IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF DARI BAKTERI ENDOSIMBIOTIK MIKORIZA Bacillus subtilis B10 YANG MENGHAMBAT PERTUMBUHAN PATOGEN Ganoderma boninense Pat

79

IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF DARI BAKTERI ENDOSIMBIOTIK MIKORIZA Bacillus subtilis B10 YANG MENGHAMBAT PERTUMBUHAN PATOGEN Ganoderma boninense Pat Identification of Active Compounds from Mycorrhizal Endosymbiotic Bacteria Bacillus subtilis B10 that Inhibit the Growth of Fungal Pathogen Ganoderma boninense Pat

Abstrak Di daerah mikorizosfir ditemukan berbagai helper bakteri yang dapat menghasilkan senyawa yang bekerja sinergis dengan FMA dalam menghambat pertumbuhan patogen Ganoderma boninense. Penelitian terdahulu menemukan bakteri B10 (Bacillus subtilis B10) memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan G. boninense, selanjutnya tujuan penelitian ini adalah mendapatkan dan mengidentifikasi senyawa yang dihasilkan oleh bakteri Bacillus subtilis B10 yang memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan G. boninense dan sekaligus mempercepat proses perkecambahan spora FMA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri Bacillus subtilis B10 menghasilkan senyawa intra seluler yang memiliki aktivitas menghambat pertumbuhan Ganoderma boninense. Ekstraksi menggunakan pelarut organik menunjukkan senyawa tersebut memiliki aktivitas penghambatan terhadap G. boninense pada fraksi etil asetat yang artinya senyawa tersebut bersifat semi polar. Hasil analisis menggunakan Liquid Chromatography–Mass Spectrometer (LC-MS) menunjukkan senyawa aktif tersebut memiliki bobot molekul 255,39 g/mol. Hasil analisis spektroskopi dengan 1 H-NMR menunjukkan senyawa tersebut memiliki rumus molekul C12H17NO5, dan dipostulasikan sebagai 2-(4-aminophenoxy)-6-methyl-tetrahydro-2H-pyran3,4,5-triol. Senyawa tetrahydro pyran dikenal memiliki aktivitas sebagai antifungi. Kata kunci: bakteri endosimbiotik mikoriza, senyawa aktif, ekstraksi, identifikasi senyawa

Abstract In the area of mycorrhizosphere found a variety of helper bacteria that can produce substrates or compounds that work synergistically with the arbuscular mycorrhiza fungi (AMF) in inhibiting the growth of pathogen Ganoderma boninense. Our previous research found that B10 bacteria (Bacillus subtilis B10) have the ability to inhibit the growth of G. boninense. Thus the purpose of this study was to find and identify the substances produced by Bacillus subtilis B10 which has the ability to inhibit the growth of G. boninense and also accelerate the germination process of AMF spores. The results showed that Bacillus subtilis B10 produced intra-cellular substances which have activity inhibiting the growth of

Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http://www.software602.com/

80

Ganoderma boninense. Extraction using organic solvents showed that this compound has inhibitory activity against G. boninense in fraction of ethyl acetate which means that this compound is semi-polar. Results of analysis using Liquid Chromatography - Mass Spectrometer (LC-MS) showed that the active compound has a molecular weight of 255.39. Spectroscopy analysis by 1H-NMR showed that the compounds having molecular formula of C12H17NO5, and postulated as of 2(4-aminophenoxy)-6-methyl-tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol. The compound of tetrahydro pyran have been known to have an activity as an antifungal. Keywords: mycorrhizal symbiotic bacteria, active substances, extraction, substances identification

Pendahuluan Beberapa bakteri endosimbiotik mikoriza memiliki potensi sebagai antagonis terhadap patogen tular tanah akan tetapi bekerja sinergis dengan FMA. Potensi ini perlu dieksplorasi lebih lanjut untuk mendapatkan informasi tentang pengaruh bakteri endosimbiotik mikoriza yang berasosiasi dengan FMA terhadap pertumbuhan dan kesehatan tanaman yang difasilitasi oleh FMA. Di daerah mikorizosfir ditemukan berbagai bakteri bermanfaat yang dapat menghasilkan substrat atau senyawa yang bekerja sinergis dengan FMA. Sebagai contoh perkecambahan spora FMA meningkat dengan adanya bahan yang mudah menguap yang dihasilkan oleh aktinomisetes (Azcon 1987). Bakteri pengikat nitrogen (N) di daerah rizosfir juga menguntungkan bagi perkembangan fungi mikoriza yang menyumbangkan asam amino dan ammonium kepada fungi mikoriza (Li & Hung 1987). Beberapa mikroorganisme di daerah mikorizosfir membantu melemahkan akar sehingga memudahkan penetrasi akar oleh Fungi Mikoriza Arbuskular. Hal ini dibuktikan oleh hasil Azcon-Aguillar & Barea (1985) dimana infeksi Trifolium parviflorum oleh FMA distimulasi oleh strain Pseudomonas sp, yang melepaskan enzim selulolitik dan pektinolitik, sehingga memudahkan FMA untuk melakukan penetrasi dengan memisahkan sel sebelah luar dari korteks akar. Penelitian lain yang dilakukan oleh Barea et al. (1998) menemukan strain Pseudomonas, yang dapat menstimulasi perkembangan miselium dari perkecambahan spora Glomus mosseae di dalam tanah dan sekaligus mengkolonisasi akar.


81

Beberapa isolat bakteri Pseudomonas fluorescens yang diisolasi dari rizosfir digolongkan sebagai Plant Growth Promoting Bacteria (PGPB) dan Plant Health Promoting Bacteria (PHPB) karena kemampuan bakteri tersebut membantu perkecambahan benih dan menghambat perkembangan fitopatogenik mikroorganisme, seperti melindungi tanaman mentimun dari serangan fungi patogen Phytium spp dan melindungi tanaman kacang dari Phytium ultimum (Luna-Romero et al. 2007). Selanjutnya bakteri ini dipertimbangkan sebagai biofungisida yang potensial karena kemampuannya dalam melindungi tanaman dari fitopatogen. Penekanan

pertumbuhan

patogen

oleh

mikroorganisme

antagonis

melibatkan satu atau beberapa mekanisme tergantung dari mikrooorganisme antagonis yang terlibat. Pengaruh langsung terhadap patogen termasuk di antaranya kompetisi dengan patogen untuk mengkolonisasi atau menginfeksi akar, kompetisi mendapatkan sumber karbon dan nitrogen sebagai hara, kompetisi untuk besi (Fe) melalui produksi senyawa pengkelat Fe atau siderofor, penghambatan pertumbuhan patogen dengan senyawa antimikroba seperti antibiotik dan HCN dan lain sebagainya (Barea et al 2005). Hasil isolasi dan seleksi bakteri endosimbiotik mikoriza pada percobaan sebelumnya, diperoleh satu bakteri B10 yang memiliki aktivitas tinggi dalam menghambat pertumbuhan G. boninense. Hasil identifikasi dengan 16S rDNA menunjukkan bahwa bakteri tersebut adalah Bacillus subtilis B10. Bacillus spp merupakan bakteri yang sangat umum terdapat di tanah yang memilliki potensi sangat besar sebagai agen biokontrol karena menghasilkan antibiotik lipopeptida siklik yang aktif terhadap berbagai mikroorganisme. Senyawa antifungi yang telah berhasil diidentifikasi adalah iturin dan golongan bacillomycin yang dihasilkan oleh B. subtilis dan fusaricidin yang dihasilkan oleh Paenibacillus polymyxa (dahulu dikenal dengan Bacillus polymyxa) (Beatty & Jensen 2002). Menurut Xiang et al. (2008) interaksi antara B. subtilis JA dan fungi patogen tanaman Botrytis cinerea menghasilkan senyawa mudah menguap yang dihasilkan oleh B. subtilis JA, dimana senyawa tersebut merupakan inhibitor dengan spektrum luas yang bermanfaat sebagai biokontrol fungi patogen. Analisis komponen senyawa mudah menguap dari B. subtilis JA dengan GC/MS menunjukkan bahwa lebih


82

dari 14 komponen senyawa mudah menguap berhasil diekstrak, termasuk heksanol, pyrazine, ketone, benzene, fenol, aldehid dan alkana alifatik. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa aktif yang dihasilkan oleh bakteri endosimbiotik mikoriza B. subtilis B10 yang memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan G. boninense secara in vitro dan juga meningkatkan persentase berkecambah spora FMA Gigaspora margarita.

Bahan dan Metode Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Agromikrobiologi, Labaratorium Analitik dan Laboratorium Recovery Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Serpong dari bulan Oktober 2008 - Desember 2010. Bahan dan Alat yang Digunakan Bakteri endosimbiotik mikoriza yang digunakan adalah jenis bakteri yang memberikan hasil terbaik pada Penelitian 2, yaitu bakteri yang dapat meningkatkan persentase berkecambah spora FMA dan memiliki kemampuan sebagai antagonis terhadap G. boninense. Bahan-bahan yang dibutuhkan: media untuk fermentasi dengan kultur kocok, pelarut organik yang berbeda polaritasnya untuk ekstraksi senyawa aktif, aluminium silika gel 60 F254 (Merck). Alat yang digunakan adalah autoklaf, shaker, rotavapor, kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), LC-MS, ultrasonikasi, spektroskopi infra merah dan NMR. Pelaksanaan Percobaan Proses fermentasi bakteri endosimbiotik mikoriza terseleksi. Bakteri

endosimbiotik

mikoriza

terseleksi

Bacillus

subtilis

B10

diinokulasikan pada media cair nutrient broth dalam erlenmeyer 100 mL yang diisi 50 mL media cair. Kemudian diinkubasikan dalam shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm selama 8 jam pada suhu 28 oC (kultur vegetatif). Tahap berikutnya

inokulasi

kultur

fermentatif

yang

dibuat

dengan

cara

menginokulasikan 50 mL kultur vegetatif ke dalam media cair nutrient broth


83

dalam erlenmeyer 2000 mL yang diisi 1000 mL media cair (5 % V/V). Kultur fermentatif diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm selama 14 jam pada suhu 28 oC. Ekstraksi senyawa metabolit sekunder dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10. Ekstraksi senyawa metabolit sekunder dari bakteri dilakukan dengan metode yang dikembangkan oleh Harborne (1987). Sampel hasil fermentasi disentrifuse pada 3000 rpm selama 20 menit, supernatan dan pelet yang terbentuk dipisahkan. Supernatan (ekstra sel) kemudian diekstraksi secara bertingkat dengan n-heksan, etil asetat dan butanol. Ketiga fraksi tersebut (n-heksan, etil asetat dan butanol) dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 30 oC, kemudian ekstrak yang diperoleh ditimbang. Sementara untuk pelet dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali, tambahkan kembali akuades steril ke dalam pelet dengan perbandingan 1 : 5 kemudian sel dilisis dengan menggunakan ultrasonicator selama 60 menit. Pelet yang sudah dilisis disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan dan debris sel dipisahkan. Supernatan hasil pellet (intra sel) diekstrak secara bertingkat dengan n-Heksan etil asetat dan butanol. Ketiga fraksi tersebut (n-heksan, etil asetat dan butanol) ditampung dan dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 30 oC. Ekstrak yang diperoleh kemudian ditimbang untuk dilakukan pengujian aktivitas senyawa aktif terhadap pertumbuhan G. boninense. Uji aktivitas senyawa aktif terhadap fungi Ganoderma boninense. Uji antagonis anti fungi dilakukan dengan cara sebagai berikut: fungi patogen Ganoderma boninense ditumbuhkan dalam media agar PDA yang diletakkan pada bagian tengah sisi kanan media. Sampel senyawa aktif disiapkan dengan melarutkan sampel dalam DMSO (Dimetil Sulfoksida) dengan variasi konsentrasi 5000 ppm, 10000 ppm dan 15000 ppm. Sebanyak 20 μL sampel diteteskan pada kertas cakram 8 mm, kemudian dimasukkan ke dalam cawan Petri yang telah ditumbuhkan fungi G. boninense di bagian tengah media sisi kiri media agar PDA (posisi senyawa aktif berseberangan dengan posisi inokulum G. boninense). Setiap sampel dibuat 3 kali ulangan, dimana dalam satu Petri berisi 3


84

kertas cakram, yaitu kontrol positif (+), kontrol negatif (-) dan sampel senyawa aktif. Kontrol (+) yang dipakai adalah nystatin yang dibuat konsentrasi sesuai sampel (5000, 10000 dan 15000 ppm). Sementara untuk kontrol

(-) adalah

DMSO (dimetil sulfoksida). Cawan Petri yang telah berisi sampel uji diinkubasi pada suhu 28

o

C selama 7 – 14 hari sampai terlihat pertumbuhan atau adanya

lingkaran bening di sekitar kertas cakram 8 mm. Lingkaran bening tersebut merupakan tanda adanya senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh bakteri endosimbiotik mikoriza B10 (B. Subtilis B10) yang menghambat pertumbuhan fungi patogen G. boninense. Pemisahan senyawa bioaktif dengan kromatografi kolom. Pemisahan senyawa bioaktif dilakukan dengan kromatografi kolom Sep– Pak Cartridges C–18. Sebanyak 10 mg sampel dilarutkan dalam 1 mL methanol for HPLC. Kolom Sep–Pak C-18 yang akan digunakan terlebih dahulu dielusi dengan acetonitril 10 % sebanyak 20 mL. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam kolom secara perlahan, setelah sampel terlihat masuk kedalam kolom, elusi kembali dengan acetonitril secara bertingkat yaitu dengan acetonitril 10 % 20 mL, sebelum kolom kering elusi kembali dengan 20 mL acetonitril 20 %, acetonitril 40 %, acetonitril 80 % dan acetonitril 100%. Proses pemisahan kolom ini dilakukan dengan vakum basah dan kolom selalu dielusi dengan acetonitril dan tidak boleh dibiarkan kering. Hasil elusi kelima fraksi tersebut (acetonitril 10 %, 20 %, 40 %, 80 % dan 100 %) ditampung dan dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 30 oC, kemudian setiap ekstrak yang diperoleh ditimbang. Kelima fraksi yang ditampung tersebut kemudian diuji aktivitas penghambatannya terhadap pertumbuhan G. boninense. Identifikasi senyawa bioaktif dengan HPLC. Identifikasi senyawa bioaktif dilakukan dengan metode Reverse Phase kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), menggunakan instrumen HPLC Water 2695, dengan detektor Photodiode Detector Array (PDA), kolom C18 Puresil (5; 4,6 x 150 mm) volume injeksi 100 uL/injeksi dengan kecepatan alir 1 mL/menit, tekanan kolom 1267 psi. Sampel dielusi secara gradien menggunakan campuran


85

asetonitril dan air dari konsentrasi 15 % sampai 100 % selama 33 menit. Puncak (peak) yang diduga sebagai senyawa aktif ditampung, kemudian dipekatkan dengan pengurangan

tekanan. Senyawa pekat diuji aktivitasnya untuk

menghambat pertumbuhan G. boninense. Elusidasi struktur kimia senyawa aktif. Bobot molekul dan rumus molekul senyawa aktif ditentukan dengan Spectrum LC-MS (ESI positif ion). Gugus fungsional senyawa ditentukan dengan FTIR (Shimadzu 8300) dan struktur molekul senyawa ditentukan dengan, 1HNMR (Bruker AV-500 (500 MHz), HMBC NMR serta HMQC NMR.

Hasil dan Pembahasan Hasil Bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 yang digunakan dalam penelitian merupakan bakteri yang terbukti memiliki kemampuan mempercepat perkecambahan spora fungi mikoriza arbuskular dan menghambat pertumbuhan fungi patogen G. boninense dari hasil penelitian sebelumnya. Hasil identifikasi bakteri tersebut secara morfologi, bakteri tersebut termasuk golongan bakteri Gam positif, berbentuk batang dan merupakan jenis Bacillus subtilis (Gambar 6).

Gambar 6 Morfologi sel bakteri Bacillus subtilis B10 pada perbesaran 100x


86

Senyawa aktif yang terdapat dalam ekstrak kasar dipisahkan dengan kromatografi

kolom

menggunakan

silika

gel

60.

Untuk

mengetahui

bioaktivitasnya, masing-masing fraksi ditampung dan diuji aktivitasnya terhadap pertumbuhan fungi patogen G. boninense dan

kemampuannya meningkatkan

persentase berkecambah spora FMA. Hasil uji bioaktivitas masing-masing fraksi terhadap pertumbuhan patogen G. boninense disajikan dalam Tabel 7, sedangkan aktivitas terhadap peningkatan persentase berkecambah spora FMA Gigaspora margarita disajikan pada Tabel 8.

Tabel 7 Rata-rata luas zona bening yang terbentuk sebagai aktivitas antagonis senyawa aktif Bacillus subtilis B10 pada masing-masing fraksi pelarut dan kontrol positif nystatin terhadap G. boninense

Fraksi Sampel Kontrol (+) nystatin

Fraksi n-hexane/Ekstra-sel

Fraksi Etil Asetat/Ekstra-sel

Fraksi Butanol/Ekstra-sel

Fraksi Etil Asetat/Intra-sel

Fraksi Butanol/Intra-sel

Konsentrasi Sampel (ppm) 5000 10000 15000 5000 10000 15000 5000 10000 15000 5000 10000 15000 5000 10000 15000 5000 10000 15000

2

Rata2 Luas Zona Bening (cm ) Hari ke 4

Hari ke 7

Hari ke 12

0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1.73 2.09 2.35 0.00 0.00 0.00

9.13 10.50 11.92 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 10.11 10.43 11.02 0.00 0.00 0.00

1.05 2.06 4.03 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 10.25 10.61 11.88 0.00 0.00 0.00

Hasil uji bioaktivitas terhadap G. boninense menunjukkan bahwa fraksi etil asetat intra sel hasil kromatografi kolom mempunyai aktivitas yang lebih besar sedangkan pada fraksi n-heksan dan butanol baik ekstra sel maupun intra sel tidak menunjukkan bioaktivitas sama sekali. Hasil ini mengkonfirmasi bahwa


87

pemisahan senyawa aktif berhasil dilakukan dan menunjukkan bahwa senyawa aktif bersifat semi polar. Dari Tabel 7 juga terlihat bahwa fraksi etil asetat pada hari ketujuh memiliki bioaktivitas yang hampir sama dengan kontrol positif nystatin (biofungisida yang beredar di pasaran). Akan tetapi pada hari keduabelas bioaktivitas senyawa aktif fraksi etil asetat jauh lebih tinggi dibandingkan bioaktivitas antifungi nystatin, sehingga dapat disimpulkan bahwa bioaktivitas fraksi etil asetat intra sel dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 jauh lebih unggul dibandingkan dengan antifungi yang beredar di pasaran, sehingga berpotensi untuk digunakan sebagai pengendali G. boninense.

Tabel 8 Rata-rata panjang hifa pada hari kelima sebagai aktivitas senyawa aktif Bacillus subtilis B10 pada masing-masing fraksi dalam meningkatkan persentase berkecambah spora FMA Gigaspora margarita Fraksi Sampel

Konsentrasi Senyawa Aktif (ppm)

Kontrol (tanpa inokulasi) Fraksi n-heksan/Ekstra-sel

Fraksi Etil Asetat/Ekstra-sel

Fraksi Butanol/Ekstra-sel

Fraksi Etil Asetat/Intra-sel

Fraksi Butanol/Intra-sel

5000 10000 15000 5000 10000 15000 5000 10000 15000 5000 10000 15000 5000 10000 15000

Rata2 Panjang Hifa (µm) 56,19 0.00 0.00 0.00 20,38 47,94 408,37 50,20 99,30 214,36 48,56 155,83 155,30 23,64 63,52 92,68

Kemampuan senyawa aktif dari bakteri B. subtilis B10 dalam meningkatkan persentase berkecambah spora FMA Gigaspora margarita, muncul pada fraksi etil asetat yang artinya senyawa tersebut bersifat semi polar dan dikeluarkan secara ekstra seluler. Panjang hifa rata-rata pada fraksi tersebut adalah 408,37 µm, yang jauh lebih panjang dibandingkan dengan kontrol yang hanya 56,19 µm. Hal ini berbeda dengan kemampuan senyawa tersebut dalam


88

menghambat pertumbuhan patogen G. boninense yang dihasilkan secara intra seluler. Hasil uji setara aktivitas senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 dari fraksi etil asetat dapat dilihat pada Tabel 9. Tabel 9 Uji setara aktivitas senyawa aktif pada beberapa konsentrasi dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 terhadap pertumbuhan G. boninense dengan kontrol (+) antifungi nystatin

Perlakuan

Nystatin (Kontrol positif)

Senyawa aktif bakteri B. subtilis B10

Konsentrasi (ppm)

Rata-rata Luas zona bening pada (cm2) Hari ke 0

Hari ke 4

Hari ke 10

Hari ke 14

Hari ke 18

Hari ke 22

5000

0,00

0,00

9,38

4,15

0,59

0,00

10000

0,00

0,00

11,50

7,30

3,58

1,43

15000

0,00

0,00

12,14

10,52

5,91

3,82

5000

0,00

0,00

16,12

15,90

15,90

15,90

10000

0,00

0,00

17,62

17,37

17,37

17,37

15000

0,00

0,00

17,88

17,88

17,88

17,88

Pada Tabel 9 terlihat bahwa pada hari keempat baik senyawa aktif maupun kontrol (+) nystatin dengan tiga tingkat konsentrasi belum menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap G. boninense. Akan tetapi pada hari kesepuluh terlihat adanya penghambatan pertumbuhan G. boninense. Kekuatan penghambatan terhadap pertumbuhan G. boninense sangat tinggi pada perlakuan inokulasi senyawa aktif bakteri Bacillus subtilis B10, dimana pada konsentrasi terendah 5000 ppm memberikan luas zona bening mencapai 16,12 cm2, sementara kontrol (+) nystatin hanya 9,38 cm2. Hal yang sama juga terjadi pada konsentrasi yang lebih tinggi yaiu 10000 ppm dan 15000 ppm, dimana luas zona bening yang terbentuk pada perlakuan senyawa aktif bakteri B. subtilis B10 mencapai 17,62 dan 17,88 cm2 secara berurutan. Hal yang menarik dari hasil penelitian ini adalah, aktivitas nystatin sebagai kontrol (+) terhadap pertumbuhan fungi G. boninense mulai menurun pada hari ke 14 pada semua variasi konsentrasi bahkan pada konsentrasi 5000 ppm di hari ke 22, aktivitas nystatin sudah tidak ada (0,00 cm2).


89

Sebaliknya, aktivitas senyawa aktif bakteri B. subtilis B10 tetap stabil sampai hari ke 22 baik pada konsentrasi 5000 ppm maupun pada konsentrasi 10000 ppm dan 15000 ppm. Ini berarti senyawa aktif bakteri B. subtilis B10 memiliki aktivitas daya hambat yang lebih tinggi terhadap pertumbuhan fungi G. boninense. Luas zona bening yang terbentuk sebagai aktivitas dari senyawa aktif dan control (+) nystatin terhadap G. boninense pada hari keempat (A) dan hari keempatbelas (B) dapat dilihat pada Gambar 7. Dari Gambar 7 tampak bahwa pada hari keempat bioaktivitas dari senyawa aktif maupun nystatin sebagai kontrol (+) belum menunjukkan adanya penghambatan terhadap G. boninense. Akan tetapi pada hari keempat belas luas zona bening yang dibentuk oleh senyawa aktif jauh lebih besar dibandingkan dengan kontrol (+) nystatin.

A

A

B

B

Gambar 7 Uji setara aktivitas senyawa aktif dari bakteri Bacillus subtilis B10 terhadap pertumbuhan G. boninense in vitro hari keempat (A) dan hari keduabelas (B). Senyawa aktif dari bakteri B10 memiliki daya hambat yang lebih besar dibandingkan nystatin (kontrol positif). Dari hasil uji setara aktivitas senyawa aktif bakteri B. subtilis B10 in vitro, selain mampu menghambat pertumbuhan G. boninense, senyawa aktif tersebut


90

juga memiliki kemampuan menyebabkan nekrotik pada miselia G. boninense yang ditunjukkan dengan adanya warna coklat tua pada miselia yang berdekatan dengan senyawa aktif (Gambar 8). Hal yang sama tidak terjadi pada fungisida nystatin sebagai kontrol positif, sehingga dapat dikatakan bahwa senyawa aktif tersebut memiliki kemampuan untuk mematikan jaringan miselia G. boninense. Hal yang menarik adalah ketika ekstrak senyawa aktif diuji aktivitasnya terhadap pertumbuhan G. boninense, sel bakteri B. subtilis B10 masih dapat tumbuh di media PDA, walaupun ekstrak senyawa aktif tersebut sudah dimurnikan dengan pelarut

organik

dan

dilakukan

ultrasonikasi

selama

satu

jam

untuk

menghancurkan sel bakterinya pada saat proses ekstraksi.

Gambar 8 Miselia fungi patogen G. boninense terlihat berwarna coklat (tanda panah) akibat mengalami nekrotik oleh aktivitas senyawa aktif dari bakteri B. subtilis B10 Analisis pendahuluan senyawa dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT), kemudian diidentifikasi lebih lanjut menggunakan spektrometer LC-MS, spektroskopi 1H-NMR, HMBC NMR dan HMQC NMR. Data LC-MS digunakan untuk mengetahui kemurnian serta bobot molekul suatu senyawa. Spektrum 1HNMR untuk menentukan jumlah dan posisi proton dalam senyawa. Analisis HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) dan HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) NMR dilakukan untuk melihat ikatan kopling (penggandengan) antara H dan C. Analisis LC-MS Hasil analisis menggunakan LC-MS terhadap ekstrak dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 menunjukkan adanya satu puncak


91

dominan, dengan waktu retensi 1,6 menit (T 1.6) dan luas area 335.77 merupakan produk hasil pemurnian kolom (Gambar 9). Dari hasil analisis menggunakan LCMS diketahui bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat B10 memiliki bobot molekul sebesar 255,39 g/mol dimana LC-MS m/z (M+H)+ ditunjukkan sebesar 256,39 m/z (Gambar 10). Kemurnian produk dihitung dengan luas area produk dengan luas total area pada kromatogram dan diperoleh kemurnian produk 83,70 %. BPI=>NR(2.00)

T1.6

100

168.4

90

% Intensity

80

70

T2.0

60

50

0

T2.6

T3.3

2

4

6

8

10

Retention Time (Min)

Gambar 9 Kromatogram senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 dengan LC-MS

Data yang diperoleh dari pengukuran LC-MS ini memperlihatkan spektrum massa berupa ion positif dan molekul garam Na nya. Perhitungan bobot molekul dapat dilihat pada Tabel 9. Tabel 10 Perhitungan bobot molekul senyawa aktif Bacillus subtilis B10 Ion molekul (m/z)

Bobot molekul

255.39 (M)

255.39

256.39 (M + H)+

255.39 + 1 = 256.39

279.39 (M + H)+ Na

256.39 + 23 = 279.39


92

Mariner Spec /31:32 (T /1.51:1.56) -25:27 (T -1.51:1.56) ASC=>NR(2.00)=>CT[BP = 256.4, 921]

256.39

100

920.7

(M+H)+

90 80 70

% Intensity

60 50 40 30 20

(M+H)+Na

257.39

10 0 252.0

257.06 258.8

260.14

279.04 265.6

272.4

279.2

0 286.0

Mass (m/z)

Gambar 10 Spektra spektroskopi massa senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10

Spektrometri Inframerah (FTIR) Hasil analisis gugus fungsional menggunakan spektroskopi IR pada daerah 4000  500 cm-1 memberikan serapan tajam yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi dari senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 (Gambar 11).

Gambar 11 Spektrum FT IR senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10


93

Serapan melebar pada bilangan gelombang () 3498,87 dan 2821,86 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi O–H. Ikatan hidrogen menyebabkan puncak melebar dan terjadi pergeseran ke arah bilangan gelombang yang lebih kecil. Vibrasi O–H bend muncul pada daerah 1415,75 dan 761,88 cm-1. Vibrasi C–H stretch muncul pada daerah 2931,80 cm-1. Adanya gugus amida didukung oleh pita serapan medium pada daerah 3437,15 dan 1670,35 cm-1. Serapan tajam pada puncak 1444,08 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi C = C (ring stretch). Serapan tajam pada puncak 900 - 675 cm-1 menunjukkan adanya gugus aromatik yang diperkuat dengan serapan tajam pada puncak 2931,80 ; 856,39 dan 761,88 cm-1. Serapan medium pada puncak 1001,06 cm-1 menunjukkan adanya gugus C–0–C stretch. Pita serapan pada  = 1236,37 cm-1 merupakan vibrasi ulur C–O (Silverstein et al. 1991). Dari analisis spektrum IR terlihat bahwa senyawa aktif Bacillus subtilis B10 memiliki gugus OH, cincin C-siklik mengandung O dan amida dengan pita serapan seperti yang disajikan pada Tabel 11.

Tabel 11 Hasil identifikasi gugus fungsi spektrum inframerah senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 No

Bilangan Gelombang (cm-1)

Jenis Vibrasi

1.

3800 - 2700

O–H

2.

2931, 80

C – H stretch, CH2 (Methylene)

3.

761

C – H Bend, CH2 (Methylene)

4.

1200 - 800

C – C strech

5.

1420 – 1330 769 – 650

O – H Bend

6.

1444,08

C = C ring stretch

7.

1260 - 1000

C – O stretch

8.

1001,06

C – O – C stretch

3437,15

N – H stretch

1670,35

N – H Bend

900 - 675

Poly aromatic

9. 10.


94

Spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Pengukuran senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 spektrum 1H-NMR dengan menggunakan NMR 500 MHz, dengan pelarut metanol-D3 dapat dilihat pada Gambar 12.

Gambar 12 Spektra 1H-NMR senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 Berdasarkan hasil pengukuran 1H-NMR menunjukkan 2 pasang proton aromatik, pada nilai geseran kimia (H) 7,38 (2H, dd, J = 7,45 dan 1,7 Hz) dan 5,59 (2H, dd, 7,38; 1,7 Hz), yang posisinya simetris pada cincin benzene tersebut. Disamping itu adanya beberapa gugus oksin metin dari suatu gugus gula pada H 3 – 5 serta adanya

gugus

metil pada H 1,31 (d, 7,45 Hz) yang berarti

menunjukan adanya gugus rhamnosida, seperti diilustrasikan pada Gambar 13. 1,31 (d, 7,45 Hz) O

7,38 (dd) H

H

3,85 (m)

4,99 (d)

3,47 (t) H

H

5,59 (dd)

HO

OH

3,95 9dd) OH

3,53 (dd) OH

(a)

(b)

Gambar 13 Posisi proton aromatik pada nilai geseran kimia (a) dan posisi gugus rhamnosida pada postulat struktur senyawa aktif (b)


95

Namun berdasarkan hasil pengukuran LC-MS menunjukkan adanya puncak molekular ion (M+H)+ = 256,39 yang berarti bahwa bobot molekul (BM) senyawa tersebut adalah 255,39. Oleh karena bobot molekul tersebut merupakan bilangan ganjil, maka diduga kuat senyawa tersebut mengandung atom N dalam bentuk gugus amina (NH2). Berdasarkan hasil dari kedua struktur pada Gambar 13 tersebut di atas (a dan b), rumus molekul senyawa tersebut adalah C12H17NO5. Hal tersebut juga didukung dengan perkiraan nilai geseran kimia 1H hasil prediksi, dimana menunjukkan adanya kemiripan nilai geseran kimia, seperti yang disajikan pada Gambar 14.

1.18

O

5.88

6.66

3.85 3.40 4.81 HO

3.91 3.49

17.0

6.74

O

O

73.7 6.66

147.4

115.4

70.5

6.74

OH 4.81

98.5

115.2

O

NH2 5.32

HO

73.4 70.5

140.0

115.2

OH

115.4

NH 2

OH

OH

Gambar 14 Kemiripan nilai geseran kimia 1H senyawa aktif hasil prediksi

Namun demikian berdasarkan hasil penelusuran data base pada http//: www.chemspider.com

dengan memasukkan data rumus molekul C12H17NO5,

ternyata diketemukan adanya kemiripan struktur namun berbeda dalam hal posisi molekul rhamnosidanya tidak berikatan dengan atom O2 melainkan berikatan dengan gugus amina. Senyawa tersebut diberi nama 2-(4-aminophenoxy)-6methyl-tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol. Selanjutnya, berdasarkan dari data analisis LC-MS, FTIR, NMR dan bank data senyawa kimia sebagai referensi, dan diperkuat oleh aktivitas antifungi yang mengindikasikan gugus aktifnya suatu fenol dibandingkan amina primer, maka dipostulasikan struktur molekul senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 seperti yang disajikan pada Gambar 15.


96 H3C

O 6

2 4

3

5

HO

O

1

4

OH

NH2

OH

2-(4-aminophenoxy)-6-methyl-tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol Gambar 15 Postulasi struktur kimia senyawa aktif dari bakteri Bacillus subtilis B10 Pembahasan Pemanfaatan mikroba antagonistik sebagai biokontrol berkembang sangat pesat. Beberapa bakteri diketahui menghasilkan senyawa aktif yang bersifat antagonis terhadap patogen sehingga berpotensi untuk dimanfaatkan sebagai agen biokontrol. Pada penelitian ini, bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10

menghasilkan

senyawa

aktif

aromatik

dengan

struktur

molekul

dipostulasikan 2-(4-aminophenoxy)-6-methyl-tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol. Senyawa aktif tersebut memiliki daya hambat yang sangat tinggi terhadap pertumbuhan fungi patogen G. boninense penyebab penyakit busuk pangkal batang pada kelapa sawit serta meningkatkan persentase berkecambah spora FMA. Kemampuan menghambat pertumbuhan G. boninense ini jauh lebih kuat dibandingkan dengan fungisida nystatin yang umum digunakan sebagai antifungi. Disamping itu, senyawa aktif tersebut ternyata juga memiliki kemampuan mematikan atau menyebabkan nekrotik jaringan miselia patogen G. boninense. Mekanisme senyawa aktif tersebut dalam meningkatkan persentase berkecambah spora FMA Gigaspora margarita, dimungkinkan dengan menipisnya dinding sel spora FMA oleh senyawa tersebut, sehingga mempercepat proses berkecambah dari spora FMA. Sementara mekanisme senyawa aktif tersebut dalam menghambat pertumbuhan patogen G. boninense diduga dengan adanya tetrahydro pyran di dalam struktur senyawa tersebut, yang dikenal fungsinya sebagai antifungi, sehingga senyawa aktif dari bakteri B. subtilis B10 tersebut


97

mampu menghambat pertumbuhan G. boninense in vitro, yang terlihat dengan adanya jaringan miselia G. boninense yang mengalami nekrotik. Beberapa senyawa antifungi yang disintesis oleh bakteri golongan Bacillus sp sangat aktif terhadap fungi patogen berfilamen dan yeast (Bottone & Peluso 2003). Dari beberapa hasil penelitian disebutkan bahwa kelompok senyawa tetrahydropyran seperti yang ditemukan pada senyawa aktif dari B. subtilis B10, memiliki kemampuan sebagai antifungi. Seperti yang dilaporkan oleh Masuda et al. (2010), senyawa morinol B yang merupakan derivatif senyawa tetrahydropyran sesquilignan memiliki sifat antifungi terhadap patogen Alternaria alterata dan diduga kerjanya dengan mempengaruhi karakteristik enzim dan jalur metabolik dari patogen A. Alterata. Ahanjan et al. (2009) yang melakukan ekstraksi senyawa 6-(ethoxymethyl)-tetrahydro-2H-pyran-2,3,4,5-tetraol dari daun Parrotia persica, menyimpulkan bahwa senyawa aktif tersebut memiliki kemampuan sebagai antifungi terhadap patogen Fusarium oxysporum dan Candida albicans. Senyawa aktif yang dihasilkan oleh mikroba sebagai agen biokontrol dapat berupa antibiotik (Kadir et al. 2008); protein (Brigitte et al. 2008; Abdel Azeiz et al. 2009), siderofor (Schneider et al. 2007) maupun antifungi (Riedlinger et al. 2006).

Kadir et al. (2008) menemukan bakteri Burkholderia cepacia

menghasilkan senyawa antibiotik pyrrolnitrin yang bersifat antifungi terhadap patogen Colletotrichum gloeosporioides pada tanaman papaya. Sementara Riedlinger et al. (2006) menemukan mycorrhiza helper bacterium Streptomyces sp AcH 505 menghasilkan senyawa auzofuran yang bersifat antifungi terhadap patogen tanaman akan tetapi merupakan pemacu pertumbuhan fungi ektomikoriza Amanita muscaria. Selain senyawa antibiotik dan antifungi, mikroba antagonis juga menghasilkan senyawa glikoprotein seperti Bacillus psychrosaccharolyticus yang memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan patogen tanaman Sclerotium rolfsii (Abdel Aziz et al. 2009). Berdasarkan penelusuran pada beberapa website senyawa kimia bahan alam, postulat senyawa aktif hasil ekstraksi dari bakteri B. subtilis B10 belum ada di dalam daftar senyawa tersebut, sehingga berpeluang sebagai senyawa baru. Potensi yang sangat besar dari senyawa aktif tersebut dalam menghambat pertumbuhan patogen G. boninense serta peluangnya sebagai senyawa baru untuk


98

kategori kimia bahan alam, merupakan noveltis atau temuan yang sangat penting artinya. Diharapkan temuan ini akan bermanfaat bagi praktisi perkebunan kelapa sawit untuk mengatasi permasalahan penyakit busuk pangkal batang yang disebabkan oleh fungi patogen G. boninense. Temuan ini dapat dijadikan rekomendasi dalam budidaya kelapa sawit untuk meminimalkan kerugian yang ditimbulkan oleh patogen tersebut sehingga produktivitas kelapa sawit dapat ditingkatkan. Optimalisasi produksi senyawa aktif tersebut akan meningkatkan kemampuan senyawa tersebut sebagai agen pengendalian hayati terhadap G. boninense.

Simpulan Bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 menghasilkan senyawa aktif yang memiliki daya hambat yang sangat tinggi terhadap pertumbuhan G. boninense in vitro melebihi daya hambat antifungi nystatin yang umum digunakan serta memiliki kemampuan mematikan jaringan (nekrotik) miselia G. boninense. Senyawa yang dihasilkan oleh bakteri Bacillus subtilis B10 dihasilkan secara intra seluler dan bersifat semi polar. Hasil purifikasi dan identifikasi struktur molekul senyawa aktif dari bakteri Bacillus subtilis B10 menunjukkan bahwa senyawa aktif yang dihasilkan memiliki bobot molekul 255,39 g/mol dan rumus molekul C12H17NO5. Struktur molekul dari senyawa tersebut dipostulasikan sebagai 2-(4-aminophenoxy)-6-methyl-tetrahydro-2Hpyran-3,4,5-triol. Senyawa yang memiliki struktur tetrahydropyran termasuk kelompok senyawa yang memiliki aktivitas antifungi. Potensi yang sangat besar dari senyawa aktif tersebut dalam menghambat pertumbuhan patogen G. boninense serta peluangnya sebagai senyawa baru untuk kategori kimia bahan alam, merupakan noveltis atau temuan yang sangat penting dari penelitian ini.

Daftar Pustaka Azcon R. 1987. Germination and hyphal growth of Glomus mosseae in vitro: effects of rhizosphere bacteria and cell-free culture media. Soil. Biol. Biochem 19:417-419.


99

Azcon-Aguilar C, Barea JM. 1985. Effect of soil microorganisms on formation of vesicular-arbuscular mycorrhizas. Trans. Br. Mycol. Soc 84:536-537. Abdel Azeiz AZ, Shadi AI, Nassar AR, El-Saeyd SA. 2009. Australian Journal of Basic and Applied Sciences 3:2262-2269. Ahanjan M, Raghavendra MP, Raveesha KA. 2009. A novel antifungal phenolic compound from Parrotia persica. African Journal of Biochemistry Research 3:174-180. Barea JM et al. 1998. Impact on arbuscular mycorrhiza formation of Pseudomonas strains used as inoculants for the biocontrol of soil-borne plant fungal pathogens. Applied and Environmental Microbiology 64:2304-2307. Barea JM, Pozo MJ, Azcon R, Azcon-Aguilar C. 2005. Microbial co-operation in the rhizosphere. Journal of Experimental Botany 56:1761-1778. Beatty PH, Jensen SE. 2002. Paenibacillus polymyxa produces fusaricidin-type antifingal antibiotic active against Leptosphaeria maculan, the causative agent of blackleg disease of canola. Can. J. Microbiol. 48:159-169. Bottone EJ, Peluso RW. 2003. Production by Bacillus pumilus (MSH) of an antifungal compound that is active against Mucoraceae and Aspergillus species: preliminary report. Journal of Medical Microbiology 52:69-74. Brigitte K, Böhlendorf B, Reichenbach H, Höfle G. 2008. Pedein A and B: Production, Isolation, Structure Elucidation and Biological Properties of New Antifungal Cyclopeptides from Chondromyces pediculatus (Myxobacteria). The Journal of Antibiotics 61:18-26. Harborne. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. Penerbit ITB Bandung. Kadir J, Rahman MA, Mahmud TMM, Abdul Rahman R, Begum MM. 2008. Extraction of Antifungal Substances from Burkholderia cepacia with Antibiotic Activity against Colletotrichum gloeosporioides on Papaya (Carica papaya). Int. J. Agri. Biol. 10:15-20. Li CY, Hung LL. 1987. Nitrogen fixing (acetylene-reducing) bacteria associated with ectomycorrhizae of Douglas Fir. Plant Soil 98:425-428. Luna-Romero I, Carvajal M, Carrillo-Castańeda G, Flores C. 2007. Inhibitory compound of the soil bacteria Pseudomonas fluorescens against the fungus Aspergillus flavus L. Ecologia 24:20-31.


100

Masuda K, Nishiwaki H, Akiyama K, Yamauchi S, Maruyama M, Sugahara T, Kishida T. 2010. Antifungal activity of Morinol B derivatives of tetrahydropyran sesquilignan. Biosci. Biotechnol. Biochem 74:2071-2076. Riedlinger J, Schrey SD. Tarkka MT, Hampp R, Kapur M, Fiedler HP. 2006. Auxofuran, a novel metabolite that stimulates the growth of fly agaric, is produced by the mycorrhiza helper bacterium Streptomyces AcH 505. Appl. Environ. Microbiol. 72:3550-3557. Schneider K et al. 2007. Nocardichelins A and B, siderophores from Nocardia strain Acta 3026. J. Nat. Prod. 70:932-935. Silverstein RM, Bassler GC, Morrill TC. 1991. Spectrometric Identification of Organic Compounds 5th edition. Toronto-Canada :John Wiley & Sons. Xiang X, Hao C, Hua C, Jun W, Chong R, Lijun W. 2008. Impact of Bacillus subtilis JA, a biocontrol strain of fungal plant pathogens, on arbuscular mycorrhiza formation in Zea mays. World J Microbiol Biotechnol 24:1133-1137.


IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF DARI BAKTERI ENDOSIMBIOTIK MIKORIZA Bacillus subtilis B10 YANG MENGHAMBAT PERTUMBUHAN PATOGEN Ganoderma boninense Pat

Recommend Documents