De ontrafeling van de rol van MYT1L in mentale retardatie

De ontrafeling van de rol van MYT1L in mentale retardatie Aurélie Verstraete

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: prof. dr. ir. Björn Menten Begeleider: Nina De Rocker Vakgroep Medische Genetica

Academiejaar 2012-2013

De ontrafeling van de rol van MYT1L in mentale retardatie Aurélie Verstraete

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: prof. dr. ir. Björn Menten Begeleider: Nina De Rocker Vakgroep Pediatrie en Genetica

Academiejaar 2012-2013

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Gent, 17 mei 2013

Promoter,

Student,

prof. dr. ir. Björn Menten

Aurélie Verstraete

Voorwoord Deze thesis is het sluitstuk van mijn vijfjarige opleiding biomedische wetenschappen. Het bundelt de inzichten en de kennis die in die belangrijke jaren zijn opgedaan. Met dit voorwoord wil ik de mensen bedanken die mij op weg geholpen hebben om deze thesis tot stand te brengen, want uiteraard lukt het niet alleen. Allereerst wil ik mijn promotor prof. Björn Menten bedanken voor het aanreiken van dit interessante onderwerp. Ondanks zijn drukke schema verleende hij mij de nodige tijd en stuurde hij mij bij. Ook Sarah Vergult en Nina De Rocker dank ik voor hun uitstekende begeleiding. Mijn bijzondere dank gaat uit naar Nina. Door haar leerde ik enorm bij en haar enthousiasme en toewijding stimuleerden mij om deze thesis tot een goed eind te brengen. De laboranten van het MRB2 bedank ik voor hun oneindig geduld met de studenten. Ik kon elke keer opnieuw bij jullie terecht met prangende vragen. Mijn medestudenten draag ik een warm hart toe omdat ze het verblijf in het immer krappe studentenlokaal aangenaam maakten. Wanneer de stress toesloeg bood een ontspannende babbel of een etentje met de groep soelaas. Bij mijn vriendinnen en vriend kon ik altijd terecht. Ze waren mijn steun en toeverlaat in moeilijke momenten en zorgden voor een schitterende studententijd. Tot slot wil ik een woordje van dank wijden aan mijn familie. Ik ben mijn ouders enorm dankbaar voor de geboden kansen. Ze gaven mij het zelfvertrouwen om mijn vijfjarige opleiding te voltooien. Uiteraard wil ik ook mijn zussen bedanken omdat ik altijd op hen kon rekenen. Zij moedigden mij aan tijdens mijn opleiding en bezorgden ten gepaste tijde de nodige afleiding. Ik wil graag eindigen met een wijsheid van mijn mama. Ze spoorde mij aan de lat altijd hoog te leggen: ‘Als je iets doet, doe het dan goed’.

Afkortingen °C

Graden Celsius

µl

microliter

µM

micromolair

5-HT

5-hydroxytryptamine

AAIDD

American Association on Intellectual and Developmental Disabilities

AMO

Antisense morpholino oligonucleotide

APA

American Psychiatric Association

array-CGH

array-comparative genomic hybridization

C2H2

Cys2His2

C2HC

Cys2HisCys

cDNA

complementair DNA

CMGG

Centrum voor Medische Genetica Gent

CNVs

Copy-number variations

CNTR

controle morfolino

Cq

Quantification cycle

CZS

Centraal zenuwstelsel

DEAF1

Deformed epidermal autoregulatory factor-1

DECIPHER

DatabasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensemble Resources

dNTPs

deoxyribonucleotide trifosfaten

dpf

dagen post fertilisatie

DSM-IV

Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition

DYRK1A

Dual specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase-1A

ENU

N-ethyl-N-nitroso-ureum

GABA

Gamma-amino boterzuur

g

relatief centrifugale kracht

GSU

Genetic Service Unit

HDACs

histon deacetylases

HE

hematoxiline eosine

hpf

uren post fertilisatie

hPa

hectopascal

ICD-10

Tenth Revision on the International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems

ID

intellectual disability

iN

induced neuronal cells

IQ

intelligentie quotiënt

KD

knock-down

KT

kamertemperatuur

MDD

Major Depressive Disorder

min

minuten

mm

millimeter

mM

millimolair

MR

mentale retardatie

MYND

Myeloid translocation 8, Nervy, Deaf-1

MYT

Myelin transcription factor

MYT1L

Myelin transcription factor 1-like

ng

nanogram

NZF1

Neural zinc finger factor 1

PBST

Phosphate Buffered Saline with Tween

PCR

Polymerase Chain Reaction

Pi

injectie druk

PKU

fenylketonurie

PLP

proteolipide proteïne

qPCR

real-time quantitative Polymerase Chain Reaction

rpm

rounds per minute

SAND

Sp100, AIRE-1, NucP41/75, Deaf-1

SD

standaard deviatie

sec

seconden

SNPs

Single nucleotide polymorphisms

ST18

Suppression of tumorigenicity 18

TD

Touch Down

Ti

injectie tijd

WHO

World Health Organization

WT

wild type

ZFIN

The Zebrafish Model Organism Database

ZIRC

Zebrafish International Resource Center

α5IA

GABA-A-benzodiazepine receptor inversieve agonist selectief voor het α5-subtype

Inhoudstafel Samenvatting

1

1. Inleiding .............................................................................................................................................. 2 1. 1 Mentale Retardatie ....................................................................................................................... 2 1.1.1 Definitie .................................................................................................................................. 2 1.1.2 Diagnose ................................................................................................................................. 2 1.1.2.1 Intelligentie Quotiënt (IQ) ............................................................................................... 3 1.1.3 Classificatie ............................................................................................................................ 4 1.1.4 Oorzaken ................................................................................................................................ 5 1.1.4.1 Omgevingsfactoren.......................................................................................................... 5 1.1.4.2 Genetische oorzaken ........................................................................................................ 6 1.1.4.3 Multifactorieel/polygenisch ............................................................................................. 7 1.1.5 Behandeling ............................................................................................................................ 7 1.2 MYT1L........................................................................................................................................ 10 1.2.1 Patiënten ............................................................................................................................... 10 1.2.2 C2HC zinkvingerfamilie ...................................................................................................... 11 1.2.3 MYT1L functie..................................................................................................................... 12 1.2.4 MYT1L als kandidaatgen voor MR ..................................................................................... 13 1.3 DEAF1 ........................................................................................................................................ 14 1.4 De Zebravis ................................................................................................................................. 16 1.4.1 Zebravis als modelorganisme ............................................................................................... 16 1.5. Doelstelling van deze masterproef ............................................................................................. 17 2. Materiaal en Methoden ...................................................................................................................... 18 2.1 Wild type ..................................................................................................................................... 18 2.1.1 Kweken ................................................................................................................................. 18 2.1.2 Oogsten................................................................................................................................. 20 2.1.3 RNA isolatie ......................................................................................................................... 20 2.1.4 cDNA synthese ..................................................................................................................... 22 2.1.5 Kwantitatieve PCR ............................................................................................................... 22 2.1.6 Polymerase kettingreactie ..................................................................................................... 24 2.2 Mutant Type ................................................................................................................................ 26 2.2.1 Morfolino’s ........................................................................................................................... 26 2.2.2 Zebravismutant myt1lb ......................................................................................................... 29 2.2.2.1 Genotypering ................................................................................................................. 30

2.2.2.2 kruisingsschema ............................................................................................................ 32 2.2.2.3 kweken........................................................................................................................... 32 3. Resultaten .......................................................................................................................................... 33 3.1 Wild type ..................................................................................................................................... 33 3.1.1 Homologie ............................................................................................................................ 33 3.1.2 qPCR .................................................................................................................................... 35 3.1.3 In situ hybridisatie (ISH) ...................................................................................................... 37 3.2 Mutant type.................................................................................................................................. 39 3.2.1 Morfolino’s ........................................................................................................................... 39 3.2.1.1. Splicesite blocking morfolino exon 2 ........................................................................... 40 3.2.1.2 Splicesite blocking morfolino exon 3 ........................................................................... 43 3.2.2 ZebravisMutant .................................................................................................................... 46 4. Discussie............................................................................................................................................ 47 5. Toekomstperspectieven ..................................................................................................................... 51 Referenties

52

Samenvatting Mentale retardatie is een ernstige ontwikkelingsstoornis die zowel impact heeft op de patiënt als zijn omgeving. De etiologie is complex en vaak ongekend. Bij het ontrafelen van de oorzaak van de aandoening wordt momenteel veel aandacht geschonken aan de invloed van genetische factoren. Een grote uitdaging voor de moleculaire genetica is dan ook het onderzoeken van mogelijke kandidaatgenen. In een internationale samenwerking identificeerde het Centrum voor Medische Genetica Gent

(CMGG)

met

behulp

van

array-CGH

microdeleties

en

-duplicaties

op

chromosoomband 2p25.3 bij 13 patiënten met milde tot matige niet-specifieke mentale retardatie. De kleinste gemeenschappelijke gedeleteerde regio bevat slechts één enkel gen nl. het myelin transcription factor 1- like (MYT1L) gen. Verschillende argumenten suggereren een rol voor dit gen in neuronale differentiatie en ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel, wat van MYT1L een geschikt kandidaatgen maakt voor mentale retardatie. Via exome sequencing werd een de novo mutatie ontdekt in DEAF1 bij twee patiënten met een verstandelijke beperking. Ook hier suggereren verschillende argumenten een rol van dit gen bij neurogenese waardoor het als kandidaatgen voor mentale retardatie naar voor wordt geschoven. Expressie van de zebravishomologen van de humane genen DEAF1 (zgc:194895 en zgc:171506) en MYT1L (myt1la en myt1b) werd gekarakteriseerd in de wild type vis. Deze resultaten werden vergeleken met de muis en met data uit studies over genen die belangrijk zijn bij de neurogenese. Dit leverde een bijkomende evidentie op dat MYT1L een belangrijke rol zou spelen bij de neurogenese. De expressie van zgc:194895 en zgc:171506 leverde een indicatie van een mogelijke functie dat start vóór de primaire neurogenese van de zebravis. Voor de twee homologen van myt1l in de zebravis zijn stabiele mutanten ter beschikking. Voor deaf1 is dit niet het geval. Enkel zgc:194895 werd door middel van morfolino injectie neergereguleerd, gezien de zeer lage expressie van zgc:171506 in de zebravis. De morfolino’s creëerden geen zichtbaar fenotype. Neerregulatie van het gen werd gecontroleerd via PCR en qPCR. De morfolino bleef actief tot de oudste leeftijd die werd onderzocht namelijk 7 dagen post-fertilisatie .

1

1. INLEIDING 1. 1 MENTALE RETARDATIE 1.1.1 DEFINITIE

Mentale retardatie (MR) is een ontwikkelingsstoornis van het centrale zenuwstelsel (CZS) met een prevalentie van 1 tot 3% wereldwijd [1]. Het gradeert van mild tot zeer ernstig en kan voorkomen als een geïsoleerd fenomeen (niet-syndromale MR) of gecombineerd met andere aangeboren fysieke en/of gedragsafwijkingen (sydromale MR) [2]. De term is echter verouderd en draagt bovendien een groot stigma met zich mee waardoor men tegenwoordig de term intellectual disability (ID) of verstandelijke beperking hanteert. Volgens de American Association on Intellectual and Developmental Disabilities (AAIDD) wordt ID gekenmerkt door tekortkomingen op zowel cognitief als adaptief gedrag en een aanvangsleeftijd jonger dan 18 jaar. Cognitief gedrag of intelligentie is de mentale capaciteit van een individu om onder andere te leren, te begrijpen, te redeneren en problemen op te lossen. Adaptief gedrag daarentegen omvat bekwaamheid op conceptueel, sociaal en praktisch niveau [3].

1.1.2 DIAGNOSE

Vanwege de enorme impact die de conditie heeft op niet alleen de persoon in kwestie maar ook op zijn/haar omgeving is een vroege en correcte diagnose van groot belang. Een incorrecte diagnose kan immers leiden tot inadequate therapie en stigmatisering [4]. Vereisten voor een goede klinische evaluatie zijn het interviewen van de ouders, het observeren van het kind en het testen van de intelligentie en het adaptief gedrag. Fysieke afwijkingen of het missen van welbepaalde mijlpalen in de ontwikkeling van het kind kunnen al een indicatie zijn voor MR. Deze fysieke afwijkingen kunnen tijdens de zwangerschap onderzocht worden via echografie met als voorbeeld de nekplooimeting om trisomie 21 uit te sluiten [1]. Adaptief gedrag kan onderzocht worden door de competenties van het kind na te gaan en deze te vergelijken met zijn leeftijdsgenoten. Men kijkt hoe het 2

zich kan aankleden, hoe het interageert en communiceert met familie, vrienden en andere kinderen van dezelfde leeftijd. De intelligentie en de gradatie van mentale achterstand kan achterhaald worden via de bepaling van het intelligentie quotiënt (IQ). Tekorten op het vlak van zowel intelligentie als adaptief gedrag zijn noodzakelijk voordat men kan spreken van MR [3]. Vooraleer men overgaat tot meten van het IQ moeten ernstige neurologische aandoeningen (vb. hersentumor) uitgesloten worden vermits behandeling de mentale problemen al kan oplossen. Indien men, gebaseerd op de klinische uitkomst, een genetische aandoening vermoedt, is een genetische screening aangewezen.

1.1.2.1 INTELLIGENTIE QUOTIËNT (IQ)

Het IQ is een maatstaf om de mentale capaciteit in te schatten en wordt bepaald door gestandaardiseerde IQ testen. De intelligentietesten van Wechsler zijn een gevestigde parameter en worden universeel aangewend voor het meten van het IQ. De testen omvatten verbale en prestatiegerichte subtesten die samen leiden tot de Full Scale IQ score. Het IQ is een statistisch concept met een gemiddelde score van 100 en een standaard deviatie (SD) van 15. Een IQ lager dan 70 wijst op een verstandelijke beperking. Dit komt overeen met 2 SD lager dan het gemiddelde [5] (Figuur 1).

Figuur 1:Gauss curve met de distributie van IQ scores in de algemene populatie [6].

3

Vóór de leeftijd van vijf jaar is het testen van de intelligentie minder evident. Zoals hierboven vermeld doet men dan beroep op de zogenaamde mijlpalen in de ontwikkeling van het kind. Die mijlpalen hebben betrekking tot de fijne en grove motoriek, communicatie, adaptatie, persoonlijkheid en sociaal gedrag. Het Van Wiechenonderzoek brengt op vaste leeftijdsmomenten deze vijf ontwikkelingsdomeinen in kaart. Naast het kijken of een kind capabel is om iets uit te voeren, wordt er gelet op de manier waarop het kind iets doet. Een kind dat bijvoorbeeld wel kan zitten, maar ‘doorzakt’, moet verder opgevolgd worden [7].

1.1.3 CLASSIFICATIE

Verschillende instanties hebben classificatiecodes opgesteld voor MR. Zo is er de Tenth Revision on the International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems (ICD-10) van de World Health Organization (WHO) en de Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th Edition (DSM-IV) van de American Psychiatric Association (APA). Beide organen werken met de gradaties van MR op basis van de IQ scores. De AAIDD benadrukt naast de IQ score het belang van toekomstige ondersteuning voor de patiënt (Tabel 1).

Tabel 1: Classificatie MR volgens verschillende instanties nl. de World Health Organization (WHO), de American Psychiatric Association (APA) en de American Association on Intellectual and Developmental Disabilities (AAIDD) [8-10].

APA Graad Mild Matig Ernstig Zeer ernstig

ICD-10 IQ scores

50-75 35-55 20-40 <20-25

AAIDD Ondersteuning

50-69 35-49 20-34 <20

Periodiek Beperkt Uitgebreid Pervasief

4

1.1.4 OORZAKEN

Telkens wanneer de normale ontwikkeling van de hersenen verstoord wordt, kan dit resulteren in MR. Het zoeken naar een oorzaak blijft een grote uitdaging vanwege de enorme ongelijksoortigheid in de etiologie. Terwijl in sommige studies een oorzaak gevonden kan worden in 65% van de gevallen met matige tot ernstige MR, blijft de etiologie ongekend bij 80% van gevallen met milde MR. Andere studies blijven een oorzaak schuldig in 80% van de gevallen van MR ongeacht de graad van ernst [8]. Globaal kan er een onderverdeling gemaakt worden in genetische oorzaken en omgevingsfactoren. Er wordt geacht dat in de geïndustrialiseerde landen ernstige MR voornamelijk te wijten is aan genetische factoren. De grote meerderheid van de oorzaken blijft echter ongekend [9].

1.1.4.1 OMGEVINGSFACTOREN

Omgevingsfactoren kan men indelen aan de hand van het moment waarop de oorzaak zich voordoet. Dit kan voor (prenataal), tijdens (perinataal) of na de geboorte (postnataal) zijn [2]. Slechte gewoontes van de moeder, zoals het gebruik van drugs, tabak en/of alcohol kunnen tijdens de zwangerschap een nefast effect hebben op de ontwikkeling van het kind. De meest prevalente vorm van MR in deze categorie is het foetaal alcohol syndroom, te wijten aan het overmatig gebruik van alcohol tijdens de zwangerschap. Anderzijds kunnen ook prenatale infecties leiden tot MR. Voorbeelden zijn besmettingen met toxoplasmose, rubella, cytomegalovirus en het Herpes simplex virus. Etiologische factoren die perinataal kunnen optreden zijn onder meer zuurstoftekort (asfyxie), een te laag geboortegewicht of prematuriteit. Postnataal

kunnen

socio-economische

factoren

een

rol

spelen

in

de

ontwikkelingsachterstand. Malnutritie en een tekort aan een goede gezondheidszorg zijn grote boosdoeners. Hier ligt ook de verklaring waarom de prevalentie van MR hoger ligt in ontwikkelingslanden dan in de Westerse cultuur. Ouders kunnen ook tekortschieten door 5

hun kind onvoldoende educatief te stimuleren. In het ergste geval dragen kindermisbruik en -verwaarlozing bij tot de etiologie van MR. Bijkomende oorzaken van MR die postnataal kunnen optreden zijn ongelukken of ongevallen met permanente hersenschade tot gevolg. Blootstelling aan toxines (zoals lood of kwik) en virussen resulterend in ziektes (zoals de mazelen

of

kinkhoest)

en

zelfs

straling

kunnen

ook

bijdragen

tot

een

ontwikkelingsachterstand [10].

1.1.4.2 GENETISCHE OORZAKEN

De frequentie van genetische causaliteit varieert van 17 tot 41% in de literatuur al naargelang de selectie van de bestudeerde populatie, de graad van mentale achterstand, de heterogeniteit van de protocols, technologische mogelijkheden en definiëring [1]. Down syndroom is de vaakst voorkomende oorzaak van intellectuele achterstand met een prevalentie van 1 op 650 tot 1 op 800 geboortes. Het wordt veroorzaakt door trisomie van het chromosoom 21 [2]. Autosomale vormen van MR komen relatief vaak voor. Ernstige dominante vormen van MR komen zelden familiaal voor vermits de reproductie bij deze individuen laag is. Maar door de hoge proportie van de novo mutaties bij patiënten met idiopathische MR zijn dominante vormen van MR niet zeldzaam. Bovendien suggereren epidemiologische data dat de meerderheid van gendefecten die aanleiding geven tot een ziekte recessief worden overgeërfd. X-chromosomale defecten komen in 8 tot 12% van de mannen met MR voor [5]. Een kort overzicht van mogelijke genetische oorzaken is te zien in Figuur 2.

Een verstandelijke beperking kan sporadisch optreden via een de novo mutatie. Dit sterkt de hypothese dat een groot deel van de gevallen van MR hierdoor veroorzaakt wordt. Voorlopig zijn mutaties in zo’n 450 genen gekend bij MR waarvan 50 gerelateerd zijn met syndromale MR en 400 met niet-syndromale MR [11] . Ondanks de grote genenpool blijft de incidentie van MR in de algemene populatie stabiel door de lage reproductiviteit bij patiënten [9].

6

Figuur 2: Overzicht genetische oorzaken van MR [2] met onder andere het Velo-Cardio-Fasciaal Syndroom (VCSF) en fenylketonurie (PKU).

1.1.4.3 MULTIFACTORIEEL/POLYGENISCH

Soms speelt de combinatie van meerdere genen (polygenie) en omgevingsfactoren een rol in het ontstaan van een verstandelijke beperking. Multifactoriële/polygenische modellen kunnen niet-Mendeliaanse overervingspatronen en verlaagde penetrantie verklaren. Deze fenomenen komen vaak voor in familiestudies met idiopathische MR. De complexe overervingspatronen samen met de invloed van omgevingsfactoren maken het moeilijk om oorzakelijke genen voor MR te identificeren [12].

1.1.5 BEHANDELING

Voor een mentale beperking bestaat er geen kant en klare oplossing, maar enkel een symptomatische behandeling en correcties van mogelijke bijkomende anomalieën zoals fysieke malformaties. Behandelingsobjectieven focussen zich voornamelijk op het normaliseren van het gedrag naargelang de normen en standaarden opgelegd door de maatschappij. Aangepast onderwijs en begeleiding zullen de patiënt een zekere zelfstandigheid aanleren. Er zijn verschillende instellingen en verenigingen die de nodige

7

steun en informatie verlenen aan patiënten en hun familie en op deze manier zorgen voor een zekere sociale acceptatie [2]. Omdat het aanbod aan therapieën schaars is, spitsen huidige strategieën zich voornamelijk toe op preventie. Zo kunnen prenatale zorg en preventieve maatregelingen voor en tijdens de zwangerschap de kans op MR verkleinen. Het innemen van foliumzuur supplementen tijdens de zwangerschap om het risico op neurale buis defecten te verkleinen en het mijden van alcohol en drugs zijn enkele voorbeelden hiervan. Wanneer het vroeg in het leven gedetecteerd wordt, kan MR veroorzaakt door metabole aandoeningen vermeden worden. Een uitgesproken voorbeeld is PKU, een autosomaal recessieve aandoening veroorzaakt door een loss-of-function mutatie in het gen dat codeert voor fenylalanine hydroxylase. Hierdoor kan de persoon het aminozuur fenylalanine niet metaboliseren en stapelt de stof zich op in het lichaam, wordt toxisch bij overmaat en kan bijgevolg schade veroorzaken aan de hersenen. Een aangepast voedingspatroon, met name een fenylalanine-arm dieet, kan de ziekte onder controle houden en MR verhinderen. In België gebeurt er systematisch een neonatale screening voor ziektes die bij vroege detectie behandeld kunnen worden door middel van een hielprik (Guthrie test). [2]. Ondanks het gebrek aan genezende behandelingen voor cognitieve deficiënties is het niet ondenkbaar dat dit een optie kan zijn voor de toekomst. MR als irreversibel fenomeen is een standpunt dat door volgende studies weerlegd kan worden. Memantine is een niet-competitieve NMDA receptor antagonist die reeds goedgekeurd is voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer. In transgene muismodellen zorgde memantine voor een verbetering van de cognitie. In Ts65Dn muizen (muismodellen voor Down Syndroom) normaliseerde memantine verschillende fenotypische gebreken zoals een tekort in aversief leren, spatiaal leren en nieuwe objecten herkenning. Er vonden echter geen effecten plaats die de ziekte modificeerde zoals neuroprotectie. Er werd een gerandomiseerde, placebo-gecontroleerde studie opgezet in mensen om de veiligheid en efficiëntie van een langdurige (1 jaar) behandeling met memantine na te gaan bij volwassenen met Down syndroom. De data waren teleurstellend wat betreft verandering in cognitie en functie. Ze leidden tot de suggestie dat de gelijkaardige neuropathologie bij Alzheimer en Down syndroom niet meer van toepassing is bij de behandeling van volwassen Down syndroom patiënten. Er loopt een klinische studie om het effect van memantine bij jonge Down syndroom patiënten te testen [13]. 8

Overexpressie van het dual specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase-1A (DYRK1A) gen blijkt een bijdragende factor in het ontstaan van de verstandelijke problematiek bij het syndroom van Down en ziekte van Alzheimer. Het gen controleert de hersengroei door in te spelen op de neuronale proliferatie en neurogenese. Inhibitie van DYRK1A activiteit via small molecules zou een mogelijkheid bieden tot farmaceutische interventies bij MR geassocieerd met bovenvermelde ziektes. Mazur-Kolecki et al. toonde in vitro de effectiviteit van harmine aan, een DYRK1A inhibitor, om alteraties van de neurogenese geassocieerd met Down syndroom te verzachten in de Ts65Dn muis [14]. Een verstoorde verhouding in inhiberende en exciterende neurotransmissie lijkt ook een rol te spelen in de afwijkende hersenfunctie bij Down syndroom patiënten. Behandeling tegen gamma-amino boterzuur (GABA), de voornaamste inhibitorische neurotransmitter in het CZS, kan de cognitieve functie van Ts65Dn muizen op een efficiënte manier verbeteren. GABA-A antagonisten lokken ook epilepsie aanvallen uit bij de mens waardoor ze niet in aanmerking komen voor klinische studies. Een oplossing hiervoor is het gebruik van een GABA-A-benzodiazepine receptor inversieve agonist selectief voor het α5-subtype (α5IA). In de muizenstudie van Braudeau et al. zorgde behandeling met α5IA voor verbetering in leer- en geheugenfuncties bij Ts65Dn muizen. Chronische en acute behandeling lokten bij de muizen geen epilepsieaanvallen uit [15]. Verschillende methoden bieden perspectieven om de cognitie te verbeteren. Educatie en training bevorderen de concentratie, het geheugen en het kritisch denken. Ook farmacologische interventies (noötropica of smart drugs), psychologische tussenkomsten, verrijkte omgevingen en de algemene gezondheid beïnvloeden de cognitie. Dit heeft belangrijke gevolgen voor de gemeenschap en voor de mens in het algemeen. Een deel van de noötropica (vb.Relatine) komt terecht op de zwarte markt en de kans op verslaving is reëel. Een grote vraag die men zich kan stellen indien moleculaire pathways worden achterhaald van genen betrokken bij het ontstaan van MR is of we al dan niet op weg zijn naar een wereld van eugenetica. Draagt het selectief aanpassen van de cognitieve capaciteit niet bij tot het creëren van de zogenaamde designer baby’s? Dit zijn discussie onderwerpen waar zeker aandacht aan geschonken moet worden [16].

9

1.2 MYT1L 1.2.1 PATIËNTEN

Chromosomale aberraties worden beschouwd als een belangrijke oorzaak van verschillende ontwikkelingsstoornissen zoals onder meer MR. Elke vooruitgang in genetische screening vertaalt zich in een verhoogde kans om het causale defect bij patiënten te identificeren. Na karyotypering en fluorescentie in situ hybridisatie heeft nu ook array-comparative genomic hybridisation (array-CGH) of arraygebaseerde vergelijkende genoomhybridisatie zijn nut bewezen als een efficiënte techniek om nieuwe microdeletie- en microduplicatiesyndromen te karakteriseren en nieuwe ziektegenen te ontdekken [17]. In een internationale samenwerking identificeerde het Centrum voor Medische Genetica Gent

(CMGG)

met

behulp

van

array-CGH

microdeleties

en

-duplicaties

op

chromosoomband 2p25.3 bij 13 patiënten met milde tot matige niet-specifieke MR. De kleinste gemeenschappelijke gedeleteerde regio bevat slechts één enkel gen nl. het myelin transcription factor 1- like (MYTL1) gen. Bij het doorlopen van de DatabasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensemble Resources (DECIPHER) werden nog twee relevante patiënten gevonden (Figuur 3).

Figuur 3: Schematische voorstelling van 13 patiënten met een MYT1L aberratie. Op de figuur wordt de lengte van de afwijkingen weergegeven met daarboven de chromosoomband. De deleties worden als rode balken afgebeeld en de duplicaties als blauwe balken. Via de DECIPHER databank werden nog twee bijkomende patiënten geïdentificeerd (DECIPHER MR 141 en 314).

10

1.2.2 C2HC ZINKVINGERFAMILIE

Het MYT1L gen, ook gekend als het neural zinc finger factor 1 (NZF1) gen is gelegen op chromosoomband 2p25.3 en omvat 542081 baseparen (bp) en 25 exonen. Het behoort tot de myelin transcription factor (MYT) genfamilie naast MYT1 en NZF3 (=MYT3 of suppression of tumorigenicity 18 (ST18)). Deze familie is doorheen de evolutie sterk geconserveerd gebleven en codeert voor specifieke, neurale zinkvinger proteïnes die op een speciale manier binden met DNA. Ze bevatten regio’s die zich wentelen rond een centraal zink-ion om zo een compact en stabiel domein te creëren. Zo’n structureel motief wordt een zinkvinger genoemd. In eiwitten worden zinkvingers teruggevonden die functioneel zijn in verschillende cellulaire processen zoals transcriptie, translatie, celproliferatie, ... . De voornaamste functie is die van interactiemodule met verschillende componenten zoals nucleïnezuren, proteïnes en kleine moleculen. Zinkvingers worden geclassificeerd in families aan de hand van de aminozuren die ze aanwenden om de metaal liganden (zoals zink) te coördineren. De voornaamste is de Cys2His2 (C2H2) zinkvinger familie die twee cysteïne residu’s bevat en twee geconserveerde histidine residu’s. De MYT familie vertegenwoordigt een zinkvinger subfamilie met een C2HC structuur [18]. Het MYT1 gen is het prototype van de MYT genfamilie en wordt tot expressie gebracht in neuronale en gliale precursors en verzwakt tijdens de terminale differentiatie. Dit in tegenstelling tot MYT1L dat niet teruggevonden wordt in gliale cellen, maar enkel tot expressie komt in neuronen na terminale mitose. MYT1 codeert voor een transcriptiefactor die bindt op de promoterregio van het proteolipide proteïne (PLP) van het CZS. Het PLP gen is het belangrijkste gen voor de myelineproductie [19]. Data uit proefdierstudies wijzen uit dat MYT1 een kritische rol zou spelen in de proliferatie en differentiatie van oligodendrocyten via transcriptieregulatie van myelinespecifieke genen [20]. MYT1 en MYT1L vertonen een grote homologie. Zo is er de sterke verwantschap op proteïneniveau, de gelijke functionele domein topologie (Figuur 4) en gelijkaardige weefselspecifieke expressie [21]. Het verlies van MYT1 zou gecompenseerd kunnen worden door activatie van zijn paralogen (eg. MYT1L en ST18), zo blijkt uit een studie naar de betrokkenheid van MYT1 in endocriene differentiatie en functie [22].

11

ST18 komt tot expressie in de hersenen en ook maar in mindere mate in het hart, lever, nieren, skeletspier, pancreas, testes, ovaria en prostaat. In normaal borstweefsel is het weinig aanwezig maar in primaire borsttumoren daarentegen wordt het in grote hoeveelheid teruggevonden [23].

Figuur 4: Schematische voorstelling van geconserveerde functionele domeinen in de drie leden van de humane myelin transcription factor protein familiy [21] Transcriptiefactoren met een C2HC-zinkvinger motief vormen compacte eiwitdomeinen die zorgen voor een sterke binding met het DNA.

1.2.3 MYT1L FUNCTIE

Om de contributie van de MYT familie aan neuronale differentiatie te onderzoeken, zochten Romm en collega’s naar nucleaire interactiepartners in de hersenen [20]. Hieruit bleek dat zowel in een yeast als een mamalian two-hybrid systeem, MYT1 en MYT1L interageren met Sin3B. Deze proteïne medieert transcriptionele repressie door te binden op histon deacetylases (HDACs). HDACs katalyseren de verwijdering van acteylgroepen van histonen wat leidt tot condensatie van chromatine en onderdrukking van transcriptie. Afhankelijk van de beschikbare Sin3B isoformen zullen deze leden van de MYT genfamilie andere genen neerreguleren gedurende de neuronale ontwikkeling. Llorens et al. toonden in een muizenstudie aan dat er ook een interactie plaatsvindt tussen het C-terminale domein van Lingo-1 en Myt1l. Lingo-1 of Lern1 is een type I transmembranair proteïne dat een onderdrukkende functie uitoefent bij de differentiatie en myelinisatie van oligodendrocyten. Naast functies gelinkt aan axonregeneratie tonen de resultaten van de studie ook aan dat Lingo-1 een rol speelt in neuronale ontwikkeling en

12

maturatie. Men vermoedt dat Lingo-1 de activiteit van de transcriptiefactor Myt1l reguleert door in te werken op zijn subcellulaire lokalisatie [24]. In combinatie met transcriptiefactoren Ascl1 en Brn2 kan Myt1l embryonale en postnatale fibroblasten van de muis [25] op een directe manier converteren naar functionele neuronale cellen. Directe conversie gebeurt niet via een pluripotente stamcel fase, waardoor het risico op tumorvorming wordt vermeden. De geïnduceerde neuronale cellen of induced neuronal (iN) cells brengen meerdere neuron specifieke proteïnen tot expressie, genereren actiepotentialen en vormen functionele synapsen. Bepaalde transcriptiefactoren kunnen ook functionele neuronen voortbrengen uit humane pluripotente stamcellen en foetale en postnatale humane fibroblasten, zo blijkt uit een artikel van Pang et al. [26]. Een vierde transcriptiefactor NeuroD1 is wel vereist voor de conversie van foetale en postnatale humane fibroblasten. In tegenstelling tot inductie van functionele neuronen uit humane pluripotente stamcellen waarbij enkel Ascl1, Brn2 en Myt1l volstaan. Conversie van humane fibroblasten naar neuronen is ook mogelijk door activatie van een regulatief neuraal ontwikkelingscircuit dat miRNAs omvat. Deze bevinding van Yoo et al. [27] toont het belang aan van neurogene transcriptiefactoren en evolutionair geconserveerde signaalwegen in de humane neurogenese. Uit de studie blijkt dat de expressie van miR-9/9* en miR-124 in de humane fibroblasten de conversie naar neuronen induceert. Dit wordt bevorderd door NeuroD2. Additie van de neurogene transcriptiefactoren Ascl1 en Myt1l verrijkt de mate van conversie en de maturatie van de geconverteerde neuronen. Uit dit alles vloeit de mogelijkheid om verschillende types neuronen te induceren gebruik makend van miR-9/9* en miR-124 in combinatie met wisselende sets van transcriptiefactoren.

1.2.4 MYT1L ALS KANDIDAATGEN VOOR MR

Zowel de temporele als neuro-anatomische distributie van MYT1L expressie suggereert dat dit gen een belangrijke rol speelt in neuronale differentiatie [19, 20]. Wat zijn exacte functie is en in welke pathways het betrokken is, moet nog achterhaald worden. Bijkomende bevindingen die van MYT1L een geschikt kandidaatgen maken voor MR zijn onder meer de homologie die MYT1L vertoont met MYT1 dat als belangrijkste gen wordt 13

beschouwd voor de myelinisatie en de associatie met enkele neuropsychologische aandoeningen, zoals autisme, schizofrenie en depressie. In een genoomwijde screening voor CNVs bij patiënten met schizofrenie identificeerden Vrijenhoek et al. [28] een duplicatie ter hoogte van chromosoom 2p25.3. De duplicatie omvat vier genen waaronder MYT1L. Het breekpunt van de duplicatie onderbreekt het terminale deel van MYT1L wat leidt tot de veronderstelling dat deze CNVs MYT1L verstoren door dosage variatie of disruptie van het gen. Wang et al. [29] onderzochten of MYT1L een risicogen kon zijn voor Major Depressive Disorder (MDD) in een Chinese Han populatie. Uit de case-control studie bleek dat singlenucleotide polymorfisms (SNPs) in MYT1L bijdroegen tot het ontstaan van MDD. Op basis van de bevindingen van Vrijenhoek en Wang werd een case-control studie uitgevoerd om na te gaan of MYT1L varianten geassocieerd zijn met schizofrenie [30]. Ook hieruit bleek dat verschillende SNPs significante risicofactoren waren voor deze psychopathologische aandoening. Recente resultaten uit een studie met twee halfbroers toonden eveneens aan dat een duplicatie in het MYT1L gen een mogelijk oorzakelijke variant is voor autisme [31]. Alle data samen ondersteunen de hypothese dat MYT1L een fundamentele rol speelt bij neuronale differentiatie en de ontwikkeling van het CZS en zo een sterk kandidaatgen is voor MR. 1.3 DEAF1

Deformed epidermal autoregulatory factor-1 (DEAF1) codeert voor een DNA bindend proteïne ontdekt in Drosophila als mogelijke cofactor van het Hox proteïne Deformed [32]. Het bevindt zich bij de mens op chromosoom 11. Het eiwit omvat zowel een DNA bindend Sp100, AIRE-1, NucP41/75, Deaf1 (SAND) domein als een terminaal zink vinger motief of het myeloid translocation 8, Nervy, Deaf1 (MYND) domein [33]. Via exome sequencing werd er een de novo mutatie ontdekt in DEAF1 bij twee patiënten met MR. Daarom wordt DEAF1 naar voorgeschoven als kandidaatgen voor MR en hier onderzocht. Deaf1 blijkt een belangrijke rol te spelen bij de embryonale ontwikkeling. Loss-of-function mutaties in Deaf1 zorgen voor groeiarrest of segmentatie defecten zoals abnormale 14

segmenten of het verlies ervan in Drosophila. Overexpressie leidt dan tot verkeerde oog en vleugelontwikkeling [34]. Bij de muis komt Deaf1 mRNA wijdverspreid tot expressie gedurende de embryogenese met pieken in onder meer het CZS en de dorsale wortel ganglia. Deaf1 speelt ook een rol in de neuronale differentiatie door interactie met Lmo4 en Nli, transcriptie regulatoren die embryonale patroonvorming en cell fate bemiddelen. Onderbreking van de Deaf1/Lmo4 interactie in een muizenstudie leidde tot fenotypes zoals neurale buis defecten en encephalie [33]. Bij de mens wordt DEAF1 gelinkt aan neurologische aandoeningen zoals MDD en angststoornissen door het inspelen op het serotonine 5-hydroxytryptamine (5-HT) systeem. Serotonine is een neurotransmitter die emotie en stemming beïnvloedt. De 5-HT 1A autoreceptoren zorgen voor een negatieve feedback inhibitie van de 5-HT neuronen. Gewijzigde expressie van de 5-HT 1A receptor kan leiden tot een verstoorde serotonerge functie en zorgt voor een predispositie voor depressie en angststoornissen. Albert et al. vermelden DEAF1 als een transcriptiefactor die de expressie van het 5-HT 1A receptor gen Htr1a reguleert in de hersenen gebaseerd op bevindingen van celculturen, muismodellen en humane studies. Het eiwit werkt als een repressor die de expressie van de 5-HT 1A autoreceptor hindert in neuronen van de Raphe nucleus en zo de serotonerge activiteit stimuleert, wat leidt tot een verminderd risico op depressie. Het wegvallen van de genfunctie zorgt voor opregulatie van de 5-HT 1A autoreceptor in vivo en reductie van 5-HT vrijstelling met meer kans op depressie als gevolg [35]. Er wordt ook gesuggereerd dat DEAF1 (suppressin) een rol speelt in de etiologie van kanker doordat mutaties ontdekt zijn in tumoren en cellijnen afkomstig van humane colorectale adenocarcinoma [33].

15

1.4 DE ZEBRAVIS 1.4.1 ZEBRAVIS ALS MODELORGANISME

De zebravis of Danio rerio is al een tijd een gegeerd modelorganisme voor ontwikkelingsbiologen. De aantrekkelijkheid zit in de biologie van het diertje en de kennis van het volledige genoom. Bovendien worden de transparante eitjes buiten het lichaam bevrucht en hatching van de embryo’s uit hun chorion is vervolledigd na 3 dagen. Dit maakt observatie van de embryogenese onder de microscoop mogelijk. Voordelen in de ontwikkeling laten studie toe van genexpressie en -functie gedurende de vroege ontwikkelingsstadia. Zo kan het embryo de eerste week overleven dankzij zijn dooierzak en door passieve diffusie van zuurstof. Behalve dit heeft het nog geen functioneel circulatiesysteem nodig. Het zebravisgenoom is gesequeneerd maar nog niet volledig geannoteerd. Het vertoont 5080% homologie met humane sequenties [36]. Voor een aantal genen is gedurende de evolutie van de Actinoptherygii (straalvinnigen) een genoomduplicatie opgetreden wat tetraploïdie veroorzaakte bij species uit deze klasse. Als gevolg bestaan er voor het humane MYT1L gen twee zebravis homologen namelijk myt1la en myt1lb [37]. Het DEAF1 gen heeft ook twee homologen in de zebravis met name zgc: 194895 en zgc: 171506. Het gebruik van de zebravis als modelorganisme ten opzichte van andere zoals Mus musculus, Xenopus laevis, Drosophila melanogaster enz. wordt door verschillende voordelen begunstigd. In vergelijking met de Mus musculus zijn zebravissen makkelijk te huishouden in grote aantallen en dus eveneens goedkoper. Er kan ook een groot aantal nakomelingen worden gegenereerd in een korte tijdsperiode, zo’n 200 à 300 eitjes per week. De transparantie van de eieren geeft een voordeel ten opzicht van de Xenopis laevis en de Drosophila melanogaster. Sinds kort bewijst de zebravis zijn nut in studies op het niveau van de gedragsgenetica en neurowetenschappen. De embryo’s vertonen similariteit met de mens wat betreft leren, slapen, drugsverslaving en andere fenotypes van neurologische gedrag. Daarnaast blijken de organisatie van het genoom, de genetische pathways die signaaltransductie controleren en de ontwikkeling hoog geconserveerd te zijn tussen de zebravis en de mens [38].

16

1.5. DOELSTELLING VAN DEZE MASTERPROEF

MR treft ongeveer 3% van de bevolking en is een ongeneeslijke aandoening. Voorlopig wordt er voornamelijk aandacht geschonken aan het verstrekken van de nodige preventie en aangepaste zorg. De impact die MR heeft op het individu maar ook op zijn omgeving vraagt om therapeutische behandelingsmethoden. Hiervoor is echter meer inzicht nodig in de fundamentele onderbouw van het gezonde brein en de aandoening. Deze thesis kadert in een overkoepelend project met de moleculaire ontrafeling van nieuwe kandidaatgenen en betrokken pathways in MR als voornaamste focus. In dit project trachten we twee genen, namelijk MYT1L en DEAF1 te karakteriseren en hun functies en de pathways waarin ze betrokken zijn op te helderen. Hierbij wordt gebruik gemaakt van verschillende modelsystemen, zowel cellulair als diermodellen. De zebravis is een belangrijk vertebraat modelorganisme voor biomedisch onderzoek door voordelen op biologisch en genetisch niveau. De bijdrage van deze thesis aan dit project is de karakterisatie van de expressie van de twee kandidaatgenen, myt1l en deaf1 in de zebravis als modelsysteem. Het Myt1l gen komt in muis enkel tot expressie in neuronale cellen, met de hoogste expressie tijdens embryonale ontwikkeling. Bij de muis komt Deaf1 mRNA wijdverspreid tot expressie gedurende de embryogenese met pieken in onder meer het CZS en de dorsale wortel ganglia. Doelstelling 1: De expressie van myt1l en deaf1 zal worden gekarakteriseerd in wild type (WT) vissen, zowel op RNA niveau als op het niveau van de weefsels. Zo willen we een beeld krijgen van de expressie van de genen van interesse in de normale zebravis. Doelstelling 2: Hier beogen we het karakteriseren van de functie van het gen van interesse. Hierbij worden de eerste stappen gezet om een mutante vis te ontwikkelen waarin het gen in kwestie is neergereguleerd. Vermits de zebravis twee homologen voor myt1l en deaf1 bezit, moet voor elke homoloog een mutant gemaakt worden. De stabiele myt1la en myt1lb heterozygote knock-out mutante zebravissen werden beiden ter beschikking gesteld via het Zebrafish International Resource Center (ZIRC; Oregon, USA). Deze heterozygoot mutante vissen zullen worden gekruist zodat een homozygote myt1la en myt1lb mutant gegenereerd wordt. Voor deaf1 is er nog geen stabiele knock-out mutant beschikbaar. Daarom zullen we in een eerste stap proberen één van de homologen nl. zgc:194895 neer te reguleren door middel van morfolino injecties en naast moleculaire confirmatie ook het fenotype evalueren. 17

2. MATERIAAL EN METHODEN 2.1 WILD TYPE 2.1.1 KWEKEN

1) Principe Zebravis mannetjes en vrouwtjes zijn eenvoudig van elkaar te onderscheiden (Figuur 5a). Om te kunnen kweken worden de mannetjes en vrouwtjes overnacht door een scheidingswand van elkaar gescheiden in eenzelfde tank. Door deze fysische scheiding maken de vissen feromonen aan. Dit zijn chemische signalen die dieren van eenzelfde soort beïnvloeden ondermeer om hun territorium af te bakenen maar ook zoals in dit geval om de aantrekkelijkheid te verhogen. In de normale habitat paren de vissen bij zonsopgang. In het labo wordt deze situatie gesimuleerd door 14u/10u licht/donker cycli: om 8 uur in de morgen gaat het licht aan tot 22 uur ’s avonds. Op deze manier worden dag en nacht nagebootst. Na 20 à 40 minuten (min) kan men reeds embryo’s verwachten, die doorheen het roostertje van de kweektank vallen (Figuur 5b). Zo wordt vermeden dat de embryo’s opgegeten of aangeraakt worden door de vissen. Benodigdheden zijn terug te vinden in Bijlage 1.

Figuur 5: (a) Zebravissen: morfologisch onderscheid in geslacht. Bovenaan een vrouwtje (dikkere, witte buik) en onderaan een mannetje (smal, gele buik) [39]. (b) Kweken van zebravissen [40].

18

2) Protocol

1. Al het materiaal (kweekbakjes, roosters, scheidingswanden, vangnetje) wordt eerst afgespoeld met reverse osmosis water of RO water om achtergebleven feromonen van een vorige kweek te verwijderen.

2. De interne kweekbakken (rooster) worden in de externe kweekbakken geplaatst en zijn voor 4/5 gevuld met systeemwater. De tussenschotten worden geplaatst zodat er twee compartimenten ontstaan: een ruimte voor vrouwtjes en een voor mannetjes. 3. Uit de aquaria worden twee mannetjes en twee vrouwtjes gehaald en in de gescheiden compartimenten overgebracht. De vissen worden op deze manier overnacht gescheiden van elkaar. Idealiter wacht je twee weken om met dezelfde vissen te kweken. 4. Op het moment van de start om te kweken (volgende morgen) worden de interne kweekbakken met de zebravissen overgebracht naar andere externe kweekbakken gevuld voor 2/3 met vers systeemwater. De tussenschoten worden verwijderd, waardoor de vissen de mogelijkheid krijgen om te paren. 5. Om de embryo’s te verzamelen worden de interne kweekbakken (met vissen) terug overgebracht naar de oorspronkelijke externe kweekbakken. 6. Het water van de kweekbakjes wordt gezeefd en de eitjes worden vervolgens in een petrischaaltje met E3 medium (+ methyleenblauw) overgebracht en in de incubator geplaatst (28 graden Celcius [°C]). 7. Medium wordt elke dag ververst en dode embryo’s, vuil en chorionvliesjes worden verwijderd. 8. Vanaf dag 6 dienen de embryo’s ook gevoed te worden met droge voeding (SDS korrels (korrelgrootte 50 tot 400 µM) en artemia of pekelkreeftjes, wat wordt bijgehouden via een voedingsschema. Vanaf dag 9 worden de embryo’s overgebracht naar het grote systeem.

19

2.1.2 OOGSTEN

1) Principe Om RNA of eiwitten te isoleren dient men de embryo’s te groeperen. Omwille van zuiverheid worden het chorion en de dooierzak (in geval van eiwitten) verwijderd. De benodigdheden zijn terug te vinden in Bijlage 1. 2) Protocol 1. Embryo’s (0 – 3 dagen post-fertilisatie [dpf]) worden met een plastic pasteurpipet in een petrischaaltje overgebracht en er wordt zo veel mogelijk E3 medium verwijderd.

2. Voeg 1 ml pronase (2 mg/ml, Sigma-Aldrich) toe en laat 1 à 2 min incuberen (afhankelijk van leeftijd). Bij een jong embryo is het chorion nog gespannen en het pronase maakt het zachter. Als het chorion week is, worden de embryo’s gewassen in Phosphate Buffered Saline met 0,1% Tween20 (PBS-T) (4°C) , dat zachtjes op en neer gepipetteerd wordt om het chorion los te maken. Hierbij kan ook gebruik gemaakt worden van pincetten. 3. Breng de embryo’s zonder chorion over naar een nieuw 1,5 ml epje en verwijder zoveel mogelijk PBS-T. Voeg vervolgens 0,5 ml RNAlater (Sigma-Aldrich) bij de embryo’s. Deze oplossing dringt snel binnen in de weefsels en stabiliseert het cellulair RNA. Zo kan dit staal een maand bewaard blijven bij 4°C.

2.1.3

RNA ISOLATIE

1) Principe Bij RNA isolatie worden de cellen gelyseerd en het cellulair DNA en eiwitten verwijderd uit het lysaat. Het RNA wordt opgezuiverd door middel van isopropanol precipitatie en dit wordt altijd uitgevoerd onder de trekkast. Het RNA wordt geïsoleerd uit embryo’s of jonge

20

zebravissen (tot 10 dpf) die in RNAlater (Sigma-Aldrich) worden bewaard (4°C of -20°C). De benodigheden zijn terug te vinden in Bijlage 1. 2) Protocol

1. Verwijder zoveel mogelijk RNAlater van de stalen met een glazen pipet.

2. Voeg 200 microliter (µl) Trizol (Qiagen) toe. Trizol is een fenol-guanidinium thiocyanaat gebaseerd lysis reagens, dat de celmembraan afbreekt en de stalen homogeniseert. 3. De stalen worden gemixt tot een homogene oplossing met behulp van een mixer (fisherbrand automatic crusher). 4. Voeg 40 µl chloroform toe en inverteer de stalen enkele malen zodat de oplossing gehomogeniseerd wordt. Laat de stalen 2 à 3 min incuberen bij kamertemperatuur (KT). Na centrifugatie (15 min, 12000 relatief centrifugale kracht (g), 4°C) krijgt men een duidelijke scheiding van drie fasen: een bovenste, waterachtige fase met de nucleïnezuren, een zwarte tussenfase met celresten en een roze fase onderaan met eiwitten en vetten. Breng de waterige fase over naar een nieuw 1,5 ml epje. 5. Pipetteer 100 µl isopropanol (100 %) bij elk staal en incubeer 10 min op KT. Pelleteer de stalen (12g, 10 min, 4°C). 6. Verwijder het supernatans en voeg 200 µl ethanol (75%) toe. 7. Vortex en centrifugeer de stalen (5 min, 7.4g, 4°C) en verwijder vervolgens het supernatans. 8. Laat de stalen 30 min aan de lucht drogen. 9. Los de pellet op in 30 µl RNase vrij water (thermomixer, 10-15 min, 65°C, 0 rpm). Meet de concentraties met de spectrofotometer NanoDrop (Thermo Scientific).

21

2.1.4

CDNA SYNTHESE

1) Principe De cDNA synthese is een methode om RNA om te zetten naar complementair DNA (cDNA) via reverse transcriptie. Dit cDNA omvat de overgeschreven exonen en wordt als startmateriaal aangewend in expressieanalyses zoals qPCR. De reactie gaat door in de Thermal Cycler (BioRad). Er wordt gebruik gemaakt van de iScript cDNA synthese kit (BioRad). De benodigdheden zijn terug te vinden in Bijlage 1. 2) Protocol

1. Per reactie wordt 500 nanogram (ng) geëxtraheerd RNA in een RNase vrij 0,2 ml epje toegevoegd, aangevuld met 4 µl iScript reactiemix (5x) en 1 µl iScript reverse transcriptase. Het volume wordt aangelengd met nuclease vrij water tot een totaal reactievolume van 20 µl. Er wordt steeds op ijs gewerkt.

2. Het geheel wordt voor 5 min geïncubeerd bij 25 ºC, 30 min bij 42 ºC en 5 min bij 85 ºC. De stockconcentratie bedraagt nu 25 ng/µl. 3. De werkconcentratie voor een kwantitatieve PCR (qPCR) bedraagt 2,5 ng/µl. Voor PCR wordt een concentratie tussen 10 en 100 ng/µl vereist.

2.1.5 KWANTITATIEVE PCR

1) Principe Real-time quantitative PCR of qPCR kan op het niveau van mRNA transcriptie de effecten van RNAi meten. Een van de meest gebruikte applicaties van qPCR is dan ook genexpressie analyse. De technologie combineert cDNA amplificatie met directe kwantitatieve detectie van de producten. SYBR Green I is een fluorescente kleurstof die intercaleert tussen dubbelstrengig DNA. Naarmate meer dubbelstrengen worden gesynthetiseerd (amplificatie) 22

wordt er meer kleurstof ingebouwd en zal de fluorescentie toenemen. Om de reactie in realtime te volgen wordt de stijging van fluorescentie ten opzichte van het aantal cycli uitgezet in een amplificatiecurve. De qPCR techniek wordt in dit werk aangewend als confirmatiemethode van knock-down en om genexpressie op verschillende tijdstippen na te gaan. Voor de data-analyse wordt de 2nd derivative maximum method gebruikt met de Cq-waarde (Quantification Cycle) (Light Cycler 480 software). Deze wordt bepaald door het maximum van de tweede afgeleide van de amplificatiecurve. De Cq-waarde is de relatie tussen het moment waarbij het fuorescent signaal boven de achtergrond fluorescentie uitkomt en de initiële hoeveelheid template DNA. Met een grote hoeveelheid initieel materiaal wordt de Cq-waarde veel sneller bereikt en zijn er minder cycli nodig. Verwerking van de qPCRresultaten gebeurt met het software programma qbasePLUS (BioGazelle). Voor elk cDNA staal worden tenminste 3 huishoudgenen gekwantificeerd voor de normalisatie van het expressieniveau [41]. De stabiliteit van de referentiegenen kan via geNorm worden bepaald. De benodigdheden zijn terug te vinden in Bijlage 1. 2) Protocol Er wordt gebruik gemaakt van de Sso Advanced SYBR Green Supermix (BioRad). Deze mix bevat reeds alle componenten voor de reactie, waaronder reactiebuffer, polymerase, SYBR Green kleurstof en deoxyribonucleotiden (dNTPs).

1. De mastermix wordt samen met de primers gepipetteerd in een 0,5 ml epje. Per reactie worden 2,5 µl supermix, 0,25 µl forward primer en 0,25 µl reverse primer toegevoegd.

2. In elke reactie well van de 384 well qPCR plaat (BioRad) komt 2 µl cDNA (2,5 ng/µl). De plaat wordt afgedekt met een Lightcycler 480 sealing foil (BioRad). 3. De plaat wordt geplaatst in de LightCycler 480 (BioRad)>New experiment>Apply template> CMGG operator> Templates> Run template> Sso Advanced_FZK (Figuur 6).

23

Figuur 6: Sso Advanced_FZK programma

2.1.6

POLYMERASE KETTINGREACTIE

1) Principe De Polymerase Chain Reaction (PCR) of polymerase kettingreactie maakt selectieve amplificatie van een specifiek doelwit DNA sequentie mogelijk. Bij deze techniek wordt naast het DNA staal ook oligonucleotide primers gebruikt die complementair zijn aan het te amplificeren dubbelstrengig DNA fragment. Daarnaast worden dNTPs toegevoegd, vrije nucleotiden die complementair zijn met de doelwitsequentie. Deze worden met behulp van een thermostabiel DNA Taq polymerase aangebouwd aan de primers. Een PCR reactie bestaat uit drie opeenvolgende thermische cycli (Figuur 7). Ten eerste is er de denaturatie fase waarbij het template DNA enkelstrengig (ssDNA) wordt gemaakt bij een temperatuur tussen 92°C en 98°C. Dan volgt de annealing stap of de aanhechting van de primers met hun complementaire sequentie waarbij de temperatuur verlaagd wordt tot 50 à 60°C. De laatste stap is de extensie (elongatie) waarbij het DNA polymerase dNTPs aanbouwt, vertrekkend van de twee gebonden primers, bij een temperatuur van 72°C gevolgd door terminatie.

Figuur 7: Schematische voorstelling van een PCR reactie. Afkortingen: P, primer.

24

De LabChip GX (Caliper Technologies) is een analyse instrument dat op basis van elektroforese de PCR-producten volgens hun grootte scheidt. De lengte van het amplicon en de concentratie van het PCR-product wordt bepaald door vergelijking met de ladder en interne merkers. Via de LabChip kan ook de specificiteit van de primers worden aangetoond. Met behulp van de LabChip GX software kunnen de bandjes worden bekeken. Benodigdheden zijn terug te vinden in Bijlage 1. 2) Protocol

1. Bereiding van de mastermix gebeurt volgens berekeningen in Tabel 2 (Kapa kit, Biosystems).

2. Alles behalve het Taq enzyme wordt vooraf gevortext en kort gecentrifugeerd. Het Taq polymerase mag enkel kort afgedraaid worden. 3. 0,5 ml epjes (Thermo Scientific) worden gevuld met 23µl mastermix en 2µl cDNA (5-50 ng/µl). Aan de blanco wordt in plaats van cDNA 2µl water toegevoegd. 4. De epjes worden ingeladen op de C1000 Thermo Cycler. Voor deze thesis werden voornamelijk de programma’s TD 6250 en KAPA7055 aangewend. De programma lay-out is terug te vinden in Bijlage 2. 5. Voor de LabChip analyse wordt de 384 well plaat gevuld met 17µl nuclease-vrij water en 3µl cDNA.

Tabel 2: Voorbereiding mastermix met KAPA kit. Afkortingen: Magnesiumdichloride (MgCl2), micromolair (µM), millimolair (mM).

Reagens

Per reactie (µl)

5x Kapa buffer

5

25mM MgCl2

1.5

1mM dNTP

5

5µM Forward primer

2

5µM Reverse primer

2

Taq polymerase

0.2

H2O

8.9

cDNA (5-50 ng/µl)

2 µl

25

2.2 MUTANT TYPE 2.2.1 MORFOLINO’S

1) Principe Zebravissen worden dikwijls aangewend om genen uit te schakelen. Dit kan bekomen worden via verschillende technieken. Een bepaald gen kan gemanipuleerd worden via mutagenese of door neerregulatie van het zebravis homoloog, gebruikmakend van antisense morpholino oligonucleotides (AMO) of morfolino’s (Gene Tools, Philomath, USA) [36]. Deze niet-ionische RNA/DNA analogen danken hun naam aan de morfolino-ring in hun ruggengraat in plaats van de ribose of deoxyribose-ringen karakteristiek voor RNA en DNA (Figuur 8). De negatief geladen fosfaatverbindingen bij DNA en RNA zijn bij de morfolino vervangen door een niet-ionische fosfordiamide link (Figuur 9). Morfolino’s binden effectief aan complementaire nucleotiden en zorgen voor blokkering via sterische hindering. Hun onnatuurlijke structuur en gebrek aan anionische sites op de ruggengraat zorgen voor bescherming tegen degradatie door nucleasen.

Figuur 8: Vergelijking ringen in ruggengraat van DNA (links), morfolino (midden) en RNA (rechts) [42].

Figuur 9: Chemische structuur morfolino [42].

26

Morfolino’s worden zo ontworpen dat ze enerzijds het ATG startcodon kunnen versperren, wat leidt tot inhibitie van de translatie (translationele morfolino) (Figuur 10A). Anderzijds kunnen ze splicesites blokkeren, wat exon skipping induceert (splicesite blokkerende morfolino) (Figuur 10B). Vanwege de makkelijke toedieningswijze en de hoge efficiëntie is het gebruik van AMO’s een vaak voorkomende techniek. De werking is echter maar tijdelijk en door de essentiële kweek-en isoleerstappen is de procedure redelijk arbeidsintensief [43]. Een ander probleem bij het gebruik van AMO zijn de zogenaamde off-target effecten. Hierbij kan het gebeuren dat het fenotype niet het gevolg is van de knock-down van het desbetreffende gen maar door een irrelevant genproduct. Een oplossing hiervoor is het gebruik van minstens twee morfolino’s tegen een specifiek gen waarbij de hoeveelheid mofolino gelijk is en de fenotypes later vergeleken worden. Het gebruik van een controle morfolino (CNTR) is belangrijk om het effect van de injectie zelf te controleren [44].

Figuur 10: Schematische voorstelling van het werkingsmechanisme van morfolino’s. Morfolino’s kunnen enerzijds het ATG startcodon hinderen (A) of de splicesites versperren met exon skipping tot gevolg (B). Aangepast uit [45].

Er werd niet gekozen om vissen te injecteren met een morfolino tegen myt1la en myt1lb omdat er een stabiele knock-out mutant ter beschikking is. Door de zeer lage expressie van zgc:171506 in de zebravis werd gekozen om een morfolino te ontwikkelend tegen zgc:194895. Het moleculair effect van een splicesite blokkerende morfolino kan nagegaan worden via RT-PCR, vermits een succesvolle splice modificatie ervoor zal zorgen dat het desbetreffende exon niet uitgesplitst wordt met deletie van het exon als gevolg (Figuur 10B).

27

In een injectie experiment worden naast de morfolino nog twee condities vergeleken. De standaard controle morfolino is een non-targeting controle en zou geen specifiek fenotype geven. Deze wordt geïncludeerd om te normaliseren voor het effect van de injectie zelf en off-target effecten. Anderzijds worden WT vissen (niet geïnjecteerd) meengenomen om de kwaliteit van de vissen na te gaan (onderscheid off-target effects en slecht kwalitatieve embryo’s). Benodigdheden zijn terug te vinden in Bijlage 1. Protocol 1. Vissen worden gekweekt zoals beschreven in punt 2.1.1. Er wordt geïnjecteerd vóór het bereiken van het achtcellig stadium (1,25 uren post fertilisatie [hpf]). Na dit stadium zijn de cel-cel contacten meer definitief en zal de morfolino niet meer diffunderen over het volledige embryo.

2. Mastermix: totaalvolume van 6 µl met 0,6 µl 10x Danieau oplossing om de pH te neutraliseren, 0,6 µl fenolrood als merker, X µl RO water en Y µl verdunde morfolino (afhankelijk van gewenste concentratie). 3. Verwarm de morfolino werkoplossing (1 mM) (10 min, 65°C). Parafilm rond het epje verhindert verdamping. 4. Vortexen en kort centrifugeren. 5. Snijd de naald totdat het 11 millimeter (mm) lang is (druppel is 1.436 nanoliter en 0.14 mm diameter). Er wordt gemeten vanaf het punt waar de diameter van de naald afneemt. 6. De naald wordt met 2 µl mastermix gevuld (microladertip). Het wordt vochtig gehouden via een oliedruppel op een dekglaasje. 7. Activeer de Femtojet injector (standby knop) a) Breng de naald in b) Koppel de tube aan c) Startinstellingen voor de injector: i. injectiedruk (Pi) = 500 hectopascal (hPa), ii. injectietijd (Ti) = 0,3 seconden (sec) 28

iii. compensatiedruk (Pc) = 20 hPa. De druk van de naald dient stabiel te zijn. d) Via de optie clean worden luchtbellen verwijderd. e) Kalibratie naald/volume injectiedruppel in een druppel minerale olie: streef naar een druppeldiameter van 0,14 mm op de micrometerlat. 8. De bevruchte eitjes worden gecollecteerd in een petrischaal met E3 medium (+ methyleenblauw). 9. De embryo’s worden vervolgens overgebracht in laantjes in een petrischaal met agarose. Er wordt geïnjecteerd in de dooierzak. Daarbij dient zowel het chorion als de dooierzak doorprikt te worden. De injectie wordt gecontroleerd via de aanwezigheid van een rode stip in de dooierzak (fenol rood).

2.2.2 ZEBRAVISMUTANT MYT1LB

1) Principe Het Zebrafish Mutation Project (Sanger instituut, UK) ambieert om voor elk eiwitcoderend gen in het zebravisgenoom een knock-out allel te maken. Dit doet men door combinatie van whole exome enrichment en next-generation sequencing. Via N-ethyl-N-nitroso-ureum (ENU) mutagenese worden willekeurige puntmutaties in het zebravisgenoom gebracht. Door de gemuteerde vissen telkens te laten paren met WT vissen hoopt men uiteindelijk een vis te creëren die slechts één geninactiverende mutatie bevat (Figuur 11). Zo werd de myt1lb mutant bekomen [46]. Dit neemt uiteraard tijd in beslag, maar het creëren van een stabiele mutant maakt voor het neerreguleren van een gen morfolino’s overbodig.

29

Figuur 11: Voorstelling Zebrafish Mutation Project [32].

De Zebrafish Insertion Collection stelt ook zebravis mutanten ter beschikking voor biomedisch onderzoek. Hierbij gebruikt men retroviraal gemedieerde insertionele mutagenese gecombineerd met hight-troughput sequencing en mapping technologie. De mutante vissen met provirale integraties worden gedistribueerd via het ZIRC. Zo is er nu ook een myt1la mutant ter beschikking [47].

2.2.2.1 GENOTYPERING

1) Principe Voor genotypering gaat men na of de zebravis in kwestie een mutatie draagt in het gen van interesse. Het DNA wordt geëxtraheerd uit een stuk van de staartvin. Dit collecteert men via finclipping. De staartvin is gemakkelijk te amputeren en regenereert snel [48]. Via Sanger sequenering wordt vervolgens nagegaan of de vis in kwestie de mutatie draagt. Benodigdheden zijn terug te vinden in Bijlage 1 . 2) Protocol

1. Voor de amputatie worden vissen in een afzonderlijke kweekbak (3,5 liter) overgebracht. Elke vis krijgt een identificatienummer. Zolang de resultaten niet gekend zijn blijven de vissen gescheiden.

30

2. De vissen worden verdoofd door even te baden (30-60 sec) in een externe kweekbak gevuld met een tricaïne anestheserende werkoplossing (1x = 4 ml 25x tricaïne stockoplossing + 96 ml systeemwater). 3. Wanneer de vis niet beweegt na stimulus wordt deze geplaatst op een plastic lepel met gaten. De vis wordt gepositioneerd zodat het lichaam op de lepel ligt en de staart uitsteekt. 4. Met een scalpel wordt een klein stukje van de staartvin gesneden dat wordt bewaard in een epje met 200µl DNA extractiebuffer (4°C). 5. Voor de DNA extractie worden de epjes eerst 10 min op de thermomixer geplaatst bij 99°C. 6. Om de eiwitten te vernietigen wordt 5 µl proteinase K toegevoegd waarna overnacht een incubatie gebeurt bij een temperatuur van 55°C op de thermomixer en schuddend aan 350 rpm.

7. Daarna worden de epjes gevortext en het proteinase K geïnactiveerd door incubatie bij 99°C voor 10 min. Het DNA kan onmiddellijk gebruikt worden voor PCR of bewaard bij -80°C. 8. Het DNA dient 20 maal verdund te worden en 2,5µl van deze oplossing wordt gebruik voor een 25 µl PCR mix. 9. Na een PCR reactie zoals in punt 2.1.6 beschreven, wordt een sequenering uitgevoerd door de Genetic Service Unit (GSU) faciliteit. De sequentie met de mutatie wordt via het Finch (https://medgenpr.ugent.be/Finch) opgehaald en vergeleken met de sequenties van de vissen met behulp van de Sequence Scanner v0.1 (Applied Biosystems). Op die manier kunnen de heterozygote mutanten geïdentificeerd worden.

31

2.2.2.2 KRUISINGSSCHEMA

Een kruisingsschema om de ultieme homozygote mutant te bekomen voor myt1la en myt1lb wordt weergegeven in Figuur 12.

Figuur 12: Kruisingsschema voor het bekomen van een homozygote mutant voor myt1la en myt1lb.

2.2.2.3 KWEKEN

Het kweken verloopt zoals beschreven in punt 2.1.1

32

3. RESULTATEN 3.1 WILD TYPE 3.1.1 HOMOLOGIE

Door een genoomduplicatie die mogelijks plaatsvond vroeg in de evolutie van de beenvissen, heeft het humane MYT1L gen twee paralogen in de zebravis namelijk myt1la en myt1lb. De zebravis heeft voor zo’n 20 % van de zoogdier genen twee homologen [37]. Deze zijn terug te vinden in de Zebrafish Model Organisme Database (ZFIN, http://zfin.org/). Gen duplicaties kunnen geassocieerd worden met een functieverandering en voor minstens één van de leden van het genpaar kunnen eigen expressiedomeinen aanwezig zijn. Wanneer er sprake is van functie similariteit bij de paralogen wordt de neerregulatie van een gen van interesse bemoeilijkt door overname van de functie door één van de kopieën. Bij complementariteit zijn de functies van het oorspronkelijke gen verdeeld over de twee zebravishomologen. Bij synergisme is de gezamenlijke invloed van de genen groter dan die van de som afzonderlijk. Vooral bij genen gevoelig aan dosage effecten kan één kopie van het gen een pseudogen worden (non-functionalisatie) met verlies van de functie tot gevolg. Tot slot kunnen de functies verschillen (subfunctionalisatie) doordat één of beide genen een nieuwe functie (neofunctionalisatie) krijgt [49]. Het myt1la gen is gelegen op chromosoom 20 en myt1lb op chromosoom 17. HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene) stelt het humane MYT1L gen en de zebravis gen myt1la als homologen van elkaar voor. In HomoloGene wordt myt1lb niet erkend als homoloog maar in Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) wel. Via Ensembl werd de homologie op proteïne niveau vervolledigd met myt1lb zoals te zien in Figuur 13a. Ensembl gaf een gelijkaardige proteïne overeenkomst na vergelijking van het humane MYT1L met myt1la/myt1lb van respectievelijk 69% en 67%. Na blasten in Uniprot KB (http://www.uniprot.org/help/uniprotkb) en Ensembl geleken de zebravishomologen op eiwitniveau respectievelijk 59% en 48% op elkaar. Op nucleotide niveau blijft de vergelijking tussen MYT1L en myt1la of myt1lb gelijkaardig (83% en 73% respectievelijk volgens NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)) net zoals bij de zebravis homologen onderling (65% volgens NCBI en 67% volgens ZFIN).

33

Figuur 13: Eiwitten gebruikt in sequentie vergelijking en hun geconserveerde domein structuur (HomoloGene

[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene] en Ensembl [http://www.ensembl.org/index.html]). Vergelijking van MYT1L met zijn zebravishomologen op eiwitniveau (a). Vergelijking van DEAF1 met zijn zebravishomologen op eiwitniveau (b).

Het zgc:194895 gen is gelegen op chromosoom 25 en zgc:171506 op chromosoom 3 van het zebravisgenoom. HomoloGene stelt het humane DEAF1 gen en het zebravis gen zgc:194895 als homologen van elkaar voor. Met behulp van Ensembl wordt de homologie op proteïne niveau vervolledigd met zgc:171506 zoals te zien in Figuur 13b. Ensembl gaf na vergelijking van het humane eiwit DEAF1 met de zebravis homologen een gelijkaardige proteïne overeenkomst van 39% (zgc:194895) en 33% (zgc:171506). De zebravishomologen onderling gaven een overeenkomst van 36% volgens Ensembl. Op nucleotide niveau geeft de vergelijking tussen DEAF1 en zgc:194895 een resultaat op van 42% volgens Ensembl. Vergelijken van deze laatste genen met zgc:171506 gaf geen resultaat.

34

3.1.2 QPCR

Om de expressie van myt1la, myt1lb, te karakteriseren werd de expressie via qPCR nagegaan over verschillende tijdstippen gaande van 0 tot 14 dpf. De volgende genen werden meegenomen als referentiegenen: loopern4, hatn10, hatn8 en tdr7. De primers voor myt1la, myt1lb, zgc:194895 en zgc:171506 zijn terug te vinden in Bijlage 3. Bij de expressie van myt1la in zebravissen met leeftijd 0 tot 14 dpf is er tussen 0 en 1 dpf weinig expressie (Figuur 14). Er zijn twee pieken waarneembaar ter hoogte van 3 en 10 dpf. Bij 12 dpf is er een opmerkelijke val van expressie. De expressie neemt dan terug toe tot 14 dpf maar is lager dan tijdens de embryonale ontwikkeling van de zebravissen.

Figuur 14: Expressie van myt1la in zebravissen met leeftijd 0 tot 14 dpf.

Expressie van myt1lb in zebravissen met leeftijd 0 tot 14 dpf vertoont een gelijkaardig patroon als myt1la, met een piek op 3dpf (Figuur 15). Bij 8 en 10 dpf is er een stabilisatie van de expressie. Opnieuw doet zich op 12 dpf een aanzienlijke daling voor. Bij 14 dpf is er dan weer een iets hogere expressie.

35

Figuur 15: Expressie van myt1lb in zebravissen met leeftijd 0 tot 14dpf.

Er werden extra tijdstippen meegenomen (8 en 10 dpf) voor de DEAF1 zebravis homologen (Figuur 16 en 17) omdat vorige data uitwezen dat de expressie voor beide genen op 1 dpf hoger was dan latere tijdstippen. De resultaten tonen dat de expressie vóór 1 dpf nog hoger is bij alle twee de genen met een piek op 8 dpf. Terwijl er op 10 hpf een grote expressie is van zgc:194895 is er op dit tijdstip geen expressie van zgc:171506. Daarna daalt de expressie bij beiden met een stabilisatie vanaf 24 hpf. Voor zgc:171506 zijn nog 2 pieken van expressie waarneembaar op 8 en 12 dpf.

Figuur 16: Expressie van zgc:194895 in zebravissen met leeftijd 0 tot 14 dpf.

Figuur 17: Expressie van zgc:171506 in zebravissen met leeftijd 0 tot 1 dpf.

36

3.1.3 IN SITU HYBRIDISATIE (ISH)

a) In situ hybridisatie myt1la De in situ hybridisatie werd niet zelf uitgevoerd maar door medewerkers van de zebravisfaciliteit. De probesequenties zijn terug te vinden in Bijlage 3b.

Figuur 18: Visualisatie van de expressie van myt1la in zebravissen van 1 tot 4 dpf oud (lateraal, dorsaal en ventraal), (afkortingen: d, dooierzak; o, oog; t, telencephalon; h, hindbrain; m, midbrain; MHBC, midbrainhindbrain-boundary contriction).

37

b) In situ hybridisatie deaf1(zgc:194895) De in situ hybridisatie werd niet zelf uitgevoerd maar door medewerkers van de zebravisfaciliteit. De probesequenties zijn terug te vinden in Bijlage 3b.

Figuur 19: Visualisatie van zgc:194895 in zebravissen van 1 tot 4 dpf oud (lateraal, dorsaal en ventraal), (afkortingen: or, ontwikkelende ruggenmerg; vk, vin knop; o, oog).

c) Structuren Bij de in situ hybridisatie is te zien hoe de expressie van myt1la op 1 dpf zich beperkt tot de forebrain. De expressie stijgt bij 2 dpf met een piek zichtbaar bij 3 dpf waar het gen duidelijk tot expressie komt in het telencephalon, de midbrain, hindbrain en de midbrainhindbrain-boundary constriction (MHBC). Daarna daalt de expressie weer. De hoogste expressie van zgc:194895 is reeds zichtbaar bij 1dpf en in meerdere structuren van de zebravis naast de hersenen zoals het oog, het ontwikkelende ruggenmerg en de vin knoppen. Naarmate de leeftijd toeneemt, vermindert de expressie in andere lichaamsdelen en beperkt ze zich tot de hersenen.

38

3.2 MUTANT TYPE 3.2.1 MORFOLINO’S

Voor myt1la en b is een stabiele mutant ter beschikking. De morfolino’s worden voor deaf1 (zgc:194895) aangewend. Er werden twee splicesite blocking morfolino's getest gericht tegen respectievelijk exon 2 en 3 (Figuur 20 a-b). Voor de eerste morfolino (exon 2) werd allereerst een concentratiereeks getest: 2, 3, 4, 7 en 10 ng werden geïnjecteerd in jonge embryo's (<8-cellig stadium) en deze werden geëvalueerd op 2 en 3 dpf (Figuur 20). Aangezien bij geen enkele hoeveelheid een duidelijk fenotype zichtbaar was, werd in een tweede test geïnjecteerde vissen (2 en 4 ng morfolino) op een later tijdstip geëvalueerd (4 en 7 dpf) (Figuur 21). Opnieuw vertoonden de vissen geen duidelijk opmerkbaar fenotype. Zelfs bij de hogere hoeveelheden (7 en 10 ng) werden geen duidelijke aspecifieke effecten opgemerkt. Voor de tweede morfolino werden vissen geïnjecteerd met 2 en 4 ng en geëvalueerd bij een leeftijd van 2 en 3 dpf. Ook voor deze morfolino werd op 3 dpf geen zichtbaar fenotype waargenomen (Figuur 25). Sequenties van de morfolino’s zijn terug te vinden in Bijlage 2b.

Figuur 20: Schematische voorstelling morfolino mechanisme voor exon 2 (a) en 3 (b) met de normale situatie bovenaan en morfolino blokkerende situatie onderaan. Voorstelling primers voor PCR en qPCR (c-d).

39

3.2.1.1. SPLICESITE BLOCKING MORFOLINO EXON 2

a) Foto’s fenotype Op de foto’s (Figuur 21) is te zien hoe geen enkele concentratie geïnjecteerde morfolino een zichtbaar fenotype teweegbrengt. De controle morfolino werd meegenomen om de invloed van de injectie zelf te visualiseren. Om aspecificiteit aan te tonen werd er vergeleken met de controle en de WT. De vissen vertonen geen zichtbaar fenotype na morfolino injectie van 2 en 4 ng bij 7 dpf (Figuur 22). Om aspecificiteit aan te tonen, werd het fenotype van de met morfolino geïnjecteerde vis enkel met een WT vergeleken.

Figuur 21: Foto’s van zebravissen geïnjecteerd met 2, 3, 4, 7 en 10 ng morfolino op 3 dpf. Afkortingen: MO, morfolino; CNTR, controle; WT, wild type.

Figuur 22: Foto’s van zebravissen geïnjecteerd met 2 en 4 ng op 7dpf. Afkortingen: MO, morfolino; WT, wild type.

40

b) Resultaten RT-PCR De duur van het knock-down effect is morfolino afhankelijk. Zo is de eerste morfolino actief tot minstens de oudste leeftijd die bij deze experimenten werd onderzocht, namelijk 7 dpf. Dit werd aangetoond via RT-PCR met primers die ontwikkeld werden op exon 1 en 3, aangezien exon 2 het exon van interesse is (Figuur 20c). Amplificatie van het PCR product wordt op de LabChip vertaald als een bandje van 293 bp, zoals te zien is bij de controle en de WT (Figuur 23). De injectie van een morfolino zorgt echter voor een blokkade van de splicesite waardoor het exon 2 niet wordt uitgespliced en samen met de intronen wegvalt (exon skipping). Het verdwijnen van exon 2 zorgt voor een bandje van 195 bp. Door onvolledige knock-out zijn beide bandjes zichtbaar op de gel. In onze morfolino PCR resultaten is er ook nog een groter bandje te zien. Een intron retentie kan ontstaan wanneer de splice grenzen op het einde van de intronen, die het geblokkeerde exon flankeren, niet herkend worden. Dit wordt echter uitgesloten vermits de intronen groter zijn dan 2 kb. Het bandje duidt hoogstwaarschijnlijk op aspecificiteit van de primers vermits ze ook bij sommige wild types en controles aanwezig is . In Figuur 23 zijn de gelelektroferese resultaten voorgesteld voor 2 en 4 ng morfolino op 2, 3, 4 en 7 dpf. Bij 4 en 7 dpf werden geen controles meer meegenomen omdat er geen aspecificiteit werd gevonden bij de controles van 2 en 3 dpf (a-b). De morfolino blijft actief tot op minstens 7 dpf. De overige resultaten zijn opgenomen in Bijlage 4.

41

Figuur 23: RT-PCR resultaten van vissen geïnjecteerd met 2,4 ng bij 2 dpf (a), 3 dpf (b), 4dfp (c) en 7 dpf (d). Afkortingen: MO1, morfolino; MO2, morfolino replicate; CNTR, controle; WT, wild type.

c) Resultaten qPCR exon 2 De qPCR biedt een tweede mogelijkheid naast RT-PCR om de knock-down te confirmeren. De primers werden ontworpen op exon 2 (Figuur 20c). De hypothese luidt dat als exon 2 in een bepaald percentage wegvalt dit op RNA niveau kan weergegeven worden als neerregulatie van expressie. De sequenties zijn terug te vinden in Bijlage 3a. De qPCR resultaten van 2 en 3 ng morfolino bij 2 dpf worden weergegeven in Figuur 24. De controle morfolino werd telkens als referentie gebruikt en is ongeveer gelijk aan de WT. Merkwaardig genoeg tonen de resultaten van de qPCR aan dat de morfolino eerder een overexpressie veroorzaakt. De overige resultaten zijn terug te vinden in Bijlage 5.

42

Figuur 24: Effect van morfolino injectie van 2 en 3 ng bij 2 dpf, nagegaan met qPCR. (mo: morfolino, cntr: controle). Afkortingen: mo, morfolino; cntr, controle; wt, wild type.

3.2.1.2 SPLICESITE BLOCKING MORFOLINO EXON 3

a) Foto’s fenotype Na injectie van 2 of 4 ng werd na 3 dpf geen zichtbaar aberrant fenotype geconstateerd (Figuur 25). Om aspecificiteit aan te tonen werd er vergeleken met de WT maar niet meer met een controle vermits vorige data uitwezen dat er geen apart effect werd veroorzaak door de injectie.

Figuur 25: Foto’s van zebravissen geïnjecteerd met 2 en 4 ng morfolino op 3dpf. Afkortingen: MO, morfolino; WT, wild type.

43

b) Resultaten RT-PCR Hier werden primers ontwikkeld waarbij het amplicon het exon 3 omvat. In dit geval overspannen de primers het deel gelegen tussen exon 1 en exon 4 (Figuur 20d). De sequenties zijn terug te vinden in Bijlage 3a. Normaal wordt bij een PCR reactie van dit amplicon een bandje van 459 bp verwacht na gelektroforese. Na morfolino injectie zal blokkade van de splicesite tijdens transcriptie zorgen voor het wegvallen van exon 3 samen met de intronen 2 en 3 (exon skipping). Dit heeft als gevolg dat er een bandje zal zichtbaar zijn van 329 bp. Door onvolledige knock-down blijft er na injectie ook een bandje zichtbaar op 495 bp. Naast een bandje van 459 bp zijn bij de morfolino’s ook grotere bandjes aanwezig wat mogelijk duidt op apecificiteit van de primers (Figuur 26). Nochtans toonde een in silico PCR via UCSC (http://genome.ucsc.edu/) voor de primers slechts één amplicon. Er is ook slechts heel vaag een bandje zichtbaar rond 329 bp. Dit kan wijzen op een onvolledige morfolino injectie (partiële diffusie) of een lage knock-down door de morfolino (lage effectiviteit). De bandjes werden geschaald in contrast met het zwakke bandje van 329 bp.

Figuur 26: RT-PCR resultaten van vissen geïnjecteerd met 2 en 4 ng morfolino bij 2 dpf (a) en 2, 4 ng bij 3 dpf (b). Afkortingen: MO1, morfolino; MO2, morfolino replicate; CNTR, controle; WT1, wild type,WT2-3, wild type replicates.

44

c) Resultaten qPCR exon 3 De qPCR biedt naast de RT-PCR nog een manier om neerregulatie door de morfolino te controleren. Hier worden de resultaten van de qPCR ter confirmatie van de knock-down door de morfolino weergegeven van 2 en 4 ng morfolino bij 2 en 3 dpf (Figuur 27). De primers werden ontworpen op exon 3 (Figuur 20d). De sequenties zijn terug te vinden in Bijlage 3a. Het WT wordt hier als referentie gebruikt. Er werden ook replicates meegenomen. Ook hier tonen de resultaten van de qPCR merkwaardig genoeg aan dat de morfolino eerder een overexpressie veroorzaakt.

Figuur 27: Effect van morfolino injectie van 2 en 4 ng bij 2 en 3 dpf nagegaan via qPCR. (mo: morfolino, cntr: controle). Afkortingen: mo, morfolino; cntr, controle; wt, wild type.

45

3.2.2 ZEBRAVISMUTANT

Zowel de stabiele myt1la als myt1lb mutant is ter beschikking in de zebravisfacilteit. In deze thesis zal de nadruk gelegd worden op de myt1lb mutant aangezien de recent ontwikkelde myt1la mutante vissen niet geslachtsrijp zullen zijn voor het einde van dit werk. De vissen worden geleverd als een mix van WT en heterozygoten. Om een onderscheid te maken wordt elke vis afzonderlijk gegenotypeerd door middel van finclipping en sequenering. Een voorbeeld van een positief en negatief resultaat zie je in onderstaande figuur. In 8 van de 16 myt1lb mutante vissen werd de voorspelde puntmutatie teruggevonden (zie Bijlage 6).

Figuur 28: Voorstelling positief en negatief resultaat na analyse op Sequence Scanner v0.1. Bovenaan wordt de sequentie met de G/T puntmutatie weergegeven.

46

4. DISCUSSIE

1. Expressie van myt1la en myt1lb in de wild type zebravis Zoals eerder vermeld suggereert de temporele en neuro-anatomische distributie van MYT1L expressie een belangrijke rol in neuronale differentiatie. Dit is gebaseerd op de bevinding dat de expressie van Myt1l in muis en rat embryo’s zich beperkt tot de ontwikkeling van het CZS waar het de neurogenese beïnvloedt. Myt1l komt gedurende de embryogenese voornamelijk tot expressie tijdens de differentiatie van post-mitotische neuronen zoals deze in de cerebrale cortex, thalamus, hindbrain en dorsale wortel ganglia [18-20]. In de Allen Brain Atlas (http://developingmouse.brain-map.org/.html) wordt de expressie van Myt1l gevisualiseerd tijdens de embryonale ontwikkeling van de muis. De expressie is zichtbaar vanaf 13,5 dpf en neemt daarna sterk toe tot 14 dagen na de geboorte en stabiliseert daarna. Bij de muis is ook te zien hoe de expressie zich tot 15,5 dpf niet beperkt tot de hersenen maar ook voorkomt in het ontwikkelende ruggenmerg. Bij de zebravis bestaat de neurogenese uit twee fasen namelijk een primaire en secundaire fase. De primaire fase start ongeveer vanaf 16 hpf met de vorming van enkele neuronen die een simpel netwerk vormen (Figuur 29) [50]. Hierdoor vertoont de larve al bij 18 hpf gedrag in de vorm van spontane tics volgens de lichaamsas [51]. Genexpressie data (ISH en qPCR) van de zebravis suggereren dat myt1la en myt1lb expressie start bij de primaire neurogenese. Na 2-3 dpf vindt zich een tweede golf van neurogenese plaats die leidt tot de vorming van de subregio’s van het volwassen brein [50]. Dit kan een verklaring bieden voor de piek van myt1la en myt1lb expressie gezien op 3 dpf. De genen kunnen een belangrijke rol spelen bij de primaire en voornamelijk de secundaire fase van de neurogenese. Het gelijkaardige expressiepatroon van de paralogen alsook de resultaten uit de homologie (3.1.1) kunnen wijzen op een gelijkaardige of synergistische relatie. De tweede piek rond 10 dpf vraagt om verder onderzoek. Data uit andere studies suggereren dat er een zogenaamde time window bestaat waar de vroege forebrain van de muis (12,5-13,5 dpf) en de zebravis (3 dpf) gelijkaardige expressie patronen vertonen van genen betrokken in de neurogenese [52]. Het Myt1l gen werd niet vermeld in deze studie maar andere transcriptie factoren zoals Neurogenin1 en NeuroD1

47

wel. Met deze bevinding in het achterhoofd geven onze resultaten een bijkomende evidentie dat het myt1l gen een belangrijke rol speelt bij de neurogenese.

Figuur 29: Deconstrucie van de zebravis hersenen. (a) Schematische voorstelling van de zebravis hersenen waarvan vele structuren teruggevonden worden in gelijkaardige subregio’s van het volwassen humane brein. (b) Schematische voorstelling van de embryonale hersenen bij vroege fasen van de neurogenese. (c) Schematische voorstelling van de embryonale hersenen bij de late fases van de primaire neurogenese. Afkortingen: mpf, months post fertilization; drc, dorsorostral cluster; vrc, ventrorostral cluster; vcc, ventrocaudal cluster; hc, hindbrain clusters; ec, epiphyseal cluster; nTPC, nucleus of the tract of the posterior commissure; AC, anterior commissure; POC, postoptic commissure; SOT, supra-optic tract; DVDT, dorsoventral diencephalic tract; MLF, medial longitudinal fasciculus; DLT, dorsal longitudinal tract; VLT, ventral longitudinal tract; TPC, tract of the posterior commissure; TPOC, tract of the postoptic commissure; OB, olfactory bulb; P, pallium; S, subpallium; e, epiphysis; Ha, habenula; DT, dorsal thalamus; VT, ventral thalamus; PT, posterior tuberculum; OC, optic chiasm; Te, tectum; nMLF, nucleus of the medial longitudinal fasciculus; III, nucleus of oculomotor nerve; Va, valvula cerebelli; nIP, nucleus interpeduncularis; Hy, hypothalamus; Ce, cerebellum; IV, nucleus of trochlear nerve; LC, locus coeruleus; V, nucleus of trigeminal nerve; RF, reticular formation; R, raphe nuclei; IO, inferior olive; VIII, nucleus of the octaval nerve; FL, facial lobe; Vlo, vagal lobe [50].

2. Expressie van zgc:194895 en zgc:171506 in wild type zebravis In de ontwikkeling van de zebravis is de voorloper van het CZS reeds zichtbaar tegen het einde van de gastrulatie. Dit speelt zich af ongeveer rond 10 hpf en wordt aangetoond door de vorming van de neurale plaat. Het ontstaan van het CZS ligt al vast vóór de morfologische aanwezigheid van de neurale plaat. De zebravis heeft dan al een rudimentair 48

patroon vastgelegd voor de toekomstige hersenen en het ruggenmerg. Neurale inductie en patroonvorming begint heel vroeg in de ontwikkeling, namelijk bij het begin van de gastrulatie [50]. De homoloog zgc:194895 komt in het algemeen veel hoger tot expressie dan zijn paraloog zgc:171506 in de zebravis. De vroege expressie van zgc:194895 maar ook de aanwezigheid in het ruggenmerg kan wijzen op een vroege rol bij de ontwikkeling van het CZS voor 24 hpf. De expressie resultaten van de ISH worden bevestigd door de qPCR resultaten. In het begin van de ontwikkeling hebben de homologe zebravis genen een gelijkaardig expressiepatroon. Rond 8 hpf hebben de genen misschien een gelijkaardige functie. De paraloog zgc:171506 vertoont bij de qPCR van de tijdsreeks op 10 en 12 dpf nog twee expressiepieken naast die op 8 hpf. Een verklaring kan zijn dat zgc:171506 een bijkomende functie heeft verworven gedurende evolutie (subfunctionalisatie) of er is sprake van complimentariteit rond 10 hpf, 10 dpf en 12 dpf tussen de twee paralogen. Met behulp van de Allen Brain Atlas (http://developingmouse.brain-map.org/.html) wordt ook de expressie van Deaf1 in de muis in kaart gebracht. De expressie start pas op de leeftijd van 15,5 dpf waarbij de aanwezigheid in de hersenen heel klein is en die in het ruggenmerg aanzienlijk groter. Op latere leeftijden beperkt de expressie zich tot de hersenen. Vanaf 14 dagen na de geboorte is er een hoge expressie en dan voornamelijk in de cerebrale cortex. Fenotypische evolutie in dieren wordt voor een groot deel gestuurd door verschil in gen expressie patronen [53]. Deze kunnen het resultaat zijn van sequentie veranderingen in cisregulatorische elementen. Dit kan een verklaring zijn voor dit temporeel-anatomisch verschil in expressie tussen de zebravis en de muis. 3. Neerregulatie van zgc:194895 via morfolino injectie Injectie van de morfolino’s levert geen zichtbaar fenotype op. Bij exon 3 kan dit mogelijk zijn door partiële diffusie van de morfolino bij injectie of lage effectiviteit van de morfolino. De ultieme knock-out vis zal een betere indicatie geven over het effect van de knock-down. De aanwezigheid van twee paralogen voor myt1l en deaf1 in de zebravis maakt het moeilijk het effect van neerregulatie te onderzoeken. Zoals eerder vermeld kan er namelijk sprake zijn van synergisme of similariteit van de gen functies. Het kan zijn dat zgc:171506 één of meerdere functies van het neergereguleerd gen heeft overgenomen waardoor geen zichtbaar fenotype is ontstaan. Het is ook mogelijk dat verlies van het gen simpelweg geen visueel aberrant fenotype oplevert of dat men pas op cellulair niveau morfologische veranderingen 49

kan waarnemen. Tenslotte kan een verstandelijke beperking bij de mens ook voorkomen zonder specifiek opmerkbaar fenotype. Als het uitschakkelen van beide genen (zowel voor myt1l als voor deaf1) niet lethaal is, vermoeden we op basis van alle bovenvermelde data dat de neurogenese verstoord wordt en de cognitieve functie van de vis aangetast is. Bij toekomstperspectieven wordt besproken hoe dit kan worden nagegaan. Via PCR en qPCR werd de knock-down van het gen van interesse gecontroleerd. PCR van exon 2 toont mooi aan hoe de morfolino zorgt voor exon skipping. De qPCR geeft opmerkelijke data waarbij de morfolino injectie een extreem hoge expressiewaarde geeft. De morfolino zorgt dus voor een overmaat aan transcript met opregulatie van het gen als gevolg. Het onderliggend mechanisme moet nog achterhaald worden.

4. De zebravis en regeneratie De vorming van het CZS start met de neurogenese uit neurale stamcellen of progenitor cellen tijdens de ontwikkeling van het embryo. De neurogenese zet zich voort gedurende het ganse leven in bepaalde delen van de hersenen. De gradatie en onderliggende activiteit is verschillend tussen species. Zoogdieren hebben een gelimiteerde neurogenese in hun volwassen hersenen terwijl de zebravis constitutief nieuwe neuronen kan genereren tijdens het leven. Adulte neurogenese is te danken aan de aanwezigheid van progenitor cellen die continu prolifereren waardoor de zebravis gedurende het hele leven neuronen kan aanmaken. De progenitor cel niches bij de zoogdieren beperken zich tot de sub ventriculaire zone en de sub granulaire zone van de dentale gyrus in het telencephalon. Bij de zebravis zijn de niches meer abundant aanwezig en verdeeld langs de rostro-caudale hersen-as. De zebravis beschikt dus over een uitgebreid regeneratief vermogen [54]. Zo wordt een inflammatoire respons na verwonding gekoppeld aan efficiënte verbetering van stamcelactiviteit en initiatie van neuronale regeneratie die onderscheiden wordt van de constitutieve neurogenese in de volwassen zebravis hersenen [55]. Het regeneratief vermogen van de zebravis doet vragen rijzen rond de mogelijkheid van het induceren van mentale afwijkingen. De hypothese luidt dat de twee genen (myt1l en deaf1) een rol zouden spelen in de ontwikkeling van de neuronen. Door constitutieve neurogenese kan wel proliferatie optreden maar foutieve of afwezige differentiatie kan zorgen voor nietfunctionele neuronen. Dit kan leiden tot een verstandelijk beperking. Immunocytochemie kan aangewend worden voor onderzoek rond differentiatie aan de hand van merkers zoals de 50

Hu-proteïnen [56] of neuronale cytoskelet componenten zoals neurofilament en beta-III tubuline.

5. TOEKOMSTPERSPECTI EVEN

Na morfolino injectie voor neerregulatie van deaf1 is er morfologisch geen fenotype zichtbaar. Een rescue experiment kan op moleculair niveau het effect van de morfolino aanwijzen. Naast de morfolino wordt ook mRNA geïnjecteerd dat codeert voor hetzelfde eiwit waartegen de morfolino is gericht. Dit mRNA is aangepast zodat de morfolino er niet meer op kan binden. Zo wordt het transcript als het ware gered waardoor het amplicon op RNA niveau weer zichtbaar is. Om het fenotype na neerregulatie (morfolino/mutant) te verfijnen kan men door middel van paraffine ingebedde coupes waarop kleuringen worden uitgevoerd of neuronale merkers worden getest, structuren van de hersenen onderzoeken op afwijkingen. Er kan ondermeer een hematoxiline-eosine (HE) kleuring, golgikleuring of een calcium kleuring worden uitgevoerd. Na ISH op WT vissen is het eveneens mogelijk om de weefselspecifieke expressie van het gen waar te nemen door het maken van paraffine coupes. Om het effect van een knock-out mutatie in de myt1la en myt1lb mutante zebravissen te testen, kan er beroep gedaan worden op gedragsmethoden. Embryo’s kunnen op vroege leeftijd op gedrag getest worden. Embryo’s zijn reeds beweeglijk op het einde van de eerste dag van de ontwikkeling. Aanraken van het embryo nabij het hoofd induceert normaal een vlugge respons waarbij het embryo 180° rond zijn horizontale lichaamsas draait. Voorbeelden van gedragstesten voor volwassen vissen zijn ondermeer de T-maze waarmee het leervermogen, onderscheidingsvermogen en navigatie kan onderzocht worden. Object herkenning en beloningsystemen zijn nog andere voorbeelden van methoden om het gedrag te testen [57]. Recent kwam via het Sanger Instituut (UK) een Myt1l mutante knock-out muis ter beschikking. De muis als tweede diermodel zal een meerwaarde bieden aan dit onderzoek. De muis vertoont een grote similariteit in anatomie, fysiologie en genetica met de mens. Meer dan 95% van het genoom is gelijkaardig aan het humane genoom wat makkelijk extrapoleerbaarheid toelaat van data bekomen uit dit diermodel.

51

Referenties [1]

C. Galasso, A. Lo-Castro, N. El-Malhany, and P. Curatolo, “‘Idiopathic’ mental retardation and new chromosomal abnormalities.,” Italian Journal of Pediatrics, vol. 36, p. 17, Jan. 2010.

[2]

B. Winnepenninckx, L. Rooms, and R. F. Kooy, “Mental Retardation: A Review of the Genetic Causes,” The British Journal of Development Disabilities, vol. 49, no. 96, pp. 29–44, Jan. 2003.

[3]

AAIDD, “Definition of Intellectual Disability.,” 2012. [Online]. Available: http://www.aaidd.org/content_100.cfm?navID=21.

[4]

C. J. Curry, R. E. Stevenson, D. Aughton, J. Byrne, J. C. Carey, S. Cassidy, C. Cunniff, J. M. G. Jr, M. C. Jones, M. M. Kaback, J. Moeschler, G. B. Schaefer, S. Schwartz, and J. Tarleton, “Evaluation of Mental Retardation : Recommendations of a Consensus Conference,” American Journal of Medical Genetics, vol. 477, no. December 1996, pp. 468–477, 1997.

[5]

H. H. Ropers, “Genetics of intellectual disability.,” Current opinion in genetics & development, vol. 18, no. 3, pp. 241–50, Jun. 2008.

[6]

“Gauss curve met de distributie van IQ scores in de algemene populatie.” [Online]. Available: http://pharosnl.nl/menu/hoogbegaafd-nieuws/hoogbegaafdheid-artikelen/iq/.

[7]

Kind en Gezin, “Ontwikkeling,” 2012. [Online]. Available: http://www.kindengezin.be/ontwikkeling/motoriek/.

[8]

A. Rauch, J. Hoyer, S. Guth, C. Zweier, C. Kraus, C. Becker, M. Zenker, U. Hu, C. Thiel, and F. Ru, “Diagnostic Yield of Various Genetic Approaches in Patients With Unexplained Developmental Delay or Mental Retardation,” American Journal of Medical Genetics, vol. 2074, pp. 2063–2074, 2006.

[9]

J. de Ligt, M. H. Willemsen, B. W. M. van Bon, T. Kleefstra, H. G. Yntema, T. Kroes, A. T. Vulto-van Silfhout, D. a Koolen, P. de Vries, C. Gilissen, M. Del Rosario, A. Hoischen, H. Scheffer, B. B. a de Vries, H. G. Brunner, J. a Veltman, and L. E. L. M. Vissers, “Diagnostic Exome Sequencing in Persons with Severe Intellectual Disability.,” The New England Journal of Medicine, pp. 1921–1929, Oct. 2012.

[10]

The Arc, “Causes and Prevention of Mental Retardation,” 2012. [Online]. Available: http://www.thearc.org/page.aspx?pid=2543.

[11]

H. van Bokhoven, “Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities.,” Annual Review of Genetics, vol. 45, pp. 81–104, Jan. 2011.

[12]

J. W. Ellison, J. a Rosenfeld, and L. G. Shaffer, “Genetic Basis of Intellectual Disability.,” Annual Review of Medicine, no. September 2012, pp. 1–10, Sep. 2012.

[13]

H. Möhler, “Cognitive enhancement by pharmacological and behavioral interventions: the murine Down syndrome model.,” Biochemical Pharmacology, vol. 84, no. 8, pp. 994–9, Oct. 2012.

[14]

B. Mazur-Kolecka, A. Golabek, E. Kida, A. Rabe, Y.-W. Hwang, T. Adayev, J. Wegiel, M. Flory, W. Kaczmarski, E. Marchi, and J. Frackowiak, “Effect of DYRK1A activity inhibition on development of neuronal progenitors isolated from Ts65Dn mice.,” Journal of Neuroscience Research, vol. 90, no. 5, pp. 999–1010, May 2012.

[15]

J. Braudeau, B. Delatour, a Duchon, P. L. Pereira, L. Dauphinot, F. de Chaumont, J.-C. Olivo-Marin, R. H. Dodd, Y. Hérault, and M.-C. Potier, “Specific targeting of the GABA-A receptor α5 subtype by a

52

selective inverse agonist restores cognitive deficits in Down syndrome mice.,” Journal of Psychopharmacology (Oxford, England), vol. 25, no. 8, pp. 1030–42, Aug. 2011. [16]

N. Bostrom and A. Sandberg, “Cognitive Enhancement: Methods, Ethics, Regulatory Challenges,” Science and Engineering Ethics, pp. 311–341, 2009.

[17]

A. M. Slavotinek, “Novel microdeletion syndromes detected by chromosome microarrays.,” Human Genetics, vol. 124, no. 1, pp. 1–17, Aug. 2008.

[18]

J. I. N. G. Kim and L. D. Hudson, “Novel Member of the Zinc Finger Superfamily : A C2-HC Finger That Recognizes a Glia-Specific Gene,” Molecular and Cellular Biology, vol. 12, no. 12, pp. 5632– 5639, 1992.

[19]

J. G. Kim, R. C. Armstrong, D. v Agoston, a Robinsky, C. Wiese, J. Nagle, and L. D. Hudson, “Myelin transcription factor 1 (Myt1) of the oligodendrocyte lineage, along with a closely related CCHC zinc finger, is expressed in developing neurons in the mammalian central nervous system.,” Journal of Neuroscience Research, vol. 50, no. 2, pp. 272–90, Oct. 1997.

[20]

E. Romm, J. A. Nielsen, J. G. Kim, and L. D. Hudson, “Myt1 family recruits histone deactylase to regulate neural transcription,” Journal of Neurochemistry, vol. 93, no. 6, pp. 1444–1453, 2005.

[21]

S. J. C. Stevens, C. M. a van Ravenswaaij-Arts, J. W. H. Janssen, J. S. Klein Wassink-Ruiter, A. J. van Essen, T. Dijkhuizen, J. van Rheenen, R. Heuts-Vijgen, A. P. a Stegmann, E. E. J. G. L. Smeets, and J. J. M. Engelen, “MYT1L is a candidate gene for intellectual disability in patients with 2p25.3 (2pter) deletions.,” American Journal of Medical Genetics. Part A, vol. 155A, no. 11, pp. 2739–45, Nov. 2011.

[22]

S. Wang, J. Zhang, A. Zhao, S. Hipkens, M. a Magnuson, and G. Gu, “Loss of Myt1 function partially compromises endocrine islet cell differentiation and pancreatic physiological function in the mouse.,” Mechanisms of Development, vol. 124, no. 11–12, pp. 898–910, 2007.

[23]

J. Yang, M. F. Siqueira, Y. Behl, M. Alikhani, and D. T. Graves, “The transcription factor ST18 regulates proapoptotic and proinflammatory gene expression in fibroblasts.,” FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, vol. 22, no. 11, pp. 3956–67, Nov. 2008.

[24]

F. Llorens, V. Gil, S. Iraola, L. Carim-Todd, E. Martí, X. Estivill, E. Soriano, J. A. del Rio, and L. Sumoy, “Developmental analysis of Lingo-1/Lern1 protein expression in the mouse brain: interaction of its intracellular domain with Myt1l.,” Developmental Neurobiology, vol. 68, no. 4, pp. 521–41, Mar. 2008.

[25]

T. Vierbuchen, A. Ostermeier, Z. P. Pang, Y. Kokubu, T. C. Südhof, and M. Wernig, “Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.,” Nature, vol. 463, no. 7284, pp. 1035–41, Feb. 2010.

[26]

Z. P. Pang, N. Yang, T. Vierbuchen, A. Ostermeier, D. R. Fuentes, T. Q. Yang, A. Citri, V. Sebastiano, S. Marro, T. C. Südhof, and M. Wernig, “Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.,” Nature, vol. 476, no. 7359, pp. 220–3, Aug. 2011.

[27]

A. S. Yoo, A. X. Sun, L. Li, A. Shcheglovitov, T. Portmann, Y. Li, C. Lee-Messer, R. E. Dolmetsch, R. W. Tsien, and G. R. Crabtree, “MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons.,” Nature, vol. 476, no. 7359, pp. 228–31, Aug. 2011.

[28]

T. Vrijenhoek, J. E. Buizer-voskamp, I. Van Der Stelt, and E. Strengman, “Recurrent CNVs Disrupt Three Candidate Genes in Schizophrenia Patients,” The American Journal of Human Genetics, pp. 504–510, 2008.

53

[29]

T. Wang, Z. Zeng, T. Li, J. Liu, J. Li, Y. Li, Q. Zhao, Z. Wei, Y. Wang, B. Li, G. Feng, L. He, and Y. Shi, “Common SNPs in myelin transcription factor 1-like (MYT1L): association with major depressive disorder in the Chinese Han population.,” PloS one, vol. 5, no. 10, p. e13662, Jan. 2010.

[30]

W. Li, X. Wang, J. Zhao, J. Lin, X.-Q. Song, Y. Yang, C. Jiang, B. Xiao, G. Yang, H.-X. Zhang, and L.-X. Lv, “Association study of myelin transcription factor 1-like polymorphisms with schizophrenia in Han Chinese population.,” Genes, Brain, and Behavior, vol. 11, no. 1, pp. 87–93, Feb. 2012.

[31]

H. Wassink, “Germline mosaic transmission of a novel duplication of PXDN and MYT1L to two male half-siblings with autism,” Psychiatric Genetics, vol. 22, no. 3, pp. 137–140, 2012.

[32]

C. T. Gross and W. Mcginnis, “DEAF-1, a novel protein that binds an essential region in a Deformed response element,” The EMBO Journal, vol. 15, no. 8, pp. 1961–1970, 1996.

[33]

P. J. Jensik, J. I. Huggenvik, and M. W. Collard, “Identification of a nuclear export signal and protein interaction domains in deformed epidermal autoregulatory factor-1 (DEAF-1).,” The Journal of Biological Chemistry, vol. 279, no. 31, pp. 32692–9, Jul. 2004.

[34]

J. I. Huggenvik, R. J. Michelson, M. W. Collard, A. J. Ziemba, P. Gurley, and K. A. Mowen, “Characterization of a Nuclear Deformed Epidermal Related ( NUDR ) Transcriptional Regulator Protein,” Molecular Endocrinology, vol. 1, no. 1, pp. 1619–1639, 1998.

[35]

P. R. Albert, B. Le François, and A. M. Millar, “Transcriptional dysregulation of 5-HT1A autoreceptors in mental illness.,” Molecular Brain, vol. 4, no. 1, p. 21, Jan. 2011.

[36]

E. Kabashi, N. Champagne, E. Brustein, and P. Drapeau, “In the swim of things: recent insights to neurogenetic disorders from zebrafish.,” Trends in Genetics : TIG, vol. 26, no. 8, pp. 373–81, Aug. 2010.

[37]

R. Dahm and R. Geisler, “Learning from small fry: the zebrafish as a genetic model organism for aquaculture fish species.,” Marine Biotechnology (New York, N.Y.), vol. 8, no. 4, pp. 329–45, 2006.

[38]

J. D. Best and W. K. Alderton, “Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases.,” Neuropsychiatric Disease and Treatment, vol. 4, no. 3, pp. 567–76, Jun. 2008.

[39]

“Zebravissen: morfologisch onderscheid in geslacht.” [Online]. Available: http://www.mc.vanderbilt.edu/reporter/index.html?ID=11153.

[40]

“Kweken zebravissen.” [Online]. Available: http://www.fac.org.ar/scvc/llave/pediat/diaz/diazi.htm#f9.

[41]

P. Mestdagh, T. Feys, N. Bernard, S. Guenther, C. Chen, F. Speleman, and J. Vandesompele, “Highthroughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA.,” Nucleic Acids Research, vol. 36, no. 21, p. e143, Dec. 2008.

[42]

J. E. Summerton, “Morpholino, siRNA, and S-DNA compared: impact of structure and mechanism of action on off-target effects and sequence specificity.,” Current Topics in Medicinal Chemistry, vol. 7, no. 7, pp. 651–60, Jan. 2007.

[43]

V. M. Bedell, S. E. Westcot, and S. C. Ekker, “Lessons from morpholino-based screening in zebrafish.,” Briefings in Functional Genomics, vol. 10, no. 4, pp. 181–8, Jul. 2011.

[44]

J. S. Eisen and J. C. Smith, “Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense.,” Development (Cambridge, England), vol. 135, no. 10, pp. 1735–43, May 2008.

[45]

GlycoPOD, “Effective targeted gene knockdown using morpholino antisense oligos in early developent of zebrafish,” 2012. [Online]. Available: http://jcggdb.jp/GlycoPOD/protocolShow.action?nodeId=t34.

54

[46]

“Zebrafish Mutation Project,” 2012. [Online]. Available: http://www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/zmp/.

[47]

“The Zebrafish International Collection.” [Online]. Available: http://research.nhgri.nih.gov/ZInC/.

[48]

A. S. Azevedo, B. Grotek, A. Jacinto, G. Weidinger, and L. Saúde, “The regenerative capacity of the zebrafish caudal fin is not affected by repeated amputations.,” PloS one, vol. 6, no. 7, p. e22820, Jan. 2011.

[49]

W. M. and Z. L. I. Detrich III H., Ed., "The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics" in Methods in Cell Biology- Volume 104, 3rd ed., 2011, p. 493.

[50]

V. Tropepe and H. L. Sive, “Can zebrafish be used as a model to study the neurodevelopmental causes of autism ?,” Genes, Brain and Behavior, pp. 268–281, 2003.

[51]

E. Kabashi, E. Brustein, N. Champagne, and P. Drapeau, “Zebrafish models for the functional genomics of neurogenetic disorders.,” Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1812, no. 3, pp. 335–45, Mar. 2011.

[52]

T. Mueller, P. Vernier, and M. F. Wullimann, “A phylotypic stage in vertebrate brain development: GABA cell patterns in zebrafish compared with mouse.,” The Journal of Comparative Neurology, vol. 494, no. 4, pp. 620–34, Feb. 2006.

[53]

A. Ariza-Cosano, A. Visel, L. a Pennacchio, H. B. Fraser, J. L. Gómez-Skarmeta, M. Irimia, and J. Bessa, “Differences in enhancer activity in mouse and zebrafish reporter assays are often associated with changes in gene expression.,” BMC Genomics, vol. 13, p. 713, Jan. 2012.

[54]

C. Kizil, J. Kaslin, V. Kroehne, and M. Brand, “Adult Neurogenesis and Brain Regeneration in Zebrafish,” Developmental Neurobiology, vol. 72, no. 3, pp. 429–461, 2011.

[55]

N. Kyritsis, C. Kizil, S. Zocher, V. Kroehne, J. Kaslin, D. Freudenreich, A. Iltzsche, and M. Brand, “Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.,” Science (New York, N.Y.), vol. 338, no. 6112, pp. 1353–6, Dec. 2012.

[56]

T. Mueller and M. F. Wullimann, “Anatomy of neurogenesis in the early zebrafish brain.,” Brain research. Developmental Brain Research, vol. 140, no. 1, pp. 137–55, Jan. 2003.

[57]

J. Buccafusco, Ed., "Behavioural Neuroscience in Zebrafish“ in Methods of Behavior Analysis in Neuroscience,” 2nd ed., 2009, p. 343.

55

Addendum Bijlage 1 Benodigdheden Materialen en Methoden

A. Kweken     

Kweekbakken, roosters, scheidingswanden en vangnetje RO water E3 medium (+ methyleenblauw) zeefje Petrischaaltjes

B. Oogsten     

1,5 ml epjes plastic pasteurpipetjes Pronase (Sigma-Aldrich) RNAlater (Sigma-Aldrich) PBS-T (Life Technologies)

C. RNA isolatie           

Centrifuge (Eppendorf) Thermomixer (Eppendorf) RNAlater (Sigma-Aldrich) Trizol (Qiagen) De Kontes Pellet Pestle Cordless Motor (Fisher Scientific) Glazen Pasteur pipetten 75% ethanol 100% isopropanol RNase vrij water (Sigma-Aldrich) Chloroform (Sigma-Aldrich) NanoDrop (Thermo Scientific)

D. cDNA synthese   

Thermal Cycler (BioRad) iScript cDNA synthese kit (BioRad) epjes (Thermo Scientific) I



Nuclease vrij water (Sigma-Aldrich)

E. Kwantitatieve PCR     

Sso Advanced SYBR Green Supermix (BioRad) Forward en reverse primer (IDT) 384-well qPCR-plaat toegevoegd (Roche) Lightcycler 480 sealing foil (Roche) Light Cyclers 480 (Roche)

F. PCR     

Kapa kit (Biosystems) Vortex Epjes (Thermo Scientific) C1000 Thermo Cycler (BioRad) LabChip GX (Caliper Technologies)

G. Morfolino      

Femtojet injector (Eppendorf) Microloadertip E3 medium (+ methyleenblauw) Naalden Agarose laantjes Morfolino (Gene tools, LCC)

H. Finclipping       

Externe kweekbakken Tricaine anestheserende oplossing (1X) Proteinase K (Qiagen) Scalpel Plastieken lepel Parafilm Thermomixer (Eppendorf)

II

Bijlage 2 Programma’s PCR

Figuur 30. Schematische voorstelling van de PCR protocols KAPA7055 en Touch Down 6452.

III

Bijlage 3 Sequenties a) Primers voor qPCR en PCR

Tabel 3 Nummer

Naam

F/R

Toepassing

Locatie

Sequentie

25654

myt1la_F

Forward

qPCR

E10

TGACTACAGCAACACTTACG

25655

myt1la_R

Reverse

qPCR

E11

GTAGCGCTTCGCATCATA

25845

myt1lb_E23_F

Forward

qPCR

E23

GGTCAGGGTCACATCACAGG

25846

myt1lb_E23_R

Reverse

qPCR

E23

CTGGTGTGGGACAGGACATC

25964

zgc:171506_F

Forward

qPCR

E3

GTCGTTCCTGTCTGGGTTTG

25965

zgc:171506_R

Reverse

qPCR

E3

26123

zgc-194895_F

Forward

qPCR

E10

ATCGATCTGCCACTTTGCTT AATCTAAACCTCCTCCGGCC

26124

zgc-194895_R

Reverse

qPCR

E10

CTCTGACTGGCTTGTTTGGC

27076

zgc:194895_E2_F

Forward

qPCR

E2

GCCGTCACTGTTGGAGATGT

27077

zgc:194895_E2_R

Reverse

qPCR

E2

TTCAGGTATAGATGTTGCTGTGG

27446

zgc:194895_E3_F

Forward

qPCR

E3

CGCTTCAGATCGGAAACACT

27447

zgc:194895_E3_R

Reverse

qPCR

E3

AGTCCCTGTGGCTTTCAGG

27037

zgc194895_ex1-3_F

Forward

PCR

E1

GAATCGGAGGCCGAAGTC

27038

zgc194895_ex1-3_R

Reverse

PCR

E3

TCTACGATGCTCCCGTCAGT

27550

zgc:194895_E1-4_F

Forward

PCR

E1

CGATATGACTGTGATGGGAGAA

27551

zgc:194895_E1-4_R

Reverse

PCR

E4

CTGAGCCCAGTCTGTTCTTG

b) Sequenties van morfolino’s voor neerregulatie en probes voor ISH

Tabel 4 Naam

Sequentie

Morfolino exon 2

ATTGTTTATTCTTACGAGCACATGT

Morfolino exon 3

GATGCTAAAGCTGAAGTTCACCAGG

myt1la forward probe

AGCTCTCACGCTATCAA

myt1la reverse probe

GGATCCATTAACCCTCACTAAAGGGAACTCGTTCATCGGCTCTCT

zgc:194895 forward probe GATGACTGTGATGGGAGAAG zgc:194895 reverse probe GGATCCATTAACCCTCACTAAAGGGAAGAGATGATGGAGGCTGTTTC

IV

Bijlage 4 PCR resultaten van het morfolino effect op de splicesite rond exon 2 (deaf1)

Figuur 31: Dit zijn de PCR resultaten van het morfolino effect op de splicesite van exon 2 waarbij 3,7 en 10 ng morfolino geïnjecteerd werd in WT zebravissen. Het effect werd geëvalueerd op 2 en 3 dpf. Na gelelektroforese is het bandje met een amplicongrootte van 293 bp aanwezig bij alle condities (behalve 10 ng bij 2 dpf) door het fenomeen van onvolledige knock-down. Bij 10 ng (2 dpf) lijkt het gen volledig neergereguleerd aangezien enkel het kleinere amplicon te zien is op de gel. Dit resultaat werd eveneens verkregen na herhaling van de PCR. Om een verklaring te vinden en dit resultaat te verifiëren zal de injectie van 10 ng morfolino opnieuw uitgevoerd worden. Het extra bandje ter hoogte van 500 bp wijst op aspecificiteit van de primers. Afkortingen: MO, morfolino; CNTR, controle; WT, wild type. V

Bijlage 5 qPCR resultaten splicesite blocking morfolino exon 2 deaf1: 

4, 7, 10 ng op 2dpf

Figuur 32: Dit zijn de qPCR resultaten van het morfolino effect op de splicesite van exon 2 waarbij 4,7 en 10 ng morfolino geïnjecteerd werd in WT zebravissen. Het effect werd geëvalueerd op 2 dpf. Bij 10 ng lijkt de injectie zelf een apart effect te hebben vermits de WT en controle niet gelijkaardig zijn. De morfolino induceert merkwaardig genoeg een overexpressie ten opzichte van de controle. Bij 4 ng induceert de morfolino ook opmerkelijk een overexpressie. Bij 7 ng lijkt de morfolino geen effect te veroorzaken. Afkortingen: mo, morfolino; cntr, controle; wt, wild type.

VI



2, 3, 4, 7, 10 ng op 3dpf

Figuur 33: Dit zijn de qPCR resultaten van het morfolino effect op de splicesite van exon 2 waarbij 2, 3, 4 ,7 en 10 ng morfolino geïnjecteerd werd in WT zebravissen. Het effect werd geëvalueerd op 3 dpf. Bij 7 ng morfolino zijn de WT en controle resultaten enorm verschillend. Aangezien de morfolino en de WT een gelijkaardig expressieniveau hebben, lijkt er geen knock-down te zijn. Bij de rest van de condities geeft de morfolino een opmerkelijke overexpressie. Afkortingen: mo, morfolino; cntr, controle; wt, wild type.

VII



2, 4 ng op 4-7 dpf

Figuur 34: Dit zijn de qPCR resultaten van het morfolino effect op de splicesite van exon 2 waarbij 2 en 4 ng morfolino geïnjecteerd werd in WT zebravissen. Het effect werd geëvalueerd op 4 en 7 dpf. Voor de morfolino injecties werden replicates meegenomen. Voor 2 ng morfolino bij 7 dpf lijkt er een neerregulatie van expressie aanwezig te zijn. Bij de andere condities creëert de morfolino opmerkelijk een overexpressie. Afkortingen: mo, morfolino; cntr, controle; wt, wild type.

VIII

Bijlage 6 Genotypering myt1lb heterozygoot mutante vissen

1. Negatief

2. Negatief

3. Positief

4. Negatief

5. Negatief

6. Negatief

IX

7. Positief

8. Positief

9. Positief

10. Negatief

11. Positief

12. Positief

X

13. Negatief

14. Negatief

15. Positief

16. Negatief

Figuur 35: Weergave dataverwerking met de Sequencescanner.

XI