvrstvou, v níž jsou zakotveny integrální a periferní proteiny;
•
existuje heterogenita lipidového složení v rovině horizontální i vertikální; cholesterol je lokalizován mezi řetězci mastných kyselin;
•
za fyziologických podmínek je lipidová dvojvrstva v „tekutém“ stavu;
•
translační a rotační pohyblivost membránových molekul umožňuje specifické procesy v membráně, např. transmembránový přenos signálu.
Tento model byl doplněn o existenci nedvojvrstevných struktur v membránách a o výskyt mikrodomén („raftů“) s odlišným zastoupením cholesterolu a určitých fosfolipidů (Mouritsen et al. 1995, Barenholz 2002). Integrální proteiny jsou v lipidové dvojvrstvě „rozpuštěny“ prostřednictvím hydrofobních a elektrostatických interakcí a vodíkových vazeb. Specifické interakce lipid-protein jsou umožněny nejen vazebnými vlastnostmi proteinů, ale i polárními hlavičkami lipidů, zbytky nenasycených mastných kyselin v molekulách lipidů a asymetrií lipidové dvojvrstvy (na vnější straně jsou lokalizovány především fosfatidylcholin,
8
sfingomyelin, galaktocelebrosid; na vnitřní straně hlavně fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylinositol). Membránové lipidy netvoří jen strukturní základ membrány, ale jsou také substráty fosfolipas, modulátory funkce řady membránových proteinů a podílejí se na biosyntéze jiných biologicky aktivních molekul, např. druhých poslů, volných mastných kyselin nebo endogenních kanabinoidů. Transportní mechanismy zahrnující receptory, iontové kanály, enzymy, přenašeče a pumpy jsou často regulovány membránovými lipidy a cholesterolem, samotnými i uspořádanými do lipidové dvojvrstvy (Shinitzky 1984, Srivastava et al. 1987, Scanlon et al. 2001, Cornelius 2001, Lee 2003). Celkově lze říci, že úloha membránových lipidů a mastných kyselin v buněčných funkcích není zdaleka poznána. Rovněž existence a úloha hustotních fluktuací nebo oblastí s nenáhodným lipidovým složením (mikrodomén) je teprve studována (Barenholz 2002, Fielding and Fielding 2003). Polární hlavičky membránových lipidů jsou obvykle tvořeny záporně nabitou fosfátovou skupinou s navázanými kladnými, zápornými, zwiterionickými nebo nenabitými skupinami. Specifické ovlivnění funkcí membránových proteinů těmito polárními hlavičkami lze vysvětlit na základě elektrostatických interakcí, jejichž specificita je dána prostorovým rozložením náboje jak na povrchu proteinu, tak v polárních hlavičkách interagujících lipidů. Obtížnější je vysvětlení vysoké variability v délce a nasycenosti acylových řetězců, protože pro udržení struktury, uspořádanosti a určité fluidity lipidové dvojvrstvy není tato různorodost nezbytná. Pravděpodobným vysvětlením je možnost přizpůsobení se tvaru acylových řetězců hydrofobnímu povrchu membránových proteinů („hydrophobic matching“), což umožňuje specificky ovlivňovat vlastnosti proteinů (Dumas et al. 1999). Proteiny vázající fosfolipidy jsou důležitou složkou přenosu buněčných signálů, přenosu molekul a metabolismu (Hurley et al. 2000). Saturované a mononenasycené mastné kyseliny mohou být syntetizovány v těle de novo, avšak esenciální polynenasycené mastné kyseliny jsou syntetizovány z potravních prekursorů, linolové kyseliny (18:2) pro n-6 skupinu a α-linolenové kyseliny (18:3) pro n-3 skupinu mastných kyselin. V neuronech se vyskytují především arachidonová kyselina (20:4, n-6) a dokosahexaenová kyselina (22:6, n-3) vázané v pozici sn-2 glycerolového základu fosfolipidů. Arachidonát je uvolňován hydrolýzou fosfolipasou A2 nebo kombinovaným působením fosfolipasy C a diglycerid lipasy. Většina arachidonátu je inkorporována ve fosfatidylcholinu, fosfatidylinositolu a fosfatidyletanolaminu. V mozku tvoří arachidonát až 10% z celkových mastných kyselin.
9
Úloha cholesterolu, fosfolipidů a esenciálních nenasycených mastných kyselin je již dlouho diskutována v některých biochemických hypotézách afektivních poruch, které vycházejí z předpokladu, že pro správný vývoj a funkci mozkových struktur je nezbytný normální neuronální lipidový metabolismus (viz kap. 1.2). Mechanismy působení n-3 a n-6 nenasycených mastných kyselin při normální nebo patologické funkci neuronální aktivity nejsou dostatečně známy, ale je zřejmé, že dokosahexaenová kyselina je hlavní n-3 masná kyselina v mozku a že eikosapentaenová kyselina má významnou úlohu jako protizánětlivý prekursor (Peet and Stokes 2005, Young and Conquer 2005). Kyselina arachidonová je u lidí prekursorem prostaglandinů, prostacyklinů, tromboxanů a leukotrienů (Jiang et al. 1998). Obecně mohou být nenasycené mastné kyseliny spojeny s mnoha aspekty fukce neuronů,včetně neurotransmise, fluidity membrán, regulace receptorů, přenašečů a iontových kanálů a genové exprese.
1.1.3. Dynamika buněčných membrán Malé membránové molekuly jsou za fyziologických podmínek vysoce pohyblivé v rovině dvojné vrstvy (podélná, laterální difúze). Se snížením teploty dochází k uspořádávání membránových molekul a ke snížení jejich laterální i rotační pohyblivosti. Přechod lipidové dvojné vrstvy z fluidního do zatuhlého stavu je přirovnáván k přechodu ze stavu tekutého krystalu do stavu tuhého gelu. Teplota, při níž dochází k přechodu membrány, nebo její části, ze stavu gelového do stavu fluidního se nazývá teplota fázového přechodu. Na tekutost, resp. fluiditu lipidové dvojné vrstvy má kromě teploty vliv také přítomnost cholesterolu (snižuje tekutost membrán), stupeň nenasycenosti zbytků mastných kyselin, přítomnost glykolipidů a dále řada fyzikálních a chemických činitelů. Příčná difúze (flip-flop, překlápění), tj. přesmyk lipidové molekuly z vnější části dvojné vrstvy do vnitřní nebo naopak, je velmi pomalá (poločas několik dnů); v buňkách může být toto překlápění katalyzováno flipasami. Rovněž nepolární zbytky mastných kyselin v lipidech jsou za fyziologických podmínek vysoce pohyblivé. Celkový tvar molekul membránových lipidů, je určen hlavně konformací jejich uhlovodíkových řetězců. Změny prostorového uspořádání jsou přitom umožněny relativně volnými rotacemi kolem jednoduchých vazeb C−C. Dvojné vazby nenasycených mastných kyselin mají cis (Z) konfiguraci, což způsobuje rigidní ohyb o 30° v uhlovodíkovém řetězci. Větší zastoupení dvojných vazeb potom vede k velmi složitým tvarům molekul. Vyšší obsah zbytků nenasycených mastných kyselin nebo nižší obsah cholesterolu zvyšují pohyblivost molekul v membráně.
10
K pozorovatelným změnám v distribuci molekul v rovině membrány dochází během milisekund, k rotační reorientaci malých molekul nebo částí makromolekul dochází během nanosekund. Heterogenita membrán způsobuje, že laterální pohyblivost molekul v rovině membrány je menší, než by odpovídalo jejich rotační pohyblivosti. Experimentálně je však často sledován jen jeden typ difúzního pohybu molekul v membráně. Nejčastěji se pro tato měření používají spektroskopické metody (elektronová spinová rezonance, jaderná magnetická rezonance, fluorescence, Ramanův rozptyl). Tyto metody jsou založeny na měření určitého signálu (rezonanční absorpce energie vysokofrekvenčního magnetického pole, fluorescenční nebo rozptýlené záření apod.) molekul, skupin či atomů lokalizovaných v membráně. Tyto zpravodajské skupiny jsou buď membráně vlastní, nebo jsou do ní vneseny (spinové sondy, radionuklidem značené molekuly, fluorescenční sondy a značky, rezonanční značky pro Ramanův rozptyl atd.); jedná se o molekuly citlivé na vlastnosti mikrookolí, které samy výrazně neovlivňují sledovaný systém, ale umožňují detekovat změny jeho vlastností. V prvním přiblížení se lze dívat na vnitřek lipidové dvojvrstvy biologické membrány jako na homogenní neasociovanou izotropní nestlačitelnou kapalinu, jejíž vlastnosti jsou charakterizovány jedinou konstantou. V analogii s mechanikou kontinua je tato konstanta označována jako viskozita nebo fluidita, resp. tekutost. V případě lipidových dvojvrstev bylo zavedeno označení mikroviskozita. Protože viskozitu vnitřního prostředí dvojvrstvy nelze měřit přímo, je experimentálně určován parametr, který je s ní v přímé souvislosti. Je jím obvykle difúzní konstanta, korelační čas nebo relaxační čas. V druhém přiblížení bereme biologické membrány jako částečně anizotropní – tj. pohyb v membráně je omezený a rozlišujeme pohyb v rovině lipidové dvojvrstvy a kolmo k ní. Stanovení změn fluidity membrán na základě měření anizotropie ustálené fluorescence vhodné sondy je pro svou jednoduchost velmi rozšířeno. Vzhledem k anizotropii buněčných membrán, ztrácí ale pojem fluidity či mikroviskozity membrán původní fyzikální význam a v těchto měřeních se jedná pouze o kvalitativní postižení změn uspořádání mikrookolí sondy a její pohyblivosti v membráně. Pomocí časově rozlišené fluorescence bylo potvrzeno, že anizotropie fluorescence určená stacionární metodou v sobě obsahuje jak informaci o pohyblivosti membránových molekul, tak informaci o jejich průměrném uspořádání. Podrobnější informace o možnostech fluorescenční spektroskopie při studiu dynamiky buněčných membrán publikoval autor na internetu (http://psych.lf1.cuni.cz/fluorescence/Default.htm).
11
1.1.4. Membránové receptory pro neurotransmitery Receptor je makromolekula specializovaná na přenos informace. Lze jej definovat jako specifické vazebné místo s funkčními vztahy. Funkčními vztahy se při synaptickém přenosu nervového signálu rozumí procesy vyvolané vazbou neurotransmiteru nebo jeho agonisty, které vedou ke změně propustnosti synaptické membrány pro určité ionty nebo k jiným specifickým změnám vlastností cílových buněk, jako je regulace obecného metabolického stavu, syntézy, ukládání a uvolňování neurotransmiterů, senzibility receptorů, organizace a struktury cytoskeletu, genové exprese apod. Receptory jsou dynamické systémy, které se mohou přizpůsobovat vnějším podmínkám a vyrovnávat tak např. změny v dostupnosti neurotransmiterů; může být regulován jak počet receptorů, tak jejich vlastnosti. Neurotransmiterové receptory buď obsahují interní iontový kanál, nebo se jedná o receptorový komplex zahrnující kromě specifického vazebného místa i transdukční prvek (obvykle G protein) a efektorový systém (iontové kanály, adenylátcyklasy, fosfolipasy C), který zajišťuje buněčnou odezvu. Pro určitý neurotransmiter existuje obvykle více podtypů receptorů, které mohou nebo nemusí mít stejný nebo podobný transdukční prvek a efektorový systém. Na synapsích se mohou vyskytovat postsynaptické i presynaptické receptory, což umožňuje zpětnovazebné a křížové ovlivňování přenosu signálu. Více informací o vlastnostech, klasifikaci a funkci receptorů umožňujících synaptický přenos signálu lze nalézt např. v monografii Fišar a Jirák (2001). Interakce neurotransmiteru se specifickým receptorem nastává na jednom nebo více aktivních (specifických) rozpoznávacích místech a vede k aktivaci receptorového systému. Různá léčiva soutěží s neurotransmiterem o obsazení těchto rozpoznávacích míst (kompetitivní látky). Působení některých psychofarmak může být úplně nebo částečně identické jako u fyziologického ligandu; hovoříme o úplných nebo částečných (parciálních) agonistech. Podobně u inhibitorů mluvíme o úplných nebo parciálních antagonistech. Inverzní agonisté vedou k opačnému efektu než plní agonisté. Nehledě ke kompetici, vytvářejí některé látky ireverzibilní vazby se skupinami v rozpoznávacích místech - jsou označovány jako blokátory. Látky, které se vážou k vazebným místům na receptorovém komplexu, tak že nedochází ke kompetici s neurotransmiterem, jsou označovány jako nekompetitivní. Konformační změny vyvolané vazbou nekompetitivních látek však mohou ovlivnit jak vazbu neurotransmiteru k receptoru, tak přenos signálu o jeho vazbě.
12
Biochemické hypotézy afektivních poruch (Fišar 1998) se nejčastěji zabývají narušením přenosu signálů v mozku vyvolaném aktivací receptorů a napojeném na G proteiny a systémy druhých poslů (cyklické nukleotidy, metabolity fosfatidylinositolu a kyseliny arachidonové, kalcium, oxid dusnatý). Dvě základní přenosové cesty nejčastěji uvažované v patofyziologii afektivních poruch a jejich léčbě jsou adenylátcyklasová a fosfoinositidová. Adenylátcyklasový systém je aktivován nebo inhibován těmito typy a podtypy receptorů (Fišar a Jirák 2001): adrenergními α2 a β, serotoninovými 5-HT1,4,6,7, dopaminovými D1 až D5, GABAB, metabotropními glutamátovými mglu2,3,4,6,7,8, histaminovými H2,3, muskarinovými acetylcholinovými M2,4, opioidními a dalšími peptidovými. Receptorem aktivovaná hydrolýza fosfoinositidů se uskutečňuje přes receptory serotoninové 5-HT2, adrenergní α1, dopaminové D2, metabotropní glutámátové mglu1,5, histaminové H1, muskarinové acetylcholinové M1,3,5 a řadu peptidových. Část přenosové cesty, která se uskutečňuje v plazmatické membráně, může být přímo ovlivněna membránovými lipidy. V receptorových studiích (Bennett and Yamamura 1985) je vazba ligandu k membránovým vazebným místům charakterizována zdánlivou disociační konstantou, Kd, a vazebnou kapacitou, Bmax. Disociační konstanta je základní veličina pro charakterizaci vztahu struktura-funkce při interakcích neurotransmiteru nebo léčiva se specifickým receptorem. Lze ji použít i pro charakterizaci interakcí léčivo-lipidová dvojvrstva, kdy je však poněkud odlišný způsob interpretace. Vyšší afinita intramembránového vazebného místa může být způsobena jak vhodnější strukturou ligandu vzhledem k požadavkům vazebného místa, tak vyšší koncentrací nebo vhodnější konformací a orientací ligandů lokalizovaných v lipidové dvojvrstvě (Schwyzer 1991, Mason et al. 1991). Pro výpočet parametrů saturovatelné specifické vazby k intramembránovým místům je tedy vhodnější použít koncentraci léčiva v dvojvrstvě místo koncentrace volného ligandu. Spočtená efektivní disociační konstanta potom odpovídá zdánlivé disociační konstantě korigované na akumulaci ligandu (Heirwegh et al. 1992). Vynásobením zdánlivé disociační konstanty hodnotou rozdělovacího koeficientu je ovšem provedena jen velmi hrubá korekce, neboť distribuce léčiva v membráně je nerovnoměrná - v určitých oblastech lipidové dvojvrstvy mohou vznikat mnohem vyšší koncentrace ligandu, než odpovídá průměrné hodnotě. Na druhou stranu nemusí být vazebná místa zanořena v dvojvrstvě stejně hluboko jako je lokalizována většina léčiva (Mason et al. 1991). Nesmíme však zapomenout, že uvedené korekce platí jen pro vazbu k intramembránovým místům, neboť pro vazebná místa na povrchu membrány (přístupná přímo z vodného prostředí) může mít akumulace léčiva v lipidové dvojvrstvě opačný efekt a projevit
13
se jako úbytek dostupného volného ligandu; disociační konstanta takových míst je nepřímo vztažena k rozdělovacímu koeficientu léčiva v membránách (Boer et al. 1989).
1.1.5. Membránové přenašeče pro neurotransmitery Pro funkci chemické synapse mají významnou úlohu membránové přenašeče (transportní proteiny, transportéry, „carriers“), které zajišťují vychytávání neurotransmiterů ze synaptické štěrbiny a jejich přenos do presynaptického zakončení (transportní proteiny závislé na Na+ a Cl-) nebo do gliových buněk (transportní proteiny závislé na Na+);další typ přenašečů (závislých na pH) umožňuje ukládání neurotransmiterů do zásobních váčků. Transportní proteiny závislé na Na+ a Cl- slouží k přenosu serotoninu (5-hydroxytryptamin, 5HT), noradrenalinu, dopaminu, γ-aminomáselné kyseliny (GABA), prolinu, glycinu, taurinu, betainu a kreatinu; přenašeče závislé na Na+ transportují glutamát a aspartát. Předpokládá se, že zpětné vychytávání (reuptake) neurotransmiterů pomocí přenašečů má 3 základní důsledky: 1. koncentrace neurotransmiteru ve štěrbině je snižována rychleji, než při pouhé difúzi; to umožňuje lepší časové rozlišení následných dějů; 2. účinky neurotransmiteru jsou omezeny na menší plochu, což dovoluje funkci anatomicky blízkých chemicky identických ale funkčně odlišných synapsí; 3. neurotransmiter může být po přenosu do presynaptického zakončení znovu použit. Předmětem studia při duševních poruchách jsou především transportní proteiny pro noradrenalin (NET), dopamin (DAT) a serotonin (SERT, 5-HTT) které se oproti ostatním přenašečům vyznačují vysokoafinní vazbou kokainu (inhibice reuptake dopaminu), amfetaminů, metylendioxymetamfetaminu (extáze) a metamfetaminu (indukce obráceného transportu serotoninovým a dopaminovým přenašečem), fencyklidinu (mimo jiné inhibuje uptake 5-HT). NET, SERT nebo oba tyto přenašeče jsou inhibovány řadou různých antidepresiv (viz kap. 1.3). Inhibice zpětného vychytávání neurotransmiteru vede ke zvýšení jeho mimobuněčné koncentrace, takže receptory mohou být aktivovány déle a na větší vzdálenost od synapse. Citlivost membránových přenašečů na ionty a napětí může určovat rychlost transmembránového přenosu (uptake) neurotransmiterů. V případě SERT se Na+, Cl- a protonovaný 5-HT+ vážou k přenašeči a tvoří komplex, který poté podléhá konformační změně, při níž dochází k přenosu přes membránu a uvolnění neurotransmiteru a iontů do cytoplazmy. Poté se nitrobuněčné K+ váže k SERT a podporuje jeho reorientaci tak, aby byl
14
připraven na další transportní cyklus. Nitrobuněčné K+ tedy urychluje vtok 5-HT. Vazba antagonistů k SERT je rovněž závislá na mimobuněčném Na+, např. pro vazbu imipraminu vyžaduje SERT přítomnost 2 iontů Na+ na 1 molekulu imipraminu. Preferovaný stav SERT v živých buňkách je homo-oligomerní forma ze 4 molekul.
1.1.6. Membránové lipidy a přenos signálu přes chemickou synapsi Klasické schéma přenosu signálu přes chemickou synapsi zahrnuje tyto kroky: 1. metabolismus, syntéza a ukládání neurotransmiteru v presynaptickém zakončení; 2. exocytóza neurotransmiteru (v odezvě na vtok Ca2+ po depolarizaci presynaptické membrány); 3. difúze neurotransmiteru v synaptické štěrbině, jeho interakce s receptorem; 4. aktivace receptoru vedoucí k otevření iontového kanálu, nebo k aktivaci G proteinu, vnitřní guanylátcyklasy nebo vnitřní tyrozinkinasy; 5. metabolismus nebo zpětné vychytávání neurotransmiteru. Přenos signálu je přirovnáván k 3-dimenzionální síti, v níž se podráždění v jednom bodě přenese do všech dalších a v níž existuje řada kladných i záporných zpětných vazeb. Receptory s tyrozinkinasovou aktivitou se na synaptickém přenosu nepodílejí přímo; jejich agonisty jsou růstové faktory, cytokiny a některé hormony. Nové metody a zdokonalující se přístroje umožňují získávání nových poznatků o převodu (transdukci) signálu z úrovně elektrické (depolarizace membrány) na chemickou (neurotransmitery) a zpět na elektrickou (membránový potenciál) nebo nitrobuněčnou (fosforylace proteinů a související procesy). Tyto nové poznatky lze využít při hledání molekulárních mechanismů vzniku duševních poruch a účinků psychofarmak. Pozornost je věnována nejen buněčným proteinům (neutransmiterovým receptorům a přenašečům, iontovým kanálům, enzymům, transkripčním faktorům), ale i úloze membránových lipidů a cholesterolu. Je známo, že značná část molekul podílejících se na přenosu signálu je lokalizována v buněčných membránách. Jedná se nejen o receptory, iontové kanály a transportní proteiny, ale i o G proteiny, adenylátcyklasy, fosfolipasy a další enzymy. Na funkci těchto membránových proteinů mají značný vliv vlastnosti lipidové dvojvrstvy tvořené především fosfolipidy, glykolipidy a steroly. Integrální proteiny jsou v membránách obaleny vrstvou tzv. „anulárních“ lipidů, na jejichž vazbě k proteinu se podílejí jednak hydrofobní a van der
15
Waalsovy síly uvnitř membrány, jednak Coulombovy interakce a interakce ion-indukovaný dipól mezi nabitými a polárními skupinami v povrchové části membrány. Obecně je vliv lipidů na membránové proteiny dán jednak specifickými interakcemi lipidprotein podmiňujícími aktivitu řady enzymů, jednak nespecifickým ovlivněním dostupnosti vazebných míst (ovlivněním vertikálního pohybu proteinů) nebo vzájemných interakcí jednotlivých podjednotek vícesložkových systémů (změnami pohyblivosti těchto složek v rovině membrány). Byla popsána úloha fyzikálního stavu membrány (charakterizovaná fluiditou) ve funkci řady membránových receptorů, enzymů a iontových kanálů. Maximální receptorová odezva závisí nejen na hustotě vazebných míst, ale i na jejich přístupnosti pro agonisty rozpuštěné ve vodné fázi a na rychlosti, s níž může docházet ke vzájemným interakcím mezi jednotlivými membránovými složkami podílejícími se na přenosu signálu. Dostupnost i pohyblivost membránových integrálních proteinů závisí jak na fluiditě lipidové dvojné vrstvy, tak na existenci nehomogenit v jejím složení (mikrodomény) a stavbě (nedvojvrstevné struktury). Vliv cholesterolu, lipidového složení a dynamických vlastností (mikroviskozity) membrán byl popsán jak pro vlastnosti neurotransmiterových receptorů (acetylcholinových, serotoninových, α1- a β-adrenergních, peptidových, GABA a dalších), tak pro aktivitu řady membránových enzymů a přenašečů (různých ATPas, proteinkinas C, fosfolipas C, membránového přenašeče pro serotonin) (Lee 2003, Scanlon 2001, Pfrieger 2003) podílejících se na přenosu nervového signálu. V aktivaci různých enzymových a receptorových systémů hrají významnou roli především kyselé fosfolipidy (Tsakiris a Deliconstantinos 1984, Rando 1988, Bernik et al. 1991, Sandermann a Duncan 1991, Gelbmann and Müller 1992, Cohen a Müller 1992). Rovněž metylace fosfolipidů v synaptických membránách nebo podávání fosfolipidů in vivo může zřejmě ovlivnit adaptaci receptorů na chronické podávání antidepresiv (Sulser et al. 1983, Racagni and Brunello 1984). Membránové fosfolipidy se podílejí na přenosu nervového signálu nejen jako strukturní základ membrány, ale i jako substráty fosfolipas C, D, A2, tj. jako zdroje některých druhých poslů - diacylglycerolu (DAG), inositoltrisfosfátu (IP3, I(1,4,5)P3) a volných mastných kyselin, především kyseliny arachidonové. Předpokládá se např., že poruchy v interakcích lipid-protein způsobené nadměrnou aktivitou fosfolipasy A2 mohou vést ke vzniku afektivních poruch.
16
1.2. Hypotézy poruch nálady (afektivních poruch) Afektivní poruchy se projevují patickou náladou. Projevují se v epizodách trvajících od několika dnů do několika měsíců. Při bipolárním typu onemocnění dochází ke střídání depresivních a manických epizod, unipolární typ zahrnuje pouze epizody depresivní, nebo pouze manické. Nástup onemocnění je obvykle mezi 20. a 35. rokem. Těžká podoba postihuje asi 1% populace a je obvykle dobře léčitelná. Pro klasifikaci poruch nálady je používána 10. revize Mezinárodní klasifikace nemocí (MKN-10, http://www3.who.int/icd/vol1htm2003/fricd.htm, http://www.pcp.lf3.cuni.cz/pcpout/is/CD/mkn_klin/obsah.htm). Na léčbu antidepresivy odpovídá 65-70% pacientů. Zlepšení nastává po asi 10-20 dnech farmakoterapie a je úplné po asi 8 týdnech. Elektrokonvulzivní terapie je účinná v dalších 1015%. Tedy asi 20% depresivních pacientů je rezistentních ke všem známým formám terapie. Neléčená deprese vede ve 25-30% k pokusu o sebevraždu. Molekulární mechanismy a procesy vedoucí ke vniku poruch nálady, ani mechanismy odpovědné za terapeutické účinky antidepresiv nejsou dosud dostatečně poznány.
1.2.1. Východiska hypotéz Psychiatrie se snaží popsat a vysvětlit mechanismy vzniku a léčby afektivních poruch pomocí vlastních i mezioborových metod a postupů, tj. na základě poznatků získaných jak klinickým hodnocením nemocných, tak měřením fyziologických, biochemických a biofyzikálních změn. Zdroje poznatků vedoucích k formulaci hypotéz afektivních poruch se nacházejí především v oblasti biologické (genetické faktory, účinky stresu, chronobiologické aspekty), imunoneuroendokrinní (změny aktivity osy hypotalamus-hypofýza-kůra nadledvin, HPA, nebo osy hypotalamus-hypofýza-štítná žláza, HPT, uvolňování cytokinů apod.), neurochemické a biofyzikální (funkce membránových receptorů, iontových kanálů, přenašečů, G proteinů, lipidů, systémů druhých poslů, membránových i nitrobuněčných enzymů). Afektivní poruchy mají ve své patogeneze významnou genetickou složku, zvláště bipolární onemocnění, i když odpovídající geny nebyly dosud nalezeny. Z biochemického a elektrofyziologického hlediska existuje řada důkazů, že se na vzniku afektivních poruch podílejí poruchy v přenosu nervového signálu, především v oblasti chemických synapsí. Svědčí pro to jednak změny koncentrací neurotransmiterů a jejich metabolitů v mozku, mozkomíšním moku a plazmě u některých depresivních pacientů, jednak dosud známé účinky
17
antidepresiv. Pozornost je věnována především poruchám ve funkci noradrenergních a serotonergních systémů v mozku, ale v různých hypotézách jsou uvažovány i další neurotransmiterové systémy, především cholinergní, GABAergní, dopaminergní a peptidergní. Na postreceptorové úrovni se předpokládají změny ve funkci G proteinů, druhých poslů, proteinkinas a fosfatas a transkripčních faktorů. Z hlediska biofyzikálního jsou studovány především interakce antidepresiv s membránami a změny vlastností buněčných membrán při onemocnění a jeho léčbě. Ze zřejmých etických důvodů je studium přenosu signálu a receptorových a postreceptorových procesů na úrovni synapsí zatím omezeno na použití nepřímých postupů a na experimenty s použitím zvířecích a buněčných modelů (synaptosomy, izolované synaptické membrány, leukocyty, trombocyty, erytrocyty, buněčné kultury, liposomy). Cenné poznatky o fungování mozku in vivo přinášejí zobrazovací a funkční zobrazovací metody (pozitronová emisní tomografie, jednofotononvá emisní tomografie, funkční magnetická rezonance, dynamická počítačová tomografie); jejich prostorová rozlišovací schopnost však neumožňuje sledování procesů na jednotlivých synapsích. Většina hypotéz afektivních poruch se soustřeďuje na změny v dostupnosti neurotransmiterů, ve vlastnostech receptorů a přenašečů pro neurotransmitery a ve vlastnostech molekul podílejících se na přenosu signálu na postreceptorové úrovni (Manji 1992, Lachman a Papolos 1995). Jako určující se jeví narušení funkce serotonergních a noradrenergních systémů v mozku. Vznik a vývoj biochemických hypotéz afektivních poruch jsem podrobně popsal v monografii (Fišar 1998).
1.2.2. Serotoninové hypotézy Serotonin je jedním z nejvýznamnějších neurotransmiterů a podílí se na regulaci spánku, agrese, chuti k jídlu, kardiovaskulární a dýchací aktivitě, motorického výstupu, úzkosti, nálady, neuroendokrinní sekrece a analgezie. Serotonergní neurony mají buněčná těla lokalizována především ve skupině jader obklopujících raphe nuclei ve středním mozku, ale inervují všechny oblasti mozku. Serotonin je po uvolnění do synaptické štěrbiny rychle inaktivován především vysokoafinním transportním systémem (viz kap. 1.1.5), který zajišťuje jeho zpětné vychytávání (reuptake) do presynaptické části. Serotoninové hypotézy afektivních poruch vycházejí z předpokladu, že změny v dostupnosti serotoninu, stavu jeho receptorů nebo funkci jeho transportního proteinu doprovázejí různé poruchy nálady a že jedním z projevů dlouhodobé antidepresivní terapie je
18
zvýšení serotonergní aktivity (Meltzer and Lowy 1987, Siever et al. 1991, Caldecott-Hazard et al. 1991, Charney et al. 1992, Stahl 1992, 1994, Maes and Meltzer 1995). Tyto hypotézy byly formulovány na základě pozorování řady změn a abnormalit u depresivních pacientů, jako je: 1. nedostatečná serotonergní presynaptická aktivita (vztažená např. ke snížené dostupnosti L-tryptofanu, nebo k funkci systému pro uptake neurotransmiteru); 2. zvýšený počet 5-HT2 receptorů a desenzitizace nebo snížený počet 5-HT1A receptorů; 3. glukokortikoidní hyperaktivita; 4. antidepresivní účinky látek ovlivňujících serotonergní systém. Nejprve byly formulovány neurotransmiterové hypotézy předpokládající spojení depresivní poruchy s relativním snížením hladin serotoninu a noradrenalinu v mozku. Např. podle tzv. permisivní hypotézy je nedostatečná centrální serotonergní neurotransmise nutnou, ale nikoli postačující podmínkou pro vznik afektivní poruchy; blízkou příčinou pro vznik afektivního stavu je za této situace změna v centrální katecholaminové transmisi. Toto propojení serotonergního a noradrenergního systému je obsaženo i v novějších receptorových hypotézách afektivních poruch. Např. podle obecné katecholaminové hypotézy je supersenzitivita určitých katecholaminových receptorů při nízkých hladinách serotoninu biochemickým základem deprese. V poslední době je věnována pozornost molekulární a buněčné hypotéze deprese, podle níž náchylnost k depresi může vzniknout v důsledku poškození neuronů, např. po chronickém stresu, dlouhodobém zvýšení hladin glukokortikoidů, hypoglykémii, ischémii, účinkem neurotoxinů nebo některých virových infekcí apod. Terapeutické účinky různých antidepresiv se podle této hypotézy uskutečňují přes zvýšení funkce serotonergního a noradrenergního systému vedoucí ke zvýšení plasticity neuronů a následné obnově jejich buněčných funkcí (Duman et al. 1997).
1.2.3. Biofyzikální (membránové) hypotézy Z hlediska biofyzikálního jsou zajímavé hypotézy afektivních poruch předpokládající významnou úlohu membránových a plazmatických lipidů ve vzniku onemocnění. Při depresi byla popsána řada abnormalit v lipidové homeostazi (Maes et al. 1997, Chiu et al. 2003). Podle membránových hypotéz afektivních poruch abnormality v zastoupení a vlastnostech fosfolipidů a cholesterolu, které jsou základem struktury buněčných membrán, mohou indukovat změny v interakcích lipid-protein a v důsledku toho změny v různých neurotransmiterových systémech, o nichž se předpokládá, že jsou vztaženy k patofyziologii deprese (např. v serotonergním a noradrenergním systému). Náchylnost pro depresi potom
19
může vzniknout v důsledku změn vlastností lipidové části buněčných membrán v určitých oblastech mozku. Některé tyto hypotézy předpokládají, že narušení interakcí lipid-protein v buněčných membránách při depresi může být způsobeno změnami mikroviskozity membrán v důsledku snížené esterifikace sérového cholesterolu při depresi (Maes et al. 1994), nebo nadměrnou aktivitou fosfolipas A2, C, D, které jsou hlavními regulátory lipidového složení membrán. Zvýšený obsah volných mastných kyselin v plasmě (Mueller et al. 1970) a snížené koncentrace membránového fosfatidylcholinu v trombocytech a erytrocytech depresivních pacientů (Sengupta et al. 1981) zřejmě souvisejí především se zvýšenou aktivitou fosfolipasy A2 (Hibbeln et al. 1989, Horrobin 2001). Rovněž změněná fluidita membrán a snížená aktivita ATPas (Rybakowski and Lehmann 1994) v erytrocytech naznačují, že při afektivních poruchách dochází ke změnám ve složení a vlastnostech buněčných membrán. Biofyzikální vlastnosti synaptických membrán (strukturu, uspořádání, mikroviskozitu) určují do značné míry esenciální nenasycené mastné kyseliny, cholesterol a glykolipidy. Poměrně malé změny ve struktuře membrán způsobené cholesterolem a zastoupením n-3, n-6 a dalších nenasycených mastných kyselin potom mohou modulovat nejen metabolismus biogenních aminů (Mandell 1984), jejich vazbu (Heron et al. 1980) nebo zpětné vychytávání (Block and Edwards 1987), ale i transdukci signálu, např. vlivem na aktivitu adenylátcyklas a jiných membránových enzymů. V tzv. biofyzikální hypotéze afektivních poruch se uvažuje především o úloze dokosahexaenové kyseliny (22:6, n-3) a arachidonové kyseliny (20:4, n-6) ve funkci neuronálních membrán (Salem and Niebylski 1995, Hibbeln and Salem 1995, Peet et al. 1998, Horrobin 2001, Frasure-Smith et al. 2004). Terapeutická účinnost podávání n-3 polynenasycených mastných kyselin, především eikosapentaenové kyseliny, byla pozorována při léčbě schizofrenie, deprese i jiných duševních poruch (Peet and Stokes 2005, Young and Conquer 2005). Mechanismy působení polynenasycených mastných kyselin při depresi nejsou dostatečně známy, ale lze předpokládat jejich vliv na serotonergní aktivitu v mozku (De Vriese et al. 2004). Byla formulována také hypotéza o vztahu mezi sérovými lipidy, depresí a aterosklerosou (Penttinen 1995). Podle hypotézy o optimální fluiditě membrán (Shinitzky 1984) závisí maximální receptorová odezva nejen na hustotě receptorových vazebných míst, ale i na jejich přístupnosti pro agonisty rozpuštěné ve vodné fázi a na difúzně kontrolované rychlosti, s níž může docházet ke vzájemným interakcím mezi jednotlivými membránovými složkami podílejícími se na přenosu signálu. Jak dostupnost, tak pohyblivost membránových proteinů přitom závisí na mikroviskozitě lipidové dvojvrstvy. Hypotéza o měnitelné afinitě receptorů 20
(Bevan et al. 1989) vychází z pozorování, že k výrazným změnám v afinitě receptorů vedou rozdíly nejen v chemické struktuře receptoru, ale i v lokálním membránovém mikrookolí a v různých nitrobuněčných procesech. Změny v lipidovém složení plazmatických membrán tedy mohou ovlivňovat přenos signálu a podílet se na terapeutických účincích antidepresiv (Sengupta et al. 1981, Vinokur and Gubachev 1994). V řadě studií bylo popsáno zvýšené riziko deprese a sebevražedného chování u osob se sníženou koncentrací sérového (a zřejmě i membránového) cholesterolu (Kunugi et al. 1997, Vevera et al. 2003). Protože serotonergní systém má významnou úlohu v patofyziologii afektivních poruch a SERT je modulován jak fluiditou, tak přímými interakcemi s cholesterolem, byla formulována hypotéza (Engelberg 1992, Terao et al. 2000), podle níž po snížení koncentrace cholesterolu dochází ke snížení funkce serotonergního systému v důsledku změněné mikroviskozity a propustnosti plazmatických membrán.
21
1.3. Antidepresiva Antidepresiva se používají především k léčbě deprese; jejich dlouhodobé podávání (týdny, měsíce) upravuje patologicky zhoršenou náladu. Ačkoli jsou používána v léčbě afektivních poruch již téměř 50 let, přesný mechanismus jejich terapeutického působení není znám. Antidepresiva jsou chemicky různorodou skupinou psychofarmak s různými primárními biochemickými účinky. Významnou skupinu antidepresiv tvoří látky primárně inhibující zpětné vychytávání neurotransmiterů ze synaptické štěrbiny (reuptake inhibitor, RUI), zvláště serotoninu, noradrenalinu nebo dopaminu (monoaminové neurotransmitery). Kromě klasických tricyklických antidepresiv (TCA), která reuptake serotoninu a noradrenalinu inhibují neselektivně, patří do této skupiny selektivní inhibitory reuptake serotoninu (SSRI), selektivní inhibitory reuptake noradrenalinu (NRI), duální inhibitory zpětného vychytávání serotoninu i noradrenalinu (SNRI) nebo noradrenalinu i dopaminu (NDRI). Druhou skupinou antidepresiv zvyšujících účinky monoaminových neurotransmiterů jsou inhibitory monoaminoxidasy (MAO), enzymu lokalizovaného na vnější membráně mitochondrií a katalyzujícícho deaminaci těchto neurotransmiterů v cytoplazmě. Inhibice zpětného vychytávání nebo inhibice enzymu MAO však není jediným mechanismem, jímž antideprsiva zvyšují funkci serotonergního a noradrenergního systému v mozku; některá jsou antagonisty α2-adrenergních, serotoninových 5-HT2 a 5-HT3 a jiných receptorů, např. noradrenergní a specifická serotonergní antidepresiva (NaSSA). Některá antidepresiva blokují jak serotoninové 5-HT2A receptory, tak reuptake serotoninu; jsou klasifikována jako duální serotonin 2A antagonisté/inhibitory reuptake (SARI). Pro předcházení vzniku dalších manických a depresivních fází se používají rovněž stabilizátory nálady (např. lithium, valproát, karbamazepin), jejichž mechanismus účinku rovněž není dosud zřejmý (Vinař 1998, Švestka a kol. 1995, Stahl 2000). Primární biochemické účinky antidepresiv nejsou dostačující pro vysvětlení jejich terapeutických účinků, ke kterým dochází až po dlouhodobé léčbě (2-4 týdny). Klíčovou úlohu v léčebných účincích antidepresiv mají adaptivní změny v neurotransmisi, jejichž přesné určení ztěžuje jednak vzájemná provázanost nitrobuněčných procesů, jednak skutečnost, že odezva na stejné antidepresivum je rozdílná u osob se stejnými depresivními symptomy a obecně je farmakoterapie úspěšná pouze ve 2/3 případů. Dosud neexistuje biochemický, biofyzikální, endokrinní nebo genetický test schopný předpovědět náchylnost k afektivní poruše nebo správnou terapeutickou odpověď na podávání určitého antidepresiva.
22
Všeobecně se předpokládá, že klinické účinky antidepresiv jsou způsobeny jejich schopností indukovat adaptivní změny v monoaminergních neurotransmiterových systémech (hlavně noradrenergních a serotonergních). Zpočátku byly studovány především jejich účinky na změnu dostupnosti monoaminových neurotransmiterů v synapsích, později vliv na změny hustoty a senzibility receptorů a přenašečů a na vlastnosti molekul podílejících se na postreceptorové transdukci signálu (G proteinů, efektorových enzymů, systémů druhých poslů, proteinkinas a transkripčních faktorů) (Manji 1992, Lachman and Papolos 1995, Fišar 1998, Fišar a Jirák 2001). Nejčastěji pozorované změny vyvolané dlouhodobým podáváním antidepresiv jsou regulace snížením počtu (down-regulace) β1-adrenergních receptorů nebo snížení odezvy na agonisty (desenzibilizace) 5-HT1A receptorů. Byly však pozorovány změny i v jiných receptorových systémech. V poslední době je věnována pozornost především molekulárním a buněčným teoriím deprese, podle nichž jsou terapeutické účinky antidepresiv uskutečňovány přes aktivaci nitrobuněčných mechanismů zahrnujících zvýšení genové exprese určitých neurotrofinů a jejich receptorů (Duman et al. 1997, Schloss and Henn 2004); konkrétně, transkripční faktor aktivovaný v odezvě na zvýšení hladin cAMP (CREB) je možným nitrobuněčným cílem dlouhodobé léčby antidepresivy a gen pro mozkový-odvozený neurotrofní faktor (BDNF) je možným cílovým genem CREB. Takže ačkoli jsou primární biochemické účinky antidepresiv poměrně specifické a dobře známé, je nalezení buněčných funkcí ovlivněných dlouhodobým podáváním antidepresiv a odpovědných za jejich terapeutické účinky obtížné a je dosud předmětem výzkumu. Nejdůkladněji prostudovanou skupinou antidepresiv jsou TCA, která jsou používána již téměř 50 let a jejichž terapeutické účinky jsou dávány do souvislosti s inhibicí reuptake serotoninu a noradrenalinu, u některých i s blokádou 5-HT2A receptorů. Dnes nejčastěji podávanými antidepresivy jsou SSRI, které sice nejsou obecně účinější než TCA, ale mají menší nežádoucí vedlejší účinky. Pro terapeutickou účinnost současných antidepresiv je nezbytný jejich snadný průchod hematoencefalickou bariérou (Gulyaeva et al. 2003) a schopnost indukovat změny přenosu nervového signálu v mozku. Předpokládá se, že antidepresiva mohou ovlivňovat funkci řady membránových proteinů a to nejen přímou specifickou vazbou, ale i nepřímým ovlivněním interakcí protein-protein a lipid-protein v důsledku akumulace antidepresiv v lipidové části buněčných membrán a tím indukovaných změn ve složení nebo struktuře lipidové dvojvrstvy (Toplak et al. 1990). Fyzikálně-chemické vlastnosti antidepresiv totiž umožňují jejich vazbu v lipidových dvojvrstvách. Koncentrace v lipidových částech biologických membrán potom mohou mnohonásobně převyšovat koncentrace v tělesných tekutinách. Je proto možné, že 23
některé účinky antidepresiv se realizují přes interakce s membránovými fosfolipidy (Bauer et al. 1990; Mason et al. 1991; Seydel et al. 1994, Seydel and Wiese 2002). V rovnovážném stavu se antidepresiva nacházejí jak v mimobuněčném prostoru, tak v buněčných membránách a v cytoplazmě. V plazmě se antidepresiva nacházejí jednak volná, jednak vázaná na albumin, alfa 1-kyselý glykoprotein a lipoproteiny (Riant et al. 1988). Rovnovážná rozdělení některých antidepresiv mezi krevní buňky a plazmu byla studována v podmínkách in vitro (Burch et al. 1981, Amitai et al. 1993) i in vivo (Sikora et al. 1990, Krulík et al. 1991, Fišar et al. 1996). Po dlouhodobém podávání antidepresiv dochází k ustavení jejich koncentrace v krvi a nerovnoměrné distribuci v mozku (Miyake et al. 1990). Existují velké rozdíly mezi plazmatickými hladinami antidepresiv u různých osob v důsledku rozdílů v metabolismu léků, variabilitě distribuce mezi plazmu a tkáně, způsobu podání léku, vlivu věku, kouření a jiných psychofarmak (Nagy and Johansson 1985, Perel et al. 1978); k výraznému kolísání dochází u jednotlivců i v průběhu dne. Kromě podaných antidepresiv jsou obvykle aktivní i jejich metabolity (Sanchez and Hyttel 1999). Různé studie vedly k závěru, že maximálních terapeutických účinností některých antidepresiv u určitých skupin pacientů může být dosaženo v určitém rozsahu ustálených plazmatických hladin, avšak vzájemný vztah mezi plazmatickými koncentracemi a klinickou účinností není jednoduchý (Perel et al. 1978, Risch et al. 1979, Perry et al. 1994, Jerling et al. 1995). Terapeutické rozsahy plazmatických koncentrací antidepresiv leží v oblasti desítek až stovek ng/ml. Lze uzavřít, že působení antidepresiv není omezeno jen na části receptorů, transportních proteinů a enzymů nacházejících se na povrchu buněčných membrán, ale že mohou být ovlivněny i procesy probíhající v hydrofobním vnitřku membrán a rovněž nic nebrání případným interakcím antidepresiv s nitrobuněčnými složkami efektorových systémů a systémů druhých a třetích poslů, včetně procesů v jádře. Existují hypotézy afektivních poruch (viz kap. 1.2.3) předpokládající, že jak onemocnění samo, tak terapeutické účinky antidepresiv jsou spojeny se změnami v metabolismu membránových lipidů a se změnami ve fyzikálním stavu lipidové dvojvrstvy.
24
1.4. Membránový přenašeč pro serotonin při depresi a její léčbě Mezi hlavní faktory určující aktivitu serotonergního systému v mozku patří biosyntéza serotoninu z tryptofanu, jeho katabolismus, ukládání do synaptických váčků, uvolňování do synaptické štěrbiny a zpětné vychytávání (reuptake). Membránovému přenašeči pro serotonin (SERT) je v serotoninových hypotézách afektivních poruch věnována značná pozornost, neboť inhibice jeho funkce je primárním biochemickým účinkem řady antidepresiv, včetně dnes nejčastěji podávaných selektivních inhibitorů reuptake serotoninu (SSRI). Přibližně 80% vazebných míst pro 5-HT na SERT je obsazeno při podávání SSRI (Meyer et al. 2001). Podávání inhibitorů uptake 5-HT vede k rychlému tří až pětinásobnému zvýšení mimobuněčných koncentrací 5-HT v mozku (Fuller 1994), avšak, jak již bylo uvedeno výše, ke klinickému zlepšení dochází až po několika týdnech. Zvýšené mimobuněčné koncentrace 5-HT tedy teprve indukují žádoucí adaptivní změny. Předpokládá se, že terapeutické účinky antidepresiv jsou podmíněny výsledným zvýšením serotonergní neurotransmise v mozku (Blier and de Montigny 1994). Aktivitu neurotransmiterových systémů v mozku lze měřit nepřímo pomocí různých neuroendokrinních testů, kdy v odezvě na farmakologickou stimulaci či inhibici lze měřit změny hladin hormonů regulovaných příslušným neuromediátorem. Příkladem je fenfluraminový test, který je zkoušen u duševních poruch pro sledování aktivity serotoninergního systému v mozku. d-Fenfluramin inhibuje transport 5-HT do synaptických váčků a působí jako substrát pro SERT, čímž jednak inhibuje zpětné vychytávání 5-HT do presynaptické části, jednak usnadňuje jeho obrácený transport ven. Podání fenfluraminu zvyšuje hladiny uvolněného 5-HT v mozku, což vede ke zvýšenému vyplavování prolaktinu z adenohypofýzy. Byla publikována řada důkazů ukazujících, že serotonergní systém v trombocytech zrcadlí presynaptický serotonergní systém. Transport 5-HT, jeho ukládání a uvolňování, stejně jako vazebné charakteristiky 5-HT2 receptorů, jsou velmi podobné v trombocytech i presynaptických neuronech. Navíc bylo potvrzeno, že SERT a 5-HT2A receptor v plazmatických membránách lidských trombocytů a neuronů jsou identické (Lesch et al. 1993, Cook et al. 1994). Toto zjištění poskytlo další podporu pro použití trombocytů jako vhodného modelu pro sledování funkce mozkového serotonergního systému. Zájem o studium uptake 5-HT do trombocytů u depresivních pacientů byl v poslední době obnoven poté, co bylo popsáno spojení mezi polymorfismem SERT promotoru a osobnostními rysy a jeho úloha v průběhu afektivních poruch.
25
Funkční vlastnosti SERT jsou charakterizovány rychlostí a účinností přenosu serotoninu do buňky. Ukázalo se, že pro charakterizaci kinetiky uptake serotoninu do buněk lze použít rovnici analogickou rovnici Michaelise a Mentenové s parametry Vmax (maximální rychlost transportu serotoninu do buněk, která odráží existenci saturovatelného množství SERT v membránách) a KM (zdánlivá Michaelisova konstanta odpovídající koncentraci mimobuněčného 5-HT, při níž je rychlost transportu rovna polovině Vmax). Za předpokladu, že rychlostní konstanta disociace komplexu serotonin-přenašeč je větší než rychlostní konstanta odpovídající přenosu serotoninu přes membránu, jeho uvolnění do nitrobuněčného prostoru a návratu SERT do původního stavu, odpovídá konstanta KM přibližně disociační konstantě komplexu serotonin-přenašeč a charakterizuje tedy afinitu SERT. Poměr Vmax/KM lze považovat za kritérium účinnosti transportního systému (zdánlivou účinnost uptake 5-HT) při nízkých (fyziologických) koncentracích mimobuněčného 5-HT (Franke et al. 2000). Pro zjištění mechanismů účinků antidepresiv a předpověď klinické odezvy na jejich podávání při depresi byly sledovány různé periferní parametry serotonergní transmise, jako koncentrace metabolitů 5-HT v mozkomíšním moku, denzita a aktivita SERT nebo koncentrace 5-HT v trombocytech a v plazmě. Bohužel, informace o změnách různých serotonergních parametrů v trombocytech depresivních osob před a po léčbě antidepresivy jsou často rozporné. Může to být do značné míry způsobeno vlivem předchozí farmakoterapie na měřené veličiny. Např. vazebná místa pro uptake 5-HT charakterizovaná vazbou [3H]imipraminu k SERT v trombocytech depresivních pacientů byla zjištěna snížená, nezměněná i zvýšená (Koyama and Yamashita 1992, Mellerup and Langer et al. 1990, Owens and Nemeroff 1994). Vzhledem v vysoké nespecifické vazbě imipraminu byly nověji použity selektivnější ligandy [3H]paroxetin, [3H]citalopram a [3H]nitroguipazin, s nimiž byly získány konsistentnější výsledky o hustotě a afinitě těchto vazebných míst a byla zjištěna i mimoneuronální exprese SERT (D'haenen et al. 1988, Lawrence et al. 1994, Bakish et al. 1997, Hrdina et al. 1997). Většina studií zabývajících se vazbou inhibitorů k SERT se týká vysokoafinního vazebného místa, avšak bylo charakterizováno i nízkoafinní alosterické vazebné místo, jehož funkce není dostatečně známa (Plenge and Wiborg 2005). Často jsou měřeny parametry kinetiky transportu 5-HT do trombocytů, o nichž se předpokládá, že odrážejí změny funkce serotonergního systému v mozku (Lesch et al. 1993, Bianchi et al. 2002, Tuomisto et al. 1979, Meltzer et al. 1981, Meltzer and Lowy 1987, Caldecott-Hazard et al. 1991). Snížení maximální rychlosti transportu serotoninu do trombocytů bylo dokonce navrženo jako možný biochemický marker deprese, avšak ukázalo se, že tento marker není dostatečně specifický (Caldecott-Hazard et al. 1991, Lawrence et al. 26
1994). U depresivních pacientů před léčbou byla popsána jak snížená (Tuomisto et al. 1979, Meltzer et al. 1981, Healy and Leonard 1987, Franke et al. 2000, Stain-Malmgren et al. 2001), tak zvýšená (Hrdina et al. 1997) maximální rychlost Vmax transportu 5-HT do trombocytů. Po podávání antidepresiv se Vmax buď nezměnilo (Meltzer et al. 1981, Hrdina et al. 1997) nebo snížilo (Stain-Malmgren et al. 2001, Axelson et al. 2005). Konsistentnější výsledky byly získány s parametrem KM, který je u depresivních pacientů před léčbou nezměněn (Tuomisto et al. 1979, Meltzer et al. 1981), ale po dlouhodobém podávání různých antidepresiv dochází k jeho významnému zvýšení (Tuomisto et al. 1979, Meltzer et al. 1981, Healy and Leonard 1987, Hrdina et al. 1997, Stain-Malmgren et al. 2001). Na základě těchto výsledků se předpokládá, že aktivita SERT v trombocytech může být použita pro sledování účinků antidepresiv (především SSRI) na serotonergní systém v mozku a jako znak účinnosti SSRI při léčbě deprese (Bakish et al. 1997, Axelson et al. 2005). SERT je regulován řadou procesů, např. protenkinasou C (PKC). Rovněž aktivace terminálních serotoninových autoreceptorů zvyšuje kinetiku uptake 5-HT přes vliv na SERT. Víme málo o tom, jak se 5-HT váže k SERT a jak je přenášen přes membránu, nebo o tom jak se vážou antagonisté. Rovněž studium úlohy fosforylace SERT nebo jiné posttranslační modifikace vedoucí ke změnám jeho funkce jsou v začátcích. Je zřejmé, že významnou úlohu mohou mít i složení a vlastnosti lipidové dvojvrstvy (Bhat and Block 1992) a specifické interakce SERT s membránovými lipidy v mikrodoménách (Magnani et al. 2004). Významným modulátorem funkce SERT je především membránový cholesterol, jehož nižší koncentrace vedly v experimentech in vitro ke snížení aktivity SERT (Scanlon et al. 2001). Propojení změn vlastností buněčných membrán způsobených různým obsahem cholesterolu s aktivitou serotonergního systému by mohlo být mechanismem podílejícím se na zvýšení rizika vzniku deprese spojené se suicidálním chováním při nízkých hladinách sérového cholesterolu (Penttinen 1995, Kunugi et al. 1997).
27
1.5. Interakce antidepresiv s lipidovými membránami Většina antidepresiv jsou amfifilní molekuly (tj. molekuly sestávající z polární a nepolární části) nesoucí za fyziologických podmínek kladný náboj (patří do skupiny CAD, „cationic amphiphilic drug“). Mohou se vázat jak ke specifickým proteinovým vazebným místům, tak k lipidové části membrán (Lieber et al. 1984, Sikora et al. 1990, Fišar et al. 1996). Není známo, zda akumulace antidepresiv v lipidové části buněčných membrán má výrazný vliv na jejich terapeutické účinky, ale interakce protein-lipid-antidepresivum mohou ovlivňovat funkci řady membránových systémů podílejících se na přenosu nervového signálu (Bevan et al. 1989). Pro úlohu membránových lipidů v účincích antidepresiv svědčí také změny ve složení membránových lipidů pozorované po dlouhodobém podávání antidepresiv (Moor et al. 1988, Toplak et al. 1990, Pettegrew et al. 2001). Některá antidepresiva mohou indukovat generalizovanou fosfolipidózu, tj. akumulaci různých fosfolipidů uvnitř buňky (Xia et al. 2000) a s tím související vedlejší nebo toxické účinky. Souhrnně lze říci, že membránové lipidy mohou ovlivňovat účinky antidepresiv jednak změnou dostupnosti antidepresiv pro více či méně specifická vazebná místa v membráně, jednak působením na neurotransmiterové receptory a přenašeče. Přímý vliv lipidů na účinky antidepresiv spočívá jak v řádovém zvýšení jejich koncentrace v bezprostřední blízkosti buněčného povrchu v důsledku elektrostatických vlastností membránových lipidů (výsledného záporného náboje), tak v ovlivnění vazby (akumulace) amfifilních antidepresiv v lipidové části membrán. Nepřímý vliv membránových lipidů na působení antidepresiv je dán skutečností, že aktivita řady membránových proteinů, které jsou zapojeny do přenosu nervového signálu a jsou ovlivněny antidepresivy, silně závisí na interakci s určitými fosfolipidy nebo cholesterolem. Je předmětem dalšího výzkumu jak může farmakologické nebo nutriční ovlivnění vlastností membránových lipidů zlepšit příznaky afektivních poruch nebo účinnost jejich farmakoterapie.
1.5.1. Modelové membrány (liposomy) Pro in vitro studium interakcí léčiv s lipidovou částí buněčných membrán jsou používány izolované buňky, buněčné membrány a modelové membrány. Zvláště liposomy jsou široce používaným modelem lipidové části buněčných membrán a umožňují měřit nejen rozdělovací koeficienty, ale i vazebné parametry různých léčiv v lipidových dvojvrstvách s definovaným složením. Liposomy jsou váčky (vezikuly) uzavírající vodný roztok membránou tvořenou
28
především fosfolipidy. Tvoří se spontánně, když jsou fosfolipidy dispergovány ve vodném prostředí. V závislosti na způsobu přípravy (New 1990) mohou vzniknout liposomy 1. mnohovrstevné (multilamellar vesicles, MLV, vezikuly o velikosti 10-1 až 100 µm, přičemž každý váček je tvořen mnoha koncentrickými vrstvičkami lipidových dvojvrstev), 2. malé jednovrstevné (small unilamellar vesicles, SUV, vezikuly o velikosti cca 25 nm) nebo 3. velké jednovrstevné (large unilamellar vesicles, LUV, vezikuly o velikosti 100 µm). Jako zvláštní skupina se někdy uvádějí jednovrstevné liposomy střední velikosti (intermediate-sized unilamellar vesicles, IUV, vezikuly o velikosti kolem 100 nm). Bylo ověřeno, že liposomy jsou vhodným modelem pro studium vlastností lipidové části buněčných membrán, včetně studia interakcí léčiv s lipidovou částí buněčných membrán (Reith et al. 1984).
1.5.2. Interakce antidepresivum-lipidová membrána Na vazbě antidepresiv k lipidovým dvojvrstvám se podílejí stejné nekovalentní interakce, jako je tomu u vazeb neurotransmiter-receptor nebo substrát-enzym; jedná se o: 1. interakce mezi elektroneutrálními molekulami nebo jejich částmi, označované jako van der Waalsovy síly, 2. elektrostatické (iontové, Coulombovy) interakce mezi ionty s určitým výsledným nábojem, 3. vodíková vazba a 4. hydrofobní interakce, které spočívají v přiblížení hydrofobních skupin tak, aby se minimalizovala velikost rozhraní mezi vodou a nepolárními skupinami. Coulombovy interakce mezi dipóly a zvláště mezi nabitými skupinami jsou dlouhodosahové, zatímco van der Waalsovy interakce se vzdáleností rychle klesají. Vazba antidepresiv do lipidové dvojvrstvy je chápána jako omezení „dimenzionality“ (Mosior and McLaughlin 1992, Beschiaschvili and Seelig 1992), neboť se nejedná o vazbu stabilní, jako je tomu např. u receptorových specifických vazeb. Termodynamická analýza vazebné rovnováhy pro různé amfifilní ligandy vedla k závěru, že hnací silou pro vazbu těchto léčiv do lipidové dvojvrstvy je hlavně změna entalpie, tzn. van der Waalsovy interakce (Bäuerle a Seelig 1991). Významnou úlohu v interakcích lipid-antidepresivum mají i elektrostatické (coulombické) interakce, neboť jak membránové molekuly, tak antidepresiva nesou za fyziologických podmínek často náboj nebo alespoň obsahují polarizovatelné skupiny. Rozdíly v rozdělovacích koeficientech antidepresiv pro lipidové membrány, jejichž povrch je celkově elekroneutrální (např. fosfatidylcholinové, fosfatidyletanolaminové), nebo nese celkový záporný náboj (např. fosfatidylserinové, fosfatidylinositolové) ukazují, že záporně nabité fosfolipidy mohou zvyšovat lokální koncentraci antidepresiv i jiných kladně
29
nabitých molekul u povrchu buněčných membrán (Fišar et al. 2004) a ovlivnit tak jejich specifickou vazbu na membránové receptory, přenašeče, iontové kanály nebo enzymy. Studium interakcí amfifilních léčiv s liposomy spočívá především v měření rozdělovacích koeficientů, charakterizujících rovnováhu mezi molekulami léčiv ve vodném roztoku a molekul adsorbovaných na povrch membrány nebo inkorporovaných do hydrofobního vnitřku lipidové dvojvrstvy. Tato adsorpce a inkorporace se obvykle chápe jako nespecifický proces. Novější přístup spočívá v respektování heterogenity fosfolipidové membrány charakterizované polaritou membrány, nábojem a orientací polárních skupin (tzv. fosfolipidových hlaviček), délkou a nenasyceností acylových řetězců (zbytků mastných kyselin) a konformací jejich dvojných vazeb, asymetrií membrány, existencí mikrodomén a nedvojvrstevných struktur a fluktuacemi hustoty. V důsledku této heterogenity jsou molekuly léčiv distribuovány v lipidových membránách nerovnoměrně (Herbette et al. 1986, Müller et al. 1986,). Existuje také možnost vzniku specifických interakcí některých ligandů s acylovými řetězci fosfolipidů (Bäuerle a Seelig 1991, Jørgensen et al. 1991). Celkově mohou vést interakce lék-dvojvrstva ke změnám (Seydel and Wiese 2002) 1. konformace molekul léku, 2. konformace membránových molekul (orientace polárních hlaviček fosfolipidů, trans-gauche konformace acylových řetězců), 3. plochy a tloušťky membrány, 4. membránového potenciálu, 5. dynamických vlastností lipidové dvojvrstvy (uspořádanost a rotační a translační pohyblivost membránových molekul). Při vysokých koncentracích amfifilních molekul může dojít k destabilizaci lipidových dvojvrstev (Zimmer 1984, Balgavý and Devínsky 1996, Zachowski and Durand 1988, Heerklotz and Seelig 2000, Schreier et al. 2000, Sanganahalli et al. 2000). Označení výsledku interakce lék-lipidová membrána jako „vazba“ bylo předmětem diskusí vzhledem k běžnému významu tohoto označení v klasických interakcích enzymsubstrát nebo ve studiích ligand-receptor. Pro odlišení byly používány přívlastky „pseudospecifická“, „nesaturovatelná“ a byl navržen termín „nespecifická akumulace“. Pokud chápeme lipidovou dvojvrstvu jako isotropní prostředí, potom je postačují kvantitativní charakteristikou vazby léku rozdělovací koeficient. Vezmeme-li v úvahu heterogenitu lipidové membrány, je nutno použít veličiny analogické receptorovým studiím (Bennett a Yamamura 1985), jako je vazebná kapacita (Bmax) a disociační konstanta (Kd), které umožňují kvantifikovat vazbu léku do různých oblastí lipidové dvojvrstvy. Teoreticky by mělo být možné určit ze saturačních křivek vazebné parametry i dvou či více různých vazebných míst. Parametry charakterizující vazbu CAD k membránám vycházejí z měření koncentračních závislostí množství volného a vázaného ligandu. Byla pozorována nezávislost rozdělovacích 30
koeficientů na nízkých koncentracích CAD (Mason et al. 1989) a jejich závislost na teplotě, pH a lipidovém složení membrán (Luxnat and Galla 1986, Zachowski and Durand 1988, Austin et al. 1995). Saturovatelnost adsorpčních izoterem pozorovaná při vyšších koncentracích amfifilních léčiv je vysvětlována změnami elektrostatického potenciálu na povrchu membrán v důsledku inkorporace nabitých molekul ligandu do lipidové dvojvrstvy. Elektrostatika nabitých lipidových dvojvrstev byla intenzivně studována a diskutována v mnoha pracích (McLaughlin a Harary 1976, Eisenberg et al. 1979, McLaughlin 1989, Beschiaschvili and Seelig 1990, Cevc 1990, 1993, Stankowski 1991, Seelig et al. 1993, Langner and Kubica 1999, Averbakh and Lobyshev 2000). Pro analýzu výsledků interakcí nabitých molekul s modelovými membránami se pokládá za postačující Sternova teorie používající pro určení vztahu hustoty povrchového náboje a povrchového potenciálu Gouyovu-Chapmanovu teorii elektrických dvojvrstev (Beschiaschvili and Seelig 1992). Gouyova-Chapmanova teorie umožňuje při studiu elektrostatiky nabitých lipidových dvojvrstev určit: •
elektrostatický potenciál v blízkosti povrchu membrány a jeho prostorový průběh;
•
elektroforetickou pohyblivost nabitých lipidových váčků;
•
koncentrace malých iontů u povrchu membrány;
•
adsorpci léčiv, hormonů, peptidů a proteinů na povrch membrány;
•
rozlišení hydrofobního a elektrostatického příspěvku k celkové vazbě ligandu k lipidové dvojvrstvě.
Vazba mezi kladně nabitými antidepresivy a negativně nabitými membránami je zvýšena oproti vazbě k celkově elektricky neutrálním membránám. Pomocí Gouy-Chapmanovy teorie lze provést korekci na elektrostatické efekty a popsat interakci antidepresiv s membránami pomocí vazebných parametrů nebo povrchových rozdělovacích koeficientů (Fišar et al. 2004).
1.5.3. Lokalizace antidepresiv v membráně Pro lokalizaci amfifilních molekul v membráně je důležitá polarita a náboj membrán. Statická dielektrická konstanta se na povrchu membrány mění z hodnoty 78 (voda) k hodnotě kolem 2 (vnitřek membrány) a celkový náboj biologických membrán je obvykle záporný. Mnoho procesů probíhajících na rozhraní membrána-voda ovlivňuje hydratace membrán (Cevc 1990). Nositeli záporného náboje u membránových fosfolipidů jsou hlavně fosfátové a karboxylové skupiny, kladný náboj mohou mít aminoskupiny a cholinové hlavičky. Náboj je
31
přitom lokalizován pro fosfátovou a karboxylovou skupinu u atomů kyslíku, pro aminoskupinu u atomů vodíku a pro cholinovou hlavičku u atomů dusíku a vodíku. V důsledku heterogenity membrán jsou v nich antidepresiva rozdělena nerovnoměrně. Zjednodušený model pro vazbu amfifilních molekul k lipidové membráně rozlišuje 4 oblasti (Bauer et al. 1990, Tieleman et al. 1997, Fišar 2005): 1. oblast rozrušené vody - je tvořena molekulami vody, které reagují na přítomnost polárních skupin lipidů; 2. interfáze – je tvořena hlavně atomy polárních hlaviček lipidů; 3. měkký polymer – oblast tvořená částečně uspořádanými uhlovodíkovými řetězci a nízkým volným objemem; 4. dekan – oblast ve střední části lipidové dvojvrstvy charakterizovaná hustotou podobnou dekanu a velkým volným objemem. První dvě oblasti jsou společně chápány jako rozhraní membrána-vodný roztok. Vlastnosti tohoto rozhraní jsou určující pro vazbu amfifilních molekul do membrány. Polární hlavičky fosfolipidů mohou být rozděleny do dvou oblastí: 1. na záporně nabitou fosfátovou skupinu a 2. na kladnou, zápornou, zwiterionickou nebo nenabitou oblast (Langner and Kubica 1999). Pro bližší charakterizaci a lokalizaci amfifilních molekul v membráně byl studován vliv vnějšího prostředí (iontů, pH, teploty) a lipidového složení membrán (Zachowski a Durand 1988, Fišar a Krulík 1995, Fišar 2005). Jak rozdělení léčiv, tak vliv na některé vlastnosti membrán závisí silně na vlastnostech membránových lipidů, zvláště na přítomnosti záporně nabitých fosfolipidů a cholesterolu (Luxnat a Galla 1986). I dosti podobné molekuly mohou přitom interagovat s membránou značně rozdílně. Vliv na složení a vlastnosti lipidové části buněčných membrán byl sledován hlavně pro léčiva ze skupiny fenothiazinů, butyrofenony a tricyklická antidepresiva. Protože fenothiaziny i TCA si jsou strukturně podobné, ale stereochemicky jsou značně odlišné a mají i odlišné terapeutické účinky, byla srovnávána jejich lokalizace v buněčných membránách a vliv na fázové přechody lipidové dvojné vrstvy. Ukázalo se, že fenothiaziny mají vyšší rozdělovací koeficienty než TCA, tj. mají vyšší hydrofobicitu a tedy silnější tendenci být inkorporovány dovnitř membrán. Pravděpodobná lokalizace molekul fenothiazinů v membráně je v hydrofobním vnitřku membrány s orientací nepolární části podél uhlovodíkových řetězců. TCA jsou vázána více periferně, v povrchových vrstvách lipidové dvojné vrstvy s nepolární částí orientovanou v rovině membrány. Po vazbě do lipidové dvojvrstvy antidepresiva snadno ztrácejí kladný náboj, stávají se nepolárními a akumulují se v hydrofobním vnitřku membrány nebo procházejí na vnitřní 32
stranu membrány, získávají kladný náboj a buď interagují s membránovými proteiny a kyselými fosfolipidy, nebo se uvolňují do nitrobuněčného prostředí a mohou ovlivňovat procesy v cytosolu, organelách nebo buněčném jádře. Heterogenitu vazby antidepresiv v membránách lze charakterizovat pomocí vazebných parametrů a podílu různých nekovalentních interakcí na vazbě (viz kap. 1.5.2).
33
1.6. Literatura Amitai Y., Kennedy E.J., DeSandre P., Frischer H.: Distribution of amitriptyline and nortriptyline in blood: role of alpha-1-glycoprotein. Ther. Drug Monit. 1993; 15: 267-273. Austin R.P., Davis A.M., Manners C.N.: Partitioning of ionizing molecules between aqueous buffers and phospholipid vesicles. J. Pharm. Sci. 1995, 84: 1180-1183. Averbakh A., Lobyshev V.I.: Adsorption of polyvalent cations to bilayer membranes from negatively charged lipid: estimating the lipid accessibility in the case of complete binding. J. Biochem. Biophys. Methods 2000; 45: 23-44. Axelson D.A., Perel J.M., Birmaher B., Rudolph G., Nuss S., Yurasits L., Bridge J., Brent D.A.: Platelet serotonin reuptake inhibition and response to SSRIs in depressed adolescents. Am. J. Psychiatry 2005; 162: 802-804. Bakish D., Cavazzoni P., Chudzik J., Ravindran A., Hrdina P.D.: Effects of selective serotonin reuptake inhibitors on platelet serotonin parameters in major depressive disorder. Biol. Psychiatry 1997; 41: 184-190. Balgavý P., Devínsky F.: Cut-off effect in biological activities of surfactants. Adv. Colloid Interface Sci. 1996; 66, 23-63. Barenholz Y.: Cholesterol and other membrane active sterols: from membrane evolution to “rafts”. Prog. Lipid Res. 2002; 41: 1-5. Bauer M., Megret C., Lamure A., Lacabanne C., Fauran-Clavel M.-J.: Differential scanning calorimetry study of the interaction of antidepressant drugs, noradrenaline and 5-hydroxytryptamine with a membrane model. J. Pharm. Sci. 1990; 79, 897-901. Bäuerle H.-D., Seelig J.: Interaction of charged and uncharged calcium channel antagonists with phospholipid membranes. Binding equilibrium, binding enthalpy, and membrane location. Biochemistry 1991; 30, 72037211. Bennett J.P.Jr., Yamamura H.I.: Neurotransmitter, hormone, or drug receptor binding methods. In: Neurotransmitter Receptor Binding (Yamamura H.I., Enna S.J. and Kuhar M.J., Eds.), 2nd edition, New York: Raven Press, 1985, pp. 61-89. Bernik, D.L., Rivas, E.A., Arnaiz, G.R.D.: Fusion between rat-brain synaptosomes and phosphatidylserine liposomes. Neurochem. Int. 1991; 19: 611-618. Beschiaschvili G., Seelig J.: Peptide binding to lipid bilayers. Binding isotherms and ζ-potential of a cyclic somatostatin analogue. Biochemistry 1990; 29, 10995-11000. Beschiaschvili G., Seelig J.: Peptide binding to lipid bilayers. Nonclassical hydrophobic effect and membraneinduced pK shifts. Biochemistry 1992; 31, 10044-10053. Bevan, J.A., Bevan, R.D., Shreeve, S.M.: Variable receptor affinity hypothesis. FASEB J. 1989; 3:1696-1704. Bhat, G.B., Block, E.R.: Serotonin transport in reconstituted endothelial cell plasma membrane proteoliposomes: effect of hypoxia. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1992; 6: 633-638. Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato E, Crespi F.: Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp. Brain Res. 2002; 143: 191-197. Blier P., de Montigny C.: Current advantages and trends in the treatment of depression. TiPS 1994; 15, 220-226.
34
Block, E., Edwards, D.: Effects of plasma membrane fluidity on serotonin transport by endothelial cells. Am. J. Physiol. 1987; 253: C672-C678. Boer R., Grassegger A., Schudt C., Glossmann H.: (+)-Niguldipine binds with very high affinity to Ca2+ channels and to a subtype of alpha 1-adrenoceptors. Eur. J. Pharmacol. 1989; 172: 131-145. Burch J.E., Roberts S.G., Raddats M.A.: Binding of amitriptyline and nortriptyline in plasma determined from their equilibrium distributions between red cells and plasma, and between red cells and buffer solution. Psychopharmacology 1981; 75: 262-272. Caldecott-Hazard S., Morgan D.G., DeLeon-Jones F., Overstreet D.H., Janowsky D.: Clinical and biochemical aspects of depressive disorders: II. transmitter/receptor theories. Synapse 1991; 9: 251-301. Cevc G.: Membrane electrostatics. Biochim. Biophys. Acta 1990; 1031, 311-382. Cevc G.: Electrostatic characterization of liposomes. Chem. Phys. Lipids 1993; 64, 163-186. Charney D.S., Delgado P.L.: Current concepts of the role of serotonin function in depression and anxiety. In: Serotonin Receptor Subtypes: Pharmacological Significance and Clinical Implications (Langer S.Z., Brunello N., Racagni G., Mendlewicz J., Eds.), Int. Acad. Biomed. Drug Res., vol. 1., Basel: Karger, 1992, pp. 89-104 Chiu C.-C., Huang S.-Y., Su K.-P., Lu M.-L., Huang M.-C., Chen C.-C., Shen W.W.: Polyunsaturated fatty acid deficit in patients with bipolar mania. Eur. Neuropsychopharmacol. 2003; 13: 99-103. Cohen S.A., Müller W.E.: Age-related alterations of NMDA-receptor properties in the mouse forebrain – partial restoration by chronic phosphatidylserine treatment. Brain Res. 1992; 584: 174-180. Cook E.H. Jr., Fletcher K.E., Wainwright M., Marks N., Yan S.-Y., Leventhal B.L.: Primary structure of the human platelet serotonin 5-HT2A receptor: identify with frontal cortex serotonin 5-HT2A receptor. J. Neurochem. 1994; 63: 465-469. Cornelius F.: Modulation of Na,K-ATPase and Na-ATPase activity by phospholipids and cholesterol. I. Steadystate kinetics. Biochemistry 2001; 40, 8842-8851. De Vriese S.R., Christophe A.B., Maes M.: In humans, the seasonal variation in poly-unsaturated fatty acids is related to the seasonal variation in violent suicide and serotonergic markers of violent suicide. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 2004; 71: 13-18. D'haenen H., De Waele M., Leysen J.E.: Platelet [3H]paroxetine binding in depressed patients. Psychiatry Res. 1988; 26: 11-17. Duman R.S., Heninger G.R., Nestler E.J.: A molecular and cellular theory of depression. Arch. Gen. Psychiatry 1997; 54: 597-606. Dumas F., Lebrun M.C., Tocanne J.-F.: Is the protein/lipid hydrophobic matching principle relevant to membrane organization and functions? FEBS Lett. 1999; 458, 271-277. Eisenberg M., Gresalfi T., Roccio T., McLaughlin S. (1979): Adsorption of monovalent cations to bilayer membranes containing negative phospholipids. Biochemistry 18, 5213-5223. Engelberg H.: Low serum cholesterol and suicide. Lancet. 1992; 339: 727-729. Fielding C.J., Fielding P.E.: Relationship between cholesterol trafficking and signaling in rafts and caveolae. Biochim. Biophys. Acta 2003; 1610: 219-228. Fišar Z., Krulík R.: Buněčné membrány a jejich interakce s antidepresivy. Biol. listy 1995; 60: 81-96.
35
Fišar Z., Krulík R., Fuksová K., Sikora J.: Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol. Biophys. 1996; 15: 51-64. Fišar Z.: Biochemické hypotézy afektivních poruch. Praha, Galén, 1998, 103 s. Fišar Z., Jirák R.: Vybrané kapitoly z biologické psychiatrie. Praha, Grada, 2001, 316 s. Fišar Z.: Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid bilayer membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005; 24: 161-180. Franke L., Schewe H.-J., Müller B., Campman V., Kitzrow W., Uebelhack R., Berghöfer A., MüllerOerlinghausen B.: Serotonergic platelet variables in unmedicated patients suffering from major depression and healthy subjects. Relationship between 5HT content and 5HT uptake. Life Sci. 2000; 67: 301-315. Frasure-Smith N., Lesperance F., Julien P.: Major depression is associated with lower omega-3 fatty acid levels in patients with recent acute coronary syndromes. Biol. Psychiatry 2004; 55: 891-896. Fuller R.W.: Uptake inhibitors increase extracellular serotonin concentration measured by brain microdialysis. Life Sci. 1994; 55: 163-167. Gelbmann C.M., Müller W.E.: Chronic treatment with phosphatidylserine restores muscarinic cholinergic receptor deficit in the aged mouse brain. Neurobiol. Aging 1992; 13: 45-50. Gulyaeva N., Zaslavsky A., Lechner P., Chlenov M., McConnell O., Chait A., Kipnis V., Zaslavsky B.: Relative hydrophobicity and lipophilicity of drugs measured by aqueous two-phase partitioning, octanol-buffer partitioning and HPLC. A simple model for predicting blood-brain distribution. Eur. J. Med. Chem. 2003; 38: 391-396. Healy D., Leonard B.E.: Monoamine transport in depression: kinetics and dynamics. J. Affect. Disord. 1987; 12: 91-103. Heerklotz H., Seelig J.: Titration calorimetry of surfactant-membrane partitioning and membrane solubilization. Biochim. Biophys. Acta 2000; 1508: 69-85. Heirwegh K.P., De Smedt H., Vermeir M.: Analysis of membrane-bound acceptors. A correction function for non-specific accumulation of poorly water-soluble hydrophobic or amphipathic ligands based on the ligand partition concept. Biochem Pharmacol. 1992; 43: 701-704. Herbette L.G., Chester D.W., Rhodes D.G.: Structural analysis of drug molecules in biological membranes. Biophys. J. 1986; 49: 91-94. Heron D., Shinitzky M., Hershkowitz M., Samuel D.: Lipid fluidity markedly modulates the binding of serotonin to mouse brain membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980; 77: 7463-7467. Hibbeln J.R., Palmer J.W., Davis J.M.: Are disturbances in lipid-protein interactions by phospholipase-A2 a predisposing factor in affective illness? Biol. Psychiatry 1989; 25: 945-961. Hibbeln J.R., Salem N.Jr.: Dietary polyunsaturated fatty acids and depression: when cholesterol does not satisfy. Am. J. Clin. Nutr. 1995; 62: 1-9. Horrobin D.F.: Phospholipid metabolism and depression: the possible roles of phospholipase A2 and coenzyme A-independent transacylase. Hum. Psychopharmacol. 2001; 16: 45-52. Hrdina P.D., Bakish D., Ravindran A., Chudzik J., Cavazzoni P., Lapierre Y.D.: Platelet serotonergic indices in major depression: up-regulation of 5-HT2A receptors unchanged by antidepressant treatment. Psychiatry Res. 1997; 66: 73-85.
36
Hurley J.H., Tsujishita Y., Pearson M.A.: Floundering about at cell membranes: a structural view of phospholipid signaling. Curr. Opin. Struct. Biol. 2000; 10: 737-743. Jerling M.: Dosing of antidepressants-the unknown art. J. Clin. Psychopharmacol. 1995; 15: 435-439. Jørgensen K., Ipsen J.H., Mouritsen O.G., Bennett D., Zuckermann M.J.: The effects of density fluctuations on the partitioning of foreign molecules into lipid bilayers: application to anaesthetics and insecticides. Biochim. Biophys. Acta 1991; 1067: 241-253. Koyama T., Yamashita I.: Biological markers of depression: WHO multi-center studies and future perspective. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 1992; 16: 791-796. Krulík R., Exner J., Fuksová K., Píchová D., Beitlová D., Sikora J.: Radioimmunoassay of dibenzazepines and dibenzcycloheptanodienes in body fluids and tissues. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1991; 29: 827-832. Kunugi H., Takei N., Aoki H., Nauko S.: Low serum cholesterol in suicide attempters. Biol. Psychiatry 1997; 41: 196-200. Lachman H.M., Papolos D.F.: A molecular model for bipolar affective disorder. Med. Hypoth. 1995; 45: 255264. Langner M., Kubica K.: The electrostatics of lipid surfaces. Chem. Phys. Lipids 1999; 101: 3-35. Lawrence K.M., Katona C.L.E., Abou-Saleh M.T., Robertson M.M., Nairac B.L., Edwards D.R., Lock T., Burns R.A., Harrison D.A., Horton R.W.: Platelet 5-HT uptake sites, labelled with [3H]paroxetine, in controls and depressed patients before and after treatment with fluoxetine or lofepramine. Psychopharmacology (Berl). 1994; 115: 261-264. Lee A.G.: Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta 2003; 1612, 1-40. Lesch K.-P., Wolozin B.L., Murphy D.L., Riederer P.J.: Primary structure of the human platelet serotonin uptake site – identity with the brain-serotonin transporter. J. Neurochem. 1993; 60: 2319-2322. Levitan I.B., Kaczmarek L.K.: The Neuron. Cell and Molecular |Biology. 3rd Edition, Oxford: Univ. Press, 2002 Lieber M.R., Lange Y., Weinstein R.S., Steck T.L.: Interaction of chlorpromazine with the human erythrocyte membrane. J. Biol. Chem. 1984; 259: 9225-9234. Luxnat M., Galla H.-J.: Partition of chlorpromazine into lipid bilayer membranes: the effect of membrane structure and composition. Biochim. Biophys. Acta 1986; 856: 274-282. Maes M., Delanghe J., Meltzer H.Y., Scharpé S., D'Hondt P., Cosyns P.: Lower degree of esterification of serum cholesterol in depression: relevance for depression and suicide research. Acta Psychiatr. Scand. 1994; 90: 252-258. Maes M., Meltzer H.Y.: The serotonin hypothesis of major depression. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress (Bloom F.E., Kupfer D.J., Eds.), New York: Raven Press, 1995; pp. 933-944. Maes M., Smith R., Christophe A, Vandoolaeghe E., Van Gastel A., Neels H., Demedts P., Wauters A., Meltzer H.Y.: Lower serum high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) in major depression and in depressed men with serious suicidal attempts: relationship with immune-inflammatory markers. Acta Psychiatr. Scand. 1997; 95: 212-221. Magnani F., Tate C.G., Wynne S., Williams C., Haase J.: Partitioning of the serotonin transporter into lipid microdomains modulates transport of serotonin. J. Biol. Chem. 2004; 279: 38770-38778.
37
Mandell A.J.: Non-equilibrium behavior of some brain enzyme and receptor systems. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1984; 24: 237-274. Manji H.K.: G proteins: implications for psychiatry. Am. J. Psychiatry 1992; 149: 746-760. Mason R.P., Campbell S.F., Wang S.-D., Herbette L.G.: Comparison of location and binding for the positively charged 1,4-dihydropyridine calcium channel antagonist amlodipine with uncharged drugs of this class in cardiac membranes. Mol. Pharmacol. 1989; 36, 634-640. Mason R.P., Rhodes D.G., Herbette L.G.: Reevaluating equilibrium and kinetic binding parameters for lipophilic drugs based on a structural model for drug interaction with biological membranes. J. Med. Chem. 1991; 34: 869-777. McLaughlin S.: The electrostatic properties of membranes. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1989; 18: 113136. Mellerup E., Langer S.Z., et al.: Validity of imipramine platelet binding sites as a biological marker of endogenous depression. A World Health Organization Collaborative Study. Pharmacopsychiatry 1990; 23: 113-117. Meltzer H.Y., Arora R.C., Baber R., Tricou B.J.: Serotonin uptake in blood platelets of psychiatric patients. Arch. Gen. Psychiatry 1981; 38: 1322-1326. Meltzer H.Y., Lowy M.T.: The serotonin hypothesis of depression. In: Psychopharmacology: The Third Generation of Progress (Meltzer H.Y., Ed.), New York: Raven Press, 1987; 513-526. Meyer J.H., Wilson A.A., Ginovart N., Goulding V., Hussey D., Hood K., Houle S.: Occupancy of serotonin transporters by paroxetine and citalopram during treatment of depression: a [11C]DASB PET imaging study. Am. J. Psychiatry 2001; 158: 1843-1849. Miyake K., Fukuchi H., Kitaura T., Kimura M., Sarai K., Nakahara T.: Pharmacokinetics of amitriptyline and its demethylated metabolite in serum and specific brain regions of rats after acute and chronic administration of amitriptyline. J. Pharmaceutical Sci. 1990; 79: 288-291. Moor M., Honegger U.E., Wiesmann U.N.: Organspecific, qualitative changes in the phospholipid composition of rats after chronic administration of the antidepressant drug desipramine. Biochem. Pharmacol. 1988; 37: 2035-2039. Mosior M., McLaughlin S.: Electrostatics and reduction of dimensionality produce apparent cooperativity when basic peptides bind to acidic lipids in membranes. Biochim. Biophys. Acta 1992; 1105: 185-187. Mouritsen O.G., Jørgensen K.: Micro-, nano- and meso-scale heterogeneity of lipid bilayers and its influence on macroscopic membrane properties. Mol. Membr. Biol. 1995; 12: 15-20. Mueller P.S., Davis J.M., Bunney W.E.Jr., Weil-Malherbe H., Cardon P.V.: Plasma free fatty acids concentration in depressive illness. Arch. Gen. Psychiatry 1970; 22: 216-221. Müller H.-J., Luxnat M., Galla H.-J.: Lateral diffusion of small solutes and partition of amphipaths in defect structures of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta 1986; 856: 283-289. Nagy A., Johansson R.: Plasma levels of imipramine and desipramine in man after different routes of administration. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1985; 290: 145-160. New R.R.C.: Preparation of liposomes. In: Liposomes. A Practical Approach (New R.R.C., Ed.), Oxford: Oxford Univ. Press, 1990, pp. 33-104.
38
Owens M.J., Nemeroff C.B.: Role of serotonin in the pathophysiology of depression: focus on the serotonin transporter. Clin. Chem. 1994; 40: 288-295. Peet M., Murphy B., Shay J., Horrobin D.: Depletion of omega-3 fatty acid levels in red blood cell membranes of depressive patients. Biol. Psychiatry 1998; 43: 315-319. Peet M., Stokes C.: Omega-3 fatty acids in the treatment of psychiatric disorders. Drugs 2005; 65: 1051-1059. Penttinen J.: Hypothesis: low serum cholesterol, suicide, and interleukin-2. Am. J. Epidemiol. 1995; 141: 716718. Perel J.M., Stiller R.L., Glassman A.H.: Studies on plasma level/effect relationships in imipramine therapy. Commun Psychopharmacol 1978; 2: 429-439. Perry P.J., Zeilmann C., Arndt S.: Tricyclic antidepressant concentrations in plasma: an estimate of their sensitivity and specificity as a predictor of response. J. Clin. Psychopharmacol. 1994; 14: 230-240. Pettegrew J.W., Panchalingam K., McClure R.J., Gershon S., Muenz L.R., Levine J.: Effects of chronic lithium administration on rat brain phosphatidylinositol cycle constituents, membrane phospholipids and amino acids. Bipolar Disord. 2001; 3: 189-201. Pfrieger F.W.: Role of cholesterol in synapse formation and function. Biochim Biophys Acta 2003; 1610: 271280. Plenge P., Wiborg O.: High- and low-affinity binding of S-citalopram to the human serotonin transporter mutated at 20 putatively important amino acid positions. Neurosci. Lett. 2005; 383: 203-208. Racagni G., Brunello N.: Transynaptic mechanisms in the action of antidepressant drugs. Trends Pharmacol. Sci. 1984; 5 (12): 527-531. Rando R.R.: Regulation of protein kinase-C activity by lipids. FASEB J. 1988; 2: 2348-2355. Reith M.E.A., Sershen H., Lajtha A.: Binding of imipramine and cocaine to a model lipid membrane: comparison with binding to brain membranes. Neurochem. Res. 1984; 9: 965-977. Riant P., Urien S., Albengres E., Renouard A., Tillement J.P.: Effects of the binding of imipramine to erythrocytes and plasma proteins on its transport through the rat blood-brain barrier. J. Neurochem. 1988; 51: 421-425. Risch S.C., Leighton Y.H., Janowsky D.S.: Plasma levels of tricyclic antidepressants and clinical efficacy: review of the literature - part I. J. Clin. Psychiatry 1979; 40: 9-21. Rybakowski J.K., Lehmann W.: Decreased activity of erythrocyte membrane ATPases in depression and schizophrenia. Neuropsychobiol. 1994; 30: 11-14. Salem N.Jr., Niebylski C.D.: The nervous system has an absolute molecular species requirement for proper function. Mol. Membr. Biol. 1995; 12: 131-134. Sanchez C., Hyttel J.: Comparison of the effects of antidepressants and their metabolites on reuptake of biogenic amines and on receptor binding. Cell. Mol. Neurobiol. 1999; 19: 467-489. Sandermann H., Duncan T.M.: Lipid-dependent membrane enzymes – kinetic modeling of the activation of protein-kinase-C by phosphatidylserine. Biochim. Biophys. Acta 1991; 1069: 235-240. Sanganahalli B.G., Joshi P.G., Joshi N.B.: Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane dynamics-a fluorescence spectroscopic study. Life Sci. 2000; 68: 81-90. Scanlon S.M., Williams D.C., Schloss P.: Membrane cholesterol modulates serotonin transporter activity. Biochemistry 2001; 40: 10507-10513.
39
Schloss P., Henn F.A.: New insights into the mechanisms of antidepressant therapy. Pharmacol. Ther. 2004; 102: 47-60. Schreier S., Malheiros S.V.P., de Paula E.: Surface active drugs: self-association and interaction with membranes and surfactants. Physicochemical and biological aspects. Biochim. Biophys. Acta 2000; 1508: 210-234. Schwyzer R.: New principle in QSAR: membrane requirements. J. Recept. Res. 1991; 11: 45-57. Seelig J., Nebel S., Ganz P., Bruns C.: Electrostatic and nonpolar peptide-membrane interactions. Lipid binding and functional properties of somatostatin analogues of charge z = +1 to z = +3. Biochemistry 1993; 32: 9714-9721. Sengupta N., Datta S.C., Sengupta D.: Platelet and erythrocyte membrane lipid and phospholipid patterns in different types of mental patients. Biochem. Med. 1981; 25: 267-275. Seydel J.K., Coats E.A., Cordes H.P., Wiese M.: Drug membrane interaction and the importance for drug transport, distribution, accumulation, efficacy and resistance. Arch. Pharm. (Weinheim) 1994; 327: 601-610. Seydel J.K., Wiese M.: Drug-Membrane Interactions. Analysis, Drug Distribution, Modeling. Weinheim: WileyVCH, 2002. Shinitzky M.: Membrane fluidity and receptor function. In: Membrane Fluidity (Kates M., Manson L.A., Eds.), New York: Plenum Publ. Corp., 1984, pp. 585-601. Siever L.J., Kahn R.S., Lawlor B.A., Trestman R.L., Lawrence T.L., Coccaro E.F.: II. Critical issues in defining the role of serotonin in psychiatric disorders. Pharmacol. Rev. 1991; 43: 509-525. Sikora J., Krulík R., Beitlová D., Příhoda P.: Plasma levels of antidepressants after their withdrawal. Endocrinol. Exp. 1990; 24: 221-227. Singer S.J., Nicolson G.L.: The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 1972; 175: 720731. Srivastava L.K., Kazmi S.M., Blume A.J., Mishra R.K.: Reconstitution of affinity-purified dopamine D2 receptor binding activities by specific lipids. Biochim. Biophys. Acta 1987; 900: 175-182. Stahl S.M.: Serotonin receptors and the mechanism of action of antidepressant drugs: postmortem, platelet, and neuroendocrine studies in depressed patients. In: Serotonin IA Receptors in Depression and Anxiety (Stahl S.M., Gastpar M., Keppel Hesselink J.M., Traber J., Eds.), New York: Raven Press, 1992, pp. 119-134 Stahl S.M.: 5HT1A receptors and pharmacotherapy. Is serotonin receptor down-regulation linked to the mechanism of action of antidepressant drugs? Psychopharmacol. Bull. 1994; 30: 39-43. Stahl S. M. (2000): Essential Psychopharmacology. Neuroscientific Basis and Practical Applications. Second Edition, Cambridge Univ. Press, Cambridge Stain-Malmgren R., Khoury A.E., Ǻberg-Wistedt A., Tham A.: Serotonergic function in major depression and effect of sertraline and paroxetine treatment. Int. Clin. Psychopharmacol. 2001; 16: 93-101. Stankowski S.: Surface charging by large multivalent molecules. Extending the standard Gouy-Chapman treatment. Biophys. J. 1991; 60: 341-351. Sulser F., Janowsky A.J., Okada F., Manier D.H., Mobley P.L.: Regulation of recognition and action function of the norepinephrine (NE) receptor-coupled adenylate cyclase system in brain: implications for the therapy of depression. Neuropharmacol. 1983; 22: 425-431. Švestka a kol.: Psychofarmaka v klinické praxi. Praha: Grada , 1995.
40
Terao T., Nakamura J., Yoshimura R., Ohmori O., Takahashi N., Kojima H., Soeda S., Shinkai T., Nakano H., Okuno T.: Relationship between serum cholesterol levels and meta-chlorophenylpiperazine-induced cortisol responses in healthy men and women. Psychiatry Res. 2000; 96: 167-173. Tieleman D.P., Marrink S.J., Berendsen H.J.C.: A computer perspective of membranes: molecular dynamics studies of lipid bilayer systems. Biochim. Biophys. Acta 1997; 1331: 235-270. Toplak H., Zuehlke R., Loidl S., Hermetter A., Honegger U.E., Wiesmann U.N.: Single and multiple desipramine exposures of cultured cells. Changes in cellular anisotropy and in lipid composition of whole cells and of plasma membranes. Biochem. Pharmacol. 1990; 39: 1437-1443. Tsakiris S., Deliconstantinos G.: Influence of phosphatidylserine on (Na+/K+)-stimulated ATPase and acetylcholinesterase activities of dog brain synaptosomal plasma-membranes. Biochem. J. 1984; 220: 301307. Tuomisto J., Tukiainen E., Ahlfors U. G.: Decreased uptake of 5-hydroxytryptamine in blood platelets from patients with endogenous depression. Psychopharmacology 1979; 65: 141-147. Vevera J., Žukov I., Morcinek T., Papežová H.: Cholesterol concentrations in violent and non-violent women suicide attempters. Eur. Psychiatry 2003; 18: 23-27. Vinař O.: Psychofarmaka. Minimum pro praxi. Praha: Triton, 1998. Vinokur V.A., Gubachev Iu.M.: The effect of antidepressants on lipid metabolism and the clinical course in IHD. Ter. Arkh. 1994; 66: 76-80. Xia Z., Ying G., Hansson A.L., Karlsson H., Xie Y., Bergstrand A., DePierre J.W., Nässberger L.: Antidepressant-induced lipidosis with special reference to tricyclic compounds. Prog. Neurobiol. 2000; 60: 501-512. Young G., Conquer J.: Omega-3 fatty acids and neuropsychiatric disorders. Reprod. Nutr. Dev. 2005; 45: 1-28. Zachowski A., Durand P.: Biphasic nature of the binding of cationic amphipaths with artificial and biological membranes. Biochim. Biophys. Acta 1988; 937: 411-416. Zimmer G.: Fluidity of cell membranes in the presence of some drugs and inhibitors. In: Membrane Fluidity (Kates M.and Manson L.A., Eds.), Plenum Publ. Corp., 1984, pp. 169-203.
41
2. SHRNUTÍ K SOUBORU PUBLIKOVANÝCH PRACÍ
2.1. Vazba imipraminu k fosfolipidovým dvojvrstvám měřená metodou vazby radioligandu Příloha 1: FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava and VELENOVSKÁ, Marie. Binding of imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol. Biophys. 2004, vol. 23, no. 1, p. 77-99. Úvod Tricyklická antidepresiva (TCA) jsou nejdůkladněji prozkoumanou skupinou antidepresiv, neboť se používají k léčbě afektivních poruch již téměř 50 let. Chemicky se jedná o amfifilní molekuly ze skupiny dibenzazepinů nebo dibenzcykloheptanodienů, které za fyziologických podmínek nesou kladný náboj (pKw = 9,4). Jejich primárním biochemickým účinkem vedoucím k terapeutickým účinkům je inhibice funkce membránových přenašečů pro serotonin a noradrenalin v neuronálních membránách. Při ztrátě kladného náboje se molekula TCA stává nepolární a může se akumulovat v hydrofobním vnitřku dvojvrstvy nebo projít na druhou stranu membrány, získat náboj a být lokalizována na vnitřním povrchu nebo se uvolnit do vodné fáze. Nakolik se akumulace TCA v lipidové části buněčných membrán podílí na jejich terapeutických nebo vedlejších účincích není známo. Pro popis adsorpce nebo inkorporace amfifilních léčiv do lipidových dvojvrstev lze použít Gouyovu-Chapmanovu teorii, která umožňuje provést korekci vazebných izoterem na elektrostatické efekty u povrchu membrán. Mohou tak být určeny správné vazebné parametry léčiv k lipidovým dvojvrstvám a rozlišen příspěvek hydrofobních a elektrostatických interakcí k celkové vazbě. Dosud nebyla dostatečně poznána heterogenita vazby a vazebné parametry TCA k lipidovým dvojvrstvám. V našich dřívějších experimentech (Fišar et al. 1991) jsme zjistili, že na vazbu TCA k modelovým membránám má větší vliv lipidové složení dvojvrstvy, než rozdíly mezi jednotlivými TCA, přičemž významnou úlohu mají fosfolipidy nesoucí záporný výsledný náboj. Proto jsme naše experimenty provedli s mnohovrstevnými liposomy připravenými z fosfatidylcholinu (PC), který je celkově elektricky neutrální, nebo fosfatidylserinu (PS), který nese celkový záporný náboj. Zaměřili jsme se na možnost rozlišení mezi slabší 42
povrchovou adsorpcí TCA k liposomům a inkorporací léku dovnitř dvojvrstvy. Z antidepresiv byl testován především imipramin (IMI), ale také desipramin (DMI), didesmetylimipramin (DDMI) a amitriptylin (AMI). Cíle Cílem této práce byla charakterizace vazby TCA k lipidovým membránám. Studie byla rodělena do tří etap: 1. Určit propustnost fosfolipidových dvojvrstev pro IMI: úkolem bylo zjistit, zda mnohovrstevné liposomy jsou vhodným modelem pro studium interakcí IMI s lipidovou dvojvrstvou, tj. prokázat, že IMI prochází lipidovými dvojvrstvami dostatečně rychle, aby změřené vazebné parametry odpovídaly vazbě ke vnějším i vnitřním dvojvrstvám. 2. Změřit a analyzovat celkovou vazbu IMI k liposomům: úkolem bylo analyzovat vazebné izotermy vazby IMI k liposomům připravených z celkově elektroneutrálních nebo záporně nabitých fosfolipidů pomocí Gouyovy-Chapmanovy teorie a Sternových rovnic. 3. Charakterizovat vysokoafinní vazbu TCA k liposomům: úkolem bylo vypracovat techniku umožňující rozlišit slabou povrchovou adsorpci od silnější vazby IMI do vniřních oblastí lipidových dvojvrstev a určit vazebné parametry silné vazby TCA lipidovým membránám a možnosti jejího vytěsňování. Metody Byla měřena rovnovážná vazba TCA k lipidovým membránám. Jako modelové membrány byly použity liposomy typu MLV (viz kap. 1.5.1) připravené z PC nebo PS. Pro měření vazby TCA k MLV jsme použili jsme metodu vazby radioligandu s tritiem značenými antidepresivy, přičemž pro oddělení volného a vázaného radionuklidu byla použita centrifugační nebo filtrační technika. Vazba antidepresiv byla popsána rozdělovacími koeficienty nebo parametry Langmuirových nebo Sternových adsopčních izoterem. Výsledky Propustnost lipidových dvojvrstev pro IMI Úlohu jsme řešili porovnáním tří typů vzorků odlišujících se tím, ve které fázi přípravy MLV byl přidán tritiem značený IMI, a změřením kinetiky asociace a disociace IMI z liposomů. Zjistili jsme, že inkubace MLV s IMI při 20°C po dobu 30 min. je postačující pro ustavení rovnovážného stavu a rovnoměrného rozdělení IMI v mnohovrstevných liposomech.
43
Měření a analýza celkové vazby IMI k liposomům Vazebné izotermy IMI k dvojvrstvám připraveným z PC a z PS byly změřeny s použitím centrifugační techniky pro oddělení nenavázaného antidepresiva. Při jejich analýze pomocí Sternových rovnic byl vzat v úvahu vliv IMI a monovalentních kationtů v roztoku na povrchový potenciál lipidových dvojvrstev a hustota povrchového náboje lipidových membrán byla korigována na průměrný elektrický náboj IMI a na zvětšení plochy membrány v důsledku inkorporace IMI do dvojvrstvy. Pro různé koncentrace IMI tak byly spočteny parametry jako elektrostatický povrchový potenciál, koncentrace IMI ve vodné fázi v bezprostřední blízkosti povrchu membrán, hydrofobní rozdělovací koeficient nebo zdánlivý celkový rozdělovací koeficient. Zatímco poslední dva uvedené parametry se od sebe pro membrány připravené z celkově elektroneutrálního PC příliš nelišily, záporný náboj PSmembrán způsobil mnohem menší hodnoty hydrofobního rozdělovacího koeficientu a vyšší hodnoty zdánlivého celkového rozdělovacího koeficientu. Koncentrační závislosti sledovaných parametrů byly silně nelinární. Experimentálně určené molární množství IMI vázaného na mol lipidu bylo pro PC menší a pro PS výrazně větší než předpovídá GouyovaChapmanova teorie. Tyto odchylky experimentálních dat od teorie ukazují na významnou úlohu jak elektrostatických odpudivých sil způsobených molekulami IMI vázanými v PCmembránách, tak elektrostatických přitažlivých sil mezi IMI a zápornými náboji v PSmembránách. Vysokoafinní vazba TCA k liposomům Vypracování vhodné techniky pro měření vysokoafinní vazby TCA k MLV obnášela např. porovnání účinnosti filtrace a centrifugace pro oddělení MLV od vodného média, stanovení vazby tritiovaného TCA na používané filtry, určení závislosti vazby TCA k MLV na koncentraci fosfolipidů a další. Vazebné saturační izotermy TCA k dvojvrstvám připraveným z PC, PS nebo hrubého extraktu lipidů z mozku byly měřeny s použitím techniky rychlé filtrace pro oddělení nenavázaného TCA. Vazebné parametry spočtené s použitím GouyovyChapmanovy teorie a zdánlivé vazebné parametry spočtené bez jejího použití se pro PCmembrány významně nelišily, zatímco pro PS-membrány byly velmi rozdílné. Množství navázaného IMI na mol fosfolipidu bylo významně vyšší pro PS-membrány. Tyto výsledky ukazují na významnou úlohu PS v interakcích IMI s membránami. Parametry vazby různých TCA (IMI, DMI, DDMI, AMI) se významně nelišily, což ukazuje na určující úlohu lipidového složení membrán při jejich interakcích s TCA. Analýza vytěsňovacích křivek
44
ukázala, že vazba IMI k PS-membránám je mnohem hůře vytěsnitelná, než vazba k PCmembránám. Závěry •
Pro měření interakcí antidepresiv s lipidovými dvojvrstvami lze použít modifikovanou metodu vazby radioligandu, původně vyvinutou pro receptorové studie. Citlivost metody a možnosti analýzy výsledků jsou srovnatelné např. s izotermickou titrační kalorimetrií.
•
Vyšší hydrofobní rozdělovací koeficienty pro IMI v PC-membránách ve srovnání s PSmembránami lze interpretovat jako důsledek lepší dostupnosti hydrofobního vnitřku PCdvojvrstev pro IMI.
•
Porovnání hodnot změřených a hodnot korigovaných na základě Gouyovy-Chapmanovy teorie ukázalo, že při nízkých koncentracích IMI (pod 1 µmol/l) je vliv navázaného IMI na povrchový náboj PC-membrán zanedbatelný; určující síly pro vazbu jsou zřejmě síly van der Waalsovy. Oproti tomu pro vazbu IMI k PS-membránám jsou elektrostatické interakce určující i při velmi nízkých koncentracích IMI.
•
Nelinearita rozdělovacích koeficientů překvapivě pozorovaná i při nízkých koncentracích IMI znamená, že parametry Sternových adsopčních izoterem (tj. maximální množství léčiva vázaného na mol fosfolipidu a rovnovážná asociační konstanta) popisují vazbu TCA k lipidovým membránám mnohe lépe, než jednoduché rozdělovací koeficienty.
•
Významně vyšší vazebná kapacita a nižší asociační konstanta pro vazbu IMI k PSmembránám ve srovnání s vazbou k PC-membránám znamená, že fosfolipidové složení může výrazně ovlivňovat rozdělení antidepresiv mezi membránu a vodnou fázi, a že při analýze vazby antidepresiv k záporně nabitým membránám je vhodnější použít jejich koncentraci v bezprostřední blízkosti membrány, než objemovou koncentraci ve vodném roztoku. Model založený na nespecifické akumulaci IMI v blízkosti povrchu membrán následovaný hydrofobní adsorpcí je mnohem realističtější, než model běžně používaný v receptorových studií, který předpokládá stejnou koncentraci ligandu ve větší i menší vzdálenosti od buněčného povrchu.
•
Vazebné konstanty antidepresiv k lipidové části buněčných membrán jsou mnohem menší, než je tomu pro receptorová vazebná místa, avšak za předpokladu, že každá receptorová molekula je obklopena řádově 106 lipidovými molekulami, je součin počtu lipidových molekul a jejich vazebné kapacity a vazebné konstanty blízký receptorové vazebné konstantě. Významná část IMI je vázána k lipidové části studovaných buněčných
45
membrán a není dostupná pro vazbu k receptorovým vazebným místům přístupným v vodné fáze. Na druhou stranu přítomnost negativně nabitých skupin v blízkosti receptorového vazebného místa může úbytek dostupného IMI i více než kompenzovat. •
Pro zjištění možné interference mezi vazbou IMI do lipidové dvojvrstvy a ke specifickým vazebným místům v biologických membránách jsme detailně proměřili silnou (vysokoafinní) část z celkové vazby IMI k membránám z PC nebo PS. Zjistili jsme, že pro toto měření je vhodné použít filtrační techniku oddělení volného a vázaného IMI. Čisté PC-membrány vykazují saturovatelnou vytěsnitelnou (specifickou) vysokoafinní vazbu, která je však z fyzikálního hlediska jen zdánlivá. Nicméně naše zjištění znamená, že v receptorových vazebných studiích, kdy je studována vazba IMI nebo podobného amfifilního ligandu, může docházet k obtížně rozlišitelné interferenci mezi vazbou ke specifickému proteinovému vazebnému místu a touto zdánlivou vysokafinní vazbou do lipidové dvojvrstvy. Specifikace vazebných sil podílejících se na zdánlivé vysokoafinní vazbě TCA k lipidovým dvojvrstvám je předmětem naší následující publikace (viz Příloha 2).
46
2.2. Interakce tricyklických antidepresiv s fosfolipidovými dvojvrstvami Příloha 2: FIŠAR, Zdeněk. Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid bilayer membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 161-180. Úvod V dřívější práci (viz Příloha 1) jsme ukázali, že vazba tricyklických antidepresiv (TCA) k modelovým membránám má kromě nízkoafinní složky charakterizující hlavně slabou povrchovou adsorpci nabitých molekul TCA i zdánlivou vysokoafinní složku, která dosud nebyla popsána a charakterizována. Rovněž jsme ukázali, že vazba TCA k liposomům silně závisí na elektrickém náboji, který je na jejich povrchu a který je dán nábojem fosfolipidů tvořících dvojvrstvy. Fosfatidylcholin (PC) a fosfatidyletanolamin (PE) jsou v širokém rozsahu pH celkově elektricky neutrální, neboť záporný náboj fosfátové skupiny (pKPO4- ≤ 1) je kompenzován kladným nábojem cholinové hlavičky (pKNH3+ = 11,25); při vysokých pH však nesou PC a PE záporný náboj. Fosfatidylserin (PS) může nést kromě záporného náboje fosfátu (pKPO4- ≤ 1) a kladného náboje aminoskupiny (pKNH3+ = 11,5) i záporný náboj na karboxylové skupině (pKCOO- = 5,5). PS tedy nese za normálních podmínek záporný náboj, který se zvyšuje při vyšších hodnotách pH, zatímco při nízkých pH je PS elektricky neutrální. Fosfatidylinositol (PI) je negativně nabitý v širokém rozsahu pH (pKPO4- = 2,7). Podíl coulombických interakcí na celkové vazbě TCA k liposomům připraveným z různých fosfolipidů lze určit na základě měření pH závislostí těchto vazeb. Mezi nejčastějí používaná a studovaná TCA patří imipramin (IMI), desipramin (DMI), amitriptylin (AMI) a nortriptylin (NOR). Při pH 7,4 nese kolem 99% molekul TCA ve vodě kladný náboj (pKw = 9,4). Hodnoty pK se však mohou lišit u ionizovatelných molekul léčiv lokalizovaných v lipidové dvojvrstvě od molekul léčiv ve vodném roztoku. Snadno lze odvodit vztah mezi posunem pK léčiva v membráně a ve vodě na jedné straně a poměrem rozdělovacích koeficientů nabité a nenabité formy tohoto léčiva na straně druhé. Posun pK lze určit z pH-závislosi vazby léčiva k lipidové dvojvrstvě. Cíle Cílem této práce byla charakterizace zdánlivé vysokoafinní vazby TCA k lipidovým dvojvrstvám. Především jsme chtěli analýzou pH-závislostí vazby určit podíl Coulombových 47
a jiných nekovalentních interakcí v této vazbě, a rozlišit vliv vlastností antidepresiv a vlastností fosfolipidů na vazbu. Metody Byly změřeny pH-závislosti zdánlivé vysokoafinní vazby čtyř různých tricyklických antidepresiv (IMI, DMI, AMI, NOR) k mnohovrstevným liposomům (MLV) připraveným z různých fosfolipidů (PC, PE, PS, PI). Pro měření vazby TCA k MLV byla použita metoda vazby radioligandu s tritiem značenými antidepresivy, přičemž pro oddělení volného a vázaného radionuklidu byla použita filtrační technika. Záchyt MLV na filtrech při různých hodnotách pH byl měřen pomocí tritiem značených fosfolipidů. Výsledky Nejprve byla upřesněna metoda měření stanovením pH-závislostí účinnosti záchytu MLV (obsahujících tritiem značené fosfolipidy) na filtrech. Při vyhodnocení vlastních vazebných experimentů potom byl proveden přepočet na 100% účinnost záchytu. Metodou fluorescenčních sond jsme ověřili, že v rozsahu pH 4 až 11 nedochází k významným změnám v anizotropie fluorescence membránových sond, tj. nedochází k podstatným změnám ani ve struktuře a uspořádání lipidových dvojvrstev, ani v pohyblivosti membránových molekul. Metodou vazby radioligandu byly změřeny pH-závislosti (v rozsahu 2 až 12) vazby tritiovaného IMI, DMI, AMI nebo NOR k liposomům připraveným jak z čistého PC, PE, PS nebo PI, tak ze směsí PC+PE, PC+PS nebo PC+PI. Křivky byly vyhodnoceny na základě známých hodnot pK zásaditých a kyselých skupin na molekulách fosfolipidů a antidepresiv. Zjistili jsme, že: 1. Pro rozlišení vazby nabitých a nenabitých molekul bylo nutné použít velmi nízké (nanomolární) koncentrace TCA. 2. Celková vazba byla závislá jak na pH, tak na lipidovém složení membrán, zatímco nespecifická vazba byla nízká a prakticky konstantní v celém rozsahu pH. 3. Průběhy pH-závislostí vazby k PC-, PE- nebo PI-membránám odpovídaly změně průměrného kladného náboje na molekulách TCA, avšak křivka pro PC byla posunuta směrem k nižším pH. Průběhy závislostí vazby TCA k PS-membránám byly komplexnější a odrážely jak změnu kladného náboje na TCA, tak negativního náboje na PS molekulách. 4. Analýzou pH-závislostí vazby k PC-membránám bylo zjištěno, že poměr rozdělovacích koeficientů nenabité a nabité formy antidepresiva je pro IMI a AMI asi 50, zatímco pro 48
DMI a NOR pouze 13. Pro dvojvrstvy připravené ze směsi PC+PE byl rozdělovací koeficient nenabité formy IMI nebo AMI dokonce 500 krát větší než formy nabité, pro DMI nebo NOR jen 250krát větší. 5. pH-závislosti vazby TCA k membránám připraveným z PS nebo PS+PC ukázaly, že při fyziologickém pH je příspěvek nabitých a nenabitých molekul TCA k vazbě přibližně stejný. 6. Vazba TCA k membránám z PI+PC je realizována inkorporací nabitých i nenabitých molekul TCA. Závěry •
Ukázali jsme, že pro získání základních údajů o intermolekulových silách podílejících se na zdánlivé vyskoafinní vazbě TCA a lipidovým dvojvrstvám lze použít nejen spektroskopicé a kalorimetrické metody, ale i metodu vazby radiologandu.
•
Velikost zdánlivé vysokoafinintní vazby TCA k lipidovým dvojvrstvám závisí silně na fosfolipidovém složení membrán a na pH, ale je velmi podobná pro různá TCA.
•
Průběhy pH-závislostí vazby TCA k membránám z elektroneutrálních fosfolipidů (PC, PE) lze interpretovat jako důsledek usnadněné inkorporace nenabitých molekul TCA do hydrofobního vnitřku dvojvrstev tvořených PC, PE nebo PC+PE.
•
Vyšší poměr rozdělovacích koeficientů nenabité a nabité formy pro vazbu IMI a AMI ve srovnání s DMI a NOR ukazuje, že v membránách připravených z PC nebo PC+PE ovlivňuje silně zdánlivou vysokoafinní vazbu nejen náboj, ale i metylace bočního acylového řetězce TCA .
•
Z měření vazby TCA k membránám obsahujícím PS vyplývá, že na zdánlivé vysokoafinní vazbě se za fyziologických podmínek silně podílí také Coulombovy interakce. Porovnání vazby TCA k membránám obsahujícím PS s membránami obsahujícími PI ukázalo, že existuje určitá specificita vazby TCA k PS, která není určena celkovým záporným nábojem jeho polární hlavičky. Jedná se zřejmě o důsledek rozdílného prostorového rozdělení náboje na povrchu membrán tvořených PS a PI.
•
Podíl jednotlivých nekovalentních interakcí na zdánlivé vysokoafinní vazbě TCA k lipidovým membránám silně závisí na fosfolipidovém složení membrán, tzn. že určujícím faktorem je rozložení náboje v oblasti polárních hlaviček fosfolipidů. Existuje však i závislost vazby na typu TCA, především na metylaci či demetylaci jejich acylového řetězce.
49
2.3. Rozdělení imipraminu mezi krevní buňky, plazmu a mozek Příloha 3: FIŠAR, Zdeněk; KRULÍK, Radoslav; FUKSOVÁ, Květoslava and SIKORA, Jan. Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol. Biophys. 1996, vol. 15, p. 51-64. Úvod Tricyklická antidepresiva, jako je imipramin (IMI) a desipramin (DMI), patří do skupiny amfifilních léčiv nesoucích kladný náboj. Dobře prostupují hematoencefalickou bariérou a akumulují se v lipidové části buněčných membrán. Byla zjištěna rozmezí plazmatických koncentrací potřebná pro terapeutickou účinnost antidepresiv, ale plazmatické koncentrace IMI a jeho metabolitů vykazují i při stejném dávkování značné interindividuální rozdíly. Nebyl dosud stanoven dostatečně přesný vztah mezi běžně měřenými koncentracemi v plazmě a skutečnými koncentracemi v mozku. Po dlouhodobém podávání antidepresiv dochází k ustavení jejich koncentrace jak v krvi, tak v mozku. Antidepresiva se mohou vyskytovat volné i vázané v mimobuněčném i nitrobuněčném prostoru a v membránách. V krvi se amfifilní léčiva akumulují především v erytrocytárních membránách. Akumulace antidepresiv v mozkových membránách a její vztah ke koncentracím plazmatickým nebyly dosud určeny. Cíle Cílem této práce bylo stanovení vztahu mezi koncentracemi antidepresiv v krvi a mozku s uvážením jejich rozdělení mezi membrány, plazmu a cytosol. Metody Laboratorním potkanům byl podáván dlouhodobě IMI v různých dávkách a poté byl měřeny koncentrace IMI a jeho aktivního metabolitu DMI v plazmě, erytrocytech, erytrocytárním cytosolu, erytrocytárních membránách (ghostech), homogenátu z mozku, mozkových membránách a mozkovém cytosolu. Pro měření koncentrací antidepresiv byla použita radioimunoassay (RIA) s tritiovaným IMI jako radioligandem. Koncentrace antidepresiv byly vyjádřeny buď v ng na 1 ml vzorku (plazmy, erytrocytů, erytrocytárního cytosolu, mozkové tkáně nebo mozkového cytosolu), nebo v ng na 1 ml fosfolipidových membrán (pro
50
erytrocytární nebo mozkové membrány) za předpokladu, že hustota membrán je přibližně 1 g/cm3. Výsledky Použité dávky IMI vedly po 7 dnech podávání k plazmatickým hladinám v rozsahu 3 až 338 ng/ml. Byla potvrzena akumulace IMI i DMI v buněčných membránách. Jejich koncentrace v erytrocytárních ghostech činila téměř 80% z koncentrace v neporušených erytrocytech. Pro kvantitativní ohodnocení vzájemné souvislosti koncentrací IMI+DMI v různých vzorcích byly spočteny korelační koeficienty pro všechny dvojice koncentrací měřených v různých částech krve a mozkové tkáně. Byly zjištěny statisticky významné závislosti mezi všemi těmito dvojicemi koncentrací. Byly spočteny koeficienty pro vzájemný přepočet koncentrací IMI+DMI v plazmě, erytrocytech, erytrocytárním cytosolu, erytrocytárních ghostech, homogenátu z mozku, mozkových membránách a mozkovém cytosolu. Ukázalo se, že dochází k výrazné akumulaci IMI+DMI v mozkové tkáni, zvláště v membránách. Koncentrace v homogenátu z mozkové tkáně byla zjištěna téměř 15 krát vyšší než v neporušených erytrocytech, koncentrace v mozkových membránách asi 11 krát vyšší než v erytrocytárních membránách atd. Z analýzy dat vyplynulo, že existuje primární závislost mezi koncentracemi v mozkovém homogenátu, v krevní plazmě a v erytrocytárních membránách. Pomocí vícenásobné regresní analýzy jsme nalezli vztah pro výpočet koncentrace antidepresiva v mozkové tkáni z koncentrací v plazmě a erytrocytárních membránách Závěry •
Koncentrace antidepresiv v membránách, především mozkových, jsou mnohem vyšší než koncentrace v plazmě. Jakou úlohu má tato akumulace antidepresiv v membránách v jejich terapeutických účincích není dosud známo.
•
Existuje významná závislost mezi koncentracemi antidepresiva v mozku (resp. mozkovém homogenátu), v krevní plazmě a v erytrocytárních membránách. Pro dobrý odhad koncentrace imipraminu v mozkové tkáni lze proto použít koncentrace změřené v krvi.
•
Koncentrace antidepresiv v mozku jsou určeny jak koncentracemi v plazmě, tak koncentracemi v membránách krevních buněk, a mohou být v principu ovlivněny změnami složení nebo vlastností lipidové části buněčných membrán. Lze tak vysvětlit skutečnost, že v některých případech plazmatické koncentrace antidepresiv nekorelují dobře s jejich terapeutickými účinky. 51
2.4. Vliv antidepresiv s různými farmakologickými účinky na uptake serotoninu do trombocytů Příloha 4: FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin and KALIŠOVÁ, Lucie. Effect of pharmacologically selective antidepressants on serotonin uptake in rat platelets. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 1, p. 113-128. Úvod Primární biochemické účinky různých antidepresiv jsou velmi různorodé (viz kap. 1.3). Přesto po dlouhodobém podávání pozitivně ovlivňují klinicky stejné depresivní příznaky. Existují důkazy, že antidepresiva s farmakologicky selektivními primárními účinky ovlivňují neurotransmisi zprostředkovanou jak cílovým neurotransmiterem, tak i jinými neurotransmitery. Mechanismy propojení mezi různými systémy aktivovanými antidepresivy však nejsou dostatečně známy. Existuje shoda v tom, že za terapeutické účinky antidepresiv jsou odpovědné adaptivní buněčné změny v monoaminergních neurotransmiterových systémech. V hypotézách afektivních poruch je pozornost věnována především serotonergní aktivitě v mozku. Tato aktivita je uskutečňována a modulována především serotoninovými receptory a přenašeči a syntézou a metabolismem sertotoninu. Důležitou úlohu v serotoninových hypotézách afektivních poruch má membránový přenašeč pro serotonin (SERT), který má určující úlohu v regulaci koncentrace serotoninu uvolněného do synaptické stěrbiny (viz kap. 1.4) a který je inhibován řadou antidepresiv. Vzhledem k závislosti aktivity SERT na interakcích s membránovými lipidy a cholesterolem lze uvažovat o spojení serotoninových a membránových hypotéz afektivních poruch (viz kap. 1.2.2 a 1.2.3). Není dosud známo, zda dlouhodobé podávání antidepresiv s odlišnými primárními biochemickými účinky vede ke společným adaptivním změnám např. v aktivitě SERT. Na základě předpokladu, že parametry kinetiky uptake serotoninu do trombocytů lze používat pro sledování změn v serotonergní aktivity v mozku (viz kap. 1.4), jsme v této práci sledovali vliv různých antidepresiv na serotonergní systém laboratorních potkanů.
52
Cíle Cílem našich experimentů bylo zjistit jaký vliv má dlouhodobé podávání antidepresiv s různými primárnímuí farmakologickými účinky na zprostředkovaný transport serotoninu do trombocytů. Porovnáním vlivu akutního a dlouhodobého podávání antidepresiv jsme chtěli zjistit, zda dlouhodobé podávání antidepresiv s různou farmakologickou selektivitou může mít společný vliv na aktivitu SERT. Studie byla provedena ve dvou etapách: 1. Proměření akutních účinků antidepresiv na uptake serotoninu do trombocytů in vitro. 2. Stanovení vlivu dlouhodobého podávání antidepresiv in vivo na uptake serotoninu do trombocytů. Metody Laboratorním potkanům byla podávána antidepresiva s různými primárními biochemickými účinky: desipramin (účinný neselektivní inhibitor reuptake noradrenalinu), maprotilin (selektivní inhibitor reuptake noradrenalinu), citalopram (selektivní inhibitor reuptake serotoninu), moklobemid (reverzibilní inhibitor monoaminoxidasy) a lithium (stabilizátor nálady s různými účinky na přenos nervového signálu) po dobu 4 týdnů. Trombocyty byly izolovány z periferní krve a aktivita SERT (charakterizovaná parametry KM, Vmax a Vmax/KM; viz kap. 1.4) byla měřena pomocí tritiem značeného serotoninu. Výsledky 1. Krátkodobá in vitro inkubace trombocytů s antidepresivy vedla k inhibici uptake serotoninu do trombocytů pro citalopram > desipramin > maprotilin, zatímco pro moklobemid a lithium nebyla pozorována významná změna uptake. 2. Dlouhodobé podávání antidepresiv způsobilo adaptivní změny v transmembránovém přenosu serotoninu. Statisticky významné snížení KM oproti hodnotám kontrolní skupiny bylo zjištěno po podávání maprotilinu, citalopramu, moklobemidu a lithia; podávání desipraminu tento parametr neovlivnilo. Změny parametru Vmax nebyly statisticky významné. Poměr Vmax/KM, reprezentující účinnost vychytávání serotoninu z mimobuněčného prostoru, byl zvýšen po podávání všech antidepresiv, především po citalopramu a maprotolinu. Závěry •
Pozorované snížení zdánlivé Michaelisovy konstanty KM po podávání většiny antidepresiv lze interpretovat jako zvýšení afinity SERT pro substrát (serotonin). Zda může být tato 53
změna afinity způsobena membránovými lipidy a cholesterolem bylo studováno v naší další práci (viz Příloha 5). •
Nejen antidepresiva, která jsou selektivními inhibitory reuptake serotoninu (jako je citalopram), ale i antidepresiva s naprosto odlišnými primárními biochemickýmu účinky způsobují po dlouhodobém podávání adaptivní změny v přenosu serotoninu, které se projevují zvýšenou účinností vychytávání serotoninu z mimobuněčného prostoru.
•
Naše výsledky podporují hypotézu afektivních poruch založenou na předpokladu, že důležitým faktorem ve vzniku náchylnosti pro depresi je nedostatečná serotonergní aktivita a že jedním ze společných projevů dlouhodobého podávání různých antidepresiv je zvýšení této aktivity v mozku, které je umožněno mimo jiné i adaptivními změnami v membránovém přenosu serotoninu.
54
2.5. Vliv dlouhodobého podávání antidepresiv na lipidové složení mozkových membrán Příloha 5: FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin; TVRZICKÁ, Eva and STAŇKOVÁ, Barbora. Effect of long-term administration of antidepressants on the lipid composition of brain plasma membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 221-236. Úvod Je známo, že antidepresiva jsou amfifilní molekuly, které jednak více či méně specificky interagují s neurotransmiterovými receptory, přenašeči nebo katabolizujícími enzymy, jednak se akumulují v lipidové části membrán, především v membránách mozkových buněk. Např. celkové koncentrace imipraminu a jeho aktivního metabolitu desipraminu byly zjištěny v mozkové tkáni téměř 15krát vyšší než v neporušených erytrocytech z periferní krve, a koncentrace v plazmatických membránách izolovaných z mozku téměř 500krát vyšší než v mozkovém cytosolu, více něž 300krát vyšší než v plazmě z periferní krve a 11krát vyšší než v erytrocytárních membránách (viz Příloha 3). Zda má akumulace antidepresiv v lipidové části membrán mozkových buněk úlohu v jejich terapeutických účincích není dostatečně známo, ale v jejím důsledku dochází ke změnám v pohyblivosti, uspořádání a vzájemných interakcích membránových molekul, což může ovlivnit transmembránový přenos signálu. Byla popsána řada abnormalit v lipidové homeostázi při depresi, ale spojitost mezi dlouhodobým podávání terapeutických dávek antidepresiv a změnami lipidového složení mozkových plazmatických membrán dosud nebyla prokázána. V předchozí studii (viz Příloha 4) jsme zjistili, že dlouhodobé podávání antidepresiv s různou farmakologickou selektivitou vede k adaptivním změnám v přenosu serotoninu do trombocytů. Za pozorované zvýšení účinnosti vychytávání serotoninu z mimobuněčného prostoru bylo odpovědné zvýšení afinity membránového přenašeče pro serotonin (SERT). Podle hypotézy o měnitelné afinitě receptorů (viz kap. 1.2.3) mohou afinitu receptorů ovlivnit jak změny proteinové struktury, tak změny lokálního membránového mikrookolí nebo přímé interakce lipid-protein. Všechna antidepresiva ovlivňují monoaminergní neurotransmisi, což zřejmě vede ke změnám genové exprese v určitých neuronech. Předpokládáme, že důsledkem těchto procesů může být nejen změna denzity receptorů, přenašečů, enzymů apod., ale i regulace lipidového složení mozkových membrán. Studovali jsme proto vliv dlouhodobého podávání vybraných 55
antidepresiv s různými primárními mechanismy působení na fluiditu a lipidové složení plazmatických membrán izolovaných z mozku laboratorních potkanů. Cíle Cílem našich experimentů bylo zjistit jaký vliv má dlouhodobé podávání různých antidepresiv na vlastnosti a lipidové složení plazmatických membrán v mozku. Naše výsledky by měly přispět k potvrzení hypotézy o úloze membránových lipidů ve vzniku a léčbě afektivních poruch. Metody Byly měřeny změny v lipidovém složení a mikroviskozitě plazmatických membrán z mozku po dlouhodobém podávání antidepresiv. Laboratorním potkanům byla podávána antidepresiva s různými primárními biochemickými účinky (desipramin, maprotilin, citalopram, moklobemid a lithium) po dobu 4 týdnů. Z mozku těchto potkanů byly izolovány plazmatické membrány a poté byly jednak změřena jejich mikroviskozita metodou fluorescenčních sond (byly použity sondy 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien, DPH, a 1-(4-trimetylamoniumfenyl)-6-fenyl1,3,5-hexatrien, TMA-DPH), jednak byla izolována a analyzována lipidová část membrán. Celkové lipidy byly určeny vážením, cholesterol byl stanoven plynovou chromatografií a celkové fosfolipidy jako součet koncentrací fosfatidylcholinu, fosfatidyletanolaminu, fosfatidylserinu, fosfatidylinositolu a sfingomyelinu, přičemž jednotlivé fosfolipidy byly stanoveny dvourozměrnou tenkovrstevnou chromatografií a následným měřením fosforu. Výsledky •
Ve srovnání s kontrolami jsme pozorovali významné snížení v zastoupení fosfatidyletanolaminu v plazmatických membránách v mozku potkanů po podávání maprotilinu, citalopramu a moklobemidu.
•
Obsah membránového cholesterolu byl snížen po desipraminu a zvýšen po citalopramu nebo lithiu.
•
Došlo ke snížení v zastoupení neutrálních fosfolipidů po všech testovaných antidepresivech kromě desipraminu.
•
Snížení fosfatidylserinu bylo pozorováno po podávání maprotilinu nebo desipraminu a relativní zastoupení fosfatidylinositolu bylo sníženo po lithiu.
56
•
Významná negativní korelace byla zjištěna mezi obsahem cholesterolu a elektroneutrálních fosfolipidů.
•
Mikroviskozita membrán byla jen málo snížena po desipraminu a zvýšena po citalopramu.
Závěry •
Ukázali jsme, že dlouhodobá léčba antidepresivy ovlivňuje lipidové složení plazmatických membrán v mozku. Struktura a dynamické vlastnosti těchto membrán ale nebyly významně změněny oproti kontrolám.
•
Byla podpořena hypotéza, že změny v mozkové neurotransmisi vyvolané antidepresivy mohou být alespoň částečně spojeny i s adaptivními změnami ve složení lipidové části buněčných membrán, které se mohou transformovat do procesů přímo ovlivňujících transmembránový přenos nervového signálu.
•
Porovnání výsledků této práce s výsledky zjištěnými v předchozí práci (viz Příloha 4) naznačuje, že zvýšená aktivita transmembránového přenosu serotoninu po dlouhodobém podávání antidepresiv může být způsobena spíše změnami interakcí cholesterol-SERT nebo fosfolipid-SERT, než změnami mikroviskozity membrán.
57
2.6. Uptake serotoninu do trombocytů u depresivních pacientů během léčby Příloha 6: FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; ANDERS, Martin; SIKORA, Jan; FUKSOVÁ, Květoslava; KOVÁŘŮ, Hana and DOBROVSKÝ, Karel. Platelet serotonin uptake in depressed patients during treatment. Homeostasis. 1998, vol. 38, no. 4, p. 172-173. Úvod Podle serotoninové hypotézy deprese (viz kap. 1.2.2) jsou v patogeneze deprese zahrnuty abnormality v serotonergní neurotransmisi a terapeutické účinky antidepresiv jsou spojeny s adaptivními změnami v monoaminergních systémech. Určující úlohu v udržování serotonergní funkce má membránový přenašeč pro serotonin (SERT, viz kap. 1.4), který je také hlavním cílem většiny antidepresiv, včetně selektivních inhibitorů zpětného vychytávání (reuptake) serotoninu (SSRI). Předpokládá se, že serotonergní systém v trombocytech zrcadlí změny v aktivitě centrálního serotonergního systému. Trombocyty jsou proto vhodný model pro studium funkce serotonergního systému v mozku při depresivní poruše a její léčbě antidepresivy. V řadě prací byly zjištěny změny transportu serotoninu do trombocytů při depresi, avšak výsledky nejsou jednoznačné. Aktivita SERT je charakterizována parametry kinetiky přenosu serotoninu, tj. maximální rychlostí transportu (Vmax), která kvantifikuje kapacitu přenosového systému, a zdánlivou Michaelisovou konstantou (KM), která je vztažena k afinitě přenašeče (viz kap. 1.4). V této práci jsme publikovali naše předběžné výsledky o změnách uptake serotoninu měřených ex vivo v trombocytech depresivních pacientů před léčbou a během podávání citalopramu (antidepresivum ze skupiny SSRI). Pro rozlišení vlivu depresivního onemocnění od vlivu citalopramu byly do studie zařazeny pouze depresivní osoby, které dosud žádné antidepresivum nepožívaly. Další skupinu tvořily osoby s afektivní poruchou dlouhodobě léčenou lithiem (stabilizátor nálady, který primárně neovlivňuje uptake serotoninu). Cíle Cílem studie bylo přispět k poznání vlivu samotného depresivního onemocnění a vlivu antidepresivní léčby na přenašečem zprostředkovaný přenos serotoninu do trombocytů.
58
Metody U kontrol, osob dlouhodobě léčených lithiem a u depresivních osob před léčbou a po 5-42 dnech podávání citalopamu byla provedena měření kinetiky přenosu (uptake) serotoninu do trombocytů z periferní krve (Vmax, KM). Uptake serotoninu byl měřen pomocí tritiem značeného serotoninu. Výsledky •
Pozorovali jsme významně vyšší hodnoty KM u depresivních osob před začátkem léčby; po 1-6 týdnech podávání citalopramu zůstal tento parametr zvýšený.
•
Parametr Vmax se před léčbou citalopramem nelišil od kontrol a podávání citalopramu vedlo k jeho snížení.
•
Parametry kinetiky uptake serotoninu u skupiny osob požívajících dlouhodobě lithium nebyly významně odlišné od kontrol.
Závěry •
Vyšší KM při nezměněné Vmax znamená sníženou účinnost vychytávání mimobuněčného serotoninu (charakterizovanou poměrem Vmax/KM) u neléčených depresivních osob.
•
Dlouhodobé podávání citalopramu zlepšilo klinické příznaky deprese sledovaných osob a současně ovlivnilo parametry uptake serotoninu do trombocytů. Účinnost vychytávání serotoninu, ale zůstala i po týdnech léčby výrazně snížena.
•
Naše výsledky naznačují, že při depresi je narušena funkce SERT, za kterou je odpovědná hlavně snížená afinita SERT pro serotonin. Předpokládáme, že jsou za to odpovědné změněné interakce SERT s lipidovým mikrookolím v membráně.
•
Výsledky a závěry uvedené v této práci lze považovat za předběžné, s tím že budou upřesněny měřením dat u větší skupiny dosud neléčených depresivních osob.
59
2.7. Transport trijodthyroninu do erytrocytů jako membránový parametr deprese Příloha 7: KALIŠOVÁ-STÁRKOVÁ, Lucie; FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; HANUŠ, Zdeněk and VEVERA, Jan. Red blood cell triiodothyronine uptake as membrane parameter of depression. Physiol. Res. 2005, [Epub ahead of print]. Úvod Etiologie afektivních poruch není doposud plně objasněná. Jedním z možných faktorů, které ovlivňují vznik afektivních poruch by mohla změněná funkce osy hypotalamus-hypofýzaštítná žláza (HPT). U pacientů s afektivními poruchami byly opakovaně potvrzeny různými studiemi odchylky funkce této osy. Erytrocyty, ač nejsou cílovými buňkami pro hormony štítné žlázy, mohou hrát roli v jejich transportu. Thyroxin (T4) vstupuje do červených krvinek volnou difuzí, L-trijodthyronin (LT3) prostupuje přes erytrocytární membránu usnadněnou difuzí pomocí stereospecifického saturovatelného přenašečového systému nezávislého na Na+. Červené krvinky zřejmě fungují jako zásobárna tohoto hormonu. Předpokládáme, že změněná schopnost vychytávání L-T3 erytrocyty by mohla být také znakem, který odráží narušenou funkci HPT osy a tím vulnerabilitu ke vzniku deprese. Funkci transportního membránového systému pro L-T3 lze hodnotit pomocí parametrů jako je maximální rychlost transportu (Vmax), zdánlivá Michaelosova konstanta (KM) a jejich poměr Vmax/KM, jejichž význam je podobný jako je tomu pro serotoninový přenašeč (viz kap. 1.4). Aktivita membránových přenašečů může být obecně ovlivněna vlastnostmi lipidové části membrán, především složením a uspořádáním molekul v lipidové dvojvrstvě. Parametrem charakterizujícím rotační pohyblivost a průměrné uspořádání membránových molekul je mikroviskozita (viz kap. 1.1.3), jejíž změny lze kvalitativně sledovat měřením anizotropie fluorescence vhodných fluorescenčních sond. Byla popsána závislost vazebných parametrů LT3 na membránových fosfolipidech. V naší studii jsme testovali hypotézu o úloze, kterou má ve vývoji a léčbě afektivních porucha osy HPT, transport L-T3 do erytrocytů a vlastnosti lipidové dvojvrstvy (mikroviskozita, cholesterol). Předpokládáme, že změněná schopnost vychytávání L-T3 erytrocyty by mohla souviset se změnami vlastností buněčných membrán a tím být markerem, který odráží vulnerabilitu ke vzniku deprese. 60
Cíle V této studii jsme chtěli ověřit tyto předpoklady: 1. Membránový přenos L-T3 je odlišný u pacientů s depresí a u zdravých kontrol a odráží změny na systémové úrovni. 2. Funkce membránového přenašečového systému je ovlivněna změnou vlastností lipidové dvojvrstvy. 3. Užíváním antidepresiv dochází u pacientů s depresí k normalizaci parametrů. Metody U kontrol, osob trpících hypercholesterolemií (viz Příloha 8) a u depresivních osob před léčbou a po 1 měsíci podávání citalopamu (antidepresivum primárně účinkující jako selektivní inhibitor reuptake serotoninu) byla provedena měření kinetiky přenosu (uptake) LT3 do neporušených erytrocytů (Vmax, KM) a mikroviskozity erytrocytárních membrán (ghostů). U depresivních osob bylo provedeno i klinické hodnocení deprese pomocí standardních stupnic (HAMD, BECK). Uptake L-T3 do neporušených erytrocytů byl měřen pomocí jódem 125 značeného L-T3 s použitím námi modifikované metody. Mikroviskozita membrán byla charakterizovaná anizotropií fluorescence sondy DPH. Výsledky •
Klinické hodnocení deprese ukázalo u všech pacientů významné zlepšení po 1 měsíci podávání citalopramu. Parametry charakterizující uptake L-T3 do erytrocytů (Vmax a KM) i mikroviskozita erytrocytárních membrán byly u depresivních osob významně zvýšeny jak před, tak i po podávání citalopramu. Nebyla zjištěna statisticky významná změna měřených parametrů po jednoměsíční léčbě ve srovnání s hodnotami před jejím začátkem.
•
U osob se zvýšenou koncentrací cholesterolu (detaily viz Příloha 8) byla ve srovnání s kontrolami zjištěna významně vyšší mikroviskozita erytrocytárních membrán, vyšší Vmax i KM a nižší poměr Vmax/KM.
Závěry •
Depresivní porucha je provázena zvýšenou mikroviskozitou erytrocytárních membrán.
•
Funkce přenašeče pro L-T3 v erytrocytárních membránách je při depresi změněna. Kinetické parametry uptake L-T3 do erytrocytů jsou při depresi zvýšeny, celková účinnost
61
vychytávání L-T3 z mimobuněčného prostoru však změněna není, neboť vyšší kapacita přenosu je kompenzováno nižší afinitou přenašeče. •
Po 1 měsíci léčby ukázalo klinické hodnocení významné zmírnění depresivních příznaků, ale nedošlo k normalizaci parametrů měřených v erytrocytech. Kinetika uptake L-T3 do erytrocytů by mohla být použita jako jeden ze znaků narušené funkce osy HPT při depresi.
•
Změna funkce přenašeče pro L-T3 souvisí pravděpodobně se změnami vlastností lipidové dvojvrstvy, v níž je přenašeč inkorporován. Úloha cholesterolu a dynamických vlastností membrán v aktivitě membránového přenašeče pro L-T3 byla podpořena výsledky získanými u osob se zvýšenými koncentracemi plazmatického a membránového cholesterolu.
•
Naše výsledky propojují hypotézu o narušené funkci osy HPT při depresi s membránovou hypotézou, podle níž může náchylnost k depresi vzniknout jako důsledek změn ve složení a biofyzikálních vlastnostech buněčných membrán.
62
2.8. Farmakologicky indukované snížení cholesterolu vyvolává časově omezené změny v serotonergní transmisi Příloha 8: VEVERA, Jan; FIŠAR, Zdeněk; KVASNIČKA, Tomáš; HANUŠ, Zdeněk; STÁRKOVÁ, Lucie; ČEŠKA, Richard and PAPEŽOVÁ, Hana. Cholesterol-lowering therapy evokes time-limited changes in serotonergic transmission. Psychiatry Res. 2005, vol. 133, no. 2-3, p. 197-203. Úvod V posledních 15 letech byla publikována řada prací zabývajících se vztahem mezi snížením hladin cholesterolu, depresí a sebevražedným chováním. Výsledky jsou však často rozporné a vztah cholesterolu k neurotransmiterovým systémům narušeným při depresi nebyl dostatečně objasněn. Předpokládá se, že snížením hladin cholesterolu je změněna mikroviskozita a propustnost buněčných membrán, což vede ke snížení serotonergní neurotransmise v mozku a vzniku depresivních příznaků. Klíčovou úlohu v udržování normální serotonergní funkce má membránový přenašeč pro serotonin (SERT), který kontroluje koncentraci mimobuněčného serotoninu a jehož aktivita je modulována mimo jiné i mikroviskozitou membrán a přímými interakcemi s cholesterolem. Funkci SERT lze hodnotit pomocí parametrů kinetiky přenosu serotoninu přes membránu (maximální rychlost transportu Vmax, zdánlivá Michaelosova konstanta KM). Vhodným modelem pro sledování funkce SERT v mozku jsou trombocyty z periferní krve (viz kap. 1.4). Syntézu cholesterolu v mozku lze snížit farmakologicky, např. podáváním simvastatinu. Simvastatin prostupuje dobře hematoencefalickou bariérou a inhibuje reduktasu hydroxymetylglutaryl-koenzymu A, čímž snižuje koncentraci cholesterolu v plazmatických membránách v mozku. V naší studii jsme u osob trpících hypercholesterolemií sledovali vliv terapie simvastatinem jak na změny jejich chování, tak na změny koncentrací cholesterolu v plazmě i buněčných membránách, mikroviskozity membrán a uptake serotoninu do trombocytů. Cíle Cílem této práce bylo objasnit vliv terapie vedoucí ke snížení cholesterolu jak na parametry charakterizující změny chování (deprese, impulsivita, empatie, dobrodružnost), tak na 63
biochemické a biofyzikální parametry ovlivňující serotonergní neurotransmisi (lipidové složení a mikroviskozita membrán, kinetika transmembránového přenosu serotoninu). Metody U osob trpících hypercholesterolemií před léčbou, po 1 měsíci, po 2 měsících a po více než 1 roce podávání simvastatinu bylo provedeno klinické hodnocení impulsivity, empatie, dobrodružnosti a depresivních symptomů. Současně byl stanoven celkový sérový cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholesterol a triacylglyceroly. Kinetika přenosu (uptake) serotoninu do trombocytů (Vmax, KM) byla určena pomocí tritiem značeného serotoninu, mikroviskozita erytrocytárních membrán (ghostů) metodou fluorescenčních sond. Z erytrocytárních memrán byly izolovány lipidy a membránový cholesterol byl analyzován tenkovrstevnou chromatografií s plameno-ionizační detekcí; celkové fosfolipidy byly stanoveny měřením fosforu. Výsledky •
Impulsivita, empatie, dobrodružnost a depresivní symptomy nebyly změněny v průběhu celé léčby.
•
Mikroviskozita erytrocytárních membrán nebyla výrazněji změněna v průběhu celé léčby.
•
Po 2 měsících podávání simvastatinu bylo zjištěno významné snížení celkového cholesterolu a LDL cholesterolu, ale jen menší snížení membránového cholesterolu.
•
Parametry kinetiky uptake serotoninu do trombocytů KM i Vmax byly zvýšeny po 1 a 2 měsících podávání simvastatinu. Aktivita SERT (hodnocená jako poměr Vmax/KM) byla významně zvýšena po 1 měsíci léčby, ale již méně po 2 měsících terapie.
•
Po 13-16 měsících terapie zůstaly celkový cholesterol a LDL cholesterol významně sníženy, ale jak membránový cholesterol, tak aktivita SERT se vrátily na hodnoty před započetím léčby.
Závěry •
Během terapie snižující cholesterol jsme nepozorovali změny chování, což může být dáno skutečností, že se jednalo o osoby s hypercholesterolemií, kdy došlo ke snížení sérového cholesterolu na normální hodnoty, nikoli na hodnoty podnormální. Samotné relativní snížení cholesterolu tedy nevyvolávalo nežádoucí změny chování.
64
•
Pozorovali jsme snížení afinity SERT po snížení cholesterolu. Parametr Vmax byl cholesterolem modulován mnohem významněji než parametr KM a byl odpovědný za celkové zvýšení účinnosti vychytávání mimobuněčného serotoninu.
•
Dlouhodobá terapie simvastatinem má na serotonergní transmisi jiný vliv než terapie krátkodobá (1-2 měsíce); aktivita SERT je zřejmě citlivější na změnu koncentrace cholesterolu než na jeho stabilní hladinu.
•
Významná změna v aktivitě SERT byla pozorována pouze po prvním měsíci terapie simvastatinem. Lze předpokládat, že případná zvýšená náchylnost k depresi, násilí nebo sebevraždě je spojena s tímto obdobím.
65
2.9. Celková diskuse Soubor předložených prací se týká studia mechanismů účinků antidepresiv, především jejich vlivu na lipidovou část membrán a funkci membránového přenašeče pro serotonin. Experimenty byly provedeny s modelovými membránami, s krevními buňkami a mozkovou tkání pokusných zvířat a s buňkami lidské periferní krve. Cílem našich experimentů bylo popsat interakce antidepresiv s lipidovými dvojvrstvami, určit vztah mezi koncentracemi antidepresiv v mozku a v periferní krvi a přispět k poznatkům o vlivu dlouhodobého podávání různých antidepresiv na vlastnosti a lipidové složení plazmatických membrán a na transport serotoninu do buněk. Dosažené výsledky přispěly k poznání vztahu membránových změn a kinetiky transmembránového přenosu serotoninu a trijodthyroninu při depresi a její léčbě a byly použity pro upřesnění a propojení serotoninových a membránových hypotéz afektivních poruch. Existuje značná akumulace antidepresiv v lipidových membránách. Úlohu membránových lipidů v mechanismech účinku antidepresiv jsme se snažili objasnit jak pokusy s modelovými membránami, tak studiemi s izolovanými buněčnými membránami či živými buňkami. V experimentech s modelovými membránami (liposomy) jsme zjistili, že vazbu antidepresiv k neutrálním nebo záporně nabitým lipidovým membránám lze velmi dobře studovat s použitím metody vazby radioligandu (Fišar et al. 1991, Fišar et al. 2004b). Přitažlivými elektrostatickými silami mezi kladně nabitými molekulami imipraminu a záporně nabitými povrchy membrán připravenými z fosfatidylserinu (PS) lze vysvětlit významně vyšší vazbu k PS-membránám ve srovnání s vazbou k membránám z fosfatidylcholinu (PC). Elektrostatické vlastnosti buněčných membrán mají tedy klíčovou úlohu v ustavení rovnovážné koncentrace antidepresiva v bezprostřední blízkosti buněčného povrchu, přičemž tato koncentrace může být řádově vyšší, než je koncentrace volného antidepresiva ve vodné fázi. V důsledku zvýšené koncentrace antidepresiv u povrchu membrány a v důsledku jejich chemických vlastností dochází k akumulaci antidepresiv v lipidové části buněčných membrán a k možnosti obsazení proteinových vazebných míst s relativně nízkou afinitou (která by podle koncentrace volného antidepresiva být obsazena neměla). Po korekci na elektrostatické efekty pomocí Gouyovy-Chapmanovy teorie byly vazebné izotermy popsány jak povrchovými rozdělovacími koeficienty, tak vazebnými parametry, jako je rovnovážná asociační konstanta a vazebná kapacita. Analýza saturačních vazebných izoterem ukázala, že vazba antidepresiv k lipidovým dvojvrstvám je silně heterogenní a lze rozlišit nízkoafinní a
66
zdánlivá vysokoafinní vazebná místa. Kapacita jak celkové, tak zdánlivé vysokoafinní vazby je významně vyšší u PS-membrán ve srovnání s PC-membránami. Proměřením a analýzou pH-závislostí jsme charakterizovali podíl elektrostatických a jiných nekovalentních interakcí na zdánlivé vysokoafinní vazbě různých tricyklických antidepresiv (TCA) k lipidovým dvojvrstvám (Fišar 2005). Zjistili jsme, že rozhodující vliv na zapojení jednotlivých nekovalentních interakcí v této vazbě má nejen fosfolipidové složení membrán, ale i metylace bočního acylového řetězce v molekulách TCA. Za zdánlivou vysokoafinní vazbu TCA k membránám připraveným z PC nebo fosfatidyletanolaminu (PE) jsou odpovědny především van der Waalsovy síly a hydrofobní interakce (realizují inkorporaci nenabitých molekul TCA do hydrofobního vnitřku dvojvrstvy). Důležitou úlohu ve vazbě TCA k PS-membránám mají i coulombické interakce a interakce ion-indukovaný dipól, neboť jsme pozorovali významnou vazbu jak nabitých, tak nenabitých molekul TCA k těmto membránám. Důležité je zjištění, že elektrostatické interakce mezi TCA a záporně nabitými povrchy lipidových membrán závisí nejen celkovém náboji fosfolipidů, ale i na jeho prostorovém rozložení, např. existuje určitá specificita vazby TCA k PS-dvojvrstvám. Není dosud objasněno do jaké míry se akumulace antidepresiv v blízkosti buněčných povrchů a v samotných membránách podílí na jejich terapeutických nebo vedlejších účincích. Může však docházet ke změnám rotační a laterální difúze, uspořádání a vzájemných interakcí membránových molekul, což ovlivňuje transmembránový přenos signálu. Naše výsledky podpořily hypotézu o úloze membránových lipidů v mechanismech účinků antidepresiv, zvláště úlohu fosfatidylserinu, který silně ovlivňuje vazbu antidepresiv k lipidové části membrány a o němž je známo, že specificky působí na funkci řady membránových proteinů zapojených do přenosu nervového signálu přes chemickou synapsi. V experimentech s laboratorními potkany jsme studovali jednak rozdělení antidepresiv mezi membrány a vodnou fázi v krvi i v mozku v podmínkách in vivo, jednak vliv dlouhodobého podávání různých antidepresiv na složení a mikroviskozitu plazmatických membrán v mozku a na kinetiku vychytávání serotoninu do trombocytů v periferní krvi. Potvrdili jsme, že po dlouhodobém podávání imipraminu je v krvi i v mozku toto antidepresivum vázáno v buněčných membránách v koncentracích mnohonásobně převyšujících plazmatické nebo cytoplazmatické koncentrace. Koncentrace v membránách z mozku navíc mnohonásobně převyšují koncentrace v membránách z krevních elementů. Určili jsme vztah, podle něhož lze pro dobrý odhad koncentrace imipraminu v mozkové tkáni použít koncentrace změřené v krevní plazmě a v erytrocytárních membránách (Fišar et al. 67
1996b). Tyto výsledky mohou přispět k objasnění skutečnosti, že plazmatické koncentrace antidepresiv nekorelují často dobře s jejich terapeutickými účinky. Protože koncentrace v mozkové tkáni nejsou určeny jen koncentrací v plazmě, ale i koncentrací v buněčných membránách krevních elementů, lze předpokládat, že při změně rozdělení antidepresiva mezi plazmu a membrány (např. v důsledku změn fosfolipidového složení erytrocytárních membrán), mohou být koncentrace v mozku značně odlišné i při nezměněných plazmatických koncentracích. Studovali jsme také rozdělení různých antidepresiv ex vivo v lidské krvi mezi erytrocyty a plazmu (Fišar a spol. 2004a). Rovnovážné rozdělení antidepresiv mezi erytrocyty a plazmu silně závisí na teplotě, ale nezávisí na koncentraci antidepresiv v oblasti jejich terapeutických koncentrací. Vysoké hodnoty poměru koncentrací erytrocyty/plazma byly zjištěny pro demetylované metabolity tricyklických antidepresiv a pro citalopram. Poměr koncentrací antidepresiv v erytrocytech a v plazmě je parametr citlivý jak na typ antidepresiva, tak na vazebné vlastnosti plazmatických proteinů a buněčných membrán. Za rozdílnou vazbu antidepresiv k erytrocytům jsou odpovědné různé části jejich molekul (aromatické kruhy i aminopropylové řetězce). Předpokládáme, že účinky antidepresiv jsou poměrem koncentrací v erytrocytech a v plazmě vystiženy lépe než plazmatickými koncentracemi a tento parametr může být použit jak pro studium změn při onemocnění a jeho léčbě, tak pro studium interindividuálních rozdílů na podávání téhož antidepresiva. Ve výše uvedených experimentech jsme potvrdili, že rozdělení léčiv v krvi i mozku se výrazně liší pro různá antidepresiva a na vazbě k buněčným membránám se podílí nepolární i nabité části molekul léčiv. Výsledky podporují hypotézu, že schopnost přestupu antidepresiv z plazmy do membrán a zpět může ovlivňovat jejich terapeutické účinky a že poměr koncentrací antidepresiv v erytrocytech a v plazmě by mohl být jedním ze snadno měřitelných parametrů použitelných při predikci účinnosti léčby daným antidepresivem nebo při charakterizaci podtypu onemocnění. Na rozdílných poměrech koncentrací antidepresiv v plazmě a v erytrocytech se mohou podílet jak změny složení erytrocytárních membrán, tak změny v plazmatických proteinech. Předpokládáme, že detailní studium změn ve fosfolipidovém a cholesterolovém složení erytrocytárních membrán a ve vazebných parametrech plazmatických proteinů pro antidepresiva u osob neodpovídajících na farmakoterapii by mohlo pomoci ve snaze určit příčiny rozdílné odpovědi jednotlivých osob na podávání téhož antidepresiva.
68
Cílem našich dalších experimentů byla snaha upřesnit adaptivní mechanismy související s dlouhodobým podáváním antidepresiv. Zaměřili jsme se na změny lipidového složení plazmatických membrán, na změny jejich dynamických vlastností a na ovlivnění přenosu (uptake) serotoninu zprostředkovaného membránovým přenašečem (SERT). Nejprve jsme testovali hypotézu, že dlouhodobé podávání antidepresiv s různými primárními biochemickými účinky má vliv na kinetiku přenosu serotoninu do trombocytů. Výsledky ukázaly, že nejen antidepresiva, která jsou selektivními inhibitory reuptake serotoninu (citalopram), ale i ta, která jsou inhibitory reuptake noradrenalinu (desipramin, maprotilin), inhibitory monoaminoxidasy (moklobemid) nebo stabilizátory nálady (lithium) způsobují po dlouhodobém podávání změny v serotonergním systému trombocytů laboratorních potkanů (Fišar et al. 2005a). Za předpokladu, že trombocyty jsou dobrým modelem pro serotonergní aktivitu v mozku, by pozorované zvýšení účinnosti vychytávání mimobuněčného serotoninu mohlo být společným adaptivním účinkem dlouhodobého podávání antidepresiv s různou farmakologickou selektivitou. Naše výsledky podporují serotoninovou hypotézu afektivních poruch, která vychází z předpokladu, že nedostatečná serotonergní aktivita je významný vulnerabilní faktor ve vzniku deprese a jedním z projevů dlouhodobého podávání antidepresiv je zvýšení serotonergní aktivity. Na tomto zvýšení se zřejmě podílí změna zpětného vychytávání (reuptake) serotoninu, která může být dána jak více či méně specifickou inhibicí SERT, tak změnou jeho afinity pro serotonin. Zvýšení afinity SERT vede při nezměněné maximální rychlosti transportu k úplnějšímu vychytávání serotoninu z mimobuněčného prostoru a k možnosti jeho opakovaného využití v neurotransmisi. Pozorovaná změna kinetiky přenosu serotoninu po podávání antidepresiv laboratorním potkanům byla způsobena především změnou zdánlivé Michaelisovy konstanty KM odpovídající zvýšení afinity SERT pro serotonin. O tomto parametru je známo, že je ovlivněn i přímou interakcí s membránovým cholesterolem. Proto jsme v další práci testovali hypotézu, že změna lipidového složení plazmatických membrán v mozku může být jednou z adaptivních buněčných změn indukovaných dlouhodobým podáváním různých antidepresiv. Zjistili jsme, že podávání výše uvedených antidepresiv skutečně ovlivňuje lipidové složení buněčných membrán v mozku (Fišar et al. 2005b). Pozorované snížení relativního zastoupení fosfolipidů v mozkových plazmatických membránách bylo přitom dáno zvýšením obsahu cholesterolu (především po podávání citalopramu). Je obtížné interpretovat vztah mezi změnami v lipidovém složení mozkových plazmatických membrán a terapeutickými účinky antidepresiv, protože membránové lipidy ovlivňují řadu buněčných procesů s velmi odlišnými 69
fyziologickými účinky. Nicméně, na základě našich výsledků se lze domnívat, že terapeutické účinky lithia a antidepresiv, která jsou selektivními inhibitory reuptake serotoninu nebo noradrenalinu, mohou souviset se zvýšením relativního zastoupení cholesterolu v buněčných membránách a s tím souvisejícími změnami funkce membránových proteinů, např. transportních proteinů pro serotonin nebo noradrenalin. Zvýšení membránového cholesterolu přitom může být specifické pro mozek, neboť v plazmatických membránách izolovaných z jater, srdce a ledvin nebyly pozorovány významné změny poměru cholesterolu k celkovým fosfolipidům (Fišar et al. 1999c). Výraznější ovlivnění membrán mozkových buněk může být dáno skutečností, že koncentrace antidepresiv v mozku jsou mnohem vyšší než v periferii (Fišar et al. 1996b). Mikroviskozita plazmatických membrán z mozku laboratorních potkanů charakterizovaná anizotropií fluorescence membránových sond se po dlouhodobém podávání antidepresiv významně nezměnila; zvýšení relativního zastoupení cholesterolu se tedy neprojevilo v očekávaném snížení fluidity membrán. Z našich výsledků nelze jednoznačně usoudit na příčinu tohoto výsledku, neboť jsme neměřili časově rozlišenou fluorescenci. Po dlouhodobém podávání antidepresiv tedy nedochází k podstatným změnám v dynamických vlastnostech plazmatických membrán a fluidita membrán pravděpodobně nemá přímou úlohu v mechanismech jejich terapeutických účinků. Dlouhodobé podávání antidepresiv ovlivňuje výrazně parametry uptake serotoninu do trombocytů a relativní zastoupení cholesterolu a jednotlivých fosfolipidů, ale jen minimálně ovlivňuje stavbu a dynamické vlastnosti plazmatických membrán v mozku. Chceme-li tedy v dalších studiích analyzovat u depresivně nemocných změny v parametrech uptake serotoninu, je nezbytné získat potřebné vzorky před započetím farmakoterapie, kdy lze případné změny považovat za znaky onemocnění a nikoli za důsledek působení léčiv. Oproti tomu případné změny fluidity buněčných membrán by bylo možné považovat za charakteristiky depresivního onemocnění i v případě, že by byly měřeny až v průběhu podávání antidepresiv. Naše výsledky ukazují, že změna serotonergní aktivity po dlouhodobém podávání různých antidepresiv laboratorním potkanům může být dána zvýšením afinity SERT, způsobeném spíše změnami interakcí cholesterol-transportní protein nebo fosfolipid-transportní protein, než změnami mikroviskozity membrán. Podpořili jsme hypotézu, že dlouhodobé podávání antidepresiv může způsobit změny v lipidovém složení buněčných membrán, které se mohou transformovat do procesů přímo ovlivňujících serotonergní neurotransmisi v mozku.
70
V experimentech s laboratorními potkany jsme zjistili, že dlouhodobé podávání různých antidepresiv ovlivňuje výrazně parametry uptake serotoninu do trombocytů a relativní zastoupení cholesterolu a jednotlivých fosfolipidů. Výsledky získané na modelových zvířatech ale mohou být obtížně přenositelné na depresivní osoby. Studovali jsme proto i účinky dlouhodobého podávání citalopramu (antidepresiva ze skupiny selektivních inhibitorů reuptake serotoninu) na aktivitu serotonergního systému měřenou kinetikou přenosu serotoninu do trombocytů z periferní krve. Pro odlišení vlivu citalopramu od vlivu samotné depresivní poruchy byla měření provedena u depresivních osob, které nebyly dosud nikdy antidepresivy léčeny. Ukázalo se, že jak depresivní porucha tak antidepresivum výrazně ovlivňují parametry uptake serotoninu do trombocytů. Celkově byla účinnost vychytávání mimobuněčného serotoninu u depresivních osob snížena nejen před léčbou, ale i po několika týdnech farmakoterapie, kdy bylo pozorováno jasné klinické zlepšení depresivních příznaků (Fišar et al. 1998). Naše výsledky ukazují, že snížení reuptake serotoninu při depresi je způsobeno spíše sníženou afinitou transportního proteinu pro serotonin, než sníženou maximální rychlostí vtoku, jak se dosud předpokládalo. Za předpokladu, že serotonergní aktivita trombocytů odráží serotonergní aktivitu v mozku, znamená nižší afinita SERT při nezměněné maximální rychlosti transportu, že při nízkých mimobuněčných koncentracích serotoninu se výrazně sníží jeho reuptake do presynaptických zakončení. Tyto předběžné výsledky (získané pro 16 depresivních osob) byly potvrzeny a upřesněny po rozšíření souboru pacientů na 30 (dosud nepublikované výsledky). Potvrdili jsme, že přenos serotoninu do trombocytů je u depresivních osob ovlivněn citalopramem mnohem více než samotným depresivním onemocněním. Nalezli jsme také významnou korelaci mezi účinností uptake serotoninu a klinickým hodnocením depresivních příznaků, což znamená, že uptake serotoninu do trombocytů lze použít jako znak účinné farmakoterapie depresivní poruchy. Zdánlivá Michaelisova konstanta KM zahrnující informaci o afinitě SERT pro serotonin byla zvýšena nejen před léčbou, ale významně i po dlouhodobém podávání citalopramu a byla odpovědná za nižší účinnost vychytávání serotoninu ve srovnání se zdravými kontrolami. Dalším membránovým přenašečem, jehož funkce by mohla být změněna při depresivní poruše a její léčbě je přenašeč pro L-trijodthyronin (L-T3). Získaná data ukazují, že kinetické parametry uptake L-T3 do erytrocytů jsou zvýšeny u depresivních pacientů před počátkem léčby ve srovnání se skupinou zdravých kontrol a v průběhu farmakoterapie se výrazně nemění (Kališová-Stárková et al. 2005). Všichni pacienti přitom byli euthyroidní a odpovídali 71
dobře na léčbu citalopramem. Získaná data umožňují diskutovat úlohu uptake L-T3 do erytrocytů při vzniku a léčbě depresivní poruchy a to jak z hlediska změn kinetických parametrů uptake, tak z hlediska změn dynamických vlastností lipidové dvojvrstvy, v níž je transportní protein pro L-T3 zanořen. Kinetiku uptake L-T3 do erytrocytů lze chápat jako proces změněný při depresi, který ale přímo nekoreluje s depresivní symptomatologií. Pravděpodobně se jedná o změnu aktivity membránového přenašeče pro L-T3 způsobenou změněnými vlastnostmi lipidové dvojvrstvy, v níž je zanořen. Pro tento závěr svědčí výsledky měření anizotropie fluorescence sondy DPH v plazmatických membránách z erytrocytů ukazující, že depresivní porucha je provázená sníženou fluiditou těchto membrán. Dynamika buněčných membrán je veličina ovlivňující řadu membránových enzymů, receptorů, iontových kanálů a přenašečů, a jedním z projevů její změny může být zvýšení parametrů kinetiky uptake L-T3. Pro tuto skutečnost svědčí i naše výsledky z jiné studie (doposud nepublikované), kdy jsme měřili uptake L-T3 do erytrocytů u osob s hypercholesterolemií. Zvýšené hladiny cholesterolu významně korelovaly se zvýšenou anizotropií fluorescence DPH v membránách a kinetické parametry uptake L-T3 do erytrocytů byly rovněž významně zvýšeny. Není dosud zřejmé, zda jsou vlastnosti přenašeče pro L-T3 ovlivněny spíše specifickými interakcemi lipid-protein, nebo celkovým dynamickým stavem lipidové dvojvrstvy. Naše výsledky podporují hypotézu, že i u klinicky euthyrodiních osob s depresí můžeme nalézt subklinické markery odrážející narušení funkce hypotalamo-hypofýzo-thyroidální osy a potvrzují hypotézu, že změněná funkce této osy vede ke změně parametrů uptake L-T3 do erytrocytů. Současně jsme tuto hypotézu propojili s membránovou hypotézou afektivních poruch, podle níž může náchylnost k depresi vzniknout v důsledku změn biofyzikálních vlastností buněčných membrán v určitých oblastech mozku. Úlohu cholesterolu ve funkci SERT jsme sledovali u osob trpících hypercholesterolemií před a v průběhu dlouhodobé léčby simvastatinem. Zjistili jsme, že cholesterol skutečně ovlivňuje aktivitu SERT, neboť v prvních dvou měsících jeho snižování došlo ke zvýšení kinetických parametrů KM i Vmax. Celková účinnost vychytávání mimobuněčného serotoninu se po snížení sérového cholesterolu nejprve zvýšila (po 1 až 2 měsících léčby), ale po delší době farmakoterapie (více než rok) se parametry kinetiky přenosu serotoninu do trombocytů vrátily na původní hodnoty před léčbou (Vevera et al. 2005). Snížení koncentrací cholesterolu z vysokých hodnot na normální tedy způsobilo pouze dočasné změny v serotonergní funkci. Tyto výsledky ukazují na existenci buněčných mechanismů vyrovnávajících odchylky 72
serotonergní funkce vlivem změny koncentrace cholesterolu. Pro klinickou praxi to znamená možnost zvýšené náchylnosti osob užívajících léky pro snížení cholesterolu k poruchám nálady především v prvních měsících farmakoterapie. Anizotropie fluorescence sondy DPH charakterizující omezenost pohyblivosti malých membránových molekul v lipidové dvojvrstvě byla významně zvýšena u depresivních pacientů před léčbou proti kontrolám. Po několikatýdenní terapii citalopramem, kdy došlo k významnému zlepšení klinického stavu, již nebylo zvýšení mikroviskozity statisticky významné (Kališová-Stárková et al. 2005). Interpretace tohoto výsledku je ztížena skutečností, že nebylo použito měření časově rozlišené fluorescence a že obsah cholesterolu, nenasycenost zbytků mastných kyselin a zastoupení jednotlivých druhů fosfolipidů a glykolipidů mohou mít opačný vliv na anizotropii fluorescence DPH a vzájemně se kompenzovat. Pro podrobnou analýzu změn dynamických vlastností buněčných membrán v důsledku podávání antidepresiv bude nutno provést měření jak lipidového složení membrán tak změn v obsahu nenasycených mastných kyselin. Nicméně naše výsledky zatím ukazují, že na změny dynamických vlastností lipidových dvojvrstev má větší vliv depresivní porucha než antidepresiva. Naše výsledky také demonstrují obtížnou přenositelnost údajů získaných na zvířecích modelech na člověka s depresivní poruchou, neboť ve srovnání s kontrolní skupinou byla účinnost vychytávání mimobuněčného serotoninu po podávání citalopramu u potkanů zvýšená, zatímco u depresivních osob snížená. Rozhodující úlohu v tomto rozporu má zřejmě vliv depresivní poruchy. Jak u zvířecího modelu, tak u lidí byly za změny v kinetice vychytávání serotoninu po dlouhodobém podávání citalopramu zodpovědné především změny KM, tj. změny afinity SERT. Vzhledem k vysoké lipofilitě citalopramu předpokládáme, že významnou úlohu v těchto změnách mají interakce lipid-protein. Navíc je známo, že membránový cholesterol moduluje funkční vlastnosti SERT přes specifické interakce potřebné pro stabilizaci přenašeče v jeho optimálně aktivní formě. Úlohu cholesterolu v aktivitě SERT u člověka in vivo jsme potvrdili v naší studii, v níž jsme nalezli významně vyšší účinnost uptake serotoninu do trombocytů a vyšší afinitu SERT (nižší KM) u osob s hypercholesterolemií (Vevera et al. 2005) ve srovnání se skupinou zdravých kontrol nebo depresivních osob z naší dřívější studie (Fišar et al. 1998). Nepozorovali jsme významně změny lipidového složení erytrocytárních membrán u neléčených depresivních pacientů před farmakoterapií, ale po dlouhodobém podávání citalopramu došlo k mírnému zvýšení relativního zastoupení 73
cholesterolu, fosfatidylcholinu a fosfatidylserinu v těchto membránách (Fišar et al. 1999c). Zdá se, že vyšší cholesterol může indukovat snížení KM a naopak. Tyto úvahy jsou značně spekulativní, neboť nejsou dostupné údaje o změnách membránového cholesterolu nebo fosfolipidového složení v lidském mozku v průběhu léčby antidepresivy. Zvýšení KM při depresi před započetím léčby lze chápat jako jeden z adaptivních mechanismů, jímž se organismus pokouší vyrovnat s narušením serotonergní neurotransmise. Funkce SERT je při depresi již narušena a účinky citalopramu zřejmě nespočívají v rychlém návratu SERT do normálního stavu, ale naopak v ještě větším vychýlení jeho funkce z rovnováhy. Kvalitativně stejný účinek citalopramu jsme pozorovali i pro uptake L-T3 do erytrocytů u depresivních osob (Kališová-Stárková et al. 2005). Lze proto uvažovat o možnosti, že existuje nějaký společný účinek citalopramu na aktivitu různých membránových přenašečů zprostředkovaný změnami vlastností lipidové části plazmatických membrán. Na základě našich výsledků lze navrhnout přeformulování jednoho z východisek o úloze serotoninu v patofyziologii depresivní poruchy: snížení reuptake serotoninu v depresivní fázi je způsobeno spíše snížením afinity transportního proteinu pro serotonin (zvýšením KM), než snížením maximální rychlosti vtoku (Vmax), jak se dosud předpokládalo. Není zcela jasné, zda je zvýšení KM primární či sekundární vzhledem ke snížené dostupnosti 5-HT, nebo zda se jedná o nezávislý doprovodný znak deprese. Nižší afinita SERT znamená na jednu stranu sníženou účinnost reuptake a tedy sníženou možnost opětovného využití 5-HT pro přenos signálu, na druhou stranu zůstává uvolněný 5-HT delší dobu v mimobuněčném prostoru, může difundovat na větší vzdálenost a aktivovat po delší dobu procesy závislé na 5-HT. Sjednocenou serotoninovou-membránovou hypotézu afektivních poruch lze formulovat takto: Snížená dostupnost serotoninu v určitých oblastech mozku se může podílet na vzniku depresivní poruchy. Snížená afinita transportního proteinu pro serotonin v membránách patří spíše mezi adaptivní změny doprovázející narušenou serotonergní funkci při depresi, než mezi vyvolávající příčiny onemocnění. Změny afinity transportního proteinu mohou být způsobeny změnami interakcí cholesterol-protein nebo fosfolipid-protein v membránách. Společné účinky různých antidepresiv na této úrovni přenosu signálu by mohly spočívat ve zvýšení mimobuněčných koncentrací 5-HT daných inhibicí SERT nebo snížením afinity SERT pro 5HT. Zatímco specifickou inhibici SERT uskutečňují inhibitory reuptake serotoninu, snížení afinity SERT je možné přes ovlivnění lipidového složení membrán a interakcí lipid-SERT, tedy přes změny vlastností lipidové dvojvrstvy, které je možné vyvolat i jinými antidepresivy.
74
Seznam použitých zkratek 5-HT - 5-hydroxytryptamin, serotonin AMI - amitriptylin ATP - adenosin-5´-trifosfát, adenosintrifosfát BDNF - mozkový-odvozený neurotrofní faktor („brain-derived neurotrophic factor“) BECK – Beckův sebeposuzovací dotazník deprese Bmax - vazebná kapacita CAD - amfifilní molekuly nesoucí za fyziologických podmínek kladný náboj („cationic amphiphilic drug“). cAMP - cyklický adenosinmonofosfát CREB - transkripční faktor aktivovaný v odezvě na zvýšení hladin cAMP („cAMP response element-binding protein“) DAG - sn-1,2-diacylglycerol (obvykle 1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol), diacylglycerol DAT - transportní protein pro dopamin DDMI - didesmetylimipramin DMI - desipramin DPH - 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien G protein - protein vázající guaninové nukleotidy GABA - 4-aminomáselná kyselina (též γ-aminomáselná kyselina) HAMD – Hamiltonova škála deprese HDL – lipoproteiny s vysokou hustotou HPA - hypotalamus-hypofýza-kůra nadledvin HPT - hypotalamus-hypofýza-štítná žláza IMI - imipramin IP3, I(1,4,5)P3 - inositol-1,4,5-trisfosfát, inositoltrisfosfát IUV - jednovrstevné liposomy střední velikosti („intermediate-sized unilamellar vesicles“) Kd - zdánlivá disociační konstanta KM - zdánlivá Michaelisova konstanta LDL – lipoproteiny s nízkou hustotou L-T3 - L-trijodthyronin LUV - velké jednovrstevné liposomy („large unilamellar vesicles“) MAO - monoaminoxidasa MKN - mezinárodní klasifikace nemocí 75
MLV – mnohovrstevné liposomy („multilamellar vesicles“) NaSSA - noradrenergní a specifická serotonergní antidepresiva NDRI - inhibitory zpětného vychytávání noradrenalinu i dopaminu NET - transportní protein pro noradrenalin NOR - nortriptylin NRI - selektivní inhibitory reuptake noradrenalinu PC - fosfatidylcholin PE - fosfatidyletanolamin PI - fosfatidylinositol PKC - proteinkinasa typu C PS – fosfatidylserin RIA - radioimunoassay RUI - inhibitory zpětného vychytávání (reuptake) neurotransmiterů SARI - duální serotonin 2A antagonisté/inhibitory reuptake SERT (též 5-HTT) - specifický serotoninový transportní protein SNRI – duální inhibitory reuptake serotoninu i noradrenalinu SSRI - selektivní inhibitor reuptake serotoninu SUV – malé jednovrstevné liposomy („small unilamellar vesicles“) TCA - tricyklická antidepresiva T4 - thyroxin TMA-DPH - 1-(4-trimetylamoniumfenyl)-6-fenyl-1,3,5-hexatrien, Vmax - maximální rychlost transportu serotoninu do buněk
76
3. SEZNAM PUBLIKACÍ TVOŘÍCÍCH PODKLAD HABILITAČNÍ PRÁCE BUREŠ, Přemysl; KRULÍK, Radoslav; FIŠAR, Zdeněk et al. Vliv kokainu na vazbu tricyklických antidepresiv v SPM mozku. Čs. psychiatrie. 1993, vol. 89, no. 5, p. 272-275. FIALOVÁ, Lenka; MIKULÍKOVÁ, Ludmila; FIŠAR, Zdeněk et al. Metoda ELISA pro stanovení antifosfatidylserinových protilátek. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 1996, vol. 45, no. 2, p. 52-55. FIALOVÁ, Lenka; MIKULÍKOVÁ, Ludmila; FIŠAR, Zdeněk et al. Antifosfatidylinositolové protilátky a jejich stanovení vlastní ELISA metodou. Sborník lékařský. 1996, vol. 97, no. 4, p. 463-467. FIŠAR, Zdeněk; KRULÍK, Radoslav and BEITLOVÁ, Dana. Liposomes – model membranes to study the binding of tricyclic antidepressants. Drug Metabolism and Drug Interactions. 1991, vol. 9, no. 3-4, p. 269-281. FIŠAR, Zdeněk a KRULÍK, Radoslav. Buněčné membrány a jejich interakce s antidepresivy. Biol. listy. 1995, vol. 60, no. 2, p. 81-96. FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin; FUKSOVÁ, Květoslava et al. Effect of long-term treatment by antidepressants on serotonin uptake in platelets and on membrane fluidity. Chemické listy. 1996a, vol. 90, no. 9, p. 636-637. FIŠAR, Zdeněk; KRULÍK, Radoslav; FUKSOVÁ, Květoslava et al. Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol. Biophys. 1996b, vol. 15, p. 51-64. FIŠAR, Zdeněk a SIKORA, Jan. Neurochemické hypotézy afektivních poruch. In Sikora, Jan; Fišar, Zdeněk; Petrovický, Pavel et al. (eds.). Biologické podklady psychických poruch. Praha: Galén, 1997, p. 68-72. FIŠAR, Zdeněk; TVRZICKÁ, Eva; ANDERS, Martin et al. Effect of long-term antidepressant treatment on membrane phospholipids. Homeostasis. 1997, vol. 38, no. 2, p. 68-69. FIŠAR, Zdeněk; TVRZICKÁ, Eva; HANUŠ, Zdeněk et al. Vliv dlouhodobého podávání antidepresiv na membránový cholesterol. In Sikora, Jan; Fišar, Zdeněk; Petrovický, Pavel et al. (eds.). Biologické podklady psychických poruch. Praha: Galén, 1997, p. 73-75. FIŠAR, Zdeněk. Biochemické hypotézy afektivních poruch. 1. vyd. Praha: Galén, 1998, 103 s. ISBN 80-85824-80-9.
77
FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; ANDERS, Martin et al. Platelet serotonin uptake in depressed patients during treatment. Homeostasis. 1998, vol. 38, no. 4, p. 172-173. FIŠAR, Zdeněk. Biochemické hypotézy afektivních poruch [online]. c1999. Dostupný z WWW:
. FIŠAR, Zdeněk a JIRÁK, Roman. Úvod do biologické psychiatrie [online]. c1999. Dostupný z WWW: . FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; KOVÁŘŮ, Hana et al. Membranes and platelet serotonin uptake in depression. Homeostasis. 1999a, vol. 39, no. 3-4, p. 130-131. FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo and SIKORA, Jan. Uptake serotoninu do trombocytů při dosud neléčené depresi. In Sikora, Jan and Fišar, Zdeněk (eds.). Neurobiologie duševních poruch. Praha: Galén, 1999b, p. 45-48. FIŠAR, Zdeněk; TVRZICKÁ, Eva; HANUŠ, Zdeněk et al. Má deprese a podávání antidepresív vliv na lipidové složení erytrocytárních membrán? In Sikora, Jan and Fišar, Zdeněk (eds.). Neurobiologie duševních poruch. Praha: Galén, 1999c, p. 49-51. FIŠAR, Zdeněk. Interaction of tricyclic antidepressants with liposomes. Eur. Neuropsychopharm. 2000, vol. 10, no. Suppl. 3, p. S270. FIŠAR, Zdeněk and PACLT, Ivo. Clinical course of depression and platelet serotonin uptake. European Psychiatry. 2000, vol. 15, no. Suppl. 2, p. 380s. FIŠAR, Zdeněk a PACLT, Ivo: Korelace klinického průběhu deprese a uptake serotoninu. In Raboch, Jiří; Zrzavecká, Irena a Uhrová, Tereza (eds.). Psychiatrie pro XXI. století. Praha: Galén, 2000, p. 152. FIŠAR, Zdeněk. Serotonin v mozku. Trendy ve farmakoterapii (příloha Zdravotnických novin vol. 50). 2001, vol. 1, no. 1, p. 3-5. FIŠAR, Zdeněk. Význam serotoninu v léčbě duševních poruch. Trendy ve farmakoterapii (příloha Zdravotnických novin vol. 50). 2001, no. 1, p. 6-7. FIŠAR, Zdeněk a JIRÁK, Roman. Vybrané kapitoly z biologické psychiatrie. 1. vyd. Praha: Grada, 2001, 316 s. ISBN 80-247-0061-1. FIŠAR, Zdeněk. Psychiatrie. 1. vyd. Praha: Galén, Karolinum, 2001. 622 s. ISBN 80-7262140-8, 80-246-0390-X. Neurochemie, s. 33-55. FIŠAR, Zdeněk. Neurochemie návykových látek. Trendy ve farmakoterapii (příloha Zdravotnických novin vol. 51, no. 9). 2002, no. 1, p. 4-7. FIŠAR, Zdeněk. Přehled biochemických účinků vybraných návykových látek. Trendy ve farmakoterapii (příloha Zdravotnických novin vol. 51, no. 9). 2002, no. 1, p. 8-10.
78
FIŠAR, Zdeněk. Introduction to Biological Psychiatry [online]. c2002. Dostupný z WWW: . FIŠAR, Zdeněk. Psychiatrie na Internetu [online]. c2003. Dostupný z WWW: . FIŠAR, Zdeněk. Fluorescenční spektroskopie v neurovědách [online]. c2003. Dostupný z WWW: . FIŠAR, Zdeněk, ANDERS, Martin, TVRZICKÁ, Eva et al. Membrane lipids and serotonin uptake after long-term administration of antidepressants. Eur. Neuropsychopharm. 2003, vol. 13, no. Suppl. 4, p. S217-S218. FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava a VELENOVSKÁ, Marie. Úloha membránových lipidů v účincích antidepresiv. Psychiatrie. 2003, vol. 7, no. Suppl. 2, p. 31-32. FIŠAR, Zdeněk. Antidepresiva a membránové lipidy. Klin. Farmakol. Farm. 2004, vol. 18, no. 4, p. 198-202. FIŠAR, Zdeněk. Psychiatry [online]. c2004. Dostupný z WWW: . FIŠAR, Zdeněk, FUKSOVÁ, Květoslava, SIKORA, Jan et al. Rozdělení antidepresiv v krvi mezi plazmu a erytrocyty. In Raboch, Jiří; Zrzavecká, Irena; Doubek, Pavel et al. (eds.). Česká psychiatrie a svět, 1. vydání. Praha: Galén, 2004a, p. 44-45. FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava and VELENOVSKÁ, Marie. Binding of imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol. Biophys. 2004b, vol. 23, no. 1, p. 77-99. FIŠAR, Zdeněk. Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid bilayer membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 161-180. FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin and KALIŠOVÁ, Lucie. Effect of pharmacologically selective antidepressants on serotonin uptake in rat platelets. Gen. Physiol. Biophys. 2005a, vol. 24, no. 1, p. 113-128. FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin; TVRZICKÁ, Eva et al. Effect of long-term administration of antidepressants on the lipid composition of brain plasma membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005b, vol. 24, no. 2, p. 221-236. FIŠAR, Zdeněk. Fytokanabinoidy. Chemické listy. ca. 2006. přijato do tisku. FIŠAR, Zdeněk. Endokanabinoidy. Chemické listy. ca 2006. přijato do tisku. KALIŠOVÁ-STÁRKOVÁ, Lucie; FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo et al. Red blood cell triiodothyronine uptake as membrane parameter of depression. Physiol. Res. 2005, [Epub ahead of print]. 79
KRULÍK, Radoslav a FIŠAR, Zdeněk. Adrenergní a serotonergní receptory při depresi a během její terapie. Čs. psychiatrie. 1992, vol. 88, no. 5, p. 229-236. KRULÍK, Radoslav a FIŠAR, Zdeněk. Přehled poznatků o vazbě tricyklických antidepresív. Čs. psychiatrie. 1993, vol. 89, no. 2, p. 71-78. KRULÍK, Radoslav; BUREŠ, Přemysl; FIŠAR, Zdeněk et al. Blokátory Ca2+-kanálů a vazba tricyklických antidepresiv. Čs. psychiatrie. 1995, vol. 91, no. 3, p. 143-151. MIKULÍKOVÁ, Ludmila; FIALOVÁ, Lenka; FIŠAR, Zdeněk et al. ELISA method for determination of anticardiolipine and antiphosphatidylcholine antibodies. Chemické listy. 1996, vol. 90, no. 9, p. 737. SIKORA, Jan; FIŠAR, Zdeněk and SIKOROVÁ, Michaela. Serotoninergní mechanismy u afektivních poruch. In Sikora, Jan; Fišar, Zdeněk; Petrovický, Pavel et al. (eds.). Biologické podklady psychických poruch. Praha: Galén, 1997, p. 228-231. SIKORA, Jan; FIŠAR, Zdeněk a NOVOTNÁ, Michaela. Molekulární změny při opakovaném podávání návykových látek. In Sikora, Jan a Fišar, Zdeněk (eds.). Neurobiologie duševních poruch. Praha: Galén, 1999, p. 245-249. STÁRKOVÁ, Lucie; FIŠAR, Zdeněk a PACLT, Ivo. Změny kinetických parametrů vychytávání trijodhyroninu erytrocyty u pacientů s depresivním onemocněním. Psychiatrie. 2001, vol. 5, no. Suppl. 2, p. 125-126. STÁRKOVÁ, Lucie; PACLT, Ivo a FIŠAR, Zdeněk. Vychytávání thyroidních hormonů erytrocyty ve vztahu k depresivním onemocněním. Čes. a slov. Psychiat. 2001, vol. 97, no. 8, p. 430-433. STÁRKOVÁ, Lucie, FIŠAR, Zdeněk, PACLT, Ivo et al.. Red blood cell triiodothyronine uptake as membrane parameter of depression. Eur. Neuropsychopharm. 2003, vol. 13, no. Suppl. 4, p. S259-S260. VELENOVSKÁ, Marie; FIŠAR, Zdeněk; HRUBÝ, Tomáš et al. Vliv kanabinoidů na vlastnosti buněčné bembrány. Psychiatrie. 2003, vol. 7, no. Suppl. 2, p. 137-138. VEVERA, Jan; FIŠAR, Zdeněk; KVASNIČKA, Tomáš et al. Cholesterol-lowering therapy evokes time-limited changes in serotonergic transmission. Psychiatry Res. 2005, vol. 133, no. 2-3, p. 197-203.
80
4. CITAČNÍ OHLASY Citační ohlasy dle SCI (k 31.8.2005) 1. Citovaný článek Kovářů F, Kovářů H, Fišar Z: Ontogenetic analysis of some surface markers on pig lymphocytes using Fluorescenceactivated cell sorter FOLIA MICROBIOLOGICA 30: 277-290, 1985 Citující článek 1. Wang FI, Williams TJ, Elawar FY, Pang VF, Hahn EC Characterization of porcine peripheral-blood leukocytes by light-scattering flowcytometry CAN J VET RES 51: (4) 421-427 OCT 1987 2. Trebichavsky I, Mandel L, Vetvicka V Immunological markers and fine-structure of alveolar cells in germ-free pigs FOLIA BIOL-PRAGUE 33: (4) 246-& 1987 3. Trebichavsky I, Patrikova I, Mandel L, Kovaru F, Zahradnickova M. Ontogeny of lymphocytes-T in the pig FOLIA MICROBIOL 33: (4) 329-331 1988 2. Citovaný článek Fišar Z, Krulík R, Fuksová K, Sikora J Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue GENERAL PHYSIOLOGY AND BIOPHYSICS 15: (1) 51-64 FEB 1996 Citující článek 1. Sanganahalli BG, Joshi PG, Joshi NB Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane dynamics - a fluorescence spectroscopic study LIFE SCI 68: (1) 81-90 NOV 24 2000 2. de Gandarias JM, Irazusta J, Varona A, Gil J, Fernandez D, Casis L Effect of imipramine on enkephalin-degrading peptidases EUR NEUROPSYCHOPHARM 9: (6) 493-499 DEC 1999
81
3. Citovaný článek Fišar Z, Tvrzická E, Anders M, Kovářů H, Sikora J, Staňková B, Vujić Z Effect of long-term antidepressant treatment on membrane phospholipids HOMEOSTASIS IN HEALTH AND DISEASE 38: (2) 68-69 JUL 1997 Citující článek 1. Sanganahalli BG, Joshi PG, Joshi NB Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane dynamics - a fluorescence spectroscopic study LIFE SCI 68: (1) 81-90 NOV 24 2000 4. Citovaný článek Fišar Z, Hýsek J, Binek B Quantification of airborne microorganisms and investigation of their interactions with nonliving particles INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOMETEOROLOGY 34: (3) 189-193 1990 Citující článek 1. Stark KDC The role of infectious aerosols in disease transmission pigs VET J 158: (3) 164-181 NOV 1999 2. Kasama T, Murakami T The effect of microorganisms on Fe precipitation rates at neutral pH CHEM GEOL 180: (1-4) 117-128 OCT 1 2001 3. Spurny KR On the chemical-detection of bioaerosols J AEROSOL SCI 25: (8) 1533-1547 DEC 1994 4. Hilliger HG Emissions of dust and microorganisms from animal houses DEUT TIERARZTL WOCH 98: (7) 257-261 JUL 1991 5. Citovaný článek Kovářů H, Kozáková H, Fišar Z, Mareš V In vitro early allogeneic reaction of murine brain cortex cells PHYSIOLOGICAL RESEARCH 46: (2) 127-135 1997
82
Citující článek 1. Kovaru H, Kovaru F, Haskova V Cell surface enzymes of brain cortex cells or lymphocytes during early allogeneic reaction PHYSIOL RES 46: (2) 137-144 1997 2. Kozakova H, Kovaru H, Mares V, Kovaru F, Siman P. Peptide cytokines in CNS and the immune system PHYSIOL RES 46: (2) 145-153 1997 6. Citovaný článek Vyhnálek V, Fišar Z, Fišarová A, Komárková J In vivo fluorescence of chlorophyll a: Estimation of phytoplankton biomass and activity in Římov reservoir (Czech Republic) WATER SCIENCE AND TECHNOLOGY 28: (6) 29-33 1993 Citující článek 1. Honeywill C, Paterson DN, Hagerthey SE Determination of microphytobenthic biomass using pulse-amplitude modulated minimum fluorescence EUR J PHYCOL 37: (4) 485-492 NOV 2002 2. Acevedo MF, Waller WT Modelling and control of a simple trophic aquatic system ECOL MODEL 131: (2-3) 269-284 JUL 1 2000 3. Komarkova J Fish stock as a variable modifying trophic pattern of phytoplankton HYDROBIOLOGIA 370: 139-152 1998 4. Becker G, Holfeld H, Hasselrot AT, Fiebig DM, Menzler DA Use of a microscope photometer to analyze in vivo fluorescence intensity of epilithic microalgae grown on artificial substrata APPL ENVIRON MICROB 63: (4) 1318-1325 APR 1997 5. MacCarthy P, Klusman RW, Cowling SW, Rice JA Water analysis ANAL CHEM 67: (12) R525-R582 JUN 15 1995 6. Podola B, Melkonian M Selective real-time herbicide monitoring by an array chip biosensor employing diverse 83
microalgae JOURNAL OF APPLIED PHYCOLOGY 17 (3): 261-271 MAY 2005 7. Citovaný článek Hýsek J, Fišar Z, Žižka Z, Kofroňová O, Binek B Airborne microorganism monitoring: A comparison of several methods, including a new direct counting technique ZENTRALBLATT FUR MIKROBIOLOGIE 146: (6) 435-443 1991 Citující článek 1. Stark KDC The role of infectious aerosols in disease transmission pigs VET J 158: (3) 164-181 NOV 1999 2. Dawson MW, Scott JG, Cox LM The medical and epidemiologic effects on workers of the levels of airborne Thermoactinomyces spp spores present in Australian raw sugar mills AM IND HYG ASSOC J 57: (11) 1002-1012 NOV 1996 8. Citovaný článek Fišar Z, Krulík R, Beitlová D Liposomes - model membranes to study the binding of tricyclic antidepressants DRUG METABOLISM AND DRUG INTERACTIONS 9: (3-4) 269-281 1991 Citující článek 1. Sanganahalli BG, Joshi PG, Joshi NB Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane dynamics - a fluorescence spectroscopic study LIFE SCI 68: (1) 81-90 NOV 24 2000 2. Beigi F, Lundahl P Immobilized biomembrane chromatography of highly lipophilic drugs J CHROMATOGR A 852: (1) 313-317 AUG 6 1999 3. Rogoz Z, Dlaboga D, Dziedzicka-Wasylewska M Effect of combined treatment with imipramine and amantadine on the central dopamine D-2 and D-3 receptors in rats J PHYSIOL PHARMACOL 54 (2): 257-270 JUN 2003 4. Macri BM, Stoian G, Marin A, Flonta ML 84
Hypericin potentates the effect of tricyclic antidepressants on artificial lipid bilayers CHEMISTRY AND PHYSICS OF LIPIDS 130 (1): 54-54 JUN 2004 9. Citovaný článek Stožický V, Kovářů F, Trebichavský I, Stožická I, Fišar Z, Kovářů H, Šiman P Imunitní poškození fetoplacentární jednotky 3RD C CZECH IMM 43 1982 Citující článek 1. Trebichavsky I, Kovaru F, Stozicky V, Siman P Localization of the antigen and antibodies in the placenta of immunized sheep AM J REPROD IMMUNOL 5: (4) 161-163 1984 10. Citovaný článek Kovářů H., Fišerová A., Lisá V., Kovářů F., Fišar Z., Malbohan I.M.: Antidepressant effect of GTP-binding proteins in C-6 glioma cells and natural killer lymphocytes. BIOL. PSYCHIATRY 42, 47S, 1997 Citující článek 1. Kovaru H, Kovaru F, Zizkovsky V, Velek J. Developmental changes of trimeric GTP-binding proteins in porcine brain and immune system ACTA VET BRNO 67: (1) 15-20 MAR 1998 11. Citovaný článek Kovářů H, Fišerová A, Španová A, Lisá V, Fišar Z, Velek J: Antidepressants as neuroimmunomodulators at postreceptor level. J. NEUROIMMUNOLOGY 90, 1, 41, 1998 Citující článek 1. Kovaru H, Fiserova A, Kovaru F, Pospisil M, Lisa V Modulation of heterotrimeric GTP-binding proteins in immune system and brain CZECH J ANIM SCI 46: (2) 62-67 FEB 2001 12. Citovaný článek Kovářů H, Kovářů F, Plášek J, Fišar Z, Mandel L: 85
Lectin-induced surface changes in lymphocytes of gnotobiotic pigs. In: Lectins - Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry (T.C.Bog-Hansen, ed.), W. de Gruyter and Co., Berlin-New York, Vol. II, 315-323, 1982 Citující článek 1. Kovaru F, Kovaru H, Fiserova A, Matalova E, Zelnickova P, Landa L, Palikova M Physiological and immunological profiles after intrauterine immunization ACTA VET BRNO 71 (4): 487-493 DEC 2002 13. Citovaný článek Kovářů H, Kozáková H, Hašková V, Kovářů F, Fišar Z, Mareš V, Lisá V: Cell surface events in allogeneic reactions between brain cells and/or lymphocytes. PHYSIOL. RES. 45, 2, 3P, 1996 Citující článek 1. Fiserova A, Kovaru H, Hajduova Z, Mares V, Starec M, Kren V, Flieger M, Pospisil M Neuroimmunomodulation of natural killer (NK) cells by ergot alkaloid derivatives PHYSIOL RES 46: (2) 119-125 1997 2. Kovaru H, Kovaru F, Haskova V Cell surface enzymes of brain cortex cells or lymphocytes during early allogeneic reaction PHYSIOL RES 46: (2) 137-144 1997 14. Citovaný článek Kovářů H, Kovářů F, Fišar Z, Svoboda P, Malbohan I, Žižkovský V Development of Galpha subunits in pig immune system P 14 INT IPVS C BOL 380 1996 Citující článek 1. Kovaru H, Kovaru F, Zizkovsky V, Velek J Developmental changes of trimeric GTP-binding proteins in porcine brain and immune system ACTA VET BRNO 67: (1) 15-20 MAR 1998 15. Citovaný článek Kovářů H, Lisá V, Fišar Z, Kovářů F, Černá V, Žižkovský V, Dobrovský K 86
Antidepressant effect on expression of G-alpha subunits in C-6 glioma cells ROYAL MICR SOC P 30: 123 1995 Citující článek 1. Kovaru H, Kovaru F, Zizkovsky V, Velek J Developmental changes of trimeric GTP-binding proteins in porcine brain and immune system ACTA VET BRNO 67: (1) 15-20 MAR 1998 16. Citovaný článek Kovářů F, Kovářů H, Fišar Z Development of T lymphocyte subpopulation in pig fetuses 12TH P C INT PIG VET II: 396 1992 Citující článek 1. Tlaskalova-Hogenova H, Mandel L, Trebichavsky I, Kovaru F, Barot R, Sterzl J Development of immune-responses in early pig ontogeny VET IMMUNOL IMMUNOP 43: (1-3) 135-142 OCT 1994 17. Citovaný článek Hýsek J, Fišar Z, Binek B Long-run monitoring of bacteria, yeasts and other micromycetes in the air of an industrial conurbation GRANA 29: 450-453 1991 Citující článek 1. Lighthart B The ecology of bacteria in the alfresco atmosphere FEMS MICROBIOL ECOL 23: (4) 263-274 AUG 1997 2. Antropova AB, Mokeeva VL, Bilanenko EN, Chekunova LN, Petrova-Nikitina AD, Zheltikova TM Seasonal variation in micromycetes of Moscow dwellings MIKOLOGIYA I FITOPATOLOGIYA 38 (5): 32-41 2004 18. Citovaný článek Krulík R, Bureš P, Fišar Z, Fuksová K, Sikora J, Beitlová D Blokátory Ca2+-kanálů a vazba tricyklických antidepresiv 87
CESK PSYCHIAT 91: (3) 143-151 1995 Citující článek 1. Fisunov A, Lozovaya N, Tsintsadze T, Chatterjee S, Noldner M, Krishtal O Hyperforin modulates gating of P-type Ca2+ current in cerebellar Purkinje neurons PFLUG ARCH EUR J PHY 440: (3) 427-434 JUL 2000 19. Citovaný článek Fialová L, Mikulíková L, Fišar Z, Beitlová D, Malbohan I Antifosfatidylinositolové protilátky a jejich stanovení vlastní ELISA metodou SB LÉK 97: (4) 463-467 1996 Citující článek 1. McIntyre JA, Wagenknecht DR, Faulk WP Antiphospholipid antibodies: discovery, definitions, detection and disease PROG LIPID RES 42 (3): 176-237 MAY 2003 20. Citovaný článek Kovářů F, Kovářů H, Fišar Z Immunophenotyping markers on T lymphocyte subpopulations in fetal pig development HISTOCHEM J 26: (11) 876-877 1994 Citující článek 1. Kovaru F, Kovaru H, Fiserova A, Matalova E, Zelnickova P, Landa L, Palikova M Fetal and postnatal development of T-lymphocyte subpopulations ACTA VET BRNO 71 (4): 495-+ DEC 2002 21. Citovaný článek Kovářů H, Kovářů F, Kozáková H, Fišar Z, Knotek Z, Vojtíšek P Lymphocyte cell surface events and regulation of cell maturation and proliferation P 12TH INT IPVS C HAAG II: 416 1992 Citující článek 1. Matalova E, Spanova A, Kovaru F Apoptotic DNA alterations in pig leukocytes after phagocytosis of bacteria are linked to maturation of the immune system PHYSIOL RES 52 (2): 235-242 2003 2. Kovaru F, Kovaru H, Fiserova A, Matalova E, Zelnickova P, Landa L, Palikova M 88
Physiological and immunological profiles after intrauterine immunization ACTA VET BRNO 71 (4): 487-493 DEC 2002
Citační ohlasy v českých časopisech 22. Citovaný článek Fišar Z Biochemické hypotézy afektivních poruch Praha Galén 1998 Citující článek 1. Höschl C. Současné trandy v psychiatrii (Current Trends in Psychiatry) Psychiatrie (Suppl. 2) 4-5 1999 11. Citovaný článek Kovářů H, Fišarová A, Španová A, Lisá V, Fišar Z, Velek J Antidepressants as neuroimmunomodulators at postreceptor level J. NEUROIMMUNOLOGY 90: 41 1998 Citující článek 1. Kovářů H, Fišerová A, Kovářů F. Neuroimmunomodulatory aspects of postreceptor signalling Psychiatrie 5: (Suppl. 2) 61-62 2001 15. Citovaný článek Kovářů H, Lisá V, Fišar Z, Kovářů F, Černá V, Žižkovský V, Dobrovský K Antidepressant effect on expression of G-alpha subunits in C-6 glioma cells PROC ROYAL MICR. SOC. 30: (Pt 2) 123 1995 Citující článek 1. Kovářů H, Fišerová A, Kovářů F. Neuroimmunomodulatory aspects of postreceptor signalling Psychiatrie 5: (Suppl. 2) 61-62 2001
89
5. PŘÍLOHY Příloha 1: FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava and VELENOVSKÁ, Marie. Binding of imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol. Biophys. 2004, vol. 23, no. 1, p. 77-99. Příloha 2: FIŠAR, Zdeněk. Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid bilayer membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 161-180. Příloha 3: FIŠAR, Zdeněk; KRULÍK, Radoslav; FUKSOVÁ, Květoslava and SIKORA, Jan. Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol. Biophys. 1996, vol. 15, p. 51-64. Příloha 4: FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin and KALIŠOVÁ, Lucie. Effect of pharmacologically selective antidepressants on serotonin uptake in rat platelets. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 1, p. 113-128. Příloha 5: FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin; TVRZICKÁ, Eva and STAŇKOVÁ, Barbora. Effect of long-term administration of antidepressants on the lipid composition of brain plasma membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 221-236. Příloha 6: FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; ANDERS, Martin; SIKORA, Jan; FUKSOVÁ, Květoslava; KOVÁŘŮ, Hana and DOBROVSKÝ, Karel. Platelet serotonin uptake in depressed patients during treatment. Homeostasis. 1998, vol. 38, no. 4, p. 172-173. Příloha 7: KALIŠOVÁ-STÁRKOVÁ, Lucie; FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; HANUŠ, Zdeněk and VEVERA, Jan. Red blood cell triiodothyronine uptake as membrane parameter of depression. Physiol. Res. 2005, [Epub ahead of print]. Příloha 8: VEVERA, Jan; FIŠAR, Zdeněk; KVASNIČKA, Tomáš; HANUŠ, Zdeněk; STÁRKOVÁ, Lucie; ČEŠKA, Richard and PAPEŽOVÁ, Hana. Cholesterol-lowering therapy evokes time-limited changes in serotonergic transmission. Psychiatry Res. 2005, vol. 133, no. 2-3, p. 197-203.
90
Příloha 1: FIŠAR, Zdeněk; FUKSOVÁ, Květoslava and VELENOVSKÁ, Marie. Binding of imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol. Biophys. 2004, vol. 23, no. 1, p. 77-99.
Gen. Physiol. Biophys. (2004), 23, 77—99
77
Binding of Imipramine to Phospholipid Bilayers Using Radioligand Binding Assay Z. Fišar1 , K. Fuksová2 and M. Velenovská1 1 2
Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic Institute of Nuclear Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic
Abstract. Binding of the tricyclic antidepressant imipramine (IMI) to neutral and negatively charged lipid membranes was investigated using a radioligand binding assay combined with centrifugation or filtration. Lipid bilayers were composed of brain phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylserine (PS). IMI binding isotherms were measured up to IMI concentration of 0.5 mmol/l. Due to electrostatic attraction, binding between the positively charged IMI and the negatively charged surfaces of PS membranes was augmented compared to binding to neutral PC membranes. After correction for electrostatic effects by means of the Gouy– Chapman theory, the binding isotherms were described both by surface partition coefficients and by binding parameters (association constants and binding capacities). It was confirmed that binding of IMI to model membranes is strongly affected by negatively charged phospholipids and that the binding is heterogeneous; in fact, weak surface adsorption and incorporation of the drug into the hydrophobic core of lipid bilayer can be seen and characterized. These results support the hypothesis suggesting that the lipid part of biological membranes plays a role in the mechanism of antidepressant action. Key words: Antidepressants — Binding — Liposomes — Phosphatidylcholine — Phosphatidylserine Abbreviations: IMI, imipramine; DMI, desipramine; AMI, amitriptyline; CMI, clomipramine; DDMI, didesmethylimipramine; PC, phosphatidylcholine; PS, phosphatidylserine; CAD, cationic amphiphilic drug; TCA, tricyclic antidepressant; MLV, multilamellar vesicle; SUV, small unilamellar vesicle; LUV, large unilamellar vesicle; GC, Gouy–Chapman; Bmax , maximum amount of drug bound to phospholipid (binding capacity); K, equilibrium association constant; Bmax,app , apparent binding capacity; Kapp, apparent association constant; Kd , equilibrium dissociation Correspondence to: Zdeněk Fišar, Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine, Charles University, Ke Karlovu 11, 120 00 Prague 2, Czech Republic E-mail: [email protected]
78
Fišar et al.
constant; IC50 , half-maximum displacement (cold ligand concentrations displacing 50 % of bound radioligand); kp , intrinsic (hydrophobic) partition coefficient; kp,app , apparent overall partition coefficient; Ceq , equilibrium IMI concentration in the bulk aqueous phase; BIMI , amount of IMI in milimoles bound per mole of phospholipid; σ, surface electric charge density; λ, Debye length; ψ0 , electrostatic surface potential; C0 , concentration of IMI in the aqueous phase at the membrane; PEI, polyethyleneimine. Introduction Antidepressants are amphiphilic molecules which are able to accumulate in lipid bilayer and alter its composition or physical characteristics. There is insufficient knowledge as regards the extent in which the action of antidepressants on lipid bilayers contributes to their therapeutic or adverse effects. Tricyclic antidepressants (TCAs) have been used in treatment of depression for almost 50 years and have been tested in many clinical and theoretical studies. Inhibition of serotonin and noradrenalin transporters in neuronal membranes is their primary biochemical effect leading to the therapeutic effect. Still it is unclear whether the TCA recognition takes place directly from the aqueous phase via binding to surface-exposed binding sites, or whether it is mediated by the lipid part of target membranes. The latter possibility was proposed on the basis of the amphiphilic properties of TCAs. Liposomes are the best model of the lipid part of biological membranes and they enable determination of partition coefficients or binding parameters (Reith et al. 1984; Fišar et al. 1991; Mason et al. 1991; Seydel et al. 1992, 1994). Liposomes are simply vesicles in which aqueous solution is enclosed by a membrane composed of lipid molecules. Depending on the method of preparation, multilamellar vesicles (MLVs), small unilamellar vesicles (SUVs) or large unilamellar vesicles (LUVs) may be produced (New 1990). LUVs are the best model of cell membranes; however, it was demonstrated that MLVs are also a good model (Choi and Rogers 1991). As a consequence of membrane heterogeneity, drugs are distributed non-uniformly in the lipid bilayer (Herbette et al. 1986; Müller et al. 1986) and multiple binding sites of cationic amphipaths with membranes have been described (Boulanger et al. 1980; Kelusky et al. 1986; Zachowski and Durand 1988). Although the lipid bilayer is a dynamic fluid structure, there are stable separate domains in which specific interactions can occur. Specific interactions of some ligands with phospholipid acyl chains may also occur (Bäuerle and Seelig 1991; Jørgensen et al. 1991). At physiological conditions, TCAs in aqueous solution carry a positive charge (pK = 9.4). It seems that these drugs primarily act on the polar phase of lipid bilayers (Zimmer and Schulze 1981). The charged phosphate and carboxylic groups on phospholipid molecules are the main membrane binding sites for cations. Protonated amines can partition to a surprising extent into phospholipid bilayers; however, it has been found that this is not a consequence of simple ion pairing (Austin et al. 1995). Having their charge lost, nonpolar TCA molecules may be accumulated
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
79
in the hydrophobic core of lipid bilayers or can pass through membranes. Therefore, at equilibrium, TCA molecules are localized on the outer and inner membrane surfaces, in the hydrophobic core of lipid bilayers and in the aqueous phase. Indeed, TCAs are known to penetrate easily into the central nervous system (Seelig et al. 1994). In our initial experiments, we verified the assumption that permeability of lipid bilayers for TCAs enables a rapid and uniform distribution of the drugs in MLVs. The tendency to refer to the result of drug-lipid bilayer interaction as “binding” has been subject to discussion because of the general meaning of this term in the classic enzyme-substrate or ligand-receptor interaction studies (Heirwegh et al. 1992). Binding into a bilayer is considered a restriction of dimensionality (Mosior and McLaughlin 1992; Beschiaschvili and Seelig 1992). It should be taken into consideration that lipid-TCA interactions can be purely electrostatic, purely hydrophobic, or a combination of both. In the case of a negatively charged membrane, not only the cationic drug, but also all other cations will accumulate at the lipid-water interface. Partition coefficients have been found to be concentration-independent at low drug concentrations (Mason et al. 1989); yet they depend on temperature, pH and membrane lipid composition (Luxnat and Galla 1986; Zachowski and Durand 1988; Austin et al. 1995). A number of studies have shown that the surface partition coefficient, determined as the ratio of surface concentration of the drug to its actual bulk concentration in the immediate vicinity of the membrane, is independent on the bulk concentrations even at higher ligand concentrations (Bäuerle and Seelig 1991; Heirwegh et al. 1992). The saturation of adsorption isotherms observed at higher concentrations of amphiphilic drugs has been explained by changes in electrostatic potential on the membrane surface due to incorporation of charged ligand molecules into the lipid bilayer. The effective ion concentration near the membrane surface differs from that in the bulk due to redistribution of the ions in the electrostatic, hydration, and steric-repulsion fields of the membrane. The electrostatics of charged lipid bilayers has been extensively discussed in a number of reviews (McLaughlin 1989; Cevc 1990, 1993; Langner and Kubica 1999). For long-range interactions, the electrostatic potential in the vicinity of the membrane surface can be approximated by the Gouy–Chapman (GC) theory. The electrophoretic mobility, profile of electrostatic potential and concentrations of small ions at the membrane surface are all described by the GC theory with sufficient accuracy. The GC theory has also been adopted to describe adsorption (incorporation) of drugs and relatively large molecules (hormones, peptides, proteins) onto the lipid bilayer surface (Stankowski 1991; Mosior and McLaughlin 1992; Seelig et al. 1996). After a correction for electrostatic effects by means of the GC theory, the binding isotherm (Langmuir or Stern) can be analyzed (Beschiaschvili and Seelig 1990). The binding parameters allow identification of one, two or more binding sites. The GC theory allows separation of the total binding to lipid bilayer into the hydrophobic and electrostatic contributions (Seelig et al. 1993).
80
Fišar et al.
Binding of TCAs to model membranes is apparently more affected by the bilayer lipid composition than by differences between individual TCAs (Cater et al. 1974; Fišar et al. 1991). This effect is mostly due to negatively charged phospholipids. Therefore, we used liposomes prepared both from the electroneutral phosphatidylcholine (PC) and from the negatively charged phosphatidylserine (PS). Imipramine (IMI) was used as a ligand representing the TCAs; in some experiments, however, we used other TCAs (desipramine, DMI; didesmethylimipramine, DDMI; clomipramine, CMI; amitriptyline, AMI). The technique employed in our study was a radioligand binding assay analogous to that used in receptor studies (Bennett and Yamamura 1985). The advantage of this method is its ability to work with very low drug concentrations and to study high-affinity binding sites. The total plasma levels of TCAs and their active metabolites during the therapy of depression are usually below 1 µmol/l (Razavi and Mendlewicz 1982), and up to 95 % thereof may be bound to plasma proteins. Consequently, the free TCA concentrations fall inside the nanomolar range (<50 nmol/l). So far, binding of IMI to lipid bilayers at nanomolar IMI concentrations has not been characterized. The aim of our experiments was to give a description of different binding sites of IMI in lipid bilayers. Total binding of IMI to PC and PS liposomes was analyzed using the GC theory and the strong (“high-affinity”) part of the total binding was characterized. Materials and Methods Chemicals and solutions All samples were prepared in a buffer solution (120 mmol/l NaCl, 10 mmol/l KCl, 30 mmol/l Tris HCl, pH 7.4). Phospholipids in the chloroform/methanol solvent mixture (2 : 1, vol/vol; 5–20 mg/ml) were prepared in our laboratories. Crude extract of lipids from white matter of bovine brain was prepared (Folch et al. 1957; Koul and Prasad 1996), and PC and PS were isolated by column chromatography using alumina and DEAE-Sephadex. The resulting purity, determined by twodimensional thin-layer chromatography, was over 95 %. The phospholipids were stored in a freezer under nitrogen atmosphere. The following stock solutions of tritium-labelled TCA ([3 H]TCA) in methanol were used: 13.0 µmol/l [3 H]IMI (specific activity 2.85 TBq/mmol, concentration 37 MBq/ml), 4.08 µmol/l [3 H]DMI (2.0 TBq/mmol, 8.16 MBq/ml), 3.00 µmol/l [3 H]AMI (4.07 TBq/mmol, 12.2 MBq/ml), 17.6 µmol/l [3 H]DDMI (2.1 TBq/mmol, 37 MBq/ml); radiochemical purity >96 %; labelled in our laboratories (Krulík et al. 1991); 50 or 100 nmol/l of [3 H]TCA solution with specific activity about 100 kBq/ml in buffer was used in a binding experiment. Tritium-labelled phospholipids, [3 H]PC and [3 H]PS (concentration 18.5 MBq/ml, radiochemical purity >96 %), were prepared by catalytic tritiation of double bonds in hydrocarbon chains of phospholipids (with a relatively great content of oleic acid) with gaseous tritium.
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
81
Preparation of liposomes A modification of the Bangham method (Bangham et al. 1965; New 1990) was used to prepare PC and PS vesicles. Phospholipid concentrations were checked using phosphorus concentration determination (Bartlett 1959; Wagner et al. 1962). Liposomes were always prepared shortly before measurement. Brief summary of the method: An aliquot part of phospholipid solution containing less than 20 mg of phospholipid was introduced into a 20 ml vial and the liquid was completely evaporated from the solution by nitrogen stream at temperature about 40 ◦C. The vial was then placed in vacuum for at least one hour to remove residual solvent. After releasing the vacuum, 2 ml of buffer was added; the vial was filled with nitrogen, closed and incubated at 50 ◦C for 5 min. The sample was agitated until all lipid was removed from the walls of the vial and a homogeneous milky-white suspension arose. The vial was shortly sonicated (for 5 to 15 s) in an XL 2020 Sonicator (Misonix, Inc.) to release all lipids from the walls and to break down large clusters. Following incubation of the sample at 50 ◦C for 30 min, the suspension was left at room temperature for further 2 h and diluted by buffer solution to the required phospholipid concentration. Radioligand binding assay Binding equilibrium was studied by the radioligand binding assay (Bennett and Yamamura 1985). Tritium-labelled IMI was used as marker. Non-labelled (cold) IMI was used in the form of hydrochloride. Typically, liposome suspension was mixed with buffer and [3 H]IMI, and the sample was incubated at 20 ◦C, pH 7.4, for 30 min. The usual final phospholipid concentrations were 50–270 µmol/l for PS vesicles, 270–540 µmol/l for PC-MLVs, with the resultant concentration being about 5 nmol/l of [3 H]IMI. To separate bound and free ligand, centrifugation or rapid filtration were employed and total binding was measured. The specific binding of TCA to liposomes was calculated as the difference between the total and nonspecific binding, with nonspecific binding determined in the presence of excess cold ligand (50 µmol/l). Samples were measured in a scintillation cocktail using an LS 6000IC liquid scintillation counter (Beckman Instruments, Inc.). Centrifugation When working with biological or model membranes, the most common procedure to determine binding parameters or partition coefficients is centrifugation and determination of the solute remaining in the aqueous phase. The total volume of samples was typically 0.8 ml; 0.2 ml of the sample was removed after incubation to measure the total drug concentration and 0.6 ml was centrifuged either at 30,000×g at 20 ◦C for 15 min, or at 100,000 × g at 20 ◦C for 60 min; subsequently, 0.2 ml of supernatant was removed for free (bulk) ligand concentration determination. The separation of liposomes from aqueous phase is not complete when using centrifugation. The amount of lipid vesicles remaining in the supernatant was determined using tritium-labelled phospholipids as markers. In more detail,
82
Fišar et al.
a trace amount (2 µl) of [3 H]PC or [3 H]PS was added to PC or PS in the chloroform/methanol solvent mixture and lipid vesicles were prepared by the standard procedure. The percentage of liposomes in the pellet was determined. The amount of liposomes remaining in the supernatant strongly depends on duration of the centrifugation and rpm. We found that the percentage of phospholipid in pellet was 69 ± 8 % (n = 7) for PC-MLVs and 54 ± 9 % (n = 7) for PS vesicles, when samples were centrifuged at 30,000 × g at 20 ◦C for 15 min. When samples were centrifuged at 100,000 × g at 20 ◦C for 60 min, only 9.6 % of PC-MLVs and 5.5 % of PS-MLVs remained in the supernatant. In any case, a correction must be involved when the molar ratio of bound IMI to the molar amount of phospholipid (BIMI ) was calculated. Filtration Rapid filtration provides a very fast and efficient separation bound and free ligand. The filters used should maximally entrap particles, minimally bind the free radioligand and have a high permeability for the rinsing solution. We used Whatman glass microfiber filters (GF/F type) impregnated previously in 0.1 % polyethyleneimine (PEI) (Sigma) to reduce nonspecific binding of radioligands to GF/F filters. Samples were filtered and filters were washed rapidly three times with 3 ml of ice-cold buffer and, after adding the scintillation cocktail, they were assayed on a scintillation counter. We established that the washing procedure used is sufficient to remove the most part of unbound [3 H]IMI, since repeated washing did not decrease the activity trapped on the filter. The measured activities of filters were corrected for the proportion of liposomes that pass through a GF/F filter. Permeability of the GF/F filters for liposomes was tested using tritium-labelled phospholipids as markers. We found that 80±11 % (n = 23) of PC-MLVs or 82±5 % of PS vesicles (n = 23) was retained on GF/F filters impregnated in 0.1 % PEI. The amount of MLVs trapped on filters did not depend on repeated washing of the filters. The total duration of filtration and washing was about 10 s; it can be calculated that the filtration rate used allows correct determination of high-affinity binding processes with Kd of order 10−8 mol/l or less (Bennett and Yamamura 1985). The rapid, easy and efficient separation of free ligand is an advantage of the filtration technique, but the technique cannot be used for low-affinity binding processes (Kd > 10−8 mol/l). The percentage of radioligand bound to filters increases progressively at concentrations below 4 nmol/l of [3 H]IMI, regardless of whether cold IMI is present or not. Within the range of 5–30 nmol/l [3 H]IMI, the percentage of [3 H]IMI bound to filters was virtually constant (0.67 ± 0.18 %, n = 20, 20 ◦C, pH 7.4). A higher percentage of [3 H]IMI binding to GF/F filters at very low radioligand concentrations (<4 nmol/l) could potentially distort the saturation curves and identification of high-affinity binding sites by Kd in the sub-nanomolar region. This explains why both total binding and displaceable binding, calculated as the difference of filter
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
83
activities with a sample incubated without and with excess cold IMI (50 µmol/l), were determined. Data analysis Binding model Three regions are distinguished in the simplified model describing binding of an amphiphilic drug to a membrane (Seelig et al. 1993): (i) the bulk solution, (ii) the interface (aqueous layer immediately above the plane of binding), and (iii) the membrane. Both the protonated and unprotonated forms of the drug may be present in these regions. The fraction of the protonated IMI, F , depends on pH (Seelig et al. 1993) as follows: F = (1 + 10pH-pK )−1
(1)
where pK is the negative logarithm of the dissociation constant for the N-terminal amino group of IMI. It is well known that pK values in lipid membrane differ from those in the bulk solution (Cevc 1990; Miyazaki et al. 1992). The thermodynamic factors giving rise to shifts in pK also cause a difference in partitioning between the protonated and unprotonated forms of the amphiphile. Analysis of binding isotherms Analysis of binding isotherms of IMI follows the approach described for adsorption of monovalent cations (Eisenberg et al. 1979) or for binding of local anaesthetics (Lee 1978; Miyazaki et al. 1992), small peptides (Beschiaschvili and Seelig 1990; Seelig et al. 1993, 1996, 2000; Ziegler et al. 2003) and amphiphilic drugs (Bäuerle and Seelig 1991; Thomas and Seelig 1993) to lipid bilayers. Membrane surface with an electric charge density σ gives rise to an electrostatic surface potential ψ0 . The relation between the two parameters is provided by the GC approximation, which was obtained from the Poisson equation provided that all structural membrane charges are confined to an infinitely narrow plane and that the ion distribution is governed solely by coulombic forces (McLaughlin and Harary 1976; Cevc 1990). The GC model predicts the electrostatic potential at the membrane surface to be ψ0 = (2kT /Ze)arcsinh (Zeσλ/2εε0 kT )
(2)
for symmetrical electrolytes with counter-ions and co-ions of similar valency, Z. ε is the dielectric constant of water, ε0 is the permittivity of free space, k is the Boltzmann constant, λ is the Debye screening length, σ is the surface charge density, T is the temperature, and e is the elementary charge. The Debye length (in meters) relates ψ0 to concentrations of ions in the bulk aqueous phase, and can be calculated from the following equation (Cevc 1990): λ = [εε0 kT /(103 NA e2
X (Zi2 ci ))]1/2
(3)
84
Fišar et al.
where NA is the Avogadro number and the summation goes over all ionic species of valencies Zi and concentrations ci (in mol/l). The surface charge density is defined as σ = e/Ac (4) where Ac is the area per charge (in nm2 ). The effect of the surface potential is to change the ion concentration at the membrane-water interface (Seelig et al. 2000). If coulombic interaction is the only one included in the mean force potential, one obtains the ion concentration profile in GC approximation. The relation between the membrane active concentration of monovalent cations in the aqueous phase at the membrane, C0 , and the bulk equilibrium concentration, Ceq , is given by the Boltzmann equation C0 = Ceq exp(−zeψ0 /(kT ))
(5)
where z is the effective charge of adsorbed species. The binding process is characterized by the transition of the drug from the layer of concentration C0 into the membrane phase. Partitioning of cationic drugs into electrically neutral PC membrane gives rise to a positive surface potential of the lipid layer and the concentration of the cationic drug at the membrane surface decreases (Ceq > C0 ). The negatively charged PS bilayers exhibit a negative surface potential that leads to accumulation of cationic drugs in the vicinity of the membrane surface (Ceq < C0 ). Binding of amphiphilic drugs is thermodynamically driven by enthalpy and entropy changes and can be described by the Langmuir binding isotherm. Due to the ion concentration profile in the vicinity of the charged membrane surface, the degree of association is determined by the interfacial rather than by the bulk ion concentrations and the classical Stern adsorption isotherm is obtained (McLaughlin and Harary 1976; Cevc 1990). A description common in ligand-receptor studies (Bennett and Yamamura 1985) was used in our study B = Bmax C0 /(C0 + 1/K)
(6)
where C0 is the concentration of ligand in the aqueous phase at the membrane, B is the amount of drug in moles bound to mole of phospholipid at free drug concentration equal to C0 , Bmax is the maximum amount of drug bound per mole of phospholipid (mol/mol), and K is the equilibrium association constant (1/K = Kd is the dissociation constant) of the solute. The ratio B/Bmax is the degree of association. The reciprocal value of Bmax can be interpreted as the number of lipid molecules creating a specific binding site for IMI; however, it is a physically unrealistic picture of drug binding (Beschiaschvili and Seelig 1990; Ziegler et al. 2003). Some authors set the maximum number of binding sites equal to the number of lipid molecules (Lee 1978), i.e. Bmax = 1. The apparent binding constant, Kapp , and the apparent binding capacity, Bmax,app can be determined using the bulk IMI concentration (rather than C0 ) in Eq. (6) B = Bmax,app Ceq /(Ceq + 1/Kapp) (7)
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
85
Binding of solutes to membranes can be analyzed in terms of either the binding or partitioning formalism. The partition coefficient formalism coincides with the linear part of the binding isotherm and some authors use the partition coefficients for a simplified description of ligand binding to membrane surface (Mason et al. 1989; Beschiaschvili and Seelig 1990; Seelig et al. 2000). The surface partition equilibrium can be formulated as (8) B = kp C0 where kp is the hydrophobic partition coefficient. If the GC approximation is not considered, then (9) B = kp,app Ceq where kp,app is the apparent overall partition coefficient. Parameters of the binding isotherms (Eqs. (6) and (7)) were determined by nonlinear regression analysis (AccuFit Saturation Two-Site software, Beckman). Displacement curves were analyzed using the four-parametric logistic model (ImmunoFit EIA/RIA software, Beckman) to establish the values of cold ligand concentrations displacing 50 % of bound radioligand (IC50 ). Data is expressed as arithmetic mean ± standard deviation (S.D.). Mann– Whitney U-test (a nonparametric alternative to the t-test for independent samples) was used to determine the statistical significance of differences between means. Results Permeability of phospholipid bilayers The purpose of the first experiment was to find whether multilamellar liposomes can be used as a model for determination of quantitative parameters of IMI binding to the lipid part of biological membranes. Problems in the determination of drug partition between liposomes and aqueous phase could arise due to the fact that only a small part of lipid bilayers in MLVs is exposed to the surrounding environment, because inner lamellae are confined by outer lipid bilayer(s). The same technique was employed to prepare both PC and PS vesicles. However, because of the differences between the two phospholipid species (polar head size and charge), PC and PS liposomes are not the same. Unsonicated PC bilayers are characteristic by multilamellar packing. The fundamental structure of charged lipids dispersed in water is the unilamellar vesicle; and potential smaller particles entrapped in larger vesicles are also unilamellar (Hauser 1984). PS bilayers alone are very similar to those formed by other phospholipids, with only the headgroup segments being significantly different (Browning and Seelig 1980). It is therefore due to ask whether the lipid bilayers in PC or PS vesicles are sufficiently permeable for IMI. The problem was solved by comparison of fractions of bound IMI in three different samples differing by the time of addition of [3 H]IMI to the sample (Fig. 1). Binding was measured using both filtration and centrifugation to separate bound and free [3 H]IMI, and the percentage of bound ligand was calculated. The samples
86
Fišar et al.
Figure 1. Binding of [3 H]IMI to PC-MLVs and PS vesicles using filtration or centrifugation to separate bound and free radioligand. [3 H]IMI was added to phospholipids in different steps of liposome preparation: (A) to chloroform/methanol solvent mixture prior to preparation of MLVs; (B) to the dried phospholipid film along with buffer; and (C) to the ready-to-use MLVs. Final concentrations were 1.33 mmol/l of PC, 0.27 mmol/l of PS and 7.8 nmol/l of [3 H]IMI. Activities of samples were determined following a 30 min incubation period at 20 ◦C. Values are means ± S.D. (n = 5).
were measured in doublets. We found that the fraction of IMI bound to both PC and PS vesicles does not depend on the moment of [ 3 H]IMI addition. The mean fraction of IMI bound to PC-MLVs equals 10.4 ± 2.2 % (n = 5) when using the filtration separation, and 50.1 ± 3.6 % when using centrifugation. The fraction of IMI bound to PS vesicles is significantly higher compared to PC-MLVs and amounts to 45 ± 11 % when using filtration and 63 ± 12 % when using centrifugation. These values are valid at our experimental conditions, i.e. 1.33 mmol/l PC or 0.27 mmol/l PS, 7.8 nmol/l [3 H]IMI, 20 ◦C and pH 7.4. We proved that a 30 min incubation at 20 ◦C is sufficient to restore equilibrium, i.e., a uniform distribution of IMI within liposomes and binding of IMI to both outer and inner lipid bilayers (Fig. 1). The implication is that repeated freezethaw cycles are not necessary in our experiments. A good agreement of the degree of binding of an amphiphilic drug to PC vesicles subjected and not subjected to several freeze-thaw cycles has been obtained previously (Bäuerle and Seelig 1991). As a result, the higher IMI binding to PS liposomes compared to PC-MLVs cannot be explained by a different availability of inner lipid bilayers. Sample filtration followed by rapid washing leads to removal of weakly bound molecules. Therefore,
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
87
Figure 2. The time course of [3 H]IMI association with liposomes prepared from (A) PC and (B) PS, and the dissociation following the addition of 50 µmol/l cold IMI at minute 60, determined at 20 ◦C, pH 7.4, at 4 nmol/l of [3 H]IMI and phospholipid concentration of 0.66 mmol/l (PC) or 0.066 mmol/l (PS). Bound and free radioligand were separated by filtration and binding of [3 H]IMI to the filter (equal to 1.1 % of total [3 H]IMI) was subtracted from the total activity of the filter. Mean values of three (PC) or eight (PS) repetitions of the experiment are shown.
the filtration technique was found not to be useful for measurement of total binding of drugs to liposomes. The period required to achieve dynamic equilibrium between IMI in the aqueous phase and IMI bound to liposomes was determined in the next experiment as follows: The time course of [3 H]IMI association with liposomes and of dissociation following addition of excess cold IMI is shown on Fig. 2. We found that the half-time of association of IMI with MLVs was 124 s (n = 6) for PC-MLVs and 108 s (n = 9) for PS vesicles. The equilibrium was fully restored during 30 min both for PC and PS-MLVs. The dissociation was started by addition of 50 µmol/l cold IMI. The half-time of dissociation of IMI from the MLVs was approximately 17 s for PC-MLVs and 6 s for PS-MLVs. The same results were found when using unlabelled CMI as displacement agent instead of IMI. Total binding of IMI to liposomes The isotherms of IMI binding/adsorption to neutral PC bilayers and to negatively charged PS bilayers were measured in the total IMI concentration range of 0.001 to 270 µmol/l (binding to PC) or 0.001 to 400 µmol/l (binding to PS) using centrifugation. The binding parameters were calculated by combination of Eqs. (2), (5), and (6) (Stern equation). The effect of both IMI and monovalent cations on the surface potential ψ0 was considered (Fig. 3).
88
Fišar et al.
Figure 3. Binding of IMI to bilayer membranes composed of PC (A) or PS (B). The molar amount of IMI bound per mole of total lipid, denoted BIMI (mmol/mol), is plotted versus the equilibrium concentration of IMI, denoted C (µmol/l), free in solution (empty symbols @). The same data are plotted against the interfacial IMI concentration (filled symbols A) calculated using Eq. (5), i.e., taking into account electrostatic effects by means of the Gouy–Chapman (GC) theory. The dashed line is the theoretical binding curve calculated from Eq. (7) (Bmax,app = 31 mmol/mol, Kapp = 6077 l/mol for PC and Bmax,app = 384 mmol/mol, Kapp = 8190 l/mol for PS). The solid line is the theoretical binding curve calculated from Eq. (6) with binding parameters (Bmax = 35 mmol/mol, K = 5596 l/mol for PC and Bmax = 608 mmol/mol, K = 93 l/mol for PS) taking into account electrostatic effects by means of the GC theory and also Na+ (KNa+ = 0.6 M−1 ) and K+ (KK+ = 0.15 M−1 ) binding to PS in buffer (0.12 mol/l NaCl, 0.01 mol/l KCl, 0.03 mol/l Tris, pH 7.4, 20 ◦C).
Normally, inorganic monovalent cations do not bind to uncharged phospholipids such as PC (Eisenberg et al. 1979). The potential at the surface of a PCvesicle in solution (containing 0.12 mol/l NaCl, 0.01 mol/l KCl and 0.03 mol/l Tris-HCl) should be 0 mV. The charged PS headgroups are assumed to be binding sites for Na+ or K+ . Sodium and potassium binding to PS headgroups follows a Langmuir adsorption isotherm (at Bmax = 1); consequently, the mole fraction of these ions bound to PS, BNaK , can be calculated as (Beschiaschvili and Seelig 1990): BNaK = (KNa CNa + KK CK )/(1 + KNa CNa + KK CK ) (10) where CNa and CK are concentrations of Na+ and K+ . The representative ionbinding constants (intrinsic association constants) for PS membranes were KNa = 0.6 l/mol for Na+ and KK = 0.15 l/mol for K+ (Eisenberg et al. 1979; Cevc 1990). We determined BNaK = 0.0685 mol/mol in our experiment.
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
89
The surface charge density (Eq. (4)) of PC and PS vesicles in a buffer containing Na+ , K+ and IMI can be written as (Beschiaschvili and Seelig 1990; Stankowski 1991): σ = (e/AL )[−BPS (1 − BNaK ) + zIMI BIMI ]/(1 + BIMI AIMI /AL )
(11)
where AL is the surface area of lipid, AIMI is the surface area of IMI, BPS is moles of PS per mole of total lipid (BPS = 0 for PC liposomes), BIMI is the surface concentration of IMI defined as moles of IMI bound per mole of lipid, zIMI is the effective charge of bound IMI. In the present study, we measured total binding of IMI to lipid membranes using centrifugation for separation of bound and free ligand at 20 ◦C and pH 7.4; i.e., we did not resolved binding of the charged and uncharged forms of IMI. Therefore, the proportion of charged IMI molecules bound to membranes was calculated according to previously published data. Since the pK of the IMI amino group is 9.4, it follows from Eq. (1) that about 99.0 % of IMI in bulk solution bear positive charge. The interfacial pK shifts of different tertiary amine drugs vary somewhat, but have a mean value of ∆pK = −0.95 (Miyazaki et al. 1992). Assuming that the interfacial pK shift of IMI is similar to that in tertiary amine local anaesthetic analogues, 91.8 % of IMI bound to the membrane carry a positive charge, i.e. the effective charge, zIMI , of the N-terminal amino group is about +0,92. In model membranes, IMI is preferably localized with its charged side-chain near phospholipid polar head groups; the nonpolar tricycle ring system of IMI is incorporated into the acyl chain (hydrophobic) region of the lipid bilayer (Bauer et al. 1990; Freisleben and Zimmer 1991). Therefore, a correction for membrane expansion due to IMI penetration into the bilayer was included. The lateral packing densities and molecular areas of charged and uncharged lipids in the fluid phase are approximately the same; the lipid cross sectional area of AL = 0.68 nm2 (Beschiaschvili and Seelig 1990; Cevc 1990; Ziegler et al. 2003) was assumed in all our calculations. A considerable flexibility of the TCA molecules, both in the side chain and in the ring system (Heimstad et al. 1991) has been demonstrated; we estimated for IMI that AIMI ≈ 0.5 nm2 . Since loading of membranes with the drug was rather low (BIMI ≤ 0.2), the accuracy of the value of AIMI is not critical and σ can be evaluated using Eq. (11). The surface charge density σ gives rise to electrostatic potential at the membrane surface, ψ0 , which can be calculated using Eqs. (2) and (3). The Debye length (Eq. (3)) was determined (λ = 0.83 nm at concentration of monovalent electrolyte in the bulk aqueous phase equal to 0.13 mol/l, 20 ◦C) and surface potentials of PS or PC vesicles were calculated (Eq. (2)) both in absence of IMI and in presence of different IMI concentrations. Finally, the concentrations C0 (Eq. (5)) were determined; the data was evaluated using Eq. (6), and parameters Bmax and K were calculated. The results are summarized in Fig. 3 and in Tables 1 and 2. Experimental data (empty symbols in Fig. 3) deviate markedly from linearity, with BIMI being smaller or bigger than predicted by the GC theory (filled symbols in
90
Fišar et al.
Table 1. Binding of imipramine to phosphatidylcholine membranes Ceq BIMI (µmol/l) (mmol/mol) 0 0.0008 0.0014 0.0019 0.0023 0.0039 0.0069 0.013 0.026 0.052 0.10 0.16 0.27 0.48 0.88 2.0 3.7 5.4 8.0 16 30 60 122 232
0 0.0012 0.0016 0.0020 0.0021 0.0036 0.0058 0.011 0.014 0.032 0.049 0.057 0.11 0.13 0.34 0.81 1.1 1.7 2.6 2.3 5.8 8.1 12.5 18.8
σ (µC/m2 ) 0 0.00027 0.00036 0.00043 0.00046 0.00078 0.0013 0.0024 0.0030 0.0070 0.011 0.012 0.024 0.029 0.074 0.18 0.23 0.36 0.57 0.49 1.2 1.7 2.7 4.0
ψ0 (mV)
C0 (µmol/l)
0 0 0.00032 0.0008 0.00043 0.0014 0.00052 0.0019 0.00056 0.0023 0.00094 0.0039 0.0015 0.0069 0.0029 0.013 0.0036 0.026 0.0084 0.052 0.013 0.10 0.015 0.16 0.028 0.27 0.035 0.48 0.089 0.88 0.21 2.0 0.28 3.7 0.44 5.3 0.68 7.8 0.59 16 1.5 29 2.1 56 3.2 109 4.8 195
kp (l/mol)
kp,app (l/mol)
1602 1214 1037 940 931 844 836 527 614 474 362 407 280 386 410 291 314 337 144 202 145 115 97
1602 1214 1037 940 931 844 836 527 613 474 362 406 280 385 407 288 309 329 141 191 134 102 81
PC liposomes were incubated in buffer (pH 7.4) at 20 ◦C for 30 min with different IMI concentrations. The final volume of samples was 0.8 ml, and the final concentrations was 0.36 mmol/l of PC; 0.7–20 nmol/l of [3 H]IMI was used as marker. 0.2 ml of the sample was removed following incubation to measure the total sample activity and 0.4 ml was centrifuged (30,000 × g, 20 ◦C, 15 min) and the activity of 0.2 ml of the supernatant was subsequently measured. Ceq , the equilibrium IMI concentration in the bulk aqueous phase; BIMI , the amount of IMI in milimoles bound per mole of PC; σ, the electric charge density (Eq. (11)); ψ0 , the electrostatic surface potential (Eq. (2)); C0 , the concentration of IMI in the aqueous phase at the PC membrane (Eq. (5)); kp , the hydrophobic partition coefficient (Eq. (8)); kp,app , the apparent overall partition coefficient (Eq. (9)). The samples were measured in doublets. Mean values were determined from 4 independent measurements.
Fig. 3), indicating that there is either an electrostatic repulsion of IMI as the PC membrane surface becomes positively charged, or electrostatic attraction of IMI as the PS bilayer is negatively charged. “High-affinity” binding of TCAs to liposomes Saturation experiment The purpose of the following experiment was to determine the binding parameters
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
91
Table 2. Binding of imipramine to phosphatidylserine membranes Ceq BIMI (µmol/l) (mmol/mol) 0 0.0002 0.0005 0.0008 0.0012 0.0016 0.0021 0.0029 0.0040 0.0060 0.0078 0.012 0.054 0.15 0.44 1.5 5.4 19 64 156 248 323 428
0 0.0029 0.0038 0.0071 0.0097 0.013 0.017 0.027 0.028 0.040 0.043 0.056 0.22 1.0 2.5 7.3 18 60 142 203 239 289 307
σ (µC/m2 )
ψ0 (mV)
−219 −219 −219 −219 −219 −219 −219 −219 −219 −219 −219 −219 −219 −219 −218 −216 −212 −195 −165 −146 −135 −122 −117
−119 −119 −119 −119 −119 −119 −119 −119 −119 −119 −119 −119 −119 −119 −119 −118 −117 −113 −105 −99 −95 −90 −89
C0 (µmol/l) 0 0.017 0.037 0.065 0.093 0.13 0.16 0.22 0.31 0.46 0.60 0.89 4.1 12 33 110 392 1174 2931 5782 8014 8692 10766
kp (l/mol)
kp,app (l/mol)
169 103 109 104 103 109 119 89 86 72 62 54 90 74 66 45 51 49 35 30 33 29
13008 7884 8392 7977 7893 8381 9169 6870 6632 5510 4798 4170 6902 5659 4974 3245 3167 2237 1297 966 894 716
PS liposomes were incubated in buffer (pH 7.4) at 20 ◦C for 30 min with different IMI concentrations. The final volume of samples was 0.8 ml, and the final concentrations was 0.26 mmol/l of PS; 0.7–20 nmol/l of [3 H]IMI was used as marker. Symbols for quantities have the same meaning as in Table 1. The samples were measured in doublets. Mean values were determined from 7 independent measurements.
characterizing strong (“high-affinity”) binding of IMI to PC or PS membranes. PC and PS liposomes were incubated with 20 different [3 H]IMI concentrations. The final volume of samples was 0.25 ml; the final concentration was about 0.23 mmol/l of phospholipid. The binding experiment started by addition of [3 H]IMI in concentration of 0.7–60 nmol/l, and the samples were incubated at 20 ◦C, pH 7.4, for 30 min. Rapid filtration was used to separate bound and free ligand. Nonspecific binding was measured at the same experimental conditions, but excess cold ligand (50 µmol/l) was added before [3 H]IMI. The samples were measured in doublets. Displaceable binding was used to determine the binding parameters Bmax and Kd using Eqs. (6) or (7). The same method was used to determine the binding of different tritiumlabelled TCA ([3 H]IMI, [3 H]DMI, [3 H]DDMI, [3 H]AMI) to liposomes prepared from crude lipid extract from white matter of bovine brain. The results are summarized
92
Fišar et al.
Table 3. Parameters of “high-affinity” binding of tricyclic antidepressants to lipid bilayers prepared from PC, PS, or from the total lipids from white matter of bovine brain lipid
ligand
Kd (nmol/l)
Bmax (µmol/mol)
Kd,app (nmol/l)
Bmax.app (pmol/mg)
n
PC
IMI
9.8 ± 3.6
3.1 ± 2.0
9.8 ± 3.6
4.0 ± 2.6
10
PS
IMI
1262 ± 568
34.5 ± 9.5
16.4 ± 7.4
45.3 ± 12.4
10
crude lipid extract
IMI DMI DDMI AMI
20.0 ± 10.0 28.9 ± 3.9 19.3 ± 10.4 26.6 ± 2.8
3.3 ± 2.1 4.0 ± 1.0 3.4 ± 2.5 5.1 ± 2.1
3 3 3 3
Isothermal saturation curves were measured following incubation of liposomes composed of phoshatidylcholine, PC, phosphatidylserine, PS, and of crude lipid extract from white matter of bovine brain with tritium labelled imipramine, IMI, desipramine, DMI, didesmethylimipramine, DDMI, and amitriptyline, AMI, at 20 ◦C, pH 7.4, for 30 min. The final volume of samples was 0.25 ml, the final phospholipid concentrations was about 0.23 mg/ml, and the radioligand concentration was between 0.7 and 60 nmol/l. Filtration was used to separate bound and free radioligand. The samples were measured in doublets and nonspecific binding was deducted. Binding to PC and PS membranes was evaluated using the GC theory, and the dissociation constant, Kd = 1/K (nmol/l) and the amount of IMI in micromoles bound per mole of phospholipid, Bmax , were determined from Eq. (6). The apparent dissociation constant, Kd,app = 1/Kapp (nmol/l) and the apparent binding capacity, Bmax.app , in picomoles of TCA bound per milligram of lipid, were calculated using Eq. (7) to characterize binding to liposomes prepared from lipid mixture. Values are reported as mean ± S.D.; the means were calculated from n values. Both Kd and Bmax were found to be significantly higher in PS membranes than in PC membranes; as determined by Mann–Whitney U-test.
in Table 3. No statistically significant differences were found between individual antidepressants. Competition curves Competition curves were produced by incubating liposomes at a fixed concentration of [3 H]IMI with increasing concentrations of unlabelled ligand. The concentration of unlabelled ligand displacing 50 % of [3 H]IMI binding (half-maximum displacement, IC50 ) was determined and its relation to phospholipid concentration was studied. We tested the efficiency of unlabelled IMI, CMI or DMI to displace [3 H]IMI. The same procedure was used to determine IC50 at different [3 H]IMI concentrations (1.25–18 nmol/l) or different phospholipid concentrations (0.23–1.06 mmol/l of PC, 0.013–0.23 mmol/l of PS). We found that major part of IMI binding to MLVs is displaceable and IC50 values are practically the same when using different TCAs as competitors. An increase in IC50 values from 0.20 µmol/l to 3.4 µmol/l was found at the concentrations range of 0.23–1.06 mmol/l of PC, and IC50 increased from 0.22 µmol/l to
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
93
Figure 4. Inhibition of [3 H]IMI binding by clomipramine (CMI). Binding was determined in liposomes prepared from PC or PS. The final volume of samples was 0.25 ml, the final concentrations was 0.23 mmol/l of lipid, 5 nmol/l of [3 H]IMI and 0–400 µmol/l of unlabelled CMI. The binding was started by the addition of [3 H]IMI and samples were incubated at 20 ◦C, pH 7.4 for 30 min. Rapid filtration was used to separate bound and free ligand. The figure shows a typical experiment repeated four times. S.D. of the means ranged between 0.7 and 5.0 %. The IC50 calculated under these conditions was 0.20 µmol/l of CMI for PC liposomes and 2.4 µmol/l of CMI for PS liposomes.
2.4 µmol/l at the concentration range of 0.013–0.23 mmol/l of PS. No significant dependence of IC50 on [3 H]IMI concentration was observed and no marked differences in displacement efficiencies of IMI, CMI, and DMI were observed. Sample displacement curves are shown on Fig. 4 (0.23 mmol/l of PC or PS and 5 nmol/l of [3 H]IMI, with CMI used as a competitor to displace [3 H]IMI binding). Discussion Equilibrium binding of IMI to PC and PS membranes was studied by a radioligand binding assay, using centrifugation to separate bound and free ligand. Binding of IMI was described in terms of surface partition equilibrium and a partition constant (Eqs. (8), (9)), or using the parameters of the Langmuir or Stern adsorption isotherms (Eqs. (6), (7)). Electrostatic effects were taken into account by means of the GC theory (Cevc 1990; Stankowski 1991). In the present analysis, the use of interfacial concentrations rather than bulk concentrations of IMI did not lead to a simple partition model (Eq. (8)) for IMI binding. The last two columns of Tables 1 and 2 demonstrate that the BIMI /C0
94
Fišar et al.
and BIMI /Ceq ratios vary considerably even in the low concentration range. Thus, binding of IMI to PC or PS membranes cannot be described by a simple surface partition equilibrium over the whole concentration range measured. The concentration dependence of the partition coefficients (kp , kp,app ) can not be explained by self-association of IMI in solution, because the critical micellar concentration of IMI is 47 mmol/l (Schreier et al. 2000). The concentration dependence of partitioning at high IMI concentrations (>10 µmol/l) can be attributed to the low lipid-to-IMI molar ratio; however, this does not explain the changes in the partition coefficients at low IMI concentrations. The hydrophobic partition coefficients were found to be significantly higher in PC membranes compared to PS membranes in the whole concentration range (Tables 1 and 2); this finding can be interpreted as better accessibility of the hydrophobic core of PC bilayers to IMI. The apparent partition coefficients determined for PC membranes were in good agreement with the hydrophobic partition coefficients calculated using the GC theory (in particular, at low IMI concentrations). Hence, the effect of bound IMI on the surface charge of PC membranes is negligible at IMI concentrations below 1 µmol/l. To the contrary, the apparent partition coefficients for PS membranes were found to be much greater than the hydrophobic coefficients. These results show that the electrostatic interaction between IMI and PS membrane is prevailing; however, the interaction is not purely electrostatic in nature and van der Waals forces and hydrophobic effects contribute to the total binding. The parameters of the Stern adsorption isotherm, Bmax and K, (Eq. (6)) provide a better description of IMI binding to lipid membranes than a simple partition coefficient. A significantly higher binding capacity and a lower association constant were found for binding to PS vesicles (Bmax = 608 mmol/mol, K = 93 l/mol) compared to binding to PC liposomes (Bmax = 35 mmol/mol, K = 5596 l/mol). Therefore, nature of the phospholipid strongly affects the drug partition. Both a higher Bmax,app and a higher Kapp were found for binding to PS vesicles (384 mmol/mol, 8190 l/mol, respectively) compared to PC membranes (31 mmol/mol, 6077 l/mol, respectively). This demonstrates the role of the surface charge on PS membranes in the binding process and the necessity of application of interfacial (rather than bulk) cationic drug concentration in analyses of binding to negatively charged lipid bilayers. In simple terms, the reciprocal value of Bmax could be interpreted as the number of lipid molecules constituting a “specific” IMI binding site in PC membranes (1/Bmax = 28.6) or PS membranes (1/Bmax = 1.6). In the first model, i.e. in the terms of receptor binding studies, our results can be interpreted by referring to low-affinity binding sites in the lipid bilayer. The second model is based on a nonspecific electrostatic accumulation of IMI near the membrane surface followed by hydrophobic adsorption. Such electrostatic/chemical partition model is physically more realistic (Ziegler et al. 2003). The lipid binding constants are small compared to receptor binding constants, which are of order 108 –1010 l/mol. However, assuming that each receptor molecule
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
95
is surrounded by some 106 lipid molecules, the product of “number of lipids” and “binding capacity” and “binding constant” is close to a receptor binding constant. Under these conditions, a significant proportion of IMI could be bound to lipid bilayer and thus become lost for receptor binding if the receptor binding site was accessible from the aqueous phase (Heirwegh et al. 1992; Seelig et al. 1993). This effect can be compensated by the presence of negatively charged groups in the vicinity of the receptor binding site. If the receptor binding site was localized in the hydrophobic part of the lipid bilayer, the binding parameters would be calculated using the intramembrane drug concentration rather than its concentration in the aqueous phase (Heirwegh et al. 1992). To discover a potential interference between IMI binding to lipid bilayer and to a specific protein binding site in a biological membrane, we assayed the “highaffinity” part of the total IMI binding to PC or PS membranes in more detail. Filtration and nanomolar IMI concentrations (corresponding to free IMI in the plasma at therapeutically active drug concentrations) were used in a set of experiments designed in analogy with the procedures used in receptor binding studies (saturation experiments, time course of association and dissociation, displacement of ligand bound). Accumulation of IMI molecules in the vicinity of negatively charged PS membranes was taken into account using the GC theory. We found that the filtration technique can yield misleading results, because pure PC membranes show a saturable displaceable (specific) high-affinity binding (Bmax = 3.07 µmol/mol and K = 1.02 × 108 l/mol), which is physically unrealistic. The apparent binding constant for membranes containing 100 % PS was much greater (Kapp = 6.09 × 107 l/mol) than the intrinsic (hydrophobic) binding constant (K = 7.93 × 105 l/mol). In the latter case, binding was due to electrostatic attraction of the cationic IMI to the negatively charged surface of a PS membrane. Consequently, interference between binding to a specific protein binding site and binding to a lipid bilayer may occur in receptor binding studies when IMI or a similar amphiphilic ligand is used. The filtration assay is useful in the study of the strong part of total binding of an amphiphilic drug to a lipid bilayer. The difference between the total binding values, established by centrifugation and filtration (Fig. 1), corresponds to the amount of bound ligand that can be removed during sample filtration and washing, i.e., to the amount of very weakly bound molecules. These molecules are probably adsorbed to the surface of MLVs mainly through the van der Waals forces and long-range electrostatic interactions. This weak surface adsorption can be regarded as non-specific, being common to different amphiphilic ligands; hence, it cannot be related to specific therapeutic effects of the drug. As the weakly bound molecules may affect the membrane electrostatic parameters, their contribution to side effects of the studied drug cannot be ruled out. Interactions of CADs with lipid bilayers were intensively studied in recent years; it is therefore difficult to find something new in this field. We attempted to characterize both the total and “high-affinity” binding of IMI, representing antidepressant drugs, to liposomes prepared from electroneutral or negatively charged
96
Fišar et al.
phospholipids. The radioligand binding assay, which is currently seldom used for such experiments, enabled us to obtain some new results and the method described can be used in other experiments with CADs and liposomes. The centrifugation technique for separation of bound and free ligand can be used to determine binding parameters of total binding of IMI to lipid membranes; the filtration technique provides characterization of “high-affinity” binding. Specification of different types of forces participating in the “high-affinity” binding of TCAs to lipid membranes is the subject of our following paper, where pH-dependence of this binding is analyzed. Due to electrostatic attraction, binding of the positively charged IMI to the negatively charged surface of PS membranes was augmented compared to binding to neutral PC membranes. After correction for electrostatic effects by means of the GC theory, the binding isotherms were described by binding parameters. To sum up, there is a marked accumulation of antidepressants in lipid membranes, and binding of IMI consists from at least two components differing by affinity. The capacity of both the total and “high-affinity” binding is significantly higher in PS membranes than in PC membranes. This can be explained by the high-capacity of surface binding of IMI to PS vesicles caused by the Coulomb interactions between charged groups. A significant part of the surface adsorption of IMI to PC liposomes is very weak and can be easily released. It can be assumed that the nature of “high-affinity” binding of IMI to PS vesicles is mainly electrostatic, whereas the “high-affinity” component of the IMI binding to PC liposomes comprises molecules incorporated into the hydrophobic core of the lipid bilayer. Acknowledgements. This work was supported by the GA UK No. 27/2000/C and MSM 111100001 grants.
References Austin R. P., Davis A. M., Manners C. N. (1995): Partitioning of ionizing molecules between aqueous buffers and phospholipid vesicles. J. Pharm. Sci. 84, 1180—1183 Bangham A. D., Standish M. M., Watkins J. C. (1965): Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. J. Mol. Biol. 13, 238—252 Bartlett G. R. (1959): Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem. 234, 466—468 Bauer M., Megret C., Lamure A., Lacabanne C., Fauran-Clavel M.-J. (1990): Differential scanning calorimetry study of the interaction of antidepressant drugs, noradrenaline, and 5-hydroxytryptamine with a membrane model. J. Pharm. Sci. 79, 897—901 Bäuerle H.-D., Seelig J. (1991): Interaction of charged and uncharged calcium channel antagonists with phospholipid membranes. Binding equilibrium, binding enthalpy, and membrane location. Biochemistry 30, 7203—7211 Bennett J. P. Jr., Yamamura H. I. (1985): Neurotransmitter, hormone, or drug receptor binding methods. In: Neurotransmitter Receptor Binding (Eds. H. I. Yamamura, S. J. Enna and M. J. Kuhar), 2nd edition, pp. 61—89, Raven Press, New York Beschiaschvili G., Seelig J. (1990): Peptide binding to lipid bilayers. Binding isotherms and ζ-potential of a cyclic somatostatin analogue. Biochemistry 29, 10995—11000
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
97
Beschiaschvili G., Seelig J. (1992): Peptide binding to lipid bilayers. Nonclassical hydrophobic effect and membrane-induced pK shifts. Biochemistry 31, 10044—10053 Boulanger Y., Schreier S., Leitch L. C., Smith I. C. (1980): Multiple binding sites for local anesthetics in membranes: characterization of the sites and their equilibria by deuterium NMR of specifically deuterated procaine and tetracaine. Can. J. Biochem. 58, 986—995 Browning J. L., Seelig J. (1980): Bilayers of phosphatidylserine: a deuterium and phosphorus nuclear magnetic resonance study. Biochemistry 19, 1262—1270 Cater B. R., Chapman D., Hawes S. M., Saville J. (1974): Lipid phase transitions and drug interactions. Biochim. Biophys. Acta 363, 54—69 Cevc G. (1990): Membrane electrostatics. Biochim. Biophys. Acta 1031, 311—382 Cevc G. (1993): Electrostatic characterization of liposomes. Chem. Phys. Lipids 64, 163— 186 Choi Y. W., Rogers J. A. (1991): Characterization of distribution behavior of 2-imidazolines into multilamellar liposomes. J. Pharm. Sci. 80, 757—760 Eisenberg M., Gresalfi T., Roccio T., McLaughlin S. (1979): Adsorption of monovalent cations to bilayer membranes containing negative phospholipids. Biochemistry 18, 5213—5223 Fišar Z., Krulík R., Beitlová D. (1991): Liposomes – model membranes to study the binding of tricyclic antidepressants. Drug Metabol. Drug Interact. 9, 269—281 Folch J., Lees M., Sloane-Stanley G. H. (1957): A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497—509 Freisleben H.-J., Zimmer G. (1991): Influence of phenothiazines and tricyclic antidepressants on red cell membrane. In: Drug and Anesthetic Effects on Membrane Structure and Function (Eds. R. C. Aloia, C. C. Curtain, L. M. Gordon), pp. 153—182, Wiley-Liss, Inc., New York Hauser H. (1984): Some aspects of the phase behaviour of charged lipids. Biochim. Biophys. Acta 772, 37—50 Heimstad E., Edvardsen Ř., Ferrin T. E., Dahl S. G. (1991): Molecular structure and dynamics of tricyclic antidepressant drugs. Eur. Neuropsychopharmacol. 1, 127— 137 Heirwegh K. P. M., De Smedt H., Vermeir M. (1992): Analysis of membrane-bound acceptors. A correlation function for non-specific accumulation of poorly watersoluble hydrophobic or amphipathic ligands based on the ligand partition concept. Biochem. Pharmacol. 43, 701—704 Herbette L. G., Chester D. W., Rhodes D. G. (1986): Structural analysis of drug molecules in biological membranes. Biophys. J. 49, 91—94 Jørgensen K., Ipsen J. H., Mouritsen O. G., Bennett D., Zuckermann M. J. (1991): The effects of density fluctuations on the partitioning of foreign molecules into lipid bilayers: application to anaesthetics and insecticides. Biochim. Biophys. Acta 1067, 241—253 Kelusky E. C., Boulanger Y., Schreier S., Smith I.C. (1986): A 2 H-NMR study on the interactions of the local anesthetic tetracaine with membranes containing phosphatidylserine. Biochim. Biophys. Acta 856, 85—90 Krulík R., Exner J., Fuksová K., Píchová D., Beitlová D., Sikora J. (1991): Radioimmunoassay of dibenzazepines and dibenzcycloheptanodienes in body fluids and tissues. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 29, 827—832 Koul A., Prasad R. (1996): Extraction of membrane lipids. In: Manual of Membrane Lipids (Ed. R. Prasad), pp. 37—51, Springer, Heidelberg Langner M., Kubica K. (1999): The electrostatics of lipid surfaces. Chem. Phys. Lipids 101, 3—35
98
Fišar et al.
Lee A. G. (1978): Effects of charged drugs on the phase transition temperatures of phospholipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta 514, 95—104 Luxnat M., Galla H.-J. (1986): Partition of chlorpromazine into lipid bilayer membranes: the effect of membrane structure and composition. Biochim. Biophys. Acta 856, 274—282 Mason R. P., Campbell S. F., Wang S.-D., Herbette L. G. (1989): Comparison of location and binding for the positively charged 1,4-dihydropyridine calcium channel antagonist amlodipine with uncharged drugs of this class in cardiac membranes. Mol. Pharmacol. 36, 634—640 Mason R. P., Rhodes D. G., Herbette L. G. (1991): Reevaluating equilibrium and kinetic parameters for lipophilic drugs based on a structural model for drug interaction with biological membranes. J. Med. Chem. 34, 869—877 McLaughlin S., Harary H. (1976): The hydrophobic adsorption of charged molecules to bilayer membranes: a test of the applicability of the Stern equation. Biochemistry 15, 1941—1948 McLaughlin S. (1989): The electrostatic properties of membranes. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18, 113—136 Miyazaki J., Hideg K., Marsh D. (1992): Interfacial ionization and partitioning of membrane-bound local anaesthetics. Biochim. Biophys. Acta 1103, 62—68 Mosior M., McLaughlin S. (1992): Electrostatics and reduction of dimensionality produce apparent cooperativity when basic peptides bind to acidic lipids in membranes. Biochim. Biophys. Acta 1105, 185—187 Müller H.-J., Luxnat M., Galla H.-J. (1986): Lateral diffusion of small solutes and partition of amphipaths in defect structures of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta 856, 283—289 New R. R. C. (1990): Preparation of liposomes. In: Liposomes. A Practical Approach (Ed. R. R. C. New), pp. 33—104, Oxford Univ. Press Razavi D., Mendlewicz J. (1982): Tricyclic antidepressant plasma levels: the state of the art and clinical prospects. Neuropsychobiology (Engl. Transl.) 8, 73—85 Reith M. E. A., Sershen H., Lajtha A. (1984): Binding of imipramine and cocaine to a model lipid membrane: comparison with binding to brain membranes. Neurochem. Res. 9, 965—977 Schreier S., Malheiros S. V. P., de Paula E. (2000): Surface active drugs: self-association and interaction with membranes and surfactants. Physicochemical and biological aspects. Biochim. Biophys. Acta 1508, 210—234 Seelig J., Nebel S., Ganz P., Bruns C. (1993): Electrostatic and nonpolar peptide-membrane interactions. Lipid binding and functional properties of somatostatin analogues of charge z = +1 to z = +3. Biochemistry 32, 9714—9721 Seelig A., Gottschlich R., Devant R. M. (1994): A method to determine the ability of drugs to diffuse through the blood-brain barrier. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 68—72 Seelig A., Alt T., Lotz S., Hölzemann G. (1996): Binding of substance P agonists to lipid membranes and to the neurokinin-1 receptor. Biochemistry 35, 4365—4374 Seelig A., Blatter X. L., Frentzel A., Isenberg G. (2000): Phospholipid binding of synthetic talin peptides provides evidence for an intrinsic membrane anchor of talin. J. Biol. Chem. 275, 17954—17961 Seydel J. K., Velasco M. A., Coats E. A., Cordes H. P., Kunz B., Wiese M. (1992): The importance of drug-membrane interaction in drug research and development. Quant. Struct.–Act. Relat. 11, 205—210 Seydel J. K., Coats E. A., Cordes H. P., Wiese M. (1994): Drug membrane interaction and the importance for drug transport, distribution, accumulation, efficacy and resistance. Arch. Pharm. (Weinheim) 327, 601—610
Binding of Imipramine to Lipid Bilayers
99
Stankowski S (1991): Surface charging by large multivalent molecules. Extending the standard Gouy–Chapman treatment. Biophys. J. 60, 341—351 Thomas P. G., Seelig J. (1993): Binding of the calcium antagonist flunarizine to phosphatidylcholine bilayers: charge effects and thermodynamics. Biochem. J. 291, 397—402 Wagner H., Lissau A., Holzi J., Horammer L. (1962): The incorporation of 32 P into inositolphosphatides of the rat brain. J. Lipid Res. 3, 177—180 Zachowski A., Durand P. (1988): Biphasic nature of the binding of cationic amphipaths with artificial and biological membranes. Biochim. Biophys. Acta 937, 411—416 Ziegler A., Blatter X. L., Seelig A., Seelig J. (2003): Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. Biochemistry 42, 9185—9194 Zimmer G., Schulze P. (1981): Membrane action of tricyclic drugs. Spectroscopic studies of a series of phenothiazines compared with tricyclic antidepressive substances in red cell membrane, using the spin labelling technique. Arzneimittelforschung – Drug. Res. 31, 1389—1392 Final version accepted: October 20, 2003
Příloha 2: FIŠAR, Zdeněk. Interactions between tricyclic antidepressants and phospholipid bilayer membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 161-180.
Gen. Physiol. Biophys. (2005), 24, 161—180
161
Interactions Between Tricyclic Antidepressants and Phospholipid Bilayer Membranes Z. Fišar Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic
Abstract. Participation of electrostatic and other noncovalent interactions in the binding of tricyclic antidepressants (TCAs) to the lipid bilayers was estimated from pH-dependencies of imipramine, desipramine, amitriptyline and nortriptyline binding to the lipid bilayers prepared from different phospholipids, both electroneutral and acidic. The binding was studied using a radioligand binding assay. It was found that the membrane phospholipid composition and methylation of the acyl side chain of TCA has a decisive effect on participation of particular noncovalent interactions in the binding. Apparent high-affinity binding of TCAs to the phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine membranes are achieved mainly by incorporation of uncharged drug molecules into the hydrophobic core of the bilayers. Van der Waals forces and hydrophobic effect are responsible for this binding. Both charged and uncharged drug molecules bind to phosphatidylserine membranes, therefore coulombor ion-induced dipole interactions play a role in these binding. Different spatial distribution of charged residues within the interface causes different electrostatic interactions between charged TCAs and vesicles formed from phosphatidylserine and phosphatidylinositol. The data supports the hypothesis under which TCAs could have effect on affective disorders partially via binding to the lipid part of the membrane and following changes of lipid-protein interactions. Key words: Antidepressants — Liposomes — Noncovalent interactions — pHdependence — Phospholipids Abbreviations: TCA, tricyclic antidepressant; IMI, imipramine; DMI, desipramine; AMI, amitriptyline; NOR, nortriptyline; PC, phosphatidylcholine; SM, sphingomyelin; PE, phosphatidylethanolamine; PS, phosphatidylserine; PI, phosphatidylinositol; PG, phosphatidylglycerol; GC, galactocerebroside; CH, cholesterol; CAD, cationic amphiphilic drug; pK, equilibrium constants for acids and bases; kp , partition coefficient; Kd , equilibrium dissociation constant. Correspondence to: Zdeněk Fišar, Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine, Charles University, Ke Karlovu 11, 120 00 Prague 2, Czech Republic E-mail: zfi[email protected]
162
Fišar
Introduction Adaptive changes in neurotransmitter transduction systems seem to be the key element in therapeutic effects of antidepressants (Stahl 2000). There are hypotheses of affective disorders supposing that both the disorder and therapeutic effects of antidepressants are connected with the alterations in the membrane lipid metabolism and with the changes in the physical state of the lipid bilayers (Mueller et al. 1970; Heron et al. 1980; Sengupta et al. 1981; Block and Edwards 1987; Hibbeln et al. 1989; Maes et al. 1994; Nakamura 1994; Rybakowski and Lehman 1994; Vinokur and Gubachev 1994; Hibbeln and Salem 1995; Penttinen 1995; Kunugi et al. 1997; Peet et al. 1998; Frasure-Smith et al. 2004). So, the study of the role of membrane lipids is necessary when understanding the nature of depression and adaptive mechanisms induced by antidepressants. Membrane lipids and the lipid bilayer itself was recognized as a potent enhancer and a regulator of the membrane receptors, transporters, ion channels and enzymes (Srivastava et al. 1987; Cornelius 2001; Scanlon et al. 2001; Lee 2003). The number of different charged or uncharged lipids containing a broad spectrum of acyl chains and their distribution within the biological membrane suggests that the role of the membrane lipids is far from being known. Generally, lipid bilayers are heterogeneous both in the horizontal and vertical direction and into the bargain there are density fluctuations, regions with non-random lipid composition (domains, rafts) and nonbilayer structures (Jain 1983; Hong et al. 1988; Devaux 1991; Mouritsen and Jørgensen 1995; Mukherjee and Maxfield 2000; Barenholz 2002; Ohvo-Rekilä et al. 2002; Fielding and Fielding 2003). A simplified four region model of the lipid bilayer (Fig. 1) is proposed (Bauer et al. 1990; Tieleman et al. 1997). The model includes the fact that the order of the hydrocarbon chains is relatively high in the region near to the lipid-water interface and decreases strongly towards the bilayer centre, however, the model does not account for charged residue distribution. The headgroups of phospholipids may be divided into two regions: i) a negatively charged phosphate group and ii) a positively, negatively, zwitterionic or uncharged group (Langner and Kubica 1999). Phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) and sphingomyelin (SM) are zwitterions with a negatively charged phosphate group and positively charged choline or ethanolamine group. Phosphatidylglycerol (PG) and phosphatidylinositol (PI) each have a single negative charge associated with the phosphate group; however, the phosphate group is screened stearically by glycerol or an inositol group. Phosphatidic acid contains a single negative charge associated with its phosphate group; a charge, unlike those of PI and PG, is not separated from the aqueous phase by any group. Phosphatidylserine (PS) has three residual charges; two negative charges are associated with phosphate and carboxyl group, one positive charge is located in the ammonium group; carboxyl group charge is easily accessible from the aqueous phase. The role of cholesterol (polar, noncharged molecule) can not be neglected both in direct action on the function of some membrane proteins (Scanlon et al. 2001; Fielding and Fielding 2003; Maekawa et al.
Antidepressant-Membrane Interactions
163
Figure 1. Schematic lipid bilayer division according to the four region model (Tieleman et al. 1997) and examples of the outer leaflet of the plasma membrane components (PC, SM, GC, and CH) and inner leaflet of plasma membrane (PE, PS, PI, and CH). Region 1 (“perturbed water”) consists of a layer in which water structure is affected by the bilayer surface; this region ends where the lipid and the water densities are comparable. Region 2 (“interphase”) includes headgroups and part of the tail methylenes; this region has the highest density in the bilayer. Region 3 (“soft polymer”) consists of partially ordered acyl chains; it starts at the carbonyl groups and it is characterized by a high chain density and low free volume. Region 4 (“decane”) is the centre of the bilayer which is characterized by a low density and high free volume. Regions 1 and 2 form the interfacial region.
164
Fišar
2003; Pfrieger 2003) and in the membrane structure and fluidity (Shinitzky 1984; Yeagle 1985; Silvius 2003). It has been shown in many previous studies that liposomes are a suitable model of the lipid part of the biological membranes for testing the potential biological activity of compounds (Reith et al. 1984; New 1990) and that there is a good agreement between the results obtained in the model systems and those obtained in vivo. Large unilamellar vesicles are the best model of cell membranes; however, it was demonstrated that multilamellar vesicles are also a good model (Choi and Rogers 1991; Fišar et al. 1991, 2004). Multiple noncovalent bonds impart specificity both to the protein-protein or lipid-protein interactions and the drug-membrane interactions, so, it is remarkably difficult to quantify separate contributions of individual noncovalent interactions to the thermodynamics of drug-membrane interactions (Cooper 1999). There is known only a limited menu of noncovalent interactions: 1. electrostatic (ionic, Coulomb) interactions; 2. dispersion and repulsive van der Waals forces; 3. hydrogen bond, and 4. hydrophobic effect (interaction). Hydrophobic and polar interactions are collectively referred to as hydropathy. Van der Waals interactions rapidly decrease with an increasing distance, but Coulomb interactions between dipoles, especially between whole charges, are quite long-ranged. The antidepressants belong to the group of the cationic amphiphilic drugs (CADs). It is not known if accumulation of antidepressants in the lipid part of biological membranes (Sikora et al. 1990; Krulík et al. 1991; Fišar et al. 1996) can be related to their therapeutic or side effects, but the protein-lipid-antidepressant interactions can influence the function of many membrane systems participating in the nerve signal transduction (Bevan et al. 1989; Mason et al. 1991; Seydel et al. 1992; Yang and Glaser 1995; Scanlon et al. 2001). Changes in the composition of the membrane lipids after the long-term administration of the antidepressants (Moor et al. 1988) indicate the role of membrane lipids in the mechanism of their action even if the phospholipids are not the specific target of the drug molecules. Many antidepressants may induce the generalized phospholipidosis, i.e. excessive accumulation of different phospholipids within the cell (Xia et al. 2000). As a consequence of membrane heterogeneity, drugs are distributed non-uniformly in the lipid bilayer (Herbette et al. 1986; Müller et al. 1986) and multiple binding sites of CADs with membranes were described (Boulanger et al. 1980; Kelusky et al. 1986; Zachowski and Durand 1988). The Gouy–Chapman theory has been adopted to describe adsorption (incorporation) of drugs, hormones, peptides and proteins onto the lipid bilayer surface (McLaughlin and Harary 1976; Eisenberg et al. 1979; McLaughlin 1989; Beschiaschvili and Seelig 1990; Cevc 1990, 1993; Stankowski 1991; Seelig et al. 1993; Langner and Kubica 1999; Averbakh and Lobyshev 2000). Thermodynamic analysis of the binding equilibrium for various amphiphilic or hydrophobic ligands led to the conclusion that the main driving force for the binding of these drugs into lipid bilayer is either a change in enthalpy, or enthalpy as well as entropy, it means van der Waals forces and a hydropho-
Antidepressant-Membrane Interactions
165
Figure 2. Chemical structures of tricyclic antidepressants used include IMI, DMI, AMI and NOR.
bic effect (Bäuerle and Seelig 1991; Wimley and White 1993; Seelig et al. 2000). Coulomb interactions are considered to explain surface adsorption of CADs. Many biologically active molecules, including phospholipids and drugs, have multiple acidic or basic groups; it is essential to know the state of dissociation of each of these groups when their mutual interactions are studied. The Henderson– Hasselbach equation describes the relations between pH and equilibrium constants (pK) for acids and bases. The pK value of an ionisable drug in the membrane differs from those in the bulk solution. It was shown that partition coefficients (defined as ratio of molar concentration of drug in membrane to the concentration in aqueous phase) of charged (kp+ ) and uncharged (kp◦ ) forms of the drugs are different, which imply a pK shift of the partitioning compound (Lee 1978; Zachowski and Durand 1988; Cevc 1990; Mason et al. 1991; Miyazaki et al. 1992; Pauletti and Wunderli-Allenspach 1994; Hata et al. 2000; Schreier et al. 2000; Castro et al. 2001; Hunziker et al. 2001; Rodrigues et al. 2001). The pK shift is generally given by a polarity-induced shift (determined by thermodynamic differences in the ionization equilibrium of drugs at the water and membrane location) and electrostatic shift (determined by surface potential of charged membranes). Relation between the difference of pK of the drug in the membrane (pKm ) and in water (pKw ) on the one hand and kp◦ /kp+ on the other can be readily derived at low drug concentrations (Lee 1978; Miyazaki et al. 1992): ∆pK = pKm − pKw = log(kp+ /kp◦ )
(1)
This pK shift can be estimated from a pH dependence of the drug binding to the lipid membranes. Tricyclic antidepressants (TCAs) are the most carefully searched group of antidepressants according to the fact that these drugs are therapeutically used almost 50 years. The primary biochemical effect of TCAs is the inhibition of the serotonin or norepinephrine membrane transporters (Hirschfeld 2000). Chemically they are dibenzazepines and dibenzcycloheptanodienes; e.g. imipramine (IMI), desipramine (DMI), amitriptyline (AMI) and nortriptyline (NOR) are included in the TCAs
166
Fišar
group (Fig. 2). A molecular dynamics simulation of TCAs demonstrated considerable flexibility of the molecules, both in the side chain and in the ring system (Heimstad et al. 1991). It is generally thought that the TCAs are anchored at the lipid membrane via the hydrophobic moiety of the molecules (aromatic rings) and with their polar part (side chain inclusive charged amine group) being preferably localized in the vicinity of the phospholipid polar groups (glycerol backbone/phosphate), however, different interactions with the membrane at low and at higher TCAs concentrations were observed (Bauer et al. 1990; Freisleben and Zimmer 1991). At a physiological pH, about 99 % of TCAs molecules carry a positive charge (pKNH+ = 9.4) and their binding to membranes is strongly dependent on lipid com3 position of the membranes (Fišar et al. 2004). Over a wide range of pH values, both PC and PE molecules are completely electroneutral as the negative charge of the phosphate group (pKPO− ≤ 1) is compensated by the positive charge of the choline 4 head (pKNH+ = 11.25); however, PC and PE become negatively charged at high 3 pH. PS may carry, in addition to a negative charge on the phosphate (pKPO− ≤ 1) 4 and a positive charge of the amino group (pKNH+ = 11.5), a negative charge on 3 the carboxyl group (pKCOO− = 5.5). As a result, PS will carry (under normal conditions) a negative net charge increasing at a higher pH while PS becomes electroneutral at a low pH. PI is negatively charged practically over the whole studied range of pH (pKPO− = 2.7; all pK values are adapted from Cevc (1990)). 4 Binding parameters of TCAs to lipid bilayers have been determined from saturation isotherms in our previous experiments (Fišar et al. 2004); data were analysed without and after correcting for electrostatic effects using the Gouy–Chapman theory. We confirmed that binding of IMI consists from at least two components differing by affinity and the strong part of the total binding (apparent high-affinity binding) can be characterized using filtration to separate bound and free ligand. The low-affinity component of the total binding can be related to the weak surface adsorption of charged TCA molecules. Diversity of low-affinity binding was described and characterized for various CADs (Zachowski and Durand 1988; Bäuerle and Seelig 1991; Austin et al. 1995); however, high-affinity binding was not identified and characterized in these studies. We supposed that both the Coulomb interactions between charged groups and the drug incorporation into hydrophobic core of lipid bilayer are responsible for apparent high-affinity binding. The aim of the presented study is a more precise determination of the participation of different weak forces in the apparent high-affinity binding of TCAs to the lipid bilayers. The pH-dependencies could be analyzed to size up a proportion of Coulomb forces and other noncovalent interactions. To resolve between the effect of the antidepressant and the phospholipid, the measurements were carried out with 4 different TCAs, IMI, DMI, AMI and NOR, and with 4 different phospholipids, PC, PS, PE and PI; mixtures of phospholipids were used also. It is known that the mutual interactions tend to destabilize the lipid bilayer at high amphiphilic ligand concentrations (Zimmer 1984; Zachowski and Durand 1988; Balgavý and Devínsky 1996; Heerklotz and Seelig 2000; Sanganahalli et al. 2000; Schreier et al. 2000); that
Antidepressant-Membrane Interactions
167
is why very low (nanomolar) TCAs concentrations (i.e. a high molar phospholipid to antidepressant ratios) were used in our study. Materials and Methods Chemicals and solutions All samples were prepared in a physiological saline (0.9 g/l NaCl, pH 7.4) and their pH were adjusted using 5 times concentrated buffers. The range of 2 to 12 was covered by three types of buffers obtained by mixing accurate volumes of following solutions: 0.5 mol/l citric acid and 1.0 mol/l disodium phosphate (pH 2, 3, 4); 0.33 mol/l monopotassium phosphate and 0.33 mol/l disodium phosphate (pH 5, 6, 7, 8); 0.5 mol/l glycine, 0.5 mol/l sodium chloride and 0.5 mol/l sodium hydroxide (pH 9, 10, 11, 12). Phospholipids in chloroform/methanol solvent mixture (2 : 1, vol/vol; 5–20 mg/ml) were isolated from total lipid extracts by column chromatography. Crude extract of lipids was prepared by Folch method (Folch et al. 1957; Koul and Prasad 1996). PC, PE and PS were isolated from the white matter of the bovine brain and PI from green peas. The resulting purity, determined by two-dimensional thin-layer chromatography, was over 95 %. Phospholipids were stored in a freezer under nitrogen atmosphere. The following stock solutions of tritium-labelled TCAs ([3 H]TCAs) in methanol were used: 80.37 µmol/l [3 H]IMI (specific activity 2.7 TBq/mmol, concentration 217 MBq/ml), 4.08 µmol/l [3 H]DMI (2.0 TBq/mmol, 8.16 MBq/ml), 3.00 µmol/l [3 H]AMI (4.07 TBq/mmol, 12.2 MBq/ml), 324 µmol/l [3 H]NOR (0.08 TBq/mmol, 25.9 MBq/ml); radiochemical purity >96 %; labelled in our laboratories (Krulík et al. 1991); 12.5 nmol/l of [3 H]TCA solutions in physiological saline were prepared just before measurement and used in binding experiments. Tritium-labelled phospholipids, [3 H]PC and [3 H]PS (concentration 18.5 MBq/ml, radiochemical purity >96 %) were prepared by catalytic tritiation of double bonds in hydrocarbon chains of phospholipids with gaseous tritium. Non-labelled (cold) TCAs were used in the form of hydrochlorides: 2 mmol/l stock solutions of IMI, DMI, AMI and NOR (all from Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) in physiological saline were used as displacement agents. Preparation of liposomes Lipid vesicles were prepared using Bangham method (Bangham et al. 1965; New 1990) shortly before measurement. Briefly, an aliquot part of phospholipid in chloroform/methanol solvent mixture containing less than 20 mg of phospholipid was introduced into a 50-ml vessel and the liquid was completely evaporated from the solution by nitrogen stream at temperature about 40 ◦C. The vessel was then placed in vacuum for at least one hour to remove residual solvent. After releasing the vacuum, 2 ml of buffer was added; the flask was filled with nitrogen, closed and incubated at 50 ◦C for 5 min. The sample was agitated until all the lipid was removed from the walls of the flask and a homogeneous milky-white suspension
168
Fišar
arose. The flask was shortly sonicated (for less then 10 s) in an XL 2020 sonicator (Misonix Inc.) to release all lipids from the walls and to break down large clusters. After incubation of the sample at 50 ◦C for 30 min, the suspension was left at room temperature for further 2 h and diluted by buffer solution to the required phospholipid concentration (0.5 mg/ml). Phospholipid concentrations were checked by a phosphorus concentration determination (Bartlett 1959; Wagner et al. 1962). The same technique was employed to prepare PC, PE, PS, PI and mixed vesicles. However, because of the differences between the electroneutral and acidic phospholipids, liposomes are not the same: unsonicated PC bilayers are characteristic by multilamellar packing; pH-induced destabilization, aggregation and fusion of liposomes composed of PE was described (Ellens et al. 1984; Allen et al. 1990; Hazemoto et al. 1990); the fundamental structure of charged lipids dispersed in water is the unilamellar vesicle (Hauser 1984). In our previous experiments (Fišar et al. 2004) we proved that the lipid bilayers in PC or PS vesicles were sufficiently permeable for TCAs and a 30 min incubation at 20 ◦C was sufficient to restore equilibrium, i.e., a uniform distribution of TCA within liposomes. Radioligand binding assay Radioligand binding assay was employed by analogy with the receptor studies (Bennett and Yamamura 1985; Fišar et al. 2004). The tritium-labelled TCAs were used, [3 H]IMI, [3 H]DMI, [3 H]AMI and [3 H]NOR. Bound and free radioligand was separated by a rapid filtration using a device harvester MB 18 (Brandel, Gaithersburg, MD, USA). The filtration time period (<10 s) was sufficiently short for the measurement of the high-affinity binding processes with equilibrium dissociation constant Kd < 10−8 mol/l. Resulting concentrations were 5 nmol/l [3 H]TCA and 0.2 mg/ml of phospholipids. Brief summary of the method: the pH values of the liposome suspensions were adjusted (pH 2 to 12) using the 5 times concentrated buffers; the binding was started by the addition of 100 µl [3 H]TCA to 150 µl of the liposome suspension; following incubation at 20 ◦C for 30 min, samples were filtered through glass microfibre filters (GF/F type; Whatman International Ltd., Kent, UK) impregnated previously in 0.1 % polyethyleneimine (Sigma) and washed by 9 ml of saline and their activities were assayed in a scintillation cocktail using an LS 6000IC liquid scintillation counter (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA). It was proved that the buffer composition did not affect the binding of TCAs to vesicles. Samples were measured in doublets. Specific binding of TCAs to lipid vesicles was calculated as the difference between total and nonspecific binding with nonspecific binding determined in the presence of excess (50 µmol/l) of cold ligand. Capture efficiency of liposomes on GF/F filters at different pH values was measured by the following technique. Trace amount (2 µl) of [3 H]PC or [3 H]PS was added to the phospholipid in a chloroform/methanol solvent mixture and liposomes were prepared by the standard procedure. The pH values of the liposome suspensions were adjusted, the total activity of 250 µl of the sample was measured and
Antidepressant-Membrane Interactions
169
250 µl of liposomes was filtered and washed. The percentage of vesicles captured on filters was calculated; samples were measured in doublets. pH dependencies of investigated parameters were measured over a wide variety of pH (2 to 12) to evaluate interactions both of charged and uncharged drugs or lipid molecules. Data analysis Data is expressed as the arithmetic mean ± standard deviation (S.D.). Selected pH curves were analyzed using the four-parametric logistic model (ImmunoFit EIA/RIA software, Beckman) to establish the pH values at which binding of TCA to lipid vesicles attains the one half of the maximal value. Statistical analyses were performed with the statistical package Statistica (StatSoft Inc.). Spearman R (nonparametric alternative to the Pearson product-moment correlation coefficient) was used to quantify relation between two quantitative parameters. Results Capture efficiency of filters First, the capture efficiency of GF/F filters was determined using the tritiumlabelled phospholipids as markers. We confirmed that the amount of vesicles captured on the filters did not depend on repeated washing of the filters. Rinsing of filters by volumes 3–15 ml of saline did not change the percentage of trapped vesicles, which was practically the same (about 80 % at pH 7.4) for PC, PS, PE and PI vesicles. The percentage of liposomes captured on the GF/F filter was found practically constant in the range of pH between 2 to 10 but marked a decrease of the capture efficiency was observed at pH above 10 (Fig. 3). pH-dependencies of the binding The radioligand binding assay was used to determine the pH-dependencies of the binding of IMI, DMI, AMI and NOR to liposomes prepared from PC, PE, PS, PI and mixtures (PC+PE) (1 : 1, w/w), (PC+PS) (1 : 1, w/w) and (PC+PI) (1 : 1, w/w). Displaceable high-affinity binding was determined and adjusted according to the percentage of phospholipid trapped on the filter; the corrected values were used in the pH curve. Only data from the range of pH 2 to 10 was interpreted due to low capturing efficiency of GF/F filters at higher pH (data points at pH 11 and 12 are shown in Figs. 4–6, but they are not used for curve fitting). The binding at 5 nmol/l TCA concentration can be used to differentiate binding of charged from uncharged molecules (Fig. 4). The courses of pH-curves for PC or PE or PI vesicles corresponded with change of positive charge on IMI molecules both for binding to electroneutral PC or PE vesicles and for electronegative PI vesicles. However, the pH-dependence of IMI binding to the PC vesicles was shifted to lower pH. The course of the binding to the PS vesicles was more complex and reflected changes of positive charge on IMI and negative charges on PS molecules.
170
Fišar
Figure 3. The percentage of liposomes collected on GF/F filter as a function of pH. Filters were impregnated in 0.1 % polyethyleneimine and a saline was used as a rinsing solution. Tritium-labelled PC and PS were used as markers; final phospholipid concentration was 0.16 mg/ml. Values are reported as mean ± S.D. (n = 3).
The total binding of TCAs to lipid vesicles was dependent both on their lipid composition and on pH, whereas, the nonspecific binding (in presence of 50 µmol/l of cold TCA) was low and practically constant over the whole range of pH (Fig. 4). The high-affinity binding of TCAs to vesicles was displaced at high concentrations of unlabelled ligand; it is shown on Fig. 4 that inhibition of [3 H]IMI binding by cold IMI (0.5 µmol/l) was higher in vesicles prepared from electroneutral phospholipids (PC or PE) in comparison with acidic phospholipids (PS or PI). Similar results were found with liposomes prepared from mixtures of phospholipids, i.e. [3 H]IMI binding was displaced more markedly from (PC+PE) vesicles in comparison with (PC+PS) or (PC+PI) vesicles (data not shown). The pH-dependencies of [3 H]TCA high-affinity binding to lipid vesicles prepared from different phospholipid classes are shown on Figs. 5 and 6. Corrected data were used in graphs, i.e. nonspecific [3 H]TCA binding to GF/F filters was subtracted and data were re-counted to agree with 100 % collection of vesicles on GF/F filters. The pK of TCAs or phospholipids are marked in graphs (vertical dashed lines) and used in Discussion.
Antidepressant-Membrane Interactions
171
Figure 4. pH-dependencies of high-affinity IMI binding to the lipid vesicles prepared from PC (A), PE (B), PS (C) and PI (D) in the presence of 5 nmol/l [3 H]IMI at a phospholipid concentration about 0.2 mg/ml. Corrected data were used in graphs, i.e. nonspecific [3 H]IMI binding to GF/F filters was subtracted and data were re-counted to agree with 100 % collection of vesicles on GF/F filters. Only data from the range of pH 2–10 was used in curve fitting due to low capture efficiency of GF/F filters at higher pH (data points at pH 11–12 are shown, but they were not interpreted). Displacement of [3 H]IMI binding following addition of 0.5 µmol/l or 50 µmol/l of cold IMI is depicted. Vertical doted lines indicate pH 7.4, vertical dashed lines represent pK values of TCAs (pKNH+ = 9.4) or pK values of phospholipids (Cevc 1990), i.e. PC (pKNH+ = 11.25), PE 3
3
(pKNH+ = 11.25), PS (pKNH+ = 11.5, pKCOO− = 5.5) and PI (pKPO− = 2.7). The figure 4 3 3 shows mean data from experiment repeated at least three times.
Similar curves were observed using [3 H]IMI, [3 H]DMI, [3 H]AMI or [3 H]NOR. Relation between bindings of different TCAs to the same phospholipid vesicles was determined as correlation coefficient (Spearman R). A significant positive correlations (at statistical significance p < 0.01) were discovered for PC, PE, PS, PI, (PC+PE), (PC+PS) and (PC+PI) vesicles, except for binding of DMI or NOR to the PC- and PI-derived vesicles.
172
Fišar
Figure 5. pH-dependencies of TCA binding to vesicles prepared from PC (A), PE (B), PS (C) and PI (D). High-affinity binding of tritium labelled IMI (), DMI (), AMI ( ) or NOR (•) was measured; final concentrations were 5 nmol/l of TCA and 0.2 mg/ml of phospholipid. Corrected data were used; the meaning of the vertical dotted and dashed lines is the same as in Fig. 4. Values are means calculated from experiments repeated 3 to 9 times. S.D. are not shown due to graph lucidity.
Discussion Our study was directed to the characterization of the apparent high-affinity binding (characterized by dissociation constant ≤ 10−8 mol/l) of TCAs to the model lipid bilayers prepared from different phospholipids. It was shown, that apparent highaffinity binding of TCAs to bilayer membranes is strongly dependent both on their phospholipid composition and on the pH of the aqueous phase. Short range van der Waals, electrostatic forces and the hydrophobic effect participate in these bindings. To interpret the obtained results in the terms of weak interactions participating in this binding, heterogeneity of lipid bilayer structure and the spatial distribution of charged residues within the interface must be considered. The study of interactions of TCAs with undisturbed lipid bilayers and the differentiation of binding of charged vs. uncharged molecules was found useful only
Antidepressant-Membrane Interactions
173
Figure 6. pH-dependencies of TCA binding to vesicles prepared from mixture (1 : 1, w/w): A. (PC+PE), B. (PC+PS) and C. (PC+PI). High-affinity binding of tritiumlabelled IMI (), DMI (), AMI ( ) or NOR (•) was measured; final concentrations were 5 nmol/l of TCA and 0.2 mg/ml of phospholipid. Corrected data were used; the meaning of the vertical dotted and dashed lines is the same as in Fig. 4. Values are means calculated from experiments repeated 3 to 6 times. S.D. are not shown due to graph lucidity.
at sufficiently low (nanomolar) drug concentrations (Fig. 4). So, the method used in this paper provided the determination of binding at very low antidepressant concentrations, i.e. near to the free TCA concentrations in plasma during the pharmacotherapy (<50 nmol/l). A decrease in the displaceable binding in [3 H]TCA to the lipid bilayers towards very low values corresponded with decrease in pH values from 10 to 2 (Figs. 5, 6). The courses in pH-curves depended strongly on the phospholipid composition of liposomes; however, they were very similar for different TCAs. As PC and PE molecules are practically electroneutral over the whole studied range of pH values, and as the positive charge of TCAs disappears with pH elevation, these pHdependencies (Figs. 5A,B and 6A) can be interpreted as a facilitated incorporation of uncharged TCA molecules into the hydrophobic core of the PC, PE or (PC+PE) bilayers. It can be stated that the [3 H]TCA binding to liposomes prepared from
174
Fišar
electroneutral phospholipids follows the pH-dependent degree of dissociation of the drug. However, the binding to the PC liposomes attained one half of the maximal value at a pH about 7.7 for IMI or AMI and at pH about 8.3 for DMI or NOR (Fig. 5A), i.e. 1.7 and 1.1 pH unit lower in comparison with TCA in aqueous medium (pKw = 9.4), which corresponds to a 50- and 13-fold higher partition coefficient of the uncharged drug compared with that of the charged form (Eq. (1)). So, the k◦p /k+ p of methylated TCAs (IMI, AMI) to PC bilayers is significantly higher than k◦p /k+ p of demethylated drugs (DMI, NOR). It seems that both the charge and methylation of the acyl side chain of TCAs affect the apparent high-affinity binding of TCAs to PC membranes. This result is valid only at nanomolar TCA concentrations. The pH-dependence of TCA binding to the PE vesicles (Figs. 4B, 5B) was markedly different from binding to PC vesicles. It can be explained by differences of PE from PC; the headgroup of PE is smaller than the phosphocholine of PC and PE can readily constitute a nonbilayer structures. Therefore, mixture PC and PE (1 : 1) was used to prepare lipid bilayers. It was demonstrated that pH-dependencies of TCAs binding to (PC+PE) liposomes (Fig. 6A) are very similar to the curves obtained with PC liposomes (Fig. 5A); however, the pK shift is greater. The binding to the (PC+PE) vesicles attained one half of the maximal value at a pH about 6.7 for IMI or AMI and at pH about 7.0 for DMI or NOR, i.e. 2.7 and 2.4 pH unit lower in comparison with TCA in aqueous medium, which corresponds to a 500and 250-fold higher partition coefficient of the uncharged drug compared with that of the charged form. This could be related to the existence of nonbilayer structures in PE membranes. The pH-dependence of TCA binding to the PS vesicles (Figs. 4C, 5C) was markedly different from binding to PC vesicles. It is done by the fact that both the drug and the PS charges vary over the used range of pH values. The course of the binding to the PS vesicles is clearly affected both by protonation and deprotonation of interacting molecules. The initial increase in the binding with the rising of pH from value 2 to 7, correlates with the addition of a negative charge to PS (pKCOO− = 5.5); hence, this increase in binding of TCAs to the PS vesicles is caused predominantly by Coulomb interactions between charged TCA+ and serine group of PS. For pH value between 7 and 10, the binding increases, the implication being binding of an uncharged ligand to a charged PS is also significant. The data suggest approximately equal fractional contributions of the charged and uncharged TCAs to the PS membranes at physiological pH. A certain decrease in the binding for pH > 10 is probably associated with the loss of the positive charge of the drug and, consequently, a decrease in Coulomb interactions. These results confirm the significant role played by Coulomb interactions in apparent high-affinity TCA binding to the PS vesicles at physiological pH. The magnitude of binding to the PS vesicles even at a marked decrease in Coulomb interactions (at pH > 9) could mean that both ion-induced dipole interactions and van der Waals forces and hydrophobic effect play a role. The difference between TCAs binding to PC vs. PS vesicles could reflect a
Antidepressant-Membrane Interactions
175
greater representation of nonbilayer structures in PS membranes. Therefore, binding to liposomes prepared from mixture PC and PS (1 : 1) was also measured. The course of the pH-dependence of the high-affinity binding of TCAs to the mixed (PC+PS) vesicles (Fig. 6B) was found very similar to the course obtained for PS vesicles; so, eventual nonbilayer structures do not play significant role. It seems that the binding to PS overlays the binding to the PC at lower pH and the contribution of the charged TCAs to the binding to (PC+PS) vesicles (i.e. electrostatic interaction) is multiple higher than that of uncharged TCAs at physiological pH. The pH-dependence of TCA binding to the vesicles prepared from PI was executed to discover if binding of TCA to the PS vesicles is caused by a total charge of phospholipid only, or if there exists some specificity of TCAs binding to the PS membranes, i.e. if spatial distribution of charged groups and their masking by noncharged groups play a role in the binding. It was found that the course of TCAs binding to the PI vesicles (Figs. 4D, 5D) is very different from binding to PS vesicles; it seems that binding is realized mainly by incorporation of uncharged drug into PI vesicles. The difference between TCAs binding to PS and PI vesicles may be caused by nonbilayer structures in PI vesicles rather than by different spatial distribution of charged groups; this was confirmed by using mixture PC and PI (1 : 1) to prepare liposomes. The pH-dependencies of TCAs binding to the liposomes prepared from (PC+PI) (Fig. 6C), PS or (PC+PS) (Figs. 5C, 6B) are similar. So, the binding of TCAs to (PC+PI) vesicles is realized both by charged and non-charged form of TCAs. However, binding of positively charged TCA+ at pH < 4 was very low, although PI is negatively charged over the whole studied range of pH (pKPO− = 2.7). Probable cause is that a negatively charged phosphate 4 group of PI is shaded off stearically by an inositol group and Coulomb interaction is too weak to constitute the high-affinity binding. This result implies the existence of partial specificity in TCAs binding to the PS membranes, which is not determined by a total negative charge of PS polar heads. It is obvious that different spatial distribution of charged residues within the interface causes different electrostatic interactions between charged TCAs and surfaces formed from PS and PI. Diverse composition and conformation of uncharged groups may also contribute to the specificity of TCAs binding to the PS vesicles. It was shown in this study that both PS and PI play an important role in the binding of TCAs to the lipid bilayers at physiological pH and there is some specificity of TCAs-serine group interaction. Because TCAs easily permeate through the membrane, they can interact also with the PS or PI on the inner membrane surface. PS is known as an acidic phospholipid affecting the activity of many membrane enzymes (including Na+ K+ -ATPase; phospholipases; protein kinase C etc.) taking part in a signal transduction. It follows that phospholipid mediated action of TCAs on nerve signal transduction need not be quite nonspecific as was supposed and that the role of the lipid phase in the cell membrane is different, but no less important than the role of membrane proteins. It can be concluded that the proportion of Coulomb interactions, van der Waals forces, ion-induced dipole interactions and the hydrophobic effect in apparent high-
176
Fišar
affinity binding of TCAs to the model lipid membranes is strongly dependent on the phospholipid composition of lipid membranes; so, a various charged residue arrangement within phospholipid headgroups is the determining factor. Acidic phospholipids participate markedly in the binding at physiological pH. There is dependence of TCAs binding to lipid bilayers on the type of TCA also; the pK shifts clearly reflect effect of methylation/demethylation of the acyl side chain of TCAs. It can be supposed that the findings presented in this paper could be common to most of the CADs. Acknowledgements. This work was supported by GA UK 27/2000/C and MSM 111100001 grants. The author wishes to thank K. Fuksová for preparing tritium-labelled substances and Z. Hanuš for his technical assistance.
References Allen T. M., Hong K., Papahadjopoulos D. (1990): Membrane contact, fusion, and hexagonal (HII) transitions in phosphatidylethanolamine liposomes. Biochemistry 29, 2976—2985 Austin R. P., Davis A. M., Manners C. N. (1995): Partitioning of ionizing molecules between aqueous buffers and phospholipid vesicles. J. Pharm. Sci. 84, 1180—1183 Averbakh A., Lobyshev V. I. (2000): Adsorption of polyvalent cations to bilayer membranes from negatively charged lipid: estimating the lipid accessibility in the case of complete binding. J. Biochem. Biophys. Methods 45, 23—44 Balgavý P., Devínsky F. (1996): Cut-off effect in biological activities of surfactants. Adv. Colloid Interface Sci. 66, 23—63 Bangham A. D., Standish M. M., Watkins J. C. (1965): Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. J. Mol. Biol. 13, 238—252 Barenholz Y. (2002): Cholesterol and other membrane active sterols: from membrane evolution to “rafts”. Prog. Lipid Res. 41, 1—5 Bartlett G. R. (1959): Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem. 234, 466—468 Bauer M., Megret C., Lamure A., Lacabanne C., Fauran-Clavel M.-J. (1990): Differential scanning calorimetry study of the interaction of antidepressant drugs, noradrenaline, and 5-hydroxytryptamine with a membrane model. J. Pharm. Sci. 79, 897—901 Bäuerle H. D., Seelig J. (1991): Interaction of charged and uncharged calcium channel antagonists with phospholipid membranes. Binding equilibrium, binding enthalpy, and membrane location. Biochemistry 30, 7203—7211 Bennett J. P. Jr., Yamamura H. I. (1985): Neurotransmitter, hormone, or drug receptor binding methods. In: Neurotransmitter Receptor Binding (Eds. H. I. Yamamura, S. J. Enna and M. J. Kuhar), pp. 61—89 (2nd ed.), Raven Press, New York Beschiaschvili G., Seelig J. (1990): Peptide binding to lipid bilayers. Binding isotherms and ζ-potential of a cyclic somatostatin analogue. Biochemistry 29, 10995—11000 Bevan J. A., Bevan R. D., Shreeve S. M. (1989): Variable receptor affinity hypothesis. FASEB J. 3, 1696—1704 Block E., Edwards D. (1987): Effects of plasma membrane fluidity on serotonin transport by endothelial cells. Am. J. Physiol. 253, C672—678 Boulanger Y., Schreier S., Leitch L. C., Smith I. C. (1980): Multiple binding sites for local anesthetics in membranes: characterization of the sites and their equilibria
Antidepressant-Membrane Interactions
177
by deuterium NMR of specifically deuterated procaine and tetracaine. Can. J. Biochem. 58, 986—995 Castro B., Gameiro P., Lima J. L., Matos C., Reis S. (2001): A fast and reliable spectroscopic method for the determination of membrane-water partition coefficients of organic compounds. Lipids 36, 89—96 Cevc G. (1990): Membrane electrostatics. Biochim. Biophys. Acta 1031, 311—382 Cevc G. (1993): Electrostatic characterization of liposomes. Chem. Phys. Lipids 64, 163— 186 Choi Y. W., Rogers J. A. (1991): Characterization of distribution behavior of 2-imidazolines into multilamellar liposomes. J. Pharm. Sci. 80, 757—760 Cooper A. (1999): Thermodynamic analysis of biomolecular interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 557—563 Cornelius F. (2001): Modulation of Na,K-ATPase and Na-ATPase activity by phospholipids and cholesterol. I. Steady-state kinetics. Biochemistry 40, 8842—8851 Devaux P. F. (1991): Static and dynamic lipid asymmetry in cell membranes. Biochemistry 30, 1163—1173 Eisenberg M., Gresalfi T., Roccio T., McLaughlin S. (1979): Adsorption of monovalent cations to bilayer membranes containing negative phospholipids. Biochemistry 18, 5213—5223 Ellens H., Bentz J., Szoka F. C. (1984): pH-induced destabilization of phosphatidylethanolamine-containing liposomes: role of bilayer contact. Biochemistry 23, 1532—1538 Fielding C. J., Fielding P. E. (2003): Relationship between cholesterol trafficking and signaling in rafts and caveolae. Biochim. Biophys. Acta 1610, 219—228 Fišar Z., Krulík R., Beitlová D. (1991): Liposomes – model membranes to study the binding of tricyclic antidepressants. Drug Metabol. Drug Interact. 9, 269—281 Fišar Z., Krulík R., Fuksová K., Sikora J. (1996): Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol. Biophys. 15, 51—64 Fišar Z., Fuksová K., Velenovská M. (2004): Binding of imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol. Biophys. 23, 77—99 Folch J., Lees M., Sloane Stanley G. H. (1957): A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497—509 Frasure-Smith N., Lesperance F., Julien P. (2004): Major depression is associated with lower omega-3 fatty acid levels in patients with recent acute coronary syndromes. Biol. Psychiatry 55, 891—896 Freisleben H.-J., Zimmer G. (1991): Influence of phenothiazines and tricyclic antidepressants on red cell membrane. In: Drug and Anesthetic Effects on Membrane Structure and Function (Eds. R. C. Aloia, C. C. Curtain and L. M. Gordon), pp. 153— 182, Wiley–Liss, Inc., New York Hata T., Sakamoto T., Matsuki H., Kaneshina S. (2000): Partition coefficients of charged and uncharged local anesthetics into dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membrane: estimation from pH dependence on the depression of phase transition temperatures. Colloids Surf., B: Biointerfaces 22, 77—84 Hauser H. (1984): Some aspects of the phase behaviour of charged lipids. Biochim. Biophys. Acta 772, 37—50 Hazemoto N., Harada M., Komatsubara N., Haga M., Kato Y. (1990): pH-sensitive liposomes composed of phosphatidylethanolamine and fatty acid. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 38, 748—751 Heerklotz H., Seelig J. (2000): Titration calorimetry of surfactant-membrane partitioning and membrane solubilization. Biochim. Biophys. Acta 1508, 69—85
178
Fišar
Heimstad E., Edvardsen Ø., Ferrin T. E., Dahl S. G. (1991): Molecular structure and dynamics of tricyclic antidepressant drugs. Eur. Neuropsychopharmacol. 1, 127— 137 Herbette L. G., Chester D. W., Rhodes D. G. (1986): Structural analysis of drug molecules in biological membranes. Biophys. J. 49, 91—94 Heron D., Shinitzky M., Hershkowitz M., Samuel D. (1980): Lipid fluidity markedly modulates the binding of serotonin to mouse brain membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7463—7467 Hibbeln J. R., Palmer J. W., Davis J. M. (1989): Are disturbances in lipid-protein interactions by phospholipase-A2 a predisposing factor in affective illness? Biol. Psychiatry 25, 945—961 Hibbeln J. R., Salem N. Jr. (1995): Dietary polyunsaturated fatty acids and depression: when cholesterol does not satisfy. Am. J. Clin. Nutr. 62, 1—9 Hirschfeld R. M. (2000): Antidepressants in long-term therapy: a review of tricyclic antidepressants and selective serotonin reuptake inhibitors. Acta Psychiatr. Scand. Suppl. 403, 35—38 Hong K., Baldwin P. A., Allen T. M., Papahadjopoulos D. (1988): Fluorometric detection of the bilayer-to-hexagonal phase transition in liposomes. Biochemistry 27, 3947— 3955 Hunziker R. W., Escher B. I., Schwarzenbach R. P. (2001): pH dependence of the partitioning of triphenyltin and tributyltin between phosphatidylcholine liposomes and water. Environ. Sci. Technol. 35, 3899—3904 Jain M. K. (1983): Nonrandom lateral organization in bilayers and biomembranes. In: Membrane Fluidity in Biology (Ed. R. C. Aloia), Vol. 1, pp. 1—37, Academic Press, New York Kelusky E. C., Boulanger Y., Schreier S., Smith I. C. (1986): A 2 H-NMR study on the interactions of the local anesthetic tetracaine with membranes containing phosphatidylserine. Biochim. Biophys. Acta 856, 85—90 Koul A., Prasad R. (1996): Extraction of membrane lipids. In: Manual of Membrane Lipids (Ed. R. Prasad), pp. 37—51, Springer, Heidelberg Krulík R., Exner J., Fuksová K., Píchová D., Beitlová D., Sikora J. (1991): Radioimmunoassay of dibenzazepines and dibenzcycloheptanodienes in body fluids and tissues. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 29, 827—832 Kunugi H., Takei N., Aoki H., Nauko S. (1997): Low serum cholesterol in suicide attempters. Biol. Psychiatry 41, 196—200 Langner M., Kubica K. (1999): The electrostatics of lipid surfaces. Chem. Phys. Lipids 101, 3—35 Lee A. G. (1978): Effects of charged drugs on the phase transition temperatures of phospholipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta 514, 95—104 Lee A. G. (2003): Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta 1612, 1—40 Maekawa S., Iino S., Miyata S. (2003): Molecular characterization of the detergentinsoluble cholesterol-rich membrane microdomain (raft) of the central nervous system. Biochim. Biophys. Acta 1610, 261—270 Maes M., Delanghe J., Meltzer H. Y., Scharpé S., D’Hondt P., Cosyns P. (1994): Lower degree of esterification of serum cholesterol in depression: relevance for depression and suicide research. Acta Psychiatr. Scand. 90, 252—258 Mason R. P., Rhodes D. G., Herbette L. G. (1991): Reevaluating equilibrium and kinetic parameters for lipophilic drugs based on a structural model for drug interaction with biological membranes. J. Med. Chem. 34, 869—877
Antidepressant-Membrane Interactions
179
McLaughlin S., Harary H. (1976): The hydrophobic adsorption of charged molecules to bilayer membranes: a test of the applicability of the Stern equation. Biochemistry 15, 1941—1948 McLaughlin S. (1989): The electrostatic properties of membranes. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18, 113—136 Miyazaki J., Hideg K., Marsh D. (1992): Interfacial ionization and partitioning of membrane-bound local anaesthetics. Biochim. Biophys. Acta 1103, 62—68 Moor M., Honegger U. E., Wiesmann U. N. (1988): Organspecific, qualitative changes in the phospholipid composition of rats after chronic administration of the antidepressant drug desipramine. Biochem. Pharmacol. 37, 2035—2039 Mouritsen O. G., Jørgensen K. (1995): Micro-, nano- and meso-scale heterogeneity of lipid bilayers and its influence on macroscopic membrane properties. Mol. Membr. Biol. 12, 15—20 Mueller P. S., Davis J. M., Bunney W. E. Jr., Weil-Malherbe H., Cardon P. V. Jr. (1970): Plasma free fatty acids concentration in depressive illness. Arch. Gen. Psychiatry 22, 216—221 Mukherjee S., Maxfield F. R. (2000): Role of membrane organization and membrane domains in endocytic lipid trafficking. Traffic 1, 203—211 Müller H.-J., Luxnat M., Galla H.-J. (1986): Lateral diffusion of small solutes and partition of amphipaths in defect structures of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta 856, 283—289 Nakamura S. (1994): Effects of phospholipase A2 inhibitors on the antidepressant-induced axonal regeneration of noradrenergic locus coeruleus neurons. Microsc. Res. Tech. 29, 204—210 New R. R. C. (1990): Preparation of liposomes. In: Liposomes. A Practical Approach. pp. 33—104, Oxford University Press Ohvo-Rekilä H., Ramstedt B., Leppimäki P., Slotte J. P. (2002): Cholesterol interactions with phospholipids in membranes. Prog. Lipid Res. 41, 66—97 Pauletti G. M., Wunderli-Allenspach H. (1994): Partition coefficients in vitro: artificial membranes as a standardized distribution model. Eur. J. Pharm. Sci. 1, 273—282 Peet M., Murphy B., Shay J., Horrobin D. (1998): Depletion of omega-3 fatty acid levels in red blood cell membranes of depressive patients. Biol. Psychiatry 43, 315—319 Penttinen J. (1995): Hypothesis: low serum cholesterol, suicide, and interleukin-2. Am. J. Epidemiol. 141, 716—718 Pfrieger F. W. (2003): Role of cholesterol in synapse formation and function. Biochim. Biophys. Acta 1610, 271—280 Reith M. E. A., Sershen H., Lajtha A. (1984): Binding of imipramine and cocaine to a model lipid membrane: comparison with binding to brain membranes. Neurochem. Res. 9, 965—977 Rodrigues C., Gameiro P., Reis S., Lima J. L. F., Castro B. (2001): Derivative spectrophotometry as a tool for the determination of drug partition coefficients in water/dimyristoyl-L-α-phosphatidylglycerol (DMPG) liposomes. Biophys. Chem. 94, 97—106 Rybakowski J. K., Lehmann W. (1994): Decreased activity of erythrocyte membrane ATPases in depression and schizophrenia. Neuropsychobiology 30, 11—14 Sanganahalli B. G., Joshi P. G., Joshi N. B. (2000): Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane dynamics-a fluorescence spectroscopic study. Life Sci. 68, 81—90 Scanlon S. M., Williams D. C., Schloss P. (2001): Membrane cholesterol modulates serotonin transporter activity. Biochemistry 40, 10507—10513
180
Fišar
Schreier S., Malheiros S. V. P., de Paula E. (2000): Surface active drugs: self-association and interaction with membranes and surfactants. Physicochemical and biological aspects. Biochim. Biophys. Acta 1508, 210—234 Seelig J., Nebel S., Ganz P., Bruns C. (1993): Electrostatic and nonpolar peptide-membrane interactions. Lipid binding and functional properties of somatostatin analogues of charge z = +1 to z = +3. Biochemistry 32, 9714—9721 Seelig A., Blatter X. L., Frentzel A., Isenberg G. (2000): Phospholipid binding of synthetic talin peptides provides evidence for an intrinsic membrane anchor of talin. J. Biol. Chem. 275, 17954—17961 Sengupta N., Datta S. C., Sengupta D. (1981): Platelet and erythrocyte membrane lipid and phospholipid patterns in different types of mental patients. Biochem. Med. 25, 267—275 Seydel J. K., Velasco M. A., Coats E. A., Cordes H. P., Kunz B., Wiese M. (1992): The importance of drug-membrane interaction in drug research and development. Quant. Struct.-Act. Relat. 11, 205—210 Shinitzky M. (1984): Membrane fluidity and receptor function. In: Membrane Fluidity (Eds. M. Kates and L. A. Manson), pp. 585—601, Plenum Publ. Corp. Sikora J., Krulík R., Beitlová D., Příhoda P. (1990): Plasma levels of antidepressants after their withdrawal. Endocrinol. Exp. 24, 221—227 Silvius J. R. (2003): Role of cholesterol in lipid raft formation: lessons from lipid model systems. Biochim. Biophys. Acta 1610, 174—183 Srivastava L. K., Kazmi S. M., Blume A. J., Mishra R. K. (1987): Reconstitution of affinity-purified dopamine D2 receptor binding activities by specific lipids. Biochim. Biophys. Acta 900, 175—182 Stahl S. M. (2000): Essential Psychopharmacology. Neuroscientific Basis and Practical Applications (2nd ed.), Cambridge University Press Stankowski S. (1991): Surface charging by large multivalent molecules. Extending the standard Gouy-Chapman treatment. Biophys. J. 60, 341—351 Tieleman D. P., Marrink S. J., Berendsen H. J. C. (1997): A computer perspective of membranes: molecular dynamics studies of lipid bilayer systems. Biochim. Biophys. Acta 1331, 235—270 Vinokur V. A., Gubachev Iu. M. (1994): The effect of antidepressants on lipid metabolism and the clinical course in IHD. Ter. Arkh. 66, 76—80 (in Russian) Wagner H., Lissau A., Holzi J., Horammer L. (1962): The incorporation of 32 P into inositolphosphatides of the rat brain. J. Lipid Res. 3, 177—180 Wimley W. C., White S. H. (1993): Membrane partitioning: distinguishing bilayer effects from the hydrophobic effect. Biochemistry 32, 6307—6312 Xia Z., Ying G., Hansson A. L., Karlsson H., Xie Y., Bergstrand A., DePierre J. W., Nässberger L. (2000): Antidepressant-induced lipidosis with special reference to tricyclic compounds. Prog. Neurobiol. 60, 501—512 Yang L., Glaser M. (1995): Membrane domains containing phosphatidylserine and substrate can be important for the activation of protein kinase C. Biochemistry 34, 1500—1506 Yeagle P. L. (1985): Cholesterol and the cell membrane. Biochim. Biophys. Acta 822, 267—287 Zachowski A., Durand P. (1988): Biphasic nature of the binding of cationic amphipaths with artificial and biological membranes. Biochim. Biophys. Acta 937, 411—416 Zimmer G. (1984): Fluidity of cell membranes in the presence of some drugs and inhibitors. In: Membrane Fluidity (Eds. M. Kates and L. A. Manson), pp. 169—203, Plenum Publ. Corp. Final version accepted: February 17, 2005
Příloha 3: FIŠAR, Zdeněk; KRULÍK, Radoslav; FUKSOVÁ, Květoslava and SIKORA, Jan. Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol. Biophys. 1996, vol. 15, p. 51-64.
Příloha 4: FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin and KALIŠOVÁ, Lucie. Effect of pharmacologically selective antidepressants on serotonin uptake in rat platelets. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 1, p. 113-128.
Gen. Physiol. Biophys. (2005), 24, 113—128
113
Effect of Pharmacologically Selective Antidepressants on Serotonin Uptake in Rat Platelets Z. Fišar, M. Anders and L. Kališová Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic
Abstract. We tested a hypothesis that a long-term administration of antidepressants acting through different primary biochemical mechanisms is associated with changes in the platelet serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) transport. Laboratory rats were administered norepinephrine reuptake inhibitors (desipramine, maprotiline), selective 5-HT reuptake inhibitor (citalopram), reversible monoamine oxidase inhibitor (moclobemide), and lithium (inositol monophosphatase inhibitor among others) during a 4-week period. Apparent kinetic parameters of platelet 5-HT transport were analyzed. Significant decrease in apparent Michaelis constant (KM ) was found after the administration of all tested antidepressants except for desipramine. There was certain increase in maximal velocity (Vmax ) values following the administration of desipramine, maprotiline, and citalopram; however, the all Vmax changes were not significant. Vmax /KM ratio representing limiting permeability at low extracellular concentrations of 5-HT was systematically increased in all the tested drugs, but significant changes were occurred only in maprotiline- and citalopram-treated rats. Adaptive changes in platelet 5-HT transport induced by citalopram were opposite to the acute inhibitory effect of this drug on 5-HT transporter activity. An increase in limiting membrane permeability for 5-HT could be included in the common adaptive effect of the long-term administration of antidepressants that differ in pharmacologic selectivity. Key words: Antidepressant — Serotonin uptake — Platelets Introduction The mechanisms of antidepressants action that are linked to their therapeutic effects are not sufficiently explained. Though the primary biochemical effects of these drugs are described very precisely, their therapeutic effects are associated with adaptive cellular changes following their long-term (several weeks) administration. Therefore it is difficult to decide, which cellular changes are actually responsible for Correspondence to: Zdeněk Fišar, Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine, Charles University, Ke Karlovu 11, 120 00 Prague 2, Czech Republic E-mail: zfi[email protected]
114
Fišar et al.
therapeutic effects. Important group of antidepressants comprises of drugs primarily inhibiting reuptake of neurotransmitters from the synaptic cleft, particularly serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) and/or norepinephrine (NE) reuptake inhibitors (Owens 2004). However, also drugs with different primary mechanisms of action (monoamine oxidase inhibitors, 5-HT1A receptors agonists, 5-HT2 receptor or α2 -adrenoceptor antagonists, selective blockers of presynaptic dopamine receptors, etc.) are effective in the treatment of affective disorders (Stahl 2000). Moreover, mood disorders are classically treated with lithium, an ion whose mechanism of action is not fully understood. Lithium directly inhibits inositol phosphate metabolism by inhibition of inositol monophosphatase and inhibits glycogen synthase kinase-3 (Harwood and Agam 2003); a number of other signal transduction pathways are indirectly affected by lithium (Stahl 2000). There is general agreement that the clinical effect of antidepressants is caused by their ability to induce adaptive changes of the monoaminergic neurotransmitter systems (Manji 1992; Lachman and Papolos 1995; Duman et al. 1997; Duman 2002). Additional research is necessary to determine final common pathway for different antidepressants in specific brain regions. There is evidence that pharmacologically selective antidepressants affect transmission mediated both by the targeted neurotransmitter and by the other neurotransmitters (Lucki and O’Leary 2004). Some early hypotheses of depression proposed that there are interactions between the serotonergic and noradrenergic systems (Caldecott-Hazard et al. 1991), or serotonergic and dopaminergic systems (Bonhomme and Esposito 1998). However, interconnectivity between 5-HT system and other neurotransmitter systems is not known sufficiently. Based on findings of the presence of identical high affinity serotonin transporter (SERT) in the plasma membranes of neurons and platelets (Lesch et al. 1993) and on the similarities of platelets with 5-HT nerve terminals, particularly for the mechanism for 5-HT uptake, storage and release as well as 5-HT2A receptor binding characteristics (Tuomisto et al. 1979; Stahl 1985; Murphy 1990; Maes and Meltzer 1995), it is believed that platelet 5-HT uptake can be used to assess brain serotonergic function. The SERT plays a pivotal role in maintaining of serotonergic function by regulation of the 5-HT level in the synaptic cleft (Haase et al. 2001). This plasma membrane transport carrier is given a lot of attention in 5-HT hypotheses of affective disorders, because the primary biochemical effect of some antidepressant drugs including today’s most commonly used antidepressants, selective 5-HT reuptake inhibitors (SSRI), is SERT inhibition. The parameters of kinetics of 5-HT platelet uptake are considered as relevant in reflecting changes in the function of brain 5-HT system (Slotkin et al. 1986; Lesch et al. 1993; Bianchi et al. 2002). There is considerable evidence that depression and suicide may be associated with alterations in platelet 5-HT parameters (Langer and Schoemaker 1988; Mellerup and Langer 1990; Pandey et al. 1995; Franke et al. 2000), thus making platelets a non-invasive model for study of the mechanism of action of antidepressants. In recent years, peripheral parameters of serotonergic transmission, such as plasma and platelet 5-HT levels (Ortiz et al. 1988), have been used to examine the
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
115
mechanism of action of SSRIs and to predict the clinical response in depression (Bakish et al. 1997; Bourdeaux et al. 1998; Alvarez et al. 1999a; Blardi et al. 2002; Castrogiovanni et al. 2003; Maurer-Spurej et al. 2004). In platelets, 5-HT is stored in dense-core granules (reserve pool) and shows a slow turnover. In contrast, extracellular plasma 5-HT reveals a rapid turnover and is pharmacologically active (Ortiz et al. 1988). Cationic amphiphilic drugs might accumulate in platelets, inhibit their functions and liberate in part 5-HT (Turčáni et al. 1982; Jančinová et al. 1996; Nosáľ and Jančinová 2002). It was demonstrated that therapeutic concentrations of the SSRI as well as the selective NE reuptake inhibitors decrease platelet and whole blood 5-HT concentrations (Alvarez et al. 1999b; Javors et al. 2000; Ashina et al. 2004). In contrast, 5-HT platelet content was significantly increased following moclobemide treatment (Lestra et al. 1998). There have been several review articles indicating that therapeutic effects of lithium can be related to its enhancements of serotonergic brain function (Meltzer and Lowy 1987; Shiah and Yatham 2000; Pandey et al. 2003). However, there is conflicting evidence with regard to the effect of lithium therapy on platelet 5-HT uptake. Lithium-induced changes at the level of 5-HT uptake in platelets were not correlated with concomitant variations in platelet 5-HT content (Glue et al. 1986; Poirier et al. 1988; Artigas et al. 1989). The binding parameters need not sufficiently reflect changes in function of SERT because binding sites may be masked or reversible sequestered. Functional parameters of SERT must be measured. 5-HT uptake is a saturable carrier-mediated endergonic transport process (active transport) obeyed simple Michaelis– Menten kinetics with a maximal (limiting) velocity (Vmax ) and apparent Michaelis constant (KM ) (defined as extracellular 5-HT concentration required for transport velocity equal to Vmax /2). The KM can be related to the reciprocal value of affinity constant of binding site to the 5-HT. The uptake activity of SERT has been suggested to be controlled through endogenous pathways, e.g. by phosphorylation/dephosphorylation and/or by trafficking to specific plasma membrane subdomains (Blakely et al. 1998; Ramamoorthy and Blakely 1999; Haase et al. 2001). Effect of 5-HT reuptake inhibitors on SERT activity have been intensively studied; however, there is little known about the effect of long-term administration of pharmacologically different antidepressants on adaptive changes in transmembrane 5-HT transport. It is hypothesised that the SERT activity is poised on by cellular mechanisms which are disturbed during depression and returned to the normal function following long-term antidepressant treatment. This mechanism may include the changes both in the expression of SERT and in the state of actin cytoskeleton (Sakai et al. 2000), cholesterol (Scanlon et al. 2001) and structure and composition of lipid bilayers (Block and Edwards 1987; Sheridan and Block 1988). For all of the above reasons, it is important to determine if antidepressants that differ in pharmacologic selectivity produce a common in vivo effect on SERT activity. The aim of the study was to determine how the long-term administration of various antidepressants could affect active transmembrane transport of 5-HT in
116
Fišar et al.
platelets. To eliminate effects of depression on SERT activity and to avoid treatment of healthy human volunteer’s with antidepressants, we studied the effect of long-term administration of selected antidepressants on the parameters of platelet 5-HT uptake in the blood of laboratory rats. The results were compared with acute in vitro action of antidepressants on the platelet 5-HT uptake in untreated rats. Potent nonselective NE reuptake inhibitor (desipramine), selective NE reuptake inhibitor (maprotiline), SSRI (citalopram), reversible monoamine oxidase inhibitor (moclobemide), and lithium were used in our study. Materials and Methods Chemicals and solutions Water solutions of drugs were administered to rats: 2 mg/ml desipramine (SigmaAldrich Co., St. Louis, MO, USA), 2 mg/ml maprotiline (Ciba Geigy Ltd., CH-4002 Basle, Switzerland), 1 mg/ml citalopram (H. Lundbeck A/S, DK-2500 CopenhagenValby, Denmark), 5 mg/ml moclobemide (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basle, Switzerland) and 10 mg/ml lithium carbonate (Sigma). Anticoagulant-citrate-dextrose (ACD) solution (0.8 % citric acid, 2.2 % trisodium citrate, 2.4 % glucose, pH 4.3) was used as anticoagulant. Platelets were incubated in modified Krebs–Ringer (KR) bicarbonate physiologic solution without Ca2+ (118 mmol/l NaCl, 4.7 mmol/l KCl, 1.2 mmol/l KH2 PO4 , 1.2 mmol/l MgSO4 .7H2 O, 25 mmol/l NaHCO3 , 11.1 mmol/l glucose; percolating with 95 % O2 and 5 % CO2 gas mixture was used during the preparation to saturate solution with oxygen, pH 7.4). 8 µmol/l tritium-labelled 5-HT ([3 H]5-HT) solution with specific activity of approximately 25 kBq/ml was prepared by mixing KR buffer with 1 mmol/l unlabelled (cold) 5-HT (5-hydroxytryptamine creatinine sulphate, Sigma) and [3 H]5-HT stock solution (specific activity of 500 to 1000 GBq/mmol, radioactive concentration 37 MBq/ml, radiochemical purity by high performance liquid chromatography >97 %, Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., England). In vitro effect of antidepressants on platelet 5-HT transport was measured using 20 µmol/l stock solutions of desipramine, maprotiline, citalopram or moclobemide, and 4 mmol/l stock solution of LiCO3 (all in KR solution). Laboratory rats and blood collection Specific pathogen-free Wistar strain of laboratory rats was used, total count of 49 males (19 in control group plus 5 groups by 6 animals) fed with standard diet under defined conditions. Keeping and treatment of laboratory animals conformed to the Declaration of Helsinki and was approved by the animal care committee of our Institution. Drugs were administered by gastric tube once a day for a total of 28 days. Administered doses were set according to human daily doses, but recalculated, supposing about 60 times lower body surface area of a rat. The weight of the rats was regularly monitored; initial weight was 180±20 g, final 329±27 g. The dosages were adjusted continuously according to the actual weight of a rat so that the dose per
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
117
kilogram per day remained constant. Table 1 shows the dosages of administered drugs. Control group of rats was administered by water. The last dose was administered one day before the rats were killed, which was done by exsanguinations from aorta under thiopental anaesthesia using plastic syringe. Blood samples (6 ml) were anticoagulated with ACD solution (1.5 ml), stirred and centrifuged in plastic test tubes at 200 × g, 20 ◦C for 15 min. 2 ml of platelet rich plasma (PRP) was transferred into a plastic container, platelets were counted under light microscope and the PRP concentration was adjusted to 200 × 109 platelets/l with KR solution. The 5-HT transport was assayed in intact platelets using modified Tuomisto et al. (1979) and Meltzer et al. (1981) methods as described below. Analyses for the 5-HT uptake were performed within 3 h after blood collection. Our blood sample withdrawal technique might be controversial; both thiopental anaesthesia and taking blood from aorta with a syringe may pre-activate platelets. Very light anaesthesia (during normal oxygen saturation) and taking blood via plastic catheter (Van Den Berg et al. 1987; Kitamura et al. 2001; Dordoni et al. 2004) is recommended for these experiments. Although we did not proof whether the sampling procedure activates platelets, we suppose that our technique can be used to asses relative changes in platelet 5-HT transport induced by different antidepressants. Dependence of platelet 5-HT transport on antidepressant concentration After PRP from untreated rats (n = 4) was diluted, 0.2 ml of the sample (4 × 107 platelets) was mixed in plastic test tubes with KR solution and with 5 different antidepressant concentrations. The samples were preincubated at 37 ◦C for 60 min. The 5-HT uptake was started by addition of 0.5 ml [3 H]5-HT. The final sample volume was 4 ml (107 platelets/ml) and the final concentrations were: 1 µmol/l [3 H]5-HT; 0, 0.01, 0.1, 1, and 10 µmol/l of desipramine, maprotiline, citalopram, or moclobemide; 0, 0.002, 0.02, 0.2, and 2 mmol/l of lithium. The samples were incubated at 37 ◦C for 5 min, and reaction was terminated by rapid filtration through glass microfiber filters GF/C type (Whatman) soaked previously in 0.1 % polyethyleneimine (Sigma). Filters were washed rapidly 2 times with 3 ml of ice-cold saline. Filtration and washing were accomplished within 10 s. After adding the scintillation cocktail, the filters were assayed on LS 6000IC scintillation counter (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA). The total uptake of 5-HT is assumed to be the sum of the high affinity transport (specific uptake) and the non-specific uptake, which was evaluated with 2 ◦C cold samples. Moreover, radiolabelled chemicals possess remarkable abilities to bind non-specifically to both biological and non-biological substances (Bennett and Yamamura 1985), e.g. to platelet surface or to filter. By subtracting the activity of filter that collected sample incubated at 2 ◦C from the activity of filter that captured the same sample incubated at 37 ◦C, the high affinity transport was determined. The samples were measured in doublets.
118
Fišar et al.
Platelet 5-HT transport kinetics measurements The technique employed in our study was method by analogy with receptor studies (Bennett and Yamamura 1985). After PRP from controls or antidepressant-treated rats was diluted, 0.2 ml of the sample (4 × 107 platelets) was mixed in plastic test tubes with KR solution and preincubated at 37 ◦C for 12 min. The measurements of platelet 5-HT uptake kinetics were initiated by adding 12 different [3 H]5-HT volumes of 8 µmol/l [3 H]5-HT so that the resultant concentrations of [3 H]5-HT for platelet uptake were in the range of 10 nmol/l and 1 µmol/l. The final volume of the testing sample was 4 ml with platelet concentration of 107 per ml. After adding labelled 5-HT the test tubes were filled with 95 % O2 and 5 % CO2 gas mixture, sealed and incubated at 37 ◦C for 5 min. Free [3 H]5-HT was then removed by rapid filtration as described above. The non-specific uptake and the non-specific binding of [3 H]5-HT to platelet surface or to filter were determined from 2 ◦C cold samples (see above). The samples at 37 ◦C were measured in doublets; the samples at 2 ◦C were measured in singlets. Data analysis Inhibition of platelet 5-HT uptake by antidepressants was analysed using the fourparametric logistic model (Rodbard et al. 1976; ImmunoFit EIA/RIA software, Beckman) to establish the values of drug concentration inhibiting 50 % of 5-HT uptake (IC50 ). To calculate the parameters of kinetics of 5-HT platelet transport (Vmax and KM ), we used AccuFit Saturation Two-Site nonlinear regression analysis software (Beckman). Limiting permeability at low (physiological) 5-HT concentrations was calculated as Vmax /KM ratio (Franke et al. 2000). Vmax /KM corresponds to second-order rate constant for transport mechanism multiplied by SERT molar concentration. Although we do not know SERT concentration, Vmax /KM can be considered as efficiency criterion of transport system (apparent 5-HT uptake efficiency). Data are expressed as the arithmetic means. Standard deviation (SD) was calculated to characterize group variability. Hypothesis testing was performed using analysis of variance (ANOVA), followed by post hoc Duncan test. Statistical analyses were performed with the statistical package Statistica (StatSoft, Inc.). Results Different acute in vitro effects of antidepressants on the 5-HT uptake are demonstrated on Figure 1. As was to be expected, the platelet in vitro treatment with different antidepressant concentrations resulted in decrease of the 5-HT uptake for citalopram (IC50 = 0.015 ± 0.002 µmol/l) > desipramine (IC50 = 0.191 ± 0.007 µmol/l) > maprotiline (IC50 = 3.48 ± 0.06 µmol/l), and no significant decrease was observed for moclobemide and lithium. The assessment of changes in the activity of platelet SERT following longterm administration of 5 pharmacologically selective antidepressants was based on
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
119
Figure 1. Dependence of 5-HT uptake on antidepressant concentration. Platelets from untreated rats were used; the 5-HT uptake was related to the value in absence of the drug. The final sample volume was 4 ml with platelet concentration of 107 per ml. The samples were incubated with antidepressants at 37 ◦C for 60 min and the uptake was started by the addition of 1 µmol/l [3 H]5-HT; following incubation at 37 ◦C for 5 min, the rapid filtration was used to separate free radioligand. The samples were measured in doublets and non-specific binding was deducted. The figure shows mean values of four repetitions of the experiment ± SD. The 4-parameter logistic model was used for fitting data and calculating results; the IC50 of 5-HT uptake was achieved at 0.015 µmol/l of citalopram, 0.191 µmol/l of desipramine or 3.48 µmol/l of maprotiline.
measurements of kinetic parameters of 5-HT uptake in rat platelets ex vivo. The adaptive changes in transmembrane 5-HT transport were studied. Eventual direct inhibitory effect of antidepressants on SERT function ex vivo was eliminated by the decrease in free drug concentration (see Discussion) which was achieved both by 24-h wash-out period before blood collection and by dilution of PRP before 5-HT uptake measurement (the final dilution of PRP by KR solution was about eighty times); remaining concentrations of antidepressants (including citalopram) were too low to affect platelet SERT activity. The results are summarized in Table 1. A significant decrease in KM compared to control group values was discovered following maprotiline (p = 0.024), citalopram (p = 0.0098), moclobemide (p = 0.026) and lithium (p = 0.0061) administration; administration of desipramine had
120
Fišar et al.
Table 1. Platelet 5-HT uptake in laboratory rats following 4-week administration of various antidepressants
Group
Controls
Dose
Primary
(mg/kg
biochemical
per day)
effect
0
KM
Vmax
Vmax /KM
(nmol/l)
(pmol/min·107
(ml/min·107
platelets)
platelets)
68.0 ± 28.0
6.6 ± 3.5
0.110 ± 0.060 0.176 ± 0.094
Desipramine
10
NE reuptake inhibitor
62.9 ± 14.0
10.3 ± 4.5
Maprotiline
10
selective NE 40.8 ± 5.7* reuptake inhibitor
9.4 ± 3.2
0.227 ± 0.059**
Citalopram
5
selective 5-HT 36.1 ± 7.6** reuptake inhibitor
9.0 ± 1.6
0.264 ± 0.082***
Moclobemide
25
reversible MAO-A 42.0 ± 6.0* inhibitor
5.4 ± 1.2
0.131 ± 0.031
LiCO3
50
inositol monophos- 33.6 ± 4.5** phatase inhibitor and other effects
6.2 ± 1.1
0.187 ± 0.031
Values are means ± SD; the means were calculated from 19 values in case of control group and from 6 values in all other groups. NE, norepinephrine; 5-HT, 5-hydroxytryptamine, serotonin; MAO-A, monoamine oxidase type A; Vmax , maximal velocity of platelet 5-HT uptake; KM , Michaelis constant; Vmax /KM , ratio representing limiting permeability at low (physiological) extracellular concentrations of 5-HT. Values different from those of control group are marked in case the difference is statistically significant: * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; determined by ANOVA and post hoc Duncan test.
no significant influence on KM values. There was certain increase in Vmax values following the administration of desipramine (p = 0.058), maprotiline (p = 0.14), and citalopram (p = 0.17); however, the all Vmax changes were not significant. Vmax /KM ratio representing limiting permeability at low (i.e. physiological) extracellular concentrations of 5-HT was calculated (Table 1). Although there was systematic increase in the Vmax /KM ratio in all the tested drugs, significant changes were occurred only in maprotiline- (p = 0.0054) and citalopram- (p = 0.00035) treated rats. Discussion Our study is a contribution to the understanding of SERT role in the treatment of depressive disorder. We measured both acute and long-term effects of pharmacologically selective antidepressants on the platelet 5-HT uptake. Experimental animals were used because capacity of a drug to alter monoamine uptake in vitro does not
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
121
predict its potential to modulate monoamine transporters after administration in vivo (Fleckenstein et al. 1999). Interpretation of our results is aggravated by the facts that both the biochemical response of the rat after long-term administration of antidepressants need not be equal to the response in man and the action of antidepressants on disturbed neurotransmitter systems during depression can be rather different from their action in normal physiological conditions. There are also dissimilarities between platelets and neurons with respect to the turnover of 5-HT. Nevertheless, we relied on the previous findings that platelets can be used as a peripheral model of central serotonergic function. Changes in platelet 5-HT transport produced by administration of antidepressants were determined by measurements of [3 H]5-HT uptake. Relative decrease in the amounts of [3 H]5-HT entrapped into platelets was determined after in vitro addition of drugs to platelets from untreated rats (Figure 1). Adaptive changes in platelet 5-HT transport following long-term administration of antidepressants with different pharmacological selectivity were determined in ex vivo experiment, when platelet [3 H]5-HT uptake was measured at different [3 H]5-HT concentrations and parameters KM and Vmax that characterize transport properties of the SERT were calculated (Table 1). It is known, that the kinetic of 5-HT transport in platelets is determined mostly by the properties of the SERT (Stahl and Meltzer 1978). The density of SERT molecules in the cell membrane is not the only factor which determines the Vmax ; e.g. storage granules which accumulate 5-HT very rapidly (Costa et al. 1977) may be of importance for the overall 5-HT uptake. Moreover, the capability to release the 5-HT after the transport has been completed was not taken into consideration in our experiments. Therefore, the calculated KM and Vmax reflect the net transport in intact platelets rather than true SERT activity. Both density of SERT molecules in the plasma membrane and the endogenous level of 5-HT in platelets could affect 5-HT transport. No significant relationship between Vmax and platelet 5-HT content was found in previous study (Franke et al. 2000); however, the existence of a functional relationship between platelet 5-HT content and apparent 5-HT uptake efficiency was established. An observed changes in the values of Vmax constant (Table 1) corresponded with antidepressantinduced changes of the 5-HT platelet content as mentioned in the Introduction; i.e. desipramine, maprotiline and citalopram decreased platelet 5-HT concentrations (Alvarez et al. 1999b; Javors et al. 2000; Ashina et al. 2004) and increased Vmax , moclobemide increased platelet 5-HT concentrations (Lestra et al. 1998) and decreased Vmax , and lithium had no effect both on platelet 5-HT concentrations (Glue et al. 1986; Poirier et al. 1988; Artigas et al. 1989) and Vmax . It seems that the variation in Vmax induced by long-term administration of pharmacologically selective antidepressants could be accounted both for density of 5-HT uptake sites (Maguire et al. 1993) and for platelet 5-HT levels. It can be hypothesised that both SSRI and non-SSRI antidepressants may exhibit their effect on 5-HT transport by increase in limiting permeability of membranes for 5-HT, which could be evoked by lowering of the 5-HT concentration gradient across the platelet membrane. This conclusion is rather speculative, because changes in Vmax observed in our study
122
Fišar et al.
were not statistically significant and we relied on previously published data about the effect of antidepressants on platelet 5-HT concentrations. The activity of SERT also depends on the modulation of substrate affinity by several endogenous factors. A registered decrease in the values of KM constant (Table 1) can be interpreted as an increase in the SERT affinity, which leads to more effective clearance of extracellular 5-HT, resulting in its increased intrasynaptic availability and decreased extracellular 5-HT concentration, if serotonergic synapse is inactive and SERT is not inhibited. Considering variable receptor affinity hypothesis (Shinitzki 1984; Bevan et al. 1989), we suppose that effect of antidepressants on lipid-protein interactions (Seydel et al. 1992) could be responsible for changes in KM . The finding of significantly reduced apparent KM is in opposition to the general view that KM constant is not changed during pharmacotherapy of depression. Our results show that in spite of the 5-HT uptake inhibition observed in the acute in vitro experiments with citalopram, desipramine, and maprotiline (Figure 1), enhancement of the SERT activity is indicated by the observed changes in Vmax /KM ratio following the 4-week premedication with these drugs (Table 1). This can be accounted for the fact that adaptive changes in 5-HT transport were measured, which can be opposite to the acute effect of antidepressants on SERT activity. The most marked difference between in vitro and ex vivo results was found for citalopram. Citalopram is the most selective and the most potent inhibitor of 5-HT reuptake. SSRI increase brain extracellular 5-HT concentrations in animals acutely following administration (Fuller 1994). However, the clinical effects are delayed for several weeks (Baumann 1992). This notion suggests the occurrence of adaptive changes triggered by the sustained elevated 5-HT levels. These changes involve desensitization of inhibitory 5-HT autoreceptors. The final increase in the overall serotonergic neurotransmission has been hypothesized to underlie the therapeutic effects of SSRIs (Blier and de Montigny 1994). The clinically effective plasma levels of citalopram in humans range between 0.12–0.84 µmol/l (Baumann 1992). In rats, similar plasma levels of citalopram were obtained at doses used in the present study (Cremers et al. 2000a). Elimination of drugs is, in general, much faster in rodents than in humans. Due to rapid drug elimination in rats, citalopram plasma levels dropped below 1/7 of stable citalopram level after 24 wash-out period (Cremers et al. 2000b) and extracellular levels of 5-HT in control and citalopram-treated rats were similar (Moret and Briley 1996). In our ex vivo uptake experiments, we used 24 wash-out period and PRP was diluted about 80 times before measurement; final free citalopram concentrations dropped below the threshold of the pharmacologically active plasma concentrations (Cremers et al. 2000b). Therefore, we really measured adaptive changes in platelet 5-HT transport evoked by long-term citalopram administration and direct effect of citalopram remaining in highly diluted PRP samples can be ruled out. The same conclusion is valid also for desipramine, maprotiline, moclobemide, and lithium-treated rats, because direct inhibitory effects of these drugs on SERT activity are much less when compared with citalopram.
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
123
Baseline levels of 5-HT in dialysate samples obtained from different brain areas varied between 0.1 and 1.0 nmol/l (Bel and Artigas 1999; Eriksson et al. 1999; Hjorth and Auerbach 1999) and uptake inhibitors cause about a 3- to 5-fold increase in extracellular 5-HT (Fuller 1994) so SERT is unsaturated at physiological conditions (KM > 30 nmol/l), except for SERT in synaptic membrane immediately after 5-HT release. Vmax /KM ratio representing limiting permeability at low extracellular concentrations of 5-HT may be a proper parameter describing relative changes in total SERT activity. We found an increase in this ratio after a long-term administration of all antidepressants used including lithium. Citalopram and maprotiline induced the significant increase in Vmax /KM ratio while moclobemide showed the least effect (Table 1), which reflect potent effect of long-term administration of both selective 5-HT and selective NE reuptake inhibitors on the platelet 5-HT transport. The SERT is associated not only with synaptic membranes but also with axons (Zhou et al. 1998) so the increase in Vmax /KM may also affect the extrasynaptic 5-HT transmission. Because desipramine (potent NE reuptake inhibitor), citalopram (SSRI antidepressant), maprotiline (selective NE reuptake inhibitor antidepressant), moclobemide (reversible monoamine oxidase type A inhibitor antidepressant) and lithium (mood stabilizer with various effects on signal transduction) had qualitatively the same effect on Vmax /KM values, it can be assumed that this might be integral part of the adaptive changes in platelet 5-HT transport following long-term administration of pharmacologically selective antidepressants. Whether this is significant in the mechanism of therapeutic action of non-SSRI antidepressants it remains to be established. Our results support 5-HT hypothesis of affective disorders, which is based on the assumption that insufficient 5-HT activity is an important factor of vulnerability to depression and that one of the manifestation of long-term antidepressant therapy is the increase in brain serotonergic activity (Meltzer and Lowy 1987; Caldecott-Hazard et al. 1991; Siever et al. 1991; Charney and Delgado 1992; Stahl 1992, 1994; Maes and Meltzer 1995). This antidepressant-induced increase in 5-HT activity is probably based both on desensitisations of inhibitory 5-HT autoreceptors and on adaptive changes in transmembrane 5-HT transport. Changes in SERT affinity and transport velocity cannot fully manifest during the administration of SSRI, because the transport is largely blocked and 5-HT concentration is increased in extracellular space and reduced in cytoplasm. When final free SSRI concentrations dropped below the threshold of the pharmacologically active plasma concentrations (after a sufficient wash-out period or dilution), the combination of increased SERT affinity and unchanged or increased transport velocity results in more complete 5-HT clearance from the extracellular space and in increased possibility of its reuse. From this point of view, the increases in extracellular 5-HT concentrations during administration of SSRI could participate in induction of their therapeutic effects, and increase in 5-HT transport after drug withdrawal could participate in the maintenance of effects of pharmacotherapy. The increase in limiting permeability of the membrane for 5-HT could be included in the common adaptive effect of the long-term administration of different antidepressants (both SSRI and
124
Fišar et al.
non-SSRI). If such 5-HT uptake changes occur in the brain, therapeutic effects of desipramine, maprotiline, moclobemide or lithium might be partially due to action on SERT function. Acknowledgements. This work was supported by the GA UK 27/2000/C and MSM 111100001 grants.
References Alvarez J. C., Gluck N., Fallet A., Gregoire A., Chevalier J. F., Advenier C., SpreuxVaroquaux O. (1999a): Plasma serotonin level after 1 day of fluoxetine treatment: a biological predictor for antidepressant response? Psychopharmacology (Berl.) 143, 97—101 Alvarez J. C., Sanceaume M., Advenier C., Spreux-Varoquaux O. (1999b): Differential changes in brain and platelet 5-HT concentrations after steady-state achievement and repeated administration of antidepressant drugs in mice. Eur. Neuropsychopharmacol. 10, 31—36 Artigas F., Sarrias M. J., Martinez E., Gelpi E., Alvarez E., Udina C. (1989): Increased plasma free serotonin but unchanged platelet serotonin in bipolar patients treated chronically with lithium. Psychopharmacology (Berl.) 99, 328—332 Ashina S., Bendtsen L., Jensen R. (2004): Analgesic effect of amitriptyline in chronic tension-type headache is not directly related to serotonin reuptake inhibition. Pain 108, 108—114 Bakish D., Cavazzoni P., Chudzik J., Ravindran A., Hrdina P. D. (1997): Effects of selective serotonin reuptake inhibitors on platelet serotonin parameters in major depressive disorder. Biol. Psychiatry 41, 184—190 Baumann P. (1992): Clinical pharmacokinetics of citalopram and other selective serotonergic reuptake inhibitors (SSRI). Int. Clin. Psychopharmacol. 6 (Suppl. 5), 13—20 Bel N., Artigas F. (1999): Modulation of the extracellular 5-hydroxytryptamine brain concentrations by the serotonin and noradrenaline reuptake inhibitor, milnacipran. Neuropsychopharmacology 21, 745—754 Bennett J. P. Jr., Yamamura H. I. (1985): Neurotransmitter, hormone, or drug receptor binding methods. In: Neurotransmitter Receptor Binding (Eds. H. I. Yamamura, S. J. Enna and M. J. Kuhar), pp. 61—89 (2nd ed.), Raven Press, New York Bevan J. A., Bevan R. D., Shreeve S. M. (1989): Variable receptor affinity hypothesis. FASEB J. 3, 1696—1704 Bianchi M., Moser C., Lazzarini C., Vecchiato E., Crespi F. (2002): Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp. Brain Res. 143, 191—197 Blakely R. D., Ramamoorthy S., Schroeter S., Qian Y., Apparsundaram S., Galli A., DeFelice L. J. (1998): Regulated phosphorylation and trafficking of antidepressantsensitive serotonin transporter proteins. Biol. Psychiatry 44, 169—178 Blardi P., De Lalla A., Leo A., Auteri A., Iapichino S., Di Muro A., Dell’Erba A., Castrogiovanni P. (2002): Serotonin and fluoxetine levels in plasma and platelets after fluoxetine treatment in depressive patients. J. Clin. Psychopharmacol. 22, 131— 136 Blier P., de Montigny C. (1994): Current advances and trends in the treatment of depression. Trends Pharmacol. Sci. 15, 220—226
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
125
Block E. R., Edwards D. (1987): Effect of plasma membrane fluidity on serotonin transport by endothelial cells. Am. J. Physiol. 253, C672—678 Bonhomme N., Esposito E. (1998): Involvement of serotonin and dopamine in the mechanism of action of novel antidepressant drugs: a review. J. Clin. Psychopharmacol. 18, 447—454 Bourdeaux R., Desor D., Lehr P. R., Younos C., Capolaghi B. (1998): Effects of fluoxetine and norfluoxetine on 5-hydroxytryptamine metabolism in blood platelets and brain after administration to rats. J. Pharm. Pharmacol. 50, 1387—1392 Caldecott-Hazard S., Morgan D. G., DeLeon-Jones F., Overstreet D. H., Janowsky D. (1991): Clinical and biochemical aspects of depressive disorders: II. transmitter/receptor theories. Synapse 9, 251—301 Castrogiovanni P., Blardi P., De Lalla A., Dell’Erba A., Auteri A. (2003): Can serotonin and fluoxetine levels in plasma and platelets predict clinical response in depression? Psychopharmacol. Bull. 37, 102—108 Charney D. S., Delgado P. L. (1992): Current concepts of the role of serotonin function in depression and anxiety. In: Serotonin Receptor Subtypes: Pharmacological Significance and Clinical Implications (Eds. S. Z. Langer, N. Brunello, G. Racagni and J. Mendlewicz), Vol. 1., pp. 89—104, Int. Acad. Biomed. Drug Res., Karger, Basel Costa J. L., Silber S. A., Murphy D. L. (1977): Effects of reserpine and imipramine on vesicular serotonin uptake and storage in intact human platelets. Life Sci. 21, 181—188 Cremers T. I. F., de Boer P., Liao Y., Bosker F. J., den Boer J. A., Westerink B. H., Wikström H. V. (2000a): Augmentation with a 5-HT1A , but not a 5-HT1B receptor antagonist critically depends on the dose of citalopram. Eur. J. Pharmacol. 397, 63—74 Cremers T. I. F., Spoelstra E. N., de Boer P., Bosker F. J., Mørk A., den Boer J. A., Westerink B. H., Wikström H. V. (2000b): Desensitisation of 5-HT autoreceptors upon pharmacokinetically monitored chronic treatment with citalopram. Eur. J. Pharmacol. 397, 351—357 Dordoni P. L., Frassanito L., Bruno M. F., Proietti R., de Cristofaro R., Ciabattoni G., Ardito G., Crocchiolo R., Landolfi R., Rocca B. (2004): In vivo and in vitro effects of different anaesthetics on platelet function. Br. J. Haematol. 125, 79—82 Duman R. S. (2002): Synaptic plasticity and mood disorders. Mol. Psychiatry 7 (Suppl. 1), S29—34 Duman R. S., Heninger G. R., Nestler E. J. (1997): A molecular and cellular theory of depression. Arch. Gen. Psychiatry 54, 597—606 Eriksson E., Engberg G., Bing O., Nissbrandt H. (1999): Effects of mCPP on the extracellular concentrations of serotonin and dopamine in rat brain. Neuropsychopharmacology 20, 287—296 Fleckenstein A. E., Haughey H. M., Metzger R. R., Kokoshka J. M., Riddle E. L., Hanson J. E., Gibb J. W., Hanson G. R. (1999): Differential effects of psychostimulants and related agents on dopaminergic and serotonergic transporter function. Eur. J. Pharmacol. 382, 45—49 Franke L., Schewe H.-J., Müller B., Campman V., Kitzrow W., Uebelhack R., Berghöfer A., Müller-Oerlinghausen B. (2000): Serotonergic platelet variables in unmedicated patients suffering from major depression and healthy subjects. Relationship between 5HT content and 5HT uptake. Life Sci. 67, 301—315 Fuller R. W. (1994): Uptake inhibitors increase extracellular serotonin concentration measured by brain microdialysis. Life Sci. 55, 163—167 Glue P. W., Cowen P. J., Nutt D. J., Kolakowska T., Grahame-Smith D. G. (1986): The
126
Fišar et al.
effect of lithium on 5-HT-mediated neuroendocrine responses and platelet 5-HT receptors. Psychopharmacology (Berl.) 90, 398—402 Haase J., Killian A.-M., Magnani F., Williams C. (2001): Regulation of the serotonin transporter by interacting proteins. Biochem. Soc. Trans. 29, 722—728 Harwood A. J., Agam G. (2003): Search for a common mechanism of mood stabilizers. Biochem. Pharmacol. 66, 179—189 Hjorth S., Auerbach S. B. (1999): Autoreceptors remain functional after prolonged treatment with a serotonin reuptake inhibitor. Brain Res. 835, 224—228 Jančinová V., Májeková M., Nosáľ R., Petríková M. (1996): Inhibition of blood platelet functions by cationic amphiphilic drugs in relation to their physico-chemical properties. Blood Coagul. Fibrinolysis 7, 191—193 Javors M. A., Houston J. P., Tekell J. L., Brannan S. K., Frazer A. (2000): Reduction of platelet serotonin content in depressed patients treated with either paroxetine or desipramine. Int. J. Neuropsychopharmacol. 3, 229—235 Kitamura R., Hirakata H., Okuda H., Sato M., Toda H., Nakamura K., Hatano Y., Urabe N., Fukuda K. (2001): Thiopental enhances human platelet aggregation by increasing arachidonic acid release. Can. J. Physiol. Pharmacol. 79, 854—860 Lachman H. M., Papolos D. F. (1995): A molecular model for bipolar affective disorder. Med. Hypotheses 45, 255—264 Langer S. Z., Schoemaker H. (1988): Effects of antidepressants on monoamine transporters. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 12, 193—216 Lesch K.-P., Wolozin B. L., Murphy D. L., Riederer P. J. (1993): Primary structure of the human platelet serotonin uptake site – identity with the brain-serotonin transporter. J. Neurochem. 60, 2319—2322 Lestra C., d’Amato T., Ghaemmaghami C., Perret-Liaudet A., Broyer M., Renaud B., Dalery J., Chamba G. (1998): Biological parameters in major depression: effects of paroxetine, viloxazine, moclobemide, and electroconvulsive therapy. Relation to early clinical outcome. Biol. Psychiatry 44, 274—280 Lucki I., O’Leary O. F. (2004): Distinguishing roles for norepinephrine and serotonin in the behavioral effects of antidepressant drugs. J. Clin. Psychiatry 65 (Suppl. 4), 11—24 Maes M., Meltzer H. Y. (1995): The serotonin hypothesis of major depression. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress (Eds. F. E. Bloom and D. J. Kupfer), pp. 933—944, Raven Press, New York Maguire K., Tuckwell V., Pereira A., Dean B., Singh B. (1993): Significant correlation between 14 C-5HT uptake by and 3 H-paroxetine binding to platelets from healthy volunteers. Biol. Psychiatry 34, 356—360 Manji H. K. (1992): G proteins: implications for psychiatry. Am. J. Psychiatry 149, 746— 760 Maurer-Spurej E., Pittendreigh C., Solomons K. (2004): The influence of selective serotonin reuptake inhibitors on human platelet serotonin. Thromb. Haemost. 91, 119—128 Mellerup E., Langer S. Z. (1990): Validity of imipramine platelet binding-sites as a biological marker of endogenous-depression – A World Health-Organization-Collaborative Study. Pharmacopsychiatry 23, 113—117 Meltzer H. Y., Lowy M. T. (1987): The serotonin hypothesis of depression. In: Psychopharmacology: The Third Generation of Progress. pp. 513—526, Raven Press, New York Meltzer H. Y., Arora R. C., Baber R., Tricou B. J. (1981): Serotonin uptake in blood platelets of psychiatric patients. Arch. Gen. Psychiatry 38, 1322—1326 Moret C., Briley M. (1996): Effects of acute and repeated administration of citalopram on extracellular levels of serotonin in rat brain. Eur. J. Pharmacol. 295, 189—197
Effect of Antidepressants on Serotonin Uptake
127
Murphy D. L. (1990): Peripheral indices of central serotonin function in humans. Ann. N. Y. Acad. Sci. 600, 282—295 Nosáľ R, Jančinová V. (2002): Cationic amphiphilic drugs and platelet phospholipase A2 (cPLA2 ). Thromb. Res. 105, 339—345 Ortiz J., Artigas F., Gelpi E. (1988): Serotonergic status in human blood. Life Sci. 43, 983—990 Owens M. J. (2004): Selectivity of antidepressants: from the monoamine hypothesis of depression to the SSRI revolution and beyond. J. Clin. Psychiatry 65 (Suppl. 4), 5—10 Pandey G. N., Pandey S. C., Dwivedi Y., Sharma R. P., Janicak P. G., Davis J. M. (1995): Platelet serotonin-2A receptors: a potential biological marker for suicidal behavior. Am. J. Psychiatry 152, 850—855 Pandey G. N., Pandey S. C., Ren X., Dwivedi Y., Janicak P. G. (2003): Serotonin receptors in platelets of bipolar and schizoaffective patients: effect of lithium treatment. Psychopharmacology (Berl.) 170, 115—123 Poirier M. F., Galzin A. M., Pimoule C., Schoemaker H., Le Quan Bui K. H., Meyer P., Gay C., Loo H., Langer S. Z. (1988): Short-term lithium administration to healthy volunteers produces long-lasting pronounced changes in platelet serotonin uptake but not imipramine binding. Psychopharmacology (Berl.) 94, 521—526 Ramamoorthy S., Blakely R. D. (1999): Phosphorylation and sequestration of serotonin transporters differentially modulated by psychostimulants. Science 285, 763—766 Rodbard D., Lenox R. H., Wray H. L., Ramseth D. (1976): Statistical characterization of the random errors in the radioimmunoassay dose-response variable. Clin. Chem. 22, 350—358 Sakai N., Kodama N., Ohmori S., Sasaki K., Saito N. (2000): Involvement of the actin cytoskeleton in the regulation of serotonin transporter (SET) activity: possible mechanism underlying SET regulation by protein kinase C. Neurochem. Int. 36, 567—579 Scanlon S. M., Williams D. C., Schloss P. (2001): Membrane cholesterol modulates serotonin transporter activity. Biochemistry 40, 10507—10513 Seydel J. K., Velasco M. A., Coats E. A., Cordes H. P., Kunz B., Wiese M. (1992): The importance of drug-membrane interaction in drug research and development. Quant. Struct.-Act. Relat. 11, 205—210 Sheridan N. P., Block E. R. (1988): Serotonin transport and fluidity in plasma membrane vesicles: effect of hyperoxia. Am. J. Physiol. 254, C781—787 Shiah I.-S., Yatham L. N. (2000): Serotonin in mania and in the mechanism of action of mood stabilizers: a review of clinical studies. Bipolar Disord. 2, 77—92 Shinitzky M. (1984): Membrane fluidity and receptor function. In: Membrane Fluidity (Eds. M. Kates and L. A. Manson), pp. 585—601, Plenum Publ. Corp., New York Siever L. J., Kahn R. S., Lawlor B. A., Trestman R. L., Lawrence T. L., Coccaro E. F. (1991): II. Critical issues in defining the role of serotonin in psychiatric disorders. Pharmacol. Rev. 43, 509—525 Slotkin T. A., Whitmore W. L., Dew K. L., Kilts C. D. (1986): Uptake of serotonin into rat platelets and synaptosomes: comparative structure-activity relationships, energetics and evaluation of the effects of acute and chronic nortriptyline administration. Brain Res. Bull. 17, 67—73 Stahl S. M. (1985): Peripheral models for the study of neurotransmitter receptors in man. Psychopharmacol. Bull. 21, 663—671 Stahl S. M. (1992): Serotonin receptors and the mechanism of action of antidepressant drugs: postmortem, platelet, and neuroendocrine studies in depressed patients. In:
128
Fišar et al.
Serotonin IA Receptors in Depression and Anxiety (Eds. S. M. Stahl, M. Gastpar, J. M. Keppel Hesselink and J. Traber), pp. 119—134, Raven Press, New York Stahl S. M. (1994): 5HT1A receptors and pharmacotherapy. Is serotonin receptor downregulation linked to the mechanism of action of antidepressant drugs? Psychopharmacol. Bull. 30, 39—43 Stahl S. M. (2000): Essential Psychopharmacology. Neuroscientific Basis and Practical Applications. (2nd ed.), Cambridge University Press, Cambridge Stahl S. M., Meltzer H. Y. (1978): A kinetic and pharmacologic analysis of 5-hydroxytryptamine transport by human platelets and platelet storage granules: comparison with central serotonergic neurons. J. Pharmacol. Exp. Ther. 205, 118—132 Tuomisto J., Tukiainen E., Ahlfors U. G. (1979): Decreased uptake of 5-hydroxytryptamine in blood platelets from patients with endogenous depression. Psychopharmacology 65, 141—147 Turčáni P., Nosáľ R., Turi-Nagy L. (1982): On the serotonin liberation from rat platelets due to betaadrenoceptor blocking drugs. Thromb. Res. 28, 213—221 Van Den Berg E. K. Jr., Schmitz J. M., Benedict C. R., Prewitt J. B., Malloy C. R., Willerson J. T., Dehmer G. J. (1987): Plasma serotonin concentrations: validation of a sampling technique using long catheters. Am. J. Med. Sci. 294, 324—327 Zhou F. C., Tao-Cheng J. H., Segu L., Patel T., Wang Y. (1998): Serotonin transporters are located on the axons beyond the synaptic junctions: anatomical and functional evidence. Brain Res. 805, 241—254 Final version accepted: January 25, 2005
Příloha 5: FIŠAR, Zdeněk; ANDERS, Martin; TVRZICKÁ, Eva and STAŇKOVÁ, Barbora. Effect of long-term administration of antidepressants on the lipid composition of brain plasma membranes. Gen. Physiol. Biophys. 2005, vol. 24, no. 2, p. 221-236.
Gen. Physiol. Biophys. (2005), 24, 221—236
221
Effect of Long-Term Administration of Antidepressants on the Lipid Composition of Brain Plasma Membranes Z. Fišar1 , M. Anders1 , E. Tvrzická2 and B. Staňková2 1 2
Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic 4th Medical Department, Clinical Department of Gastroenterology and Hepatology, 1st Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic
Abstract. The connection between changes in lipid pattern in brain plasma membranes and long-term administration of therapeutically effective doses of antidepressants has not been sufficiently demonstrated so far. Therefore, we analyzed effect of antidepressants that differ in pharmacological selectivity on membrane lipid composition in the rat brain tissue. Laboratory rats were given desipramine, maprotiline, citalopram, moclobemide or lithium for a 4-week period. We observed a significant decrease in phosphatidylethanolamine representation after administration of maprotiline, citalopram and moclobemide when compared with controls. Membrane cholesterol content was decreased after desipramine administration and increased after citalopram or lithium treatment. Electroneutral phospholipids were decreased after the administration of all tested antidepressants except for desipramine. Decrease in phosphatidylserine was found following long-term administration of maprotiline or desipramine; relative representation of phosphatidylinositol was reduced after lithium treatment. Statistically significant negative correlation between cholesterol and electroneutral phospholipids was discovered. Membrane microviscosity evaluated by fluorescence anisotropy of membrane probes was only slightly decreased after desipramine and increased after citalopram administration. Hypothesis was supported that changes in brain neurotransmission produced by antidepressants could be, at least partially, associated with adaptive changes in membrane cholesterol and phospholipids. Key words: Antidepressant — Phospholipid — Cholesterol — Plasma membrane — Rat brain Introduction Antidepressants are known to realize their primary biochemical actions through the binding to specific binding sites of neurotransmitter receptors, transporters Correspondence to: Zdeněk Fišar, Department of Psychiatry, 1st Faculty of Medicine, Charles University, Ke Karlovu 11, 120 00 Prague 2, Czech Republic E-mail: zfi[email protected]
222
Fišar et al.
or catabolizing enzymes. However, most of antidepressants belong to the cationic amphiphilic drugs group and interact more or less specifically with lipid bilayer also (Herbette et al. 1986; Seydel et al. 1994; Fišar et al. 2004). It results in changes of rotational and lateral diffusion, ordering and mutual interactions of membrane molecules, which can influence transmembrane signal transduction and play a part in effects of antidepressants. There is insufficient knowledge as regards the extent in which the accumulation of antidepressants in lipid part of brain cell membranes contributes to their therapeutic or adverse effects. Phosphatidylcholine (PC), sphingomyelin (SM) and phosphatidylethanolamine (PE) are the most abundant lipids in the biological membranes; however, acidic phospholipids, such as phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylglycerol, phosphatidic acid and gangliosides, play a key role in direct activation of various enzymatic and receptor systems (Tsakiris and Deliconstantinos 1984; Rando 1988; Sandermann and Duncan 1991; Lee 2003). The role of cholesterol consist both in direct action on the function of some membrane proteins (Scanlon et al. 2001; Fielding and Fielding 2003; Pfrieger 2003) and in regulation of the membrane structure, lateral organization, free volume distribution and “fluidity” (Shinitzky 1984; Burger et al. 2000; Barenholz 2002). Cholesterol is most likely associated with PCs and SMs in the membranes (Ohvo-Rekilä et al. 2002). A lot of abnormalities related to lipid homeostasis were described in depression (Maes et al. 1997; Kato et al. 1998); however, little is known about ability of antidepressants to induce alterations in the brain membrane phospholipid turnover at therapeutic drug concentrations. Phospholipid methylation in synaptic membranes or in vivo phospholipid administration can possibly influence receptor adaptation to chronic administration of antidepressants (Sulser et al. 1983; Racagni and Brunello 1984). Several papers reported that tricyclic antidepressants had a stimulatory effect on PS synthesis in cell cultures (Singh et al. 1992; Bobeszko et al. 2002); however, this effect was significant at relatively high drug concentrations. Many antidepressants, including tricyclic antidepressants and selective serotonin reuptake inhibitors, may induce excessive intracellular accumulation of different phospholipids (generalized phospholipidosis, phospholipid storage disorder) in cultured cells or in several organs of experimental animals. However, drug concentrations far from therapeutical plasma levels were used in these experiments (Honegger et al. 1983; Lüllmann-Rauch and Nassberger 1983; Stoffel et al. 1987; Xia et al. 2000). Organspecific changes in the phospholipid composition were observed in rats after the long-term administration of therapeutical doses of the desipramine, but no changes were found in whole brain (Moor et al. 1988). Changes in anisotropies of the superficial membrane layers and in lipid composition (PC/PE ratios) were observed following exposure of cultured human fibroblasts to high desipramine concentrations (Toplak et al. 1990). The synthesis of PI was inhibited in vitro by a great number of antidepressants; however, pharmacological significance of this inhibitory action is doubtful due to very high concentration of the drugs required (Li et al. 1988).
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
223
More data were reported on action of prophylactic drug lithium on membrane lipids. Data suggest that lithium exert both multiple effects on signal transduction and neuroprotective effects (Jope 1999; Manji et al. 1999). Lithium at therapeutic concentrations has been shown to have a strong inhibitory effect on arachidonic acid specific phospholipase A2 (PLA2 ) in the rat brain in vivo, i.e. it reduces turnover of the major n-6 polyunsaturated fatty acids in several brain phospholipids (Chang and Jones 1998). Brief chronic lithium administration to rats led to the subtle depressing the biosynthesis of PI as well as PE in the brain (Navidi et al. 1991). Likewise, lithium treatment induced small decreases (by several percent) in PS and PI brain levels (Pettegrew et al. 2001); it should be noted that even small changes in the quantity of these key membrane phospholipids could influence the function of many membrane proteins. No significant changes on the cholesterol/phospholipid ratio were observed in the synaptosomal plasma membranes after chronic administration of lithium (Lopez-Corcuera et al. 1988). Clinically relevant concentrations of lithium have been reported to affect membrane molecular dynamics both on the erythrocyte membrane surface (Pettegrew et al. 1987) and on the synaptosomal plasma membrane (Lopez-Corcuera et al. 1988). Though the primary biochemical effects of antidepressants are described very precisely, their therapeutic effects are associated with adaptive cellular changes following their long-term (2–4 weeks) administration (Stahl 2000). All antidepressants have a common action on monoamine neurotransmission, leading to changes in gene expression in the neurons targeted by monoamine neurotransmitters. We suppose that this includes not only desensitization of neurotransmitter receptors but also regulation of the composition of brain lipids. The aim of our experiments was to determine how the long-term administration of various antidepressants affects the lipid composition of plasma membranes in rat brain. We decided to study the effect of five widely used antidepressants, desipramine (potent nonselective norepinephrine reuptake inhibitor), maprotiline (selective norepinephrine reuptake inhibitor), citalopram (selective serotonin reuptake inhibitor), moclobemide (reversible monoamine oxidase inhibitor), and lithium (mood stabilizer with various effects on signal transduction). Materials and Methods Chemicals and solutions Water solutions of following concentrations of antidepressants were administered to rats: 2 mg/ml desipramine (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), 2 mg/ml maprotiline (Ciba Geigy Ltd., CH-4002 Basle, Switzerland), 1 mg/ml citalopram (H. Lundbeck A/S, DK-2500 Copenhagen-Valby, Denmark), 5 mg/ml moclobemide (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basle, Switzerland) and 10 mg/ml lithium carbonate (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA). Sucrose buffer (0.32 mol/l sucrose, 10 mmol/l Tris HCl, 1 mmol/l MgCl2 , pH 7.4) with protease inhibitors (0.5 mmol/l phenylmethanesulfonyl fluoride, 0.5 mmol/l benzamidine HCl, 1 mmol/l EDTA,
224
Fišar et al.
2 mmol/l dithiothreitol) was used as grinding medium. Buffer was prepared one day in advance, it’s pH was adjusted and following the filtration through 0.45 µm filter, it was stored at 4 ◦C. Dichloromethane/methanol (2 : 1, v/v) containing 0.25 % HCl (conc.) was used as an extraction mixture to remove lipids from membranes. Buffer A (120 mmol/l NaCl, 10 mmol/l KCl, 30 mmol/l Tris HCl, pH 7.4) and the membrane probes 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) and 1-(4-trimethylammoniumphenyl)-6-phenyl-1,3,5-hexatriene (TMA-DPH; Molecular Probes Inc., Eugene, OR 97402, USA) were used for the measurement of relative changes of plasma membrane microviscosity. DPH was dissolved in 6 mmol/l acetone solution, TMA-DPH in 3 mmol/l methanol solution, and these stock solutions were stored in a freezer. Fresh 6 µmol/l solutions of probes in buffer A were prepared for every measurement. Laboratory rats Specific pathogen-free Wistar strain of laboratory rats was used, total count of 45 males (15 in control group plus 5 groups by 6 animals) fed with standard diet under defined conditions (room temperature 22 ◦C, relative humidity 65 %, lighting 12 h/day). Keeping and treatment of laboratory animals conformed to the Declaration of Helsinki and was approved by the animal care committee of our Institution. Desipramine, maprotiline, citalopram, moclobemide and lithium carbonate were given with gastric tube once daily in doses of 10, 10, 5, 25 and 50 mg/kg per day, respectively, for the period of 4 weeks (period sufficient for realization of adaptive cellular changes related to therapeutic action of antidepressants). Administered doses were set according to human daily doses (75–150 mg/day for desipramine or maprotiline, 20–60 mg/day for citalopram, 100–400 mg/day for moclobemide, and 600–900 mg/day for lithium), but recalculated, supposing about 60 times lower body surface area of a rat. The weight of the rats was regularly monitored; initial weight was 180 ± 20 g, final 329 ± 27 g. The dosages were adjusted continuously according to the actual weight of a rat so that the dose per kg per day remained constant. The control group of rats was given water. The last dose was given one day before the rats were killed, which was done by exsanguinations from aorta under thiopental (Spofa, Czech Republic) anaesthesia. The whole brains were removed and immediately processed as described below. Isolation of plasma membranes Plasma membranes were isolated according to the method of Scott et al. (1993) with our modification. Briefly, after the weight was checked, whole brain was cut into pieces and placed in ice-cold sucrose buffer with protease inhibitors. Fine homogenization of the brain tissue was made in a glass homogenizer with teflon piston. Homogenate was replenished with grinding medium to 6 ml and centrifuged at 280 × g for 10 min at 4 ◦C. Supernatant was attentively removed so that 1/3 of total volume was left down to avoid stirring up of pellet. Supernatant was stored in an ice-cold bath. Pellet was re-suspended in 5 ml of the sucrose buffer with protease inhibitors, centrifuged at 280×g for 10 min at 4 ◦C, and supernatant was attentively
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
225
removed. Both supernatants were put together and centrifuged at 20,000 × g for 20 min at 4 ◦C. Supernatant was decanted and pellet was homogenized using UltraTurrax (Janke & Kunkel, IKA Werk) with 5 ml of icy distilled water. Sample was centrifuged at 5000 × g for 20 min at 4 ◦C. Supernatant was stored, pellet was again turraxed with 5 ml of icy distilled water and sample was centrifuged (5000 × g, 20 min, 4 ◦C). Supernatants were put together and centrifuged (50,000 × g, 20 min, 4 ◦C). Pellet was re-suspended in 1 ml of buffer A and sample was rapidly frozen and stored at −50 ◦C. Enrichment of the samples with plasma membranes was monitored during their isolation by determining ecto-5 -nucleotidase activity (Mitchell and Hawthorne 1965). Enrichment of samples by plasma membranes was about threefold when compared with crude membrane fraction of the brain homogenate. Protein concentrations were measured by Lowry method (Lowry et al. 1951). Lipidic phosphorus was assessed by Bartlett method (Bartlett 1959) following sample combustion with perchloric acid (60 min, 180 ◦C). Isolation of membrane lipids Modified Folch et al. (1957), Koul and Prasad (1996) methods were used to isolate membrane lipids. Briefly, samples were homogenized in Ultra-Turrax and centrifuged for 10 min at 20,000 × g. Supernatant was discarded and pellet was diluted in dichloromethane/methanol mixture (2 : 1, v/v, acidified by 0.25 % HCl), which volume was 20 times the original pellet volume. Test tubes content was gently stirred in dry bath at room temperature for 15–30 min under nitrogen atmosphere. Denatured proteins were removed by filtration through a mull and the filtrate (approximately 5 ml) was transferred into a calibrated test tube, circa 1 ml (20 volume percent) of water was added and the mixture was stirred. Phases were separated by 5-min centrifugation at 1000 × g. Top layer was carefully disposed off and the pure bottom layer containing most of lipids was transferred into labelled pre-weighted vial and evaporated under nitrogen. The vial was then weighted again and stored in freezer under nitrogen atmosphere. Membrane lipid analysis Membrane lipids were analyzed by two-dimensional thin-layer chromatography (TLC) on glass plates. Epicoprostanol (30 percentage by weight) was added to sample as internal standard for determination of cholesterol using gas chromatography. The samples in chloroform/methanol (2 : 1, v/v) solvent were spotted (40 µl, 10 mg/ml) on TLC plates and allowed to develop for 1 h and 20 min in the first dimension (chloroform/methanol/ammonium hydroxide/water, 70 : 25 : 4 : 1, v/v/v/v) and then for 1 h and 30 min in the second dimension (chloroform/methanol/acetone/acetic acid/water, 70 : 12.5 : 17.5 : 10 : 4.5, v/v/v/v/v). Lipids were visualized by exposing the plates to iodine vapours; fractions were scraped off for phosphorus (Bartlett 1959) and cholesterol assessment (Tvrzická et al. 1991).
226
Fišar et al.
Method of fluorescent probes Relative changes in membrane fluidity were assessed by the method of fluorescent probes with membrane probes DPH and TMA-DPH (Prendergast et al. 1981; Plášek and Jarolím 1987; Lakowicz 1999). Fresh 6 µmol/l DPH or TMA-DPH solution in buffer A was mixed with aliquots of buffer A and membrane suspension, so that the resultant concentration of fluorescent probe was 2 µmol/l, and the phospholipid concentration was about 100 µmol/l. Following 60 min incubation at 37 ◦C, the fluorescence polarization was measured on SLM 4800 spectrofluorometer using an excitation wavelength of 360 nm and an emission wavelength of > 405 nm. The fluorescence anisotropy was then calculated; increase in fluorescence anisotropy can be interpreted as an increase in the extent of probe movement restriction in the anisotropic membrane environment. Data analysis Data are expressed as the arithmetic means. Standard deviation (S.D.) was calculated to characterize group variability. Hypothesis testing was performed using analysis of variance (ANOVA), followed by post hoc Duncan’s multiple range test. Spearman R (nonparametric alternative to the Pearson product-moment correlation coefficient) was used to quantify relation between two quantitative parameters. Normality of distribution has been verified by the Shapiro–Wilk’s W test. Statistical analyses were performed with the statistical package Statistica (StatSoft Inc., Tulsa, USA). Results Male Wistar rats were dosed for four weeks with desipramine, maprotiline, citalopram, moclobemide and lithium (5 groups by 6 animals) and compared with control group (n = 15). During the course of experiment, the weight of the rats was regularly monitored in order to calculate antidepressant dosage and to determine its influence on the weight of laboratory rats. The final body weight (329 ± 27 g, n = 45) did not differ between all groups except for maprotiline (343 ± 17 g) and moclobemide (308 ± 30 g, p = 0.047) treated rats. The relative weight gain (85 ± 20 % of initial body weight, n = 45) was found significantly increased after citalopram (100 ± 15 %, p = 0.0056) or lithium (98 ± 12 %, p = 0.0078) treatment when compared to controls (69 ± 7 %). Both the whole brain weight (1.91 ± 0.16 g, n = 45) and the relative brain weight (0.593 ± 0.047 %, n = 45, related to final body weight) did not differ significantly between all groups. Lipid composition of plasma membranes in a rat brain Total lipid (TL) was determined by weighing dried lipid extract, total phospholipid (PL) weight was determined from the phosphorus content in lipid extract, and cholesterol (CH) was measured by gas chromatography. We did not find statistically significant changes in ratios of these parameters (Fig. 1). The mean ratios
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
227
Figure 1. Ratios of weight to weight concentrations of total lipids (TL), total phospholipids (PL) and cholesterol (CH) in rat plasma membranes following 4-week administration of antidepressants. Values are means ± S.D. The means were calculated from 15 values in case of control group and from 6 values in all other groups. Values after antidepressant treatment are not significantly different from controls; determined by ANOVA and post hoc Duncan’s test.
(weight/weight) in the control group were found PL/TL = 0.68 ± 0.12, CH/TL = 0.22 ± 0.06, and CH/PL = 0.34 ± 0.12. A decrease both in PL/TL (by 16 %) and CH/TL (by 20 %) ratios were found after the treatment with maprotiline. The CH/PL ratio was decreased by 20 % after desipramine administration. The increase both in CH/TL (by 24 %) and CH/PL (by 16 %) ratios were observed after lithium administration also. To interpret the changes in the relative representation of individual lipids in brain plasma membranes due to administration of antidepressants, we used the sum of CH+PL molar concentrations as the 100 % value (Table 1). Low values of relative representation of PE, which was observed in all groups, are caused by a method used in the isolation of membrane lipids, i.e. by acidification of ini-
0.017 0.011 0.003 * 0.005 * 0.005 * 0.020
0.075 0.076 0.065 0.061 0.068 0.063
± ± ± ± ± ± 0.016 0.024 0.020 0.014 0.010 0.010
SM 0.044 0.038 0.036 0.041 0.039 0.033
± ± ± ± ± ±
PI 0.012 0.012 0.011 0.006 0.014 0.011
0.043 0.033 0.025 0.047 0.048 0.040
± ± ± ± ± ±
PS 0.018 0.018 0.012 0.017 0.021 0.009
0.369 0.331 0.373 0.402 0.374 0.419
± ± ± ± ± ±
0.102 0.101 0.056 0.078 0.108 0.098
CH
Values are means ± S.D. The means were calculated from 15 values in case of control group and from 6 values in all other groups. PC, phosphatidylcholine; PE, phosphatidylethanolamine; SM, sphingomyelin; PI, phosphatidylinositol; PS, phosphatidylserine; CH, cholesterol; PL, total phospholipids. Sum of (CH+PL) molar concentrations was used as the 100 % value. Low values of relative representation of PE are caused by a method used in the isolation of membrane lipids. Marked values are significantly different from controls at * p < 0.05; determined by ANOVA and post hoc Duncan’s test.
0.042 0.036 0.024 0.024 0.024 0.031
± ± ± ± ± ±
0.057 0.055 0.038 0.026 0.026 0.032
± ± ± ± ± ±
Controls Desipramine Maprotiline Citalopram Moclobemide Lithium
0.208 0.202 0.167 0.181 0.186 0.166
PE
PC
Group
Table 1. Relative representation of molar concentrations of individual phospholipids or cholesterol in plasma membranes isolated from the brain of laboratory rats following 4-week administration of various antidepressants (in relation to total molar concentration of phospholipids and cholesterol)
228 Fišar et al.
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
229
tial dichloromethane/methanol mixture. We observed a significant decrease in PE representation after administration of maprotiline, citalopram and moclobemide compared to control group. No statistically significant changes were found both in other phospholipids and in cholesterol representation although it seemed that there was a decrease in PC, PE and SM after the administration of all tested antidepressants except for desipramine. PS was nonsignificantly decreased after maprotiline and desipramine, PI was decreased after lithium treatment. Cholesterol representation was decreased after desipramine and increased after citalopram or lithium administration compared to controls. Other ratios of molar concentrations of membrane lipids were calculated to discover a relation between CH, PC, PE, SM, PI and PS. Data had shown no significant decrease in SM/PC ratio after citalopram administration (0.333 ± 0.036, n = 6) in comparison with controls (0.375 ± 0.075, n = 15, p = 0.348). Statistically significant increase was found in ratio of main electroneutral phospholipids (PC+PE+SM) and sum of individual phospholipids molar concentrations (SUM = PC+PE+SM+PI+PS) after treatment with desipramine (0.820 ± 0.048, n = 6, p = 0.036) or maprotiline (0.814 ± 0.037, n = 6, p = 0.05) in comparison with citalopram administration (0.749 ± 0.058, n = 6). It is exactly the opposite for (PI+PS)/SUM ratio (Fig. 2). It seems that representation of PS is responsible for this effect because statistically significant decrease was found in ratio of PS/SUM after treatment with desipramine (0.082 ± 0.040, n = 6, p = 0.038) or maprotiline (0.080 ± 0.032, n = 6, p = 0.034) in comparison with citalopram administration (0.135 ± 0.048, n = 6). Plasma membranes microviscosity The results for DPH and TMA-DPH probes in membranes isolated from the brain are shown in Table 2. There were no significant changes in fluorescence anisotropy of DPH or TMA-DPH after antidepressant administration in comparison with controls. Relatively most change in fluorescence anisotropy of DPH was observed after the desipramine administration (decrease by 1.5 %). Statistically significant increase in fluorescence anisotropy of DPH was found after treatment with citalopram in comparison with desipramine administration (p = 0.018) and in fluorescence anisotropy of TMA-DPH after treatment with citalopram (p = 0.011) or moclobemide (p = 0.046) compared with desipramine. Mutual relations between variables Mutual relations between variables given in Table 1 were tested by means of a correlation coefficients matrix (Table 3). Spearman correlations that were calculated from 45 cases consist of controls plus antidepressants administered rats. In accordance with what had been expected, a significant positive correlation between the relative representations of individual phospholipids and their sum was found. A significant negative correlation between the relative representation of CH and electroneutral phospholipids (PC, PE, and SM) was discovered. Correlations between CH and acidic phospholipids (PS, PI) were negative but statistically no
230
Fišar et al.
Figure 2. Relative representation of molar concentrations of main electroneutral phospholipids (PC+PE+SM), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylserine (PS), and PI+PS, respectively, in plasma membranes isolated from rat’s brains following 4-week administration of various antidepressants (in relation to sum of individual phospholipids molar concentrations; SUM = PC+PE+SM+PI+PS). Values are means ± S.D. The means were calculated from 15 values in case of control group and from 6 values in all other groups. Marked values are significantly different from citalopram-treated rats at * p < 0.05; determined by ANOVA and post hoc Duncan’s test.
significant. Fluorescence anisotropy both in DPH and TMA-DPH probe did not correlate with other variables due to very small changes in this parameter after antidepressant administration; there was only a significant mutual relation between DPH and TMA-DPH fluorescence anisotropy characterized by correlation coefficient R = 0.782 (p < 0.0001). Discussion Our study is a contribution to the understanding the role of membrane lipids in the treatment of depressive disorder. Disturbances in the lipid metabolism in depression
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
231
Table 2. Fluorescence anisotropy of DPH and TMA-DPH in plasma membranes isolated from rat’s brains following 4-week administration of various antidepressants Group
DPH
Controls Desipramine Maprotiline Citalopram Moclobemide Lithium
0.2074 0.2043 0.2055 0.2090 0.2079 0.2054
± ± ± ± ± ±
TMA-DPH
0.0036 0.0020 0.0017 0.0038 * 0.0025 0.0016
0.2547 0.2529 0.2540 0.2570 0.2560 0.2534
± ± ± ± ± ±
0.0023 0.0025 0.0022 0.0031 * 0.0019 * 0.0021
Values are means ± S.D. The means were calculated from 15 values in case of control group and from 6 values in all other groups. DPH, 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene; TMA-DPH, 1-(4-trimethylammoniumphenyl)-6-phenyl-1,3,5-hexatriene. Values after antidepressant treatment are not significantly different from controls. Marked values are significantly different from desipramine-treated rats at * p < 0.05; determined by ANOVA and post hoc Duncan’s test.
Table 3. Relation between relative representation of molar concentrations of phospholipids and cholesterol in brain plasma membranes (Table 1) determined as correlation coefficients (Spearman R) PE PC PE SM PI PS PI+PS SUM
0.523*** 1.000
SM 0.701*** 0.548*** 1.000
PI 0.520*** 0.297* 0.457** 1.000
PS 0.455** 0.302* 0.245 0.434** 1.000
PI+PS
SUM
0.569*** 0.401** 0.386** 0.829*** 0.841*** 1.000
0.921*** 0.623*** 0.783*** 0.632*** 0.603*** 0.722*** 1.000
CH −0.719*** −0.315* −0.404** −0.230 −0.276 −0.270 −0.573***
Spearman correlations between each pair of variables were calculated from 45 cases (controls plus antidepressants administered rats). PC, phosphatidylcholine; PE, phosphatidylethanolamine; SM, sphingomyelin; PI, phosphatidylinositol; PS, phosphatidylserine; SUM, sum of individual phospholipid molar concentrations (PC+PE+SM+PI+PS); CH, cholesterol. Marked correlations are significant at * p < 0.05, ** p < 0.01 or *** p < 0.001.
and restoration of balance by antidepressants are supposed by many hypotheses of affective disorders. However, the connection between changes in lipid pattern in brain plasma membranes and long-term administration of therapeutically effective doses of antidepressants has not been sufficiently demonstrated so far. In this study, hypothesis was tested that the changes in the lipid composition of plasma membranes from brain could be included in the common adaptive effect of long-term administration of antidepressants. We investigated the effects of five an-
232
Fišar et al.
tidepressants (that differ in primary pharmacological selectivity) on the cholesterol and phospholipid composition and “microviscosity” of brain membranes. Antidepressants were given to laboratory rats for the period of 28 days, which is sufficient for realization of adaptive cellular changes owing to drugs. Changes in the length and saturation of acyl chains of membrane phospholipids were not measured in our study and interpretation of results is aggravated by the facts that the biochemical response of the rat after long-term administration of antidepressants need not be equal to the response in man. Plasma membranes isolated from the whole brain of experimental animals were analyzed. Unfortunately, there is no single procedure that results in the quantitative recovery of all membrane lipids, so the absolute values of ratios determined can be shifted. We acidified the initial dichloromethane/methanol mixture for the recovery of acidic phospholipids, but the acidity leads to cleavage of PE plasmalogen. We did not solve this problem because the aim of our study was the determination of relative changes in lipid composition in membrane lipids after long-term administration of antidepressants and because lipids were extracted by the same technique for all groups. The results summarized in Table 1 and Fig. 2 showed that long-term administration of antidepressants had influence on lipid composition of cell membranes in the brain. However, the variability of individual results, as reflected by S.D., is rather high, which limits the statistical significance. The reason for the high variability is not known, as both non-normally distribution of values and dietary or seasonal variations can be ruled out in our study. We have demonstrated that treatment with antidepressants evidently influenced the composition of lipid classes in the brain plasma membranes. Maprotiline, citalopram and moclobemide significantly decreased PE representation when compared to control group (Table 1). Although it is known that some antidepressants stimulate PS synthesis (Singh et al. 1992; Bobeszko et al. 2002) we did not observe any significant increase in PS in the brain plasma membranes (Table 1). Statistically significant decrease in ratio PS to sum of individual phospholipids was found after treatment with desipramine or maprotiline when compared with citalopram-treated group (Fig. 2). The decrease in relative representation of electroneutral phospholipids was found systematically decreased after administration of all tested antidepressants except for desipramine; reduction of the conversion of PS to PE by amphiphilic cationic antidepressants (Kanfer and McCartney 1993) could participate in this effect. No statistically significant but apparent decrease in cholesterol representation in brain membranes after long-term administration of desipramine and the increase in cholesterol after citalopram or lithium (Table 1) may be of great importance, as cholesterol strongly affects the properties of lipid bilayer and function of some membrane transporters, including serotonin transporter (Scanlon et al. 2001). Based on these findings, we can assume that the effects of lithium and antidepressants differing in pharmacological selectivity could be related partly to the changes of cholesterol and phospholipids content in cell membranes and hence
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
233
resulting changes in the membrane proteins (e.g. serotonin or norepinephrine receptors and transporters) function. This cell membrane impact may be brain specific due to the fact that the concentration of antidepressants in the brain significantly exceeds their concentration in the periphery (Fišar et al. 1996). The opposite effects of desipramine administration in comparison with citalopram or with other tested antidepressants could be related to a nonspecificity of desipramine biochemical action. Method of fluorescent probes with hydrophobic DPH and amphiphilic TMADPH membrane probes was used to determine relative changes in structural and physicochemical properties of specific membrane regions following long-term administration of various antidepressants. The rotational flexibility of DPH or TMADPH within the membrane expressed as steady-state fluorescence anisotropy gives information on the surrounding of the lipid environment of the probes (Lentz 1993). TMA-DPH showed fluorescence anisotropy values that were significantly higher with respect to DPH, suggesting a localization of the fluorescent portion of TMA-DPH in a more ordered region of membrane. Surprisingly, DPH and TMADPH fluorescence anisotropy measurements in plasma membranes isolated from the brain did not show any marked changes when compared to controls except for desipramine effect (Table 2). Decrease in the fluorescence anisotropy after the desipramine administration was observed in usage of both DPH and TMA-DPH probe. It emerges from in vitro experiments (Sanganahalli et al. 2000) that predominant cause of the desipramine effect on membrane dynamic is not direct influence of drug on membrane structure. This result can be interpreted as a change in membrane dynamic properties both in the hydrophobic core of the membrane, where the DPH probe is localized (Kaiser and London 1998), and in the membrane/water interface, which is the target of TMA-DPH probe (Prendergast et al. 1981). Fluorescence anisotropy of both DPH and TMA-DPH was slightly increased after citalopram administration (Table 2). This increase was statistically significant when compared to desipramine administration, which could be related to the opposite effect of drugs on membrane cholesterol and/or phospholipids (Table 1). However, the increase in relative cholesterol content after lithium administration (Table 1) was not expressed in the expected increase in fluorescence anisotropy. Our results do not clearly indicate the reason for this fact. Overall, the changes in steady-state fluorescence anisotropy of DPH or TMADPH produced by antidepressants cannot be assessed as very distinct. Accordingly, there are no substantial changes in dynamic properties of brain plasma membranes. However, both the time-resolved fluorescence spectroscopy and fatty acid analysis is required for detailed study of the effect of long-term treatment with antidepressants on membrane dynamic properties. Long-term administration of antidepressants has rather small effect on relative representation of cholesterol and individual phospholipids in brain plasma membrane; the structure and dynamic properties of the brain plasma membrane does not show significant impairment compared to controls. Possible changes in cell
234
Fišar et al.
membranes fluidity could be considered as non-specific signs of a depressive disorder even in the case they were registered during the administration of antidepressants. We found in previous experiments that the increase in limiting permeability of the platelet membranes for serotonin could be included in the common adaptive effect of the long-term administration of antidepressants that differ in pharmacological selectivity (Fišar et al. 2005). Our results indicate that increased activity of serotonin transporter is caused rather by changes in cholesterol-transporter or phospholipid-transporter interactions, then by changes in membrane microviscosity. It is difficult to interpret relation between changes in the composition brain lipids and therapeutic effects of antidepressants, because membrane lipids affect great number of cellular processes resulting in very different physiological effects. Nevertheless, our results support hypothesis about the role of adaptive changes of membrane cholesterol and phospholipids in mechanisms of action of antidepressants. Acknowledgements. This work was supported by GA UK No. 27/2000/C and MSM 111100001 grants.
References Barenholz Y. (2002): Cholesterol and other membrane active sterols: from membrane evolution to “rafts”. Prog. Lipid Res. 41, 1—5 Bartlett, G. R., 1959. Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem. 234, 466—468 Bobeszko M., Czajkowski R., Wójcik M., Sabala P., Lei L., Nalepa I., Bara´ nska J. (2002): Modulation by cationic amphiphilic drugs of serine base-exchange, phosholipase D and intracellular calcium homeostasis in glioma C6 cells. Pol. J. Pharmacol. 54, 483—493 Burger K., Gimpl G., Fahrenholz F. (2000): Regulation of receptor function by cholesterol. Cell. Mol. Life Sci. 57, 1577—1592 Chang M. C., Jones C. R. (1998): Chronic lithium treatment decreases brain phospholipase A2 activity. Neurochem. Res. 23, 887—892 Fielding C. J., Fielding P. E. (2003): Relationship between cholesterol trafficking and signaling in rafts and caveolae. Biochim. Biophys. Acta 1610, 219—228 Fišar Z., Krulík R., Fuksová K., Sikora J. (1996): Imipramine distribution among red blood cells, plasma and brain tissue. Gen. Physiol. Biophys. 15, 51—64 Fišar Z., Fuksová K., Velenovská M. (2004): Binding of imipramine to phospholipid bilayers using radioligand binding assay. Gen. Physiol. Biophys. 23, 77—99 Fišar Z., Anders M., Kališová L. (2005): Effect pharmacologically selective antidepressants on serotonin uptake in rat platelets. Gen. Physiol. Biophys. 24, 113—128 Folch J., Lees M., Sloane Stanley G. H. (1957): A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497—509 Herbette L. G., Chester D. W., Rhodes D. G. (1986): Structural analysis of drug molecules in biological membranes. Biophys. J. 49, 91—94 Honegger U. E., Roscher A. A., Wiesmann U. N. (1983): Evidence for lysosomotropic action of desipramine in cultured human fibroblasts. J. Pharmacol. Exp. Ther. 225, 436—441 Jope R. S. (1999): Anti-bipolar therapy: mechanism of action of lithium. Mol. Psychiatry 4, 117—128
Effect of Antidepressants on the Brain Lipids
235
Kaiser R. D., London E. (1998): Location of diphenylhexatriene (DPH) and its derivatives within membranes: comparison of different fluorescence quenching analyses of membrane depth. Biochemistry 37, 8180—8190 Kanfer J. N., McCartney D. G. (1993): Modulation of the serine base exchange enzyme activity of rat brain membranes by amphiphilic cations and amphiphilic anions. J. Neurochem. 60, 1228—1235 Kato T., Inubushi T., Kato N. (1998): Magnetic resonance spectroscopy in affective disorders. J. Neuropsychiatry Clin. Neurosci. 10, 133—147 Koul A., Prasad R. (1996): Extraction of membrane lipids. In: Manual on Membrane Lipids. pp. 37—51, Springer, Heidelberg Lakowicz J. R. (1999): Principles of Fluorescence Spectroscopy (2nd ed.), Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York Lee A. G. (2003): Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta 1612, 1—40 Lentz B. R. (1993): Use of fluorescent probes to monitor molecular order and motions within liposome bilayers. Chem. Phys. Lipids 64, 99—116 Li P. P., Warsh J. J., Stanacev N. Z. (1988): In vitro and ex vivo effects of antidepressants on rat brain membrane-bound phosphatidylinositol synthetase activity. Neurochem. Res. 13, 789—795 Lopez-Corcuera B., Gimenez C., Aragon C. (1988): Change of synaptic membrane lipid composition and fluidity by chronic administration of lithium. Biochim. Biophys. Acta 939, 467—475 Lowry O. H., Rosbrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. (1951): Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265—275 Lüllmann-Rauch R., Nassberger L. (1983): Citalopram-induced generalized lipidosis in rats. Acta Pharmacol. Toxicol. (Copenh.) 52, 161—167 Maes M., Smith R., Christophe A., Vandoolaeghe E., Van Gastel A., Neels H., Demedts P., Wauters A., Meltzer H. Y. (1997): Lower serum high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) in major depression and in depressed men with serious suicidal attempts: relationship with immune-inflammatory markers. Acta Psychiatr. Scand. 95, 212— 221 Manji H. K., Moore G. J., Chen G. (1999): Lithium at 50: have the neuroprotective effects of this unique cation been overlooked? Biol. Psychiatry 46, 929—940 Mitchell R. H., Hawthorne J. N. (1965): The site of diphosphoinositide synthesis in rat liver. Biochem. biophys. Res. Commun. 21, 333—338 Moor M., Honegger U. E., Wiesmann U. N. (1988): Organspecific, qualitative changes in the phospholipids composition of rats after chronic administration of the antidepressant drug desipramine. Biochem. Pharmacol. 37, 2035—2039 Navidi M., Yoa F. G., Sun G. Y. (1991): Brief chronic effects of lithium administration on rat brain phosphoinositides and phospholipids. J. Neurosci. Res. 28, 428—433 Ohvo-Rekilä H., Ramstedt B., Leppimäki P., Slotte J. P. (2002): Cholesterol interactions with phospholipids in membranes. Prog. Lipid Res. 41, 66—97 Pettegrew J. W., Short J. W., Woessner R. D., Strychor S., McKeag D. W., Armstrong J., Minshew N. J., Rush A. J. (1987): The effect of lithium on the membrane molecular dynamics of normal human erythrocytes. Biol. Psychiatry 22, 857—871 Pettegrew J. W., Panchalingam K., McClure R. J., Gershon S., Muenz L. R., Levine J. (2001): Effects of chronic lithium administration on rat brain phosphatidylinositol cycle constituents, membrane phospholipids and amino acids. Bipolar Disord. 3, 189—201 Pfrieger F. W. (2003): Role of cholesterol in synapse formation and function. Biochim. Biophys. Acta 1610, 271—280 Plášek J., Jarolím P. (1987): Interaction of the fluorescent probe 1,6-diphenyl-1,3,5hexatriene with biomembranes. Gen. Physiol. Biophys. 6, 425—437
236
Fišar et al.
Prendergast F. G., Haugland R. P., Callahan P. J. (1981): 1-[4-(trimethyamino)phenyl]6-phenylhexa-1,3,5-triene: synthesis, fluorescence properties, and use as a fluorescence probe of lipid bilayers. Biochemistry 20, 7333—7338 Racagni G., Brunello N. (1984): Transynaptic mechanisms in the action of antidepressant drugs. Trends Pharmacol. Sci. 5, 527—531 Rando R. R. (1988): Regulation of protein kinase-C activity by lipids. FASEB J. 2, 2348— 2355 Sandermann H., Duncan T. M. (1991): Lipid-dependent membrane enzymes – kinetic modeling of the activation of protein-kinase-C by phosphatidylserine. Biochim. Biophys. Acta 1069, 235—240 Sanganahalli B. G., Joshi P. G., Joshi N. B. (2000): Differential effects of tricyclic antidepressant drugs on membrane dynamics – a fluorescence spectroscopic study. Life Sci. 68, 81—90 Scanlon S. M., Williams D. C., Schloss P. (2001): Membrane cholesterol modulates serotonin transporter activity. Biochemistry 40, 10507—10513 Scott L., Schell M. J., Hubbard A. L. (1993): I. Isolation and analysis. In: Methods in Molecular Biology (Eds. J. M. Graham and J. A. Higgins), Biomembrane Protocols, Vol. 19, Humana Press, Totowa, New Jersey Seydel J. K., Coats E. A., Cordes H. P., Wiese M. (1994): Drug membrane interaction and the importance for drug transport, distribution, accumulation, efficacy and resistance. Arch. Pharm. (Weinheim) 327, 601—610 Shinitzky M. (1984): Membrane fluidity and receptor function. In: Membrane Fluidity (Eds. M. Kates and L. A. Manson), pp. 585—601, Plenum Publ. Corp., New York Singh I. N., Massarelli R., Kanfer J. N. (1992): Modulation of phosphatidylserine homeostasis by amphiphilic cations in a human neuronal cell line, LA-N-2. J. Lipid Mediat. 5, 301—311 Stahl S. M. (2000): Essential Psychopharmacology. Neuroscientific Basis and Practical Applications (2nd ed.), Cambridge University Press, Cambridge Stoffel P., Burkart T., Honegger U. E., Wiesmann U. N. (1987): Subcellular distribution of the antidepressant drug desipramine in cultured human fibroblasts after chronic administration. Drug-effect on the subcellular distribution of accumulated phospholipids. Biochem. Pharmacol. 36, 655—662 Sulser F., Janowsky A. J., Okada F., Manier D. H., Mobley P. L. (1983): Regulation of recognition and action function of the norepinephrine (NE) receptor-coupled adenylate cyclase system in brain: implications for the therapy of depression. Neuropharmacology 22, 425—431 Toplak H., Zuehlke R., Loidl S., Hermetter A., Honegger U. E., Wiesmann U. N. (1990): Single and multiple desipramine exposures of cultured cells. Changes in cellular anisotropy and in lipid composition of whole cells and of plasma membranes. Biochem. Pharmacol. 39, 1437—1443 Tsakiris S., Deliconstantinos G. (1984): Influence of phosphatidylserine on (Na+ /K+ )stimulated ATPase and acetylcholinesterase activities of dog brain synaptosomal plasma-membranes. Biochem. J. 220, 301—307 Tvrzická E., Mareš P., Písaříková A., Novakovic J., Hrabák P. (1991): Simplified gas chromatographic method for the simultaneous determination of phytosterols and cholesterol. J. Chromatogr. 563, 188—192 Xia Z., Ying G., Hansson A. L., Karlsson H., Xie Y., Bergstrand A., DePierre J. W., Nässberger L. (2000): Antidepressant-induced lipidosis with special reference to tricyclic compounds. Prog. Neurobiol. 60, 501—512 Final version accepted: January 25, 2005
Příloha 6: FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; ANDERS, Martin; SIKORA, Jan; FUKSOVÁ, Květoslava; KOVÁŘŮ, Hana and DOBROVSKÝ, Karel. Platelet serotonin uptake in depressed patients during treatment. Homeostasis. 1998, vol. 38, no. 4, p. 172-173.
Příloha 7: KALIŠOVÁ-STÁRKOVÁ, Lucie; FIŠAR, Zdeněk; PACLT, Ivo; HANUŠ, Zdeněk and VEVERA, Jan. Red blood cell triiodothyronine uptake as membrane parameter of depression. Physiol. Res. 2005, [Epub ahead of print].
Red blood cell triiodothyronine uptake as membrane parameter of depression
Kališová – Stárková Lucie, Fišar Zdeněk, Paclt Ivo, Hanuš Zdeněk, Vevera Jan
Department of Psychiatry, First Faculty of Medicine, Charles University, Ke Karlovu 11, 128 01, Prague 2, Czech Republic Tel.: +420-224965313 fax: +420-224923077 E-mail address: [email protected]
Short title: Erythrocyte L-T3 uptake as parameter of depression
Summary
We tested the hypothesis considering the role of hypothalamic-pituitary-thyroid axis (HPT), L-triiodothyronine (L-T3) uptake into erythrocytes, and the role of the membrane lipids in the development and treatment of affective disorders. Changes in kinetic parameters (Vmax, maximal velocity and KM, apparent Michaelis constant) of L-T3 uptake into red blood cells (RBCs) and changes in membrane fluidity in a group of 24 patients with major depression before treatment and after 1 month of treatment with citalopram were measured. Parameters Vmax and KM, as well as membrane microviscosity, were significantly increased in depressed patients both before and after treatment in comparison with healthy subjects. We concluded that the function of the membrane transporter for L-T3 in RBC is changed in depression. This change is probably connected with the alteration of membrane fluidity and/or transporter–lipid interactions. We did not find any normalization of the measured parameters after 1 month of treatment. Results show the importance of composition and physical properties of lipid bilayer in transmembrane transport of L-T3 and support the hypothesis of HPT axis disturbance in depression.
Keywords: Depression; Erythrocyte; Fluidity; Triiodothyronine; Uptake
2
Introduction
The aetiology of affective disorders has not yet been sufficiently clarified. One of the possible factors influencing the development of mood disorders might be a modified function of hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis. Numerous researches focusing on patients who suffer from affective disorders, repeatedly confirmed aberrations of the HPT axis function (Joffe et al.1993, Sullivan et al. 1997). In thyrotropin releasing factor (TRF) tests approximately 30% of clinically euthyroid depressive patients showed e.g. an altered response of thyroid stimulating hormone (TSH) to TRF, transient hyperthyroxinemia in serum and a flattening of the TSH diurnal rhythm. In some cases there was also a lowered transthyretin level in the cerebrospinal fluid, an increased level of antibodies against thyroid peroxidase and other responses (Bauer and Whybrow 2001, Kirkegaard et al. 1998, Loosen 1988, Pop et al.1998, Styra et al. 1991). All the presented parameters seem to be “state markers” since after a patient is cured of depression the parameters tend to return to normal levels. The basic cause of the changes, however, is not quite clear. There is evidence that the mediator-system function is affected by the membrane transfer. The changes in the cell membranes may then reflect the changes on the system level. The present scientific knowledge suggests that erythrocytes, though they are not the target cells for the thyroid hormones, can participate in their transport (Crispell et al. 1956, Angel et al. 1990, Yamauchi et al. 1989). Thyroxine (T4) enters the red blood cells (RBC) by free diffusion (Galton et al. 1996); L-T3 permeates through the erythrocyte membrane by facilitated diffusion, via the Na+ independent stereo-specific saturable transport system (Holm and Jacquemin 1979, Docter et al. 1982, Osty et al. 1990). Red blood cells seem to function as a reservoir pool of the hormone (Osty et al. 1988, 1990).
3
The function of membrane transport systems - velocity and efficiency of the L-T3 uptake into the erythrocytes - can be evaluated by two kinetic parameters: Vmax - maximal transport velocity into the cells, reflecting the existence of the saturable amount of membrane transporters; and KM - apparent Michaelis constant, defined as extracellular concentration of the transported substance, when the transport velocity into the cell equals ½ Vmax. The KM value is close to the value of dissociation binding constant of transporter–L-T3 complex, and KM is also the affinity criterion between the transporter and substrate. The activity of the membrane transporters can be equally influenced by the properties of the lipid membrane component, mainly by the composition, structure and ordering of the lipid bilayer. The membrane microviscosity (reciprocal value of fluidity) is the parameter which characterizes rotational motility and average ordering of membrane molecules; the changes of the microviscosity can be qualitatively determined by means of measurement of fluorescence anisotropy of an hydrophobic fluorescence probe. The parameter concerned serves to express relative changes of the membrane dynamic properties caused by alteration of membrane lipid composition or by physical or chemical factors (including effects of psychotropic drugs). An important modulator of microviscosity is the proportion of membrane phospholipids and cholesterol, presence of unsaturated fatty acids side chains in membrane lipids, and the amount of oligosaccharides in membrane glycolipids and glycoproteins. 1,6-Diphenyl-1,3,5hexatriene (DPH) is the hydrophobic fluorescence probe most frequently used to study changes in the lipid bilayer microviscosity. Membrane microviscosity is a factor affecting both the lateral and transversal motion of membrane proteins (receptors, ion channels, enzymes, transporters). Specific changes in their function can be caused by the lipid – protein interactions. Special attention is paid to the role of cholesterol and acidic phospholipids (phosphatidylserine and phosphatidylinositol) in the activation of membrane components of signal transduction systems. As far as the L-T3 transporter in erythrocyte membranes is
4
concerned, the dependence of their L-T3 binding parameters on phospholipid membrane composition has been described by a previous author (Samson et al. 1996). Our experiments used RBCs isolated from peripheral human blood. Radiolabelled L-T3 uptake into erythrocytes was measured by the method we had modified, and the kinetic parameters were measured before treatment, and after one month of treatment with citalopram (an antidepressant functioning primarily as a selective serotonin reuptake inhibitor). Consequently, the results were compared with the healthy controls. As the activity of the LT3 transporter can be affected by the properties of the lipid part of the cell membrane, plasma membranes (ghosts) were isolated from erythrocytes, and using the fluorescence probe, changes in their lipid bilayer fluidity were identified. We tried to determine to what extent depression and administration of citalopram could affect the L-T3 uptake into erythrocytes, and whether there exists a correlation between the membrane changes that have been mentioned, L-T3 uptake parameters, and clinical evaluation. These results evoked discussion of the hypothesis considering the role of HPT axis, L-T3 uptake into erythrocytes, and the role of the membrane lipids in development and treatment of the affective disorders. In our project we sought to verify the following assumptions: 1. The L-triiodothyronine membrane transport of the depressive patients differs from that of the healthy controls, and reflects the changes on the system level; 2. The membrane transport system function is influenced by the change of membrane fluidity; 3. By taking antidepressants, the depressive patients’ parameters return to normal levels.
Methods
Patients and the clinical evaluation of depression
5
Twenty-four people suffering from major depression participated in the project (diagnoses F 32.0-F 32.3.; F 33.1-F33.2 according to ICD 10; major depressive disorder single episode or recurrent mild, moderate or severe – DSM IV). In this group (mean age ± S.D. = 37 ± 13 years, range: 19-60 years) there were 12 females (mean age ± S.D. = 39 ± 10) and 12 males (mean age ± S.D. = 36 ± 15). None of them, at the time of their joining the project, had been taking any antidepressants for at least five months. The majority of them were diagnosed as suffering from depression for the first time; 20 of them were ‘drug naive’. The patients were clinically evaluated on the base of a structured interview regarding valid diagnostic criteria with the psychiatrist at Psychiatric Clinic Prague, who made diagnose of major depression. Patients were then assessed using the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD) (Hamilton 1960) and with the Beck Self-Assessment Depression Rating Scale (BECK) (Beck et al. 1974). All the participants were comprehensively informed about the project, consented to the conditions and provided written consent. Between 8:00 and 10:00 am, after the clinical checkup, we took 7 ml of blood from them to examine free thyroxine (fT4) and TSH levels and 4 ml of non-coagulable blood to measure the kinetic parameters of L-T3 uptake into erythrocytes and for the subsequent measurement of membrane fluidity in the ghosts. The study included clinically euthyroid persons only; none of them had ever been treated with any HPT axis affecting medication. The standard values fall into interval 9.8 – 23.1 pmol/l for fT4 and 0.500 – 6.00 mIU/l for TSH. After the clinical check-up and the initial sampling, all the depressive patients were medicated with citalopram (Seropram, Citalec) at a dose of 20 – 60 mg/day. One month later (28-31 days) all the patients were clinically assessed with the HAMD and BECK and 4 ml of blood was taken for measurement of kinetic parameters of LT3 uptake and for measurement of erythrocyte ghosts’ membrane fluidity. In the course of the second evaluation and sampling five people were withdrawn from the project, as they no
6
longer fulfilled the criteria of the study (for example they had changed antidepressant, had discontinued the drug, were unable to attend the clinic at the planned time; etc.). The control group consisted of people of corresponding age and the same nutritional status, who had not been treated either for psychiatric disorders or for thyroid gland dysfunction. There were 19 subjects in the control group, all of whom were screened during interviews with a psychiatrist for the presence of depressive symptoms. None of controls fulfilled the criteria for major depression. A 4 ml sample of blood was taken from the controls for measurement of the L-T3 erythrocyte uptake kinetic parameters, and subsequent measurement of the erythrocyte ghosts’ membrane fluidity.
Chemicals and solutions 800 nM [125I] L-T3 solution with specific activity 16 kBq/ml was prepared by mixing of buffer T (125 mM NaCl, 20 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM glucose, 4.05 mM Na2HPO4, 0.95 mM NaH2PO4; before use effervesced with 95% O2 and 5% CO2, pH 7) with unlabelled (cold) L-T3 (Sigma) solution and [125I]L-T3 stock solution (specific activity of 114 MBq/µg, Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., England). Samples were filtered through the glass microfiber filters (Whatman, type GF/C), which were impregnated in 0.1% polyethyleneimine (Sigma) and filters were washed with buffer A (120 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM Tris, 10 µM L-T3, pH 7.4). The hydrophobic membrane probe 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH, Sigma) was used for the measurement of relative changes of plasma membrane fluidity.
Erythrocyte L-T3 uptake
Non-coagulable blood sample was mixed thoroughly and gently centrifuged in plastic test tubes; then the platelet rich plasma was taken away together with the upper layer of sediment,
7
the RBCs pellet was washed three times with cold buffer T. The RBC triiodothyronine uptake was measured using modified Osty et al. (1990) and Moreau et al. (1998, 2000) methods. Briefly, RBCs in buffer T were preincubated at 37°C for 12 minutes and the reaction was started by addition of various volumes of 800 nM [125I] L-T3 solution. The final volume of the sample for the uptake measurement was 2 ml with concentration of the cells 108 RBC/ml and the final L-T3 concentrations were in the range of 4 nM and 240 nM. The test tubes were filled with 95% O2 and 5% CO2 gas mixture, sealed and incubated at 37°C for 15 min. It was verified that even after the time concerned the increase of the L-T3 uptake into the cells is approximately linear (Fig. 1). Free and non-specifically bound L-T3 was removed by rapid filtration through the GF/C filters and the filters were measured on scintillation counter LS 6000IC (Beckman). Non-saturable L-T3 uptake (passive transport) was determined by measurement of the samples incubated in 2°C.
Erythrocyte ghosts fluidity
Plasma membranes from RBCs (ghosts) were isolated using the technique reported by Dodge et al. (1963). The ghosts were re-suspended in 1.5 ml of buffer, 10 µl were taken out for measuring phosphorus (Bartlett 1959, Wagner et al. 1962) and the sample was frozen. Membrane fluidity was measured using method of fluorescence probes (Lakowicz 1999). The resultant DPH concentration was 2 µM, and the concentration of phospholipids was approximately 100 µM. Fluorescence anisotropy was measured on the spectrofluorometer FluoroMax-3 (Jobin Yvon, Horiba) after the 60 minutes incubation at 37°C.
Data analysis
8
Erythrocyte L-T3 uptake is a passive saturable carrier-mediated transport process (facilitated diffusion) obeying simple Michaelis-Menten kinetics with an apparent Michaelis constant KM and maximal velocity Vmax. For calculation of the required kinetic parameters we used nonlinear regression analysis - the AccuFit Saturation Two-Site software (Beckman). Limiting permeability at low (physiological) L-T3 concentrations was calculated as Vmax/KM ratio. Vmax/KM is an efficiency criterion of the transport system.
Statistical Analysis
All the values are presented as mean ± standard deviation (S.D.), or ± 95% confidence interval (CONF95). Wilcoxon matched pairs test was used to compare the responses from the depressed patients before and after treatment with citalopram. The Mann-Whitney U test was used to compare the responses from the controls and from the depressed patients both before and after treatment with citalopram. Spearman R was used to quantify relation between two quantitative parameters; pairwise deletion of missing data in correlation matrix was used. Normality of distribution has been verified by the Chi-square test of goodness of fit and by the Kolmogorov-Smirnov one sample test. Application of t-tests and Pearson correlation coefficient results in very similar statistics as nonparametric methods mentioned above.
Results
Clinical assesment and parameters of erythrocyte L-T3 uptake were determined in 24 depressive patients before the beginning of the treatment and in 19 of them after 1 month of pharmacotherapy with citalopram taken at a daily dose 20-60 mg. Following one month
9
treatment with citalopram the depressive patients showed a significant decrease in BECK (p=0.00013) and HAMD (p = 0.00013) score (Table 1). The depressive patients before treatment showed significantly enhanced kinetic parameters of RBC L-T3 uptake in comparison with the controls (Table 2) both for KM (p=0.026) and Vmax (p=0.0077). After one-month treatment with citalopram the values of uptake parameters remained significantly increased compared to the control values (p=0.0090 for KM; p=0.015 for Vmax). We detected no statistically significant change of the measured parameters after one-month treatment in comparison with the values before the beginning of citalopram administration both for KM (p=0.63) and Vmax (p=0.65). When the data from the females and males were processed separately, the results remained qualitatively unchanged. From the values KM and Vmax the limiting permeability was calculated (Vmax/KM) at low (physiological) L-T3 concentrations (Table 2). Compared to the controls, there were no significant changes of this parameter either in depression before the treatment (p = 0.54), or after the treatment with citalopram (p = 0.34). The relatively greatest, although statistically no significant, change of Vmax/KM appeared in comparison of values before and after the treatment (p = 0.21). Fluorescence anisotropy of DPH (rDPH) in ghosts of depressive patients before the treatment was found statistically significantly increased compared to the controls (p = 0.030; Table 2). After one-month of treatment with citalopram only a slight decrease in this parameter was observed (p = 0.11). Mutual relations between the measured parameters were tested by means of correlation coefficients matrix (Table 3). A significant correlation between the clinical evaluation before treatment and after the one-month citalopram administration was discovered; the correlation was determined using the score of HAMD or BECK. Significant correlations were also observed between KM and Vmax values, both before, and after the treatment; the same relation
10
between KM a Vmax also is valid for the controls. No significant correlation between fluorescence anisotropy of DPH in ghosts and other measured variables was found.
Discussion
The data presented here confirms the significance of RBCs in blood transport and homeostasis of L-T3. The data we collected show that kinetic parameters of L-T3 uptake into erythrocytes are increased in the depressive patients before the treatment when compared with the group of controls. In the course of the pharmacotherapy, these parameters did not significantly change (Table 2). All the patients were euthyroid and were responding well to the treatment (Table 1). Further on, we detected enhanced fluorescence anisotropy of the DPH probe in erythrocyte membranes in the depressive persons both before and after the onemonth treatment with citalopram (Table 2). As fluorescence anisotropy of DPH reflects the degree of the probe movement restriction in anisotropic membrane environment, and by the same token, the degree of movement restriction of membrane molecules, we can assume that the change of kinetic parameters of L-T3 uptake into erythrocytes in depression is to an extent affected by the change of the interaction lipid-L-T3 transporter. We found no significantly diverse values of KM, Vmax or rDPH in patients diagnosed as depressive for the first time (N=20), and in patients who had already been treated ( but more than 5 months before the beginning of the project without medication; N=4). The interpretation of the enhanced kinetic uptake parameters is not fully unequivocal. Higher Vmax can mean higher density of transporters in the membrane, or it can mean only their higher activity while the density is unchanged. The enhanced activity might be caused e.g. by specific interaction with certain membrane molecules and/or by altered dynamic
11
properties of the lipid bilayer, in which transporters are embedded. The enhanced KM value corresponds qualitatively to the decrease in L-T3 transporter affinity, i.e. it corresponds to the decrease in its capacity to bind free L-T3, in particular when in low concentrations. The decrease in affinity of the binding site for L-T3 can be conceived of either as a result of the conformation change of the binding site caused by allosteric interaction with other molecules, or as a result of the deeper embedding of the whole carrier protein into the lipid bilayer, and consequently altered accessibility of the binding site. While interpreting the changes of the uptake kinetic parameters, it is necessary to take into account the physiological concentrations of transported ligand. As for the free L-T3, the standard values move within the interval 3.28-8.20 pmol/l, considering that the detected KM constants lie within the range of tens to hundreds of nmol/l, the L-T3 transporter is in the entirely non-saturated state. In low (physiological) concentrations of free L-T3, the role of effectiveness of its uptake characterized by affinity of the L-T3 transporter rises. Vmax enhancement in depressive patients can then be easily compensated by the increase of KM (lowering of affinity). Then there can appear the situation when significantly different kinetic parameters of uptake signify higher velocity of transport into erythrocytes at nanomolar concentrations of free L-T3, while in its picomolar concentrations the velocity of the transport is virtually unchanged (Fig. 2). The change of the kinetic parameters of L-T3 uptake into RBC in depression is, according to our findings, compensated in this way and it is possible to ask to what extent the Vmax and KM change is the starting factor, or just an associated symptom of depression. The data we received enable us to discuss the role of L-T3 uptake into RBC in the development and treatment of depressive disorder, both for the changes of kinetic parameters of uptake, and the changes of dynamic properties of lipid bilayer, in which the transport protein for L-T3 is embedded. Our study draws on the results published by Moreau et al.
12
(1998, 2000), though it does not entirely confirm them. The differences in absolute values of the measured kinetic parameters KM and Vmax in our and Moreau’s study can be easily explained: each of us used a different method of separation of extracellular and intracellular L-T3. Our technique of rapid filtration has, compared to the centrifugation technique, a certain advantage: we could wash away the nonspecifically surface-bound L-T3 more rapidly. A different method, however, should not influence the prominent qualitative decrease in measured parameters detected by Moreau et al. (2000) after a four-week treatment with fluvoxamine. Our results confirm, in accordance with Moreau’s study, a significant increase in kinetic parameters of L-T3 uptake into RBC in patients suffering from depression before the beginning of the treatment (drug-free state); all the patients engaged in our study were responders. However, after one-month treatment with citalopram we did not find any significant changes in the measured parameters, i.e. they were not normalized, though the score of HAMD and BECK in all the cases dropped remarkably. By comparing both the sets in terms of the clinical parameters, we find out that Moreau’s study dealt with a slightly different group of patients – the level of depression may have been equally chosen (HAMD ± S.D. was 33.7 ± 9.6) (but Moreau used a 26 degree Hamilton scale, we used a 21 degree), only 8 patients were drug-naive, the wash out period prior to the treatment was only 7 days, and after one month 9 patients were qualified as non-responders. Our data does not sufficiently answer all the questions, although they enable a summarization that the kinetics of L-T3 uptake into RBC can be seen as a process, which gets altered in depression, however, it does not correlate directly with depressive symptoms. Most probably the point is the change of activity of membrane L-T3 transporter that is caused by altered properties of the lipid bilayer, in which carrier protein is embedded. This conclusion is supported by the evidence of the measurement of fluorescence anisotropy of DPH in plasma membranes from erythrocytes, which shows that the depressive disorder is accompanied by a
13
lowered fluidity of the membranes concerned. The cell membrane dynamic is the magnitude that affects a number of membrane enzymes, receptors, ion channels and transporters; one of the manifestations of its change could be increase in kinetic parameters of L-T3 uptake. This conclusion is supported by the results of another project we initiated (in progress), in which we measured [125I]L-T3 uptake into erythrocytes in people with hypercholesterolaemia. The increased plasma levels of cholesterol significantly correlated with the increased anisotropy of fluorescence of DPH in erythrocyte membranes compared to controls (mean ± S.D.; rDPH = 0.2376 ± 0.0071 to 0.2279 ± 0.0066, p < 0.001), and kinetic parameters of [125I]L-T3 uptake into erythrocytes were also significantly increased compared to controls (KM = 224.1 ± 127.1 to 116.1 ± 62.1 nM, p = 0.00057; Vmax = 5.91 ± 2.97 to 3.67 ± 1.77 pmol/min·108 cells, p = 0.0072). The velocity of L-T3 uptake into erythrocytes was generally decreased at increased membrane microviscosity, which was determined by limiting permeability reflecting kinetics of uptake at physiological L-T3 concentration (Vmax/KM = 0.0278 ± 0.0062 compared to 0.0345 ± 0.0105 min-1, p = 0.024). It has not yet been fully elucidated, whether the characteristics of L-T3 transporter are influenced by specific lipid-protein interactions (e.g. cholesterol-transporter, phosphatidylserine-transporter and so on), rather than by the overall dynamic state of the lipid bilayer, i.e. by arrangement and rotational and translational motility of the membrane molecules. Clinically, the work supports the hypothesis according to which we can evaluate the triiodothyronine uptake into erythrocytes as a peripheral membrane marker of a depressive disorder. The hypothesis of the altered function of the HPT axis in development and maintaining depression points towards medication of thyroid hormones for effective therapy for depression.
14
Our results support the hypothesis that even clinically euthyroid patients with depression show the change of L-T3 uptake into erythrocytes. It can be speculated that L-T3 uptake into erythrocytes can be used as subclinical marker reflecting the dysfunction of the hypothalamicpituitary-thyroid axis in pathophysiology of affective disorders. Yet the kinetic parameters of L-T3 uptake into erythrocytes do not correlate with depressive symptoms and are affected by properties of the lipid bilayer. At the same time we inter-related the hypothesis concerning the erythrocyte L-T3 uptake alteration with the membrane hypothesis of affective disorders, according to which the vulnerability to depression can originate as a result of the changes in composition and biophysical properties of the lipid component of the cell membranes.
Acknowledgments This work was supported by GA UK No. 27/2000/C and MSM 111100001 grants.
15
References ANGEL RC, BOOTTA JA, MORERO RD, FARIAS RN: Solubilization and Purification of a membrane erythrocytes associated 3,3’,5 triiodo-L-thyronine binding protein from rat. Biochem J 270: 577-82, 1990. BARTLETT GR: Phosphorus assay in column chromatography. J Biol Chem 234: 466-468, 1959. BAUER M, WHYBROW PC: Thyroid hormone, neural tissue and mood modulation. World J Biol Psychiatry 2: 59-69, 2001. BECK AT, BEAMESDERFER A: Assessment of Depression Inventory. In: Psychopharmacology, P PICHOT (ed), Basel, 1974, pp 151-169. CRISPELL KR, COLEMAN J: A study of the relative binding capacity of plasma proteins, intact human red cells, and human red cell stroma for radioactive I-131 labeled L-thyroxine. J Clin Invest 35: 475-80, 1956. DOCTER R, KRENNING EP, BOS G, FEKKES DF, HENNEMANN G: Evidence that the uptake of triiodo-L-thyronine is carrier–mediated, but not energy-dependent. Biochem J 208: 27-34, 1982. DODGE JT, MITCHELL C, HANAHAN DJ: The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes. Arch Biochem Biophys 100: 119-130, 1963. DOZIN B, CAHNMANN HJ, NIKODEM VM: 1985. Comparative characterization of thyroid hormone receptors and binding proteins in rat liver nucleus, plasma membrane and cytosol by photoaffinity labeling with L-thyroxine. Biochemistry 24: 5203-8, 1985. GALTON VA, ST GERMAIN DL, WHITTEMORE S: Celular uptake of cells. 3,5,3’ triiodothyronine and thyroxine by red blood and thymus cells. Endocrinology 118: 1918-23, 1996. HAMILTON MA: A rating scale for depression. J Neurol Neurosurg Psychiat 23: 56-62, 1960. HILLIER AP: The binding of thyroid hormone to phospholipid membranes. J Physiol 211: 585-97, 1970. HOLM AC, JACQUEMIN C: Membrane transport of L-triiodothyronine by human red cell ghosts. Biochem Biophys Res Commun 89: 1006-1017, 1979. JOFFE RT, LEVITT AJ: The thyroid axis and psychiatric ilness. American Psychiatry Press, Washington, DC, 1993, p 339. KIRKEGAARD C, FABER J: The role of thyroid hormone indepression – review. J Endocrinol 138: 1-9, 1998. 16
LAKOWICZ JR: Principles of Fluorescence Spectroscopy, Second Edition. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, Boston, Dordrecht, London, Moscow, 1999. LOOSEN PT, ARTHUR J, PRANGE JR: 1988. Serum thyrothropine response to thyrotropine releasing hormone in psychiatric patients: a review. Am J Psychiatry 139:4: 405-410, 1988. MOREAU X, AZORIN JM, LEJEUNE PJ, JEANNINGROS R.: Red blood cell triiodothyronine uptake in unipolar major depression: effect of a chronic antidepressant treatment. Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry 24: 23-35, 2000. MOREAU X, AZORIN JM, MAUREL M, JEANNINGROS R: Increase in red blood cell triiodothyronine uptake in untreated unipolar major depressed patients compared to healthy volunteers. Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry 22: 293-310,1998. OSTY J, JEGO L, FRANCON J, BLONDEAU JP: Characterization of triiodothyronine transport and accumulation in rat erythrocytes. Endocrinology 123: 2303-2311, 1988. OSTY J, VALENSI P, SAMSON M, FRANCON J, BLONDEAU JP: Transport of thyroid hormones by human erythrocytes: kinetic characterization in adults and newborns. J Clin Endocrinol Metab 71: 1589-1595, 1990. POP JK, LUC HM, LEUSINK G, VAN SON MJ, KOTTNERUS AJ, WARD M: Are autoimmune thyroid dysfunction and depression related? J Clin Endocrinol Metab 83: 31943197, 1998. SAMSON M, OSTY J, BLONDEAU JP: Identification by photoaffinity labeling of a membrane thyroid hormone binding protein associated with the triiodothyronine transport systém in rat erythrocytes. Endocrinology 132: 2470-2476, 1993. SAMSON M, OSTY J, FRANCON J, BLONDEAU JP: Triiodothyronine binding sites in the rat erythrocyte membrane: involvement in triiodothyronine transport and relation to the tryptophan transport system T. Biochim Biophys Acta 1108: 91-98, 1992. SAMSON M, OSTY J, THIBOUT H, BLONDEAU JP: Solubilization, reconstitution and molecular properties of the triiodothyronine transport protein from rat erythrocyte membranes. Eur J Endocrinol 134: 660-668, 1996. STYRA R, JOFFE R, SINGER W: Hyperthyroxinemia in major affective disorders. Acta Psychiatr Scand 81: 61-63, 1991. SULLIVAN PF, WILSON DA, MULDER RT, JOYCE PR: The hypotalamic-pituitarythyroid axis in major depression. Acta Psychiatr Scand 93: 370-378, 1997. WAGNER H, LISSAU A, HOLZI J, HORAMMER L: The incorporation of 32P into inositolphosphatides of the rat brain. J Lipid Res 3: 177-180, 1962. YAMAUCHI K, HORIUCHI R, TAKIKAWA H: Uptake of 3,5,3’-triiodothyronine in human erythrocytes. J Endocrinol 121: 585-591, 1989. 17
Table 1 Age and clinical assessment of depression in depressed patients before and after one month treatment with citalopram N
Age
BECK score
HAMD score
(years) Depressed patients before treatment Depressed patients treated 1 month with citalopram Controls
24
37.3 ± 12.6
16.1 ± 7.5
21.3 ± 4.0
19
38.5 ± 12.3
7.8 ± 4.8***
6.8 ± 3.1***
19
35.6 ± 10.5
-
-
Values are reported as mean ± S.D. Marked values are significantly different from patients before treatment at ٭٭٭p<0.001; determined by Wilcoxon test.
18
Table 2 Kinetic parameters of RBC L-T3 uptake and fluorescence anisotropy of DPH in ghosts of depressed patients before and after one month of treatment with citalopram KM
Vmax
mean
166.5*
Depressed patients before
S.D.
treatment
Vmax/KM
rDPH
5.77**
0.0356
0.2323*
68.2
2.49
0.0101
0.0065
CONF95
27.3
0.99
0.0040
0.0026
N
24
24
24
24
mean
176.0**
5.48*
0.0315
0.2316
Depressed patients treated
S.D.
68.4
2.44
0.0095
0.0083
1 month with citalopram
CONF95
30.8
1.10
0.0043
0.0039
N
19
Controls
19
19
18
mean
116.1
3.67
0.0345
0.2279
S.D.
62.1
1.77
0.0105
0.0066
CONF95
27.9
0.80
0.0047
0.0029
N
19
19
19
20
Vmax – maximal velocity of L-T3 uptake to RBC (pmol/min·108 cells ); KM – apparent Michaelis constant reflecting extracellular concentration of L-T3, when the transport velocity into cells equals ½ Vmax (nM); Vmax/KM – limiting permeability at low L-T3 concentrations (min-1); rDPH - fluorescence anisotropy of 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH), S.D. – standard deviation, N – number of values, CONF95 – 95% confidence interval for the mean. Marked values are significantly different from controls at ٭p<0.05 or ٭٭p<0.01; determined by Mann-Whitney U test. There were no significant differences in uptake parameters and fluorescence anisotropy before and after treatment.
19
Table 3 Relations between clinical evaluation, parameters of L-T3 uptake and fluorescence anisotropy of DPH of depressed patients before and after treatment with citalopram determined as correlation coefficients (Spearman R).
HAMD1 BECK1 KM1 Vmax1 Vmax1/KM1 rDPH1 HAMD2 BECK2 KM2 Vmax2 Vmax2/KM2
BECK1 0.652** 1.000
Before treatment KM1 Vmax1 Vmax1/KM1 -0.268 -0.080 0.226 -0.464* -0.466* -0.086 1.000 0.850** -0.178 0.292 1.000 1.000
rDPH1 0.372 0.212 0.097 -0.058 -0.293 1.000
HAMD2 0.666** 0.339 -0.176 0.034 0.202 0.166 1.000
After one month treatment with citalopram BECK2 KM2 Vmax2 Vmax2/KM2 0.428 0.053 -0.258 -0.436 0.583** -0.089 -0.075 -0.301 -0.339 0.223 0.119 0.114 0.225 -0.337 0.174 0.117 -0.172 -0.088 -0.040 0.153 0.344 -0.172 -0.360 -0.284 0.543* -0.041 -0.229 -0.405 1.000 -0.001 -0.008 -0.108 1.000 0.783** -0.016 1.000 0.591** 1.000
rDPH2 -0.063 -0.065 0.164 0.026 -0.172 0.061 0.031 0.143 0.094 -0.172 -0.360
HAMD – Hamilton Depressive Rating Scale score, BECK – Beck Self-Assessment Depression Rating Scale score, KM – apparent Michaelis constant for L-T3 uptake to RBC (nM), Vmax – maximal velocity of L-T3 uptake to RBC (pmol/min·108 cells), Vmax/KM – limiting permeability at low L-T3 concentrations (min-1), rDPH – fluorescence anisotropy of DPH in erythrocyte ghosts; variables measured before treatment are marked with No.1, after one month treatment with citalopram are marked with No.2. Marked correlations are significant at ٭p<0.05 or ٭٭p<0.01
20
Fig. 1. Time course of L-T3 uptake into human erythrocytes. Intact erythrocytes (108 cells/ml) were incubated in buffer T in the presence of 40 nM [125I]L-T3. One millilitre aliquots were rapidly filtered through GF/C glass fiber filters at selected time intervals. The filters were washed twice with ice-cold buffer A and measured by means of scintillation counter.
Fig. 2. Uptake L-T3 into erythrocytes at low and high concentrations of free L-T3. Velocities of L-T3 transport are calculated from KM and Vmax values stated above in Table 2. – Depressive patients before treatment (KM = 166.5 nM, Vmax = 5.77 pmol/min·108 cells), U – depressive patients after one month of citalopram administration (KM = 176.0 nM, Vmax = 5.48 pmol/min·108 cells), z – controls (KM =116.1 nM, Vmax = 3.67 pmol/min·108 cells).
21
L-T3 UPTAKE (rel. u.)
1500
1000
500
0 0
10
20
30 TIME (min)
40
50
60
UPTAKE VELOCITY 8 (fmol/10 RBC per min)
8 7
UPTAKE VELOCITY 8 (pmol/10 RBC per min)
6 5
0,3 0,2
0,1 0 3
4
5 7 FREE L-T3 (pM)
9
3 2
BEFORE TREATMENT AFTER 1 MONTH
1
CONTROLS 0 0
100
200 FREE L-T3 (nM)
300
400
Příloha 8: VEVERA, Jan; FIŠAR, Zdeněk; KVASNIČKA, Tomáš; HANUŠ, Zdeněk; STÁRKOVÁ, Lucie; ČEŠKA, Richard and PAPEŽOVÁ, Hana. Cholesterol-lowering therapy evokes time-limited changes in serotonergic transmission. Psychiatry Res. 2005, vol. 133, no. 2-3, p. 197-203.
Psychiatry Research 133 (2005) 197 – 203 www.elsevier.com/locate/psychres
Cholesterol-lowering therapy evokes time-limited changes in serotonergic transmission Jan Veveraa,b,*, Zdeneˇk Fisˇara, Toma´sˇ Kvasnicˇkac, Hanusˇ Zdeneˇka, Lucie Sta´rkova´a, Richard Cˇesˇkac, Hana Papezˇova´a a
Psychiatric Clinic, First Faculty of Medicine of Charles University, Ke Karlovu 11, 120 00 Prague, Czech Republic b School of Public Health, University of California at Berkeley, Berkeley, CA, USA c Third Medical Department, Clinical Department of Endocrinology and Metabolism, First Faculty of Medicine Charles University, Prague, Czech Republic Received 24 February 2004; received in revised form 24 September 2004; accepted 26 November 2004
Abstract A number of studies have reported an increased risk for violent deaths and depression in subjects with reduced serum cholesterol concentrations. Links with hypothesized impairment of serotonin neurotransmission have not been satisfactorily tested. In this investigation, the serum and membrane cholesterol, microviscosity of erythrocyte membranes, platelet serotonin uptake, and clinical parameters were determined during pharmacotherapy of 17 hypercholesterolemic patients. A significant decrease in serum cholesterol and a nonsignificant decrease in membrane cholesterol concentration were found after 2 months of simvastatin therapy. Serotonin transporter (SERT) activity was significantly increased following 1 month of simvastatin; the tendency to decrease the initial increase in SERT activity was evident following 2 months of therapy. Both membrane cholesterol and SERT activity returned to pre-treatment levels after more than 1 year of therapy. Microviscosity of plasma membranes, impulsivity, empathy, adventure, sensation seeking, and depressed mood were not markedly changed. These data indicate that long-term therapy has different effects on serotonin transmission from short-term (1- to 2-month) therapy. A significant increase in SERT activity was detected only during the first month of simvastatin therapy. This finding suggests that within this period some patients could be vulnerable to depression, violence, or suicide. D 2004 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. Keywords: Serotonin uptake; Microviscosity; Depression; Impulsivity
1. Introduction * Corresponding author. Psychiatric Clinic, First Medical Faculty, Charles University, Ke Karlovu 11, 120 00 Prague, Czech Republic. E-mail address: [email protected] (J. Vevera).
Since Muldoon et al. (1990) reported that cholesterol-lowering interventions are associated with a significant increase in male deaths from accidents, violence or suicide, a large body of
0165-1781/$ - see front matter D 2004 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.psychres.2004.11.005
198
J. Vevera et al. / Psychiatry Research 133 (2005) 197–203
studies have confirmed a relationship between lower cholesterol levels, depression, and suicide (Balon, 2000; Huang et al., 2003; Vevera et al., 2003). However, contradictory results have also been reported (Tanskanen et al., 2000). Increased cholesterol levels have been found in patients with painrelated syndromes (Krikava et al., 2004). Other randomized trials on hypercholesterolemic patients have not found adverse effects on mood of cholesterol-lowering treatment (Muldoon et al., 2001; Deisenhammer et al., 2004). Cholesterol is the main membrane-active sterol, which has an effect on cell growth and on the function of many membrane proteins. The functioning of a receptor or a transporter could be directly modulated by specific molecular interactions (Scanlon et al., 2001) or indirectly affected by cholesterol induced changes in membrane microviscosity and permeability. The widely accepted theory of Engelberg (1992; modified by Terao et al., 2000) states that central serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) neurotransmission is decreased via the altered microviscosity of plasma membranes caused by lowered blood cholesterol levels. Serotonin pathways function as a behavioral restraint system that inhibits impulsive behavior (Volavka, 2002). Reduced cholesterol levels could thus facilitate such complex behavior as violence towards the self or others. In the maintenance of normal serotonergic neurotransmission, a crucial role is played by the serotonin transporter (SERT), which controls the concentration of free serotonin in the brain. An important mechanism for the modulation of SERT activity is the density of transporter molecules at the cell membrane and their affinity to 5-HT. Kinetic parameters of serotonin uptake, maximal velocity (V max) and apparent Michaelis constant (K M) are used to characterize SERT activity. Previous findings indicate that SERT is regulated both by membrane cholesterol (Scanlon et al., 2001) and several regulatory proteins (Haase et al., 2001). Brain cholesterol synthesis could be affected by cholesterol-lowering medication that can cross the blood–brain barrier. Simvastatin (an inhibitor of the hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase) penetrates the blood–brain barrier (Saheki et al., 1994), and it has been demonstrated that treatment with simvastatin decreases levels of cholesterol in synap-
tosomal membranes, affects transbilayer cholesterol distribution (Kirsch et al., 2003), and reduces cholesterol turnover in the brain (Locatelli et al., 2002). Given the hundreds of studies discussing the role of cholesterol-lowering therapy on serotonin transmission (the Engelberg theory was cited in 187 articles indexed in Web of Science—January 2004), there have been surprisingly few studies examining the underlying biological mechanisms. Furthermore, the studies that have been conducted have yielded conflicting results (Ringo et al., 1994; Delva et al., 1996; Hibbeln et al., 2000; Sarchiapone et al., 2001; Papakostas et al., 2003). The aim of our study was to elucidate the effect of cholesterol-lowering therapy on membrane microviscosity and serotonin uptake and behavioral changes (depression, impulsivity, empathy, adventure). SERT activity in platelets was used as a model of SERT function in the brain (Tuomisto et al., 1979). Changes in the lipid composition of erythrocyte membranes were used to estimate changes in brain lipid composition (Chin et al., 1978; Agrawal et al., 1995).
2. Methods 2.1. Subjects and clinical assessment The study included 17 consecutively diagnosed patients with familial hypercholesterolemia (8 females, 9 males) with a mean age of 63 (S.D.=10). All patients who were diagnosed with hypercholesterolemia during the period of enrolment participated in the study. None had been diagnosed with a mental disorder. A complete psychiatric and internal medicine examination, including blood sampling, was performed before the first administration of simvastatin, after 1 and 2 months of treatment, and in nine patients, also after 13–16 months. All of the patients were medicated with simvastatin (Simvor, Ranbaxy Laboratories, London) with a 20-mg/day dosage in the evening. A clinical evaluation of the patients was performed by an experienced psychiatrist (JV). The Structured Clinical Interview MINI 5.0 was used for assessment of patients. Impulsivity, empa-
J. Vevera et al. / Psychiatry Research 133 (2005) 197–203
thy, and adventurousness were evaluated using the Eysenck IVE (impulsiveness/venturesomeness/empathy questionnaire) test, and depressive symptomatology using the 21-point Hamilton Rating Scale for Depression (HRSD). Data from the Zuckerman Sensation Seeking Scale, form V (a 40-item selfreport), and the Lecrubier et al. (1995) impulsivity rating scale (IRS) were also collected, but these two scales have not been validated in the Czech Republic. The study was approved by the ethics committee of the First Faculty of Medicine, Charles University of Prague, Czech Republic. All participants gave written informed consent.
199
the samples by measurement of phosphorus (Bartlett, 1959) concentrations. 2.3. Data analysis To calculate kinetic parameters of serotonin uptake, we used AccuFit Saturation Two-Site nonlinear regression analysis software (Beckman). Limiting permeability at low (physiological) 5-HT concentrations was calculated as the V max/K M ratio, which more properly reflects the function of the serotonin transporter (V max/K M is an efficiency criterion of transport system). 2.4. Statistical analysis
2.2. Blood processing and biochemical determinations Peripheral blood samples were obtained from the cubital vein of fasting subjects. Seven milliliters of blood were collected between 07:00 and 10:00 h into Vacutainerk vacuum test tubes (BD Vacutainer), with no additive for cholesterol and triacylglycerol determination. Levels of serum total cholesterol (TC), HDL cholesterol (HDL), and triacylglycerols (TG) were determined using enzymatic kits (Cobas, Mira, ROCHE). LDL cholesterol (LDL) was calculated by Friedewald’s formula. Four milliliters of non-coagulable blood (BD Vacutainer 9NC with 0.5 ml of 0.129 M trisodium citrate used as anticoagulant) were collected to measure the kinetic parameters of 5-HT uptake into platelets using tritium-labelled 5-HT (Tuomisto et al., 1979) and for erythrocyte ghost preparation (Dodge et al., 1963). Hydrophobic membrane probe 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH, Sigma) was used to determine changes in erythrocyte membrane microviscosity (Lakowicz, 1999). Fluorescence anisotropy (r DPH), which reflects the extent of probe movement restriction in an anisotropic membrane environment, was measured. Modified Folch (Koul and Prasad, 1996) methods were used to isolate total lipids from erythrocyte ghosts. Membrane cholesterol was analyzed by thin-layer chromatography (TLC) by chromatographic rods (silica-coated glass rods, type Chromarod SIII) with Iatroscan TH-10 (Iatron Laboratories) flame ionization detection (FID). Total phospholipids were determined in
Data are expressed as the arithmetic means. Standard deviations (S.D.) were calculated to characterize group variability. Comparisons between patients before and after cholesterol-lowering therapy were performed using analysis of variance (ANOVA), followed by post hoc Duncan’s test. Pearson correlation coefficients were used to quantify the relation between two quantitative parameters. Statistical analyses were performed with the statistical package Statistica (StatSoft, Inc.).
3. Results 3.1. Clinical evaluation Seventeen patients were examined before and after 1 and 2 months of cholesterol-lowering therapy, and nine of them were also examined after 13–16 months of therapy. No significant changes were found in impulsivity, empathy, adventurousness, and depressive symptomatology based on the Eysenck IVE, the IRS and the HRSD. The Zuckerman Sensation-Seeking Scale did not reveal any significant changes in Thrill and Adventure Seeking (TAS), Experience Seeking (ES), Disinhibition (Dis), Boredom Susceptibility (BS), or the total score (TS). Eight patients did not continue in the study because of time constraints (patients were not compensated for their time). No psychiatric disorder or suicidal attempt was reported for these patients.
200
J. Vevera et al. / Psychiatry Research 133 (2005) 197–203
Table 1 Serum cholesterol and triacylglycerol concentrations before and after treatment of hypercholesterolemia with simvastatin Period of TC treatment (month)
TG
HDL
0 1 2 13–16
2.08F0.94 1.98F0.74 2.02F0.60 1.65F0.37
1.18F0.13 4.18F0.91 1.20F0.15 3.94F0.79 1.19F0.10 ***3.00F0.37 1.20F0.09 ***2.98F0.20
6.57F1.26 6.20F0.89 ***5.10F0.42 ***5.02F0.39
LDL
Values are meansFstandard deviations. The means were calculated from 17 values. TC, total cholesterol; TG, triacylglycerols; HDL, HDL cholesterol; LDL, LDL cholesterol; all in mmol/l. Marked values are significantly different from values before treatment with simvastatin at ***Pb0.001.
3.2. Serum cholesterol Total cholesterol, TG, HDL cholesterol, and LDL cholesterol were monitored before treatment with simvastatin and during pharmacotherapy (Table 1 and Fig. 1). A decrease of TC was found after 1 month of simvastatin therapy ( P=0.21), and a highly significant decrease was observed after 2 months ( P=0.000061) or
more than 1 year ( P=0.000053) of simvastatin therapy compared with pre-treatment values. Similar changes were observed for LDL cholesterol. Neither TG nor HDL cholesterol was significantly changed. 3.3. Kinetics of platelet serotonin uptake The kinetics of platelet serotonin uptake were described by the V max/K M ratio. When changes in 5-HT uptake during treatment were compared with pretreatment values (Table 2 and Fig. 1), the V max/K M ratio was found to be significantly increased after 1 month of treatment only ( P=0.0082); no significant increase in this ratio was observed after 2 months ( P= 0.067), and almost the same value as before treatment was observed after more than 1 year of therapy ( P=0.87). The V max value was found to have almost doubled after 1 month ( P=0.00027) and 2 months ( P=0.00013) of treatment compared with pre-treatment values. The K M value was significantly increased after 2 months ( P=0.024) of simvastatin therapy. Both K M and V max values returned to nearly the initial value
Fig. 1. Parameters measured in hypercholesterolemic patients as percentage of value before treatment with simvastatin. Values are meansFstandard deviations. The means were calculated from 17 values except for data from more than 1 year, when means were counted from only nine cases. TC, total cholesterol; LDL, LDL cholesterol; all in mmol/l; K M (nmol/l), apparent Michaelis constant characterizing affinity of serotonin transporter and calculated as extracellular serotonin concentration when the velocity of its transport equals to 50% of V max (pmol/ mind 107 platelets), maximal velocity of platelet serotonin uptake; V max/K M, ratio representing limiting permeability at low (physiological) extracellular concentrations of 5-HT (ml/min107 platelets); r DPH, fluorescence anisotropy of 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene; CH/PL, molar ratio of membrane cholesterol to total phospholipid. Marked values are significantly different from values before treatment with simvastatin at **Pb0.01, ***Pb0.001.
J. Vevera et al. / Psychiatry Research 133 (2005) 197–203
201
Table 2 Platelet serotonin uptake and fluorescence anisotropy of DPH in erythrocyte membranes and molar ratio cholesterol/phospholipid before and after treatment of hypercholesterolemia with simvastatin Period of treatment (month)
0 1 2 13–16
Platelet serotonin uptake
Ghosts
KM
V max
V max/K M
r DPH
CH/PL
189F83 224F75 **258F68 186F47
3.68F2.09 ***6.60F1.91 ***6.85F1.87 3.63F0.69
0.0210F0.0103 **0.0315F0.0090 0.0279F0.0103 0.0204F0.0049
0.2363F0.0065 0.2344F0.0063 0.2314F0.0109 0.2314F0.0059
0.755F0.115 0.779F0.098 0.688F0.098 0.786F0.198
Values are meansFstandard deviations. The means were calculated from 17 values except for data from more than 1 year, when means were counted from only nine cases. K M (nmol/l), apparent Michaelis constant characterizing affinity of serotonin transporter and calculated as extracellular serotonin concentration when the velocity of its transport equals 50% of V max (pmol/min107 platelets), maximal velocity of platelet serotonin uptake; V max/K M, ratio representing limiting permeability at low (physiological) extracellular concentrations of 5-HT (ml/min 107 platelets); r DPH, fluorescence anisotropy of the membrane probe 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene; CH, cholesterol; PL, total phospholipid. Values different from values before treatment are marked in case the difference is statistically significant (**Pb0.01, ***Pb0.001).
(before treatment) after more than 1 year of simvastatin therapy.
V max (r= 0.32, P=0.015), and between and LDL cholesterol and K M (r= 0.27, P=0.040).
3.4. Membrane cholesterol and microviscosity 4. Discussion When fluorescence anisotropy changes during treatment were evaluated in comparison to values before treatment (Table 2 and Fig. 1), we found that fluorescence anisotropy of DPH (r DPH) in erythrocyte membranes had not significantly decreased following 1 month, 2 months, or more than 1 year of simvastatin therapy. To interpret the changes in the relative representation of cholesterol in erythrocyte membranes due to the administration of simvastatin, we used the ratio of cholesterol/total phospholipid (CH/PL, mol/mol). The results are summarized in Table 2. A nonsignificant decrease in CH/PL was found after 2 months of simvastatin therapy ( P=0.17). The CH/PL ratio returned to a value close to the pre-treatment value after more than 1 year of therapy. 3.5. Mutual relations Mutual relations between each pair of variables were tested by means of a correlation coefficient matrix. Pearson’s correlations (r) were calculated from 57–68 cases consisting of simvastatin-treated patients. There was a significant positive correlation between V max and K M (r=0.48, Pb0.001) and between TC and LDL cholesterol (r=0.94, Pb0.001). A negative correlation was found between TC and V max (r= 0.29, P=0.028), between LDL cholesterol and
Our study finds that, in vivo, SERT functioning and membrane composition are influenced by serum cholesterol levels. The microviscosity of plasma membranes was not significantly changed by simvastatin treatment. SERT activity was significantly increased following 1 month of simvastatin therapy. However, longer-term therapy has a different effect on SERT activity (Fig. 1). The tendency for the initial increase in SERT activity to subsequently decline was evident after 2 months of therapy and especially after more than 1 year of therapy (13–16 months). A decreased relative membrane cholesterol representation was observed after 2 months of therapy. Serum cholesterol (TC, LDL) was markedly decreased after 1 month of simvastatin therapy; neither TC nor LDL cholesterol levels changed significantly in the period of 2–16 months of therapy. It is of interest that most of the biochemical parameters showed lower variance after treatment. Psychometric tests did not reveal any changes in depression, impulsivity, empathy, adventurousness, and sensation seeking. An increase in V max was used to explain increased serotonin uptake. The V max value appears to be more significantly modulated by cholesterol than the K M value. Similar to Scanlon et al. (2001), we found an increase of K M, i.e., a decrease of the affinity of SERT to 5-HT, following depletion of cholesterol; however,
202
J. Vevera et al. / Psychiatry Research 133 (2005) 197–203
we observed significantly increased V max, and total serotonin uptake was consequently increased. This conflicting finding can be explained by the different designs of the two experiments; we measured in vivo the effect of therapeutic cholesterol-lowering medication in humans, whereas Scanlon et al. used cultured kidney cells and a much greater reduction in cholesterol content. We hypothesize that the direct effect of cholesterol on SERT activity is compensated for by other homeostatic mechanisms that maintain SERT activity in the normal range, e.g., by changes in SERT affinity for serotonin. Our results suggest that SERT activity is more sensitive to an initial change in cholesterol concentration than to its stable level. This interpretation is consistent with a recent report that found an increase in impulsivity after 4 weeks of cholesterol-lowering therapy that dissipated over a longer (52 weeks) course of therapy (Ormiston et al., 2003). These findings did not support Engelberg’s (1992) hypothesis. Decreased cholesterol did not significantly lower membrane microviscosity as postulated in the theory, and opposite results in serotonin uptake were found. Increased uptake of serotonin was reported. The fact that changes in SERT activity were observed after 1 month of treatment has important theoretical and practical implications. The implication for clinical practice is that patients could be vulnerable to depression, violence, or suicide during the first month of cholesterol-lowering therapy. In biochemical and behavioral studies, attention should be paid to 1 month of therapy because, at later stages, the changes are no longer apparent. Acknowledgments This work was supported by grants from GA UK No. 27/2000/C and MSM 111100001 and NIH Fogarty Program Finance and Mental Health Services Training in the Czech Republic, School of Public Health, UC Berkeley, D43 TW05810-01. References Agrawal, D., Subramoniam, A., Afaq, F., 1995. Influence of hexachlorocyclohexane on phosphoinositides in rat erythrocyte membranes and brain. Toxicology 95, 135 – 140.
Balon, R., 2000. Cholesterol, mental illness and violence. Psychiatrie 2, 83 – 90. Bartlett, G.R., 1959. Phosphorus assay in column chromatography. Journal of Biological Chemistry 234, 466 – 468. Chin, J.H., Parsons, L.M., Goldstein, D.B., 1978. Increased cholesterol content of erythrocyte and brain membranes in ethanol-tolerant mice. Biochimica et Biophysica Acta 513, 358 – 363. Deisenhammer, E.A., Kramer-Reinstadler, K., Liensberger, D., Kemmler, G., Hinterhuber, H., Fleischhacker, W., 2004. No evidence for an association between serum cholesterol and the course of depression and suicidality. Psychiatry Research 121, 253 – 261. Delva, N.J., Matthews, D.R., Cowen, P.J., 1996. Brain serotonin (5HT) neuroendocrine function in patients taking cholesterollowering drugs. Biological Psychiatry 39, 100 – 106. Dodge, J.T., Mitchell, C., Hanahan, D.J., 1963. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes. Archives of Biochemistry and Biophysics 100, 119 – 130. Engelberg, H., 1992. Low serum cholesterol and suicide. Lancet 339, 727 – 729. Haase, J., Killian, A.M., Magnani, F., Williams, C., 2001. Regulation of the serotonin transporter by interacting proteins. Biochemical Society Transactions 29, 722 – 728. Hibbeln, J.R., Umhau, J.C., George, D.T., Shoaf, S.E., Linnoila, M., Salem Jr., N., 2000. Plasma total cholesterol concentrations do not predict cerebrospinal fluid neurotransmitter metabolites: implications for the biophysical role of highly unsaturated fatty acids. American Journal of Clinical Nutrition 71 (1 Suppl.), 331S – 338S. Huang, T.L., Wu, S.C., Chiang, Y.S., Chen, J.F., 2003. Correlation between serum lipid, lipoprotein concentrations and anxious state, depressive state or major depressive disorder. Psychiatry Research 118, 147 – 153. Kirsch, C., Eckert, G.P., Mueller, W.E., 2003. Statin effects on cholesterol micro-domains in brain plasma membranes. Biochemical Pharmacology 65, 843 – 856. Koul, A., Prasad, R., 1996. Extraction of membrane lipids. In: Prasad, R. (Ed.), Manual on membrane lipids. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, pp. 35 – 37. Krikava, K., Kalla, K., Yamamotova, A., Rokyta, R., 2004. Blood serum changes in patients with pain during bone fractures and acute pancreatitis. Neuroendocrinology Letters 25, 62 – 69. Lakowicz, J.R., 1999. Principles of Fluorescence Spectroscopy, Second edition. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. Lecrubier, Y., Braconnier, A., Said, S., Payan, C., 1995. The Impulsivity Rating Scale (IRS): preliminary results. European Psychiatry 7, 331 – 338. Locatelli, S., Lutjohann, D., Schmidt, H.H., Otto, C., Beisiegel, U., von Bergmann, K., 2002. Reduction of plasma 24S-hydroxycholesterol (cerebrosterol) levels using high-dosage simvastatin in patients with hypercholesterolemia: evidence that simvastatin affects cholesterol metabolism in the human brain. Archives of Neurology 59, 213 – 216. Muldoon, M.F., Manuck, S.B., Matthews, K.A., 1990. Lowering cholesterol concentrations and mortality: a quantitative review
J. Vevera et al. / Psychiatry Research 133 (2005) 197–203 of primary prevention trials. British Medical Journal 301, 309 – 314. Muldoon, M.F., Manuck, S.B., Mendelsohn, A.B., Kaplan, J.R., Belle, S.H., 2001. Cholesterol reduction and non-illness mortality: meta-analysis of randomized clinical trials. British Medical Journal 322, 11 – 15. Ormiston, T., Wolkowitz, O.M., Reus, V.I., Manfredi, F., 2003. Behavioral implications of lowering cholesterol levels: a double-blind pilot study. Psychosomatics 44, 412 – 414. Papakostas, G.I., Petersen, T., Mischoulon, D., Hughes, M.E., Alpert, J.E., Nierenberg, A.A., Rosenbaum, J.F., Fava, M., 2003. Serum cholesterol and serotonergic function in major depressive disorder. Psychiatry Research 118, 137 – 145. Ringo, D.L., Lindley, S.E., Faull, K.F., Faustman, W.O., 1994. Cholesterol and serotonin: seeking a possible link between blood cholesterol and CSF 5-HIAA. Biological Psychiatry 35, 957 – 959. Saheki, A., Terasaki, T., Tamai, I., Tsuji, A., 1994. In vivo and in vitro blood-brain barrier transport of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG CoA) reductase inhibitors. Pharmaceutical Research 11, 305 – 311. Sarchiapone, M., Camardese, G., Roy, A., Della Casa, S., Satta, M.A., Gonzalez, B., Berman, J., De Risio, S., 2001. Cholesterol
203
and serotonin indices in depressed and suicidal patients. Journal of Affective Disorders 62, 217 – 219. Scanlon, S.M., Williams, D.C., Schloss, P., 2001. Membrane cholesterol modulates serotonin transporter activity. Biochemistry 3, 10507 – 10513. Tanskanen, A., Vartiainen, E., Tuomilehto, J., Viinamaki, H., Lehtonen, J., Puska, P., 2000. High serum cholesterol and risk of suicide. American Journal of Psychiatry 157, 648 – 650. Terao, T., Nakamura, J., Yoshimura, R., Ohmori, O., Takahashi, N., Kojima, H., Soeda, S., Shinkai, T., Nakano, H., Okuno, T., 2000. Relationship between serum cholesterol levels and metachlorophenylpiperazine-induced cortisol responses in healthy men and women. Psychiatry Research 96, 167 – 173. Tuomisto, J., Tukiainen, E., Ahlfors, U.G., 1979. Decreased uptake of 5-hydroxytryptamine in blood platelets from patients with endogenous depression. Psychopharmacology 65, 141 – 147. Vevera, J., Zukov, I., Morcinek, T., Papezova, H., 2003. Cholesterol concentrations in violent and non-violent women suicide attempters. European Psychiatry 18, 23 – 27. Volavka, J., 2002. Neurotransmitters, hormones, and genes. Neurobiology of Violence, 2nd ed. American Psychiatric Press, Washington, DC, pp. 45 – 81.
