OPTIMASI PRODUKSI ENZIM MANANASE DARI BAKTERI LAUT Bacillus subtilis DENGAN SUBSTRAT BIOMASSA MANAN IRFAN PEBI NUGRAHA

OPTIMASI PRODUKSI ENZIM MANANASE DARI BAKTERI LAUT Bacillus subtilis DENGAN SUBSTRAT BIOMASSA MANAN

IRFAN PEBI NUGRAHA

DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

ii

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Optimasi Produksi Enzim Mananase dari Bakteri Laut Bacillus subtilis dengan Substrat Biomassa Manan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai oleh DIPA Biorefinary, Puslit Bioteknologi LIPI, tahun anggaran 2014. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Juni 2014

Irfan Pebi Nugraha NIM G84100064

* Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.

ABSTRAK IRFAN PEBI NUGRAHA. Optimasi Produksi Enzim Mananase dari Bakteri Laut Bacillus subtilis dengan Substrat Biomassa Manan. Dibimbing oleh EDY DJAUHARI PURWAKUSUMAH dan NANIK RAHMANI. Enzim mananase dapat diaplikasikan secara luas di dunia industri khususnya industri kertas, pakan, pangan, tekstil, detergen, ataupun farmasi. Proses produksi mananase dari Bacillus subtilis dipengaruhi oleh jenis substrat, konsentrasi substrat, pH media produksi, serta suhu fermentasi. Substrat manan murni tidak direkomendasikan untuk produksi karena harganya yang terlalu mahal. Tujuan penelitian ini adalah menentukan jenis substrat alternatif terbaik dari berbagai biomassa manan untuk optimasi produksi mananase dari Bacillus subtilis yang diisolasi dari Laut Bali. Berdasarkan penelitian ini, porang merupakan substrat alternatif terbaik untuk produksi mananase dari Bacillus subtilis dengan nilai aktivitas enzim sebesar 11.29 U/mL. Aktivitas mananase optimum 37,70 U/mL diperoleh dalam 24 jam fermentasi dengan konsentrasi substrat, pH dan suhu masing-masing 1%, pH 8 dan 50oC. Kata kunci: Bacillus subtilis, manan, mananase

ABSTRACT IRFAN PEBI NUGRAHA. Optimization Production of Mannanase from Marine Bacterium Bacillus subtilis with Mannan Biomass Subrate. Supervised by EDY DJAUHARI PURWAKUSUMAH and NANIK RAHMANI. Mananase can be applied widely in the industrial world, such as paper, feed, food, textiles, detergent, or pharmaceutical industries. Mannanase production process is influenced by the type of substrate, substrate concentration, pH of the media production and fermentation temperature. Mannan pure substrate is not recommended because it is too expensive. The aim of this research was to determine alternative substrates of various mannan biomass and the optimum conditions for production of mananase by Bacillus subtilis isolated from Bali sea. Based on this research, porang was the best alternative substrate for production of mananase by Bacillus subtilis with enzyme acitivities of 11.29 U/mL. The maksimum mannanase activity of 37.70 U/mL was achieved following 24 hours of fermentation when substrat concentration, pH and temperature were controlled at 1%, pH 8 and 50◦C respectively. Keyword: Bacillus subtilis, mannan, mannanase

iv

OPTIMASI PRODUKSI ENZIM MANANASE DARI BAKTERI LAUT Bacillus subtilis DENGAN SUBSTRAT BIOMASSA MANAN

IRFAN PEBI NUGRAHA

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

vi

PRAKATA Alhamdulillah. Terima kasih, terima kasih, terima kasih. Penulis menghaturkan segala puji bersanding syukur kepada Allah yang telah memberikan karunia-Nya untuk membantu menyelesaikan penulisan skripsi yang berjudul Optimasi Produksi Enzim Mananase dari Bakteri Laut Bacillus subtilis pada Biomassa Manan. Penelitian ini dilaksanakan mulai dari bulan November 2013 sampai dengan Juni 2014 di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Bidang Bioproses, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI Cibinong. Selesainya proses penelitian dan penulisan skripsi ini penulis hanya bisa mengucapkan banyak terima kasih kepada ibu Nanik rahmani M.Si. dan bapak Drs. Edy Djauhari Purwakusumah M.Si. atas segala arahan dan bimbingan selama penelitian ataupun penulisan skripsi ini. Penulis juga mengucapkan banyak terimakasih terutama bagi kedua orang tua penulis (Ibu dan Bapak) yang telah memberikan dukungan dan motivasi spiritual, kepada Lisnawati yang selalu membantu saya dan memotivasi dalam proses kegiatan penelitian dan penulisan. Terimakasih juga penulis ucapkan kepada bapak Dr. Yopi selaku kepala Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi (LBF) Puslit Bioteknologi LIPI. Tidak terkecuali kepada teman-teman di laboratorium (Yuli, Rony, Nadia, Fatia, Mona, Muti, Ajeng, Azizah, Gading, Wida, Kholis, Ari, dkk.), selain itu khususnya kepada Ibu Lia, Pak Diki dan untuk semua civitas LBF yang tidak bisa saya sebutkan namanya satu-persatu penulis mengucapkan terima kasih untuk semua bantuan yang pernah diberikan. Sekali lagi, terima kasih. Atas segala kekurangan dan ketidaksempurnaan baik dari segi isi ataupun cara penyampaian materi pada skripsi ini penulis memohon maaf, karena penulis menyadari bahwa tulisan ini dibuat sebatas pengetahuan dan pemikiran penulis yang masih dalam tahap pembelajaran. Terakhir, penulis berharap bahwa barisan kata-kata yang terangkai dalam skripsi ini bisa bermanfaat bagi siapapun yang membacanya. Bogor, Juni 2014

Irfan Pebi Nugraha

viii

DAFTAR ISI

DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN METODE Bahan dan Alat Metode Penelitian HASIL PEMBAHASAN SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP

viii viii 1 2 2 3 6 9 13 13 13 13 16 32

DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Hasil peremajaan Bacillus subtilis pada media LBG 0.5% Hasil analisis pertumbuhan sel pada berbagai biomassa manan Hasil analisis aktivitas mananase pada berbagai biomassa manan Hasil analisis pertumbuhan sel pada konsentrasi substrat porang Hasil analisis aktivitas mananase pada konsentrasi substrat porang Hasil analisis pertumbuhan sel pada berbagai kondisi pH Hasil analisis aktivitas mananase pada berbagai kondisi pH Hasil analisis pertumbuhan sel berbagai variasi suhu Hasil analisis aktivitas mananase berbagai variasi suhu

6 6 7 7 7 8 8 9 9

DAFTAR LAMPIRAN 1 Alur penelitian 2 Kurva standar D-(+)-Manosa 3 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada berbagai jenis biomassa 4 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada berbagai konsentrasi porang 5 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada ragam pH media produksi 6 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada ragam suhu produksi 7 Contoh perhitungan aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis laut menggunakan substrat porang 0.5% pada jam ke-0 ulangan 1 8 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm kultur bakteri laut Bacillus subtilis pada berbagai substrat biomassa 9 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm kultur bakteri laut Bacillus subtilis pada berbagai konsentrasi substrat porang 10 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm kultur bakteri laut Bacillus subtilis pada beragam pH media produksi 11 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm kultur bakteri laut Bacillus subtilis pada beragam suhu produksi

18 19 20 22 24 26 28 29 30 31 32

x

PENDAHULUAN Mananase merupakan enzim penghidrolisis kompleks polisakarida (manan) menjadi bentuk yang lebih sederhana seperti oligosakarida (mano-oligosakarida) dan monosakarida (manosa). Aplikasi mananase untuk saat ini sudah sangat luas terutama untuk bidang bioteknologi dan dunia industri. Hasil hidrolisis manan berupa mano-oligosakarida dapat dimanfaatkan sebagai bahan pangan fungsional pada industri pangan. Industri kertas memanfaatkan mananase dalam tahapan proses bleaching bahan baku kertas, yaitu untuk menggantikan fungsi hidrogen peroksida yang bermanfaat dalam proses ekstraksi lignin pada pulp. Industri kopi instan memerlukan mananase dalam proses pengeringan produk, yaitu untuk menurunkan tingkat viskositas ekstrak kopi dengan memecah kandungan manan pada biji kopi. Mananase juga dibutuhkan pada industri detergen sebagai penghilang kotoran pada pakaian yang terkena noda makanan yang mengandung manan, galaktomanan, guar gum yang biasanya digunakan untuk zat penstabil es krim, saus, gel rambut, dan pasta gigi. Aplikasi lain dari mananase yaitu pada dunia industri pakan ternak, untuk meningkatkan nilai kandungan nutrisi pakan (Dhawan dan Kaur 2007). Aplikasi enzim mananase yang cukup luas pada berbagai industri tersebut khususnya, memberikan peluang besar untuk memproduksi enzim pendegradasi manan ini dalam skala industri. Dalam proses produksi mananase dibutuhkan suatu sumber yang baik. Salah satu sumber penghasil mananase yang telah banyak diketahui selain hewan dan tumbuhan adalah bakteri (Dhawan dan Kaur 2007). Bakteri dengan kemampuan memproduksi enzim mananase dinamakan sebagai bakteri manolitik, yang dapat ditemukan pada ekosistem daratan ataupun daerah perairan. Penelitian ini difokuskan pada jenis mananase yang dihasilkan oleh bakteri manolitik laut. Pemilihan bakteri laut dikarenakan jenis bakteri dari perairan laut Indonesia belum banyak diteliti dan dikembangkan, selain itu pemilihan jenis bakteri laut juga didasarkan pada sifat dan karakteristik yang unik pada bakteri ataupun enzim yang dihasilkannya. Enzim yang diproduksi oleh mikroba laut memiliki karakter yang lebih stabil dan lebih aktif dibanding enzim sejenis yang bersumber dari hewan atau tumbuhan (Bull et al. 2000). Selain itu diketahui bahwa enzim yang berasal dari mikroba laut memiliki sifat unik yaitu toleran terhadap kadar garam tinggi serta tahan terhadap suhu dan tekanan tinggi serta bersifat adaptif terhadap suhu dingin (Tricone 2011). Bacillus subtilis yang berasal dari perairan pantai Sanur Bali dipilih sebagai sumber penghasil mananase pada penelitian ini. Kualitas produk (enzim) dari suatu fermentasi selain bergantung pada jenis mikrobanya juga dipengaruhi substrat pada media fermentasinya. Menurut Sumardi (2005) enzim mananase biasanya diproduksi dengan tambahan substrat manan murni seperti Locust bean gum (LBG) pada media produksinya. Harga substrat murni yang relatif mahal memunculkan peluang untuk memanfaatkan biomassa pertanian sebagai sumber karbon utama (substrat) dalam produksi enzim mananase. Di Indonesia berbagai jenis sumber manan banyak terdapat pada limbah perkebunan dan merupakan sumber biomasa yang masih belum banyak dimanfaatkan. Selama ini pemanfaatan biomasa mannan, terutama dari limbah bungkil kelapa sawit dan kopra, lebih ditujukan untuk pakan ternak dengan

2

tingkat efisiensi penyerapan yang rendah (Yopi et al. 2006). Biomassa pertanian diketahui memiliki kandungan hemiselulosa yang tinggi dan manan merupakan salah satu koponen penyusun hemiselulosa. Beberapa jenis biomassa yang digunakan sebagai substrat pada penelitian ini yaitu tepung umbi porang, bungkil kelapa sawit, tandan kosong kelapa sawit dan juga bagasse. Biomassa porang dijadikan sebagai kandidat substrat untuk produksi mananase karena umbi porang diketahui mengandung 30.56% glukomanan (Akbar et al. 2013). Sekitar 20-40% komposisi serat dari bungkil kelapa sawit adalah manan (Yopi et al. 2006). Hasil penelitian Samsuri et al. (2007) menyatakan bahwa kandungan lignoselulosa pada bagasse sekitar 52.7% selulosa, 20% hemiselulosa, dan 24.2% lignin. Sebagai hasil samping produksi minyak kelapa sawit, tandan kosong kelapa sawit mengadung 46.77% selulosa, 17.92% hemiselulosa, dan 4.15% lignin (Piarpuzan et al. 2011). Selain jenis substrat yang tepat, kondisi fermentasi juga perlu diperhatikan agar enzim yang didapat lebih optimum. Kondisi produksi mananase dari bakteri dapat dioptimalkan dengan memperhatikan beberapa faktor diantaranya konsentrasi substrat, pH media serta suhu ketika fermentasi (Sumardi 2005). Proses produksi enzim juga dipengaruhi oleh kondisi aerasi, volume media tumbuh mikroba, serta kecepatan agitasi pada proses fermentasinya (Dan et al. 2012). Tujuan penelitian ini adalah menentukan substrat biomassa mannan terbaik sebagai substrat alternatif untuk produksi enzim mananase dari bakteri laut Bacillus subtilis. Penelitian ini juga bertujuan menentukan kondisi optimum fermentasinya (konsentrasi substrat media, pH media kultur, suhu fermentasi). Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan November 2014 hingga bulan Juni 2014 di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Puslit Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Cibinong, Bogor.

METODE Bahan dan Alat Penelitian ini menggunakan bahan LBG (Locust bean gum), tepung porang, serbuk bagasse, serbuk tandan kosong kelapa sawit (TKKS), serbuk bungkil kelapa sawit (BKS), bakteri laut Bacillus subtilis dari Pantai Sanur, Bali, Artificial Sea Water (ASW), ekstrak khamir, bacto peptone, larutan bufer fosfat pH 6 0.05 M, larutan NaOH 2%, larutan HCl 10%, larutan DNS, larutan bufer standar pH 4, larutan bufer standar pH 7, larutan bufer standar pH 10, akuades, es, alkohol 96%, D-manosa, dan agar. Peralatan yang digunakan adalah spektrofotometer UV-VIS double beam Hitachi U-3900H, water bath Julabo TW20, shaker BioShaker BR-43FL, oven Memmert, autoklaf Tomy High Pressure Steam Sterillizer ES-315, inkubator, sentrifus Hitachi Micro Ultracentrifuge CS 150NX, laminar air flow Sanyo Bio Clean Bench MCV-B13, pH meter, ice maker, neraca analitik percisa 303A, cool box, pengaduk magnetik, vortex IKA MS 3 Basic, tabung reaksi, mikropipet 10– 1000 µL, eppendorf 1,5 mL, tips 10-1000 µL, Erlenmeyer 100 mL, 250 mL, dan

2

3

300 mL, gelas piala, botol scott, pipet tetes, sudip, cawan petri, ose, botol semprot, termometer, bunsen, gelas ukur, labu takar 10 mL, rak tabung, dan kuvet. Metode Penelitian Penelitian ini terbagi atas empat tahap utama yaitu seleksi substrat manan dari berbagai jenis biomassa, optimasi konsentrasi substrat terpilih, optimasi pH media produksi dan optimasi suhu fermentasi. Peremajaan Bakteri Laut Bacillus Subtilis (Yopi et al. 2006) Pembuatan Media Peremajaan. Komposisi media yang terdiri dari 3.8% (b/v) Artificial Sea Water (ASW), 0.5% (b/v) substrat Locust Bean Gum (LBG), 0.5% (b/v) agar, 0.1% (b/v) yeast extract dan 0.5% (b/v) bacto peptone dilarutkan dengan akuades, dihomogenkan dengan pengaduk magnetik kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 1 atm dengan suhu 121oC selama 15 menit. Media kemudian dituang ke dalam cawan petri secara aseptik dalam laminar air flow, dibiarkan dingin dan memadat. Peremajaan bakteri laut Bacillus subtilis. Bakteri dari stok secara aseptik digoreskan pada media padat dengan ose steril di dalam laminar air flow. Media yang telah ditanami bakteri diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu ruang. Sebelum melakukan penanaman, laminar tempat kerja disinari sinar UV terlebih dahulu selama 15 menit untuk membunuh mikroorganisme yang tidak diinginkan sehingga dapat menurunkan risiko kontaminasi sebelum penanaman. Seleksi Substrat Manan Alternatif dari Berbagai Jenis Biomassa Media cair untuk proses produksi dibuat dua bagian yaitu untuk proses prekultur sebanyak 10 mL (Erlenmeyer 100 mL) dan kultur sebanyak 30 mL (Erlenmeyer 300 mL). Komposisi media yang terdiri dari 3.8% (b/v) Artificial Sea Water (ASW), 0.1% (b/v) yeast extract dan 0.5% (b/v) bacto peptone dilarutkan dengan akuades, dengan terlebih dahulu ditambahkan substrat porang, LBG, BKS, TKKS dan bagasse sebanyak 0.5% (b/v) pada masing-masing Erlenmeyer, kemudian dihomogenkan dengan pengaduk magnetik kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 1 atm dengan suhu 121oC selama 15 menit. Bakteri yang telah berhasil diremajakan secara aseptik diinokulasikan pada media prekultur sebanyak satu ose, kemudian diinkubasi dalam inkubator bergoyang pada kecepatan 150 rpm dan suhu 30oC selama satu malam. Prekultur dimasukkan ke dalam media kultur secara aseptik dan diinkubasi selama 120 jam. Pemanenan sel dilakukan setiap 24 jam sebanyak 2 mL. Masing-masing sebanyak 1 mL untuk pengukuran pertumbuhan sel dan preparasi enzim ekstrak kasar. Optimasi Konsentrasi Substrat Terpilih Optimasi konsentrasi terdiri dari lima variasi konsentrasi yaitu 0.5%, 1%, 1.5%, 2% dan 2.5% (b/v). Media cair untuk proses produksi dibuat dua bagian yaitu untuk proses prekultur sebanyak 10 mL (Erlenmeyer 100 mL) dan kultur sebanyak 30 mL (Erlenmeyer 300 mL) masing-masing 2 ulangan untuk setiap parameter. Komposisi media yang terdiri dari 3.8% (b/v) Artificial Sea Water (ASW), 0.1% (b/v) yeast extract dan 0.5% (b/v) bacto peptone dilarutkan dengan akuades, dengan terlebih dahulu ditambahkan substrat terpilih sebanyak 0.5%

19

4

(b/v), 1% (b/v), 1.5% (b/v) 2% (b/v) dan 2.5% (b/v) pada masing-masing Erlenmeyer, kemudian dihomogenkan dengan pengaduk magnetik kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 1 atm dengan suhu 121oC selama 15 menit. Bakteri yang telah berhasil diremajakan secara aseptik diinokulasikan pada media prekultur sebanyak satu ose, kemudian diinkubasi dalam shaker pada kecepatan 150 rpm dan suhu 30oC selama satu malam. Prekultur dimasukkan ke dalam media kultur secara aseptik dan diinkubasi selama 120 jam dengan suhu dan kecepatan yang sama dengan prekultur. Pemanenan dilakukan setiap 24 jam sebanyak 2 mL. Masing-masing sebanyak 1 mL untuk pengukuran pertumbuhan sel dan 1 mL lainnya untuk preparasi enzim ekstrak kasar. Optimasi pH Media Produksi Optimasi pH media terdiri dari lima variasi pH yaitu 5, 6, 7, 8 dan 9. Media cair untuk proses produksi dibuat dua bagian yaitu untuk proses prekultur sebanyak 10 mL (Erlenmeyer 100 mL) dan kultur sebanyak 30 mL (Erlenmeyer 300 mL) masing-masing 2 ulangan untuk setiap parameter. Komposisi media yang terdiri dari 3.8% (b/v) Artificial Sea Water (ASW), 0.1% (b/v) yeast extract dan 0.5% (b/v) bacto peptone dilarutkan dengan akuades, pH media untuk masing-masing Erlenmeyer diukur dengan menggunakan pH meter, tingkat keasaman media ditepatkan dengan penambahan sedikit asam (larutan HCl 10%) atau sedikit basa (larutan NaOH 2%) dengan pipet tetes. Setelah diukur pH kemudian media ditambahkan substrat terpilih pada masing-masing Erlenmeyer dengan konsentrasi yang telah diperoleh pada optimasi konsentrasi substrat. Media dihomogenkan dengan pengaduk magnetik kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 1 atm dengan suhu 121oC selama 15 menit. Bakteri yang telah berhasil diremajakan secara aseptik diinokulasikan pada media prekultur sebanyak satu ose, kemudian diinkubasi dalam shaker pada kecepatan 150 rpm dan suhu 30oC selama satu malam. Prekultur dimasukkan ke dalam media kultur secara aseptik dan diinkubasi selama 120 jam dengan suhu dan kecepatan yang sama dengan prekultur. Pemanenan dilakukan setiap 24 jam sebanyak 2 mL. Masing-masing sebanyak 1 mL untuk pengukuran pertumbuhan sel dan 1 mL lainnya untuk preparasi enzim ekstrak kasar. Optimasi Suhu Produksi Optimasi suhu produksi terdiri dari empat variasi yaitu suhu 20oC, 30oC, o 40 C dan 50oC. Media cair untuk proses produksi dibuat dua bagian yaitu untuk proses prekultur sebanyak 10 mL (Erlenmeyer 100 mL) dan kultur sebanyak 30 mL (Erlenmeyer 300 mL) masing-masing 2 ulangan untuk setiap parameter. Komposisi media yang terdiri dari 3.8% (b/v) Artificial Sea Water (ASW), 0.1% (b/v) yeast extract dan 0.5% (b/v) bacto peptone dilarutkan dengan akuades, kemudian pH media diukur dengan menggunakan pH meter, tingkat keasaman media ditepatkan dengan penambahan sedikit asam (larutan HCl 10%) atau sedikit basa (larutan NaOH 2%) dengan pipet tetes. Setelah diukur pH kemudian media ditambahkan substrat terpilih pada masing-masing Erlenmeyer dengan konsentrasi yang telah diperoleh pada optimasi konsentrasi substrat. Media dihomogenkan dengan pengaduk magnetik kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 1 atm dengan suhu 121oC selama 15 menit. Bakteri yang telah berhasil diremajakan secara aseptik diinokulasikan pada media prekultur sebanyak satu ose, kemudian

4

5

diinkubasi dalam inkubator bergoyang pada kecepatan 150 rpm dan suhu sesuai variasi yang ada yaitu masing-masing 20oC, 30oC, 40oC dan 50oC selama satu malam. Prekultur dimasukkan ke dalam media kultur secara aseptik dan diinkubasi selama 120 jam pada suhu dan kecepatan yang sama dengan prekultur. Pemanenan sel dilakukan setiap 24 jam sebanyak 2 mL. Masing-masing sebanyak 1 mL untuk pengukuran pertumbuhan sel dan 1 mL lainnya untuk preparasi ekstrak kasar enzim mananase. Pembuatan Kurva Pertumbuhan Sel Bakteri laut Bacillus subtilis (Yopi et al. 2006) Kurva pertumbuhan sel dibuat dengan cara melakukan pengukuran optical density (OD) 1 mL hasil pemanenan sel setiap 24 jam, mulai dari jam ke-0 sampai jam ke 120. Pengukuran OD dilkukan dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 660 nm. Preparasi Ekstrak Kasar Mananase (Yopi et al. 2006) Enzim mananase ekstrak kasar didapatkan dari ekstraksi kultur sel dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC, kemudian supernatan dipindahkan pada microtube ependorf baru dan disentrifugasi pada kecepatan, suhu dan waktu yang sama. Ekstrak enzim mananase dipertahankan pada suhu dingin yaitu minimal 4°C untuk menjaga aktifitas enzimnya (Liu et al. 2011). Hasil ekstraksi enzim (supernatan) yang diperoleh merupakan enzim ekstrak kasar mananase yang siap digunakan untuk proses pengujian. Analisis Aktivitas Ekstrak Kasar Mananase (Miller 1959) Aktivitas enzim mananase ditentukan dengan menggunakan metode DNS yang telah dimodifikasi, yaitu mereaksikan 0.25 mL enzim yang telah diencerkan dengan 0.25 mLsubstrat LBG 0.5% (b/v) dalam bufer fosfat pH 6 (0.05 M) dan ditambahkan reagen DNS sebanyak 0.75 mL dalam tabung reaksi, kemudian diinkubasi pada suhu 50°C selama 15 menit. Reaksi dihentikan dengan merendam tabung reaksi berisi sampel dalam air mendidih 100°C selama 15 menit. Gula pereduksi yang dibebaskan ditentukan dengan menggunakan metode DNS (Miller 1959). Warna yang terbentuk diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh dikonversi menjadi konsentrasi gula pereduksi (ppm) menggunakan persamaan yang didapat dari kurva standar manosa. Kurva standar manosa dibuat dengan cara melarutkan 0.01 g D-manosa ke dalam 10 mL bufer fosfat 0.05 M (1000 ppm), kemudian diencerkan secara bertingkat pada konsentrasi 100 ppm sampai 900 ppm. Setiap hasil pengenceran direaksikan sebanyak 0.5 mL dengan 0.75 mL reagen DNS, dipanaskan 15 menit dalam water bath 100oC, didinginkan dalam es selama 10 menit, kemudian diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 540 nm. Satu unit aktivitas enzim (U) yaitu jumlah mikromol gula pereduksi yang terbentuk per mL enzim per menit (Kanti 2005). DNS adalah senyawa aromatis yang mampu bereaksi dengan gula reduksi dalam suasana lingkungan yang bersifat basa. Hasil uji DNS berwarna jingga kemerahan sehingga dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansi sebanding dengan jumlah gula reduksi.

19

6

Penambahan NaOH ke dalam komposisi larutan reagen DNS bertujuan untuk memberikan suasana basa ketika reaksi. Reaksi DNS ini merupakan reaksi redoks, gugus aldehid gula pereduksi akan teroksidasi menjadi gugus karboksil, sedangkan DNS (kuning) sebagai oksidator akan tereduksi membentuk 3-amino5-nitrosalicylic acid (jingga-merah kecolatan) (Sastrohamidjojo 2005).

HASIL Peremajaan Bakteri Laut Bacillus Subtilis pada Media Padat Bakteri laut Bacillus subtilis berhasil diremajakan pada media padat mengandung substrat LBG 0.5% (b/v). Pertumbuhan Bacillus subtilis ditandai dengan adanya koloni berwarna putih kecoklatan, sedikit berlendir dan tumbuh pada permukaan media padat (Gambar 1) Bakteri yang diremajakan digunakan untuk perlakuan selanjutnya.

Gambar 1 Peremajaan bakteri laut Bacillus subtilis pada media LBG 0.5% Seleksi Substrat Manan Alternatif dari Berbagai Jenis Biomassa Kurva pertumbuhan sel Bacillus subtilis dengan substrat biomassa manan menunjukkan bahwa porang memiliki nilai pertumbuhan lebih tinggi dibandingkan biomassa lain. Pertumbuhan Bacillus subtilis pada media TKKS dan bagasse memliliki laju yang lambat (Gambar 2). Hasil ananisis aktivitas mananase menunjukkan bahwa tepung porang memiliki nilai aktivitas enzim paling tinggi yaitu 11.3 U/mL pada jam ke-96, nilai ini lebih tinggi dibanding aktivitas enzim pada biomassa BKS, TKKS dan bagasse dengan LBG sebagai pembanding (Gambar 3).

Gambar 2 Pertumbuhan sel Bacillus subtilis pada berbagai biomassa manan. ●Porang ●BKS ●Bagasse ●TKKS ●LBG

6

7

Gambar 3 Aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada berbagai biomassa manan. ●Porang ●BKS ●Bagasse ●TKKS ●LBG Optimasi Konsentrasi Substrat Porang Berdasarkan hasil seleksi substrat, porang dipilih sebagai substrat alternatif untuk proses optimasi. Tahap pertama diawali dengan optimasi konsentrasi porang pada 0.5%, 1%, 1.5%, 2% dan 2.5% (b/v). Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada panjang gelombang 660 nm menunjukkan perbedaan laju pertumbuhan yang tidak berbeda nyata antar konsentrasi substrat. Kurva yang terbentuk saling berimpit dengan pertumbuhan optimum pada jam ke-24 (Gambar 4). Hasil analisis aktivitas mananase menunjukkan konsentrasi 1% memiliki nilai aktivitas enzim lebih tinggi dari konsentrasi lain yaitu sebesar 15,64 U/mL pada jam ke-96 (Gambar 5).

Gambar 4 Pertumbuhan sel Bacillus subtilis pada berbagai konsentrasi substrat porang. ●0.5% ●1% ●1.5% ●2% ●2.5%

Gambar 5 Aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada berbagai variasi konsentrasi substrat porang. ●0.5% ●1% ●1.5% ●2% ●2.5%

19

8

Optimasi pH Media Produksi Proses optimasi produksi mananase dari Bacillus subtilis laut dilanjutkan dengan proses optimasi pH media produksi. Optimasi dilakukan dengan mengggunakan substrat porang 1% pada ragam pH 5, 6, 7, 8, dan 9. Pertumbuhan optimum dari Bacillus subtilis terjadi pada jam ke-96 (gambar 6). Berdasarkan analilisi aktivitas enzim, aktivitas mananase dari Bacillus subtilis laut optimum pada pH 8 dengan waktu inkubasi selama 72 jam, dengan nilai aktivitas enzim mencapai 19,31 U/mL (Gambar 7).

Gambar 6 Pertumbuhan sel Bacillus subtilis dengan substrat porang 1% pada berbagai kondisi pH media produksi. ●5 ●6 ●7 ●8 ●9

Gambar 7 Aktivitas mananase dari Bacillus subtilis dengan substrat porang 1% pada berbagai kondisi pH media produksi. ●5 ●6 ●7 ●8 ●9 Optimasi Suhu Produksi Setelah diketahui jenis substrat alternatif terbaik, konsentrasi substrat optimum, serta pH media optimum, selanjutnya dilakukan tahap optimasi suhu dengan kondisi konsentrasi substrat porang 1%, pH media 8 pada ragam variasi suhu 20oC, 30oC, 40oC dan 50oC. Laju pertumbuhan Bacillus subtilis pada kondisi fermentasi suhu 40oC lebih tinggi dibanding suhu lain (Gambar 8). Berdasarkan hasil analisis aktivitas enzim, pada suhu fermentasi 50oC nilai aktivitas mananase lebih tinggi dibanding suhu lain yaitu 40oC, 30oC, dan 20oC (Gambar 9), nilai aktivitas enzimnya mencapai 37,70 U/mL pda jam ke-24.

8

9

Gambar 8 Pertumbuhan sel Bacillus subtilis dengan substrat porang 1% pada pH media 8 dengan berbagai variasi suhu. ●20oC ●30oC ●40oC ●50oC

Gambar 9 Aktivitas mananase dari Bacillus subtilis dengan substrat porang 1% pada pH media 8 dengan berbagai variasi suhu. ●20oC ●30oC ●40oC ●50oC

PEMBAHASAN Seleksi Substrat Manan Alternatif dari Berbagai Jenis Biomassa Bakteri membutuhkan nutrien agar dapat bertahan hidup dan berkembang biak. Salah satu nutrien penting bagi pertumbuhan sel bakteri adalah karbon yang penting sebagai sumber energi. Karbon dibutuhkan bakteri sebagai sumber energi utama untuk proses pertumbuhan dan replikasi. Karbon biasanya diperoleh bakteri dari hasil pemecahan enzimatis molekul-molekul organik kompleks seperti karbohidrat (Greg and Richard 2009). Agar bakteri dapat bertahan hidup, berkembang dengan baik dan menghasilkan enzim yang diinginkan, dalam komposisi media kulturnya harus ditambahkan sumber karbon utama sebagai substrat. Suatu substrat dimanfaatkan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhan biomassa, pemeliharaan sel dan menghasilkan produk (Yuliana 2008). Jenis substrat biasanya disesuaikan dengan jenis enzim yang akan diproduksi. Manan merupakan substrat spesifik untuk produksi enzim mananase. Substrat manan yang ditambahkan ke dalam media produksi enzim mananase merupakan gula kompleks (polisakarida), sel tidak dapat mencerna secara langsung karena molekul gula kompleks terlalu besar.

19

10

Manan yang merupakan polisakarida adalah satu-satunya sumber karbon yang ada dalam media, sehingga akan didegradasi menjadi gula yang lebih sederhana seperti monosakarida atau oligosakarida oleh sel bakteri. Polisakarida manan hanya akan terdegradasi menjadi gula sederhana jika sel mensekresikan enzim pendegradasi manan berupa enzim mananase. Mananase akan mendegradasi manan, glukomanan, galaktomanan, galaktoglukomanan menjadi manosa dan gula-gula sederhana lain sehingga karbohidrat yang ada dapat dicerna oleh sel bakteri. Oleh karena itu pemilihan jenis substrat harus tepat agar enzim mananase yang dihasilkan oleh bakteri lebih optimum. Biomassa yang dihasilkan dari berbagai macam limbah pertanian diketahui memiliki kandungan hemiselulosa yang tinggi. Hemiselulosa diketahui sebagai polisakarida kedua terbanyak di alam yang sangat melimpah setelah selulosa. Hemiselulosa memiliki komponen penyusun utama yang terdiri atas hetero-1,4-βD-xilan dan hetero-1,4-β-D-manan (galaktoglukomanan, galaktomanan, dan glukomanan). (Sumadi 2005). Fakta ini memungkinkan bahwa biomassa dari limbah pertanian dapat dijadikan substrat manan alternatif. Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada berbagai macam substrat menunjukkan laju yang berbeda. Bacillus subtilis yang dikulturkan pada media yang ditambahkan substrat porang memiliki laju pertumbuhan paling tinggi jika dibandingkan pertumbuhan Bacillus subtilis pada media yang ditambahkan substrat dari biomassa lain seperti TKKS, bagasse ataupun BKS. Berdasarkan kurva dapat diketahui bahwa Bacillus subtilis pada media kultur telah tumbuh dengan baik (gambar 2). Diketahui terdapat 4 fase pertumbuhan bakteri ketika ditumbuhkan pada kultur curah (batch culture), yaitu fase adaptasi (lag phase), fase perbanyakkan (exponential phase), fase statis (stationer phase), dan fase kematian (death phase) (Purwoko, 2007). Berdasarkan analisa pertumbuhan Bacillus subtilis pada media substrat porang, fase lag atau fase penyesuaian bakteri terhadap lingkungannya yang baru terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-24, ditunjukkan dengan garis yang cenderung mendatar dan hanya sedikit naik di awal kurva. Fase log dimulai pada jam ke-24 sampai jam ke-72 di mana bakteri mulai tumbuh dan berkembang secara cepat seiring berjalannya waktu fermentasi, garis kurva cenderung meningkat tajam. Fase stasioner terjadi ketika sel bakteri yang mati dan yang berkembang biak kurang lebih seimbang sehingga membuat garis kurva sedikit mendatar seperti yang terlihat pada kurva sekitar jam ke-72 dan jam ke-96, pada jam ini terjadi aktivitas mananase optimum pada media dengan substrat porang. Biasanya kurva pertumbuhan diakhiri dengan fase kematian dengan garis kurva yang semakin menurun, hal ini disebabkan habisnya kandungan zat makanan pada media sehingga bakteri tidak mampu berkembang biak dan melakukan metabolisme, keadaan ini menyebabkan jumlah sel yang hidup semakin berkurang (Yuwono 2005). Bentuk kurva yang cenderung mendatar pada jam ke-96 sampai jam ke-120 diperkirakan karena adanya fase adaptasi kembali Bacillus subtilis terhadap suber karbon lain selain manan yang terkandung dalam biomassa, hal ini bersifat wajar karena biomassa tersusun atas berbagai macam karbohidrat (Chuan et al. 2006). Hasil seleksi berbagai jenis biomassa yang diuji sebagai substrat alternatif untuk produksi mananase dari bakteri laut Bacillus subtilis pada percobaan ini menunjukkan nilai yang beragam, hal ini didapat diamati dari kurva aktivitas

10

11

ekstrak kasar enzim mananase (Gambar 3). Nilai aktivitas enzim mananase menunjukkan banyaknya unit enzim yang diproduksi oleh Bacillus sbutilis laut pada saat fermentasi. Nilai aktivitas mananase pada media yang ditambahkan porang 0.5% sebagai substrat menunjukkan nilai aktivitas enzim sebesar 11.3 U/mL, nilai ini lebih tinggi dibanding nilai aktivitas mananase dengan substrat biomassa lain seperti TKKS, bagasse, dan BKS pada konsentrasi yang sama. Aktivitas enzim tertinggi terjadi pada jam ke-96, ini dapat diartikan bahwa produksi enzim mananase oleh Bacillus subtilis laut paling banyak terjadi pada jam ke-96. Secara analitik, aktivitas enzim mananase pada media substrat porang lebih tinggi dibanding yang lain, antara lain disebabkan karena komposisi tepung porang mengandung persentase manan yang tinggi yaitu sekitar 30.56% glukomanan (Akbar et al. 2013). Konsentrasi manan tersebut lebih tinggi dibanding bungkil kelapa sawit (BKS) yang mengandung sekitar 20-40% manan (Yopi et al. 2010). Biomassa lain seperti bagasse diketahui hanya mengadung 20% hemiselulosa (mengandung manan) dan substansi TKKS terdiri atas 17.92% hemiselulosa (mengandung manan) (Samsuri et al. 2007, Piarpuzan et al. 2011). Penelitian sebelumnya oleh Chuan et al. (2006) pada Bacillus subtilis ATCC3366 menunjukkan aktivitas mananase optimum sebesar 8 U/mL setelah diinkubasi selama 36 jam pada substrat biomassa PKC (palm kernel cake). Berdasarkan hasil seleksi substrat manan, tepung porang dipilih sebagai substrat terbaik dan digunakan sebagai sumber karbon utama dalam tahap optimasi produksi mananase dari bakteri laut Bacillus subtilis. Media dengan substrat tepung porang memiliki nilai aktivitas mananase lebih tinggi dibanding biomassa lain yang digunakan pada pengujian ini.

Optimasi Konsentrasi Substrat Porang Pertumbuhan Bacillus subtilis pada proses optimasi konsentrasi substrat porang diamati dari kurva pertumbuhannya (Gambar 4). Berdasarkan kurva, laju pertumbuhan bakteri optimum pada jam ke-24, pertumbuhan meningkat drastis pada rentang jam ke-0 sampai jam ke-24 kemudian menurun di jam selanjutnya hingga hari terakhir pemanenan. Kurva pertumbuhan bakteri laut Bacillus subtilis pada beberapa konsentrasi tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan, sehingga garis kurva cenderung saling berimpit. Tidak adanya pengenceran menyebabkan konsentrasi sel yang diukur terlalu tinggi sehingga menyebabkan ketidaktepatan dalam pengukuran nilai absorbansi sampel oleh spektrofotometer. Konsentrasi sampel yang terlalu pekat sangat mempengaruhi nilai OD (optical density) sampel yang terbaca oleh spektrofotometer (Assidqi et al. 2012). Hasil analisis aktivitas enzim mananase pada tahap optimasi konsentrasi substrat menunjukkan bahwa konsentrasi substrat porang paling optimum adalah 1%, nilainya lebih tinggi dibanding aktivitas enzim mananase pada konsentrasi lain seperti 0.5%, 1.5%, 2.% dan 2.5% (Gambar 5). Nilai aktivitas mananase untuk konsentrasi 1 % optimum pada jam ke-96 dengan nilai sebesar 15.64 U/mL, lebih tinggi dibanding aktivitas mananase pada konsentrasi 0.5%, 1.5%, 2.% dan 2.5% berturut-turut adalah 8.13 U/mL, 10.47 U/mL, 11.87 U/mL dan 12.67 U/mL. Keadaan ini menyatakan bahwa mananase paling banyak diproduksi pada jam ke-96 oleh bakteri Bacillus subtilis laut pada konsentrasi substat 1%. Dapat dilihat bahwa konsentrasi substrat yang terlalu rendah (0.5%) tidak dapat

19

12

memproduksi enzim secara maksimal, namun konsentrasi substrat yang terlalu tinggi (>1%) juga bersifat tidak efektif untuk proses produksi. Konsentrasi substrat yang tinggi membuat molekul mananase berinteraksi dengan substratnya membentuk kompleks enzim dengan dobel substrat yang sifatnya tidak produktif, sehingga aktivitas enzim menjadi rendah (Sumardi 2005). Konsentrasi substrat yang terlalu tinggi pada proses kultur dapat menyebabkan penurunan laju transfer oksigen yang penting bagi proses metabolisme mikroba, karena konsentrasi substrat yang tinggi dapat membatasi gerak pencampuran media oleh shaker (Purwadaria et al. 2003).

Optimasi pH media Produksi Berdasarkan kurva pertumbuhan Bacillus subtilis memiliki pH optimum 6 untuk pertumbuhannya (Gambar 6), namun berbeda dengan pH optimum untuk produksi enzimnya yang optimum pada pH 8 (Gambar 7). Produksi mananase pada pH 5 dan pH 9 sangat rendah jika dilihat dari nilai aktivitas enzimnya, hal ini dikarenakan kondisi media yang terlalu asam atau terlalu basa yang menyebabkan penghambatan proses produksi enzim. Nilai pH diketahui dapat mempengaruhi konformasi enzim mananase (Sumardi 2005). Konformasi enzim akan berubah jika berada pada kondisi pH terlalu asam atau terlalu basa (Agustini 2009). Sejalan dengan penelitian sebelumnya oleh Dan et al. (2012) yang menyatakan bahwa bakteri jenis Bacillus sp. HDYM-05 optimum memproduksi mananase pada pH 8. Namun Jiang et al. (2006) menyatakan bahwa pH optimum untuk Bacillus subtilis adalah pH 6. Selain itu Bacillus sp. memiliki pH optimum untuk proses produksi mananase pada pH 6.5 (Meenakshi et al. 2010). Berbeda dengan Bacillus subtilis IE dan Bacillus pumilus S5 pada penelitian Adebayo et al. (2013) yang yang menyatakan bahwa enzim mananase diproduksi secara optimum pada kondisi media pH 5. Berdasarkan kurva, nilai aktivitas enzim optimum untuk pH 8 terjadi sekitar jam ke-72. Hasil ini menunjukkan bahwa perubahan pH media mempengaruhi waktu optimum produksi mananase oleh Bacillus subtilis. Waktu optimum produksi enzim mananase berubah dari jam ke-96 menjadi jam ke-72 setelah dilakukan proses optimasi pada pH medianya. Sejalan dengan Gupta et al. (2003) yang menyatakan bahwa induksi perubahan morfologi bakteri dan sekresi enzim dipengaruhi oleh kondisi pH media tumbuh bakteri.

Optimasi Suhu Produksi Metabolisme suatu organisme tidak terlepas dari kondisi lingkungannya, termasuk pengaruh suhu. Suhu diketahui mampu mengendalikan pertumbuhan bakteri dan mempengaruhi laju pertumbuhannya, selain itu suhu juga mempengaruhi jumlah total pertumbuhan dari suatu organisme (Pelczar dan Chan 2008). Suhu merupakan faktor penting yang dapat mempercepat atau bahkan memperlambat laju metabolisme suatu organisme termasuk bakteri yang dikulturkan pada media fermentasi. Oleh sebab itu perlu dilakukan optimasi suhu pada proses produksi mananase dari Bacillus subtilis laut. Bacillus subtilis laut yang dikulturkan memiliki suhu optimum pertumbuhan pada temperatur 40oC (Gambar 8) namun sangat baik memproduksi mananase

12

13

pada temperatur 50oC, dengan nilai aktivitas mananase sebesar 37.70 U/mL pada jam ke-24 (Gambar 9). Pertumbuhan Bacillus subtilis meningkat sejalan dengan bertambahnya suhu. Dapat dilihat dari kurva pertumbuhannya ketika suhu dinaikan hingga 40oC pertumbuhannya meningkat drastis namun kembali menurun pada suhu 50oC. Terlihat bahwa pertumbuhan Bacillus subtilis sangat dipengaruhi oleh perubahan suhu dengan perubahan temperatur pada rentang 10oC (Prescott et al. 2008). Berdasarkan pertumbuhannya bakteri ini digolongkan ke dalam kelompok mesofilik, yang tumbuh optimum pada temperatur 30oC-45oC (Tang et al. 2009), namun optimum memproduksi mananase pada suhu 50oC. Penelitian sebelumnya oleh Younis et al. (2010) menyatakan bahwa Bacillus subtilis KO strain tubuh dengan baik pada temperatur 45oC dengan waktu optimum pertumbuhan 24 jam pada substrat mollase. Sedangkan Jiang et al. (2006) menyatakan kondisi optimum untuk produksi mananase dari Bacillus subtilis WY34 adalah 50oC, dengan substrat porang 2% dan pH optimum 6.

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Porang merupakan substrat alternatif terbaik untuk proses produksi enzim mananase dari bakteri laut Bacillus subtilis karena memiliki nilai aktivitas enzim mananase yang lebih tinggi dibanding biomassa lain seperti TKKS, BKS dan bagasse yaitu sebesar 11.29 U/mL. Proses optimasi produksi enzim mananase telah berhasil dilakukan dengan menggunakan substrat porang pada konsentrasi 1% dan pH media 8 dengan suhu 50oC. Produksi enzim mananase mengalami peningkatan setelah tahap optimasi berdasarkan nilai aktivitas enzimnya, dari 11.29 U/mL pada jam ke-96 menjadi 37.70 U/mL pada jam ke-24. Saran Proses optimasi dilengkapi dengan parameter-parameter lain seperti aerasi, kecepatan agitasi, dan penambahan garam-garam mineral yang dibutuhkan untuk pertumbuhan Bacillus subtilis agar proses produksi dapat lebih dioptimalkan. Enzim dapat dipurifikasi agar lebih murni dan dapat diaplikasikan secara luas.

DAFTAR PUSTAKA Adebayo-tayo B, Elelu T, Akinola G, Oyinloye I. 2013. Screening and production of mannanase by Bacillus strains isolated from fermented food condiments. IRFB 13: 53-62. Agustini N dan Kusmiati. 2009. Identifikasi dan uji aktivitas antibakteri senyawa aktif secara maserasi dan digesti dalam berbagai pelarut dari mikroalga Dunaliella salina. Seminar Nasional IX Pendidikan Tinggi FKIP UNS 544-551.

19

14

Assidqi K, Tjahjaningsih W, Sigit S. 2012. The potentials of leaves extracts of patikan kebo (Euphorbia hirta) as antibacterial against Aeromonas hydrophila in vitro. Journal of Marine and Coastal Science.1(2), 113-124. Akbar H, Supriyanto A, Haryani K. 2013. Karakterisasi tepung konjak dari tanaman iles-iles (Amorphallus oncophyllus) di Daerah Guning Kreo Semarang Jawa Tengah. J Chem Tech Ind 2 (4): 4-47. Arisman. 2009. Buku Ajar Ilmu Gizi. Jakarta: Penerbit buku kedokteran EGC. Bull AT, Ward AC, Goodfellow M. 2000. Search and discovery strategies for biotechnology: The Paradim Shift. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64 (3): 573. Chuan CH, Krishnaiah K, Wong CM, Janaun J. 2006. Palm Kernel Cake as Substrate for β-Mannanase production by Bacillus subtilis ATCC336 under Submerged and Solid State Fermentation. Proceedings of the 1st International Conference on Natural Resource Engineering & Technology 182-185. Dan Z, Wenxiang P, Gang S, hongzhi L, Xue L, Jingping G. 2012. Optimization of mannanase production by Bacillus sp. hdym-05 through factorial method and response surface methodology. Afr. J. Microbiol. Res. 6 (1): 176-182. Dhawan S, Kaur J. 2007. Microbial mannanases: An overview of production and applications. Critical Reviews in Biotechnology 27: 197–216. Greg A. Somerville dan Richard A. Proctor. 2009. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73(2): 233. Gupta R, Gigras P, Mohapatra H, Goswami VK, Chauhan B. 2003. Microbialamylases: a biotechnological perspective. Journal of Process. Biochem. 38: 1599-1616. Jiang Z, Wei Y, Li D, Li L, Chai P, dan Kusakabe I. 2006. High-level production, purification, and characterization of a thermostable β-mannanase from the newly isolated Bacillus subtilis WY34. J. Carbo Polys. 66:89-96. Kanti Atit. 2005. Cellulolytic actinomycetes isolated from soil in Bukit Duabelas National Park, Jambi. J. Biol Diversity. 6(2): 85-89. Liu J, Zhang Z, Zhu H, Dang H, Lu J, Cui Z. 2011. Isolation and characterization of α-amilase from marine Pseudomonas sp. K6-28-040. J Biotech 10 (14): 2733 -2740. Meenakshi M, Singh G, Bhalla A, Hoondal GS. 2010. Solid State fermentation and characterization of partially purified thermostable mannanase krom Bacillus sp. MG-33. Bioresource. 5(3):1689-1701. Miller GL. 1959. Use of dinitrosalisylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31(3):426–428. Pelczar MJ, Chan ECS. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah. Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.

14

15

Piarpuzan D, Quintero JA, Cardona CA. 2011. Empty fruit bunches from palm as a potential raw material for fuel ethanol production. Biomass and Bioenergy 35: 1130-1137. Purwadaria T, Haryati T, Frederick E, Tangendjaja B. 2003. Optimation of βmannanase production on submerged culture of Eupenicillium javanicum as well as pH and temperature enzyme characterization. JITV 8 (1). Samsuri M, Gozan M, Mardias R, Baiquni M, Hermansyah H, Wijanarko A, Prasetya B, Nasikin M. 2007. Pemanfaatan selulosa bagas untuk produksi etanol melalui sakarifikasi dan fermentasi serentak dengan enzim xilanase. Makara Teknologi 11 (1): 17-24. Sastrohamidjojo. 2005. Kimia Organik, Sterokimia, Lemak, dan Protein. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Sumardi. 2005. Optimasi produksi enzim β-mananase ekstraseluler dari bakteri Geobacillus Stearothermophilus L-07. J. Sains Tek. 11: 2. Tricone A. 2011. Marine biocatalyst: enzymatic features and apllication. Mar. Drugs. 9: 478-499. Yopi, Purnawan A, Thontowi A, Hermansyah H, Wijanarko A. 2006. Preparasi manan dan mananase kasar dari bungkil kelapa sawit. Jurnal Teknologi 4: 312-319. Yopi, Susilaningsih D, Purnawan A, Hermansyah H, Thontowi A, Djohan AC, Praharyawan S, Lisdiyanti. 2010. Palm kernel cake biomass fermentation using stirrer fermentor for mananase and saccharides production. Prosiding Asean-Korea Symposium and Workshop on Biorefinery Technology 455-459. Younis Magdi AM, Hezayen Francis F, Nour-Eiden MA, Shabeb MSA. 2010. Optimization of cultivation medium and growth condition for Bacillus subtilis KO strain isolated from sugar cane molasses. American-Eurasian J. Agric. And Envviron. Sci. 7(1): 31-37. Yuliana Neti. 2008. Kinetika pertumbuhan bakteri asam laktat isolat T5 yang berasal dari tempoyak. Industrial Tech J and Agric. 13(2). Yuwono T. 2005. Biologi Molekular. Yogyakarta : Erlangga.

19

16

LAMPIRAN

16

17

Lampiran 1 Alur Penelitian PEREMAJAAN Bacillus subtilis

SELEKSI SUBSTRAT ALTERNATIF (BKS, TKKS, Bagasse, Porang)

OPTIMASI PRODUKSI ENZIM MANANASE Optimasi konsentrasi substrat Optimasi pH media produksi

Optimasi suhu produksi

Proses yang dilakukan pada tahap seleksi substrat dan optimasi: 1. Prekultur 2. Kultur 3. Pengukuran pertumbuhan sel 4. Preparasi enzim ekstrak kasar 5. Analisis aktivitas enzim

18

Lampiran 2 Kurva standar D-(+)-Manosa

20

21

Lampiran 3 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada berbagai jenis biomassa Jenis Inkubasi biomassa

Porang

BKS

Bagasse

0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

Sample

Kontrol

S-K

ppm (mg/L)

mg/mL

S1

S2

K1

K2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

0.063 0.340 0.816 0.736 0.870 0.827 0.030 0.082 0.092 0.123 0.112 0.113 0.020 0.086 0.065 0.072 0.058 0.058

0.066 0.397 0.663 0.631 0.842 0.690 0.040 0.161 0.077 0.225 0.189 0.182 0.071 0.148 0.149 0.175 0.140 0.133

0.023 0.022 0.020 0.020 0.023 0.018 0.020 0.029 0.017 0.016 0.015 0.024 0.033 0.019 0.028 0.023 0.015 0.020

0.023 0.022 0.020 0.020 0.023 0.018 0.023 0.021 0.029 0.038 0.032 0.035 0.061 0.030 0.034 0.039 0.045 0.034

0.040 0.318 0.796 0.716 0.847 0.809 0.012 0.024 0.020 0.033 0.030 0.022 -0.013 0.067 0.037 0.049 0.043 0.038

0.043 0.375 0.643 0.611 0.819 0.672 0.017 0.140 0.048 0.187 0.157 0.147 0.010 0.118 0.115 0.136 0.095 0.099

31.345 127.207 292.034 264.448 309.621 296.517 21.690 25.828 24.448 28.931 27.897 25.138 13.069 40.655 30.310 34.448 32.379 30.655

32.379 146.862 239.276 228.241 299.966 249.276 23.414 65.828 34.103 82.034 71.690 68.241 21.000 58.241 57.207 64.448 50.310 51.690

0.031 0.127 0.292 0.264 0.310 0.297 0.022 0.026 0.024 0.029 0.028 0.025 0.013 0.041 0.030 0.034 0.032 0.031

0.032 0.147 0.239 0.228 0.300 0.249 0.023 0.066 0.034 0.082 0.072 0.068 0.021 0.058 0.057 0.064 0.050 0.052

Aktivitas mananase S1 S2 (U/mL) 1.161 1.199 1.180 4.711 5.439 5.075 10.816 8.862 9.839 9.794 8.453 9.123 11.467 11.110 11.288 10.982 9.232 10.107 0.803 0.867 0.835 0.957 2.438 1.697 0.905 1.263 1.084 1.072 3.038 2.055 1.033 2.655 1.844 0.931 2.527 1.729 0.484 0.778 0.636 1.506 2.157 1.831 1.123 2.119 1.621 1.276 2.387 1.831 1.199 1.863 1.531 1.135 1.914 1.524 U/mL

19 19

20 20 Lanjutan Jenis biomassa

TKKS

LBG

Sample Inkubasi 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

Kontrol

S-K

ppm (mg/L)

mg/mL

U/mL

S1

S2

K1

K2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

0.041 0.049 0.060 0.077 0.083 0.097 0.037 0.312 0.440 0.389 0.357 0.435

0.069 0.084 0.085 0.088 0.091 0.071 0.036 0.359 0.464 0.368 0.430 0.397

0.016 0.017 0.021 0.027 0.018 0.015 0.027 0.022 0.023 0.020 0.031 0.027

0.014 0.013 0.009 0.026 0.012 0.022 0.025 0.021 0.016 0.018 0.020 0.023

0.025 0.032 0.039 0.050 0.065 0.082 0.010 0.290 0.417 0.369 0.326 0.408

0.055 0.071 0.076 0.062 0.079 0.049 0.011 0.338 0.448 0.350 0.410 0.374

26.172 28.586 31.000 34.793 39.966 45.828 21.000 117.552 161.345 144.793 129.966 158.241

36.517 42.034 43.759 38.931 44.793 34.448 21.345 134.103 172.034 138.241 158.931 146.517

0.026 0.029 0.031 0.035 0.040 0.046 0.021 0.118 0.161 0.145 0.130 0.158

0.037 0.042 0.044 0.039 0.045 0.034 0.021 0.134 0.172 0.138 0.159 0.147

0.969 1.059 1.148 1.289 1.480 1.697 0.778 4.354 5.976 5.363 4.814 5.861

1.352 1.557 1.621 1.442 1.659 1.276 0.791 4.967 6.372 5.120 5.886 5.427

Aktivitas mananase (U/mL) 1.147 1.308 1.384 1.365 1.569 1.486 0.784 4.660 6.174 5.241 5.350 5.644

22

23

Lampiran 4 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada berbagai konsentrasi substrat Konsentrasi Inkubasi porang

0.5%

1%

1.5%

0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

Sample

Kontrol

S-K

ppm (mg/L)

mg/mL

U/mL

S1

S2

K1

K2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

0.102 0.106 0.113 0.062 0.087 0.123 0.140 0.099 0.168 0.167 0.234 0.186 0.147 0.087 0.124 0.117 0.123 0.076

0.099 0.111 0.141 0.173 0.126 0.149 0.128 0.078 0.106 0.125 0.212 0.148 0.111 0.108 0.112 0.101 0.163 0.128

0.056 0.047 0.035 0.031 0.034 0.026 0.049 0.047 0.047 0.021 0.023 0.026 0.056 0.039 0.030 0.029 0.032 0.026

0.038 0.036 0.066 0.032 0.026 0.028 0.061 0.050 0.044 0.028 0.035 0.024 0.050 0.026 0.040 0.034 0.028 0.037

0.046 0.059 0.078 0.031 0.053 0.097 0.091 0.052 0.121 0.146 0.211 0.160 0.091 0.048 0.094 0.088 0.091 0.050

0.061 0.075 0.075 0.141 0.100 0.121 0.067 0.028 0.062 0.097 0.177 0.124 0.061 0.082 0.072 0.067 0.135 0.091

33.414 37.897 44.448 28.241 35.828 51.000 48.931 35.483 59.276 67.897 90.310 72.724 48.931 34.103 49.966 47.897 48.931 34.793

38.586 43.414 43.414 66.172 52.034 59.276 40.655 27.207 38.931 51.000 78.586 60.310 38.586 45.828 42.379 40.655 64.103 48.931

0.033 0.038 0.044 0.028 0.036 0.051 0.049 0.035 0.059 0.068 0.090 0.073 0.049 0.034 0.050 0.048 0.049 0.035

0.039 0.043 0.043 0.066 0.052 0.059 0.041 0.027 0.039 0.051 0.079 0.060 0.039 0.046 0.042 0.041 0.064 0.049

1.238 7.018 8.231 5.230 6.635 9.444 1.812 6.571 10.977 12.573 16.724 13.467 1.812 6.315 9.253 8.870 9.061 6.443

1.429 8.040 8.040 12.254 9.636 10.977 1.506 5.038 7.209 9.444 14.553 11.169 1.429 8.487 7.848 7.529 11.871 9.061

Aktivitas mananase (U/mL) 0.429 7.529 8.135 8.742 8.135 10.210 1.659 5.804 9.093 11.008 15.638 12.318 1.620 7.401 8.550 8.199 10.466 7.752

21 19

20 22 Lanjutan Konsentrasi Prang

2%

2.5%

Sample Inkubasi 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

Kontrol

S-K

ppm (mg/L)

mg/mL

S1

S2

K1

K2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

0.132 0.118 0.136 0.131 0.165 0.122 0.131 0.125 0.156 0.174 0.169 0.087

0.116 0.096 0.107 0.118 0.153 0.089 0.135 0.085 0.126 0.114 0.179 0.103

0.042 0.039 0.040 0.023 0.023 0.038 0.044 0.047 0.045 0.024 0.027 0.039

0.055 0.046 0.048 0.024 0.025 0.029 0.053 0.027 0.053 0.027 0.026 0.030

0.090 0.079 0.096 0.108 0.142 0.084 0.087 0.078 0.111 0.150 0.142 0.048

0.061 0.050 0.059 0.094 0.128 0.060 0.082 0.058 0.073 0.087 0.153 0.073

48.586 44.793 50.655 54.793 66.517 46.517 47.552 44.448 55.828 69.276 66.517 34.103

38.586 34.793 37.897 49.966 61.690 38.241 45.828 37.552 42.724 47.552 70.310 42.724

0.049 0.045 0.051 0.055 0.067 0.047 0.048 0.044 0.056 0.069 0.067 0.034

0.039 0.035 0.038 0.050 0.062 0.038 0.046 0.038 0.043 0.048 0.070 0.043

U/mL S1

S2

1.799 1.429 8.295 6.443 9.381 7.018 10.147 9.253 12.318 11.424 8.614 7.082 1.761 1.697 8.231 6.954 10.338 7.912 12.829 8.806 12.318 13.020 6.315 7.912

Aktivitas mananase (U/mL) 1.614 7.351 8.199 9.700 11.871 7.848 1.729 7.592 9.125 10.817 12.669 7.113

21 24

25

Lampiran 5 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada ragam pH media produksi Sample pH media

5

6

7

Inkubasi 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

Kontrol

S-K

ppm (mg/L)

mg/mL

U/mL

S1

S2

K1

K2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

0.050 0.122 0.164 0.196 0.198 0.206 0.104 0.099 0.196 0.209 0.181 0.162 0.047 0.133 0.233 0.155 0.241 0.270

0.051 0.074 0.080 0.071 0.070 0.073 0.122 0.122 0.173 0.192 0.185 0.183 0.044 0.122 0.231 0.198 0.201 0.261

0.028 0.024 0.023 0.026 0.017 0.023 0.043 0.045 0.050 0.046 0.031 0.050 0.029 0.028 0.023 0.026 0.023 0.025

0.028 0.025 0.021 0.023 0.020 0.017 0.040 0.045 0.046 0.055 0.055 0.039 0.028 0.025 0.020 0.023 0.026 0.023

0.022 0.098 0.141 0.170 0.181 0.183 0.061 0.054 0.146 0.163 0.150 0.112 0.018 0.105 0.210 0.129 0.218 0.245

0.023 0.049 0.059 0.048 0.050 0.056 0.082 0.077 0.127 0.137 0.130 0.144 0.016 0.097 0.211 0.175 0.175 0.238

25.138 51.345 66.172 76.172 79.966 80.655 38.586 36.172 67.897 73.759 69.276 56.172 23.759 53.759 89.966 62.034 92.724 102.03

25.483 34.448 37.897 34.103 34.793 36.862 45.828 44.103 61.345 64.793 62.379 67.207 23.069 51.000 90.310 77.897 77.897 99.621

0.025 0.051 0.066 0.076 0.080 0.081 0.039 0.036 0.068 0.074 0.069 0.056 0.024 0.054 0.090 0.062 0.093 0.102

0.025 0.034 0.038 0.034 0.035 0.037 0.046 0.044 0.061 0.065 0.062 0.067 0.023 0.051 0.090 0.078 0.078 0.100

4.655 9.508 12.254 14.106 14.808 14.936 7.146 6.699 12.573 13.659 12.829 10.402 4.400 9.955 16.660 11.488 17.171 18.895

4.719 6.379 7.018 6.315 6.443 6.826 8.487 8.167 11.360 11.999 11.552 12.446 4.272 9.444 16.724 14.425 14.425 18.448

Aktivitas mananase (U/mL) 4.687 7.943 9.636 10.210 10.625 10.881 7.816 7.583 11.965 12.829 12.190 11.424 4.336 9.6995 16.692 12.955 15.798 18.671

23 19

20 24 Lanjutan Sample pH media

8

9

Inkubasi 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

Kontrol

S-K

S1

S2

K1

K2

S1

0.067 0.184 0.267 0.298 0.303 0.294 0.057 0.089 0.085 0.103 0.100 0.126

0.045 0.222 0.287 0.286 0.260 0.279 0.063 0.093 0.086 0.080 0.136 0.121

0.049 0.042 0.046 0.040 0.051 0.042 0.051 0.050 0.059 0.060 0.052 0.059

0.042 0.042 0.040 0.041 0.039 0.043 0.059 0.061 0.055 0.050 0.065 0.050

0.018 0.142 0.221 0.258 0.252 0.252 0.006 0.039 0.026 0.043 0.048 0.067

ppm (mg/L) S2

S1

S2

0.003 23.759 18.586 0.180 66.517 79.621 0.247 93.759 102.724 0.245 106.517 102.034 0.221 104.448 93.759 0.236 104.448 98.931 0.004 19.621 18.931 0.032 31.000 28.586 0.031 26.517 28.241 0.030 32.379 27.897 0.071 34.103 42.034 0.071 40.655 42.034

mg/mL

U/mL

S1

S2

S1

S2

0.024 0.067 0.094 0.107 0.104 0.104 0.020 0.031 0.027 0.032 0.034 0.041

0.019 0.080 0.103 0.102 0.094 0.099 0.019 0.029 0.028 0.028 0.042 0.042

4.400 12.318 17.363 19.725 19.342 19.342 3.633 5.741 4.911 5.996 6.315 7.529

3.442 14.745 19.023 18.895 17.363 18.321 3.506 5.294 5.230 5.166 7.784 7.784

Aktivitas mananase (U/mL) 3.921 13.536 18.193 19.31 18.352 18.831 3.569 5.517 4.152 4.092 7.049 7.656

26

27

Lampiran 6 Hasil perhitungan aktivitas mananase dari Bacillus subtilis pada ragam suhu produksi Suhu Inkubasi fermentasi

20oC

30oC

40oC

0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

Sample

Kontrol

S-K

ppm (mg/L)

mg/mL

U/mL

S1

S2

K1

K2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

0.090 0.096 0.061 0.090 0.159 0.197 0.067 0.184 0.267 0.298 0.310 0.294 0.078 0.440 0.350 0.396 0.411 0.377

0.084 0.090 0.055 0.107 0.155 0.183 0.045 0.222 0.287 0.286 0.260 0.279 0.082 0.517 0.312 0.339 0.343 0.340

0.076 0.082 0.010 0.062 0.064 0.049 0.049 0.042 0.046 0.051 0.040 0.042 0.074 0.090 0.015 0.056 0.059 0.048

0.076 0.085 0.016 0.063 0.055 0.054 0.047 0.042 0.040 0.041 0.039 0.043 0.078 0.089 0.018 0.057 0.051 0.047

0.014 0.014 0.051 0.028 0.095 0.148 0.018 0.142 0.221 0.247 0.270 0.252 0.004 0.350 0.335 0.340 0.352 0.329

0.008 0.005 0.039 0.044 0.100 0.129 -0.002 0.180 0.247 0.245 0.221 0.236 0.004 0.428 0.294 0.282 0.292 0.293

22.379 22.379 35.138 27.207 50.310 68.586 23.759 66.517 93.759 102.74 110.65 104.44 18.931 138.21 133.06 134.79 138.93 131.00

20.310 19.276 31.000 32.724 52.034 62.034 16.862 79.621 102.724 102.034 93.759 98.931 18.931 165.138 118.931 114.793 118.241 118.586

0.022 0.022 0.035 0.027 0.050 0.069 0.024 0.067 0.094 0.103 0.111 0.104 0.019 0.138 0.133 0.135 0.139 0.131

0.020 0.019 0.031 0.033 0.052 0.062 0.017 0.080 0.103 0.102 0.094 0.099 0.019 0.165 0.119 0.115 0.118 0.119

4.144 4.144 6.507 5.038 9.317 12.701 4.400 12.318 17.363 19.023 20.492 19.342 3.506 25.600 24.642 24.962 25.728 24.259

3.761 3.570 5.741 6.060 9.636 11.488 3.123 14.745 19.023 18.895 17.363 18.321 3.506 30.581 22.024 21.258 21.897 21.960

Aktivitas mananase (U/mL) 3.9525 3.857 6.124 5.549 9.476 12.094 3.7615 13.535 18.193 18.959 18.927 18.831 3.506 28.090 23.333 23.110 23.812 23.109

25 19

20 26 Lanjutan Suhu Inkubasi fermentasi

50oC

0 24 48 72 96 120

Sample

Kontrol

S-K

ppm (mg/L)

mg/mL

U/mL

S1

S2

K1

K2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

S1

S2

0.100 0.673 0.290 0.453 0.462 0.584

0.095 0.588 0.400 0.390 0.518 0.586

0.085 0.092 0.015 0.056 0.057 0.035

0.078 0.090 0.014 0.058 0.060 0.040

0.015 0.581 0.275 0.397 0.405 0.549

0.017 0.498 0.386 0.332 0.458 0.546

22.724 217.897 112.379 154.448 157.207 206.862

23.414 189.276 150.655 132.034 175.483 205.828

0.023 0.218 0.112 0.154 0.157 0.207

0.023 0.189 0.151 0.132 0.175 0.206

4.208 40.351 20.811 28.602 29.112 38.308

4.336 35.051 27.899 24.451 32.497 38.116

Aktivitas mananase (U/mL) 4.272 37.701 24.355 26.526 30.804 38.212

28

27

Lampiran 7 Contoh perhitungan aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis laut menggunakan substrat porang 0.5% pada jam ke-0 ulangan 1 Sampel – kontrol = 0.102 – 0.056 = 0.0046 y = 0.046 Persamaan garis yang diperoleh adalah y=0.0029x - 0.0509, maka y = 0.0029x - 0.0509

x=

y + 0.0509 0.0029

Sehingga x=

y + 0.0509 = 0.0029

0.046 + 0.0509 = 33.414 ppm 0.0029

Karena 1 ppm setara dengan 1 mg/L, maka 33.414 1000

33.414 ppm =

Aktivitas Enzim =

=

Ket : C

= 0.0334 mg/mL

C x fp x 1000 t x BM [0.0334] x 100 x 1000 15 x 180

= konsentrasi (mg/mL)

fp = faktor pengenceran t

= waktu reaksi (menit)

BM = Bobot molekul gula pereduksi

= 1.238 U/mL

28

Lampiran 8 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm kultur bakteri laut Bacillus subtilis pada berbagai substrat biomassa Jenis substrat Inkubasi

Porang

BKS

Bagasse

TKKS

LBG

0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

Sampel S1 S2 0.042 0.041 0.243 0.213 1.150 1.224 2.171 2.192 1.783 1.758 1.681 1.791 0.107 0.116 0.312 0.342 0.716 0.660 1.372 1.427 0.611 0.959 1.199 1.224 0.053 0.054 0.364 0.307 0.528 0.654 0.608 0.686 0.560 0.791 0.485 0.603 0.040 0.050 0.241 0.287 0.333 0.479 0.442 0.574 0.439 0.598 0.373 0.534 0.043 0.057 0.082 0.114 0.886 0.620 1.855 1.924 1.790 1.761 1.776 1.764

Rata-rata (S) 0.041 0.228 1.187 2.181 1.770 1.736 0.111 0.327 0.688 1.399 0.785 1.211 0.053 0.335 0.591 0.647 0.675 0.544 0.045 0.264 0.406 0.508 0.518 0.453 0.050 0.098 0.753 1.889 1.775 1.770

30

29

Lampiran 9 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm kultur bakteri laut Bacillus subtilis pada berbagai konsentrasi substrat porang Konsentrasi Inkubasi substrat 0 24 48 0.5% 72 96 120 0 24 48 1% 72 96 120 0 24 48 1.5% 72 96 120 0 24 48 2% 72 96 120 0 24 48 2.5% 72 96 120

Sampel S1 S2 0.193 0.133 2.462 2.411 2.477 2.390 2.318 2.246 2.273 2.226 2.273 2.181 0.383 0.314 2.491 2.554 2.517 2.526 2.358 2.409 2.354 2.355 2.394 2.355 0.482 0.513 2.522 2.509 2.524 2.534 2.407 2.395 2.383 2.368 2.367 2.375 0.603 0.580 2.509 2.479 2.560 2.537 2.393 2.402 2.391 2.396 2.390 2.382 0.693 0.704 2.497 2.525 2.548 2.548 2.375 2.379 2.389 2.391 2.385 2.381

Rata-rata (S) 0.163 2.436 2.433 2.282 2.249 2.227 0.348 2.522 2.521 2.383 2.354 2.374 0.497 2.515 2.529 2.401 2.375 2.371 0.591 2.494 2.548 2.397 2.393 2.386 0.698 2.511 2.548 2.377 2.390 2.383

30

Lampiran 10 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm kultur bakteri laut Bacillus subtilis pada beragam pH media produksi pH media

5

6

7

8

9

Inkubasi 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

Sampel S1 S2 0.200 0.270 2.700 2.230 7.700 3.470 10.500 3.640 11.250 3.550 10.720 3.620 1.140 1.360 4.120 7.760 9.390 9.850 12.870 10.920 10.940 10.040 9.990 9.870 1.680 0.220 4.720 4.220 7.130 7.610 8.350 7.530 8.240 6.530 7.620 7.270 0.380 0.250 4.710 5.950 7.880 8.320 10.350 9.800 11.400 10.490 10.750 9.540 1.830 1.670 1.970 1.870 3.090 2.720 3.210 3.310 3.210 2.850 3.480 3.150

Rata-rata (S) 0.235 2.465 5.585 7.070 7.400 7.170 1.250 5.940 9.620 11.895 10.490 9.930 0.950 4.470 7.370 7.940 7.385 7.445 0.315 5.330 8.100 10.075 10.945 10.145 1.750 1.920 2.905 3.260 3.030 3.315

19

31

Lampiran 11 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm kultur bakteri laut Bacillus subtilis pada beragam suhu produksi Suhu fermentasi (oC)

20

30

40

50

Sampel Inkubasi 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

S1

S2

0.011 0.062 0.171 0.134 0.216 0.203 0.038 0.471 0.788 0.104 1.140 0.108 0.180 0.557 0.505 0.588 0.613 0.174 0.016 0.275 0.197 0.158 0.143 0.108

0.010 0.057 0.176 0.137 0.191 0.215 0.025 0.595 0.832 0.980 0.105 0.954 0.160 0.541 0.542 0.575 0.604 0.170 0.022 0.295 0.157 0.193 0.091 0.073

Rata-rata (S) 0.010 0.059 0.173 0.135 0.203 0.209 0.031 0.533 0.810 0.541 0.622 0.530 0.170 0.549 0.523 0.581 0.608 0.172 0.019 0.285 0.177 0.175 0.117 0.090

32

RIWAYAT HIDUP Irfan Pebi Nugraha, lahir di Ciamis tepatnya di Dusun Batumalang, Desa Nasol, Kecamatan Cikoneng pada tanggal 15 Februari 1993. Merupakan anak pertama dari dua bersaudara pasangan Ibu Elah dan Bapak Duloh. Penulis pernah melaksanakan kegiatan belajar di SMAN 3 Ciamis, dan sekarang sedang menjalani pendidikan di Departemen Biokimia Institut Pertanian Bogor. Selama kuliah penulis pernah mengikuti unit kegiatan mahasiswa, seperti PSM Agriaswara. Penulis juga aktif mengikuti organisasi kemahasiswaan dan kepanitiaan sebagai anggota divisi CIC CREBs 2011-2012, PJLT acara MPKMB 48 IPB, anggota divisi PDD Pesta Sains Nasional 2012, anggota divisi logstran acara IPB Art Contest 2012, Ketua divisi CIC CREBs 2013, dan Ketua divisi Publikasi Dekorasi Dokumentasi Pesta Sains Nasional 2013. Penulis pernah mendapatkan penghargaan sebagai Juara 1 Lomba Karikatur SPIRIT FMIPA 2012 dan 2014. Peringkat 2 Drama Musikal SPIRIT FMIPA 2012, Peringkat 1 Senam Aerobik Olimpiade Mahasiswa IPB 2013. Penulis pernah melaksanakan praktik lapang di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, LIPI Cibinong dengan judul Produksi dan Analisis Enzim Mananase dari Bakteri Laut.

19