Introductie Hoewel de eerste leden van de 14-3-3 eiwit-familie al in de jaren ’60 ontdekt zijn, is hun functie nog steeds niet volledig opgehelderd. 14-3-3 eiwitten komen voor in verschillende isovormen en kunnen worden aangetoond in eukaryote cellen. Ze tonen een opvallend sterke evolutionaire conservatie, wat wijst op een gelijksoortige functie en oorsprong voor deze eiwitten in verschillende eukaryote organismen. Het is inmiddels opgehelderd dat deze eiwitten belangrijke rollen spelen in verschillende signaal transductie routes, cel cyclus regulatie, differentiatie exocytose en nog vele andere processen. Ook is het aantal ontdekte substraten voor 14-3-3 binding de laatste jaren exponentieel toegenomen. Mutanten van het 14-3-3 eiwit beginnen langzaam maar zeker verheldering te brengen in een scala van specifieke functies van 14-3-3 in verschillende celtypen. Deze scriptie zal een beknopt overzicht geven van de structuur en werking van 14-3-3 eiwitten en zal enkele functies van het eiwit nader toelichten. Bijzondere aandacht zal worden geschonken aan de betrokkenheid van 14-3-3 bij de prion-gerelateerde ziekte van CreutzfeldtJakob.
1
De ontdekking van 14-3-3 eiwitten Moore en Perez waren in 1967 de eersten die het 14-3-3 eiwit beschreven als een zuur eiwit dat overvloedig aanwezig was in de hersenen (Moore en Perez, 1967). In eerste instantie werd gedacht dat 14-3-3 eiwitten unieke, met het neuronale weefsel geassocieerde eiwitten waren. Pas in de afgelopen tien jaar is duidelijk geworden dat ze betrokken zijn bij veel meer processen. Zo werd ontdekt dat 14-3-3 eiwitten activatoren waren van tryptofaan and tyrosine hydroxylase en inhibitors van PKC’s. De interesse in 14-3-3 eiwitten werd nog verder versterkt door de ontdekking dat ze geassocieerd konden worden met Raf en het polyoma middel T antigen, en als moleculen die betrokken zijn in de reparatie van DNA schade en de fusie van gist cellen (Yaffe, 2002 en referenties daarin). Sinds die tijd, zijn er meer dan 100 verschillende moleculen gevonden die als substraat voor 14-3-3 kunnen dienen. 14-3-3 eiwitten zijn 30 kDa grote polypeptiden. De naam 14-3-3 is afgeleid van de combinatie van het fractie/migratie nummer dat verkregen kan worden wanneer 14-3-3 DEAE-cellulose chromatografie ondergaat en van zijn migratie positie tijdens gel-electroforese. Deze fractie nummers werden verkregen door Moore en Peres (1967) toen zij probeerden om een systematische classificering van eiwitten in de hersenen van runderen te maken. Tegenwoordig is bekend dat 14-3-3 eiwit niet langer alleen in de hersenen kan worden aangetroffen, maar dat het bestaat uit een familie van algemeen tot expressie gebrachte regulatoire eiwitten die voorkomen in eukaryote organismen. Het is gebleken dat 14-3-3 een groep multifunctionele eiwitten omvat die binden aan een grote verscheidenheid cellulaire eiwitten en hun functie moduleren. Meer dan 50 signaal transductie eiwitten zijn inmiddels gevonden die als ligand voor 14-3-3 kunnen dienen. Verschillende isovormen van het 14-3-3 eiwit zijn inmiddels gevonden. In de mens en andere zoogdieren zijn er tot nog toe 7 vormen gevonden, die met Griekse letter weergegeven worden: b (beta), e (epsilon), g (gamma), h (eta), s (sigma), t (tau) en z(zeta). Oorspronkelijk waren ook de a (alfa) en de d (delta) isovorm geïsoleerd, maar deze bleken de gefosforyleerde vormen van respectievelijk b en z te zijn (Aitken et al., 1995). De namen van deze isovormen van 14-3-3 zijn letters van het Griekse alfabet en gebaseerd op de elutie positie van de isovormen na reversed-phase chromatography en cDNA klonering uit runder-hersenen (Ichimura et al, 1988). Isovormen die in eerste instantie niet of nauwelijks in de hersenen konden worden aangetroffen, zijn wel aangetroffen in andere weefsels in zoogdieren. Zo werd de t (tau)-isovorm aangetroffen in T-lymfocyten, en de isovorm q (theta) in epitheliale cellen. Bij nader inzien bleken deze identiek te zijn. In planten (zoals de Arabidopsis thaliana) zijn tenminste 12 isovormen geïdentificeerd. Ook in andere eukaryoten zijn 14-3-3 eiwitten gevonden; Bijvoorbeeld in gist (Saccharomices cerevisiae), springstaarten (Caenorhabditis elegans) en fruitvliegjes (Drosophila melanogaster) zijn twee soorten 14-3-3 eiwitten ontdekt (Wang en Shakes, 1996, Fu et al., 2000). Het lijkt er dus op de eencellige en eenvoudige organismen maar een paar isovormen van 14-3-3 hebben, terwijl meercellige complexere organismen er meerdere hebben. Regelmatig worden nog nieuwe vormen van 14-3-3 eiwitten ontdekt. Via een philogenetische en structurele overeenkomsten met andere vormen kan meestal eenvoudig worden vastgesteld om welke vorm het gaat. Een voorbeeld hiervan is de ontdekking van Kültz et al. (2001) dat in euryhaline vissen (vissen die zowel in zoet als in zout water kunnen leven), een 14-3-3 eiwit vorm voorkomt in de kieuwen (zie verderop in dit verslag). De onderzoekers noemden dit eiwit 14-3-3.a en bepaalden met behulp van een philogenetische boom dat het een vorm van 14-3-3_ of 14-3-3_ betrof (figuur 1). 2
Niet alle isovormen die in bepaalde organismen voorkomen, kunnen in ander organismen worden teruggevonden. De meeste 14-3-3 eiwit-isovormen kunnen worden onderverdeeld in vier hoofdgroepen die identiek zijn aan de vier hoofd koninkrijken van eukaryote organismen: planten (Viridiplantae), schimmels (Fungi), eencelligen als het malaria plasmodium (Protozoa) en dieren (Metazoa). Toch blijkt dat iedere 14-3-3 isovorm een functionele specificiteit heeft, ondanks het feit dat de aminozuur sequentie in het bindings domein van een 14-3-3 eiwit compleet geconserveerd kan zijn (zie bijvoorbeeld figuur 2). Zelfs verschillende isovormen die in het zelfde organisme voorkomen, kunnen over het algemeen niet aan elkaars substraten binden (Rosenquist et al., 2000 en zie verdeop in dit verslag). Het is moeilijk te zeggen welke isovorm van 14-3-3 de originele is. Daarom heeft de philogenetische boom van figuur 1 ook geen stam die voor één isovorm staat. Een verklaring voor het ontstaan van meerdere isovormen zou kunnen zijn dat in gevallen waarbij grote hoeveelheden van het 14-3-3 eiwit nodig zijn, het handig is wanneer meerdere genen voor dit eiwit coderen. Een voorbeeld waarbij dit verschijnsel goed toepasbaar is in de plant Arabidopsis thaliana, waar het onderzoekes is opgevallen dat verschillende isovormen zich in verschillende subcellulaire compartimenten kunnen bevinden. Zo zijn de isovormen epsilon (e), mu (m,) nu (n) en upsilon (u) aangetroffen in zowel het cytosol als in het stroma van chloroplasten (Sehnke et al., 2000).
Figuur 1: Voorbeeld van een philogenetische boom, hier gebruikt om de evolutionaire relatie tussen 14-3-3.a, gevonden in euryhaline vissen, en andere 14-3-3 eiwitten weer te geven. Naar Kültz et al., 2001.
.
Filogenetische analyse van 14-3-3 eiwitten heeft aangetoond dat er in de evolutie een vroege scheiding tussen isovormen van14-3-3 eiwitten in planten en in dieren moet hebben plaatsgevonden (Wang en Shakes, 1996). Ook is het aannemelijk dat er op verschillende tijdstippen in de evolutie gen duplicaties zijn opgetreden, wat het voorkomen van 12 verschillende soorten 14-3-3 eiwitten in planten versus 7 soorten in zoogdieren kan verklaren. Het is al eerder aangetoond dat genen van teleost vissen sterk afwijken van hun homologen in 3
Figuur 2: De aminozuur sequenties van verschillende 14-3-3 isovormen in verschillende eukaryote oprganismen; Laan 1-6: menselijk z, b, t, h, s en e 14-3-3 eiwit; laan 7-8: gist 14-3-3 eiwit; laan 9-10: Drosophila z en e 14-3-3 eiwit. Zwarte balken geven de 9 alfa-helices weer waaruit een 14-3-3 monomeer is opgebouwd. Paars gearceerde gebieden geven de sterk geconserveerde bindings domeinen weer, terwijl de rood gearceerde gebieden residuen weergeven die direct betrokken zijn bij eiwit binding.
4
zoogdieren (bijvoorbeeld estrogene receptoren in katvissen; Xia et al., 2000, en het CFTR Clkanaal voor zout transport in de kieuwen van teleost vissen; Singer et al., 1998). Sinds de oorspronkelijke ontdekking in 1967, zijn een aantal functies van 14-3-3 eiwitten ‘herontdekt’. Deze series van herontdekkingen begon met de bevinding dat 14-3-3 betrokken bleek bij de activatie van tryptofaan en tyrosine hydroxylase en als verhinderaar van PKC’s (Yaffe, 2002 en referenties daarin). 14-3-3 is voor het eerst gekloond in 1988 (Ichimura et al, 1988), waardoor de DNA sequentie van 14-3-3 bekend werd, wat wetenschappers de mogelijkheid gaf tot het onderzoeken van een groot aantal biochemisch functies van 14-3-3. Dit gaf eveneens de mogelijkheid tot het onderzoeken van diverse eiwit-eiwit interacties, waarin 14-3-3 een belangrijke rol als allosterische co-factor blijkt te spelen. ten aanzien van de katalitsche activiteiten van een aantal van zijn lignanten. Voorbeelden van zulke 14-3-3geassocieerde eiwitten zijn elders in dit verslag weergegeven. Behalve als regulator van eiwit-eiwit interacties, is 14-3-3 ook betrokken gebleken bij het reguleren van verschillende regulatoire processen , zoals de controle van de celcyclus, overlevings signaal transductie, samenhang processen tussen cellen en neuronale plasticiteit. Nog steeds is het aantal ontdekkingen van de functies van 14-3-3 niet aan het afnemen, waardoor het begrip van deze eiwit-familie zich in de toekomst nog verder zal uitbreiden.
5
Wat zijn 14-3-3 eiwitten? De 14-3-3 eiwitten zijn een familie van geconserveerde regulatoire moleculen die in alle eukaryote cellen tot expressie komen. Een opvallend kenmerk van deze eiwitten is dat ze de mogelijkheid hebben om te binden met een verscheidenheid aan functioneel verschillende signaal-transductie eiwitten, zoals kinases, fosfatases en transmembraan receptors. Door deze interacties zijn 14-3-3 eiwitten betrokken bij een grote verscheidenheid aan vitale regulatoire processen, zoals signaal transductie tijdens de mitogenese, cel dood door apoptose and algehele controle over de cel cyclus. Door de grote verscheidenheid aan cellulaire eiwitten die als ligand voor 14-3-3 kunnen dienen, heeft men gesuggereerd dat 14-3-3 een rol zou spelen als algemene biochemische regulator, die zou lijken op het goedgedefinieerde regulatoire eiwit calmoduline. 14-3-3 helpt mee aan de regulatie van verschillende biologische processen door interacties met zijn effector eiwitten. Deze processen omvatten onder andere neuronale ontwikkeling, de controle over cel groei en de pathogenese van virussen en bacteriën. 14-3-3 eiwitten bestaan voornamelijk als dimeren met een monomere moleculaire massa van ongeveer 30.000 en een isoelectrisch punt van 4-5. Monomeren zijn opgemaakt uit 9 alfahelixen (figuren 1 en 2). 14-3-3 eiwitten zijn betrokken bij het binden en stabiliseren van andere eiwitten. Een 14-3-3 dimeer heeft twee bindingsdomeinen (een op elke monomeer), waar eiwitten aan kunnen binden (figuur 3). 14-3-3 eiwitten kunnen functioneren als homoen hetero dimeren, waarbij iedere monomeer, net een grote van ongeveer 30 kDA, in staat is om via zijn amphipatisch bindingsdomein te binden aan een gefosforyleerd doelwit proteïne (Yaffe et al., 1997). 14-3-3 eiwitten zijn tijdens de evolutie opmerkelijk goed geconserveerd gebleven tussen de verschillende soorten eukaryoten (53% van het eiwit: Wang en Shakes, 1996). Vooral de grote overeenkomsten in biochemische eigenschappen tussen 14-3-3 eiwitten van verschillende organismen pleiten voor een hoge functionele conservatie ervan.
Figuur 1: Afbeelding van de dimeer vorm van 14-3-3: een monomeer bestaat uit 9 alfa-helices.
Elke 14-3-3 polypeptide bestaat uit 9 a helices die antiparallel zijn gerangschikt en van elkaar worden gescheiden door een korte lus (“loop”; zie ook figuur 2). Vier helices hebben een Nterminus en creëren met elkaar het extensieve oppervlak van de dimeer. Tussen de twee N-
6
A
B
Figuur 2: A. 3-D structuur van het 14-3-3.a eiwit gevonden door Kültz et al. (2001). De helices (H1-H9) zijn gelabeld. H9 corres-pondeert met het 14-3-3 signatuur motief 2 (S2). De rode helices vormen de buitenste laag van het eiwit, terwijl de groene helices (H3, H5, H7, H9) het amfipathische bindings-domein van het substraat vormen. Vooral dit bindingsdomein is uitzonderlijk geconserveerd gebleven in 14-3-3. B. De mate van evolutionaire conservatie correspondeertmet de mate van arcering.
terminale groepen van twee polypeptiden die samen een dimeer vormen, zit een centraal gat dat omgeven wordt door polaire en geladen delen. De delen van de dimeer die contact met elkaar maken zijn voornamelijk hydrofoob, met enkele ongeladen polaire stukken. Deze contact-residuen zijn sterk geconserveerd gebleven in alle eukaryote organismen voor alle isovormen van 14-3-3 (figuur 3). Het is aangetoond dat wanneer substituties of deleties in de N-terminale helices gemaakt worden, 14-3-3 dimeren dedimerizeren en monomeren vormen. Toch is het vaak ook mogelijk voor 14-3-3 monomeren om substraten te binden, hoewel dit significant minder stabiele interacties geeft dan met dimeren. De 5 C-terminale helices, die zorgen voor de karakteristieke hoefijzer-vorm van 14-3-3 dimeren, vertonen meer moleculaire variëteit (Tzivion en Avruch, 2002 en artikelen daarin).
Figuur 3: 14-3-3 eiwitten hebben sterk geconserveerde bindingsdomeinen
Behalve dimerisatie levert ook fosforylatie een belangrijke bijdrage aan de stabiliteit van interacties tussen 14-3-3 eiwitten en hun substraten. 14-3-3 eiwitten binden dus met hun substraat met behulp van twee bindingsdomeinen. Initiële observaties leken erop te duiden dat 14-3-3 bindingen afhankelijk waren van fosforylatie van het substraat. Dit was aan de hand van studies naar tryptofaan hydroxylase (Furukawa et al., 1993), een enzym dat betrokken is bij de biosynthese van neurotransmitters, en studies naar Raf (Michaud et al., 1997), wat een activator is van de klassieke MAP kinase route. Latere onderzoeken naar de relatie die Raf zou hebben met 14-3-3 in combinatie met onderzoek in de eiwit-database voor alle 14-3-3 isovormen bij zoogdieren, heeft tot de identificatie van twee optimale fosfoserine/threonine bevattende DNA-motieven
7
Figuur 4: De 14-3-3 dimeer heeft twee bindings domeinen voor eiwit substraten; eerst bindt het substraat met een monomeer van 14-3-3 na een confirmationele vernadering in dit substraat (1). Daarna bindt een tweede, vaak wat zwakkere, secundaire site van het substraat aan de tweede monomeer van 14-3-3 (2).
geleid. Deze motieven, die alle 14-3-3 isovormen herkennen en kunnen binden, kunnen worden weergegeven als RSXpSXP en RXXXpSXP voor bindings domein 1 en 2 respectievelijk uit figuur 4). Hierin staat pS voor zowel fosfoserine als fosfothreonine, R staat voor arginine, S voor serine, P voor proline en X voor een willekeurig aminozuur (zie voor verdere uitleg Yaffe et al., 1997 en Yaffe, 2002). Toch zijn er ook verscheidene voorbeelden bekend van 14-3-3 substraten met een binding motief dat sterk afwijkt van dit standaard motief, zelfs van substraten met een motief waarin niet eens fosforylatie voorkomt. Yaffe en collega’s (1997) suggereren dat de mate waarin het bindings-motief van een 14-3-3 substraat overeenkomt met het standaard 14-3-3 bindings-domein, bepaalt of 14-3-3 werkt als sequestering molecuul, chaperone molecuul of adapter molecuul, met betrekking tot het substraat. Appendix IV geeft een overzicht van de moleculaire activiteit van 14-3-3 eiwitten met betrekking tot het substraat dat ze binden, en hoe men deze interactie heeft kunnen aantonen, en figuur 5 geeft een schematische weergave van interactie modellen voor 14-3-3
Figuur 5: Modellen voor interacties van 14-3-3 eiwitten met hun substraten. A-C geven het adapter model weer, waardoor verschillende eiwitten kunnen worden gelinkt, en 14-3-3 dus als een brug tussen twee eiwitten fungeert. D en E geven het modulator model weer, waarmee enzym activiteit kan worden gereguleerd, en een binding kan worden gestabiliseerd.A: Interactie tussen de target eiwitten op het sterk evolutionair geconserveerde, gefosforyleerde bindings motief van het 14-3-3 dimeer (links). B: Interacties van target eiwitten met de tamelijk variabele buitenkant van het 14-3-3 dimeer. C: Interacties van het target eiwit met verschillende domeinen van de 14-3-3 dimeer. Het is voor 14-3-3 mogelijk om meer dan twee eiwitten tegelijk te binden. D: Een target eiwit kan gebonden worden aan beide dimeren. E: Ook het buitenvlak van 14-3-3 is betrokken bij interacties. F: Modulatie van activiteit wordt echter veroorzaakt door
8
en zijn substraten. De binding van fosfopeptiden wordt gereguleerd door de N-terminale helices, maar ook de binding aan niet-gefosforyleerde eiwitten, waarvan blijkt dat ze met elkaar competeren voor een binding met 14-3-3 (Wang et al., 1999). Het is bijvoorbeeld geobserveerd dat 14-3-3 eiwitten interacties aangaan met niet-gefosforyleerde Cys-His-rijke domeinen (beter bekend als zinc-fingers) van Raf en met leucine zipper structuren in diverse planten (Tzivion en Avruch, 2002 en referenties daarin).Zoals uit bovenstaande blijkt, staat de familie van 14-3-3 eiwitten erom bekend dat ze binden aan verschillende fosfoserine/ threonine motieven (Tzivio en Avruch, 2002 en referenties daarin). Fosfoserine en fosfothreonine domeinen binden een grote verscheidenheid aan eiwitten, die betrokken zijn bij vitale processen in de cel, zoals de cel cyclus, groei, overleving en DNA schade controle. Omdat niet alle bindingspartners van 14-3-3 precies het zelfde ideale bindingsdomein hebben (zie boven) biedt het vormen van 14-33 dimeren voor substraat binding uitkomst: De binding wordt op die manier stabieler. Toch zijn er enkele substraten van 143-3 die een zelfde effectiviteit hebben wanneer ze aan een 14-3-3 monomeer binden als aan een 14-3-3 dimeer. Aangezien de bindings regionen van 14-3-3 als kenmerkende sequentie fosfoserine en fosfothreonine domeinen hebben, zijn ook de meeste 14-3-3 substraten gefosforyleerd, hoewel onlangs is gebleken dat sommige substraten ook ongefosforyleerd kunnen Figuur 6: Vijf verschillende vormen van bindingen tussen 14-3-3 eiwitten en hun targets. Zie voor verdere uitleg de tekst en het artikel van Tzivion en binden met 14-3-3. De Avruch (2002). TPH = tryptofaan hydroxylase. mechanismen waarmee 143-3 eiwitten binden met hun substraat kunnen in 5 verschillende categorieën onderverdeeld worden (figuur 6): In figuur 6A wordt getoond hoe 14-3-3 de mogelijkheid veranderd van zijn target eiwit om interacties aan te gaan met andere partners. Dit gebeurt bijvoorbeeld met BAD; wanneer BAD in aanraking komt met liganden zlaIGF-1, interleukine-3, insuline of kinases, wordt de fosforylatie van BAD gekataliseerd en daarmee de interactie met 14-3-3 gemedieerd. In figuur 6B kan binding met 14-3-3 het cytoplasmatiche/nucleaire deel van zijn eiwit partner veranderen door de nucleaire export te versnellen, de nucleaire import te vertragen, of beide. Eiwitten die hieraan onderhevig zijn, zijn bijvoorbeeld de door insuline gereguleerde forkhead domein transcriptie factoren (FKHRL1) en DAF-16. Figuur 6C laat zien dat binding van 14-3-3 intrinsieke katalytische activiteiten van het target eiwit zowel kan verhinderen als vergroten, zoals de voorbeelden 9
met tryptofaan en ASK-1 laten zien. Figuur 6D demonstreert dat binding met 14-3-3 een eiwit kan beschermen tegen defosforylering en/of proteolyse. Figuur 6E laat tenslotte zien dat 14-33 eiwitten kunnen dienen als fosforylatie-afhankelijke adaptors/scaffold eiwitten om een brug tussen twee targets te vormen.
10
4-
Waar zijn 14-3-3 eiwitten bij betrokken?
Het binden van 14-3-3 eiwit aan andere eiwitten is een gemeenschappelijk kenmerk van alle 14-3-3 eiwitten in alle eukaryote organismen. 14-3-3 eiwitten zijn betrokken bij een groot aantal biochemische processen die zich afspelen in eukaryote cellen. Een aantal functies van 14-3-3, zoals de invloed op neuronale ontwikkeling (Skoulakis en Davis, 1998), signaal transductie (Aitkin, 1996, Morrison, 1994, Pawson en Scott, 1997) en planten biologie (Ferl, 1996, Finnie et al., 1999) zijn elders beschreven en zullen in dit verslag niet aan de orde komen. De algemene rol van 14-3-3 in diverse processen in eukaryote cellen daarentegen wel. Een opvallend gemeenschappelijk kenmerk van alle leden van de 14-3-3 eiwit familie, is dat ze een zeer groot aantal proteïne kinases, fosfatases en andere fosfo-eiwitten binden en reguleren (Fu et al., 2000). De grote verscheidenheid aan moleculen die aan 14-3-3 eiwitten kunnen binden, gelijken het grote aantal calmoduline-doelen en daaruit kan gesuggereerd worden dat 14-3-3 eiwitten zij alomvertegenwoordigde regulatoren van fysiologische en biochemische processen in de cel. Het wordt zelfs verondersteld dat 14-3-3 eiwitten belangrijke snijpunten zijn op vele, zoniet alle, belangrijke signaal transductie routes van de Insuline
Groei-factoren
hormonen
Exoenzyme S receptor
RTK’s
Bcr
Ptdlns(4,5)P2
b g a
Grb2
G-proteinen
Rac-GTP t IRS-1
DAG
Sos
Ca2+
14-3-3
z
MT
Ins(1,4,5)P3
Zink vinger p85
p110
Ras-GTP b
z
PI 3-kinase
Zink-vinger c-Raf-1
MAPKK (MEK) MAPK
Rsk-s (MAPKAP kinase-1 Transcriptie factoren Differentiatie/proliferatie
PKC
Figuur 1: De rol van 14-3-3 eiwitten in signaal transductie. Deze signaal transductie route reguleert groei factoren en de effecten van hormonen op differentiatie en proliferatie van de cel cyclus. MAPK = mitogen-activated protein kinase; PKC = protein kinase C; DAG = diacylglycerol; RTK’s = receptor tyrosine kinases; IRS1 = insulin receptor substrate-1; MT = polyoma middel T antigen; PI 3-kinase = phosphoinositide 3-kinase; Ptdlns(4,5)P2 = phosphatidylinositol (4,5)biphosphate; Ins(1,4,5)P3 = inositol (1,4,5)-trisphosphate; MAPKK = MAPK kinase; MAPKAP kinase-1 = MAPK-activated proteine kinase-1. Zie voor verdere tekst en uitleg het artikel van Aitken, 1995.
11
cel (Fu et al., 2000 en zie bijvoorbeeld figuur 1). Een andere eigenschap van 14-3-3 eiwitten is dat ze betrokken zijn bij het transport van blaasjes en Ca2+-afhankelijke exocytose. Dit suggereert eveneens dat 14-3-3 eiwitten een belangrijke rol spelen bij osmoregulatie. Dit komt omdat het actieve transport van NaCl in euryhaline vissen via exocytose gebeurt (Kültz et al., 2001, en referenties daarin). Naast het bovengenoemde zijn 14-3-3 eiwitten betrokken als sleutel eiwitten in diverse signaal transductie routes en diverse andere processen. Zo is er melding gemaakt van betrokkenheid van 14-3-3 eiwitten bij inhibitie, activatie, en structurele stabilisatie van tenminste 35 verschillende eiwitten en enzymen. Recentelijk is er ook een nucleair export signaal (NES) geïdentificeerd in een 14-3-3 isovorm in gist, dat essentieel betrokken bleek te zijn voor translocatie van het mitose-inducerende eiwit Cdc25 naar het cytosol wanneer DNA beschadiging optreedt. Hierdoor wordt de mitose van een cel uitgesteld, wat een aanwijzing is voor de betrokkenheid van 14-3-3 eiwitten bij de celdeling (Lopez-Girona et al., 1999 en zie ook beneden). In meercellige organismen heeft zich een groot aantal verschillende isovormen van 14-3-3 ontwikkeld (Wang en Shakes, 1996 en hoofdstuk 3). In sommige fasen van de ontwikkeling van een meercellig organisme neemt het aantal 14-3-3 eiwitten, welke meestal toch al ruimschoots aanwezig zijn, sterk toe. Het is bijvoorbeeld gevonden dat het niveau van 14-3-3 eiwitten in de platworm Echinococcus multilocularis tot 10 keer zo hoog is in de metacestode fase in vergelijking met de volwassen fase, en bovendien is de aanwezigheid van 14-3-3 eiwitten het hoogst in de lagen die de kiemcellen bevatten (Siles-Lucas et al., 1998). In Drosophila melanogaster zijn aanwijzingen gevonden voor een isotype-specifieke rol in de ontwikkeling. Normaal gesproken worden beide isovormen e en z (in Drosophila beter bekend als Leonardo) tot expressie gebracht en zijn ze betrokken bij receptor tyrosine kinase (RTK) activiteit, olfactatoir leergedrag en geheugen, en lichaamsontwikkeling. Wanneer 143-3z niet tot expressie komt, terwijl de concentratie van 14-3-3e normaal is, leidt dit tot embryonale sterfte. Wanneer slechts de expressie van 1 allel van 14-3-3z verhinderd wordt, leidt dit tot een afwijkend geheugen en leergedrag (Skoulakis en Davis, 1996). Behalve in de ontwikkeling, komt isotype-specifieke expressie van 14-3-3 eiwitten ook voor als normaal onderdeel van cellulaire reactie op beschadiging. Zo kan een sterke opregulatie worden gevonden van 14-3-3s in epitheel cellen, vooral in epitheel cellen in de dikke darm en het rectum die hebben blootgestaan aan ioniserende straling of andere stoffen die het DNA beschadigen (Hermeking et al., 1997). Wanneer cellen in zoogdieren DNA-schade oplopen, wordt de mitose van die cellen stopgezet. Deze stopzettingen zijn vaak afhankelijk van een product van het p53 gen, een transcriptie factor. p53 en BRCA1 zijn in staat om een toename van gen transcriptie van de 14-3-3s isovorm te reguleren. Een ander opvallend kenmerk van de 14-3-3s isovorm is dat het de enige isovorm is die niet kan binden met een van de voornaamste doelwit substraten van de 14-3-3 eiwit familie; Cdc25C, wat een eiwit is dat het G2/M checkpoint in de celcyclus reguleert. Hermeking en collega’s (1997) hebben aangetoond dat in colorectale kankercellen niet alleen de fosforylatie van Cdc25C plaats vindt, maar ook een sterke opregulatie van 14-3-3 eiwitten. Er wordt aangenomen dat dit mechanisme als volgt de cel cyclus controleert: DNA schade resulteert in Rad3-afhankelijke activatie van Chk1 kinase, wat ervoor zorgt dat Cdc25C fosforyleert. Deze fosforilatie zorgt ervoor dat Cdc25C kan binden met 14-3-3, waardoor defosforylatie van Cdc2, een cyclineafhankelijk kinase dat noodzakelijk is voor het aanzetten van een cel tot mitose, onmogelijk wordt (figuur 2).
12
14-3-3 s↑ DNA schade
14-3-3s/Cdc25C
P53 ↑ P21 ↑
P21/Cdk’s
inactivatie Cdc2
G2 blokkade
inactivatie Cdk’s
G1 blokkade
Figuur 2: Model voor de opregulatie van 14-3-3s en p53 voor controle over de cel cyclus na beschadiging van
het DNA (Hermeking et al., 1997).
Behalve in mensen, is de betrokkenheid van 14-3-3 bij controle over mitose na DNA schade ook aangetroffen bij andere eukaryote organismen, bij voorbeeld bij de gist soort Schizosaccharomyces pombe. Men heeft hier kunnen aantonen dat de twee 14-3-3 isovormen die in deze gist soort voorkomen, die de benamingen rad24 en rad25 hebben gekregen, beide nodig zijn om de mitose cyclus van de gistcel stop te zetten totdat de DNA schade is gerepareerd (Aitken, 1995). De lange lijst van functies en eigenschappen die de 14-3-3 eiwit-familie heeft in eukaryote organismen breidt zich nog steeds uit (zie het artikel van Rosenquist et al. (2000) en de referenties daarin). Zo worden verschillende enzymreacties in planten beïnvloed door 14-3-3 eiwitten: voorbeelden hiervan zijn de binding van 14-3-3 in het cytosol aan het enzym nitraat reductase, waardoor de activiteit van dit enzym verhinderd wordt, en daarmee dus de eerste stap van de stikstof assimilatie cyclus gereguleerd wordt. Op een soort gelijke manier wordt de activiteit van sucrose fosfatase synthase verhinderd door 14-3-3, waardoor dus controle over de koolhydraat voorraad kan worden uitgeoefend door 14-3-3. Ook kunnen 14-3-3 eiwitten de pH van planten cellen reguleren via actief transport van zout moleculen, door aan te grijpen op H+ATPase, dat betrokken is bij het transport van H+ ionen over het celmembraan. Een hoge zout concentratie zet de expressie van 14-3-3 aan. Andere kleine interne processen in planten cellen kunnen de activiteit van 14-3-3 ook aanzetten, zoals een lage temperatuur, hypoxia en aanvallen van pathogenen en fusicoccin (een toxine geproduceerd door schimmels dat de H+-ATPase in het plasma membraan van planten activeert en hiermee membraan hyperpolarisatie veroorzaakt). Het lijkt erop dat de verschillende isovormen van 14-3-3 eiwitten allemaal een andere groep van specifieke substraten hebben waar ze aan binden, ondanks de sterke evolutionaire conservatie die 14-3-3 isovormen ondergaan hebben. Toch blijkt het in sommige in vitro gevallen mogelijk dat verschillende 14-3-3 isotypes in staat zijn om een gemixte heterodimer te vormen, in plaats van alleen homodimeren van twee identieke isovormen, zoals werd aangenomen. Ook in vivo heeft men kunnen aantonen dat bijvoorbeeld 14-3-3e en -z kunnen heterodimeriseren (Jones et al., 1995). Bovendien bleek het optimale fosforylerings motief geselecteerd door de verschillende isovormen exact hetzelfde was. Sommige 14-3-3 substraten, zoals Raf-1, Cas en Rem blijken bijna even goed te binden aan verschillende, maar niet alle, 14-3-3 eiwit-isotypes. Echter de meeste liganten binden aan één bepaalde 14-3-3 isovorm met een significant sterkere affiniteit dan aan andere isovormen (Yaffe, 2002 en referenties daarin). Voorbeelden van specifieke substraten voor specifieke isovormen zijn: • Associatie van Raf-1 kinase in het cytosol en aan het membraan van zowel cellen van zoogdieren als van gist met 14-3-3b en z (Aitken, 1995). • Binding en fosforylaite van de 14-3-3t isovorm door c-Bcr en Bcr-Abl kinases
13
• De opregulatie van 14-3-3s na DNA schade (zie boven) • De benodigdheid van 14-3-3z (Leonardo) bij de ontwikkeling van geheugen en leergedrag bij Drosophila (zie boven) • De associatie van 14-3-3t met T lymfocyten en 14-3-3q met epitheliale cellen Het lijkt erop dat alle leden van de 14-3-3 eiwit-familie betrokkenheid bij de aanpassing van vrijwel alle eukaryote cellen aan een veranderende omgeving.in overeenkomst hebben. Dit wordt weerspiegeld in de sterke evolutionaire structurele conservatie van 14-3-3 eiwitten in alle eukaryoten (Finnie et al., 1999). Kültz en collega’s (2001) hebben ontdekt dat 14-3-3 eiwitten betrokken zijn, via signaal transductie, bij de osmoregulatie in het epitheel weefsel van kieuwen in euryhaline vissen (dit zijn vissen die hun zouthuishouding regelen door zout transport buiten de nieren om; in zee water scheiden ze actief zout [NaCl] uit, terwijl ze in zoet water actief zout absorberen via de kieuwen). Dit ondervonden zij door aan te tonen dat mRNA en eiwit niveau coderend voor 14-3-3 binnen 24 uur twee tot drie keer zo hoog werd, wanneer een vis werd verplaatst van zout naar zoet water. De onderzoekers suggereren dat 143-3 een belangrijke rol speelt in het remodelleren van het epithelium van de kieuwen na deze transfer. Het was al eerder aangetoond dat 14-3-3 eiwitten uitstekende molecuul-kandidaten zijn voor de rol als regulator van de reorganisatie van kieuw epitheel cellen tijdens aanpassing aan een nieuw zout niveau in euryhaline vissen. Dit is omdat ze alomvertegenwoordigde partners voor fosforylatie eiwitten zijn, en bovendien krachtige regulatorenvoor de controle van de activiteit van verschillende signaal transductie routes die betrokken zijn bij aanpassingen aan een veranderende omgeving (Fu et al., 2000). Het lijkt erop dat vele moleculaire fenomenen die betrokken zijn bij aanpassingen aan de zout-osmoregulatie in euryhaline vissen gereguleerd worden door 14-3-3 eiwitten. Voorbeelden hiervan zijn; H+ATPase, de regulatie van cel proliferatie en turnover, de regulatie van apoptose, de regulatie van proteïne kinase C (KPC) welke belangrijk is voor de modulatie van Na+/K+-ATPase activiteit, de regulatie van ion kanalen en transporteurs, en regulatie van het cytoskelet. Kültz en collega’s (2001) vonden een familielid van de 14-3-3 familie in vissen, wat zij 14-33.a hebben genoemd, dat na nader onderzoek sterk verwant bleek aan 14-3-3b en 14-3-3z. (zie hoofdstuk 3). De ontdekking van dit nieuwe familie lid gaf wel de mogelijkheid om overeenkomsten in functie tussen de verschillende 14-3-3 familieleden te onderzoeken. Deze functies blijken sterk geconserveerd te zijn gedurende de evolutie, en het 14-3-3.a eiwit in het bijzonder. In de onderstaande tabel staat een overzicht van biologische processen waarbij 14-3-3 eiwitten betrokken zijn in verschillende organismen. De tabel is naar alle waarschijnlijjkheid niet compleet omdat er tot op de dag van vandaag nog steeds nieuwe functies van 14-3-3 eiwitten gevonden worden. De tabel maakt een onderscheid tussen planten aan de ene kant en andere eukaryote organismen, zoals gist, Drosophila en zoogdieren aan de andere kant. Dit betekent niet dat 14-3-3 eiwitten in gist, Drosophila en zoogdieren precies dezelfde functies bekleden. De tabel is bedoeld om een indicatie te geven van de grote verscheidenheid aan functies die 14-3-3 heeft.
14
Dieren, Gist, Drosophila
Planten
Raf-kinase PKC Bcr-kinase CDK2 (cyclin dependent kinase) Cdc25 (phosphatase) PKU alpha (kinase) HDAC4/5 (histone deacetylases) TERT (telomerase catalitische subeenheid) BAD (apoptose) Interleukin 9 receptor Glycoprotein Ib alpha Tryptophane hydroxylase Slob/Slowpoke (K+-kanaal) Chloride kanaal Ziekte van Creutzfeldt-Jakob Borst kanker Cel cyclus controle Neurotransmitter productie Chromosoom stabilisatie/onsterfelijk maken van cellen Transcriptie processen Adhesie en aggregatie van bloedplaatjes Olfactatoir leergedrag in Drosophila Reparatie van DNA schade
CDPK (kinase) WPK (SNF1 gerelateerd kinase) G-box bindings factor VP1 (transcriptie complex) Nitraat reductase Sucrose phosphate synthase Nucleaire translocatie (TERT) Stabilisatie (Raf) Inhibitie/activatie (NR, ATPase) Degradatie (NR, SPS) Membraan localisatie (Raf, BAD) Eiwit invoer (mitochondria, chloroplasten) Groei Energie productie Voedingsstof assimilatie Chloroplast functioneren Zetmeel productie Glyceraldehydes-3-fosfatase dehydrogenase Trehalose-6-fosfatase synthase Glutamine synthetases Glutamyl-tRNA synthetase
Er zijn vandaag de dag al meer dan 100 substraten gevonden voor 14-3-3 eiwitten in mensen (zie voor referenties Yaffe, 2002 en referenties daarin en Fu et al., 2000 en referenties daarin); • Verschillende eiwit kinases (PKC’s, familieleden van Raf, KSR, PCTAIRE, MEKK1, -2, en -3, Bcr (Breakpoint Cluster Region), PKUa, ASK1, phosphatidylinositol (PI-) 3 kinase, MLK, Ser/Thr kinase) Zie bijvoorbeeld figuur 3. • Receptor eiwitten (Glucocorticoide receptor, GpIb-IX, a2 adrenerge receptor, GABA receptor, insuline-achtige groeifactor I receptor, IL-3/IL-5/GMCSF receptor bc keten) • Enzymen (tyrosine en tryptofaan hydroxylase, nitraat reductase, serotonine N-acetyl transferase, PTPH1 tyrosine fosfatase) • Structurele en cytoskelet eiwitten (vimentin, keratinen K8/K18, Tau, Kif1C) • Kleine G-eiwitten en hun regulatoren (Rem, Rad, RGS3/7, p190RhoGEF) • Scaffolding en docking moleculen (insuline receptor substraat 1 (IRS-1), calmoduline, Grb2, polyoma middel T, p130Cas, Cbl) • Eiwitten betrokken bij controle van de celcyclus (Cdc25, CDK-2, tyrosine fosfatase en verschillende andere fosfatases, PTPH1, Chk1, Weel, p53, de katalytische subeenheid van humaan telomerase, centrosoom) • Eiwitten betrokken bij transcriptionele controle van gen expressie (TATA box bindings eiwitten TBP en TFIIB, histone deacetylases 4,5, en 7, histone acetyl transferase 1, transcriptie factoren NFAT, Msn2p eb 4p, forkhead (FKHRL) familie leden, DAF-16, co-activatoren TAZ, TLX-2, YAP, histone deacetylase) • Eiwitten betrokken bij de regulatie van apoptose (BAD, A20, de p75NTRgeassocieerde cel dood executeur NADE). Zie bijvoorbeeld figuur 4. • Oncogene producten (sommige polyoma virus antigenen, Bcr-Abl)
15
Het mag duidelijk zijn dat 14-3-3 eiwitten bij een zeer groot aantal processen betrokken is. Toch is de precieze functie of betekenis achter interacties niet altijd duidelijk. Een voorbeeld hiervan is de MAPK (mitogen-activated protein kinase) synthese route. Dit is een evolutionair geconserveerd signaal transductie systeem. Het heeft een verbazingwekkend grote verscheidenheid aan functies en komt voor in alle eukaryoten, waar het fundamentele cellulaire processen reguleert, zoals cel proliferatie, differentiatie, overleving en apoptosis. 14-3-3 is een belangrijke activator van Raf, een eiwit dat een cruciale rol speelt in deze en andere intracellulaire synthese routes. De interactie van 14-33 en Raf is hierboven weergegeven in figuur 1, in een zogenaamd multi-protein signalling complex. In dit schema heeft 14-3-3 dus de eigenschappen van een adapter eiwit in dat het interacties van andere eiwitten met Raf vereenvoudigd (Kolch, 2000).
Figuur 3: De waarschijnlijke rol van 14-3-3 en asynucleine bij: a) dopamine synthese en b) neurodegeneratie/apoptose Dopamine wordt gemaakt in een meerstappen proces waarin het aminozuur tyrosine wordt omgezet in DOPA door de activiteit van het gefosforyleerde enzym tyrosine hydroxylase (TH) en vervolgens in dopamine door amino acid decarboxylase (AADC). 143-3 bindt aan het gefosforyleerde TH en asynucleine bindt aan een eiwit dat TH weer kan defosforyleren. Hiermee houden TH en a-synucleine de fosforylatie van TH, en dus de productie van dopamine in evenwicht (1 in a). Wanneer a-synucleine minder aanwezig is (2 in b) wordt teveel dopamine geproduceerd door het uit evenwicht gebrachte TH. Hierdoor treed als het ware ‘vergiftiging’ van het neuron op (3) en zal de cel sterven.
16
Figuur 4: Lijnen in de figuur geven interacties tussen eiwitten weer. Kinases zijn weergegeven in rood, Gproteinen in groen, fosfatases in rose, adapters in donker gele 6vlakken, chaperones in licht gele rechthoeken en transcritpie factoren in blauw. (Zie voor verdere tekst en uitleg het artikel van Kolch, 2000).
17
Wat is de rol van 14-3-3 eiwitten in het menselijk brein? In de eukaryote cel wordt 14-3-3 eiwit voornamelijk gevonden in het cytoplasma, maar ook in het plasma membraan en in intracellulaire cel organellen, zoals de kern en het golgi apparaat, is 14-3-3 aangetroffen. 14-3-3 eiwitten zijn rijkelijk aanwezig in de hersenen, het orgaan waar ze in eerste instantie ontdekt zijn (Moore en Perez, 1967); ongeveer 1% van de totale hoeveelheid oplosbare 14-3-3 eiwitten bevindt zich daar. De eiwitten zijn echter ook aangetroffen in bijna alle andere weefsels, zoals de testes, de lever en het hart. 14-3-3 eiwitten lijken een belangrijke rol te spelen in de neuronale ontwikkeling en functie van het menselijk brein (Skoulakis en Davis, 1998). 14-3-3 eiwitten zijn rijkelijk aanwezig in het zenuwstelsel. Uit experimenten met Drosophila (fruitvliegjes) is naar voren gekomen dat mutaties in genen die het 14-3-3 eiwit tot expressie brengen, leidt tot verstoringen van neuronale differentiatie, synaptische plasticiteit en gedrags plasticiteit. Extrapolatie van deze experimenten op Drosophila indiceert dat dergelijke veranderingen ook in mensen optreden wanneer 14-3-3 niet op een juiste manier tot expressie komt. De Leonardo isovorm van 14-3-3 in Drosophila, lijkt essentieel te zijn voor de mogelijkheid om informatie uit de omgeving te verkrijgen en verwerken (leer-gedrag) en om deze informatie op te slaan en weer op te roepen wanneer dat nodig is (geheugen). Hiermee is Leonardo dus betrokken bij geconditioneerd leer-gedrag in Drosophila, waarbij neuronen uit vele verschillende neuronale routes betrokken zijn (Skoulakis en Davis, 1996). Het is zeer waarschijnlijk dat 14-3-3 ook betrokken is bij geheugen vorming en leer-gedrag bij andere organismen en waarschijnlijk ook bij de mens. De meeste van de zeven isovormen van 14-3-3 eiwitten die in gewervelde dieren voorkomen, dus ook bij de mens, worden in hoge concentraties tot expressie gebracht in de hersenen en ander neuronaal weefsel (Skoulakis en Davis, 1996). Dit gegeven is consistent met het grote aantal functies in neuronen waarbij 14-3-3 eiwitten betrokken zijn. Een belangrijke functie van 14-3-3 eiwitten in de hersenen is hun interactie met tyrosine hydroxylase en tryptofaan hydroxylase, nadat deze enzymen gefosforyleerd zijn door calmodulin kinase II (CaMK II). Door activatie van deze enzymen, kunnen 14-3-3 eiwitten invloed uitoefenen op de biosynthese van respectievelijk catecholamines en serotonine. Daarnaast spelen ze een belangrijke rol in het functioneren van Ca2+-gereguleerde exocytose, regulatie van de cel cyclus, en regulatie van proteïne kinase C (PKC; zie Skoulakis en Davis, 1996, en referenties daarin). Wakabayashi en collega’s (2001) hebben gevonden dat 14-3-3 eiwitten in verhoogde concentraties aanwezig zijn in de CSF van AIDS patiënten die dementie of door het cytomegalovirus veroorzaakte encefalitis ten gevolge van hun ziekte hebben. Van de vijf isovormen die aanwezig zijn in humane neuronen, bèta, gamma, zeta, epsilon en eta, toonden Wakabayashi en collega’s de aanwezigheid van epsilon, gamma en zeta aan in de CSF van AIDS patiënten met pathologische neurologische aandoeningen. Ze konden deze isovormen niet aantonen in de CSF van AIDS patiënten zonder deze neurologische verschijnselen, of in de CSF van niet-HIV geïnfecteerde patiënten. Het is opvallend dat het patroon van deze isovormen verschilt van het patroon van 14-3-3 eiwitten in patiënten met CJZ of van patiënten met herpes simplex encefalitis. Deze wetenschappers concluderen dat de aanwezigheid van 14-3-3 eiwitten in de CSF zijn vrijgekomen uit kapotte neuronale cellen, en goed zouden kunnen dienen als zogenaamde real-time markers voor de ratio en het aantal neuronale cellen dat ten gevolge van een neuronale aandoening vernietigd zijn.
18
Ook Satoh en collega’s (1999) detecteerden 14-3-3 eiwit in de CSF van patiënten met nietprion gerelateerde aandoeningen. In in vitro cellen vonden Satoh en collega’s tot expressie gebrachte 14-3-3 eiwitten. De cellen waarin ze 14-3-3 eiwit vonden, waren alle neuronen die ze onderzochten, astrocyten, oligodendrocyten en microglia cellen, in alle celsoorten zowel in het cytoplasma als in de celkern regionen. Satoh en collega’s concluderen, net als Wakabayashi en collega’s (boven), dat 14-3-3 eiwitten in de CSF zijn vrijgekomen uit zowel neuronen als glia cellen van patiënten met hersenaandoeningen waarbij hersenweefsel vernietigd wordt. Fountoulakis en collega’s vonden in 1999 dat 14-3-3 eiwitten ook kunnen worden aangetoond bij oudere patiënten die lijden aan de ziekte van Alzheimer, of aan het Down syndroom, met optreden van een Alzheimer-achtige neuropathologie. Vooral de epsilon en gamma isovormen van 14-3-3 waren in verhoogde concentraties aanwezig in de CSF van deze patiënten. Fountoulakis en collega’s veronderstellen dat deze verstoring in de expressie van de epsilon en gamma isovorm van 14-3-3 onvolledige signaal transductie en / of apoptose in de hersenen zouden kunnen reflecteren. Ze stellen hierbij proteïne kinase C, Ras, en het mitogengeactiveerde kinase MEK voor als signaal transductie eiwitten, en de bcl-2-gerelateerde eiwitten BAD en BAG-1 als apoptose factoren. Burkhard en collega’s (2001) screenden 100 patiënten vonden 14-3-3 eiwit in de CSF van patiënten met verschillende vormen van degeneratieve dementie, onder andere de ziekte van Alzheimer, frontotemporale dementie, dementie met Lewy lichaampjes, vasculaire dementie, carcinomateuze meningitis en anoxische encefalopathie. De aanwezigheid van 14-3-3 eiwitten in de CSF bij patiënten met dementie bleek onafhankelijk van de tijdsduur van de ziekte. De verschillende isovormen van 14-3-3 eiwitten kunnen door het gehele brein worden aangetroffen. Baxter en collega’s (2002) hebben 14-3-3 isovormen in het brein van muizen met specifieke antilichamen aangekleurd (figuur 1) om de neuroanatomische lokalisatie van de verschillende isovormen te onderzoeken. Dit deden zij zowel in normale hersenen als in hersenen die geïnfecteerd waren met scrapie. In normale hersenen lieten de b, g, h, en z een gelijk distributie patroon zien, en waren voornamelijk de neuronale cellichaampjes Figuur 1: Methode voor 14-3-3 antilichaam kleuringen. aangekleurd. De precieze locatie van de De 14-3-3 dimeer bindt aan een eiwit (in de figuur; activated ligand) dat covalent gebonden zit door een verschillende isovormen vertoonde echter reactie met zijn N-terminale cysteine residu aan een subtiele verschillen. De t isovorm werd alleen maleimide (MA)- geactiveerde plaat. De complexen die aangetroffen in de hippocampus en de medulla, hierdoor gevormd worden, kunnen worden gedetecteerd door immunostaining met een 14-3-3 antilichaam en de e isovorm verspreid door de grijze massa gevolgd door een secundair antilichaam. van het centraal zenuwstelsel. In hersenen die geïnfecteerd waren met scrapie, waar ernstige pathologische veranderingen konden worden waargenomen, werden significante verschillen in de 14-3-3 isovorm distributie aangetroffen in de hippocampus en de thalamus. In figuur 2 wordt de verdeling van 7 verschillende isovormen in de normale hersenen van muizen weergegeven. Niet alleen de distributie van de 14-3-3 isovormen verschilt, maar ook de
19
manier waarop hun antilichamen cellen aankleuren; antilichamen voor de b, g, z, en t isovormen kleuren het cellichaam en het begin van de dendrieten boom licht tot zeer licht aan, terwijl de h isovorm de hele cel inclusief de complete dendrieten boom aankleurt, en de e isovorm helemaal niets aankleurt (Baxter et al., 2002). Vanwege de zeer sterke evolutionaire conservatie van de 14-3-3 eiwitten, kan men ervan uit gaan dat een dergelijke verdeling bij de mens te vinden is. Figuur 2: Diagrammatische voorstelling van de verdeling van de verschillende 14-3-3 isovormen in de normale hersenen van de muis. De verschillende kleuren duiden op verschillende labellingen. Donker groen staat voor neuronale labelling, waarbij de neuronale cellichaampjes worden aangekleurd. Deze labelling geldt overigens niet automatisch voor alle neuronen die zich in het microscopische veld bevinden. Bovendien bestaat de mogelijkheid dat ook andere cellen dan neuronen zijn aangekleurd, hoewel morfologische testen dit niet kunnen aantonen. Rose staat zowel voor mindere labelling van de cellichaampjes als voor minder intense labelling. Lichtgroen tenslotte, staat voor nog net waarneembare labelling in de grijze massa van de hersenen. (Zie voor verdere uitleg het artikel van Baxter et al., 2000).
20
Wat is Creutzfeldt-Jakob ziekte? De overdraagbare spongiforme encephalopathies bestaan uit een groep fatale neurodegeneratieve ziektes. Deze ziektes omvatten onder andere de humane ziekte van Creutzfeldt-Jacob, Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndroom, Fatal Famial Insomnia (FFI) en kuru (Brown, 1994, Medori et al., 1992), het in schapen en geiten voorkomende scrapie, en spongiforme encephalopathie in runderen, beter bekend als gekke koeien ziekte (Gajdusek, 1996). Spongiforme encephalopathieën worden gekenmerkt door een spongiforme degeneratie van de hersenen, een reactieve gliosis in de grijze massa van de cortex en de subcortex en de aanwezigheid van de abnormale vorm van cellulaire prion eiwitten (Prusiner, 1996). Deze degeneratieve encephalopathieën zijn overdraagbaar op laboratorium dieren wanneer de infectieuze prionen experimenteel worden ingeënt. Algemene histologische kenmerken van humane spongiforme encephalopathieen veroorzaakt door prionen, in de hersenen, zijn; Spongiforme veranderingen in het hersenweefsel (waarbij sponsachtige Figuur 1: Spongiosis; het onstaan van vacuoles in het vacuoles in het weerfsel onstaan), verlies hersenweefsel, waarmee de cel architectuur van neuronen, astrocytosis (toename van ernstig verstoord wordt. het aantal astrocyten, specifieke cellen in de hersenen die de functies van de neuronen ondersteunen, wat resulteert in een afbraak van neuronen), het vormen van amyloide plaques (klontering van een chemische substantie [in CJZ vaak het prion eiwit]), zwelling van neuronen, abnormale dendriet-vorming, necrose (afsterving) en gat-vorming in de witte stof van de hersenen en microgliose (het afsterven van de glia cellen van de hersenen).
Figuur 2: Astrocytose; toename van het aantal astrocyten in de hersenen ,aangekleurd met een specialeimmunocytochemische kleuring.
Creutzfeldt-Jakob ziekte is een zeldzame en dodelijke neuro-degeneratieve ziekte. De meeste patiënten die de ziekte krijgen zijn tussen de 50 en 75 jaar oud, maar gevallen in patiënten van 40, 30 of zelfs 20 jaar zijn ook bekend. Klinische kenmerken van Creutzfeldt-Jakob ziekte (CJZ) omvatten onder andere een snelle en progressieve dementie in combinatie met myoclonus (schokachtige trekkende bewegingen van een spier of spiergroep, meestal beperkt tot een bepaald gedeelte van het lichaam) en aan karakteristiek patroon van de hersenactiviteit dat op elektro-encefalogrammen zichtbaar gemaakt kan worden. Er vormen zich
21
spongiforme pathologische verandering-en in de hersenen, waarvandaan de naam spongiforme encephalopathie is afgeleid. Ook is er vaak sprake van verschillende vormen van disfunctioneren van het bewegingsorgaan (onder andere Parkinsonisme en dystonia (verstoorde spier-ritmiek), disfunctioneren van het cerebellum (kleine hersenen), visuele stoornissen, spongiosis (ontsteking van de onderhuid), astrocytose en soms stuiptrekkingen. In latere stadia van de ziekte wordt het centraal zenuwstelsel in steeds ernstiger mate aangetast, waardoor primitieve reflexen en zelfs mutisme optreden. Patiënten in het eindstadium van de ziekte zijn vaak stom, stijf en hebben een afwijkende ademhaling. Een zeldzaam symptoom van CJZ is het zogenaamde ‘alien hand syndrome’ waarbij het vermogen van de patiënt om de bewegingen van zijn hand te herkennen weg is. De patiënt heeft echter geen verminderd gevoel in zijn hand (Inzelberg et al., 2000). Dit zeer eigenaardige syndroom is ook waargenomen in patiënten waarbij het corpus callosum (het gedeelte van de hersenen Figuur 3: amyloide plaques, gekenmerkt door een dat de ene hersenhelft aan de andere donkere plaque omgeven door een lichte verbindt) beschadigd is door bijvoorbeeld rand. een tumor, of bij patiënten die ontstekingen hebben aan de mediaal frontale cortex of de thalamus, of die lijden aan degeneratie van de cortico-basale signaal transductie route. De ziekte is voor het eerst beschreven in 1920 door de Duitse neuroloog H.G. Creutzfeldt. Een jaar later beschreef een andere Duitse neuroloog, A. Jakob, vier dergelijke ziektegevallen, waarvan twee ook daadwerkelijk de klinische kenmerken van Creutzfeldt-Jakob vertoonden. Hoewel CJZ meestal als sporadisch optredende ziekte wordt gevonden, kan het ook voorkomen in een overerfbare of infectieuze vorm. Deze laatste vorm werd voor het eerst vastgesteld tijdens een studie naar een andere vorm van spongiforme encephalopathie, kuru, in de jaren ’50. Kuru komt alleen voor bij de bevolking van het Fore gebied op Papua Nieuw Guinea en wordt waarschijnlijk overgedragen via het eten van hersenen tijdens rituele, kannibalistische begrafenissen. De veterinaire neuroloog Hadlow stelde een overeenkomst tussen kuru en het bij schapen en geiten voorkomende scrapie vast en startte een onderzoek naar de overdracht van deze ziekten. Na het infecteren van hersenweefsel van een patiënt die overleden was aan CJZ in de hersenen van een chimpansee, kon een verband tussen scrapie, kuru en CJZ worden vastgesteld. In 1985 werd voor het eerst een geval van CJZ gevonden in een patiënt die was behandeld met een humaan groeihormoon, wat uit een kadaver was verkregen. Erfelijke gevallen van CJZ zijn meerdere malen gevonden, maar zijn totnogtoe niet verklaard. Wel is onlangs een link gevonden tussen het optreden van deze vorm van CJZ en een genetische mutatie op de korte arm van chromosoom 20. Een tijd lang heeft met niet kunnen ontdekken welke ziekte verwekker verantwoordelijk was voor CJZ. In eerste instantie werd verondersteld dat een virus verantwoordelijk was, maar men heeft nooit een immunologische reactie van het lichaam kunnen vaststellen, en bovendien werkte geen enkele medicatie die in normale gevallen virussen zou moeten inactiveren. Ook heeft moleculair biologisch onderzoek uitgewezen dat de ziekte verwekker kleiner is dan een standaard, en een sterke associatie met celmembranen lijkt te hebben.
22
Daarom werd verondersteld dat CJZ wordt veroorzaakt door zogenaamde prionen (‘proteinacious infectious particle’). Dit wordt verondersteld omdat men nog niet heeft kunnen aantonen dat er nucleine zuur betrokken is bij verspreiding van de ziekte. Prionen zijn eiwitten die afstammen van protease-sensitieve eiwitten, welke onderdelen zijn van normale cel membranen. Het wordt gedacht dat deze normale eiwitten een soort transformatie ondergaan tijdens DNA translatie, waardoor ze een onoplosbaar pathogeen prion vormen. Zo’n pathoFiguur 4: Plaques van prion eiwitten. geen prion kan op zijn beurt weer andere eiwitten aanzetten tot het verworden van prionen. Hierdoor ontstaat een ketting reactie waardoor het aantal gevormde prionen exponentieel toeneemt. Het ontstaan van het initiële prion kan een spontane gebeurtenis zijn, maar is meestal het gevolg van een genetische abnormaliteit of door infectie. Er wordt vanuit gegaan dat het prion eiwit, PrPSc, interacties zou aangaan met verschillende cellen in de hersenen, en hierdoor verantwoordelijk zou zijn voor een van de kenmerkende eigenschappen van prion-ziekten; spongiose. Neurotoxiciteit wordt waarschijnlijk direct veroorzaakt door interacties met het PrPSc eiwit, of indirect door activatie van astrocyten en microglia cellen. In beide gevallen treed neuronaal verlies op, ontwikkeling van spongiforme vacuoles en kunnen die klinische beelden omschreven worden als ‘status spongiformis’. Het schema hieronder geeft hier een overzicht van:
PrPSc interacties MICROGLI A ACTIVATIE
Ontstekings mediatoren Reactieve O2 intermediairen Degradatie enzymen
Neurotoxiciteit fagocytose
NEURONEN
DEGENERATIE
APOPTOSE
Neuronaal verlies Spongiforme vacuolisatie
ASTROCYTEN
AVTIVATIE
Ontstekings mediatoren Degradatie enzymen Glutamaat toxiciteit
Astrocytose Fibrillaire gliose neurotoxiciteit
STATUS SPONGIOSE
23
De prionen theorie waarmee men probeert het ziektebeeld van spongiforme encephalopathie te verklaren, is meestal goed bruikbaar om het ziektebeeld van CJZ te verklaren, maar vertoont wat mankementen bij het verklaren van het bij schapen en geiten voorkomende scrapie; bij scrapie worden verschillende ‘stammen’ van de ziekte waargenomen, die verschillende incubatie tijden, klinische kenmerken en besmettings pathologie vertonen. Dit zijn meer de kenmerken van een virus-besmetting die verschilt door variatie binnen de soort en is moeilijk te verklaren met de prionen theorie. Naast de de prionen-theorie, vindt ook de zogenaamde ‘slow-virus theory’, die voor het eerst werd voorgesteld door Sigurdsson in 1954, aftrek onder wetenschappers (zie voor uitgebreide informatie op: http://www.cjdfoundation.org/Agent.html). De meerderheid van de ziektegevallen van CJZ zijn sporadisch (85%). 10-15% van de gevallen zijn genetisch en een kleine minderheid ontstaat door besmetting. Wereldwijd worden jaarlijks 0.5-1 gevallen per miljoen personen vastgesteld, hoewel het werkelijke aantal veel hoger zal zijn, aangezien CJZ meestal niet wordt opgemerkt. Hogere incidenties (tot 100 gevallen per miljoen mensen) zijn gerapporteerd in Slowakije en in Libanon geboren Israëli’s, wat verklaard kan worden door een hoge kans bestaat op een mutatie in een gen dat betrokken zou kunnen zijn bij het ontstaan van CJZ binnen deze bevolkingsgroepen. De ‘epidemie’ van CJZ in het Verenigd Koninkrijk van een paar jaar geleden, heeft totnogtoe geen bewijs geleverd voor besmetting van organisme op organisme. Ook wordt aangenomen dat de overdracht van TSE’s (transmissible spongiforme encephalopathies) van schapen met scrapie op mensen niet mogelijk is, hoewel in al in 1938 werd aangetoond dat deze TSE’s wel van schaap op schaap kunnen worden overgedragen. Dit wordt bijgestaan door het feit dat er geen hogere incidentie van CJZ is in landen waar scrapie in schapen en geiten voorkomt (zoals het Verenigd Koninkrijk en Australië) en landen waar scrapie niet voorkomt. Er kunnen twee soorten van CJZ worden onderscheiden; de normale vorm, CJZ, en een afwijkende, sporadische variant; ‘new-variant Creutzfeldt-Jakob disease’ of vCJZ. Deze laatste vorm is voor het eerst beschreven in 1996 in wordt sterk in verband gebracht met BSE (bovine spongiform encephalopathy), beter bekend als gekke koeien ziekte. Dit verband is echter nog nooit aangetoond, en het is ook nog steeds niet duidelijk prionen via voedsel van het ene op het andere organisme kunnen worden overgebracht. vCJZ wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een spontane verandering van een eiwit in een prion, en komt vaker voor in relatief jonge patiënten. vCJZ vertoont in eerste instantie de kenmerken van een neuropsychiatrische aandoening; de patiënt lijdt aan depressie en krijgt de andere kenmerken van CJZ pas in een later stadium van de ziekte. Dit verschilt echter per patiënt. Het is duidelijk dat wat de ziekteverwekker van CJZ ook is, een virusachtig deeltje of een prion of misschien nog wel iets anders, het beschikt over een hoge graad van resistentie tegen de huidige conventionele behandelmethodes die men totnogtoe op de ziekteverwekker heeft uit geprobeerd: Ultraviolette straling, ioniserende straling, extreme temperaturen, ethanol, formaldehyde en autoclaven hebben totnogtoe niets kunnen uitrichten tegen deze ziekteverwekker: Totnogtoe is het dus onmogelijk gebleken om CJZ te genezen. Amantidine en amphotericine leken veel belovende medicijnen, maar bleken weinig tot geen effect te hebben op het verloop van de ziekte. Verschillende andere medicijnen zijn geprobeerd, waaronder acyslovir, interferon, steroïden, virusremmers en antibiotica, maar geen van deze behandelingen mocht baten. Klinische testen met een nieuw medicament, flupirtine, zijn momenteel aan de gang. Het is aangetoond dat flupirtine de intracellulaire concentraties van het anti-apoptotische eiwit Bcl-2 en van het antioxidatieve middel glutathion (GSH) ophoogt (Muller et al., 2000). Men heeft onlangs voorgesteld om patiënten speciale stoffen toe te
24
dienen, die specifiek aan het prion eiwit binden of om ze te behandelen met gen therapie. Deze laatste methode zou gebruik moeten maken van een anti-sense oligunucleotide dat in de hersenen van de patiënt bindt aan het gen dat verantwoordelijk is voor het ontstaan van de prion eiwitten. Deze therapie gaat ervan uit dat ziekte als CJZ niet kunnen bestaan zonder de aanwezigheid van prionen en dat de afwezigheid van prionen het normale functioneren van het lichaam niet belemmert. Deze aannames zijn echter nog niet bewezen; de oorzaak van CJZ probeert men te verklaren met behulp van de prionen-theorie. Omdat er geen medicatie bestaat voor prion ziekten is het van groot belang dat ziekte gevallen tijdig herkend worden. Post-mortem kunnen prionen weliswaar gedetermineerd worden in hersenweefsel met behulp van histopathologie van hersen-biopsieën, maar een goede diagnostische pre-mortem test voor het identificeren van mensen en dieren besmet met overdraagbare spongiforme encephalopathieën bestaat nog niet. In principe is een hersenbiopsie op levende patiënten mogelijk, maar het brengt grote risico’s met zich mee voor de gezondheid van zowel de patiënt als de arts, en kan bovendien de exacte locatie waar de ziekte zich heeft gemanifesteerd missen. In principe zijn er drie methoden voor het detecteren van prionen ziekten in mensen: 1) Pathologie 2) Klinische definiëring, zoals progressieve dementie, myoclonus en karakteristieke electroencephalografische bevindingen 3) Klinische veronderstellingen, zoals de punten genoemd onder methode twee, ataxia en de aanwezigheid van bepaalde cerebrospinale eiwitten. Een relatief nieuwe methode voor het detecteren van prion ziektes in mensen is het onderzoeken van eiwitten die zich in de cerebrospinale vloeistof van patiënten bevinden. De meeste van deze studies zijn echter ontoereikend gebleken (Hsich et al., 1996 en referenties daarin). Er zijn echter twee 30-kd eiwitten, eiwit 130 en 131, gevonden via gebruik van tweedimensionale electroforese die een goede diagnose prognose en een hoge gevoeligheid en specificiteit voor Creutzfeldt-Jakob ziekte lijken geven (Hsich et al., 1996, . Harrington et al., 1986).
25
Wat is de rol van 14-3-3 in Creutzfeldt-Jakob ziekte? Het testen van vloeistof uit de ruggengraat op de aanwezigheid van het 14-3-3 eiwit (of andere eiwitten), het nemen van een biopsie van de hersenen, of het aantonen van de aanwezighied van de ziekteverwekkende isoform van het prionen eiwit (PrPSc: Kretzschmar et al., 1996)) in hersenweefsel zijn totnogtoe de enige manieren om de ziekte vast te stellen, waarvan alleen biopsie en de aanwezigheid van PrPSc definitief uitsluitsel kan geven. Deze methoden zijn helaas alleen uitvoerbaar op hersenweefsel, en kunnen daardoor schade aan de hersenen van de patiënt berokkenen. Via gebruik van twee-dimensionale electrofores zijn twee 30-kd eiwitten gevonden, eiwit 130 en 131, die een goede diagnose prognose en een hoge gevoeligheid en specificiteit voor Creutzfeldt-Jakob ziekte lijken geven (Hsich et al., 1996, . Harrington et al., 1986). Deze techniek met eiwitten 130 en 131 is nog niet geschikt voor routine gebruik, maar heeft zich toch bruikbaar bewezen. Een nadeel in deze prion ziekte detectie methode is het feit dat de eiwitten slechts in lage concentraties aanwezig zijn in de cerebrospinale vloeistof. Hsich en collega’s (1996) stellen voor dat eiwitten 130 en 131 in hogere concentraties in normaal hersenweefsel aanwezig zouden zijn. Als dat het geval zou zijn, zal de identificatie van de ziekte van Creutzfeldt-Jakob via het gebruik van bijvoorbeeld immunoassay’s, een stuk eenvoudiger zijn en zal er geen biopsie verricht hoeven te worden. Hsich en collega’s (1996) hebben via aminozuur sequenties bepaald dat de eiwitten 130 en 131 overeen komen met het humane en in runderen aanwezige 14-3-3 eiwit. De ontdekking dat eiwit 130 en 131 tot de 14-3-3 familie behoren, is een aanleiding om cerebrospinale vloeistof via immunoassay te screenen voor 14-3-3. De reden dat 14-3-3 vaak slechts in lage concentraties in de cerebrospinale vloeistof wordt aangetroffen, staat waarschijnlijk in verband met de pathologie van prion-gerelateerde ziekten; deze ziektes veroorzaken massieve neuronale verstoringen, waardoos eiwitten in de cerebrospinale vloeistof lekken (Hsich et al., 1996). De precieze reden dat 14-3-3 betrokken is bij Creutzfeldt-Jakob ziekte is nog niet duidelijk. Een verklaring zou kunnen zijn dat 14-3-3 in normale gevallen een neuronaal eiwit is dat bestaat uit verscheidene isovormen en een rol speelt in de stabilisatie van andere eiwitten; Creutzfeldt-Jakob is een ziekte waarbij prion eiwitten verkeerd gevouwen worden. Het is mogelijk dat 14-3-3 in verband staat met de pathologie van overdraagbare spongiforme encephalopathie (Hsich et al., 1996). Het is interessant om te vermelden dat de h isovorm van 14-3-3 in met scrapie-geïnfecteerde hersenen van muizen werd aangetroffen in dezelfde neuronen van de hypothalamus en het cerebellum werd aangetroffen als het prion eiwit (Baxter et al., 2002). Deze onderzoeksresultaten hebben aangetoond dat de concentratie van bepaalde 14-3-3 isovormen afneemt of toeneemt gedurende het verloop van een priongerelateerde ziekte. De begripsvorming over het verband tussen 14-3-3 eiwitten en neurodegeneratieve ziektes wordt hierdoor nog ingewikkelder. Green en collega’s (2001) hebben geprobeerd om een verband te leggen tussen de concentratie van 14-3-3 eiwitten in de cerebrospinale vloeistof (CSF; cerebro-spinal fluid) van patiënten die aan Creutzfeldt-Jakob ziekte (CJZ) of aan de variant daarvan (vCJZ) leiden. Al eerder is vastgesteld dat patiënten die aan CJZ leiden een verhoogde concentratie 14-3-3 eiwitten in hun CSF hebben (Green et al., 2001 en referenties daarin). Hieruit is naar voren gekomen dat 14-3-3 een goed bruikbare marker zou kunnen zijn om CJZ te detecteren. Behalve 14-3-3, lijken ook ander eiwitten toegenomen in de CSF van CJZ patiënten. 26
Voorbeelden hiervan zijn neuron specific enolase (NSE), S100b (een glia-cell eiwit), en tau eiwit (Green et al., 2001 en referenties daarin). Voor de vCJZ, de variante vorm die vaak jongere patiënten treft en een link zou kunnen hebben met BSE, is het aantonen en op tijd detecteren van de ziekte een stuk moeilijker. Het specifieke EEG patroon dat kan worden waargenomen vanuit de hersenen van patiënten van CJZ, ontbreekt vaak bij vCJZ. Green en collega’s (2001) hebben aangetoond dat 14-3-3, NSE, S100b en tau eiwitten kunnen worden aangetoond in de CSF van sommige vCJZ patiënten, maar dat de gevoeligheid en nauwkeurigheid van deze testen veel lager zijn dan voor ‘gewone’ CJZ patiënten. Van de vier neuronale markers die getest werden, gaf tau eiwit de meest betrouwbare prognose voor vCJZ. Nadeel is echter dat de aanwezigheid van tau in de CSF ook verhoogd is in een verscheidenheid aan andere, niet CJZ-gerelateerde, ziektes, zoals Alzheimer, wat de specificiteit van deze marker weer verlaagd. De auteurs stellen een combinatie voor van markers voor 14-3-3 en tau in CSF van patiënten die mogelijk lijden aan CJZ of vCJZ. Verdere experimentele data zullen moeten vaststellen of dit een bruikbare methode is. Ook Aksamit en collega’s (2001) hebben de hoeveelheid 14-3-3 eiwit in de CSF van CJZ patiënten vergeleken met de hoeveelheid in gezonde patiënten. Ook keken ze naar het neuronspecifieke enolase eiwit NSE. Deze onderzoekers concluderen dat de het meten van 14-3-3 eiwit, zeker in combinatie met het meten van NSE concentratie, een bruikbare en gevoelige methode is om CJZ vast te stellen, wanneer de concentraties van deze eiwitten 35 ng/mL en 8 ng/mL, voor 14-3-3 en NSE repectievelijk, is. Wanneer de concentraties onder deze grenswaarden ligt, is de methode ook mogelijk om de aanwezigheid van CJZ uit te sluiten. Deze methode is echter niet gevoelig genoeg om alle ziekte gevallen eruit te pikken en zal dus moeten worden uitgebreid met standaard procedures zoals het maken van EEG’s en het nemen van biopsieën, om zekerheid te krijgen. Tshampa en collega’s (2001) hebben vastgesteld dat determinatie van 14-3-3 eiwitten in de CSF kan helpen om verschil te maken tussen patiënten met CJZ en patiënten die lijden aan Alzheimer’s ziekte of patiënten met dementie die de lichaampjes van Lewy vertonen. Alledrie deze ziektes zijn neurodegeneratieve ziektes waarbij dementie als voornaamste verschijnsel optreedt. Ook hebben alledrie de aandoeningen nog geen bekende oorzaak, en hebben een fatale afloop. Verschil is dat CJZ veel zeldzamer is en dat de twee andere voornamelijk bij oudere patiënten voorkomen, en de voornaamste oorzaken van ouderdoms dementie zijn (Gómez-Tortosa et al., 1998). Deze resultaten suggereren dat een concentratie verhoging van 14-3-3 eiwitten niet alleen betrokken lijken te zijn bij dementie die optreedt bij CJZ, maar een specifieke reactie is op een ander kenmerk van de ziekte, misschien wel op de prionen. Otto en collega’s (2002) hebben de concentraties van 14-3-3 en tau eiwit in de CSF van CJZ patiënten onderzocht. Ze vonden dat de concentratie tau eiwit in de CSF van CJZ patiënten niet significant verschilt van dat van gezonde mensen. Dit komt door de lage sensitiviteit en specificiteit van deze methode met tau eiwit. Toch stellen Otto en collega’s dat het meten van CSF concentraties van tau in combinatie met 14-3-3 wel een goede diagnose van CJZ kan geven. Weber en collega’s (1997) stellen dat de beste manier om de diagnose CJZ te stellen is om een verhoogde aanwezigheid van 14-3-3 in combinatie met NSE, S-100 en tau te meten in de CSF. Satoh et al (1999) en Wakabayashi et al (2001) veronderstellen dat het screenen op de aanwezigheid van 14-3-3 eiwitten in de CSF van patiënten geen goede manier is om de
27
diagnose CJZ te stellen; zij vonden immers dat 14-3-3 eiwitten ook uit neuronen en glia cellen in de CSF vrijkomen bij diverse niet-prion gerelateerde pathologische hersen-aandoeningen. Ook Burkhard et al. (2001) concluderen dat deze methode niet selectief genoeg is voor CJZ; van de 100 patiënten van wie zij de CSF screenden op de aanwezigheid van 14-3-3 eiwit, hadden 14 patiënten inderdaad 14-3-3 eiwit in hun CSF, maar slechts 2 van deze patiënten bleek CJZ te hebben. Saiz en collega’s (1999) wijzen er bovendien op dat de symptomen van paraneurplastische neurologische aandoeningen de symptomen van CJZ kunnen maskeren en dat in de CSF van patiënten bovendien 14-3-3 eiwit kan worden aangetroffen. Samenvattend kan geconcludeerd worden dat patiënten met CJZ 14-3-3 eiwitten in hun CSF hebben, maar dat de aanwezigheid van 14-3-3 eiwitten niet perse hoeft te duiden op CJZ.
28
Discussie Sinds de ontdekking van 14-3-3 eiwitten, zijn steeds meer functies van dit eiwit aan het licht gekomen. Het afgelopen decennium is het aantal publicaties over 14-3-3 eiwitten bijna exponentieel gestegen. Het is een verrassende ontdekking dat de verschillende 14-3-3 isovormen in verschillende gebieden in de hersenen voorkomen, aangezien 14-3-3 eiwitten adapter moleculen zijn en in het hele lichaam in vele verschillende signaal transductie routes hun taken uit voeren. Patiënten van neurodegeneratieve ziektes, zoals de ziekte van Creutzfeldt-Jakob, zijn onderhevig aan degeneratie van de neuronen in hun hersenen. Hierdoor komen eiwitten die zich normaal gesproken in die neuronen bevinden vrij in, onder andere, de cerebrospinale vloeistof. Daarom is het screenen van de cerebrospinale vloeistof op de aanwezigheid van 143-3 eiwitten een manier om de ziekte van Creutzfeldt-Jakob te detecteren. Uit onderzoek is echter gebleken dat andere ziektes, zoals bepaalde vormen van dementie, ook leiden tot neuronale degeneratie en dus de aanwezigheid van 14-3-3 eiwitten in de cerebrospinale vloeistof. Screenen op bepaalde isovormen van het 14-3-3 eiwit zou een mogelijkheid kunnen zijn, aangezien aangetoond werd dat bepaalde neuronen zowel de 14-3-3 h-isovorm in hun cellichaam, als het prion eiwit in het gebied om het cellichaam had. De veranderingen in verspreiding van individuele 14-3-3 isovormen in geval van scrapie, of andere prion gerelateerde infecties in een terminaal stadium, zijn in opvallend door de afgenomen labelling in gebieden die ernstige pathologische veranderingen ondergaan. Een belangrijk voorbeeld hiervan is de sterke neuronale degeneratie die optreed in de cellen van de hippocampus en delen van de thalamus. Verder onderzoek is nodig om uit te wijzen hoe de precieze mechanismen zijn die de verschijning van 14-3-3 eiwitten in de cerebrospinale vloeistof te weeg brengen. Hiermee zal niet alleen meer duidelijkheid ontstaan omtrent priongerelateerde ziektes, maar ook omtrent andere ziektes van het centraal zenuwstelsel, waarbij neurodegeneratie een prominente rol speelt. Uit dit verslag blijkt dat het screenen op 14-3-3 eiwitten in de cerebrospinale vloeistof van patiënten die aan prion gerelateerde ziekten, zoals de ziekte van Creutzfeldt-Jakob, geen volledig uitsluitsel kan geven over het al dan niet aanwezig zijn van prionen. De aanwezigheid van 14-3-3 in de cerebrospinals vloeistof is het gevolg van degeneratie van hersenweefsel bij verschillende neurologische aandoeningen, en wijst dus niet per definitie op CJZ. 14-3-3 eiwitten spelen een belangrijke rol in vele processen in de cellen van eukaryote organismen. Nog lang niet alle functies van 14-3-3 zijn ontdekt, bestudeerd en begrepen. In de toekomst zouden deze eiwitten een belangrijke bijdrage kunnen leveren aan verder begrip van de onvoorstelbaar ingewikkelde processen die zich afspelen in onze cellen.
29
9-
I
Appendix
De ziekte van Creutzfeldt-Jakob (CJZ) in de UK
jaar
vermoedde gevallen
sporadisch
iatrogeen
genetisch
vCJD
totaal dodental
1990
53
28
5
0
-
33
1991
75
32
1
3
-
36
1992
96
44
2
5
-
52
1993
78
37
4
3
-
46
1994
116
51
1
4
-
59
1995
87
35
4
2
3
47
1996
134
40
4
2
10
60
1997
161
59
6
4
10
80
1998
154
63
3
4
18
89
1999
169
61
6
2
15
84
2000
178
48
1
2
28
80
2001
172
48
3
2
20
75
2002*
23
3
0
1
5
9
totaal aantal vermeldingen
1496
549
40
34
109
750
*Op 4 maart 2002
30
200 180 160 vermoedde gevallen
140
dodental 120 sporadische CJZ 100 iatrogene CJZ 80 genetische CJZ 60
vCJZ
40 20
19
90 19 91 19 92 19 93 19 94 19 95 19 96 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01
0
Grafiek behorende bij de tabel van bovenstaande pagina.
31
II-
!I
Klassificatie criteria voor de ziekte van Creutzfeldt-Jakob
!
Snel vorderende staat van dementie !
II
A
Myoclonus
B
Visuele of cerebellaire problemen
C
Pyramidale of extrapyramidale kenmerken
D
Akinetisch mutisme
III
!
Typische patroonvorming op EEG (ElectroEncefaloGram)
!
!
!
DEFINITIEVE SPORADISCHE CJZ
Neuropathologische/immunocytochemische bevestiging.
WAARSCHIJNLIJKE SPORADISCHE CJZ
I en 2 van II en III OF waarschijnlijke sporadische CJZ en positieve test resultaten van screening naar 14-3-3.
MOGELIJKE SPORADISCHE CJZ
I en 2 van II en een tijdsduur van de ziekte van < 2 jaar.
BESMETTELIJKE CJZ
Progressieve cerebellaire syndromen in een ontvanger van hormonen uit de pituitary OF sporadische CJZ met een herkenbaar blootstellings risico, bijvoorbeeld trnasplantatie van de dura mater (hersenvlies).
GENETISCHE CJZ
Definitieve of waarschijnlijke CJZ plus definitieve or waarschijnlijke CJZ in een eerste grads familielid OF het voorkomen van een neuropsychiatrische aandoening in combinatie met een ziekte-specifieke mutatie
III-
!I
Klassificatie criteria voor de variante vorm van Creutzfeldt-Jakob ziekte (vCJZ)
A
Progressieve neuroprychiatrische aandoeningen.
32
II
III
B
Een ziekte duur van > 6 months.
C
Routine onderzoeken wijzen niet op een alternatieve ziekte diagnose.
D
Geen geschiedenis bekend van mogelijke iatrogene blootstelling.
A
Vroege psychiatrische symptomen
B
Aanhoudende pijnlijke sensorische symptomen
C
Ataxia.
D
Myoclonus of chorea of dystonia.
E
Dementie.
A
EEG’s zijn niet in staat om typische kenmerken van klassieke CJZ aan te tonen OF er is geen EEG gemaakt.
! !
B
Posterieure thalamische hoge signalen op MRI scans.
IV
A
Positieve uitkomst na het nemen van een biopsie van de amandelen.
!
IV-
14-3-3 eiwit interacties
Eiwitten die interacties kunnen aangaan met 14-3-3 eiwitten (zie verder Palmgren et al., 1998) Methode A: B: C: D: E: F: G:
Co-purificatie of co-immunoprecipitatie Two-hybrid screen In Vitro interacties (recombinante eiwitten/ gezuiverde eiwitten) Eiwit bindings studies Expressie van Baculovirus Expressie van bacteriofaag library In vivo studies in Xenopus laevis eicellen
Substraat A20 Ascorbaat, peroxidases BAD Breakpoint cluster region protein Cdc25 fosfatase Cdk PCTAIRE-1
Moleculaire activiteit van 14-3-3 Chaperone Inhibitor Adapter Inhibitor -
Methode AB B BC ABDE BG BC 33
Proto-oncogen product c-Clb Exoenzyme S G-box binding factor Glucocorticoid receptor (GR) Glycoprotein Ib-IX Type I insuline growth factor receptor (IGFIR) Insuline receptor substraat 1 43-kDa Inositol polyfosfaat 5-fosfatase Keratine intermediate filament Kinase suppressor van Ras (KSR) NADH: nitraat reductase (NR) Nonstructureel eiwit NS2 Plasma membraan H+-ATPase Polyoma virus middle T antigen Pre-sequentie regio van mitochondriele precursor eiwitten Protein kinase C (PKC) PKC theta Myosin II zware keten specifieke PKC (MHC_PKC) Protein-tyrosine fosfatase 1 (PTPH1) B-Raf c-Raf-1 Tryptofaan hydroxylase Vav Proto-oncogen product Wee1 kinase
Activator Activator Inhibitor Activator Chaperone Niet zeker Inhibitor Inhibitor Niet zeker Activator -
ABC C A BC AD B ABC CD C ABC D A AB D C CD AC A BC BD CDG AC F BC
34
Literatuur Aitken A. 1995. 14-3-3 proteins on the MAP. TIBS 20: 95-97. Aitkin A. 1996. 14-3-3 and its possible role in co-ordinating multiple signaling pathways. Trends Cell. Biol. 6: 341-347. Aitken A, Howell S, Jones D, Madrazo J, Patel Y. 1995. 14-3-3 alpha en delta are the phosphorylated forms of of Raf-activating 14-3-3 beta and zeta. J. Biol. Chem. 270: 57065709. Aksamit AJ Jr, Preissner CM, Homburger HA. 2001. Quantitation of 14-3-3 and neuronspecific enolase proteins in CSF in Creutzfeldt-Jakob disease. Neurol. 57: 728-730. Baxter HC, Liu W-G, Forster JL, Aitken A, Fraser JR. 2002. Immunolocalisation of 14-3-3 isoforms in normal and scrapie-infected murine brain. Neurosci. 109: 5-14. Brown P. 1994. Transmissible human spongiform encephalopathy (infectious cerebral amyloidosis): Creutzfeldt-Jakob disease, Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome, and kuru. In: Calne DB,ed. Neurodegenerative diseases. Philadephia: WB Saunders: 839-876. Burkhard PR, Sanchez JC, Landis T, Hochstrasser DF. 2001. CSF detection of the 14-3-3 protein in unselected patients with dementia. Neurol. 56: 1528-1533. Ferl R. 1996. 14-3-3 proteins and signal transduction. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 49-73. Finnie C, Borch J, Collinge DB. 1999. 14-3-3 proteins: eukaryotic regulatory proteins with many functions. Plant Mol. Biol. 40: 545-554. Fountoulakis M, Cairns N, Lubec G. 1999. Increased levels of 14-3-3 gamma and epsilon proteins in brain of patients with Alzheimer’s disease and Down syndrome. J. Neur. Transm. Suppl. 57: 323-335. Fu H, Subramanian RR, Masters SC. 2000, 14-3-3 proteins: structure, function, and regulation. Annu. Rev. Pharm. Tox. 40: 617-647. Furukawa Y, Ikuta N, Omata S, Yamauchi T, Isobe T, Ichimura T. 1993. Demonstration of the phosphorylation-dependent interaction of tryptophan hydroxylase with the 14-3-3 protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 194: 144-149. Gajdusek DC. 1996. Infectious amyloids:subacute spongiform encephalopathies as transmissible cerebral amyloidosis. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, eds. Fields virology. 3rd ed. Vol. 2Philadelphia: Lippincott-Raven: 2851-2900. Gómez-Tortosa E, Ingraham AO, Irizarry MC et al. 1998. Dementia with Lewis bodies. J. Am. Geriatr. Soc. 46: 1449-1458.
35
Green AJE, Thompson EJ, Stewart GE, Zeidler M, McKenzie JM, MacLeod M-A, Ironside JW, Will RG, Knight RSG. 2001. Use of 14-3-3 and other brain specific proteins in CSF in the diagnosis of variant Creutzfeldt-Jakob disease. J. Neurol. Neurosurg. Psych. 70: 744-748. Harrington MG, Merril CR, Asher DM, Gajdusek DC. 1986. Abnormal proteins in the cerebrospinal fluid of patients with Creutzfeldt-Jakob disease. N. Eng. J. Med. 315: 279-283. Hermeking H, Lengauer C, Polyak K, He TC, Zhang L, Thiagalingam S, Kinzler KW, Vogelstein B. 1997. 14-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression. Cell 1: 311. Hsich G, Kenney K, Gibbs CJ, Lee KH, Harrington MG. 1996. The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a marker for transmissible spngiform encephalopathies. N. Eng. J. Med. 335: 924-930. Ichimura T, Isobe T, Okuyama T, Takahashi N, Araki K, et al. 1988, Molecular cloning of cDNA coding for brain-specific brain protein 14-3-3, a protein kinase-dependent activator of tyrosine and tryptophan hydroxylases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 85: 7084-7088. Inzelberg R, Nisipeanu P, Blumen SC, Carasso RL. 2000. Alien hand sign in CreutzfeldtJakob disease. J Neurol. Neurosurg. Psych. 68:103-104. Jones DH, Ley S, Aitken A. 1995. Isoforms of 14-3-3 protein can form homo- and heterodimers in vivo and in vitro: implications for function as adapter proteins. FEBS Letters 368: 55-58. Kolch W. 2000. Meaningful relationships: the regulation of the Ras-Raf/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochem. J. 351: 289-305. Kretzschmar HA, Ironside JW, DeArmond SJ, Tateishi J. 1996. Diagnostic criteria for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Arch. Neurol. 53: 913-920. Kültz D, Chakravarty D, Adilakshmi T. 2001. A novel 14-3-3 gene is osmoregulated in gill epithelium of the euryhaline teleost Fundulud heteroclitus. J. Exp. Biol. 204: 2975-2985. Lopez-Girona A, Furnari B, Mondesert O, Russell P. 1999. Nuclear localization of Cdc25 is regulated by DNA damage and a 14-3-3 protein. Nature 397: 172-175. Medori R, Tritschler H-J, LeBlanc A et al. 1992. Fatal familial insomnia, a prion disease with a mutation at codon 178 of the prion protein gene. N. Eng. J. Med. 326: 444-449. Michaud NR, Fabian JR, Mathes KD, Morrison DK. 1995. 14-3-3 is not essential for Raf-1 function: identification of Raf-1 proteins that are biologically activated in a 14-3-3- and Rasindependent manner. Mol. Cell Biol. 15: 3390-3397. Moore BW, Perez VJ. 1967. Specific acidic proteins of the nervous system. In: Physiological and Biochemical Aspects of Nervous Integration, ed. FD Carlson, pp. 343-359. Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall. Morrison D. 1994, 14-3-3: modulators of signaling proteins? Science 266: 56-57.
36
Muller WE, Laplanche JL, Ushijima H, Schroder HC. 2000. Novel approaches in diagnosis and therapy of Creutzfeldt-Jakob disease. Mech. Ageing Dev. 116: 193-218. Müller J, Ory S, Copeland T, Piwnica-Worms H, Morrison DK. 2001. C-TAK1 regulates Ras signaling by phosphorylating the MAPK scaffold, KSR1. Otto M, Wiltfang J, Cepek L, Neumann M, Mollenhauer B, Steinacker P, Ciesielczyk B, Schultz-Schaeffer W, Kretzschmar HA, Poser S. 2002. Tau protein and 14-3-3 protein in the differential diagnosis of Creutzfeldt-Jakob disease. Neurol. 58: 192-197. Palmgren MG, Fuglsang AT, Jahn T. 1998. Deciphering the role of 14-3-3 proteins. Exp. Biol. Online 3: 4. ISSN 1430-3418. Pawson T, Scott JD. 1997. Signalling through scaffold, anchoring, and adaptor proteins. Science 278: 2075-2080. Prusiner SB. 1996. Prions. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, eds. Fields virology. 3rd ed. Vol. 2Philadelphia: Lippincott-Raven: 2901-2950. Rosenquist M, Sehnke P, Ferl RJ, Sommarin M, Larsson C. 2000. Evolution of the 14-3-3 protein family; Does the large number of isoforms in multicellular organisms reflect functional specificity? J. Mol. Evol. 51: 446-458. Saiz A, Graus F, Dalmau J, Pifarre A, Marin C, Tolosa E. 1999. Detection of 14-3-3 brain protein in the cerebrospinal fluid of patients with paraneoplastic neurological disorders. Ann. Neurol. 46: 774-777. Satoh J, Kurohara K, Yukitake M, Kuroda Y. 1999. The 14-3-3 protein detectable in the cerebrospinal fluid of patients with prion-unrelated neurological diseases is expressed constitutively in neurons and glial cells in culture. Eur. Neurol. 41: 216-225. Sehnke PC, Henry R, Cline K, Ferl RJ. 2000. Interaction of a plant 14-3-3 protein with the signal peptide of a thylacoid-targeted chloroplast precursor protein and the presence of 14-3-3 isoforms in the chloroplast stroma. Plant Physiol. 122: 235-242. Siles-Lucas M, Felleisen RS, Hemphill A, Wilson W, Gottstein B. 1998. Stage-specific expression of the 14-3-3 gene in Echinococcus multilocularis. Mol. Biochem. Parasitol. 91: 281-293. Singer TD, Tucker SJ, Marshall WS, Higgins CF. 1998. A divergent CFTR homologue: highly regulated salt transport in the euryhaline teleost F. heteroclitus. Am. J. Physiol. 274: C715-C723. Skoulakis EM, Davis RL. 1996. Olfactory learning deficits in mutants for leonardo, a Drosophila gene encoding a 14-3-3 protein. Neuron 17: 931-944. Skoulakis EM, Davis, RL. 1998. 14-3-3 proteins in neuronal development and function. Mol. Neurobiol. 16: 269-284.
37
Tschampa HJ, Neumann M, Zerr I, Henkel K, Schröter A, Schultz-Schaeffer WJ, Steinhoff BJ, Kretzschmar HA, Poser S. 2001. Patients with Alzheimer’s disease and dementia with Lewy bodies mistaken for Creutzfeldt-Jakob disease. J. Neurol. Neurosurg. Psych. 71: 33-39. Tzivion G, Avruch J. 2002. 14-3-3 proteins: active cofactors in cellular regulation by serine/threonine phosphorylation. J. Biol. Chem. 277: 3061-3064. Wakabayashi H, Yano M, Tachikawa N, Oka S, Maeda M, Kido H. 2001. Increased concentrations of 14-3-3 epsilon, gamma and zeta isoforms in cerebrospinal fluid of AIDS patients with neuronal destruction. Clin. Chim. Acta 312: 97-105. Wang W, Shakes DC. 1996. Molecular evolution of the 14-3-3 protein family. J. Mol. Evol. 43: 384-398. Wang B, Yang H, Liu YC, Jelinek T, Zhang L, Ruoslahti, Fu H. 1999. Isolation of HighAffinity Peptide Antagonists of 14-3-3 Proteins by Phage Display. Biochem. 38: 1249912504. Weber T, Otto M, Bodemer M, Zerr I. 1997. Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob disease and related human spongiform encephalopathies. Biomed. Pharm. Ther. 51: 381-387. Xia Z, Gale WL, Chang X, Langerau D, Patino R, Maule AG, Densmore LD. 2000. Phylogenetic sequence analysis, recombinant expression, and tissue distribution of a channel catfish estrogen receptor beta. Gen. Comp. Endocrinol. 118: 139-149. Yaffe MB. 2002. How do 14-3-3 proteins work? – Gatekeeper phosphorylation and the molecular anvil hypothesis. FEBS Letters 513: 53-*\57. Yaffe MB, Rittinger K, Volinia S, Caron PR, Aitken A, Leffers H, Gamblin SJ, Smerdon SJ, Cantley LC. 1997. The structural basis for 14-3-3 phosphopeptide binding specificity. Cell. 91: 961-971.
38
