27
PEMBAHASAN
Dari tiga isolat Bacillus sp. penghasil antimikrob yang diseleksi, isolat Bacillus sp. Lts 40 memiliki aktivitas penghambatan paling besar terhadap E. coli dan V. harveyi dengan indeks penghambatan masing-masing 3 dan 7. Berdasarkan zona hambatan yang terbentuk dapat diketahui bahwa V. harveyi memiliki sensitivitas lebih tinggi dari pada E. coli terhadap antimikrob yang dihasilkan Bacillus sp. Lts 40. Irina et al. (2001) melaporkan Bacillus sp. memiliki kemampuan untuk menghasilkan zat antimikrob berupa bakteriosin, seperti Cerein oleh B. cereus (Oscariz & Pisabarro 2000). Rachmaniar (1997) menyatakan bahwa faktor yang mempengaruhi besar kecilnya zona hambat zat antimikrob antara lain adalah aktivitas zat antimikrob gugus fungsi dari substansi sendiri, resistensi dari bakteri terhadap substansi zat antimikrob, kadar substansi aktif serta jumlah inokulum bakteri atau kepadatan bakteri uji. Pada cross streak method, Bacillus sp. Lts 40 juga memiliki jarak penghambatan lebih besar dibandingkan Bacillus sp. yang lain. Jarak penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap E. coli (8 mm) dan V. harveyi (7 mm), dilihat secara secara statistik jarak penghambatannya tidak berbeda nyata. Ketiga Bacillus sp. yang diuji, aktivitas penghambatan pada masing-masing isolat berbeda nyata. Hasil uji ini menunjukkan bahwa dengan adanya perbedaan isolat maka aktivitas penghambatannya juga akan berbeda dan pada metode ini Bacillus sp. lebih dulu ditumbuhkan dari pada bakteri uji. Pada saat Bacillus sp. menghasilkan zat antimikrob, V. harveyi dan E. coli baru memasuki fase pertumbuhan. Beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas antimikrob itu ialah 1) jenis, jumlah, umur dan latar belakang kehidupan bakteri, 2) konsentrasi zat antimikrob, 3) suhu dan waktu kontak dan 4) sifat fisiko-kimia substrat seperti pH, kadar air dan tegangan permukaan (Frazier & Westhoff 1981). Isolat yang mempunyai aktivitas penghambatan paling besarlah yang dipakai untuk uji selanjutnya yaitu Bacillus sp. Lts 40.
28
Dari uji kompetisi, persentase penghambatan dengan rasio inokulum 1:1 sudah cukup bagi Bacillus sp. Lts 40 untuk menghambat pertumbuhan V. harveyi (81,8%) sedangkan persentase penghambatan terhadap E. coli (85,5%). Zat antimikrob selain terdapat di dalam sel, juga merupakan komponen permukaan sel yang dihasilkan pada kondisi tertentu dan dilepas dari sel ke dalam lingkungan sekitarnya. Oleh karena itu sel bakteri yang telah ditumbuhkan di dalam media cair akan melepaskan zat antimikrobnya ke dalam media. Fase cair yang diperoleh setelah dipisahkan dari media sudah merupakan antimikrob ekstraseluler. Bacillus sp. Lts 40 menghasilkan zat antimikrob selama fase pertumbuhan dan produksi optimum pada umur 3 hari dengan besar zona penghambatan pada E. coli 12 mm dan pada V. harveyi 11 mm. Pada umumnya bakteriosin diproduksi pada fase pertumbuhan eksponensial dan disintesis di ribosom dengan menghasilkan senyawa metabolit berupa protein atau polipeptida (Ray & Daeschel 1992). Pada inkubasi lebih dari 3 hari terlihat aktivitas antimikrobnya menurun. Penyebab menurunnya aktivitas antimikrob pada inkubasi yang terlalu lama, hal ini diduga karena pengaruh senyawa penghambat aktivitas antimikrob, enzim pencernaan atau sifat reabsorbsi antimikrob oleh sel produsen (Dajani & Wannamaker (1969), atau terbebasnya protease dari sel autolisis (Jo et al. 1996). Setelah mendapatkan ekstrak kasar dalam larutan yang bebas dari bentuk sel, tahap selanjutnya adalah pemurnian. Preparasi ektrak kasar mula-mula dipekatkan dengan fraksi presipitasi dengan amonium sulfat. Pada hasil pengendapan amonium sulfat secara bertahap menunjukkan fraksi endapan aktivitas penghambatan paling tinggi diperoleh pada pengendapan 30-40 % terhadap bakteri indikator E.coli dengan zona penghambatannya meningkat dari 12 mm menjadi 19 mm sedangkan pada bakteri indikator V. harveyi diperoleh pada pengendapan 60-70 % dengan zona penghambatannya juga meningkat dari 11 mm menjadi 22 mm. Terjadinya peningkatan aktivitas penghambatan pada V. harveyi dan E. coli karena tujuan dari pengendapan ini ialah untuk meningkatkan konsentrasi protein dan untuk memperoleh zat antimikrob dalam jumlah yang banyak.
29
Tahap selanjutnya adalah untuk menghilangkan molekul garam amonium sulfat dan ion pengganggu lain yang berpengaruh terhadap kestabilan molekul protein yaitu dengan proses dialisis. Konsentrasi amonium sulfat 30-40% pada E. coli aktivitas penghambatan sebelum dialisis 19 mm dengan kadar protein 0,0192 mg dan setelah dialisis 18 mm dengan kadar protein 0,0077 mg sedangkan pengendapan 60-70% pada V. harveyi aktivitas penghambatan sebelum dialisis 35 mm dengan kadar protein 0,1653 mg dan setelah dialisis 30 mm dengan kadar protein 0,1104 mg. Hasil dari uji secara statistik aktivitas penghambatan sebelum dan setelah dialisis tidak berbeda nyata baik terhadap V. harveyi maupun E. coli. Setelah protein dipisahkan, dilakukan fraksinasi untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul yaitu dengan filtrasi gel. Prinsip dari kromatografi filtrasi gel dimana protein yang ukuran besar tidak dapat merembes melewati pori sehingga akan dibasuh ke luar, mengalir turun sepanjang kolom dengan cepat. Sedangkan protein dengan ukuran molekul yang lebih kecil akan masuk ke pori sehingga alirannya tertahan atau lambat sekali. Pada tahap ini di lakukan presipitasi dengan amonium sulfat sampai kadar akhir 60-70%, selanjutnya didialisis semalam dan dilanjutkan ke kromatografi filtrasi gel. Dari 13 fraksi yang mewakili puncak yang ada, fraksi yang memiliki aktivitas penghambatan paling besar terdapat pada fraksi no 21 dengan zona penghambatan sebesar 30 mm terhadap bakteri V. harveyi sedangkan fraksi no 29 memiliki zona penghambatan pada E. coli sebesar 20 mm. Dari hasil uji karakterisasi pemurnian zat antimikrob menunjukkan bahwa Bacillus sp. Lts 40 menghasilkan zat antimikrob polipeptida yang termasuk dalam kelompok bakteriosin. Hal ini terlihat dari berat molekul yang dihasilkan oleh zat antimikrob Bacillus sp. Lts 40 terhadap V. harveyi adalah 47,38 kDa dan pada E. coli berat molekul yang dihasilkannya adalah 34,83 kDa . Beberapa peneliti juga telah mengkarakterisasi bakteriosin berdasarkan berat molekul yang dihasilkan seperti yang terdapat pada Tabel 6.
30
Tabel 6 Karakterisasi bakteriosin dari beberapa isolat bakteri Isolat
BM
Kestabilan
Pemurnian
Referensi
Brevibacterium linens
95 kDa
Stabil terhadap panas sampai 450C 60’, pada 600C tidak ada aktivitas antimikrob
Filtrasi gel, SDS-PAGE
(Kato et al. 1991)
Lactobacillus brevis
10-30 kDa
Pertukaran ion
(Benoit et al. 1994)
Pediococcus acidilactici
3,6 kDa
Stabil terhadap panas & kisaran pH yang luas Stabil terhadap panas 1000C 40’, stabil pH 2-11
(Cintas et al. 1995)
Bacillus coagulans I4
3-4 kDa
Stabil terhadap panas 600C 90’, stabil pada kisaran pH 4-8
Pertukaran ion, kromatografi hidrofobik, HPLC, SDSPAGE SDS-PAGE
Lactobacillus acidophilus 30SC
3,5 kDa
Stabil terhadap panas 1210C 20’, stabil pH 3-10
Kromatografi hidrofobik,SDS -PAGE
(Oh et 2000)
al.
Bacillus polyfermentucus
14,3 kDa
labil terhadap panas, diatas 700C tidak ada aktivitas antimikrob, stabil pada kisaran pH 2-9
SDS-PAGE
(Lee et 2001)
al.
Bacillus licheniformis
2 kDa
Stabil terhadap panas 1000C, stabil pada kisaran pH yang luas
Filtrasi gel, SDS-PAGE
(Martirani et al. 2002)
Bacillus cereus
1-8 kDa
Stabil terhadap panas 750C 15’, stabil pada kisaran pH 3-10
SDS-PAGE
(Torkar & Matijasic. 2003)
Lactobacillus palntarum F1 Lactobacillus brevis OG1
1-10 kDa
Stabil terhadap panas 1210C 10’, stabil pH 2-6
Ultrafiltrasi
(Ogunbanwo et al. 2003)
30 kDa
Stabil 500C 10’, dan satbil pada pH 2-10
Filtrasi gel, pertukaran ion dan SDSPAGE
(Anastasios & George 2003)
&
Streptococcus thermophilus ACADC 0001
(Hyronimus et al. 1998)
31
Bacillus amyloliquefaciens
5 kDa
Stabil terhadap panas 1000C 60’, stabil pH 2-8
SDS-PAGE
(Lisboa et al. 2006)
Zat antimikrob dari Bacillus sp. Lts 40 hasil dialisis stabil pada kisaran pH 3-11, yang ditunjukkan dengan masih ada aktivitas penghambatan pada pH 11 sebesar 14 mm terhadap V. harveyi dan 15 mm terhadap E. coli. Dari hasil statistik dengan selang kepercayaan 95% tidak berbeda nyata pada kisaran pH 311. Aktivitas penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap V. harveyi dan E. coli terlihat zat antimikrob ini bersifat stabil pada kondisi asam dan basa. Kemungkinan stabilnya zat antimikrob pada kisaran pH yang luas karena komposisi asam aminonya banyak mengandung sistein sehingga akan membentuk ikatan disulfida dan situs aktif zat antimikrob terhadap target tidak hanya satu. Jika terjadi perubahan pada pH dapat menyebabkan perubahan derajat ionisasi gugus ionik dari asam amino pada rantai protein. Peningkatan aktivitas antimikrob disebabkan ionisasi gugus ionik pada sisi aktif yang menyebabkan konformasi sisi aktif lebih stabil efektifitasnya (Denniston et al. 2001). Hasil uji stabilitas aktivitas zat antimikrob terhadap perlakuan setelah dialisis menunjukkan bahwa zat antimikrob dari Bacillus sp. Lts 40 bersifat tahan terhadap perlakuan panas sampai suhu 100 0C selama 20 menit, hal ini terlihat dari zona penghambatan oleh zat antimikrob tersebut terhadap bakteri indikator V. harveyi dan E. coli sebesar 15 mm dan 22 mm. Kemungkinan susunan asam amino zat antimikrob secara alamiah mendukung stabilitasnya dan berada dalam keadaan kompleks. Ikatan sulfidanya lebih banyak sehingga akan menyebabkan zat antimikrob ini lebih stabil terhadap panas. Bhunia et al. (1988), Ahn & Stiles (1990) melaporkan bahwa bakteriosin pada umumnya mempunyai sifat tahan terhadap panas dan asam, misalnya pada pemanasan 100 0C selama 30 menit, aktivitasnya masih tetap ada. Hal yang sama juga dinyatakan Kone & Fung (1992), bahwa bakteriosin pada pH rendah lebih toleran terhadap panas.
