Studi Aktivitas Antibakteri Minuman Fermentasi Whey Keju dari Lactobacillus plantarum B2 dan Lactobacillus bulgaricus (Kajian Konsentrasi (NH4)2HPO4 dan Sukrosa) The Studi of Cheese Whey Fermented Drink Antibacteria Activity from Lactobacillus plantarum B2 and Lactobacillus bulgaricus (Focused on (NH4)2HPO4 and Sucrose Concentration) David Yudianto1), Joni Kusnadi 2) Whey is a waste from cheese factory, like transparent liquid and rust colored, produced from press and filtration curd during cheese process production. Every production 1 kilogram cheese from 10 liters of milk will be produced 8-9 liters of whey, and can cause damage of environment. Lactose is the higest non water nutrient in the whey and protein is the second, so whey waste is used be cheese whey fermented drink use Lactobacillus plantarum B2 and Lactobacillus bulgaricus bacteria. That bacteria can produce organic acid and H2O2 compounds that can inhibit the growth or kill patogenic bacteria by damage their metabolism activity. The growth of patogenic bacteria in food can cause food bornedisease which will cause ill. Addition of (NH4)2HPO4 and sucrose as nitrogen and carbon sources be provided can increase the growth of lactid acid bacteria in order to can maximaze their antibacteria activity. Research method which will be used is Randomized Block Design with 2 factors, they are: concentration of (NH4)2HPO4 (0,1%, 0,3%, 0,5%) and concentration of sucrose (6%, 8%, 10%) with 3 times repetitions. The observation result will be analyzed by Analysis of Varians (ANOVA). Selection of the best treatment will be done by Zeleny method. The observation result show that addition of (NH4)2HPO4 concentration (0,1%, 0,3%, and 0,5%) and sucrose concentration (6%, 8%, and 10%) real influential (α=5%) concerning increase and dicrease of sugar total, but no real influential concerning pH, LAB total, and antibacteria activity (Escherichia coli and Staphylococcus aureus). The best combination treatment from cheese whey fermented drink is 0,3% (NH4)2HPO4 and 8% sucrose proportion which have many charateristics, they are; LAB total 6,926 log cfu/ml, pH 3,8, sugar total 7,65%, antibacteria activity with Escherichia coli as indicator bacteria 4,255 cm2, and antibacteria activity with Staphylococcus aureus 5,335 cm2. Key words: cheese whey, lactic acid bacteria antibacteria, (NH 4)2HPO4, sucrose 1) Alumni Jurusan Teknologi Hasil Pertanian Universitas Brawijaya 2) Staf Pengajar Jurusan Teknologi Hasil Pertanian Universitas Brawijaya PENDAHULUAN Whey adalah hasil samping dari industri pembuatan keju, merupakan cairan bening berwarna kuning kehijauan yang diperoleh dari penyaringan dan pengepresan curd selama proses pembuatan keju. Setiap produksi 1 kilogram keju dari 10 liter susu akan dihasilkan 8-9 liter whey (Jenie dan Rahayu, 1993). Komposisi utama whey adalah protein 0,8%-1,0% dan laktosa 3,8%-
4,3%. Negara India mencatat dalam buku tahunan untuk produksi limbah whey mencapai 2 juta ton per tahun dan industri pengolahan keju di USA menunjukkan 67 juta pounds limbah whey tiap tahunnya (Bohnert, 1998). Whey adalah produk samping dari industri keju yang sering dibuang sebagai limbah dan berpotensi tinggi mengkontaminasi lingkungan. Sehingga limbah whey ini dimanfaatkan
sebagai minuman fermentasi whey keju menggunakan bakteri asam laktat Lactobacillus plantarum B2 yang merupakan bakteri probiotik dan Lactobacillus bulgaricus (Widodo, 2003). Bakteri asam laktat memproduksi senyawa asam organik dan hidrogen peroksida (jika terjadi kelebihan oksigen pada lingkungan sekitar) yang bersifat antibakteri. Antibakteri adalah zat yang dapat menghambat pertumbuhan atau bahkan mematikan bakteri dengan cara mengganggu metabolisme bakteri patogen seperti Staphyllococcus aureus (Gram positif) dan Escherichia coli (Gram negatif). Bakteri patogen dapat menyebabkan bahaya karena memiliki kemampuan menginfeksi dan menimbulkan penyakit serta merusak kualitas bahan pangan. Salah satu faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas antibakteri adalah adanya nutrisi untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Girindra (1986), menyatakan bahwa senyawa amonium fosfat mempunyai kandungan nutrien yang tinggi yaitu fosfor (P) dan nitrogen (N), mempunyai kelarutan yang tinggi dan mempunyai sifat yang stabil dalam penanganan penyimpanan. Prescott dan Dunn (1959) juga menyatakan bahwa senyawa amonium fosfat sesuai digunakan sebagai sumber nitrogen dalam proses fermentasi karena dapat dimanfaatkan oleh mikroorganisme. Menurut Rahman (1989) sukrosa merupakan substrat yang digunakan dalam proses fermentasi sebagai sumber karbon. Penambahan (NH4)2HPO4 sebagai sumber nitrogen dan sukrosa sebagai sumber karbon diharapkan dapat meningkatkan pertumbuhan bakteri asam laktat sehingga dapat mempengaruhi aktivitas antibakterinya. Namun belum diketahui proporsi penambahan (NH4)2HPO4 dan sukrosa yang tepat untuk mendapatkan aktivitas antibakteri Lactobacillus plantarum B2 dan Lactobacillus bulgaricus yang maksimal
pada media whey keju. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian mengenai pengaruh penambahan (NH4)2HPO4 dan sukrosa selama proses fermentasi terhadap aktivitas antibakteri Lactobacillus plantarum B2 dan Lactobacillus bulgaricus yang ditumbuhkan pada media whey keju. METODOLOGI PENELITIAN Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2011 sampai November 2011, di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknologi Hasil Pertanian dan Laboratorium Biokimia dan Nutrisi Hasil Pertanian Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Brawijaya, Malang. Bahan Limbah cair keju mozarella (whey asam) dari CV. An Nur, Koperasi Mitra Bhakti Makmur, Junrejo, Batu, kultur Lactobacillus plantarum B2, Lactobacillus bulgaricus, bakteri patogen Escherichia coli, Staphylococcus aureus dari Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknologi Hasil Pertanian Universitas Brawijaya, MRSA, MRSB, (NH4)2HPO4, glukosa, aquades, buffer pH 4 dan pH 7, larutan H2SO4 pekat, CaCO3, Na-oksalat, Pb-asetat, anthron. Alat Gelas ukur, kompor listrik (Maspion S-300 220V), autoklaf (HL-36 AE Hiramaya, Jepang), kulkas, inkubator (Binder DB53 Jerman), Laminar Air Flow, tabung reaksi, beaker glass, erlenmeyer, timbangan digital ( Denver Instrumen M310), pipet ukur, bunsen, jarum ose, spatula besi, vortex, pH meter (model pHS-3C), spektrofotometer (Unico, uv-2100 Spectrophotometer). Rancangan Percobaan Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan
menggunakan 2 faktor, yaitu: konsentrasi (NH4)2HPO4 (0,1%, 0,3% dan 0,5% (b/v)) dan konsentrasi sukrosa (6%, 8% dan 10% (b/v)) dengan tiga kali ulangan.
Grafik Total BAL (Log) 7 6,9 6,8 6,7 6,6 6,5
(NH4)2HPO4 0,1% (b/v) (NH4)2HPO4 0,3% (b/v) (NH4)2HPO4 0,5% (b/v)
R C
Tahap Prosedur Penelitian Setiap unit percobaan digunakan 100 ml whey. Whey dipasteurisasi suhu 85 0C, selama 15 menit, untuk membunuh sel vegetatif bakteri patogen. Kemudian disaring dengan cepat dalam keadaan whey masih panas, agar terbebas dari gumpalangumpalan curd. Whey yang telah disaring kemudian ditambahkan (NH4)2HPO4 (0,1%, 0,3%, dan 0,5% (b/v)) dan sukrosa (6%, 8% dan 10% (b/v)) secara hot filling agar mikroba yang terdapat di dalam bahan padat (NH4)2HPO4 dan sukrosa mati. Pendinginan dilakukan pada suhu ruang sampai suhu mencapai 37 0C, yaitu suhu pertumbuhan optimum Lactobacillus plantarum B2 dan Lactobacillus bulgaricus. Inokulasi dilakukan dengan penambahan starter Lactobacillus plantarum B2 1% (v/v) dan starter Lactobacillus bulgaricus 1% (v/v) secara aseptis. Sebelum diinkubasi dilakukan analisa awal yang meliputi; total BAL, pH, total gula, dan aktivitas antibakteri. Kemudian diinkubasi suhu 37 0C, selama 42 jam. Setelah inkubasi dilakukan analisa akhir yang meliputi; total BAL, pH, total gula, dan aktivitas antibakteri.
dan menghasilkan metabolit berupa asam laktat selama proses fermentasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN Total BAL Jika semakin tinggi konsentrasi (NH2)HPO4 dan sukrosa maka rerata total BAL akan semakin meningkat. Hal ini sesuai dengan pernyataan Ratnayanti (2008) bahwa pemberian (NH4)2HPO4 sebesar 0,2% dan 0,3% dapat meningkatkan total BAL pada minuman probiotik. Selain itu Salminen dan Wright (1998) menyatakan bahwa bakteri asam laktat memanfaatkan gula sebagai sumber energi, pertumbuhan
6%
8% 10%
Penambahan Sukrosa (b/v)
Gambar 1. Grafik Pengaruh Konsentrasi (NH4)2HPO4 dan Sukrosa terhadap Rerata Total BAL Total BAL pada produk minuman fermentasi whey keju dengan penambahan konsentrasi (NH4)2HPO4 0,5% setelah fermentasi lebih rendah dari pada produk minuman fermentasi whey keju dengan penambahan konsentrasi (NH4)2HPO4 0,1% dan 0,3%. Hal ini diduga karena menurut Pelczar et. al. (1977), senyawa amonium bersifat bakterisidal pada konsentrasi 1% dan bersifat bakteristatik pada konsentrasi 0,5%. Mekanisme senyawa amonium dalam menghambat pertumbuhan bakteri adalah merusak membran sel setelah berekasi dengan fosfat pada fosfolipid membran sel mikroba. Selain itu, grafik total BAL (Gambar 1) produk minuman fermentasi whey keju pada semua penambahan (NH4)2HPO4 di konsentrasi sukrosa 10% mengalami penurunan. Hal tersebut diduga karena kombinasi penambahan (NH4)2HPO4 dan sukrosa yang diberikan mempengaruhi pertumbuhan bakteri asam laktat. Penambahan (NH4)2HPO4 0,5% akan menghambat pertumbuhan bakteri asam laktat sesuai dengan pernyataan Pelczar et. al. (1977), senyawa amonium bersifat bakteristatik pada konsentrasi 0,5%. Total BAL meningkat setelah proses fermentasi. Salminen dan Wright (1998) menyatakan bahwa, peningkatan total BAL
dikarenakan jika semakin lama fermentasi, maka bakteri asam laktat akan mempunyai kesempatan lebih lama untuk memanfaatkan nutrisi dalam proses metabolismenya, sehingga terjadi kenaikan jumlah sel (Tabel 1). Menurut Ratnayanti (2008), pemberian (NH4)2HPO4 sebesar 0,2% dan 0,3% mampu memberikan peningkatan terhadap jumlah BAL pada minuman probiotik. Selain itu, peningkatan ini juga diakibatkan oleh adanya penambahan sukrosa maka bakteri asam laktat akan mendapatkan nutrisi yang cukup sehingga BAL mengalami petumbuhan yang cepat. Hal ini didukung oleh Haynes (2002), yang menyatakan bahwa pertumbuhan bakteri dipengaruhi oleh beberapa hal antara lain nutrisi, temperatur, kelembapan, oksigen, pH dan substansi penghambat. Tabel 1. Rerata Peningkatan Total BAL Akibat Penambahan (NH4)2HPO4 dan Sukrosa Perlakuan Konse Konse ntrasi ntrasi (NH4)2 Sukro HPO4 sa (%) (%) (b/v) (b/v) 0,1% 6% 8% 10% 0,3% 6% 8% 10% 0,5% 6% 8% 10%
Total BAL Sebelum Fermen tasi (log cfu/ml)
Setelah Ferme ntasi (log cfu/ml)
5,452 5,442 5,686 5,480 5,406 5,586 5,473 5,527 5,380
6,739 6,913 6,884 6,765 6,926 6,884 6,678 6,842 6,778
Peni ngka tan (log cfu/ ml) 1,287 1,471 1,198 1,284 1,519 1,298 1,205 1,314 1,397
Hasil analisa ragam menunjukkan bahwa perlakuan konsentrasi (NH4)2HPO4 dan sukrosa memberikan pengaruh tidak nyata (α = 0,05) terhadap nilai total BAL minuman fermentasi whey keju. Interaksi
antar perlakuan juga tidak berpengaruh nyata (α = 0,05) terhadap nilai total BAL. pH Terjadi penurunan nilai pH dari nilai pH awal dan nilai pH hasil fermentasi. Penurunan derajat keasaman (pH) disebabkan oleh ion H+ yang berasal dari perombakan senyawa asam hasil metabolisme bakteri asam laktat. Singleton (1988) menyatakan bahwa, penurunan pH merupakan salah satu akibat dari proses fermentasi yang terjadi karena adanya akumulasi asam yang berasal dari BAL. Tabel 2. Rerata Penurunan pH Akibat Penambahan (NH4)2HPO4 dan Sukrosa Perlakuan Nilai pH Konsen Sebe Sete trasi Konsen lum lah (NH4)2 trasi Penu Fer Fer HPO4 Sukrosa runan men men (%) (%)(b/v) tasi tasi (b/v) 5,233 3,843 1,39 0,1% 6% 5,243 3,816 1,426 8% 5,216 3,81 1,406 10% 5,176 3,843 1,333 0,3% 6% 5,18 3,81 1,37 8% 5,16 3,803 1,356 10% 5,12 3,88 1,24 0,5% 6% 5,116 3,853 1,263 8% 5,11 3,843 1,266 10% Asam laktat yang dihasilkan sebagai produk utama akan terdisosiasi menghasilkan H+ dan CH3CHOHCOO-, sehingga semakin tingginya asam laktat memungkinkan tingginya ion H+ yang terbebaskan dalam medium. Jika semakin tinggi konsentrasi (NH4)2HPO4, maka pH semakin menurun. Hal ini diduga karena peningkatan jumlah asam organik yang merupakan hasil metabolisme dari bakteri asam laktat yang ada pada produk minuman
fermentasi whey keju. Jika rerata total BAL meningkat, maka produksi asam laktat pun juga makin meningkat sehingga pH akan semakin turun. Yang (2000) menyatakan bahwa, fermentasi yang melibatkan bakteri asam laktat ditandai dengan peningkatan jumlah asam-asam organik yang diiringi dengan penurunan pH. Namun pada semua penambahan (NH4)2HPO4 0,5% memiliki nilai pH yang lebih tinggi dari pada penambahan (NH4)2HPO4 0,1% dan 0,3%. Hal ini diduga karena menurut Pelczar et. al. (1977), senyawa ammonium bersifat bakteristatik pada konsentrasi 0,5%. Sehingga dimungkinkan pada penambahan konsentrasi (NH4)2HPO4 0,5%, senyawa ini mulai menghambat pertumbuhan bakteri asam laktat itu sendiri. Grafik Nilai pH
yang dihasilkan menyebabkan penurunan pH media fermentasi atau meningkatkan keasaman dan menimbulkan aroma khas. Charalampopoulus et al. (2002), menyatakan bahwa akumulasi asam yang dihasilkan melalui metabolisme bakteri asam laktat dapat menurunkan pH medium. Hasil analisa ragam menunjukkan bahwa perlakuan konsentrasi (NH4)2HPO4 dan sukrosa memberikan pengaruh tidak nyata (α = 0,05) terhadap pH minuman fermentasi whey keju. Interaksi antar perlakuan juga tidak berpengaruh nyata (α = 0,05) terhadap pH . Total Gula Total gula menurun akibat penambahan (NH4)2HPO4 dan meningkat akibat penambahan sukrosa. Grafik Total Gula
3,9 3,88 3,86 3,84 3,82 3,8 3,78 3,76
(NH4)2HPO4 0,1% (b/v) (NH4)2HPO4 0,3% (b/v)
12 10 8 6 4 2 0
(NH4)2HPO4 0,1% (b/v) (NH4)2HPO4 0,3% (b/v)
R
(NH4)2HPO4 0,5% (b/v)
6%
8%
10%
Penambahan Sukrosa (b/v)
(NH4)2HPO4 0,5% (b/v)
6%
8%
10%
Penambahan Sukrosa (b/v)
Gambar 2. Grafik Pengaruh Penambahan Konsentrasi (NH4)2HPO4 dan Sukrosa terhadap Rerata pH
Jika semakin tinggi konsentrasi sukrosa yang diberikan, maka nilai pH dari minuman fermentasi whey keju yang dihasilkan semakin rendah. Hal tersebut dikarenakan perlakuan penambahan sukrosa diduga dapat memberikan nutrisi tambahan bagi bakteri asam laktat untuk metabolisme dan pertumbuhan sel. Dengan tersedianya nutrisi yang optimal, maka aktivitas bakteri asam laktat akan meningkat sehingga menyebabkan jumlah asam hasil metabolisme juga meningkat. Menurut Spreer (1998), asam laktat dan asetaldehid
Gambar 3. Grafik Pengaruh Penambahan Konsentrasi (NH4)2HPO4 dan Sukrosa terhadap Total Gula
Lama fermentasi akan mempengaruhi seberapa banyak gula diubah menjadi asam laktat. Bakteri asam laktat memanfaatkan gula sebagai sumber energi, pertumbuhan dan menghasilkan metabolit berupa asam laktat selama proses fermentasi. Hasil analisa ragam menunjukkan bahwa perlakuan konsentrasi (NH4)2HPO4 dan sukrosa memberikan pengaruh yang nyata (α = 0,05) terhadap
nilai total gula minuman fermentasi whey keju. Pada interaksi antar perlakuan tidak berpengaruh nyata (α = 0,05) terhadap nilai total gula minuman fermentasi whey keju. Tabel 3. Rerata Penurunan Total Gula Akibat Konsentrasi (NH4)2HPO4 Konsentrasi Total Gula (NH4)2HPO4 BNT 0,05 (%) (%)(b/v) 8,791 c 0,1 8,144 a 0,87406 0,3 0,5 8,462 b Keterangan: angka yang didampingi huruf yang tidak sama pada satu kolom menunjukkan berbeda nyata (α = 0,05) Total gula akan semakin menurun seiring dengan makin tingginya konsentasi (NH4)2HPO4 yang ditambahkan. Penurunan total gula dikarenakan proses metabolisme dari sel mikroba. Mikroba akan merombak senyawa karbon (sukrosa/gula) menjadi energi untuk pertumbuhan dan asam laktat sebagai metabolitnya. Menurut Ratnayanti (2008), pemberian (NH4)2HPO4 sebesar 0,2% dan 0,3% mampu memberikan peningkatan terhadap jumlah BAL pada minuman probiotik. Peningkatan jumlah BAL juga akan berpengaruh terhadap penggunaan sumber N (nitrogen) untuk kebutuhan metabolisme, salah satunya merombak gula (sukrosa/laktosa) menjadi asam laktat. Namun, pada konsentrasi (NH4)2HPO4 0,5% total gula mengalami kenaikan. Hal ini terjadi karena pertumbuhan bakteri asam laktat mulai terhambat dengan semakin tingginya konsentrasi (NH4)2HPO4. Karena menurut Pelczar et. al. (1977), konsentrasi senyawa amonium fosfat 5% dapat menghambat pertumbuhan bakteri (bakteristatik).
Tabel 4. Rerata Peningkatan Total Gula Akibat Konsentrasi Sukrosa Konsentrasi Total Sukrosa Gula BNT 0,05 (%)(b/v) (%) 6,705 a 6 8,192 b 0,87406 8 10,500 c 10 Keterangan: angka yang didampingi huruf yang tidak sama pada satu kolom menunjukkan berbeda nyata (α = 0,05) Total gula meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi sukrosa. Peningkatan konsentrasi sukrosa memberikan pengaruh terhadap peningkatan total gula, sehingga sukrosa yang ditambahkan terhitung sebagai total gula. Jika semakin tinggi sukrosa yang ditambahkan maka total gula akan semakin tinggi. Total gula juga meliputi gula hasil pemecahan laktosa oleh Lactobacillus selama fermentasi (Wood, 1998). Tabel 5. Rerata Penurunan Total Gula Akibat Penambahan Konsentrasi (NH4)2HPO4 dan Sukrosa Perlakuan Nilai Total Gula (%) Kon Konse sen ntrasi Sebe trasi Setelah (NH4)2 lum Penuru Su Fermen HPO4 Fermen nan krosa tasi (%) tasi (%) (b/v) (b/v) 7,89 7,02 0,87 0,1% 6% 9,81 8,62 1,19 8% 11,58 10,73 0,85 10% 8,30 6,52 1,78 0,3% 6% 9,54 7,65 1,89 8% 11,56 10,26 1,29 10% 7,97 6,58 1,39 0,5% 6% 9,04 8,30 0,74 8% 10% 11,23 10,50 0,73
ammonium bersifat bakteristatik pada konsentrasi 0,5%. Sehingga diduga penambahan konsentrasi (NH4)2HPO4 0,5%, mampu menghambat pertumbuhan bakteri indikator Escherichia coli. Grafik Aktivitas Antibakteri
L2)
Total gula mengalami penurunan setelah proses fermentasi, karena sukrosa dimanfaatkan oleh bakteri asam laktat sebagai sumber karbon dan energi untuk pertumbuhan yang selanjutnya akan dirombak menjadi asam laktat. Mikroba membutuhkan gula untuk aktivitas metabolisme dan perkembangbiakan sel. Hal tersebut berkaitan dengan peningkatan jumlah sel bakteri, dimana semakin banyak sel bakteri yang ada, maka sukrosa akan semakin banyak digunakan untuk metabolisme sel. Oberman and Libudzisz (1998) dalam Rahmawati (2006), menyatakan bahwa peningkatan jumlah bakteri menyebabkan peningkatan perombakan senyawa gula yang ada pada medium menjadi asam–asam organik. Aktivitas Antibakteri (Bakteri Indikator Escherichia coli) Semakin tinggi konsentrasi (NH4)2HPO4 dan sukrosa maka akan semakin besar luas zona bening. Zona bening yang terbentuk dipengaruhi oleh bakteri asam laktat yang memproduksi asam laktat, asam-asam organik lain, hidrogen peroksida, dan diasetil serta senyawasenyawa lain yang bersifat antimikroba (Yang, 2000). Semakin banyak jumlah mikroba yang berkembangbiak maka kemampuan menghasilkan asam laktat juga meningkat. Asam laktat yang dihasilkan oleh BAL akan diekresikan keluar sel sehingga terakumulasi dalam cairan fermentasi (Astawan, 2007). Rahman (1992), menambahkan asam laktat yang terbentuk akan menyebabkan penurunan nilai pH. Zona bening yang terbentuk berhubungan dengan jumlah total BAL dan pH pada masing-masing perlakuan produk. Jika semakin tinggi total BAL dan semakin rendah pH, maka akan semakin besar luas zona bening, karena metabolit yang dihasilkan akan semakin banyak. Berdasarkan Pelczar et. al. (1977), senyawa
5 4 3 2 1 0
(NH4)2HPO4 0,1% (b/v) (NH4)2HPO4 0,3% (b/v) (NH4)2HPO4 0,5% (b/v)
6%
8%
10%
Penambahan Sukrosa (b/v)
Gambar 4. Grafik Aktivitas Antibakteri terhadap Escherichia coli
Rerata luas zona bening mengalami peningkatan setelah fermentasi. Hasil analisa ragam menunjukkan bahwa perlakuan konsentrasi (NH4)2HPO4 dan sukrosa memberikan pengaruh tidak nyata (α = 0,05) terhadap peningkatan luas zona bening dari minuman fermentasi whey keju terhadap bakteri indikator Escherichia coli, begitu juga interaksi antar perlakuan, juga tidak berpengaruh nyata (α = 0,05). Escherichia coli termasuk dalam golongan bakteri Gram negatif. Menurut Tortora et al. (2001) dalam Sitepu (2011), selain lapisan peptidoglikan, dinding sel bakteri Gram negatif juga memiliki lapisan lagi diluar lapisan peptidoglikan yang tidak dimiliki oleh bakteri Gram positif yang disebut membran luar. Membran luar adalah suatu lapisan bilipid yang mengandung fosfolipid, protein, dan lipopolisakarida. Asam laktat juga bersifat lipofilik sehingga akan lebih mudah masuk ke dalam sel bakteri Gram negatif, karena dinding sel bakteri Gram negatif memiliki kandungan lemak yang lebih tinggi dibanding dinding sel bakteri Gram positif.
Aktivitas Antibakteri (Bakteri Indikator Staphylococcus aureus) Semakin tinggi konsentrasi (NH4)2HPO4 dan sukrosa maka akan semakin besar luas zona bening. Zona bening yang terbentuk dipengaruhi oleh bakteri asam laktat yang memproduksi asam laktat, asam-asam organik lain, hidrogen peroksida, dan diasetil serta senyawasenyawa lain yang bersifat antimikroba (Yang, 2000). Grafik Aktivitas Antibakteri
L2)
Asam laktat yang tidak terdisosiasi dapat melalui lipid bilayer bakteri serta melepaskan proton dalam sitoplasma dan menyebabkan asam (Naidu, 2000). Sel akan berusaha mempertahankan pH internalnya dengan mengeluarkan proton yang masuk, sehingga energi sel akan habis untuk usaha ini dan energi untuk pertumbuhan berkurang. Jika konsentrasi asam ekstraseluler tinggi, energi sel tidak cukup untuk mengeluarkan semua proton dari dalam sel, sehingga pH sitoplasma akan terus menurun. Akibatnya, sel tidak lagi dapat terus bertahan hidup (Adam dan Moss, 2000). Peningkatan jumlah proton menyebabkan enzim terdenaturasi dan permeabilitas membran sel berubah, sehingga metabolit sel terganggu dan bakteri perlahan-lahan mati (Naidu, 2000).
7 6 5 4 3 2 1 0
(NH4)2HPO4 0,1% (b/v) (NH4)2HPO4 0,3% (b/v) (NH4)2HPO4 0,5% (b/v)
6%
8%
10%
Penambahan Sukrosa (b/v)
Tabel 6. Rerata Peningkatan Luas Zona Bening Akibat Penambahan Konsentrasi (NH4)2HPO4 dan Sukrosa terhadap Escherichia coli Luas Zona Bening Perlakuan (cm2) Kon Konsen sen trasi trasi Sebelum Setelah (NH4)2 Su Fermen Fermen HPO4 krosa tasi tasi (%) (%) (b/v) (b/v) 0 3,383 0,1% 6% 8% 0 3,993 0 4,221 10% 0 3,823 0,3% 6% 0 4,255 8% 0 4,380 10% 0 4,545 0,5% 6% 0 4,728 8% 0 4,694 10%
Gambar 5. Grafik Aktivitas Antibakteri terhadap S. aureus
Semakin banyak jumlah mikroba yang berkembangbiak maka kemampuan menghasilkan asam laktat juga meningkat. Asam laktat yang dihasilkan oleh BAL akan diekresikan keluar sel sehingga terakumulasi dalam cairan fermentasi (Astawan, 2007). Rahman (1992), menambahkan asam laktat yang terbentuk akan menyebabkan penurunan nilai pH. Zona bening yang terbentuk berhubungan dengan jumlah total BAL dan pH pada masing-masing perlakuan produk. Jika semakin tinggi total BAL dan semakin rendah pH, maka akan semakin besar luas zona bening, karena metabolit yang dihasilkan akan semakin banyak. Berdasarkan Pelczar et. al. (1977), senyawa ammonium bersifat bakteristatik pada konsentrasi 0,5%. Sehingga diduga penambahan konsentrasi (NH4)2HPO4 0,5%, mampu menghambat pertumbuhan bakteri indikator Staphylococcus aureus.
Rerata luas zona bening mengalami peningkatan setelah fermentasi. Hasil analisa ragam menunjukkan bahwa perlakuan konsentrasi (NH4)2HPO4 dan sukrosa memberikan pengaruh tidak nyata (α = 0,05) terhadap peningkatan luas zona bening dari minuman fermentasi whey keju terhadap bakteri indikator Staphylococcus aureus, begitu juga interaksi antar perlakuan juga tidak berpengaruh nyata (α = 0,05). Tabel 7. Rerata Peningkatan Luas Zona Bening Akibat Penambahan (NH4)2HPO4 dan Sukrosa terhadap Staphylococcus aureus Luas Zona Bening Perlakuan (cm2) Kon Konsen sen trasi trasi Sebelum Setelah (NH4)2 Su Fermen Fermen HPO4 krosa tasi tasi (%) (%) (b/v) (b/v) 0 4,726 0,1% 6% 0 5,312 8% 0 5,563 10% 0 4,974 0,3% 6% 0 5,335 8% 0 5,691 10% 0 5,139 0,5% 6% 0 5,382 8% 0 6,097 10% Naidu (2000) menyatakan bahwa efektivitas antibakteri dari asam laktat meningkat bersamaan dengan penurunan pH. Asam laktat yang tak terdisosiasi bebas menembus membran sel dan kemudian masuk ke dalam sitoplasma bersuasana pH tinggi. Pada kondisi pH tinggi (dalam sitoplasma), asam laktat terdisosiasi sehingga menghasilkan proton yang cenderung menurunkan pH sitoplasma. Sel akan berusaha mempertahankan pH internalnya dengan cara menetralkan atau
memaksa keluar proton. Usaha ini akan memperlambat pertumbuhan bakteri karena energi pertumbuhan digunakan untuk mengeluarkan proton. Jika pH eksternal rendah dan konsentrasi asam ekstraseluler tinggi maka beban dari sel akan menjadi besar dan pH sitoplasma akan menjadi turun. Hal ini tidak mungkin bisa dilalui pada kondisi pertumbuhan dan jika terjadi maka sel akan mati.Penghambatan senyawa antibakteri lebih tinggi pada Staphylococcus aureus dibandingkan dengan Escherichia coli. Tabel 8. Rerata Ketahanan Escherichia coli dan Staphylococcus aureus terhadap Minuman Fermentasi Whey Keju Zona Bening Aktivitas Perlakuan Antibakteri (cm2) Kon Konsen sen trasi trasi Su Escheri Staphyloco (NH4)2 krosa chia coli ccus aureus HPO4 (%) (%) (b/v) (b/v) 3,383 4,726 0,1% 6% 3,993 5,312 8% 4,221 5,563 10% 3,823 4,974 0,3% 6% 4,255 5,335 8% 4,380 5,691 10% 4,545 5,139 0,5% 6% 4,728 5,382 8% 4,694 6,097 10% Lactobacillus plantarum B2 dan Lactobacillus bulgaricus bersifat fakultatif anaerob. Selama proses fermentasi diduga ada oksigen di sekitar lingkungan. Bakteri asam laktat akan menghasilkan H2O2 dalam keadaan kelebihan oksigen. H2O2 akan menyebabkan denaturasi enzim dan peroksidasi membran lipid sehingga meningkatkan permeabilitas membran. H2O2
juga merupakan prekursor radikal bebas yang bersifat antibakteri seperti superoksida (O2.) dan hidroksil (OH.) yang merusak DNA. Menurut Yang (2000), produksi H2O2 oleh Lactobacillus dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus. Taufik (2004) menyatakan bahwa Lactobacillus plantarum dapat memproduksi H2O2 tertinggi di antara bakteri asam laktat lainnya. Hal ini diduga sebagai penyebab aktivitas antibakteri pada Staphylococcus aureus lebih tinggi dari pada Escherichia coli. Pemilihan Perlakuan Terbaik Perlakuan terbaik ditentukan dengan metode Zeleny, dimana parameternya meliputi parameter kimia dan mikrobiologi. Perlakuan pemberian senyawa (NH4)2HPO4 0,3% dan sukrosa 8% merupakan proporsi terbaik dalam menghasilkan komposisi minuman fermentasi whey keju yang terbaik. Komposisi kimia dan mikrobiologi pada minuman fermentasi whey keju dengan penambahan senyawa (NH4)2HPO4 0,3% dan sukrosa 8% yaitu: total BAL sebesar 6,926 log cfu/ml; pH 3,81; total gula 7,65%; luas zona aktivitas antibakteri terhadap bakteri indikator Escherichia coli sebesar 4,255 cm2; dan luas zona aktivitas antibakteri terhadap bakteri indikator Staphylococcus aureus sebesar 5,335 cm2. KESIMPULAN Penambahan tiga konsentrasi (NH4)2HPO4 yang berbeda (0,1%, 0,3%, dan 0,5) secara kimiawi berpengaruh nyata (α=5%) terhadap penurunan total gula. Pemberian tiga konsentrasi sukrosa yang berbeda (6%, 8%, dan 10%) secara kimiawi berpengaruh nyata (α=5%) terhadap peningkatan total gula. Pemberian tiga konsentrasi (NH4)2HPO4 dan sukrosa yang berbeda tidak berpengaruh nyata terhadap pH, total BAL dan aktivitas antibakteri.
Kombinasi perlakuan terbaik dari minuman fermentasi whey keju adalah proporsi 0,3% (NH4)2HPO4 dan 8% sukrosa (T2A2) dengan komposisi; total BAL sebesar 6,926 log cfu/ml; pH 3,81; total gula 7,65%; luas zona aktivitas antibakteri terhadap bakteri indikator Escherichia coli sebesar 4,255 cm2; dan luas zona aktivitas antibakteri terhadap bakteri indikator Staphylococcus aureus sebesar 5,335 cm2. SARAN Perlu penelitian lanjut mengenai jenis BAL yang cocok tumbuh pada media whey keju, karena waktu yang diperlukan fermentasi cukup lama untuk mencapai pH 3,8 yaitu 42 jam. Perlu penelitian mengenai jenis sumber nitrogen serta sumber karbon yang dapat memaksimalkan aktivitas antibakteri dari BAL yang ditumbuhkan pada media whey keju, sehingga bisa berpengaruh nyata terhadap luas zona bening aktivitas antibakteri. Selain itu, selisih penambahan konsentrasi (NH4)2HPO4 dan sukrosa perlu diperbesar, agar bisa berpengaruh nyata terhadap analisa total BAL, pH, total gula, dan aktivitas antibakteri. DAFTAR PUSTAKA Adams, M. R. and M. O. Moss. 2000. Food Microbiology 2nd ed. Royal Society of Chemistry. Cornwall, UK. Astawan, M. 2007. Brem. http://cybermed.cbn.net. Tanggal akses 10 April 2010. Bohnert, G. 1998. Bioconvertion Of Cheese Waste (Whey). Journal United States Departement Of Energy. Charalampopoulus, D.R., Wang S., S. Pandiella and C. Webb. 2002. Application of Cereals and Cereal Components in Functional Food: A Review. International Journal of Food Microbiology 79:131-141.
Girindra, A. 1986. Biokimia I. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Haynes, I. N. and M. J. Playne. 2002. Survival of Probiotic Culture in Low-Fat Ice Cream. Aust. J. Diary Tech. 57:3-7. Jenie, B. S. L. dan W. P. Rahayu. 1993. Penanganan Limbah Industri Pangan. Kanisius. Yogyakarta. Naidu, A. S. dan R. A. Clemens. 2000. Natural Food Antimicrobial Systems. CRC Press, LCC. Pelczar, M. J., Reid, R.D., and Chan,E. C. S. 1977. Microbiology. McGraw-Hill Publ. Co. Ltd. New Delhi. Prescott, S.C dan J. Dunn. 1959. Industrial Microbiology. Mc Graw Hill Book Company. New York. Rahman, A., 1989. Pengantar Teknologi Fermentasi. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. IPB. Bogor. Rahman, A., S. Fardiaz, W. P. Rahayu, Suliantari dan C. C. Nurwitri. 1992. Bahan Pengajaran: Teknologi Fermentasi Susu. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi Institut Pertanian Bogor. Bogor. Rahmawati, R.D. 2006. Studi Viabilitas dan Aktivitas Antimikrobial Bakteri Probiotik (Lactobacillus acidophillus) dalam Medium Fermentasi Berbasis Susu dan Bekatul Selama Proses Fermentasi. Skripsi. Jurusan THP. Universitas Brawijaya. Malang. Ratnayanti, R. 2008. Studi Aktivitas Antioksidan Minuman Probiotik Jambu Biji Merah (Psidium guajava) Kajian Jenis Isolat (L. Acidophilus dan L. Plantarum) dan Penambahan Diamonium Hidrogen Phosphat (DAHP). Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Brawijaya. Malang.
Salminen, S. and A. von Wright. 1993. Lactic Acid Bacteria. Marcell Dekker Inc. New York. Singleton, P. and D. Sainsburry. 1988. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd. John Willey and Sons, Ltd. Singapore. Sitepu, M. D. 2011. Studi Aktivitas Antibakteri Cuka Strawberry (Fragaria vesca L.) (Kajian Proporsi Buah:Air dan konsentrasi Sukrosa). Skripsi. Teknologi Pertanian Universitas Brawijaya. Malang. Spreer, E. 1998. Milk and Dairy Product Technology. Marcel Dekker Inc. USA. Taufik, E. 2004. Dadih Susu Sapi Hasil Fermentasi Berbagai Starter Bakteri Probiotik yang Disimpan pada Suhu Rendah : Karateristik Kimiawi. Departemen Ilmu Produksi Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Widodo. 2003. Bioteknologi Industri Susu. Lacticia Press. Yogyakarta. Wood, B.J.B. 1998. Microbiology of Fermented Food. Blackie Academic and Profesional. London. Yang, Z. 2000. Antimicrobial Compounds And Extracellular Polysaccharides Produced By Lactic Acid Bacteria: Structure and Properties. Department of Food Technology University of Helsinki .
